BRPI0619919A2

BRPI0619919A2 - composições terapêuticas

Info

Publication number: BRPI0619919A2
Application number: BRPI0619919-4A
Authority: BR
Inventors: Michael Edward Donald Crothers; Tahir Nazir; Marc Barry Brown
Original assignee: Peplin Research Pty Ltd
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2011-10-25
Also published as: US9820959B2; AU2006325244A1; US8735375B2; US8278292B2; US20160263070A1; US8372828B2; CY2014030I1; EA201201452A1; ES2461315T3; US20160263069A1; NO344271B1; KR101593579B1; EA024152B1; IL192221A; AU2006325244B2; PT1988877E; JP2009519314A; EP1988877A2; US20160263067A1; ZA200805187B

Abstract

COMPOSIçõES TERAPêUTICAS. Trata-se de angelato de ingenol, um potente agente anticâncer, podendo ser estabilizado por dissolução do mesmo num solvente aprótico, na presença de um tampão ácido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS"

A presente invenção refere-se a composições de compostos que podem ser obtidos da espécie Euphorbia e que são úteis no tratamento de cânceres da pele.

O composto angelato de ingenol pode ser isolado de diversas espécies de Euphorbia e especialmente de Euphorbia peplus e Euphorbia drummondii. O angelato de ingenol existe em três isoformas: 3-angelato de ingenol (isoforma 'b'), 5-angelato de ingenol (isoforma 'a') e 20 angelato de ingenol (isoforma iC'). Refere-se ao primeiro destes também como 13A e ele tem a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 2</formula>

Foi descoberto que o angelato de ingenol é extremamente tóxico para as células cancerosas da pele por meio de uma rápida destruição mitocondrial e morte celular por necrose primária, deixando as células sadias incólumes.

US-A-643252 descreve compostos presentes em um princípio ativo derivado de plantas das espécies Euphorbia peplus, Euphorbia hirta e Euphorbia drummondii, que mostram uma citotoxicidade seletiva contra diversas linhagens de células cancerosas diferentes. Os compostos são úteis no tratamento efetivo de cânceres, especialmente melanomas malignos e carcinomas de células escamosas (SCCs). Os compostos são

selecionados de jatrofanos, pepluanos, paraliana e ingenanos. O composto preferido é um ingenano substituído com angeloíla obtido da seiva de Euphorbici peplus.

Quantidades em microgramas de angelato de ingenol são tipicamente efetivas terapeuticamente. No entanto, a tendência que a isoforma 'b' tem de sofrer rearranjo em isoforma 'a' e subseqüentemente na isoforma 'c' apresenta um problema de formulação, no caso em que se deseja restringir a formulação ou em uma isoforma específica ou em uma relação de isoformas. Isto é especialmente um problema com Í3A, uma vez que diferentes isoformas têm solubilidades diferentes.

Há a necessidade de um tratamento tópico efetivo para câncer da pele, uma vez que tratamentos sistêmicos que envolvem outros fármacos necessariamente resultam na exposição de células sadias suscetíveis, em partes não alvo do corpo, a substâncias químicas citotóxicas. Além disso, os tratamentos sistêmicos anticancerígenos, quer administrados oralmente ou por injeção, têm uma aceitação inferior por pacientes.

Existe a necessidade de se prover uma formulação estável de angelato de ingenol, de preferência para a administração tópica. Descobriu-se agora, com surpresa, que o angelato de ingenol pode ser solubilizado, substancialmente sem rearranjo entre isoformas em um solvente aceitável aprótico na presença de um tampão ácido miscível aceitável.

Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção propõe uma formulação de angelato de ingenol para uso em terapia, em que o angelato de ingenol foi dissolvido em um solvente aprótico farmaceuticamente aceitável, compreendo ainda a formulação um agente acidificador farmaceuticamente aceitável que é pelo menos parcialmente compatível com o solvente e que proporciona a formulação com um pH aparente não superior a 4,5.

A presente invenção propõe formulações de qualquer uma das isoformas de angelato de «ngene! ou suas misturas. Atualmente, a isoforma preferida é a isoforma *b\ a que se refere aqui também como 13A. Deve ficar subentendido que

referências a 'angelato de ingenol' e Ί3Λ' incluem referência a outras isoformas e suas misturas, a não ser que seja evidente em contrário.

O angelato de ingenol pode ser dissolvido em muitos solventes e diversos solventes são ilustrados no Ex 1 que acompanha. No entanto, o angelato de ingenol é geralmente suscetível a rearranjo em solventes próticos c qualquer grau substancia! de rearranjo, tipicamente acima de aproximadamente 1% para produtos derivados de vegetais, mas mais preferivelmente de aproximadamente 0,5%, é indesejável em uma formulação farmacêutica.

Em solventes apróticos, que são geralmente solventes que não contribuem pró tons a urna solução, tais como polietileno glicol, a dissolução pode levar algum tempo considerável e isso, juntamente com as temperaturas necessárias, pode também levar a rearranjo até um ponto que está acima de níveis aceitáveis.

As substâncias tais como acctona c acetonitriia são capazes de dissolver I3A, mas não sào geralmente farmaceuticamente aceitáveis, e podem não ser adequadas para unia armazenagem a longo prazo. Mais aceitáveis podem ser substâncias tais como meti! et U cetona, acetato de ctiia, ou éter dietílico, mas geralmente o mais preferido c álcool benzi!ico.

Uma série de substâncias é adequada para dissolver Ϊ3Α, mas a estabilidade não é garantida e podem ser observados cm geral níveis de rearranjo inaceitáveis depois de períodos que variam desde 12 horas até mais de seis meses ou um ano.

Na ausência de água, ou de outro solvente prótico, não haverá um pH mensurável. Em tais condições e

especialmente a temperaturas elevadas é provável o rearranjo. Portanto, foi descoberto que é geralmente possível se inibir o rearranjo pela presença de um ácido adequado.

Os ácidos adequados são geralmente ácidos orgânicos, uma vez que foi estabelecido que I3A pode se decompor muito abaixo de aproximadamente um pH de 3, ao passo que o rearranjo tem a probabilidade de ocorrer a um pH acima de aproximadamente 4,5. Quando se destina a armazenar a formulação por períodos de qualquer duração, tal como de um mês ou mais, então é preferível que o ácido se encontre na forma de um tampão. Tampões adequados incluem tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão acetato e tampão de citrato-ibsíato, embora outros tampões possam ocorrer aos versados na técnica. Mais cspeciHcamente, c preferível que o tampão proporcione um pH aparente a formulação que não seja superior a 4,5 c não inferior a 2,5. Uni pH de formulação inferior a 4 e mais preferido, e é especialmente preferido que o ρB aparente de formulação seja 3,8 ou menos, de preferência de aproximadamente 3,5 ou menos. Um plí aparente de aproximadamente 3 é útil. Foi descoberto que um tampão que tenha um plí de 2,75 é especialmente vantajoso, conferindo um pH aparente de aproximadamente pH 3,5 à formulação final quando usado em quantidade conforme ilustrado nos Exemplos apensos. Limites de pH preferidos do tampão se encontram entre 2,6 e 2,85, de preferencia entre pH 2,7 c pH 2,8, e o tampão é de preferência um tampão de citrato, deve se observar que o ácido geralmente se encontrará na forma de uma solução aquosa, de preferência cm água deionizada, a não ser que seja indicado em contrário. Ii preferido o tampão de citrato. Quando se emprega um tampão de acetato, ele pode tipicamente ter limites de pH cie 3,5 a 5,5, ao passo que o tampão de citrato- fosfato pode tipicamente ter limites de pH de 2,75 a 7,0. Deve ficar subentendido que urna solução em que o solvente seja aprótico não pode ter um pH, uma vez que esse é uma medição do íon H+. No entanto, nos casos em que uma tal solução é pelo menos parcialmente rniscível com um ácido, ou tampão ácido, e um tal tampão está presente, então tentativas de se medir o pH darão um resultado. As formulações preferidas da invenção são preparadas em forma de formas de administração tópicas c geralmente compreenderão uma maioria de tampão, ou solução iônica, mas sempre compreenderão um solvente aprótico, de oiodo que somente pode ser medido um pI-J aparente e não um absoluto, uina vez que o pH medido se refere somente ao componente iônico. Um meio adequado para a medição de pH aparente consiste em um conduzido com um medidor de pH Jenway 3320, Conseqüentemente, o resultado pode não ter o significado habitualmente atribuído a unia solução iônica, especialmente nos casos em que a quantidade de ácido ou de tampão é pequena, mas a significância é tal que, na medida em que estiver presente qualquer ambiente iônico, tal ambiente é ácido. A medida que a quantidade de ácido aumenta, o pH aparente se torna mais equivalente ao pH. Embora não se deseje ser cerceado por teoria, é provável que o angelato de ingenol seja principalmente dissolvido no solvente aprótico, uma vez que ele tem uma solubilidade muito baixa em água. A adição subseqüente da solução de angelato de ingenol em solvente a uma solução iônica acidificada permite que se prepare uma solução iônica opcionalmente aquosa adequada de angelato de ingenol, evitando- se assim a dissolução do angelato de ingenol diretamente em um solvente prático, que é quando parece ocorrer a maior parte de rearranjos. Assim, o contato com um solvente prótico pode imediatamente resultar na formação das outras isoformas, mas isso pode ser minimizado se for acrescentada uma pequena quantidade de ácido ou de tampão ácido, termos estes que são usados como sinônimos no presente documento, a não ser que seja evidente em contrário. Mesmo o ato de dissolução em solventes próticos, dada a duração de tempo e as condições necessárias, pode levar a níveis indesejavclmente altos de formação de isoformas, tal é a suscciibilidade do angelato de ingenol a rearranjos.

O solvente aprótico e o ácido são pelo menos parcialmente compatíveis, permitindo que seja formada uma preparação estável dos dois. O ácido e o solvente são de'· preferência miscíveis e são de preferência miscíveis em todas as proporções. Mais especificamente, c geralmente preferido se acrescentar uma pequena quantidade de tampão ao solvente durante a solubilização do angelato de ingenol, ou um. pouco depois, a fim de manter o pH aparente a um nível relativamente baixo. Subseqüentemente, pode ser desejável se preparar o angelato de ingenol solubilizado em um excesso do tampão que foi usado durante a solubilização inicial. Preparações estáveis preparadas com um excesso de tampão são ilustradas no Exemplo 9 abaixo. Deve se observar que é preferido que o ácido e o solvente sejam suficientemente miscíveis para serem capazes de formar uma única fase, embora solventes e ácidos imiscíveis, ou menos miscíveis possam ser preparados na forma de emulsões ou micro-emulsões. Tais emulsões podem ser estáveis, mas a provisão de uma mistura de solvente e ácido em forma de uma única fase geralmente minimiza qualquer risco de rearranjo de an gel ato.

Os solventes que são especialmente úteis na presente invenção são aqueles que apresentam tanto caracterís- ticas hidrófilas como lipófilas, tais como sistemas dc anel que são de preferência homocíclicas e que tem grupos hidróxi substituídos neles, mas separados por pelo menos um átomo de carbono proveniente da estrutura de anel. um exemplo especialmente preferido dc um tal solvente é álcool benzlico.

Ernbora seja possível se usar um ácido e não um tampão, c geralmente preferível se usar um tampão ácido para se minimizar a flutuação em pH. Por este motivo, deve se observar que, embora o termo 'tampão' seja geralmente usado no presente documento, este termo também abrange ácidos e preparados de ácidos, sempre que for adequado. Um tampão especialmente preferido é tampão de citrato, de pH 3, de preferência de pH 2,75. Em álcool benzílico, urna quantidade de tampão de citrato de pH 2,5 a 2,5% peso/peso, geralmente produzirá um ρFi aparente não mensurável, mas em proporções maiores, produz um pH de aproximadamente pH 3. A relação entre o pH do tampão e o pH aparente é explorada nos Exemplos apensos. Com quantidades baixas de tampão quando se dissolve I3A no solvente, é simplesmente preferível se manter o ambiente ácido, e a natureza do tampão preferido a estes níveis é análoga à natureza cio tampão preferido quando se dilui subseqüentemente a formulação para uso. geralmente é preferido se acidsfscar o solvente, de preferencia álcool benzíüco com uma quantidade de tampao acido, de preferencia entre 1 e 10% em peso, sendo mais preferivel entre 2 e 5%, antes da adicao de I3A.

Embora a formulacao nao tenha que ser diluida para uso, e um fato que geralmente a I3A e uma substancia potente, e solucoes de estoque de I3A em solvente, de preferncia em álcool benzílico, podem ser preparadas para armazenagem, de preferência a 8°C ou abaixo, Tais soluções de estoque podem ser então diluídas, de preferência com tampão, se for desejável, quando se prepara qualquer formulação ou preparação final

A quantidade de tampão usado quando se solubiliza o angelato de ingenol pode variar entre aproximada- mente 0 c 100%. Quando a quantidade e 0 e prerenvei se acrescentar uma quantidade de tampão pouco depois de se ter acrescentado o angelato de ingenol ao solvente, a fim de minimizar a probabilidade de ocorrer qualquer rearranjo. E geralmente preferível se evitar o uso de quantidades de tampão superiores a 100% em peso do solvente, uma vez que em geral não e fácil se obter uma dissolução diretamente no tampão. E preferival se empregar o tampão como um meio de se manter o pH aparente cio solvente a um nível baixo, sem proporcionar qualquer quantidade substancial de solvente prótico durante a dissolução do angelato de ingenof. Uma vez substancialmente dissolvido o angelato de ingenol, então c possível, e pode até ser desejável, se preparar a formulação com um excesso de tampão, compreendendo, se for desejável outros constituintes opcional- mente proticos, tais como antibióticos, por exemplo= Os níveis preferidos de tampao se ecncontram na faixa de 0,5%-10% e se encontra, de preferencia, entre 1% e 5%, sendo o mais preferivel de aproximadamente 2-3% durante a fase de dissolucao. A fase de dissolucao compreende a dissolucao de pelo menos uma maioria do angelato de ingenol no solvente, e de preferencia pelo menos 95% peso de angelato de ingenol no solvente, sendo mais preferível pelo menos 99% peso/peso,

As formulações da presente invenção podem ser usadas diretamente, ou podem ser armazenadas para uso futuro. Além disso, as formulações da presente invenção podem proporcionar uma formulação base que pode então ser ainda mais modificada antes do uso. Conforme foi descrito acima, por exemplo, a formulação pode ser preparada cm um excesso de tampão ou pode ser formulada cm um gel, por exemplo.

Foi também descoberto que as formulações da presente invenção são geralmente mais estáveis a temperaturas mais baixas. As formulações especialmente preferidas da presente invenção, tais como as que compreende álcool benziIico e tampão citrato, podem apresentar uma estabilidade substancial a temperaturas de até 40°C, -mas, em geral, c observado um aumento da estabilidade a temperaturas abaixo da temperatura ambiente e pressão ambiente (RTP) e a estabilidade máxima c observada a temperaturas abaixo de aproximadamente 8°C. O congelamento não parece aumentar a estabilidade, de modo que, em geral, a estabilidade máxima é atingida simplesmente colocando-se as formulações da invenção cm um refrigerador convencional a uma temperatura entre aproximadamcníc 2°C e

A presente invenção propoe ainda um processo para a preparação de uma solução dc angelato de ingenol, compreendendo a dissolução do angelato de ingenol em um solvente aprótico farmaceuíicamente aceitável, compreendendo a formulação ainda uni agente acidifícanle farmaceuíicamente aceitável que é pelo menos parcialmente compatível com o solvente e com o qual se obtém as formulação com um pH aparente não acima de 4,5, sendo o ácido acrescentado junto com o angelato de ingenol, antes dele ou depois dele.

Em uma alternativa, a presente invenção propõe um processo para a preparação de uma solução de angelato de ingenol, compreendendo a dissolução do angelato de ingenol em um solvente aprótico farmaceuticamente aceitável, compreendendo o processo a adição de um agente acidificante farmaceuticamente aceitável que é pelo menos parcialmente compatível com o solvente e com o qual se obtém a formulação com um pH aparente não superior a 4,5, sendo o agente acidificante acrescentado simultaneamente com o angeiato de ingeno!, antes dele ou depois dele. O agente acidificante é, de preferencia, urn tampão.

