MX2008007685A - Composiciones terapeuticas. - Google Patents

Abstract

Angelato de ingenol es un agente anticáncer potente, y puede estabilizarse disolviéndolo en un solvente aprótico en presencia de un amortiguador acídico.

Description

COMPOSICIONES TERAPEUTICAS Descripción de la Invención La presente invención se refiere a composiciones de compuestos obtenibles de especies Euphorbia y que son útiles en el tratamiento de cánceres dé la piel. El compuesto angelato de ingenol puede aislarse de varia especie Euphorbia, y particularmente de Euphorbia peplus y Euphorbia drummondii . El angelato de ingenol existe en tres isoformas; ingenol-3-angelato (isoforma 'b'), ingenol-5-angelato (isoforma 'a') e ingenol-20-angelato (isoforma 'c'). La primera de éstas también se refiere en la presente como 13A y tiene la siguiente estructura: El angelato de ingenol se ha encontrado por ser altamente tóxico para célula cancerosa de la piel vía interrupción mitocondrial rápida y muerte celular por necrosis primaria, mientras dejando inafectadas las células sanas. El documento US-A-6432452 describe los presentes compuestos en un principio activo derivado de plantas de las especie Euphorbia peplus, Euphorbia hirta y Euphorbia drummondii, que muestran citotoxicidad selectiva contra varias diferentes líneas celulares cancerosas. Los compuestos son útiles en el tratamiento efectivo de cánceres, particularmente melanomas malignos y carcinomas de células escamosas (SCCs por sus siglas en inglés). Los compuestos se seleccionan de jatrofanos, pepluanos, paralianos e ingenanos. El compuesto preferido es un ingenano sustituido por angeloiio obtenido de la savia del Euphorbia peplus. Las cantidades en microgramos de angelato de ingenol son normalmente terapéuticamente efectivas. Sin embargo, la tendencia para la isoforma 'b' para experimentar la redistribución a la isoforma 'a' y posteriormente a la isoforma 'c' que presenta un problema de formulación, donde se desea restringir la formulación a una isoforma específica o a un porcentaje de isoformas. Esto es particularmente un problema con I3A, tal que las diferentes isoformas tienen diferentes solubilidades. Existe una necesidad de un tratamiento efectivo, tópico para el cáncer de piel, puesto que los tratamientos sistémicos que involucra otros fármacos necesariamente dan lugar a la exposición de células sanas susceptibles, en partes no-objetivo del cuerpo, a productos químicos citotóxicos. En adición, los tratamientos anticáncer sistémicos, si se administra oralmente o por inyección, tiene aceptación del paciente inferior. Existe una necesidad de proporcionar una formulación estable del angelato de ingenol, preferiblemente para administración tópica. Ahora, se ha encontrado sorpresivamente que el angelato de ingenol puede solubilizarse, sustancialmente sin redistribución entre las isoformas, en un solvente aceptable, aprótico en presencia de un amortiguador acídico aceptable, miscible. Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una formulación del angelato de ingenol para uso en terapia, en donde el angelato de ingenol se ha disuelto en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, la formulación además comprende un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable que es por lo menos parcialmente compatible con el solvente y el cual proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5. La presente invención considera formulaciones de cualquiera de las isoformas del angelato de ingenol, o mezclas de los mismos. Actualmente, la isoforma preferido es la isoforma 'b', también designado en la presente como I3A. Se entenderá que las referencias a 'angelato de ingenol' y a 'I3A' incluyen referencia a otras isoformas y mezclas de las mismas, a menos que de otra manera sea aparente. El angelato de ingenol puede disolverse en muchos solventes, y los varios solventes se ilustran en el acompañamiento del Ejemplo 1. Sin embargo, el angelato de ingenol es generalmente susceptible a redistribución en solventes próticos, y a cualquier grado sustancial de redistribución, normalmente más allá de aproximadamente 1% en para productos derivados de plantas, pero más preferiblemente de manera aproximada 0.5%, es indeseable en una formulación farmacéutica.

