CN116376885A - 产气荚膜梭菌噬菌体cps2裂解酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白质工程领域和生物技术领域，具体涉及产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体及其应用。本发明通过定向改造的方法提高产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶在肠道环境下的抗胰蛋白酶酶解性能，所得的突变酶在肠道环境胰蛋白酶作用下，与野生型酶相比具有更高的抑菌活性。本发明的裂解酶突变体可作为替代抗生素产品经口服在肠道中发挥抑菌效果，预防和治疗产气荚膜梭菌引发的相关疾病，改善肠道健康。

Description

产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域和生物技术领域，具体涉及产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体及其应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是重要的人畜共患病原菌，且广泛存在于自然界的水源、土壤及人和动物肠道之中。A型产气荚膜梭菌是引起人的食物中毒的主要病原体，亦可引起动物的坏死性肠炎和肠毒血症；C型产气荚膜梭菌可以引起人的坏死性肠炎以及各种动物的肠毒血症；B型和D型产气荚膜梭菌主要存在于动物的肠道中，作为一种条件致病菌可引起动物发生肠毒血症。由产气荚膜梭菌引发的死亡率增加、经济损失和畜禽产品污染是人们关注的重要问题。

噬菌体是一类对致病菌有非常强特异性杀灭作用的病毒。针对致病细菌的噬菌体，天然就是抗生素的替代品。而噬菌体自身的能力也展现出了这方面的潜力，比如它的专一性很强，只针对某一种细菌，因此可以避免误伤有益菌及机体本身的细胞，而且极不容易产生耐药。噬菌体裂解酶是噬菌体编码的肽聚糖水解酶，产生于溶菌周期中的生物合成晚期，噬菌体依靠裂解酶水解细胞壁中的肽聚糖从而释放子代噬菌体。早在1959年，人类就已经发现噬菌体裂解酶裂解细菌的特性，将其命名为endolysin。但由于当时抗生素疗效显著，对噬菌体抗菌的探索一度被搁置。如今，细菌对抗生素的耐药性急剧增加，人们将目光重新投向噬菌体及其裂解酶。噬菌体本身是病毒，含有遗传物质，对机体存在毒性风险，产品开发投入大，筛选难度大。开发噬菌体裂解酶能够很好的解决噬菌体的安全问题，且更利于产业化，也更有利于市场推广。

2018年，一株产气荚膜梭菌噬菌体CPS2被从鸡粪中分离出来。同时通过对CPS2基因组的生物信息学分析，发现了其裂解酶。该产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶对产气荚膜梭菌具有较强的裂解活性，且具有很高的热稳定性，作为替抗产品具有很大应用前景。

胰蛋白酶是存在于肠道中的一种蛋白水解酶，能选择性地水解蛋白质中由赖氨酸或者精氨酸的羧基构成的肽链。对产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶进行蛋白质三级结构建模与分析，发现其Loop区含有多个胰蛋白酶酶切位点，极容易被胰蛋白酶水解而失去抑菌活性。因此，基于该技术问题，本发明通过定向改造的方法提高产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶在肠道环境下的抗胰蛋白酶酶解性能。解决了这个短板问题，将更有利于裂解酶作为替代抗生素产品经口服在肠道中发挥抑菌效果，预防和治疗产气荚膜梭菌相关疾病，改善肠道健康。

发明内容

本发明针对现有技术公开的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶(野生型CPS2-WT)进行突变筛选。产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的核酸编码序列由SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶对产气荚膜梭菌具有较强的裂解活性，且具有很高的热稳定性，作为替抗产品具有很大应用前景，但其极容易被胰蛋白酶水解而失去抑菌活性。因此，通过对该野生型酶进行定点突变，以期获得在肠道环境下抗胰蛋白酶酶解性能增强的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体。

本发明的目的是提供一种产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体及其应用。本发明通过大量的定点突变筛选，最终获得在模拟肠道环境下抗胰蛋白酶酶解性能增强的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体，并构建得到了重组表达产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的基因工程菌株，为实现其应用奠定了基础。

首先，本发明提供一种在肠道环境胰蛋白酶作用下，与野生型酶相比具有更高的抑菌活性的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体，其氨基酸序列是在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列基础上，在K58，L91，K139，L140，R141，K147，K212，L213，K214位中的至少一个位置的氨基酸残基发生突变；或者所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点。

更优选地，所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体包括对应于SEQ ID NO:2，存在如下位点的突变：K58P，L91F，K139G，L140S，R141P，K147P，K212G，L213P，K214P中的一种或两种或三种或四种以上的组合。