E preferível se acrescentar o ácido, ou tampão, suficientemente cedo depois da adição do 13Λ para se assegurar que não mais de 1%, e de preferência, não mais de aproxima- damentc 0,5% da isoforma 'b' se rearranja na isoforma 'a'. E preferível que o ácido ou tampão seja acrescentado ao solvente antes de se acrescentar o I3A, embora os três ingredientes possam ser combinados ao mesmo tempo. Esta úilima c a opção menos preferida.

Este processo pode também ser usado para a preoaracão de formulações de ansclato de ineenol usando-se outros compostos e solventes, tais como polieiiieno glicol, cm que a solubiiização direta oode ser associada com uni nível inaceitável de rearranjo. Embora o I3A possa se dissolver em PEG, ele leva algo da ordem de uma hora a temperatura elevada, o que geralmente leva a geração de níveis inaceitáveis da isoforma ca\ Se o 13Λ for primeiro dissolvido ern álcool benziIico tarnponado, este pode então ser introduzido diretamente no PEG, sem a exposição prolongada a calor. Como basta uma quantidade suficiente de álcool benzílico para se solubilizar o Ϊ3Λ, então a quantidade total de álcool benzílico na formulação de PBG final só precisa se encontrar na faixa de 1% peso/peso ou menos.

Elstas formulações podem ser conservadas durante períodos prolongadas, especialmente quando conservadas a temperaturas de 8°C ou menos. Nas composições preferidas não se observa mais de aproximadamente 1% e de preferência não mais de aproximadamente 0,5% de rearranjos da isoforma 'b' na isoforma 'a' depois de 3 meses, sendo mais preferível 6 meses.

Propõe-se ainda o uso de uma formulação da invenção no tratamento de um câncer da pele.

A invenção também propõe o uso de angelato de ingenol na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um câncer da pele, em que o angelato de ingenol é dissolvido em um solvente apróüco farmaccutieamentc aceitável, compreendendo a formulação um agente acidificante farmaceuticamente aceitável que é pelo menos parcialmente compatível com o solvente e que produz uma formulação com um p 11 aparente não superior a 4,5.

Os cânceres adequados para o tratamento de acordo com a presente invenção incluem cânceres de células escamosas e baso-celulares.

Deve se observar que 'tratamento', conforme empregado no presente, inclui tanto terapia como profilaxia.

Λ presente invenção também propõe um método de tratamento de um paciente que sofre de uma condição de pele cancerosa que compreende a aplicação tópica de uma quantidade terapeuticamente efetiva de urna composição da invenção à área. da condição cancerosa.

Os pacientes adequados para o tratamento são mamíferos, incluindo seres humanos, primatas, animais de criação (incluindo bovinos, eqüinos, ovinos, porcos e caprinos), animais de companhia (incluindo cães, gatos, coelhos, cobaias), animais selvagens cativos e animais de laboratório, tais como coelhos, camundongos, ratos, cobaias e hamsters. As composições da presente invenção são especialmente adequadas para o tratamento de cânceres da pele em seres humanos.

Deve se observar que as formulações da presente invenção podem ser usadas cm qualquer profilaxia ou tratamento de câncer adequado. As formas de administração podem ser quaisquer adequadas e incluem cremes, géis, ungüentos, loções, pulverizações, Iacas c tintas para aplicação tópica, pós, soluções e suspensões para as vias aéreas, soluções e emulsões para injeção, cápsulas, xaropes e elixires para a administração oral e pessários e supositórios, Outras formas de administração adequadas serão evidentes aos versados na técnica- e podem incluir adesivos transdérmicos, por exemplo. Em uma modalidade preferida da presente invenção, as formulações de an gel ato de ingenol são preparadas para a administração tópica.

Em todos os casos a formulação inicial consiste em uma formulação da invenção. A formulação pode ser preparada na forma final ou imediatamente antes do uso tão logo seja desejado depois da preparação da formulação, mas geralmente continuará como uma formulação da invenção em todas as ocasiões.

As formulações podem compreender ingre- dientes adicionais, conforme será discutido abaixo. E especialmente pretendo se empregar antioxidaníes, uma vez que estes parecem proporcionar uma maior estabilidade às formulações. Exemplos adequados de antioxidantes incluem retinol, ácido ascórbico, licopeno, hidróxi tolueno butilado e

A quantidade de angelato de ingenol necessária oara a eficácia farmacêutica será aparente aos versados na técnica e pode ser adaptada de acordo com os parâmetros fisiológicos, tais como idade, peso e sexo do paciente, assim como as dimensões de qualquer lesão. Em geral pode ser empregada uma quantidade de angelato de ingenol adequada para proporcionar entre aproximadamente 0,01 μg cm^-2 a aproximadamente 1 mg cm^-2 sendo mais preferida a faixa de 0,1 mg cm^-2 a 100 μg cm^-2. Nos Exemplos apensos, foí usada uma formulaçao que fornece 15 μg cm^-2, mas foi constatado que formulações de 1 μg m-2 ou menos eram efetivas. Alternativãmente, as formulacaoes da invenção podem conter 13A cm uma quantidade de 0,001% (peso/peso) a 0,15% (peso/peso), sendo mais preferível de ate aproximadamente 0,1 -- 0,12% (peso/peso).

As formulações tópicas constituem uma modalidade preferida de presente invenção. Neste sentido, uma propriedade até agora desconhecida dos angelatos de ingenol e especialmente útil, pois foi descoberto que eles têm propriedades vasoconstritoras. Conseqüentemente, é minimizada a distribuição sistêmica do ingrediente ativo, devido ao fluxo sangüíneo reduzido na vizinhança do tratamento. Deve se observar que a natureza da formulação determinará a taxa de permeação através da pele. Por este motivo geralmente é preferido que a formulação seja preparada de modo tal que seja obtida uma taxa de permeação de pelo menos aproximadamente 11 ng cm"1 If1. Não existe um limite superior especial, embora se prefira, geralmente que este não exceda adamente 1 uc; cm'4 b"!.

As formulações tópicas podem assumir qualquer

forma adequada, Em gera! é preferível que elas apresentem algum nível de viscosidade, para que elas possam ser direcionadas a urna área desejada sem escorrer. Conseqüentemente, é em gera» preferível se formular o angelato de ingenol cm forma de cremes géis, ungüentos c pintura. Dada a potência do angelato de ingenol, podem ser empregadas pinturas, uma vez que elas podem ser aplicadas com moderação, dependendo dos níveis do ingrediente ativo.

Podem ser empregados poloxâmeros nas formu- lações preferidas da presente invenção. Eles são copolímeros que consistem em urna molécula de poloxipropileno hidrófobo (POP) entremeada entre duas moléculas hidrófilas de poloxietileno (POE). Portanto cies têm a capacidade de solubilizar drogas lioófilas no interior do núcleo hidrófobo, Além disso as formulações de gel aquosas à base de poloxâmeros apresentam propriedades termo-reológicas, o que pode ser vantajoso para o fornecimento localizado e sustentado de drogas. Acima de uma determinada temperatura, conhecida como a temoeratura crítica micelar (cmt), a viscosidade do gel de poloxâmero aumenta dramaticamente. Uni aumento na viscosidade leva a uma redução na difusão de qualquer droga dissolvida no gel que retarda a liberação da droga do gel e leva a um fornecimento sustentado. O aumento em viscosidade pode também proporcionar um "depósito" localizado prolongado no sitio de ação.

A cmt depende de uma série de variáveis tais como a concentração do poloxâmero e de outros aditivos tais como propileno glicol. O ideal é que a. ernt estivesse a uma temperatura tal que a formulação possa ser injetada na lesão em forma de uni líquido (facilidade de administração) e depois de contato com a temperatura corporal se formasse um gel com a Ilnalidade de se obter um fornecimento localizado sustentado do medicamento. Cinco poioxâmcros são relacionas na USP, e incluem, poloxâmero 188 e poloxâmero 407. O poloxâmero foi aprovado como um excipiente para formulações IV (http: //www.accessdata.fda.gov).

Os géis de poioxâmcros vem sendo usados para o fornecimento subeutâneo de insulina (Barichelio et al., 1999, c outros sistemas de fornecimento de drogas para uso percutâneo (Tobiyama et aL, 1994). Um copolímero específico, o poloxâmero 407, vem sendo administrado subeutaneamente para a liberação lenta de peptídeos e proteínas terapêuticas, que incluiam interleucian-2 e hormônio de crescimento humano (Morika et al., 1987; Katakama et al., 1997). Depois da administração, os géis lentamente liberaram as moléculas de proteína aprisionadas durante um período de 1-2 dias, Além disso, uma fração substancial deste poíoxâmero eventualmente sofreu excreção renal.

Os poloxâmeros são geralmente considerados materiais não tóxicos e não irritantes. Os estudos de toxicidade em animais, com cães e ratos mostraram que os poloxâmeros são não irritantes e não sensibilizantes quando aplicados cm concentração de 5% peso/volume e 10% peso/volume aos olhos, gengivas e pele. Em um estudo de 14 dias de administração intravenosa a coelhos, a concentrações de até 0,5 g/kg/dia, nenhum efeito adverso evidente foi observado. Urn estudo análogo com cães também não mostrou nenhum efeito adverso em níveis de dosagem de até 0,5 g/kg/dia. Além disso, não foi observada nenhuma hemóiisc de células de sangue humano durante 18 horas a 25°C, com soluções de poloxâmeros as 0,00 10% (peso/volume). (Wade c Weiler, 1994). No entanto, foi relatada hiperlipidemia em ratos quando foi introduzida uma injeção intraperitoncal (IP) (1,0 g/kg) de poíoxâmero 407 (Wasan et al, 2003).

Uleos podem também ser usados na presente invencao. O uso de umna formulação intralesional à base de emulsao foí tamoem relatado para o tratamento de psoriase (Ho et al., 1990). Antes da administração um veículo, tal como óleo de rícino polioxietilado é normalmente diluído com solução salina para formar a emulsão. No entanto, nossos estudos demonstraram que a com solução salina normal aumenta a conversão da isoforma 'b' na 'a'. Estas conversão pode ser minimizada se o tempo de administração da IbrmuIação for curto.

Há uma série de produtos lipófilos que são formulados em forma de soluções oleosas para administração intramuscular (ÍM), Enantrato de ProHxina (Brsstol Myers Squibb), por exemplo. O veículo (óleo) usado varia amplamente de óleos vegetais tais como óleo de amendoim (usado com benzoato de benziIa em injeção de Dimercaprol B.P.) e óleo de gergelim (usado em injeções de depósito de Injeção de Enantralo de Flufenazina B.P.). O uso de veículos oleaginosos pode retardar a absorção devido à distribuição retardada do medicamento em óleo nos fluidos corporais aquosos (For, 1987), Quando injetada em um ambiente aquoso (tal como o tecido muscular) uma droga relativamente lipófila como Í3A, dissolvida em uma fase oleosa, terá a tendência de não deixar o óleo e sc distribuir· "instantaneamente" pela fase aquosa. Deste modo pode ser obtido um efeito de liberação sustentada.

Formulações bucais podem também ser empregadas. O fornecimento transmucosal de agentes terapêuticos é uma forma de administração popular, pois as membranas mucosas são relativamente permeáveis, permitindo a rápida absorção de uma droga na circulação sistêmica e evitando-se que sc passe primeiro pelo metabolismo. Os produtos transmueosais podem ser projetados para serem administrados por via nasal e via oral/bucal usando-se mucoadesivos. NO desenvolvimento destes sistemas de fornecimento de drogas, a mucoadesão do dispositivo/formulação é um elemento chave. O termo "mucoadesivo" é habitualmente usado para materiais que aderem à camada de mucina de uma membrana biológica. Os polímeros mucoadesivos foram utilizados em muitas formas de dosagem diferentes no sentido de atingir o fornecimento sistêmico e localizado do medicamento através de mucosas diferentes. Estas formas de dosagem incluem comprimidos, adesivos, fitas, películas, serni-sólidos e pós.

Para servir conio polímeros mucoadesivos, os polímeros devem possuir características fisico-químicas tais como ser predominantemente aniônico com numerosos grupos formadores de ligação hidrogênio, propriedades superficiais adequadas para umectação de superfícies mucosas/tecidos mucosais e uma flexibilidade suficiente e um comprimento suficiente (peso molecular) para penetrar a rede de muco ou as fissuras teciduais. Diversas classes de polímeros foram relatadas como sendo potencialmente mucoadesivas tais como os carbômeros (ácidos poliacrílicos) hidróxi propil metil celulose (HPMC) assim como polímeros que ocorrem naturalmente, tais como o ácido hialurônico e quitosan.

A preparação de formulações adequadas incide nas habilidades dos versados na técnica e excipientes para inclusão em qualquer tal formulação incluem, por exemplo, gelantes, viscosificantes, intensificadores de penetração, conservantes tais como antibióticos e antifúngicos e ingredientes cosméticos, tais com fragrâncias e colorantes. Os agentes gelantcs adequados incluem: polímeros derivados de celulose hidrossoJúvel, tais com polímeros de hidroxialquil celulose (hidroximetil hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose e fm celulose, por exemplo), carbóxi metiI cel celulose e rnetil celulose, carbômero (carbopol, por exemplo); e carrageenanas. O agente geíante pode ser acrescentado em qualquer adequada quantidade, tal como de 1-5% (peso/peso). Os agentes preferidos são derivados de celulose, sendo o mais preferível hidroxialquil celulose, especialmente hidroxietil celulose.

Os conservantes adeauados serão evidentes aos versados na técnica e incluem os parabenos (rnetil, etil, propil e butii parabenos), ácido benzóico e álcool benzi licos. Os conservantes empregados somente para tal tira geralmente constituirão 1% (peso/peso)ou menos da frmulacao topica final.

Os intcnsificadorcs de penetração adequados incluem álcool Is sulfóxido.azonas suitoxiaos (tais como irocaprama, por exemplo), pirrolidonas (2-pirrolidona, por exemplo), alcanóis (decanol, por exemplo) e gSicóis (propileno glicol, por exemplo).

As composições preferidas da presente invenção compreendem:

b) intensificado!* de penetração;

c) conservarite; d) agente gel ante; e

e) tampão; em que a

lf*m um

um pH aparente entre

3 e 4, inclusive.

com oreende:!

Uma composição especialmente preferida

οΛ

0,1% (ρes?

b) 30% (peso/peso) de álcool isopropílico;

c) 0,9% (peso/peso) de álcool benzilico;

10 d) 2,5% (peso/peso) dc hidróxi cíil celulose; c

e) 67,5% (peso/peso) de tampão de citrato de pH 3, de preferencia de pH 2.,'75.

A invenção será agora descrita, fazendo referência aos Desenhos apensos em que: 15 Figura 1: usostra uma representação esquemática

de urna célula de Franz.

Figura 2: porcentagem da isoforma 4b' cm gel

30%/tampão

cie fi

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ntaecm oe

O

ΛΛ% a 2-8°C, RTP e ^

a

Ι3Λ 'b' ern álcool

mura 5: porcentagem de I3A "b1 cm fenóxi-

cJ> Ϊ O

Denziiico a

Figura 5

etanol a 100% a 2-8°C, RTP e 40°C.

Figura 6: mostra um fluxograma para a de 0,1% peso/peso de 13Λ Formulação 16 e o píacebo respectivo. *Para a formulação do placebo acrescentaram-se 0,25 g de álcool benzílico a 24,75 g de formulação de base.

Figura 7: valores relativos de G' e de G" para as Formulações 4, 14, 15, 16, e 17 (n = 5 ± desvio padrão).

Figura 8: valores de tan d correSj as Formulações 4, 14, 15, 16 e S 7

Figura 9: Gráfico da quantidade media liberada depois de 26 horas (µg/cm2) de I3A 'b' a partir de formulacoes gel de poloxamero a 0,1% peso/peso e PEG 400 (n = 3 ± crro padrão).

Figura 10: gráfico da quantidade media liberada depois de 26 horas (µg/cm2) de 13A 'b' de formulações em óleo a 0,1% peso/peso e PEG 400 (n = 3 ± erro padrao).

A presente invenção será ainda ilustrada r tocante aos Excmoios não Iimitantes abaixo

EXEMPLO 1

A estabilidade de I3A foi investigada em diversos sistemas de solventes, incluindo acetona, acelonitrila,

es de fosfato (pH entre 4,5 e 7) e tampão de amônio (pH 4,5) e mostrou ser estável em acetona, acetonitrila, DMSO, tampão fosfato de pH 4,5 e tampão de amônio (pH 4,5). O rearrartjo do angelaío dc ingenol parece ocorrer na ordem do isôracro 'b' rearranjando-se em isômero 'a' e em seguida no isômero *c\ Devido às pequenas quantidades dc substância ativa usadas, a medida da estabilidade do composto foi calculada como a relação da área de pico 'b' para a área de pico 'a'.