En solventes apróticos, que son generalmente solventes que no contribuyen protones a una solución, tal como polietilenglicol, la disolución puede tomar un cierto tiempo considerable y éste, junto con las temperaturas requeridas, pueden también conducir a redistribución a un grado anterior de niveles aceptables. Las sustancias tal como acetona y acetonitrilo son capaces de disolver I3A, pero no son de manera general farmacéuticamente aceptables, y pueden no ser adecuados para almacenamiento de larga duración. Más aceptables pueden ser las sustancias tal como metiletilcetona, acetato de etilo, o dietiléter, pero el alcohol bencílico es generalmente más preferido. Un número de sustancias son adecuadas para disolver I3A, pero la estabilidad no está garantizada, y los niveles de redistribución generalmente inaceptables pueden observarse después de períodos de intervalos entre pocos como 12 horas y muchos como seis meses o un año. En ausencia de agua, u otro solvente prótico, no habrá un pH medible. Bajo tales condiciones, y especialmente a temperaturas elevadas, la redistribución es probable. Así, se ha encontrado que es generalmente posible inhibir la redistribución por la presencia de un ácido adecuado. Los ácidos adecuados son generalmente ácidos orgánicos, pues se ha establecido que I3A puede descomponerse mucho por debajo de aproximadamente un pH de 3, mientras que la redistribución es probable que ocurra en aproximadamente un pH de aproximadamente 4.5. Donde se desea almacenar la formulación por períodos de cualquier longitud, tal como un mes o más, entonces se prefiere que el ácido esté en la forma de un amortiguador. Los amortiguadores adecuados incluyen amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato y amortiguador de citrato-fosfato, aunque otros amortiguadores serán aparentes a los expertos en la técnica. En particular, se prefiere que el amortiguador proporcione un pH aparente a la formulación no mayor de 4.5 y no menor de 2.5. Una formulación de pH menor de 4 es más preferida, y es particularmente preferida que la formulación aparente de pH sea 3.8 o menor, preferiblemente alrededor de 3.5, o menor. Un pH aparente de alrededor de 3 es útil. Un amortiguador que tiene un G pH de 2.75 se ha encontrado por ser particularmente ventajoso, confiriendo un pH aparente de aproximadamente pH 3.5 a la formulación final cuando se utiliza en cantidades como se ¡lustra en los ejemplos anexos. Un intervalo preferido de pH del amortiguador está entre 2.6 y 2.85, preferiblemente pH 2.7 - pH 2.8, y es preferiblemente un amortiguador de citrato. Se apreciará que el ácido estará generalmente en la forma de una solución acuosa, preferiblemente en agua desionizada, a menos que se indique lo contrario. Se prefiere el amortiguador de citrato. Donde se utiliza el amortiguador de acetato, éste puede normalmente tener un intervalo de pH de 3.5 a 5.5, mientras que el amortiguador de citrato-fosfato puede normalmente tener un intervalo de pH de 2.75 a 7.0. Se entenderá que una solución en la cual el solvente es aprótico no puede tener un pH, esto que esta es una medida del ion H + . Sin embargo, donde tal solución está por lo menos parcialmente miscible con un ácido, o amortiguador ácido, y tal está presente, después se procura medir el pH produciendo un resultado. Las formulaciones preferidas de la invención, se hacen como formas de administración tópicas, y generalmente comprenderán una mayoría de amortiguador, o solución iónica, pero siempre comprenderán el solvente aprótico, para que solamente un pH aparente, más que uno absoluto, pueda medirse, puesto que el pH medido se relaciona solamente con el componente iónico. Los medios adecuados para medir el pH aparente están con el medidor de pH Jenway 3320. Por consiguiente, el resultado no puede tener el significado atribuido normalmente a una solución iónica, especialmente donde la cantidad de ácido o amortiguador es pequeña, pero el significado es que, en cuanto cualquier ambiente iónico está presente, este ambiente es ácido. Mientras que la cantidad de ácido aumenta, así el pH aparente llega a ser más equivalente al pH. Mientras que no se determina por ia teoría, es probable que el angelato de ingenol esté sobre todo disuelto en el solvente aprótico, ya que tiene solubilidad muy baja en agua. La adición subsiguiente de la solución del angelato de ingenol. en solvente a una solución iónica acidificada permite una solución iónica, opcionalmente acuosa adecuada, del angelato de ingenol a prepararse, de tal modo evitando la disolución del angelato de ingenol directamente en un solvente prótico, que es cuando la cantidad más grande de redistribución parece ocurrir. Así, el contacto con un solvente prótico puede dar lugar inmediatamente a la formación de otras isoformas, pero esto puede minimizarse si una cantidad pequeña de amortiguador ácido o acídico, cuyos términos se utilizan sinónimamente en la presente a menos que de otra manera sean aparentes, se agrega. Incluso el acto de la disolución en solventes próticos, da la longitud de tiempo y condiciones necesarias, puede conducir a niveles indeseable altos de formación de isoformas, tal es la susceptibilidad del angel'ato de ingenol a redistribución. El solvente aprótico y el ácido son por lo menos parcialmente compatibles, en donde una preparación estable de los dos puede formarse. El ácido y solvente son preferiblemente miscibles, y son preferiblemente miscibles en todos los índices. En particular, se prefiere generalmente para agregar una cantidad pequeña de amortiguador al solvente durante, o poco después, de la solubilidad del angelato