更具体地的，对应于SEQ ID NO:2，存在如下位点的突变：

(1)第58位赖氨酸突变为脯氨酸；

(2)第91位亮氨酸突变为苯丙氨酸；

(3)第214位赖氨酸突变为脯氨酸；

(4)第212位赖氨酸突变为甘氨酸，且第213位亮氨酸突变为脯氨酸；

(5)第139位赖氨酸突变为甘氨酸，第140位亮氨酸突变为丝氨酸，第141位精氨酸突变为脯氨酸，且第147位赖氨酸突变为脯氨酸。

本发明还提供上述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的编码基因。

本发明进一步提供含所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的编码基因的重组载体、重组细胞。

本发明还提供所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的编码基因重组表达的方法，通过含重组表达载体的重组菌进行表达获得。更具体的是，以pET-30a(+)为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，将所得的重组菌株接种于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB表达培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，转至16℃、150rpm培养16-18h诱导产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶蛋白的表达。其中LB培养基含有10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物和10g/L NaCl。

进一步，还包括将重组菌体破碎后，收集上清，用Ni柱纯化目的蛋白，通过高浓度咪唑缓冲液洗脱得到目的蛋白。

本发明还提供所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体在肠道环境胰蛋白酶作用下抑制产气荚膜梭菌的应用。

本发明进一步提供所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体在制备预防和/或治疗产气荚膜梭菌引发的相关疾病的药物中的应用。优选地，所述药物适于口服的制型；所述疾病是产气荚膜梭菌引发的食物中毒、坏死性肠炎或肠毒血症。所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体可以作为替代抗生素产品经口服在肠道中发挥抑菌效果，以预防和治疗产气荚膜梭菌引发的相关疾病应用。

本发明的有意效益是通过基因工程手段，通过蛋白质的结构分析与定向改造的方法，构建大量的突变体，然后从中筛选获得在肠道环境下抗胰蛋白酶酶解性能增强的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体。所得的突变酶在肠道环境胰蛋白酶作用下，与野生型酶相比具有更高的抑菌活性。其中获得了一些突变体的抑菌活性提高2.08倍甚至是2.47倍，表明其抗胰蛋白酶酶解性能显著增强。因此，所述突变体更有利于裂解酶作为替代抗生素产品经口服在肠道中发挥抑菌效果，预防和治疗产气荚膜梭菌引发的相关疾病，改善肠道健康。

附图说明

图1：产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶野生型及其突变体蛋白纯化后的SDS-PAGE。

图2：产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶野生型及其突变体在肠道环境胰蛋白酶作用下的抑菌效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法做进一步说明。在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照分子生物学领域的常规实验中的条件，或按照质粒、菌株等商品化生产厂商的说明书进行操作。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。突变PCR为本领域技术人员所熟悉的定点突变PCR。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。具体实施案例如下：

实施例一：产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶野生型CPS2-WT的基因克隆

本发明以现有技术公开的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶(野生型CPS2-WT)进行突变筛选。产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的核酸编码序列由SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，在大肠杆菌中表达制备。委托金斯瑞生物技术有限公司经过密码子优化后人工合成该基因，然后连接入pET-30a(+)载体的NdeI和XhoI的酶切位点之间，转化入大肠杆菌克隆宿主Top10中，于含有卡那霉素50μg/mL的LB平板上筛选，筛选阳性的菌中包含的表达载体被命名为pET30a-CPS2，抽提质粒，测序验证正确。

其中，SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.2：

实施例二：突变筛选

1、构建突变体

为了进一步提高实施例一中产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶(氨基酸序列为SEQID NO.2)在肠道环境中抗胰蛋白酶酶解性能，首先根据文献(Ha,E.；Son,B.；Ryu,S.Clostridium perfringens virulent bacteriophage CPS2 and its thermostableendolysinLysCPS2.Viruses 2018,10,251.)确定CPS2裂解酶的16到134位氨基酸为催化活性区域，166到224位氨基酸为细胞壁结合区域，134到166位为Linker；然后对CPS2裂解酶三级结构建模找到催化域和结合域的Loop区胰蛋白酶切位点共13个，对此13个突变位点设计了19个突变体(表1，Mutant1～19)。同时，对Linker上的4个胰蛋白酶切位点设计组合突变体(表1，Mutant 20)。以实施例一中构建得到的质粒pET30a-CPS2为模板，针对突变体Mutant1～20分别设计定点突变引物，进行反向PCR。PCR纯化产物分别转化入大肠杆菌克隆宿主Top10中，于含有卡那霉素50μg/mL的LB平板上筛选，筛选阳性的菌中包含的表达载体分别被命名为pET30a-Mutant1～20，抽提质粒，测序验证正确。