MATERIAIS

Tabela 1. Fornecedores de materiais usados neste Exemplo

<table>table see original document page 25</column></row><table> Todos os excipientes usados na formulação final de I3A de categoria compendial

MÉTODOS

Estudo de estabilidade de I3A em solventes/cxcipientes

Um estudo de estabilidade de T3A nas combina- ções abaixo de solvente/excipientes/excipiente foi conduzido durante 14 dias (exceto onde é declarado em contrário) à temperatura ambiente:

Acetona

Acetonitrila

Metanol

Metanol/água (70/30) Água

Tampão de Fosfato pK 4,5, píl 5,5, pH 6,5, pH 7,0

Oleo minerai

Migliol 810

Polietileno glicol 300

Propileno glicol

Ácido oléico

pH 4,5)

2-Hidroxipropil-p-ciclodextrina (CavasorkVH2O)

2-Hidroxipropil-p-ciclodextrina (Cavasol®/PO.

Tween 80/Span 80/H2O

Tween 80/Span 80/PO,, pH 4,5 Eter β-ciclodextrino-sulfobutílico (Captisol®)/

H2O **

Eter β-ciclodextriíio-sulfobutilico (Captisol®)/ PO4 ρΗ 4,5**

Hialouronato dc sódio (ΗA)/ΡO4 ρΗ 4,5***

Hialuronato de sódio (HA)/H2O ρΗ 4,5***

* estudo de 10 dias ** estudo de 7 dias *** estudo de 2 dias

Foi. preparada urna solução de estoque de 0,5 mg/mL de Ϊ3Λ em acetonitriía. Transferiram-se alíquotas de 1,0 mL para frascos de amostra de vidro individuais por uma bureía; secaram-se as soluções por jato de ar e em seguida acrcsccntou-sc 1,0 g da combinação de solvente/excipicntc/cxcipiente respectivos aos frascos. NO dia 0, dia 5 e dia 14 foram removidas alíquota das amostras de estabilidade para análise por HPLC usando-se as condições cromatográficas descritas em "Estabilidade em DMSO", abaixo. A estabilidade foi expressa como a relação do pico 'b' para o pico 'a' (e pico V se este estiver presente), indicando uma relação alta a estabilidade em um excipiente especifico.

Análise por HPLC para a estabilidade de I3A em estudo de excipientes

Um método alternativo de HPLC foi desenvolvido a fim de se separar um "degrau" que apareceu no pico 'b' e que foi observado com algumas preparações de I3A. As condições cromatográflcas empregadas para o estudo de estabilidade foram as seguintes:

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Estudo preliminar de difusao in vitro

Uma vez estabelecida a estabilidade de I3A nos excipientes e nos intensificadores de penetracao, poderia ser conduzida um experimento preliminar de difusao in vitro para se determinar a permeacao do estrato corneo por I3A a partir de algumas formulacoes simples. A celula de difusao de Franz e projetada para imitar as condicoes fisiologicas e anatomicas da pele in situ. Ela consiste em uma celula estatica de ar/fase fluida que compreende um compartimento de doador, compartimento de receptor e um orifício de amostragem de braço lateral(veja Figura 10). A pele cirurgicamente excisada e posicionaoa entre as doas metades do estrato córneo voltado para o compartimento de doador para permitir a aplicação do medicamento.

Foi conduzido um experimento de difusao inicial in vitro usando uma formulaçao simples de 13A em migliol. Não havia nenhum fluxo do medicamento através do estrato córneo sugerindo que o BA não foi formulado na sua atividade termodinâmica máxima no migliol. Esia formulação foi usada em experimento de células de difusão posteriores como um controle negativo e também serviu para confirmar a integridade do estrato córneo, uma vez que se não há nenhuma difusão do medicamento desta formulação, pode-se presumir que o estrato córneo permanece intacto

Fabricação das formulações

Preparou-se uma formulação de 13 A em tampão de fosfato (pH 4,5) com β-ciclodcxtrinas (Captisorly) acrescentado visando-se aumentar a solubilidado e a estabilidade de Ϊ3Α, c o fluxo do medicamento. Uma segunda formulação cm DMSO, um ensifícador de penetração conhecido foi também preparada para fíns comparativos, assim como um formulacao em migliol, que serviu como um controle negativo. A difusão de Ϊ3Α peio estrato córneo a partir destas formulações foi investigada.

Foram preparadas as seguintes formulações: Formulação

<table>table see original document page 30</column></row><table>

A tabela 2 mostra a% peso/peso de cada um dos ingredientes presentes nas formulações. Os ingredientes foram pesados com precisão para dentro de frascos de vidro íacráveis e agitados vigorosamente coro um agitador magnético durante diversas horas à temperatura ambiente. Tabela 2. Formulacao de 13A para estudo de difusao in vitro

<table>table see original document page 31</column></row><table> Escolha de fluido receptor 2-Hidroxipropil-β-ciclodextrina (Cavasoi®, 1,38 mM) em tampão de PO4 (pH 4,5) foi o fluido receptor usado neste estudo a fim de se tentar conservar as condições de coleta. Impôs-se a restrição a outros fluidos reservatórios tais como sistemas de etanol/água pois a "retro difusão" de etanol através do estrato córneo poderia degradar o I3A presente nas formulações.

Preparação da pele

Uma amostra fresca excisada cirurgieamente de pele humana foi obtida diretamente depois de uma abdominoplastia. O doador foi uma mulher de 56 anos não fumante européia branca. A gordura subcutânea foi cuidadosa- mente removida da amostra de pele usando-sc íórccps e um bisturi, sendo então a porção de pele imersa em água a 60°C durante 45 segundos. A pele foi então presa com alfinetes, o lado da derme para baixo, sobre unia placa de cortiça e a epiderme (compreendendo o estrato córneo e a epiderme viável) foi gentilmente removida da derme subjacente. A derme foi descartada e a membrana epidérmica Outuois sobre a superfície da água e foi apanhada sobre papel de filtro Wliatnian no. 1. A folha epidérmica resultante foi exaustivamente secada e armazenada chata em lâmina de alumínio a -20°C ate ser usada.

Unia seção da folha epidérmica (com o papel de filtro voltado para cirna) foi grampeada e incubada durante 4 horas a 4°C imersa em solução de tripsina a 0,1% peso/volume. A pele foi então ainda mais incubada durante 1 hora a 37°C. O estrato eórneo foi fisicamente removido por agitação suave do grampo com movimentos laterais. A camada de estrato eórneo resultante foi lavada duas vezes com água deionizada e em seguida com solução antitripsina a 0,1% peso/volume para bloquear a atividade enzimática e foi ainda lavada duas vezes com água deionizada. O estrato eórneo foi secado e armazenado chato em lâmina de alumínio a -20°C até ser usado.

Estudo de difusão em células de Pranz

Células de difusão de Franz calibradas individu- almente com uma área de superfície difusional média de 0,56 ± 0,05 cm" e uma volume receptor médio de 1,79 ± 0,06 mL foram usadas para a condução dos experimentos de di/usâo. O estrato eórneo (preparado conforme descrito acima) foi lavado com tampão de fosfato (pH 4,5), cortado com um furador de 10" e montado sobre células de Franz (ilustradas na Figura 1). O Huido receptor empregado foi 2-hidróxi propil-β-ciclodextrina (Cavasol3Vtampao de fosfato (pH 4,5) e cie foi incorporado às células de Franz, agitado constantemente com um agitador magnético e mantido a 37°C. Deixou-se que as membranas se equilibrassem com a fase receptora, durante 30 minutos antes de se aplicar as formulações. Unia dose infinita de cada formulação foi aplicada sobre a superfície da membrana usando uma Finpipette® de deslocamento positivo e as câmaras doadoras foram protegidas com Parafilm®. Cinco tempos de amostragem foram investigados (1, 2, 4, 6 e 24 horas), em que 200 μΐ, do fluido receptor foram cuidadosamente extraídos do braço da célula de Franz; cada amostra removida foi substituída por um volume igual de fluido receptor fresco (37°C). Durante todo o experimento, quaisquer perdas no fluido receptor devidas a evaporação da célula de Franz foram substituídas para se manter um volume constante. As amostras Soram analisadas por HPLC (acima).

Análise por HPLC para estudo de difusão in vilro

As condições cromatográ ficas empregadas foram as seguintes:

<table>table see original document page 34</column></row><table> Resultados

Estabilidade de I3A em solventes c cxcipientcs

A Tabela 3, abaixo, fornece urna indicação de estabilidade de I3A nos diversos sistemas de solventes. A estabilidade de I3A nos solventes e cxcipientes depois de 14 dias (a não ser que seja declarado era contrário) à temperatura ambiente foi quantificada em termos da relação da isoforma 'b' para as isoformas 'a' e V com uma predominância de 'b' correspondendo a estabilidade. Os resultados são resumidos na tabela 3. Presume-se que para um excipiente cm que I3A não é estável, outros excipientes semelhantes não serão adequados

Tabela 3. Sumário dos resultados do estudo de estabilidade de I3A em diversos solventes e excipientes

<table>table see original document page 35</column></row><table> <table>table see original document page 36</column></row><table>

* estudo de 10 dias ** estudo de 7 dias *** estudo de 2 dias Estudo de difusão in vitro

A Tabela 4 fornece uma comparação do 'fluxo entre formulações de Ι3Λ conforme determinada a partir da quantidade cumulativa de 13A permeada por área unitária. DMSO é um dos primeiros e mais amplamente investigados intensificadores de penetração e foi mostrado que intensifica a penetração percutânea de muitos medicamentos in vitro e em experimentos in vivo. Por este motivo, DMSO foi um excipiente comparador útil para confirmar a penetração do estrato córneo por 13A. NO entanto, devido à natureza extremamente tóxica deste solvente e ao fato de que ele produz dano irreversível à pele. DMSO nao seria usado em uma formulacao final. Nenhuma permeaçâo de 13A foi observada com a formualacao de migliol. Uma explicação possível para esta falta de difusão de I3A do rniglioi através do estralo córneo c que Ι3Λ c extremamente solúvel neste excipiente.

Tabela 4. Comparação do fluxo entre formulações de Ι3Λ conforme determinado a partir da quantidade cumulativa de 13A permeada por área unitária, (média ± erro padrão médio, η 3 e 4, respectivamente).

<table>table see original document page 37</column></row><table>0,6 i ±0,13 Os resultados mostram que I3A se difunde através do estrato córneo (que forma a principal barreira para a difusão da maioria de medicamentos) a níveis detectáveis.

Estudo de estabilidade a 4-8°C

A estabilidade de I3A em diversos solventes a 4-8°C foi investigada. Uma solução estoque de 1,26 mg de 13 A foi pesada e dissolvida em 2 mL de acetona. Esta solução de estoque foi usada para a preparação de mostras dc estabilidade conforme segue:

Alíquotas de 100 μL de solução de estoque foram transferidas para frascos individuais de HPLC de vidro por uieio de uma seringa de Hamilton, com um cnxágüe e secagem cuidadosos da seringa entre cada duas amostras. As amostras foram secadas por jato de ar e em seguida acrescentados 0,5 mL do solvente de teste apropriado. Os sistemas de solventes foram testados em triplicata e estão relacionados abaixo;

1. 100% volume/volume dc acetona

2. 100% volume/volume de acetonitrila

3. 100% volume/volume de metanol

4. 70% volume;/volume de metanol;30% peso/peso de água

5. 100% peso/peso de água

Amostras vazias foram também preparadas em triplicata usando-se 100 μL de acetona em vez da solução de estoque. As amostras vazias foram então secadas e acrescentou-se 0,5 mL de acetona a cada frasco. Os frascos foram todos lacrados, vedados com parafilm® e colocados a 4-8°C durante o estudo de estabilidade. A análise por HPLC foi conduzida nas amostras no Dia o, Dia 1, Dia 5 e dia 14 do estudo de estabilidade. As amostras foram preparadas para o ensaio conforme descrito abaixo:

As amostras de estabilidade foram removidas de 4-8°C e deixadas à temperatura ambiente durante 30 minutos. Alíquotas de 100 μL foram transferidas para frascos de vidro frescos para HPLC usando-sc unia seringa Hamilton, com uma cuidadoso enxágüe e secagem da seringa entre cada duas amostras. Para facilitar a secagem das amostras, acrescentaram-se 0,5 ml de acetona a cada frasco, sendo então as amostras secadas com jato de ar. As amostras foram reconstituídas com 1 ml de acetonitrila e analisadas por HPLC usando-se as condições cromatográficas especificadas acima.

Portanto, Í3A é estável em acetona e em acetonitrila a 4-8°C, conforme refletido na predominância de pico 'b' para os dois solventes durante os 14 dias. Nos solventes próticos, a formação do isômero 'a' c em seguida do isômero tC5 aumenta rapidamente.

Estabilidade a diversos pH

A estabilidade de 13A foi investigada a pH 4,5 em dois tampões, isto c, corn fosfato monopotássico/fosfato dissódico e ácido acéfico/acetalo de amônio durante 24 horas à temperatura ambiente. A análise por HPLC mostrou que 13A é estável nos dois tampões a pH 4,5, isto é, continua a haver a predominância da isoforma 'b' (Figura 1) depois de 24 horas. A estabilidade de BA foi investigada a pH 5,5, 6,5 e 7,0 durante 1.4 dias à temperatura, ambiente, e foi descoberto que se reduz com um aumento em pH, isto é, a formação da isoforma 'a' e subseqüentemente da iso forma V ocorre no Dia 14.

Estabilidade em DMSO

investigado para estabilidade em DMSO à temperatura ambiente e a 37°C durante um período de 10 dias. IJma amostra de controle de 13A em acctonitrila foi mantida nas mesmas condições que a amostra de leste, As amostras foram analisadas por HPLC no inicio do experimento Dia 0), depois de 48 horas (Dia 2|) e novamente depois de 10 dias,

<table>table see original document page 40</column></row><table> Volume de injeção: 10 tuL

Duração do teste; 35 minutos

Tenipo de retenção: 15 minutos, 24 minutos

Ι3A parece ser estável em DMSO à temperatura ambiente e a 37°C durante 10 dias.

EXEMPLO 2

Gel de isopropanoL Ph 6,5

A estabilidade de 13a 'b' ern uma preparação de gel de isopropanoL (pH 6,5) foi investigada. O protocolo foi o seguinte:

Composição do gel de isopropano) (pH 6,5 )

<table>table see original document page 41</column></row><table>

O carbopol R foi disperso na água e gliecrina e dissolvido aquecendo-se até 40°C em um banho-maria. O álcool propílico foi então acrescentado a esta solução. A ciciometicona foi dissolvida no álcool isopropílico e esta segunda solução foi bem misturada com a solução de carbopolR, sendo então acrescentada a água, com agitação até 100%. O pH do gel foi levado a 6,5 com a adição gota a gota de etanolamina, O gel de isopropanol foi armazenado a 2-8°C até ser usado.

Para se investigar a estabilidade de OA 4b' em gel de isopropanol (pH 6,5) foi preparada urna formulação de 0,02% (peso/peso) de 13A 'b'/gel de isopropanol c dividiu-se em três amostras para armazenagem a 2-8°C, RTP e 40°C. Á pontos regulares no tempo, as amostras foram analisadas em duplicata para a estabilidade de BA5IV em termos da formação da isoforma 'a', sendo os resultados dados na figura 2. 13A'b' se rearranja na isoforma 'a' e subseqüentemente na isoforma 'c' Isto pode· possivelmente ser atribuído ao pH mais alto e à presença de gel de isopropanol facilitando esta conversão de 13A 'b' nas isoformas 'a' e 'c'.

13A*b' em 30% peso/peso de álcool ísopropílico/tampão de citrato pH 3.0

A estabilidade de 13A 'b' (Lote no. 240902) em 30% peso/peso de IPA/tampão de citrato (pH 3) quando armazenado a 2-8°C e a 40°C foi investigada em duplicata, sendo os resultados dados na Figura 3.