de ingenol, para guardar el pH aparente en un nivel relativamente bajo. Posteriormente, puede ser deseable hacer el angelato de ingenol solubilizado en un exceso del amortiguador que se ha utilizado durante la solubilidad inicial. Las preparaciones estables hechas con un exceso de amortiguador se ilustran en el Ejemplo 9, más adelante. Se apreciará que se prefiere que el ácido y solvente sean suficientemente miscibles para poder formar una sola fase, aunque sean inmiscibles, o menos miscibles, los solventes y ácidos pueden prepararse en la forma de emulsiones o micro-emulsiones. Tales emulsiones pueden ser estables, pero la disposición de una mezcla de solvente y ácido como una sola fase generalmente además minimiza cualquier riesgo de la redistribución del angelato. Los solventes que son particularmente útiles en la presente invención son los que exhiben rasgos hidrofílicos y lipofílicos, tal como sistemas del anillo que son preferiblemente homocíclicos, y que tienen grupos hidroxi sustituidos sobre los mismos pero separados o por lo menos un átomo de carbono de la estructura del anillo. Un ejemplo particularmente preferido de tal solvente es alcohol bencílico. Aunque es posible utilizar un ácido más bien un amortiguador, se prefiere generalmente utilizar un amortiguador acídico para minimizar la fluctuación en el pH. Como tal, se apreciará que, mientras que el término 'amortiguador' sé utilizará generalmente en la presente, este término también comprende los ácidos y preparaciones de ácido, cuando sea apropiado. Un amortiguador particularmente preferido es el amortiguador de citrato, pH 3 o menor, preferiblemente pH 2.75. En alcohol bencílico, una cantidad de 2.5% en p/p de amortiguador de citrato de pH 2.5 generalmente producirá un pH aparente np medible pero, en cantidades más altas, produciendo un pH de alrededor de pH 3. La relación entre el pH del amortiguador y pH aparente se explora en los ejemplos anexos. En las cantidades bajas de amortiguador cuando se disuelve I3A en el solvente, se prefiere simplemente para mantener el ambiente acídico, y la naturaleza del amortiguador preferido a estos niveles es similar a la naturaleza del amortiguador preferido cuando se .diluye posteriormente la formulación para uso. Es preferido generalmente para acidificar el solvente, preferiblemente el alcohol bencílico, con una cantidad de amortiguador acídico, preferiblémente entre 1 y 10% en peso, preferiblemente entre 2 y 5%, antes de la adición del I3A. Mientras que la formulación no tiene que diluirse para uso, es generalmente el caso que I3A es una sustancia potente, y las soluciones de base del I3A en solvente, preferiblemente alcohol bencílico, pueden hacerse para almacenarse, preferiblemente a 8°C o debajo. Tales soluciones de base pueden entonces diluirse, preferiblemente con amortiguador, como se desee, cuando se hace cualquier formulación o preparación final. La cantidad de amortiguador usada cuando se solubiliza el angelato de ingenol puede variar entre aproximadamente 0 y 100%. Cuando la cantidad es 0, se prefiere agregar una cantidad de amortiguador poco después la adición del angelato de ingenol al solvente, para minimizar la probabilidad de que ocurra cualquier redistribución. Se prefiere generalmente para evitar usar cantidades de amortiguador mayores de 100% en peso del solvente, como en la disolución directamente en el amortiguador generalmente no es fácilmente realizable. Se prefiere utilizar el amortiguador como el medio para mantener el pH aparente del solvente en un nivel bajo, sin proporcionar ninguna cantidad sustancial de solvente prótico durante la disolución del angelato de ingenol. Una vez que el angelato de ingenol se ha disuelto sustancialmente, después es posible, y puede incluso desearse, hacer la formulación con un exceso de amortiguador que comprende, si se desea, otros constituyentes opcionalmente prótico, tal como antibióticos, por ejemplo. Los niveles preferidos de amortiguador están en la región de 0.5% - 10%, y preferiblemente entre 1% y 5%, con aproximadamente 2-3% siendo más preferidos durante la fase de disolución. La fase de la disolución comprende disolver por lo menos una mayoría del angelato de ingenol en el solvente, y preferiblemente por lo menos 99% en p/p de angelato de ingenol en el solvente, más preferiblemente por lo menos 95% en p/p. Las formulaciones de la presente invención pueden utilizarse directamente, o se pueden almacenarse para uso futuro.

Además, las formulaciones de la presente invención pueden proporcionar una formulación base que pueda después modificarse adicionalmente antes de uso. Por ejemplo; como se describe antes, la formulación se puede hacerse en un exceso de amortiguador o puede formularse en un gel, por ejemplo. También se ha encontrado que las formulaciones de la presente invención son generalmente más estables a temperaturas bajas. Las formulaciones particularmente preferidas de la presente invención, tal como las que comprenden alcohol bencílico y amortiguador de citrato, pueden exhibir estabilidad sustancial a temperaturas de hasta 40°C pero, en general, el incremento de estabilidad se observa a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente y presión (RTP por sus siglas en inglés), y la estabilidad mayor se observa a temperaturas por debajo de aproximadamente 8°C. El congelamiento no parece mejorar la estabilidad de modo que, en general, la estabilidad mayor es alcanzada simplemente colocando las formulaciones de la invención en un refrigerador convencional a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y 8°C. La presente invención además