2、蛋白表达纯化方法

利用本领域公知的质粒转化感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)的方法，所用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购买于北京擎科生物科技有限公司，并用热激法将实施例一的野生型表达载体pET30a-CPS2和20个成功构建的突变体载体pET30a-Mutant1～20转化入感受态细胞，筛选阳性克隆PCR验证及测序验证正确后备用。

接种针挑取野生型与突变体阳性单克隆菌株接种于5mL LB培养基中，以37℃、220rpm培养过夜，然后以按2％(V/V)接种量接种于250mL LB培养基中，以37℃、220rpm培养2-3h。当细菌密度OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，为防止包涵体的形成，表达条件为150rpm，16℃低温过夜诱导蛋白表达。

7000rpm、4℃、10min离心收集菌体，Tris-HCl/NaCl(pH7.5)缓冲液重悬细胞，冰浴超声破碎；12000rpm，30min离心收集上清，即为胞内表达的粗酶提取液，用孔径0.22μm水系膜过滤。采用AKTA亲和层析系统，利用Ni²⁺层析柱对上述表达的粗酶提取液进行亲和层析纯化，用咪唑洗脱后经过脱盐柱脱盐，蛋白保存在Tris-HCl/NaCl(pH7.5)缓冲液中，并测定蛋白浓度。野生型蛋白命名为CPS2-WT，突变体蛋白分别命名为Mutant加编号，纯化获得蛋白进行SDS-PAGE检测，CPS2野生型及部分突变体蛋白纯化后SDS-PAGE结果见图1。

3、产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶及其突变体酶的抗胰蛋白酶酶解性能测定

取产气荚膜梭菌24h新鲜平板用KH₂PO₄(50mM，pH 6.8)洗下，用KH₂PO₄(50mM，pH6.8)稀释至约1.0×10⁵CFU/mL～9.0×10⁵CFU/mL菌悬液备用。

将产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶及其突变体酶稀释于含有10mg/mL胰蛋白酶，50mMKH₂PO₄，10％产气荚膜梭菌菌悬液，pH6.8的混合溶液中，使产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶及其突变体酶的终浓度为0.78mg/mL。同时设置不含产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶野生型及其突变体酶的对照组。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃孵育1h，后进行平板菌落计数。产气荚膜梭菌平板培养24h观察最终结果，计算抑菌率，并比较产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶野生型及其突变体酶的相对抑菌效果。结果如表1和图2所示。

从结果可知，在肠道环境胰蛋白酶作用下，不同突变位点对产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶的抑菌活性影响表现不同。多数位点突变后抑菌活性下降或基本丧失，有些突变体的抑菌活性有提高，其中获得了一些突变体的抑菌活性提高2.08倍甚至是2.47倍，表明其抗胰蛋白酶酶解性能显著增强。

表1

Claims (10)

1.一种在肠道环境胰蛋白酶作用下与野生型酶相比具有更高的抑菌活性的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体，其氨基酸序列相应于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列基础上，在K58，L91，K139，L140，R141，K147，K212，L213，K214位中的至少一个位置的氨基酸残基发生突变；或者所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点。

2.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体，其特征在于，所述产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体包括对应于SEQ ID NO:2，存在如下位点的突变：K58P，L91F，K139G，L140S，R141P，K147P，K212G，L213P，K214P中的一种或两种或三种或四种以上的组合。

3.如权利要求1所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体，其特征在于，对应于SEQ ID NO:2，存在如下突变：

(1) 第58位赖氨酸突变为脯氨酸；

(2) 第91位亮氨酸突变为苯丙氨酸；

(3) 第214位赖氨酸突变为脯氨酸；

(4) 第212位赖氨酸突变为甘氨酸，且第213位亮氨酸突变为脯氨酸；

(5) 第139位赖氨酸突变为甘氨酸，第140位亮氨酸突变为丝氨酸，第141位精氨酸突变为脯氨酸，且第147位赖氨酸突变为脯氨酸。

4.如权利要求1至3任一项所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体的编码基因。

5.含有如权利要求4所述的编码基因的重组载体、重组细胞。

6.一种如权利要求1至3任一项所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体的重组表达的方法，通过含有如权利要求4所述的编码基因的重组表达载体的重组菌进行表达获得。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括将重组菌体破碎后，收集上清，用Ni柱纯化目的蛋白，通过高浓度咪唑缓冲液洗脱得到目的蛋白。

8.如权利要求1至3任一项所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体在肠道环境胰蛋白酶作用下抑制产气荚膜梭菌的应用。

9.如权利要求1至3任一项所述的产气荚膜梭菌噬菌体CPS2裂解酶突变体在制备预防和/或治疗产气荚膜梭菌引发的相关疾病的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物适于口服的制型；所述疾病是产气荚膜梭菌引发的食物中毒、坏死性肠炎或肠毒血症。

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