Conservantes

Diversos conservantes foram investigados para a sua adequacidade para uso nas formulações de 13A 'b' a concentrações capazes de passar um teste dc eficácia do conservante. Inicialmente os conservantes foram preparados em tampão de citrato (pH 3) e analisados por HPLC para verificar a presença de picos nos cromatogramas que pudessem interferir no ensaio para isoformas de 13A. Os resultados estão resumidos na

Tabela 5

Tabela 5. Análise de coaservantes por MPLC

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Não é desejável se ter muitos picos que interferissem nos cromatogramas a partir dos conscrvantes, uma vez que isto leva a dificuldades na análise do medicamcnío cm formulações c poderia precisar da introdução dc um ensaio separado para os conscrvantes.

Dissolveu-se 13A 'b' (0,05% peso/peso) separadamente nos conservantes selecionados(alcool benzilico e fenóxi etanol), armazenou-se a 2-8°C, RTP e 40°C e vcrificou-se a te em duplicata cm termos da formação da isoforma 'a' a intervalos regulares. Os resultados deste estudo de estabilidade são dados nas Figuras 4 e 5.

Os resultados indicam que o álcool benzílico é o conservante mais adequado dos testados.

Preparação de Formulações de 13A 'b'

As três formulações abaixo e seus placebos respectivos foram preparados:

A. 0,1% (peso/peso) de Í3A 'bVcreme de éter maerocetílico com 1% (peso/peso) de álcool benzílico como conservante

B. 0,1% (peso/peso) de 13A 4bV30% (peso/ peso) de 1PA/1,5% (peso/peso) de HEC/!,0% (peso/peso) de álcool benzílico/citrato ρ Fi 3.

C. OJ% (peso/peso) de 13A lb'/9,5% (peso/ peso) de ciclometicona/ 9,5% (peso/peso) de IPM/1,0% (peso/ peso) de álcool benzílico/Elasíômero 10

Uma solução de estoque de I3A 'b' foi preparada em álcool benzílico (Tabela 6) e este estoque foi usado para preparar as formulações. Para os placebos foi usado o álcool benzílico sozinho em vez do estoaue de 13A 'bVálcool benzílico, As massa precisas dos componentes das formulações de 13A 'b' estão relacionadas nas Tabelas 7-98. As formulações e seus placebos respectivos foram preparados do seguinte modo:

Fórmula A: 13A cb Vcreme de éter maerocetílico

O ungüento emulsificante de éter maerocetílico foi pesado com precisão para dentro de tnn frasco de vidro e em seguida fundido em um banho-maria a 60°C. Tampão de citrato recém-preparado (pH 3) foi pesado com precisão para dentro de um frasco de vidro separado, aquecido no banho-maria e em seguida gradualmente incorporado ao ungüento emuIsiflcante fundido com uma agitação constante até se resfriar. Este processo produziu o creme de éter macrocetílico. Para se preparar a formulação, pesou-se com precisão OA '"b5 em álcool benzíiico para dentro de um frasco de vidro e o creme de éter macrocetílico foi pesado gradualmente e com precisão sobre esta, com uma agitação constante.

Formulação Β: 13A 1)730% de ReI de IPA

O 13 A 'bVálcool benzíiico foi pesado com precisão para dentro de um frasco dc vidro, Os componentes restantes foram pesados com precisão sobre esta solução na ordem de ÍPA, em seguida tampão de citrato e finalmente HEC, com uma mistura vigorosa entre cada duas adições.

Formulação C: BA 'b'/silicones

O 13A 'bVálcool benzíiico foi pesado com precisão para dentro de um frasco de vidro. Os componentes restantes foram pesados com precisão soSire esta solução na ordem de Elastômero 10, em seguida ciclometicona c em seguida IPM, com uma. mistura vigorosa entre cada duas adições.

Análise da Formulação

As formulações foram analisadas no início do 25 estudo para confirmar a concentração de Ϊ3Α 'b' (peso/peso) nas formulações e foi constatado que era de aproximadamente 0,1% (peso/peso) de 13A 'b\ Deste teor total de OA 'b\ havia menos de 0,7% da isoforma 'a' e nenhuma, isoforma 'c' nas formulações. As formulações tiveram verificado o aparecimento da ssoforma 6a' na ocasião da conclusão do estudo c foi demonstrado que havia menos de 0,3% de isoforma 'a' quando se armazenou a 2- 8°C. A isoforma 'c' não foi detectada cm nenhuma das formulações. <table>table see original document page 47</column></row><table> Tabela 8

<table>table see original document page 48</column></row><table> Tabela 9. Formilacao C.

<table>table see original document page 49</column></row><table> Estabilidade de isoformas de BA nos sistemas de solventes de ensaio durante 72 horas A estabilidade de isoformas Ϊ3Α 'a', Ίτ e 'c' nos três sistemas de amostras durante 72 horas (equivalentes à duração máxima possível que as amostras poderiam ser mantidas no auto-amostrador durante um teste analítico de HPLC prolongado) foi confirmada do seguinte modo. Prepararam-se padrões de três isoformas de Í3A (aproximadamente 100 μ^ιτιί) em acetonitrila, acetonitrila/tampão de citrato (pH 3) e acetonitrila/tampão de acetato de amônio (píí 4,5 e analisou-se imediatamente por HPLC. Cada um dos padrões foi então dividido em três volumes iguais e colocado a 2-8°C, à temperatura ambiente e a 40°C durante 72 horas e foram então novamente analisados por HPLC. Os resultados deste estudo estão apresentados na Tabela. 10. A conversão máxima de Ϊ3Λ eI)' na isoforma 'a' à temperatura ambiente ocorreu com a amostra preparada em 100% volume/volume de acetonitrila ao passo que o padrão de Í3A 'b' em acetonitrila/citrato (pH 3) apresentou uma conversão muito reduzida na isoforma 'a' mesmo a 40°C, sugerindo que este sistema de solvente poderia ser o mais adequado para se assegurar que as amostras permanecem estáveis durante o tempo de amostragem. Tabela 10

<table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table> EXEMPLO 3 Um estudo de estabilidade de pH de I3A 'b' em géis de IPA preparados com tampão de citrato entre os limites de pH 2,5 e 4,0 foi conduzido a 2-8°C e a 40°C (estabilidade âcelerada)

MATERIAIS

<table>table see original document page 53</column></row><table>

METODOS

Preparação de géis de 13A 'b' e placebos usando-se tampão de citrato entre os limites de pH 2,5 e 4,0, As composições dos géis de IPA ativos e placebos preparadas para o estudo de estabilidade dentro dos limites de pH, são dadas nas Tabelas 11 e 12 respectivamente. Grandes quantidades de placebo foram preparadas para facilitar a medição do pH dos géis de placebo no Tempo 0. Quantidades menores do gel ativo, isto é, 30 g de cada foram preparadas, uma vez que a quantidade de medicamento disponível para o estudo era limitada. Estudos de estabilidade anteriores conduzidos com o gel de 13A IPA em que o pH aparente do placebo e o do gel ativo foram monitorados durante 12 meses, mostraram que não houve nenhuma diferença perceptível entre os dois. Além disso, o mesmo pH aparente foi medido tanto para o gel ativo como o de placebo. Deste modo, somente o pH dos géis placebos foi medido, para se determinar o pH aparente dos géis no início do estudo de estabilidade. Depois se hidratar de um dia para o outro, os géis foram analisados para o ponto no tempo T = 0 e os valores de pH aparente dos placebos foram medidos. As amostras foram divididas igualmente em frascos de vidro de soda de 7 mL para se evitar a ciclização térmica do material quando se extraíam as amostras em pontos diferentes de tempo e os frascos foram armazenados a 2-8 °C e a 40°C (estabilidade acelerada), respectivamente. TABELA 11

<table>table see original document page 55</column></row><table> Tabela 12. Composicao de geis de IPA placebos preparados com tampao de citrato limites de pH de 2,5 a 4,0

<table>table see original document page 56</column></row><table> A medição do pH aparente de géis de placebo de IPA preparados usando-se tampão de citrato nos limites de pH de 2,5 a 4,0.

O pH aparente dos géis de IPA placebo preparados usando-se tampão de citrato nos limites de pH de 2,5 a 4,0 foram medidos usando-se um medidor de pH Jenway 3320.

Extração de I3A dos géis de IPA.

A droga foi extraída dos géis de ΪΡΑ do seguinte modo. Um grama de cada um dos géis ou dos seus placebos respectivos foi pesada com precisão para dentro de um frasco volurnétrico de 10 mL em duplicata ou triplicata. As amostras foram primeiro misturadas com 1 mL de tampão de citrato (pH 3) por mistura vigorosa e repetitiva em um misturador de ciclone ajustado para a velocidade máxima, deixando-se então se agitando em um agitador orbital durante 30 minutos a 400 rpm. Os frascos volumétricos foram então preenchidos até a marca de volume com acetonitrila de categoria HPLC e as amostras foram novamente submetida a mistura vigorosa por mistura repetitiva em um mistura de ciclone ajustado para a velocidade máxima, sendo então deixadas se agitando em um agitador orbital durante 60 minutos a 400 rpm. Alíquotas foram transferidas para frascos de HPLC para análise.

A extração de 13A do gel foi conduzida em triplicata, isto é, foram feitas três dosagens separadas com injeções em duplicata para os pontos no Tempo 0 e Tempo = 3 meses (amostras de 2-8°C) e em duplicata, isto é, duas dosagens separadas com injeções em duplicata para o Fempo = uma semana e quatro semanas (amostras a 40°C).

Análise por HPLC

A análise foi conduzida usando-se os sistemas e condições abaixo:

<table>table see original document page 58</column></row><table> Fase móvel: 50% volume/volume de tampão de acetato de sódio pH 4,5/50% volume/ volume de aceíonitrila

Taxa de fluxo: 1,0 mL/min

Comprimento de onda de UV: 230 nm

Volume de injeção: 30 μL

Duração do teste: 35 minutos

Temperatura do auto-amostrador: S0C ± 2°C

Tempos de retenção: 13 minutos ± 2 minutos isoforma 'as'; 22 minutos ± 2 minutos isoforma 'b'; 23 minutos ± 2 minutos isoforma V; pico não atribuído com tempo de retenção relativo para isoforma 'b' de 0,93 ± 0,02.

RESULTADOS

Medição do pH aparente dos géis placebos no Tempo 0

Os resultados para a medição do pH aparente dos géis placebo são dados na rFabela 13. Não foram feitas medições de pH em nenhum dos pontos no tempo de estabilidade.

Tabela 13. Medição do pH aparente de géis de IPA placebos (η = 1)

<table>table see original document page 59</column></row><table> Determinação da porcentagem de ρurezas de pico cie isoformas de I3A nos géis ativos

A porcentagem de ρurezas de pico de I3Α 'b' nos géis ativos no início do estudo de estabilidade (T-0) e depois de lima semana de armazenagem a 40°C, quatro semanas de armazenagem a 40°C, e depois de três meses de armazenagem a 2-8°C, são dadas nas Tabelas 14, 15, 16 e 17, respectivamente. A porcentagem, de pureza de pico de 13A 'b' era superior a 98% ao passo que a porcentagem de pureza de pico da isoforma 1 'a' era inferior a .1,2% para todos os géis depois de três meses de armazenagem a -28°C. Para o estudo de estabilidade acelerada a 40°C, a redução máxima na porcentagem de pureza de pico de 'b' durante as quatro semanas foi observada com o gel com o valor de placebo aparente de 4,74, Como 13A 'b5 mostrou converter na isoforma 'a', a formação de isoforma 'a' foi também examinada como um marcador de estabilidade. Foram calculados os aumentos na porcentagem de purezas de pico de isoforma 'a' a partir do Tempo 0 depois de armazenagem de uma semana c de quatro semanas a 40°C, c depois de três meses a 2-8°C, sendo os resultados dados na tabela 18. Tabela 14. Porcentagem de purezas de pico de isoformas de 13A nos géis ativos (n = 3, média ± desvio padrão, UAP = pico sem atribuição, RRT = tempo de retenção relativo) no Tempo Q

<table>table see original document page 61</column></row><table>

Tabela 15. Porcentagem de purezas de pico de isoformas de Ι3Λ nos géis ativos (n - 3, média ± desvio padrão, UAP = pico sem atribuição, RRT = tempo de retenção relativo) depois de uma semana de armazcnagem a 40°C.

<table>table see original document page 61</column></row><table> Tabela 16. Porcentagem de purezas de pico de isoformas de I3A nos géis ativos (n = 3, média ± desvio padrão, UAP = pico sem atribuição, RRT = tempo de retenção relativo) depois de quatro semanas de armazenagem a 40°C

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Tabela 17. Porcentagem de purezas de pico de isoformas de I3A nos géis ativos (n = 3, média ± desvio padrão, UAP = pico sem atribuição, RRT = tempo de retenção relativo) depois de três meses de armazenagem a 2-8°C

<table>table see original document page 62</column></row><table> Tabela 18. Aumento calculado em porcentagem de purezas de pico de isoforma 13A 'a' a partir do Tempo Q nos géis de IPA

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Os dados sugerem que o pH tem um efeito sobre a formação da isoforma 'a', mesmo quando o gel está armazenado a 2-8°C durante 3 meses. Urn aumento na porcentagem da área de pico da isoforma 'a' de 0,21% foi medido com o gel preparado com tampão de citrato de pH 3,00 em comparação com um aumento de 0,44% na porcentagem de área de pico da isoforma 'a' para o gel preparado com tampão de citrato de pH 3,5. Depois de T = 4 semanas a 40°C, as diferenças entre os géis em termos dos aumentos na porcentagem de purezas de pico da isoforma 'a' foram amplificadas. EXEMPLO 4 Formulações em Oteo MATERIAIS

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Selecao de oleos/ excipientes adequados Oleo de gergelm, oleo de coco francionado (triglicedeos de cadeia media), oleo de soja, oleo de milho e oleo de amendoim foram identificados corno veículos para a administração parenteral. Cada um deles pode ser usado ate um nível de 100%. Outros excipientes que podem ser incluídos cm formulações em óleo parenterais são mostrados abaixo, junta- mente com. as concentrações máximas usadas.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Preparação de formulações de I3A e placebo para estudos preliminares de estabilidade

Esterilização do óleo dc coco fracionado

Aproximadamente 50 g do óleo de coco (CRODAMOL GTC/C) foram dosados para dentro dc um frasco cônico de 100 mL (vidro de borossiiicalo), fechados (rolha de vidro de borossiiicalo) e foram colocados dentro de um Forno pré- aquecido (forno GatlenkaiTipf Hot box Oven com ventilador, Tamanho 2) a 173 ± 5°C durante 1 hora, Depois deste procedimento, deixou-se o óleo se resfriar até a temperatura ambiente antes do uso

Adicao de I3A ao oleo esterilizado Aproxidamenie 10 mg de I3A foram pesados com precisão para dentro de um frasco de vidro de 2 acrescentados a aproximadamente 200 mg de álcool benzílico (observou-se o peso exato), que tinha sido anteriormente filtrado através de um filtro MiLLFiX-GV de 0,22 μm. Hsta mistura foi periodicamente colocada em um ciclone durante aproximadamente 2 horas até o Í3A ter se dissolvido no álcool benzilico. A esta mistura acrescentaram-se aproximadamente 9,79 g do óleo esterilizado e passaram por ciclone durante 5 minutos aproximadamente até ser obtida uma solução homogênea. O ρlacebo foi preparado de modo análogo exceto que foi usado 9,80 g (e não 9,79 g) do óleo esterilizado (observou-se o peso exato) para compensar o 13A. Os pesos e porcentagens exatos das composições são mostrados na Tabela 19 e 20 para a formulação de ingrediente ativo (13A) e de placebo.

Tabela 19. Quantidades alvo c reais (e% peso/peso") para a formulação de 13A em óleo

<table>table see original document page 66</column></row><table>

* Arredondado até 3 d.p. Tabela 20. Quantidades alvo e reais (% peso/peso) para a formulação de placebo em óleo

<table>table see original document page 67</column></row><table>

* Arredondado até 3 d.p.