proporciona un proceso para preparar una solución del angelato de ingenol, que comprende disolver el angelato de ingenol en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, la formulación adicionalmente comprende un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable que es por lo menos parcialmente compatible con el solvente y el cual proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5, el ácido es agregado con, antes, o después del angelato de ingenol. En un alternativa, la presente invención proporciona un proceso para preparar una solución del angelato de ingenol, que comprende disolver el angelato de ingenol en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, el proceso que comprende la adición de un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable el cual es por lo menos parcialmente compatible con el solvente y el cual proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5, el agente de acidificación es agregado con, antes, o después del angelato de ingenol. El agente de acidificación es preferiblemente un amortiguador. Se prefiere agregar el ácido, o amortiguador, suficientemente en seguida después de la adición del I3A para asegurar no más de aproximadamente 1%, y preferiblemente no más de aproximadamente 0.5%, de la isoforma 'b' redistribuida en la isoforma 'a'. Preferiblemente, el ácido o amortiguador se agrega al solvente antes de agregar el I3A, aunque los tres ingredientes pueden combinarse al mismo tiempo. Este último es el menos la opción preferida. Este proceso también puede utilizarse para la preparación de formulaciones del angelato de ingenol usando otros compuestos y solventes, tal como polietilenglicol, donde la solubilidad directa puede asociarse con un nivel inaceptable de la redistribución. Aunque I3A puede disolverse en PEG, tomado en la región de una hora a temperatura elevada, que generalmente conduce a la generación de niveles inaceptables de la. isoforma 'a'. Si el I3A se disuelve en alcohol bencílico amortiguado primero, este puede entonces introducirse directamente en el PEG, sin la exposición prolongada al calor. Mientras que solamente bastante alcohol bencílico es necesario para solubilizar el I3A, después la cantidad total de alcohol bencílico en la formulación de PEG final necesita solamente estar en la región de 1% en p/p o menos. Estas formulaciones pueden conservarse por períodos sostenidos, especialmente cuando están conservadas a temperaturas de 8°C o menores. Las composiciones preferidas no se consideran de aproximadamente 1%, y preferiblemente no mayores de aproximadamente 0.5%, la redistribución de la isoforma 'b' a la isoforma 'a' después de 3 meses, más preferiblemente 6 meses. Más a fondo se proporciona el uso de una formulación de la invención en el tratamiento de un cáncer de piel. La invención también proporciona el uso del angelato de ingenol en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer de piel, en donde el angelato de ingenol se disuelve en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, la formulación adicionalmente comprende un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable que sea por lo menos parcialmente compatible con el solvente y el cual proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5. Los cánceres adecuados para el tratamiento de acuerdo con la presente invención incluyen cánceres de células escamosas y básicas. Se apreciará que el 'tratamiento', como se utiliza en la presente, incluye terapia y profilaxis. La presente invención también proporciona un método para tratar un sujeto que sufre de una condición cancerosa de la piel, que comprende la aplicación tópica de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la invención al área de la condición cancerosa. Los sujetos adecuados para el tratamiento son mamíferos, incluyendo humanos, primates, animales de ganado (vacas incluyendo, caballos, ovejas, cerdos y cabras), animales acompañantes (perros incluyendo, gatos, conejos, cerdos de Guinea), animales salvajes cautivos, y animales de laboratorio, tal como conejos, ratones, ratas, cerdos de Guinea y hámsteres. Las composiciones de la presente invención son particularmente adecuadas para el tratamiento de cánceres humanos de la piel. Se apreciará que las formulaciones de la presente invención pueden utilizarse en cualquier profilaxis o tratamiento del cáncer adecuado. Las formas de administración pueden ser cualquiera adecuadas, e incluyen cremas, geles, ungüentos, lociones, aerosoles, lacas y pinturas para aplicación tópica, polvos, soluciones y suspensiones para vías respiratorias, soluciones y emulsiones para inyección, cápsulas, jarabes y elixires para administración oral, y pesarios y supositorios. Otras formas de administración adecuadas serán fácilmente aparentes a los expertos en la técnica, y pueden incluir parches transdermales, por ejemplo. En una modalidad preferida de la presente invención, las formulaciones del angelato de ingenol se formulan para la administración tópica. En todos los casos, la formulación inicial está como una formulación de la invención. La formulación puede hacerse en la forma final o justo antes de uso tan pronto como se desee después de la preparación de la formulación, pero permanecerá generalmente una formulación de la invención siempre. Las formulaciones pueden comprender los ingredientes adicionales, como se discute más adelante. Es particularmente preferido utilizar antioxidantes, como los que parecen proporcionar estabilidad mejorada a las formulaciones. Los ejemplos adecuados de antioxidantes incluyen retinol, ácido ascórbico, licopeno, hidroxitolueno