Condições dc armazenagem para formulações de 13A c placebo

Alíquotas de cada formulação (placebo ou ativa) foram dispensadas em frascos de vidro âmbar de tampa aparafusada de 2 mL (vidro de borossilicaío), vedadas e armazenadas nas duas condições de armazenagem, a 2-8°C e a 25 ± 2°C. As formulações foram testadas usando-se o método descrito abaixo em tempos de armazenagem dc até inclusive um mês

Estabilidade preliminar de 13A cm óleo de coco fracionado

A Tabela 21 resume a estabilidade de 13A em óleo de coco fracionado armazenado a 2-8°C c a 25°C durante 43 dias. Os dados de estabilidade indicam que parece não haver nenhum aumento na porcentagem da isoforma 'a' durante armazenagem a 2-8°C e 25°C depois de 43 dias, comparável à porcentagem da isoforma 'a' proveniente de um lote fresco de 13A a t = 0 e t = 43 dias. Tabela 21. A porcentagem da isoforma 'a' como uma porcentagem da isoforma 'a' e I3A 'b' armazenadas nas duas condições durante 43 dias

<table>table see original document page 68</column></row><table>

RESULTADOS Não foi observada nenhuma diferença significativa (p>0,05) na área de pico e no tempo de retenção de isoformas 'a5 e 'b5 de BA entre as amostras injetadas em acetonitrila ou acetonitrila/óleo.

Da lista de óleos disponível dois foram considerados adequados para a formulação de 13A, a saber, óleo de coco fracionado e óleo de gergelim. A esterilização recomendada de óleo de gergelim é de 2 horas a 170°C, ao passo que para o óleo de coco fracionado era de 1 hora a 170°C. Isto tem vantagens no tocante à quantidade de tempo e energia gastos preparando-se a formulação. Devido à instabilidade de BA a calor (provado experimentalmente, dados não apresentados), o óleo tem que ser esterilizado separadamente e o 13A acrescentado assepticamente (filtrado) era forma de uma solução dissolvida em álcool benzílico. Um meio de filtro foi identificado como sendo adequado para a fi I tração da mistura de Í3A/álcool benzílico, mais exatamente, um filtro MILLEX-GV de 0,22 μιη, no entanto a adsorção de BA sobre a membrana do filtro ainda exige investigação. Se for desejado, devido a uma viscosidade relativamente baixa deste óleo (aproximadamente 30 mPas em comparação com o óleo de gergelim que tem unia viscosidade de aproximadamente 44 mPas), a formulação poderia também ser preparada in sitii com BA/álcool benzílico e a formulação completa esterilizada por íiltração.

EXEMPLO 5

Forrnu.1 ações Orais Uma série de excipientes foi selecionada para as formulações bucais e 17 formulações não aquosas foram preparadas e visualmente avaliadas para consistência e solvatcao.

Uma variedade de polímeros estava em forma de veículos potenciais mucoadesivos. Devido à instabilidade inerente de BA em sistemas aquosos, as formulações investigadas eram não aquosas, substitui η do-se a fase aquosa por glicero! ε polietileno glicol (PEG). <table>table see original document page 70</column></row><table>

Teste visual preliminar de formulações placebo

Dezessete formulações dc placebo forma inicial- mente preparadas e testadas visualmente para consistência e solvatação (Tabela 22). resumindo, as quantidades necessárias de PEG 400 e carbopol 934 forma agitadas em frascos de vidro de 28 mL durante 10 minutos com uma espátula e outros ingredientes foram acrescentados na seguinte ordem, glicerol, álcool benzi Isco e metiI celulose ou HEC ou HPC. As formulações forma então misturadas cora um agitador Silverson 14RT a aproximadamente 10.000 rpm durante aproximadamente 2-3 minutos. Todas as formulações ρ lacebo misturadas foram deixadas para se soIvatarem de ura dia para o outro (>24 horas) antes da testagem visual. Tabela 22

<table>table see original document page 72</column></row><table> Análise Reológica de formulações de placebo (adesão por mueos idade)

Uma abordagem ao teste de adesão por mu cos idade é a caracterização reológica da interface mucoadesiva. Ele se baseia na presunção de que a extensão da interpenetração pode ser detectada mcdindo-se as diferenças nos parâmetros reológicos entre géis poliméricos e suas misturas com mucina. O aumento sinérgico na viscosidadc foi proposto como um índice da resistência à ligação por bioadesão. Da análise visual, cinco formulações de pJaccbo foram escolhidas, com base na viscosidade e solvatação, para avaliação reológica adiciona! usando mucina de porco, As formulações escolhidas estão relacionadas na Tabela 23.

Tabela 23. Formulações escolhidas para anáfisc reológica

<table>table see original document page 73</column></row><table> Preparação das amostras para avaliação reológica Preparação de mucina de porco

Em resumo, 15 g de pó de mucina de porco foram pesados num béquer e enchidos até 150 g com água desionizada para dar uma concentração final de 10% peso/peso de mucina. Esta foi deixada hidratar a 2-8°C por aproximadamente 2-3 horas. A mucina hidratada foi ainda diluída com água desionizada obtendo-se uma concentração finai de 5% peso/peso de mucina em água desionizada, deixando-se hidratar durante a noite no refrigerador a 2-8°C.

Procedimento de Teste Reológico Dinâmico (oscilatório)

A análise reológica foi feita usando-se um reômetro Carrimed. Aproximadamente 0,5 g da amostra de teste foi colocada entre a geometria da plataforma e placa paralela. Estando a amostra comprimida entre a plataforma e a placa qualquer amostra em excesso foi cuidadosamente removida usando-se uma espátula em ângulos retos à geometria. Cada amostra foi testada num total de cinco vezes resultando em espectros mecânicos. Os parâmetros resultantes G', G", e delta δ foram usados para avaliar a resistência mucoadesiva das formulações, onde G' é o módulo elástico, G" o módulo viscoso e δ tan a relação de G' para G".

Otimização e preparação de Ibrmuiações ativas e de placebo selecionadas

Seguinte ao teste reológico duas formulações foram selecionadas para mais otimização (formulação 16 e 17) com relação à preparação do lote de formulação para estabi- lidade. O processo de manufatura otimizado foi empregado para preparar lotes das formulações ativas (contendo 13A) e de placebo (25 g de cada). A figura 6 mostra a preparação da formulação ativa e placebo 16 com as quantidades alvo de excipientes/fármaeo usados. Resumidamente, a quantidade necessária de carbopol 934 foi adicionada a PEG 400 num recipiente de borossi licato e aquecida a 50°C por aproximadamente 2 horas até a mistura estar completamente solvatada. Esta mistura foi resfriada a temperatura ambiente, a quantidade necessária de gíicerol adicionada e a. mistura aquecida a aproximadamente 60°C num banho de água por 2 horas até ser formada uma pasta homogênea. A quantidade necessária de HEC foi adicionada e agitada numa. mistura resfriada usando um miSturador Silverson L4RT a aproximadamente 10.000 rpm por 2-3 minutos. Esta. mistura foi então deixada solvatar completamente durante a noite (cerca de 12 horas) a temperatura ambiente. Como a Figura 6 Ilustra, isto produziu uma "Formulação de Base".

A formulação ativa foi preparada, dissolvendo- se inicialmente o 13A em álcool benzilico. A quantidade necessária de 13A/álcool benziIico foi adicionada para a formulação de Base solvatada e agitada brandament e com uma espátula dando uma concentração final de 0,1% peso/peso de 13A. De modo semelhante, a formulação de placebo foi preparada adicionando-se o álcool benzílico d ara a mistura solvatada agitando-se suavemente. Λ formulação 17 foi

similar. A tabela 24 mostra a % peso/peso alvo excipientes/BA nas formulações ativas c de placebo.

Aproximadamente 1 g das formulações de placebo e ativas foram feitas em alíquotas em frascos com tampa rosqueada de 2 mL e colocadas cm estabilidade a 2-8°C, 25°C e 40°C (a última temperatura foi utilizada para análises de estabilidade acelerada a curto prazo).

Tabela 24. ASvo % peso/peso {a 1 d.p) nas placebo otimizadas

<table>table see original document page 76</column></row><table>

Extração de 13A da formulação ativa

Para fins da avaliação do produto fármaco, realizado um método de extração para se avaliar a degradação de BA 'b' na isoforma 'a5 (pureza de pico por cromaíografia). A iação ativa foi como a seguir (o mesmo para a formulação de placebo). Em resumo, cerca de 1 g da formulação foi precisamente medida num frasco volumétrico de 10 niL cuido por 1 ml de tampão de citrato (pH 3). Este foi suavemente agitado manualmente por cerca de 5 minutos ate a homogeneidade, e completado em volume com metanol grau HPLC. O frasco foi então agitado num agitador mecânico por aproximadamente 2 horas, O conteúdo do frasco foi então transferido para um tubo de polipropilcno de 15 niL e centrifugado por 5 minutos a 2200 rpm. O sobrenadantc foi festo em alíquotas em frascos de bPLC e analisado.

Os dados de recuperação preliminares (não mostrados) indicam, que, cerca de 80% ou mais de DA 'b' foi recuperado da formulação ativa e de modo suais significativo, não houve interferência de quaisquer excipientes na formulação.

Método HPLC

O método de análise para a análise de Ι3A na formulação bucal é dada abaixo.

Coluna; Simetria C18-5um (Waters) (S/n° T636515 07, P/n° WAT054205)

Comprimento da coluna: 150 χ 3,90 mm Temperatura da coluna: 30°C

Coluna protetora: Simetria C18-5 μm (Waters) (P/n° WATO54225)

Comprimento da coluna protetora: 20 χ 3,90 mm

Fase móvel: 0,02% v/v de TFA em água (A); 0,02% v/v de TFA em acetonitrila (B) A: B;50: 50 (composição de partida) (GRADIENTE, ver tabela abaixo)

Velocidade de fluxo: 1,0 mL/minutos Comprimento de onda UV: 230 nm (PDA) Volume de injeção: 10

Tempo de operação: 20 minutos

Temperatura da amostragem automática: 8°C

As amostras e os píacebos foram testados em tempo zero. A aproximadamente 1-2 semanas, as amostras armazenada a 40°C, também foram testadas de modo a obter-se alguns dados de estabilidade acelerada.

RESULTADOS Análise Visual A análise visual foi realizada qualitativamente e proporcionou um método relativamente eficiente de pre-seleção de uma série de formulações com respeito à viscosidade e solvatação. Formulações de placebo foram avaliadas por dois assessores independentes e rejeitadas com base no fato de que a viscosidade era, ou muito alta ou muito baixa. Alem disso, qualquer formulação, que não tivesse sido completamente solvatada também foi rejeitada. Ficou quase evidente que, de acordo com o método de preparação urna concentração de carbopol 934 maior do que 1,5% peso/peso produziu geles não aquosos, que eram viscosos demais e/ou não totalmente solvatados. Uma redução na quantidade de carbopol 934 para 0,5% peso/peso e adição de meti !celulose a uma concentração de 2,0% peso/peso produziu um gel de baixa viscosidade. Conl aumentando-se a concentração de carbopol 934 para 1,()% peso/peso e, ao mesmo tempo, reduzi ndo~se a concentração de metilcelulose para 1,0% peso/peso ainda obíeve-se um gel com baixa viscosidade. De observações visuais pareceria que, a adição de metilcelulose não influenciou a viscosidade a uma maior extensão, comparado com a adição de carbopol 934. Contudo, metilcelulose demonstrou ter propriedades mucoadesivas c, portanto, foram preparadas mais formulações as quais continham 1,0 e 1,5% peso/peso de metilcelulose em combinação com 1,5% peso/peso de carbopol 934. A avaliação visual dessas formulações demonstrou que, elas eram homogêneas e tinhas a consistência necessária par mais avaliação. Similarmente, IIPC demonstrou não afetar a. viscosidade, em relação à adição de carbopol 934. Contudo, visto HPC ter sido implicado também corno um mucoadesivo potencial, as formulações contendo HPC a 1,0 e 1,5% peso/peso juntamente com carbopol 934 a 1,5% peso/peso foram vistos visualmente aceitáveis para u Iterior avaliação reoióeica. A formulação 4 também foi vista como visualmente aceitável, com relação à viscosidade e solvatação e isto incluiu HEC (um outro polímero mucoadesivo potencial). Conseqüentemente, cinco formulações (Formulação 4, 14, 15, 16 e 17) foram reologicamente avaliadas quanto a sua resistência mucoadesiva usando mucina de porco. Avaliação reológica das Formulações 4, 14, 15, 16 e 17

O módulo elástico G' é uma medida da resistência da amostra à deformação elástica (ou seja, uma reflexão da capacidade de conexão da rede polimérica) e G" é uma medida da resistência da amostra à deformação viscosa.

A média G' e G" a 5 Hz teve em média mais de 5 amostras que foram extraídas dos dados resultantes para permitir comparações entre diferentes formulações. Uma expressão que permite a determinação das diferenças sinérgicas, em termos de G' e G", entre a mistura formulações/mucina e os componentes individuais daquela mistura é dada na Equação 1, Quanto mais altos forem os valores G' relativos, maior será a interação da formulação com a mucina.

<formula>formula see original document page 80</formula>

Uma equação similar pode ser usada para calcular G". delta δ foi calculado usando os valores relativos G' e G" usando a Equação 2.

<formula>formula see original document page 80</formula>

A Figura 7 mostra os valores relativos G' e G" para todas as cinco formulações testadas e a Figura 8 mostra os correspondentes valores δ tan. Com base na avaliação rcológica, a ordem para o aumento na resistência mucoadesiva foi vista ser Formulação 17 > Formulação 16 > Formulação 14 > Formulação 15 > Formulação 4. Contudo, as Formulações 14 e 15 apresentaram grandes variações (como observado com os grandes desvios padrão). Isto poderia ser devido às interações não homogêneas dessas formulações com mucina. Além disso, o G' gerado para as formulações em água desionizada também foi visto ter grandes variações, indicando assim, que, essas formulações não apresentaram hidratação homogênea, A formulação 4 foi vista ter os maiores valores G' quando misturada com a mucina, contudo, o valor G' relativo foi significantemente mais baixo (p<0,05), comparado com todas as outras formulações testadas. Atribuiu-se isto ao fato de que os valores G1 para a Formulação 4 dispersa em água foram consideravelmente mais altos comparados a todas as formulações dispersa em água. Pareceria que, a Formulação 4 produziu ura gel viscoelástico relativamente bom em água (comparado com as outras formulações em água), contudo pareceu ter uma interação relativamente pequena com mucina, visto o valor G' relativo, que elimina o efeito da formulação (bem como o efeito da mucina) foi significativamente menor. Com base nos valores G' relativos, as Formulações 16 e 17 demonstraram a maior interação com a mucina de porco deduzindo que, essas duas formulações poderiam ser usadas como formulações mucoadesivas potenciais. As formulações 14 e 15 demonstraram alguma interação com mucina, contudo a hidratação/interação dessas formulações poderia ser não homogênea, como julgado por grandes desvios padrão, A formulação 4 demonstrou o menor valor G' relativo, e, portanto, a menor interação. Os correspondentes valores δ tan são urna medida relativa da viscoelasticidade, o menor δ tan indica unia complicação relativamente maior e, de modo inverso o maior δ tan indica uma complicação relativamente menor (devido à um componente viscoso relativamente maior) apoiando assim, essas observações.

Otimização e preparação de formulações ativa e de pjacebo selecionadas

O procedimento de otimização foi feito de modo a reduzir o tempo de preparação para as formulações, de cerca de 24 horas caindo para 12 horas. As formulações 16 e 17 foram escolhidas para análises de otimização e estabilidade.

Análisc HPLC das formulaçôesJ3A

A tabela 25 mostra as purezas de pico percentuais para I3A 'b' bem como área percentual da isoforma 'a' e outros picos não especificados (UAP) para as Formulações 16 e 17 em tempo zero. Também demonstrado como comparação, é a pureza de pico percentual de uma amostra de gel IPA Ϊ3Α 0,1% peso/peso em tempo zero. Todos os picos para formulações bucais foram manualmente integrados e comparados às respectivas formulações de placebo. Tabela 25 - Purezas de pico Percentuais de formula tempo zero

<table>table see original document page 83</column></row><table>

A tabela 26 mostra s purezas de pico percentuais para 13A 'Ir, bem como a área percentual da isoforma 'a' e outros picos não especificados 16 e 17 tirados em aproximadamente duas semanas após armazenagem, a 2-8°C e 40°C) estabilidade acelerada). Também tabulado como unia comparação está a pureza de pico percentual de gel IPA BA a 0,1% peso/peso armazenado a 40°C por uma semana. rFodos os picos para as formulações bocais foram manualmente integrados comparados com as resncctivas formulações de

Tabela 26- Purezas de pico cromatograficas percentuais das formulacoes na ocasiao, cerca de 1-2 semanas armazenados a 2-8 ºC e 40ºC

<table>table see original document page 83</column></row><table> <table>table see original document page 84</column></row><table>

Parece não haver diferença evidente na pureza zero para o valor inicial da receita (99,3% I3A 'b', referência PB21001/24. Além disso, a área. percentual! da isoforma 4a' na recepção foi de 0,40%, similar à área de pico percentual para a isoforma 'a' em tempo zero (Tabela 25).