butilado y tocoferol. La cantidad de angelato de ingenol requerida para eficacia farmacéutica será aparente a los expertos en la técnica, y puede adaptarse de acuerdo a los parámetros fisiológicos, tal como edad, peso y sexo del paciente, así como el tamaño de cualquier lesión. En general, una cantidad de angelato de ingenol adecuada para proporcionar entre aproximadamente 0.01 µ g cm"2 a aproximadamente 1 mg cm"2 puede utilizarse, con un intervalo de 0.1 mg cm"2 a aproximadamente 100 pg cm'2 que es más preferida. En los Ejemplos anexo, una formulación que proporcionaba 15 pg cm"2 se utiliza, pero las formulaciones de 1 pg cm"2 o menos, se han encontrado por ser efectiva. En alternativa, las formulaciones de la invención pueden contener I3A en una cantidad desde 0.001% (p/p) a 0.15% (p/p), más preferiblemente hasta de aproximadamente 0.1 - 0.12% (p/p). Las formulaciones tópicas son una modalidad preferida de la presente invención. En este respeto, una propiedad hasta ahora desconocida de angelatos de ingenol es particularmente útil, en la cual se ha encontrado que tiene propiedades vasoconstrictivas. Por consiguiente, la distribución sistémica del ingrediente activo es minimizada, debido al flujo reducido de la sangre en la proximidad del tratamiento. Se apreciará que la naturaleza de la formulación determinará el índice de impregnación a través de la piel. Como tal, se prefiere generalmente que la formulación sea preparada tal que un índice de impregnación de por lo menos aproximadamente 11 ng cm"2 h"1 sea alcanzado. No hay límite superior especial, aunque se prefiere generalmente que este no exceda alrededor de 1 pg cm"2 h"1. Las formulaciones tópicas pueden tomar cualquier forma adecuada. En general, se prefiere que exhiban algún nivel de viscosidad, para que puedan marcarse en el área deseada sin producirse. Por consiguiente, se prefiere generalmente para formular el angeiato de ingenol como cremas, geles, ungüentos y pinturas. Dado la potencia del angeiato de ingenol, las pinturas se pueden utilizarse, mientras que puedan aplicarse moderadamente, dependiendo de los niveles del ingrediente activo. Los poloxámeros pueden utilizarse en formulaciones preferidas de la presente invención. Estos son copolímeros que consisten de una molécula de poloxipropileno hidrofobica (POP por sus siglas en inglés) intercalada entre dos moléculas hidrofílicas de poloxietileno (POE por sus siglas en inglés). Así, tienen la capacidad de solubilizar fármacos lipofílicos dentro de la base hidrofobica. Además, las formulaciones de gel acuosas basadas en poloxámero exhibén propiedades termo-reológicas, que pueden ser ventajosas para liberación localizada, sostenida de fármacos. Sobre cierta temperatura, conocida como la temperatura micelar crítica (cmt por sus siglas en inglés), la viscosidad del gel de poloxámero aumenta dramáticamente. Un incremento en viscosidad conduce a una disminución de la difusión de cualquier fármaco disuelta en el gel que retrasa la liberación del fármaco del gel y conduce a la liberación sostenida. El incremento en viscosidad puede también proporcionar un 'depósito' prolongado, localizado en el sitio de acción. La cmt es dependiente en un número de variables tal como concentración del poloxámero y otros aditivos tal como propilenglicol. Idealmente, la cmt debe estar en una temperatura tal que la formulación pueda inyectarse en la lesión como un líquido (de fácil administración) y en contacto con la temperatura corporal un gel es formado con la propósito de alcanzar una liberación localizada, sostenida del fármaco. Cinco poloxámeros se listan en el USP, e incluyen poloxámero 188 y poloxámero 407. El poloxámero 188 se ha aprobado como un excipiente para las formulaciones IV (http://www.accessdata.fda.gov). Los geles de poloxámero se han utilizado para la liberación subcutánea de la insulina (Barichello y colaboradores, 1999) y otros sistemas de liberación de fármaco para uso percutáneo (Tobiyama y colaboradores, 1994). Un copolímero particular, el poloxámero 407 se ha administrado subcutáneamente para la liberación lenta de péptidos y proteínas terapéuticas, que incluyen interleucina-2 y hormona de crecimiento humana (Morikawa y colaboradores, 1987; Katakama y colaboradores, 1997). Después de la administración, los geles liberaron lentamente las moléculas de proteína atrapadas durante un período de 1-2 días. Además, una fracción sustancial de este poloxámero eventualmente experimentó la excreción renal. Los poloxámeros se consideran generalmente como materiales no tóxicos y no-irritantes. Los estudios de toxicidad en animales, con perros y conejos, han mostrado poloxámeros por ser no-irritantes y no-sensibles cuando son aplicados, en 5% en p/v y concentración 10% en p/v, a los ojos, gomas y piel. En un estudio de 14-día de administración intravenosa a conejos, a concentraciones de hasta 0.5 g/kg/día, no se observó ningún efecto nocivo adverso aparente. Un estudio similar con perros también no mostró ningún efecto nocivo en niveles de dosificación de hasta 0.5 g/kg/día. Además, no se observó ninguna hemolisis de células sanguíneas humanas durante 18 horas a 25°C, con 0.001-10% en p/v de soluciones de poloxámero (Wade and Weller, 1994). Sin embargo, la hiperlipidemia en ratas se ha descrito cuando una inyección intraperitúneal (IP por sus siglas en inglés) (.1,0 g/kg) de poloxámero 407 se introdujo (Wasan y colaboradores, 2003). Los aceites también pueden utilizarse en la presente invención. El uso de una formulación intralesional basada en emulsión se ha descrito para el tratamiento de psoriasis (Ho y colaboradores, 1990). Antes