Nao houve aumento visível na pcrccntaeem da isoforma "a5 após aproximadamente 1-2 semanas de armazenagem das formulações bucais a 2-8°C (Tabela 26), enquanto um aumento na perccntagem da isoforma 'a' foi observado oara todas as amostras bucais armazenadas a 40°C.

Contudo, o aumento na porcentagem da isoforma 'a3 observado para o gel IPA a 0,1% peso/peso foi maior (1,60%) após I semana de armazenagem a 40°C. Com base nas purezas de pico 15 percentuais, estes dados preliminares pareceriam indicar que, as formulações 13A bucais são pelo menos tão estáveis quanto o gel IPA I3A a 0,1% e, possivelmente ainda mais estáveis. EXEMPLO 6

Formulações de poloxâmero Quatro formulações de poloxâmero foram analisadas.

MATERIAIS

<table>table see original document page 85</column></row><table> MÉTODOS

Escolha dos Excipientes Antes da análise de pré-formulação, vários excipientes adequados para as formulações de poloxâmero foram identificados sendo relacionados abaixo, juntamente com as concentrações máximas recomendadas.

<table>table see original document page 86</column></row><table>

* Usado para a formulação de controle

Preparação das formulações para análises reológicas

Varias formulações de poloxâmero 407 placebo foram preparadas usando os excipientes relacionados sopra de modo a se avaliar o comportamento reológico.

Preparação de tampão de citrato pH 3

Ácido cítrico monoidratado (peso molecular: 211g/ mol) foi preparado em água desionizada a uma concentração de 0,1 M. Uma solução de citrato trissódico diidratado, 0,1 M (peso molecular: 294J g/mol) também foi preparada em água desionizada. Solução de tampão de citrato píi 3 foi preparada misturando-se solução de ácido cítrico monoidratado v/v a 40% (0,1 M) 10% v/v de solução de citrato trissódico diidratada (0,1 Μ) e água desionizada v/v a 50% sendo medido o pH final usando uni Medidor de pH (3320 JENWA Y).

Preparação das soluções 'de base' de poloxâmero 407

Análises preliminares indicaram que, soluções de poloxâmero 407 a uma faixa de concentração entre 1 8-20% p/p eram adequadas para propiciar uma faixa de νiscosidades com valores cmt variados. AS soluções de poloxâmero foram preparada usando o método a frio descrito por Schmolka (1972).

Em resumo, as quantidades necessárias de poloxâmero 407 (Tabela 27) foram adicionadas, ou a tampão de citrato pH 3, ou tampão de propileno glicol/ citrato pH 3 em garrafas de 100 mL de borossilicato (garrafas de vidro Duran). O tampão de propileno glicol/citrato a pH3 foi previamente preparado pesando-se a quantidade apropriada de tampão de propileno glicol e tampão de citrato pll 3 (Tabela 27) e agitado por 1-2 minutos até ficar visualmente homogêneo, Os frascos Duran contendo os ingredientes foram tampados e colocados num banho de gelo/água por 4 horas com agitação 'freqüente a cada 15 minutos, até serem produzidas soluções límpidas Essas soluções foram armazenadas a 2-83C até o uso.

Procedimento de Esterilização

Visto os geles serem exigidos para terapia intra- lesional. a esterilização é imoortante. DiC modo a conseguir esterilização, os geles preparados foram submetidos a au toe lave usando o método BP, onde aproximadamente 100 g de cada um dos seles relacionados na Tabela 27 foi colocado em frascos Diiran de 1.00 mL e submetidos a autoclavc durante 15 minutos a 121°C. Após este procedimento, os geles foram deixados resfriar a temperatura ambiente e em seguida armazenados a 2-8°C até o uso. TABELA 27

<table>table see original document page 89</column></row><table> Tabela 28

<table>table see original document page 90</column></row><table> Preparação de formulações placebo de polox amero para aval iação reológica

Devido à instabilidade de DA à esterilização por calor, formulações contendo 13Λ devem ser preparadas dissolvendo-se a I3A num solvente apropriado seguido por adição asséptica (ou seja filtração asséptica) em soluções de poloxâmero 'básicas' submetidas a autoclave. O solvente de escolha foi álcool benzílico. Contudo, para avaliação reológíca apenas formulações placebo de poloxâmero foram preparadas contendo álcool benzilico, devido à disponibilidade limitada de 13Α.

Preparação de solução tampão de álcool benzílico/citrato apll 3

A proporção de tampão de citrato adicionado ao álcool benzi lico foi 2,5% peso/peso, que estava abaixo da solubilidade do tampão de cítrato a pH 3 em álcool benzílico. Resumidamente, aproximadamente 0,5 g dc tampão de ci trato a pH 3 foi adicionado a 19,5 g de álcool benzílico dando uma percentagem final de tampão de citrato de 2,5% peso/peso em álcool benzi lico. Esta solução foi então filtrada através de um filtro Millipore (0,22 μm MILLEX-GV, MILLÍPORE) para imitar a condição de filtração asséptica.

Adição de solução tampão de álcool benzílico/citrato a pH 3 às soluções de poioxâmero 'básicas"

Formulações placebo (Tabela 28) foram preparadas por adição da quantidade necessária de tampão álcool benzílico/citrato filtrada a pII 3 para as soluções 'básicas' de poloxâmero esterilizadas preparadas como acima, Em resumo, aproximadamente 9,90 g (peso exato registrado na Tabela 28) de cada solução 'básica' de poloxâmero foram pesados num frasco de vidro de 20 rnL e este foi resfriado em gelo/água formando um líquido ( a temperatura ambiente essas soluções formam geles).

Ao poloxâmero resfriado 'básico' aproximadamente 0,10 g (peso exato registrado na Tabela 28)( do tampão filtrado de álcool benzílico/citrato a pH 3 foi adicionado e submetido a turbilhonamento por 2 minutos até ser obtida urna solução visualmente límpida homogênea. Essas formulações foram então armazenadas a 2-8°C até o uso.

Avaliação Reológica A avaliação reológica foi realizada usando um reômetro Carrimed CSL'. Aproximadamente 0,4 g da amostra de teste foi colocado entre a geometria de plataforma e placa paralela. Uma vez a amostra ser comprimida entre a plataforma e a placa, qualquer excesso dc amostra foi cuidadosamente removida usando-se uma espátula em ângulos retos à geometria. Cada amostra foi testada por três vezes a as viscosidades resultantes foram registradas como uma função da temperatura.

Preparação das formulações ativas e placebos relativos para estabilidade e análises de liberação Seguinte à avaliação reológica, formulações do poloxâmero placebo e ativas (13A) foram preparadas para estabilidade e análises de liberação. Além disso, formulações de PEG 400 ativas e placebo (0,1% p/p de 13A) também foram preparadas como formulações de controle para teste de liberação. Preparação de estoque de I3A em tampão de álcool benzilico/citrato

Aproximadamente 50 mg (quantidade alvo) de 13A foi precisamente pesada num frasco de vidro de 7 mL juntamente com 500 mg (quantidade alvo) de tampão de álcool benzílico/ ei trato a ρ H 3. Esta mistura foi periodicamente submetida a vórtice por 5 minutos até a dissolução de Í3A.

Preparação das formulações de poloxâmero ativas e placebo

Formulações placebo foram preparadas como descrito supra (Tabela 28). Formulações de poloxâmero ativas (13A) contendo uma concentração alvo de 0,1% p/p de Ι3A 'b' foram preparadas num modo similar às formulações placebo, exceto que o peso extra devido à adição de I3A 4b' foi compensado por uma redução semelhante na quantidade da solução 'básica' de poloxâmero adicionada (Tabela 29). Bni resumo, aproximadamente 110 mg (peso exato registrado) de tampão de 1.3A/álcool benzílico/citrato a pH 3 foi adicionado para 9,89 g da solução 'básica' de poloxâmero esterilizado, resfriado e submetido a vórtice por cerca de 2 minutos até ser obtida uma solução visivelmente límpida e homogênea. Os pesos exatos e pesos alvos são mostrados na Tabela 29. Tabela 29 Tabela 30. Quantidades reais e alvo de formulacoes de controle PEG 400placebo e ativas para analises

<table>table see original document page 95</column></row><table>Peso exato 13A emalcool benzilico = 0,09155 g/g Preparação de formulações cie controle IjEG 400

Hniento similar, 12,3 mg I3A foi adicionado a 125 rag de álcool benzsüco que tinha si previamente filtrado através de um filtro Millipore (0,22 μηι MILLEX-GV MÍLLIPORE). Esta solução foi submetida a vórtice por aproximadamente 5 minutos até o OA ser completamente dissolvido. Para preparar as formulações de controle ativas aproximadamente 110 mg desta mistura foi adicionado para uma solução de 7,912 g de PEG400 c 1,978 g de tampão de citrato pH 3. Os placebos foram preparados num modo similar, exceto que, foram usados aproximadamente 7,92 g de PEG400, 1,98 g ds tampão de citraío e 100 mg de álcool benzíiico esterilizado, Os pesos exatos e pesos alvos demonstram-se na Tabela 6 para formulações placebo c PEG400 ativas, respectivamente. Condições de armazenagem paraJonnuIações de poloxame ro

ativas e piaceho

Alíquotas de cada formulação de poloxâmero 407 (placebo ou ativas) foram dispensadas a frascos de vidro âmbar com tampa rosqueada de 2 mL (vidro de borossiIicato) tampados e armazenados a três condições de armazenagem, ou seja, 2-8°C, 25± 2°C e 40 ± 2°C para análises de estabilidade.

Teste de estabilidade de Ϊ3Α nas formulações de ooloxâmero

Para finalidade de avaliação do produto farmacêutico, foi realizado um método de extração a fim de avaliar a degradação de I3Á 'b' na isoforma V (pureza d épico cromatográfico) A extração de I3A da formulação ativa foi como a seguir (o mesmo procedimento também foi usado formulação placebo). Em resumo, cerca de 0,5 g da formulação foi precisamente pesada num frasco volumétrico de 5 ml e completado até a marca com tampão de acetonitrila/citrato grau HPLC a pH 3 (90:10 v/v). A solução foi feita em alíquotas em frascos de HPLC e analisada.

Dados de recuperação preliminares (não mostrados) indicaram, que cerca de 80% ou mais de BA 'b' foi recuperado da. formulação ativa e de modo mais significativo, não houve interferência de quaisquer exespientes na formulação. As formulações foram analisadas a um tempo 0 e análises de estabilidade acelerada (40°C) foram realizadas a um tempo = 5 semanas.

Análises preliminares de.liberação de I3A

A liberação de Í3A 'b' das formulações pela membrana sintética foi pesquisada usando células de difusão de Franz sob condicoes de absorcao.

Escolha do fluido recsptor

O fluido receptor empregado para tentativa c manutenção de condições submersas era 20% v/v etanol/citrato (pH 3,0) e este foi incorporado à célula de Fi agitado constantemente com um agitador magnético. Análises de estabilidade preliminares foram realizadas em I3A em tampão de etanol/citrato v/v a 20% (pH 3,0) a 37"C por aproximadamente 18 horas. O aumento da área de pico percentual na isoforma 'a' após 18 horas, foi visto ser de 0,26%. Para fins da análise de células de Franz considerou-se isto como aceitável. A solubi lidado cinética de 13A em tampão de etanol/citrato a 20% v/v (pH 3,0) foi determinada em 509,7 ± 3 }ig/ml a 25°C.

Análises de liberação in vit.ro (célula de Franz)

Células de difusão de Franz calibradas individualmente com uma área superficial de difusão média de 0,53 cm2 e um volume receptor médio de 1,85 ± 0,02 mL foram usadas para realizar o teste de liberação. AS membranas de celulose regeneradas (MWCO 12000-14000) foram preparadas, cortadas e montadas nas células de Franz, As membranas foram deixadas equilibrar com a fase receptora por 30 minutos antes de aplicar as formulações. Unia dose infinita de 0,5 g de cada formulação foi aplicada sobre a superfície da membrana usando um Finnpipette(R' de deslocamento positivo. Unia leitura da amostra foi feita (26 horas após a aplicação dc gel) pelo que, 200 μΐ do fluido receptor foi cuidadosamente retirado do braço da célula de Franz. Por todo o experimento quaisquer perdas no fluido receptor devido à evaporação das células de Franz foram substituídas para manter um volume constante. O experimento foi realizado sob condições de absorção, (o topo dos compartimentos doadores superiores cobertos com Parafilmw), para iodas as formulações (n - 3 células de Franz por formulação ativa e n = 1 por formulação placebo por célula de Franz). As amostras foram analisadas por HPLC, como descrito no Exemplo 1 e a concentração de 13A 'b' liberada foi avaliada usando urna série de padrões de calibração preparados em tampão de citrato 80% v/v / etanol 20% v/v.

RESULTADOS Esterilização da soluções 'básicas' de poloxâmero

Imediatamente após a esterilização das soluções 'básicas' de poloxâmero, Polox-0l e Polox-02 - sem demonstração de separação de fase pelo propileno. IJma vez resinada em gelo/água, essas soluções tornam-se de fase transparente, homogênea. Contudo, as soluções de chase' contendo propileno glicol, Polox-pg-01 e Polox-pg-02 não demonstraram separação de fase imediatamente após esterili- zação, sugerindo que, a adição de propileno glicol impede este fenômeno.

Avaliacao Reologica

Análises reológicas foram. feitas nas formulações placebo de poloxâmero e a viscosidade (Pa.s) foi determinada como uma função da temperatura (°C), na faixa de temperatura 4-40°C. O valor cmt .foi determinado tomando-se o ponto mediano de inflexão. Para todas as formulações placebo houve um pequeno aumento na viscosidade com aumento na temperatura até um determinado ponto, na cmt, houve um aumento dramático na viscosidade com um pequeno aumento de temperatura. O valor cmt foi visto como a concentração dependente, ou seja, quanto menor for a concentração do poloxâmero 407, maior será o valor cmt. Além disso, a adição do propileno glicol para as formulações placebo do poloxâmero reduziram ainda mais o valor de cmt. Contudo, acima da cmt, as viscosidade para as mesmas amostras aumentaram aproximadamente 1,5- 2 vezes em comparação com as respectivas formulações isentas de propileno glicoi. Por exemplo, a 37°C a viscosidade do placebo Poíox -01 foi vista como ccrca dc 1,2 Pas. enquanto a respectiva formulação placebo de propileno glicol (Polox-pg-01 -placebo) foi vista como 2,4 Pas= Portanto, a adição de propileno glicol pareceria aumentar a viscosidade acima do valor cmt, contudo o valor cmt real fica reduzido. A tabela 31 resumo os valores cmt c as viscosidadcs a 37°C para toadas as formulações.

Tabela 3 L Valores Cmt e viscosidadcs a 37°C) para iodas as formulações placebo de poloxâmero (n = 3 ± SEM)

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Análises de estabilidade de Ι3Λ cm formulações de poloxâmero A tabela 32 mostra as purezas dc pico percentuais para 13A 'b', bem corno a área percentual da isoforma 'a' c outros picos não especificados (UAP) para todas as formula- ções de poloxâmero ativas tiradas cm tempo zero, Também se demonstra como uma comparação a pureza de pico percentual de um gel IPA 13A a 0,1% p/o em tempo zero. Todos os picos foram manualmente integrados e comparados com as respectivas formulações placebo.

Tabela 32. Purezas de pico percentuais das formulações em tempo zero

<table>table see original document page 101</column></row><table>

A tabela 33 mostra as purexas de pico percentuais para Ι3Λ *b' bem como a área percentual da isoíorma 'a' e outros UAPiS para todas as formulações ativas tomadas em cinco semanas após armazenagem a 40°C (estabilidade aceleradas). Também está tabulado como uma comparação, a pureza de pico percentual de gel IPA Ϊ3Λ a 0,1% p/p armazenado a 40°C por quatro semanas, todos os picos foram integrados manualmente comparado com a respectiva formulação placebo. Tabela 33. Purezas de pico cromatográficas percentuais das formulações ao tempo de cinco semanas, armazenadas a 40°C.

<table>table see original document page 102</column></row><table>

* Analisado após quatro semanas de armazenagem a 40°C usando método 1 de HPLC

Não houve diferença evidente na pureza de pico

percentual de 13A em quaisquer formulações de poloxâmero. Em tempo zero, contudo, a percentagem da isoforma 'a' e menor para essas formulações comparado com o gel IPA 13A, possivelmente como um resultado da adição de uma pequena quantidade dc tampão de citrato a pH 3 adicionado ao álcool benzílico durante a manufatura das formulações.

Um aumento na percentagem da isoforma 'a' foi observado para todas as formulações de poloxâmero ativas após cinco semanas de armazenagem a 40°C. Contudo, o aumento na percentagem da isoforma V observado para o gel IPA a 0,1% peso/peso foi maior (4,7%) após quatro semanas de armazenagem a 40°C. Com base nas purezas de pico percentuais, esses dados pareceriam indicar, que, a estabilidade das formulações de poloxâmero I3A são comparáveis ao gel IPA Í3A a 0,1%.

Análises de liberação Preliminares A figura 9 mostra a quantidade liberada (ng/crrf) após 26 horas, de 13A do gel de poloxâmero a 0,1% p/o e formulações de PEG 400. Nenhuma diferença significativa na liberação foi vista (p>0,05) entre quaisquer formulações de poloxâmero, contudo, a liberação de todas as formulações de poloxâmero foi significativamente mais lenta (p<0,05) do que a liberação da formulação de controle, PEG 400, A quantidade de I3A if liberada, teve em média cerca de 16 μ g/cm" para todas as formulações de poloxâmero, enquanto a quantidade liberada da formulação PEG 400 de controle foi de cerca de 53 pg/cinJ, representando assim, urna redução de cerca de 70% na quantidade de 13A 'b' liberada de todas as formulações de poloxâmero comparado com o controle, após 26 horas.

Quatro formulações de poloxâmero foram pesquisadas neste teste. Esses geles de poloxâmero conferiram um aumento na viscosidade (2 37°C) onde a viscosidade do polox-01-placebo < polox-pg-01 -placebo < polox-02-ρlacebo < polox-pg-02-placebo. Além disso, a adição de propileno glicol pareceria aumentar a viscosidade acima do valor cinl, contudo o valor cmt real fica reduzido. A estabilidade dos geles de poloxâmero parece ser comparável com o gel IPA I3A a 0,1% sob condições aceleradas.

Testes de liberação demonstraram, que não houve diferença significativa na liberação (p<0,05) entre quaisquer formulações de poloxâmero; contudo, a liberação de todas as formulações de poloxâmero foi significativamente mais lenta (p<0,05) do que a liberação da formulação de controle, PEG 400. Alem disso, foi observada uma redução de cerca de 70% na quantidade de 13A 'b' liberada de todas as formulações de poloxâmero, comparado com o controle, após 26 horas.

EXEMPLO 7

Pesquisou-se a liberação in vitro dc 13A 4b' de formulações intralesionais a base de óleo comprado com a formulação de controle, PEG 400.

MATERIAIS

<table>table see original document page 104</column></row><table> <table>table see original document page 105</column></row><table>

MÉTODOS

Preparação de 13A (ativa) e formulações placebo para análises de liberação

Três formulações oleosas foram preparadas com os respectivos placebos. A quantidade de álcool benzílico foi mantida em 1% p/'p. A preparação de duas formulações envolveu, ou adição de um antioxidante antes de esterilização térmica do óleo ou a adição do antioxidante após a esterilização do óleo.

Preparação da formulação oleosa (como descrito em PB23001/2) tCroda-BA'

Esterilização de óleo de coco fracionado

Aproximadamente 100 g de óleo de coco fracionado (CRODAMOL GTC/C) foi pesado num frasco cônico de 100 mL (vidro de borossilicato), com batoque (batoque de vidro borossilicato) e colocado dentro de um forno pré-aquecido forno (Gallenkampf Hot Box com ventilador, tamanho 2) a 170 ± 2°C por 1 hora. Após este procedimento, o óleo foi deixado resfriar a temperatura ambiente antes do uso.

Adição de OA ao óleo esterilizado Aproximadamente 15 mg de 13 A foi precisamente pesado um frasco de vidro de 20 mL e adicionado a aproximadamente S 50 mg dc álcool ben/.ί Iico (anotado o peso exato), que tinha sido previamente filtrado por um filtro MTLLEX-GV de 0,22 μιτι. Esta mistura foi periodicamente turbiIhonada por aproximadamente 2 horas até o 13A ser dissolvido no álcool benzi!ico. A esta mistura, adicionou-se aproximadamente 14,835 g de óleo esterilizado c remoinhado por aproximadamente 5 minutos até ser obtida uma solução homogênea. O placebo foi preparado de modo similar, exceto que foi usado aproximadamente 14,85 g de óleo cslüri!i/£do (peso exato registrado) para compensar o Ι3Λ. Os pesos exatos c composições percentuais são mostradas na Tabela 34 e 35 para formulações ativas (13A) e placebo.

Tabela 34. Quantidades alvo e reais (e % p.p) para a formulação oleosa 13A Croda/BA

<table>table see original document page 106</column></row><table>

* Arredondado até 3 d.ρ Tabela 35. Quantidades alvo e reais (e % p/p)para a formulação oleosa Croda/BA placebo

<table>table see original document page 107</column></row><table>

* Arredondado até 3 d.ρ

Preparação da formulação oleosa tCiOda-BAZAntiox'

A armazenagem a loníio prazo dos óleos pode levar à rancidcz, podendo degradar o produto farmacológico. Portanto, pode-se incluir um antioxidante na formulação (após esterilização térmica) a fim de reduzir este efeito. Forniu!ações placcbo e ativas contendo um antioxidante após esterilização térmica do óleo foram preparadas de acordo com a seguinte metodologia:

Preparação de mistura antioxidanle/álcool benzíiico

Aproximadamente 60 mg de antioxidante (BMT) foi dissolvido em 2 g de álcool benzíiico c filtrado por um filtro MILLEX-GB de 0,22 pm.

Adição de 13A ao óleo esterilizado Aproximadamente 15 mg de 13A (Lote 0319) foi precisamente pesado num frasco de vidro de 20 irsL c adicio- nado a aproximadamente 154,5 mg de BHTZálcool benzíiico preparado corno acima. Esta mistura foi periodicamente turbi- lhonada por aproximadamente 2 horas até o 13A dissolver-se no álcool benzílico. A esta mistura adicionou-se aproximadamente 14,8305 do óleo esterilizado resfriado, sendo remoinha por aproximadamente 5 minutos até ser obtida uma solucao homogênea. O placebo foi preparado de modo similar, exceto que foi usado aproximadamente 14,8455 g do óleo esterilizado (peso exato registrado) a fim de compensar a formulação 13A, Pesos exatos e composições percentuais demonstram-se na Tabela 36 ε 37 para formulações ativas (BA) c placebo.

Tabela 36. Quantidades alvo e reais e % p/p) para oleosa Croda-BA/Antiox 13A

<table>table see original document page 108</column></row><table>

Tabela 37. Quantidades alvo e reais (e % p/p) para ajormulação oleasa Croda-BA/Antiox placebo

<table>table see original document page 108</column></row><table> <table>table see original document page 109</column></row><table>

* Arredondado até 3 d.ρ

Preparação da formulação oleosa "CrodaZAntiox-BA'

A esterilização térmica a seco dos óleos pode conduzir também à rancidez, podendo degradar o produto farmacêutico. Portanto, um antioxidantc pode ser incluído na formulação de modo a reduzir este eleito antes da esterilização térmica. Formulações placebo e ativas contendo um anlioxidante antes da esterilização térmica do óleo foram preparadas de acordo com a seguinte metodologia.

Esterilização da mistura antioxidante/óleo

Aproximadamente 15 mg de antioxidante (BHT) foi dissolvido em aproximadamente 50 g de óleo num frasco cônico de 100 mL (vidro de borossiiicato, arrolhado (rolha de vidro borossiiicato) e colocado dentro de um forno pré- aquecido (Ga!Ienkampf Hot Box Ovem com ventilador, tamanho 2) a 170 ± 2°C por 1 hora. Após este procedimento, o antioxidante/óleo foi deixado resinar a temoeratura ambiente antes do uso.

Adição de 13A ao óleo esterilizado

Aproximadamente 15 rng de OA (Lote 0319) foi precisamente pesado num frasco de vidro de 20 mL e adicionado a aproximadamente 150 mg de álcool benzílico que tinha sido previamente filtrado por um filtro MILLEX-GB de 0,22 μm. Esta mistura foi periodicamente turbiihonada por aproximadamente 2 horas até a Í3A ser dissolvida no álcool benzílico. A esta mistura aproximadamente 14,835 g da mistura antioxidante/óleo esterilizado resfriado foi adicionada e turbiihonada por aproximadamente 5 minutos ate ser obtida uma solução homogênea. O placebo foi preparado de modo similar, exceto que, aproximadamente 14,8455 g do óleo esterilizado (peso exato registrado) foi usado para compensar o I3A. Pesos exatos e composições percentuais demonstram-se nas Tabelas 38 e 39 para formulações ativas (I3A) e placebo.

Tabela 38. Quantidades alvo e reais (e % p/p) para a formulação oleosa Croda/Antiox-BA I3A

<table>table see original document page 110</column></row><table> Tabela 39. Quantidades alvo e reais (e % p/p) para a formulação oleosa Croda/Antiox-BA de placebo

<table>table see original document page 111</column></row><table>

* Arredondado até 3 d.ρ

Alíquotas de todas as Ibmiu !ações foram armazenadas para testes de liberação preliminares e o restante foi feito em alíquotas de 2 ml em frascos de vidro de borossiIieato de 2 ml, tampados e armazenados a 2-8°C e 25°C para análises de estabilidade.

Análises de liberação de I3A preliminares

A liberação de Ι3Λ 'b' das formulações pela membrana sintética foi analisada usando células de difusão de Franz sob condições submersas.

Escolha do fluido receptor O fluido receptor empregado para tentativa e manutenção de condições submersas era 20% v/v de tampão etanol/citrato (pH 3,0) e este foi incorporado à célula de Franz e agitado constantemente com um agitador magnético. Análises de estabilidade preliminares foram realizadas cm 13A cm tampão dc etanol/citrato v/v a 20% (pH 3,0) a 37°C por aproχ ι rn a cs am ente 18 horas. O aumento da área de pico percentual na isoíòrma 'a' após 18 horas, foi visto ser de 0,26%. Para fins da análise de célula de Franz, considerou-se isto como aceitável. A solubilidade cinética de 13A em tampão de etanol/citrato a 2.0% v/v (pH 3,0} foi determinada em 509,7 ± 3 ug/mi a 25°C.

Analises de liberação in vitro (célula dc Franz)

Células de difusão de Franz calibradas individualmente com uma área superficial de difusão média de 0,53 cm2 e um volume receplor médio dc 1,85 ± 0,02 mL foram usadas para realizar o teste de liberação. AS membranas de celulose regeneradas (IVIWCO 12000--' 14000) foram preparadas, cortadas e montadas nas células de Franz. As membranas foram, deixadas equilibrar com a fase receptora por 30 minutos antes de aplicar as formulações. IJma dose infinita de 0,5 g de cada formulação foi aplicada sobre a superfície da membrana usando uni Finnpipette(R) de deslocamento positivo. IJnia leitura da amostra foi feita (26 horas após a aplicação do gel) pelo que, 200 μΐ do fluido receptor foi cuidadosamente retirado do braço da célula de Franz. Por todo o experimento quaisquer perdas no fluido receptor devido à evaporação das células dc Franz foram substituídas para manter um volume constante. O experimento foi realizado sob condições de absorção, (o topo dos poços doadores superiores cobertos com Parati!m(K)), para todas as formulações (n = 3 células de Franz por formulação ativa c η · I por formulação placebo por célula de Franz). As amostras foram analisadas HPLC, e a concentração de I3A cIr liberada foi avaliada usando uma série de padrões de calibração preparados em tampão de citrato 80% v/v / etanol 20% v/v .

Método MPLC O método HPLC previamente descrito no Rxemplo 1. foi usado para determinação de Ι3Λ.

Resultados

Análises de liberação preliminarçs

A figura 10 mostra a quantidade de I3Λ 'b' liberada (µg/cm2) após 26 horas, das formulações oleosas a. 0,1% p/p e PEC 400.Nenhuma diferença significativa na liberação foi vista (p>0,05) entre quaisquer das formulações oleosas. Contudo, a liberação de I3A lb' de todas as formulações oleosas foi significantemente menor (p<0,05) do que a liberação da formulação de controle PEG 400. A quantidade de I3Λ 'b' liberada de todas as formulações oleosas foi cerca de 3,4 µg/cm2, contudo, a quantidade liberada da formulação PEG 400 de controle foi cerca de 16 vezes maior (53 µg/cm2). Além disso, pareceu que, a adição de BHT (antioxidante) não afetou de modo significativo a liberação de I3Λ 'b' das formulações oleosas.

EXEMPLO 8

Estabilidade das Formulacoes de Gel IPA

A estabilidade (Τ =12 meses) de I3A 'b' nas formulações de gel IPA preparadas usando diferentes pH dos tampões de citrato foi determinada. A faixa de pH ficou em 2,5 a 4,0. <table>table see original document page 114</column></row><table>

METODOS INTSRUMENTACAO E METODOLOGIA HPLC

Soluções de amostra foram analisadas quanto à pureza de pico percentual por HPLC. As condições cromatográ- Hcas para o Método 2 por !IPLC estão descritas abaixo:

Waters Alliance 2695 Separations Module mais Autosampler (SN: L96SM4656N)

Detector Water 996 PDA (SN: ΜΧ7ΛΜ798 Software Millennium"'", versão 4,0 Condições cromatográficas: Coluna: Simetria (Ci8-S μηι (Waters)

(SN: T70641T 12) Extensão da Coluna: 150 χ 3,90 mm Temperatura da Coluna: 30°C ± T

Coluna de segurança: Simetria C!8-5 μιη (Waters)

(PN: WAT054225) Extenso da coluna de segurança: 20 χ 3,90 min 5 Fase móvel: 0,02% v/v TFA em água (A); 0,02%

v/v TFA em

Acetonitrila (B) A:B 50:50 (composição de partida)

Velocidade de fluxo: 1,0 ml/minutos Temperatura da amostragem automatizada (Autosamplcr): 8°C ± 2°C Comprimento de onda UV: 230 nm Volume da injeção: 10 μl

Tempo da. operação: 20 minutos

<table>table see original document page 115</column></row><table>

Extração de 13Ab das formulações de get IPA

13Ab foi extraída de cada unia das formulações de gel IPA como a seguir: aproximadamente 0,5 g de cada formulação de gel ativa ou placebo foi precisamente pesada num frasco volumétrico de 5 mL grau A. Isto foi realizado em triplicata para cada formulação. Tampão de citrato (pH - 3,0 0,5 mL). foi então adicionado para cada amostra de gel e turbilhonada na velocidade máxima durante 1 minuto e a seguir transferida a um agitador orbital e agitada a 400 rpm por 30 minutos. Adicionou-se então acetonitrila de grau HPLC até um volume, para cada um dos frascos volumétricos e novamente turbilhonada a velocidade máxima durante 1 minuto. Finalmente os frascos volumétricos foram transferidos para um agitador orbital e agitados a 400 rpm durante 60 minutos. As alíquotas foram então transferidas para frascos HPLC para análise.

Medição do pH aparente dos geles de placebo

O pH aparente dos geles de placebo foi medido usando um medidor de pH Jenway 3320 com uma combinação de eletrodo de pH Em resumo, aproximadamente 0,5 g de cada gel foi transferido para frascos de vidro de 25 mL e deixados repousar a temperatura ambiente por pelo menos 1 hora. O eletrodo de pH combinado foi colocado no gel IPA assegurando que toda a membrana do eletrodo ficasse coberta com gel. A leitura do medidor de pLI foi ajustada por um mínimo de 1 minuto e o pH aparente do gel registrado.