de la administración, un vehículo, tal como un aceite de ricino polioxietilado, se diluye normalmente con solución salina para formar la emulsión. Sin embargo, nuestros estudios han mostrado a la dilusión del I3A con solución salina normales incrementa la conversión de la ¡soforma 'b' a 'a'. Esta conversión puede minimizarse si el tiempo de administración de la formulación es corta. Hay un número de productos lipofílicos que se formularon como soluciones aceitosas para administraciones intramusculares (IM por sus siglas en inglés), por ejemplo Prolixin Enanthate (Bristol Myers Squibb). El vehículo (aceite) usado varía ampliamente de aceites vegetales tal como aceite de cacahuate (usado con benzoato de bencilo en Dimercaprol Injectipn B.P.) y aceite de sésamo (usado en inyecciones de Fluphenazine Enanthate Injection B.P). El uso de vehículos oleaginosos puede retardar la absorción debido a división retrasada del fármaco de aceite a los fluidos corporales acuosos (Ford, 1987). Cuando se inyecta en un ambiente acuoso (tal como tejido muscular) un fármaco relativamente lipofílico tal como I3A, disuelto en una fase aceitosa, tendrá una tendencia a no dejar el aceite y división 'instantáneamente' en la fase acuosa. De esta manera un efecto de liberación sostenida puede alcanzarse. Formulaciones bucales también pueden utilizarse. La liberación transmucosal de agentes terapéuticos es una forma popular de administración, debido a que las membranas mucosas son relativamente permeables, permitiendo la absorción rápida de un fármaco en la circulación sistémica y evitando el primer metabolismo de paso. Los productos transmucosales pueden diseñarse para administrarse vía la ruta nasal y ruta oral/bucal usando mucoadhesivos. En el desarrollo de estos sistemas de liberación de fármaco, la mucoadhesión del dispositivo/formulación es un elemento clave. El término 'mucoadhesivo' se utiliza comúnmente para los materiales que adhieren la capa de mucina de una membrana biológica. Los polímeros de mucoadhesivo se han utilizado en muchas diferentes formas de dosificación en esfuerzos para alcanzar la liberación sistémica y localizada de fármacos con las diferentes mucosas. Estas formas de dosificación incluyen tabletas, parches, cintas, películas, semisólidos y polvos. Para servir como polímeros mucoadhesivo, los polímeros deben poseer características fisicoquímicas tal como para ser predominante aniónicos con numeroso grupos formadores de enlace de hidrógeno, las propiedades superficiales adecuadas para humedecer superficies de tejido mucso/mucosal y flexibilidad y longitud suficientes (peso molecular) para penetrar la pared moca o fisuras. del tejido. Diferentes clases de polímeros se han descrito como mucoadhesivos potenciales tal como carbómeros (ácidos poliacrílico), metjlcelulosa hidroxipropilo (HPMC) así como polímeros que ocurren naturalmente, tal como ácido hialurónico y citosan. La preparación de formulaciones adecuadas está dentro de la habilidad de los expertos en la técnica, y los excipientes adecuados para la inclusión en cualquier formulación incluyen, por ejemplo, gelantos, viscosificantes, mejoradores de penetración, preservativos, tal como antibióticos y antifúngicos, e ingredientes cosméticos, tal como esencias y colorantes. Los agentes de gelificacion adecuados incluyen: polímeros derivados de celulosa soluble en agua, tal como polímeros de hidroxialquilcelulosa (por ejemplo hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa), carboximetilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa y metilcelulosa, carbómero (por ejemplo carbopol); y carragenanos. El agente de gelificación puede agregarse en cualquier cantidad adecuada, tal como 1-5% (p/p). Los agentes de gelificación preferidos son celulosa derivada, más preferiblemente hidroxialquilcelulosa, particularmente hidroxietilcelulosa. Los preservativos adecuados serán aparentes para los expertos en la técnica, e incluyen los parabenos (metilo, etilo, propilo y butilo), ácido benzoico y alcohol bencílico. Los preservativos utilizados solamente para este propósito generalmente formarán 1% (p/p) o menos de la formulación tópica final. Los mejoradores de penetración adecuados incluyen alcohol de isopropilo, sulfóxidos (tal como dimetilsulfóxido, DMSO), Azonas (por ejemplo laurocapram), pirrolidonas (por ejemplo 2-pirrolidona), alcanoles (por ejemplo decanol), y glicoles (por ejemplo propilenglicol).

Las composiciones preferidas de la invención comprenden: a) I3A; b) mejorador de penetración; c) preservativo; d) agente de gelificación; y e) amortiguador; en donde la composición tiene un pH aparente de entre 3 y 4, inclusive. Una composición particularmente preferida comprende: a) 0.1% (p/p) I3A; b) 30% (p/p) de alcohol isopropilo; c) 0.9% (p/p) de alcohol bencílico; d) . 1.5% (p/p) de hidroxietilcelulosa; y e) 67.5% (p/p) de amortiguador de citrato de pH 3, preferiblemente pH 2.75. La invención ahora será descrita con referencia a las figuras anexas, en donde: Figura 1: muestra una representación esquemática de una célula de Franz. Figura 2: Porcentaje de la ¡soforma 'b' en el gel de isopropanol (pH 6.5). Figura 3: Porcentaje del I3A de 'b' en 30% de amortiguador de IPA/citrato (pH 3). Figura 4: Porcentaje del I3A de 'b' en 100% de alcohol bencílico a 2-8°C, RTP y 40°C. Figura 5: Porcentaje del I3A de 'b' en 100% de fenoxitanol a 2-8°C, RTP y 40°C. Figura 6: muestra a una gráfica para la preparación de 0.1% en p/p de una formulación del I3A 16 y el placebo respectivo. *Para la formulación del placebo 0.25 g de alcohol bencílico se agregó a 24.75 g de la formulación base.

Figura 7: Valores relativos de G' y G" para las Formulaciones 4, 14, 15, 16 y 17 (n = 5 ± SD). Figura 8: Valores correspondientes de tan d para las Formulaciones 4, 14, 15, 16 y 17. Figura 9: Esquema de la cantidad promedio liberada después de 26 h (pg/cm2) del I3A de 'b' de 0.1% en p/p de gel de poloxámero y formulaciones PEG 400, (n = 3 ± SE). Figura 10: Esquema de la cantidad promedio liberada después de 26 h (pg/cm2) del I3A de 'b' de 0.1% en p/p. de aceite y formulaciones PEG 400 (n = 3 ± SE). La presente invención se ilustrará adicionalmente con respecto a lo siguiente, sin Ejemplos limitantes.

EJEMPLO 1 La estabilidad del I3A se investigó en varios sistemas solventes, incluyendo acetona, acetonitrilo, metanol/agua, agua, DMSO, amortiguadores de fosfato (intervalo de pH 4.5 a 7) y amortiguador de amonio (pH 4.5) y se muestra por ser estable en acetona, acetonitrilo, DMSO, amortiguador de fosfato pH 4.5 y amortiguador de amonio (pH 4.5). La redistribución del angelato de ingenol parece ocurrir en el orden del isómero 'b' que redistribuye al isómero 'a' y después al isómero 'c'. bebido a cantidades pequeñas de sustancia activa usadas, la medida de estabilidad del compuesto se calculó como el índice del área máxima de 'b' al área máxima de 'a'.

MATERIALES Tabla 1. Suministradores de materiales usados en este pío Todos los excipientes usados en la formulación final del I3A del grado compendial. METODOS Estudio de estabilidad del I3A en solventes/excipientes Un estudio de estabilidad del I3A en las siguientes combinaciones de solvente/excipientes/excipiente se realizó durante 14 días (a menos que se indique de otra manera) a temperatura ambiente: Acetona Acetonitrilo Metanol Metanol/agua (70/30) Agua Amortiguador de fosfato pH 4.5, pH 5.5, pH 6.5, pH 7.0 DMSO* Aceite mineral Miglyol 810 Polietilenglicol 300 Propilenglicol Acido oleico 2-Hidroxipropilo- -ciclodextrina (Cavasol®/H20) 2-Hidroxipropil-3-ciclodextrins (Cavasol®/P04 pH 4.5) Tween 80/Span 80/H2O Tween 80/Span 80/PO4 pH 4.5 Sulfobutiléter de ß-ciclodextrina (Capt¡sol®)/H20** Sulfobutiléter de ß-ciclodextrins (Captisol®)/P04 pH 4.5** Hialuronato de sodio (HA)/P04 pH 4.5 '** Hialuronato de sodio (HA)/H20 pH 4.5 '** *10 días de estudio **7 días de estudio *** 2 días de estudio 0.5 mg/ml de una solución base del I3A en acetonitrilo se preparó. Las alícuotas de 1.0 mi se transfirieron a frascos de de muestra vidrio individuales mediante una bureta; las soluciones se secaron mediante chorro de aire y después 1.0. g de la combinación de solvente/excipiente/excipiente respectiva se agregó a los frascos. El día 0, día 5 y día 14, las alícuotas de las muestras de estabilidad se eliminaron mediante análisis de CLAR usando las condiciones cromatográficas descritas bajo "estabilidad en DMSO", más adelante. La estabilidad se expresó como el índice máximo de 'b' a máximo de 'a' (y máximo de 'c' se está presente), con un índice alto que indica la estabilidad en un excipiente particular. Análisis de CLAR para la estabilidad del I3A en estudio de excipientes Un método de CLAR alterno se desarrolló para separar un "hombro" que aparece en el máximo de 'b' que se ve con algunas preparaciones del I3A. Las condiciones cromatográficas utilizadas para el estudio de estabilidad de los excipientes con como sigue: Columna: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex) (S/no.3- 34070) Longitud de columna: 100 x 4.60 mm Temperatura de columna: 25°C Columna protectora: C16 Columbus (Phenomenex) (S/no. 202678) Longitud de columna protectora: 50 x 4.60 mm Fase móvil: 50% v/v de amortiguador de pH 4.5 / 50% v/v de acetónitrilo Velocidad de flujo: 1.0 ml/min Longitud de onda UV: 230 nm Volumen de inyección: 10 µ? Tiempo de producción: 35 mins Estudio de difusión in vitro preliminar Una vez que la estabilidad del I3A en los excipientes y mejoradores de penetración se ha establecido, un experimento de difusión in vitro preliminar podrá conducirse para determinar la impregnación del estrato córnea de la piel por I3A de algunas formulaciones simples. La célula de difusión de Franz se diseñó para imitar las condiciones fisiológicas y anatómicas de la piel in situ. Esta es una célula estática de la fase aire/fluido, que comprende un compartimiento donador, compartimiento receptor y un puerto de muestreo de brazo lateral (ver Figura 1). La piel quirúrgicamente suprimida se coloca entre las dos mitades con el estrato córnea de la piel que orienta al compartimiento donador para permitir el uso del fármaco. Un experimento de difusión in vitro inicial que utiliza una formulación simple del I3A en Miglyol se realizó. No hubo flujo del fármaco en todos a través del estrato córnea de la piel que sugiere que el I3A no se formuló en su actividad termodinámica máxima en el Miglyol. Esta formulación se utilizó en los últimos experimentos celulares de difusión como un control negativo y también sirvió para confirmar la integridad del estrato córnea de la piel, como si no hubiera difusión del fármaco de esta formulación, puede asumirse que el estrato córnea de la piel permanece intacto. Fabricación de formulaciones Una formulación del I3A se preparó en amortiguador de fosfato (pH 4.5) con ß-ciclodextrinss (Captisol®) agregado con una vista para incrementar la solubilidad y estabilidad del I3A, y el flujo del fármaco. . Una segunda formulación en DMSO, un mejorador de penetración conocido, también se preparó para los propósitos comparativos, así como una formulación en Miglyol, que sirvió como un control negativo. La difusión del I3A a través del estrato córnea de la piel de estas formulaciones se investigó.