RESULTADOS

Medição do pH aparente dos geles de piacebo a um tempo de 12 meses O pH aparente dos geles IPA de ρlacebo a t = O e T = 12 meses após armazenagem a 2-8°C demonstra-se na Tabela 40.

Tabela 40

pH aparente dos geles IPA de placebo a T = 0 e T= 12 meses

<table>table see original document page 117</column></row><table>

Os dados na Tabela 40 mostram que, não houve alteração significativa no pH aparente, após 12 meses de armazenagem a 2-8°C para os geles ÍPA de placebo preparados com tampão de citrato a pH 3,00, 3,50 e 4,00. Contudo, os geles IPA de placebo preparados com tampões de citrato a pH 2,50 e 2,75 houve uma ligeira redução no pH observado após 12 meses de armazenagem a 2-8°C. A redução no pH observado para esses geles pode ser atribuível à evaporação de IPA do gel, seja durante armazenagem ou durante a análise da amostra.

Pureza de pico percentual dos isômeros I3A nos geles IPA ativos

a T = 12 meses A tabela 41 mostra a pureza d épico percentual dos isômeros de Í3A para as diferentes formulações de gel ativas (0,1% p/p) por 12 meses a 2-8°C e a Tabela 42 mostra a comparação da pureza d épico percentual, de I3Aa a T = 0 e T = 12 meses.

Tabela 41 - Pureza de pico percentual dos isômeros de 13A para os geles IPA ativos após 12 meses de armazenagem a 2-8°C

<table>table see original document page 118</column></row><table>

Dados analisados usando o Método 2 de HPLC

Os dados na Tabela 41 mostram que, após 12 meses de armazenagem a 2-8°C houve um aumento na pureza de pico percentual da isoforma 'a' com pH aparente aum respectiva tormulaçao oe gel oe placcbo. Por exer IPA produzido com tampão de estrato a pH 2,75 possui unia pureza de pico percentual da isoforma 'a' de 1,07% comparado com uma formulação de gel íPA preparada com tampão de citrato a pH 4,00 que possui uma pureza de pico percentual da isoforma 'a' de 4,92%. Esses dados exolicam a estabilidade crescente de 13A em formulações de gel IPA preparadas com citrato a um píl mais baixo.

Tabela 42.Comparação da pureza de pico percentual de 13Aa a T = 0 e T = 12 meses

<table>table see original document page 119</column></row><table>

T = O, dados analisados pelo Método 1 de HPLC c T = 12 meses, dados analisados pelo Método 2 de HPLC

Os dados na Tabela 42 demostram que, ha um aumento na pureza de pico percentual da isoforma 'a' em todas as formulações do gel IPA ativas após 12 meses de armazenagem a 2-8°C. Contudo, a formulação de gel IPA preparada com tampão de citrato a pH 2,50 demonstrou apenas um ligeiro aumento na pureza de pico percentual da isoforma V (0,22%) se comparado, a por exemplo, a formulação de gel IPA prepara com tampão de citrato a pH 4,00 que demonstrou o maior aumento na pureza de pico percentual da isoforma 4a '(4,48%). Novamente, esses resultados evidenciam a estabilidade aumentada de BA b nas formulações de gel IPA preparadas com tampões de estrato a pH mais baixo. Como tal, a formulação de gel IPA preparada com os tampões de ei tia to a menores ρ Ii parece permanecer dentro da especificação (isoforma a <1%) durante 12 meses a 2-8°C.

Assim, após 12 meses de armazenagem, a 2-8°C, as formulações de gel IPA que proporcionaram a melhor estabilidade para 13Ab foram aquelas que forarn preparada com os tampões de citrato ao menor pH (pli = 2,5 - 3,0).

EXEMPLO 9

Estabilidade de I3A 'b' em Soluções de Gel Pré-misturadas a pH

e temperaturas variadas Métodos

Preparação das Soluções de Gel pré-misturadas

As soluções pré-misturadas de gel foram, preparadas de acordo com o seguinte procedimento:

1. Pesar o tampão de citrato diretamente num frasco Duran limpo a seco.

2. Pesar o IPA diretamente no frasco Doran da.

Etapa 1.

3. Pesar a quantidade exata de 13A 4Ir num frasco da amostra limpo a seco.

4. Pesar a quantidade exata de álcool benziIico no frasco da amostra da Etapa 3.

5. Colocar o frasco da amostra da Etapa 4 no agitador orbital e agitar a 400 rpm até todo o 13A "o' ter se dissolvido.

6. Adicionar a solução dc Ι3Λ 'b'/álcool benzíüco da Etapa 5 para o frasco Duran da Etapa 2.

7. Destilar a mistura até ser obtida uma solução homogênea.

As composições das soluções de gel pre- mi st ura das para preparação e estabilização são:

Tabela 43. Solução 1 da pré-mistura de gel

<table>table see original document page 121</column></row><table>

Tabela 44. Solução 1 da pré-mistura de gel

<table>table see original document page 121</column></row><table> Tabela 45. Solução 3 da pré-mistura de gel

<table>table see original document page 122</column></row><table>

Tabela 46. Solução 4 da pré-mistura de gel

<table>table see original document page 122</column></row><table>

Tabela 47. Solução 5 da pré-mistura de gel

<table>table see original document page 122</column></row><table> Tabela 48. Solução 6 da pré-mistura de gel

<table>table see original document page 123</column></row><table> Teste de Estabilidade das Formulações Pré-misturadas de Gel

As soluções de pré-mistura em gel preparadas supra foram colocadas em estabilidade a 2-8°C, 25° e 40°C sendo testadas nos pontos de tempo T - 0 e T = 2 semanas. Em cada ponto de tempo as soluções de pré-mistura foram avaliadas quanto ao teor de 13A 4b' de acordo com o procedimento descrito abaixo.

1.1.3 Teste de Estabilidade das Formulações de Pré-mistura de Gel

As soluções de pré-mistura de gel preparadas foram colocadas em estabilidade a 2-8, 25 e 40°C sendo testadas nos pontos de tempo T = 09 e T = 2 semanas. Em cada ponto de tempo as soluções de pré-mistura foram avaliadas quanto ao teor de I3A 'b' calculando-se a are de pico por HPLC percentual de I3A 'b' em relação as áreas de pico das substâncias de ísoforma 'a' e isoforma 'c' relacionadas a I3A 'b' conformo descrito a seguir.

Instrumentação e Metodologia por HPLC

Todas as amostras pra análise de I3A 'b' foram analisadas usando o Método 2 de HPLC. A s condições de instrumentação e cromatografia para o Método 2 de MPLC são como seçue:

Instrumentação:

Waters Alliancc 2695 Separations Module plus Autosampler

Detector Waters 996 PDA

Software Empower, versão 2,00 Condições cromatográ ficas:

Coluna: Simetria (C18 -- 5 um (Waters) (SN: T70641T 12)

Extensão da Coluna: 150 χ 3,90 mm

Temperatura da Coluna 30°C ± 2"

Coluna de segurança: Simetria C18 - 5 μm (Waters) (PN: WAT054225)

Extenso da coluna de segurança: 20 χ 3,90 mm

Fase móvel: 0,02% v/v TFA em água (A); 0,02% v/v TFA cm

Acetonitrila (B) A:B 50:50 (composicao de partida) (Gradiente, ver Tabela 51 abaixo)

Velocidade de fluxo: 1,0 ml/minutos

Temperatura da amostragem automatizada (Autosampler): 8°C ± 2°C

Comprimento de onda UV: 230 nm

Volume da injeção: 10/ 40 μl

Tempo da operação: 20 minutos

Tabela 51. Tabela de Gradiente para o Método 2 de HPLC

<table>table see original document page 125</column></row><table> Dados de Estabilidade para I3A 'b' nas soluções de pré-mistura de gel ia ia de pH 2,75 a 4,00 a 2°-8°, 25° e 40°C (média η - 3)

<table>table see original document page 126</column></row><table> <formula>formula see original document page 127</formula>

Conclusões:

A armazenagem de todas as soluções de pré- mistura de gel a 2-8°C proporciona a melhor estabilidade para 13A 'b\ com base na maior pureza de pico percentual por HPLC obtida para Í3A 'b' comparado com a armazenagem das soluções de pré-mistura de gel a 25° c 40°C.

As duas soluções de pré-mistura de gel que propiciaram a melhor estabilidade para OA 'b\ com base na pureza de pico percentual por HPI ,C, foram os números 1 e 5. essas soluções de pré-mistura continham o tampão de citrato no pH mais baixo empregado no teste (pH = 2,75).

As duas soluções de pré-mistura de gel que propiciaram a menor estabilidade para BA 'b\ com base na pureza de pico percentual por HPLC Foram os números 4 e 8. Essa soluções de pré-mistura continham o tampão de citrato ao pH mais alto empregado no teste (pH -- 4,00). Diminuindo-se a temperatura e o pH do tampão de citrato nas soluções de pré-mistura de gel proporciona-se a melhor estabilidade para I3A 'b' onde a pureza de pico percentual pro HPLC de I3A 'b' foi usada como um indicador de estabilidade neste teste. REFERÊNCIAS: Ho VC, Griffiths CEM, Ellis CN, Gupta AK, McCuaig CC, Nicoloff BJ, Cooper KD, Hamilton TA e Voorhees JJ. J Am Aeadd Dermatol 22:94-100, 1990.

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Claims

1. Formulação de angelato de ingenol para uso em terapia, CARACTERIZADA pelo fato do angelato de ingenol ser dissolvido num solvente aprótico farmaceuticamente aceitável, compreendendo essa formulação adicionalmente, um agente de acidulação farmaceuticamente aceitável que c pelo menos parcialmente compatível com o solvente, propiciando uma formulação com um pH aparente não maior do que 4,5.

2. Formulação, de acordo com 1, CARACTERIZADA pel o fato do agente de acidulação ser adicionado subseqüente à preparação de uma solução de angelato de ingenol no solvente aorótico.

3. Formulação, de acordo com as reivin- dicações 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo angelato de ingenol ser 3-angelato de ingenol.

4. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo angelato de ingenol presente na formulação consistir de pelo menos 99% de -3-angelato de ingenol.

5. Formulação, de acordo com a reivindicação -4, CARACTERIZADA pela quantidade do 3-angelato de ingenol ser de pelo menos 99,5%.

6. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo solvente aprótico ser selecionado do grupo consistindo de polietileno glicol, metil etil cetona, acetato de etila, éter dietílico, álcool benzílico e misturas destes.

7. Formulação, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo solvente aprótico consistir essencialmente de álcool benzílico.

8. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo agente acidulante ser um ácido.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo agente acidulante ser um ácido orgânico.

10. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo agente acidulante ser um tampão ácido.

11. Formulação, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo tampão ser selecionado do grupo consistindo de um tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de citrato-fosfato.

12. Formulação, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo tampão ser tampão de citrato.

13. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADA pelo pH do tampão, antes da adição à formulação ficar entre ρH 2,5-ρH 4,5, inclusive.

14. Formulação, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo pH do tampão ficar entre pH 2,7 e pH 3,5 inclusive.

15. Formulação, de acordo com a reivindicação -14, CARACTERIZADA pelo pH do tampão ficar entre pH 2,7 e pH 3,0 inclusive.

16. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA por ter um pH aparente entre pH 3 e pH 4.

17. Formulação, de acordo com a reivindicação -16, CARACTERIZADA por ter um pH aparente de 3,5.

18. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA por consistir de angelato de ingenol, álcool benzílico e tampão de citrato a pH 2,5, onde o tampão está presente numa quantidade entre 1 e 10% p/p da formulação.

19. Formulação, de acordo com quaisquer -15 reivindicações precedentes, CARACTERIZADA por compreen- der ainda um antioxidante.

20. Formulação, de acordo com a reivindicação -19, CARACTERIZADA pelo antioxidante ser selecionado do grupo consistindo de retinol, ácido ascórbico, licopeno, tocoferol, hidroxitolueno butilado e misturas destes.

21. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo solvente e o agente acidulante serem capazes de formar urna única fase.

22. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA por compreen- der ainda um conservante selecionado dentre: parabeno, ácido benzóico, álcool benzílico e misturas destes.

23. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes CARACTERIZADA por compreen- der ainda um intensificador da penetração.

24. Formulação, de acordo com a reivindicação -23, CARACTERIZADA pelo intensificador da penetração ser selecionado do grupo consistindo de álcool isopropílico, um sulfóxido um azônio, uma pirrolidona, um alcanol, um glicol, um ácido graxo, água, um tensoativo um terpeno um fosfolipídio, e misturas destes.

25. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA por compreen- der ainda um mucoadesivo.

26. Formulação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pro estar na forma de uma preparação adequada para administração tópica.

27. Preparação, de acordo com a reivindicação -26, CARACTERIZADA por compreender uma parte principal de um tampão ácido em peso.

28. Preparação, de acordo com a reivindicação -26 ou 27, CARACTERIZADA por compreender ainda um gelificante.

29. Preparação, de acordo com quaisquer reivindicações 26 a 28, CARACTERIZADA por estar na forma de um gel, creme, ungüento, ou tintura.

30. Preparação, de acordo com quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo angelato de ingenol ser pelo menos 99% de 3-angelato de ingenol e onde não mais que 1% de rearranjo à isoforma 'a' ocorre após 3 meses.

31. Preparação, de acordo com quaisquer reivindicações, CARACTERIZADA pelo angelato de ingenol ser pelo menos 99% de 3-angelato de ingenol, onde não mais que 0,5% de rearranjo à isoforma 'a' ocorre após 3 meses.

32. Uso de uma formulação conforme definida em quaisquer reivindicações precedentes, CARACTERIZADO por ser para o tratamento de um câncer de pele.

33. Uso de angelato de ingenol, CARACTERIZADO pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um câncer de pele, onde o angelato de ingenol é dissolvido num solvente aprótico, farmaceuticamente aceitável, tal formulação compreendendo ainda um agente acidulante farmaceuticamente aceitável que é pelo menos parcialmente compatível com o solvente propiciando a formulação com um pH aparente não maior do que 4,5.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pela formulação ser como definida em quaisquer reivindicações 1 a 30.

35. Uso, de acordo com quaisquer reivindi- cações 32 a 34, CARACTERIZADO pelo câncer de pele ser um câncer escamoso ou de célula basal.

36. Processo para preparar uma formulação de angelato de ingenol, CARACTERIZADO por compreender a dissolução do angelato de ingenol num solvente aprótico farma- ceuticamente aceitável, compreendendo esse processo a adição de um agente acidulante farmaceuticamente aceitável que é pelo menos parcialmente compatível com o solvente, e que proporciona um pH aparente à formulação não maior que 4,5, sendo esse agente acidulante adicionado com o angelato de ingenol, antes deste ou após este.

37. Processo, de acordo com a reivindicação 36, CARACTFiRIZADO pela formulação ser como indicado em quaisquer reivindicações 2 a 29.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, CARACTERIZADO pelo angelato de ingenol ser substancialmente 3-angelato de ingenol e a adição do agente de acidulaçâo e as condições serem de modo tal selecionadas para evitar que mais de 1% do 3-angelato de ingenol se rearranje na isoforma 'a'.

39. Processo, de acordo com quaisquer reivin- dicações 36 a 38, CARACTERIZADO pelo angelato de ingenol ser substancialmente 3-angelato de ingenol e a adição do agente de acidulaçâo e as condições serem de modo tal selecionadas para evitar que mais de 0,5% do 3-angelato de ingenol se rearranje na isoforma 'a'.

40. Processo, de acordo com quaisquer reivin- dicações 36 a 39, CARACTERIZADO pelo agente acidulante conferir um ρH aparente entre ρH 3 e pH 3,5 na formulação.

41. [claim missing on original document]

42. Processo, de acordo com quaisquer reivin- dicações 36 a 41, CARACTERIZADO pela formulação ser composta com apenas os componentes indicados, antes da adição de quaisquer outros componentes desejados .

43. Processo, de acordo com a reivindicação -42, CARACTERIZADO pelo componente adicional desejado se um excesso de tampão ácido.

44. Processo, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, CARACTERIZADO pelo componente adicional desejado ser polietileno glicol.

45. Processo, de acordo com quaisquer reivin- dicações 42 a 44, CARACTERIZADO pelo componente adicional desejado ser um gelificante.

46. Processo, de acordo com quaisquer reivin- dicações 42 a 45, CARACTERIZADO pela formulação ser subseqüentemente armazenada a uma temperatura entre a temperatura de congelamento e 8°C.