Las siguientes formulaciones se prepararon: Formulación Descripción 1 I3A / Captisol® (30 mM) / amortiguador de fosfato pH 4.5 2 Captisol®(30 mM) / amortiguador de fosfato pH 4.5 control 3 I3A / Miglyol 4 control de Miglyol 5 I3A / DMSO /amortiguador de fosfato pH 4.5 6 DMSO / amortiguador de fosfato pH 4.5 control La tabla 2 muestra el % en p/p de cada uno de los ingredientes presentes en las formulaciones. Los ingredientes se pesaron exactamente en frascos de vidrio sellables y se agitaron vigorosamente con una barra agitadora magnética por varias horas a temperatura ambiente.

Tabla 2. Formulación del I3A para el estudio de difusión ¡n vitro 5 10 15 Elección del líquido receptor El 2-h¡droxipropil- -c¡clodextrina (Cavasol®, 1.38 mM) en amortiguador P0 (pH 4.5) fue el fluido receptor usado en este estudio para intentar y mantener las condiciones de la piel. Una restricción en otros fluidos de reserva tal como sistemas de etanol/agua se impusieron puesto que la 'difusión posterior' de etanol a través del estrato córnea de la piel pudo haber degradado el I3A presentes en las formulaciones. Preparación de la piel Una muestra reciente, quirúrgicamente extirpada de piel humana se obtuvo directamente después de una abdominoplastía. El donante fue. un Europeo Blanco (White Europid) femenino no fumante de 56 años de edad. La grasa subcutánea se retiró cuidadosamente de la muestra de piel usando fórceps y un bisturí, y después la porción de piel se sumergió en agua a 60°C durante 45 s. La piel después se fijó, el lado de la dermis abajo, en un tablero de corcho y la epidermis (que comprende el estrato córnea de la piel y epidermis viable) se retiraron suavemente de la dermis subyacente. La dermis se desechó y la membrana epidérmica se mantuvo a flote sobre la superficie de agua y se tomó sobre papel filtro Whatman no.1. La hoja epidérmica resultante se secó y almacenó completamente en plano en papel aluminio a -20°C hasta uso. Una sección de la hoja epidérmica (con papel filtro hacia arriba) se sujetó e incubó durante 4 h a 4°C inmersa en 0.1% en p/v de solución de tripsina. La piel después se incubó adicionalmente durante 1 h a 37°C. El estrato córnea de la piel se retiró físicamente agitando suavemente la sujeción con movimientos laterales. La capa de estrato córnea de la piel resultante se lavó dos veces con agua desionizada seguido por 0.1% en p/v de solución anti-tripsina para bloquear la actividad enzimática y se lavó adicionalmente dos veces con agua desionizada. El estrato córnea de la piel se secó y almacenó en plano en papel aluminio a -20°C hasta uso. Estudio de difusión de la célula de Franz Las células de difusión de Franz calibradas individualmente con un área superficial difusional promedio de 0.56 ± 0.05 cm2 y un volumen de reserva promedio de 1.79 ± 0.06 mi se utilizaron para conducir los experimentos de difusión. El estrato córnea de la piel (preparado como se describe antes) se lavó con amortiguador de fosfato (pH 4.5), cortó con un taladro de 10" y montó sobre las células de Franz (ilustrado en la Figura 1). El líquido de reserva utilizado fue 2-hidroxipropil- -ciclodextrina (Cavasol®)/ amortiguador de fosfato (pH 4.5) y esto se incorporó en la célula de Franz, se agitó constantemente con un agitador magnético y mantuvo a 37°C. Las membranas se dejaron para equilibrarse con la fase de reserva durante 30 minutos antes de aplicar las formulaciones. Una dosis infinita de cada formulación se aplicó sobre la superficie de la membrana usando un Finpipette® de desplazamiento positivo y cámaras donadoras se protegieron con Parafilm . Se investigaron los cinco tiempos de muestreo (1, 2, 4, 6 y 24 h) por lo cual 200 µ? del fluido de reserva se retiró cuidadosamente del brazo de la célula de Franz; cada muestra retirada se sustituyó por un volumen igual de fluido de reserva fresco (37°C). A través del experimento, cualquier pérdida en el fluido de reserva debido a la evaporación de la célula de Franz se sustituyó para mantener un volumen constante. Las muestras se analizaron vía CLAR (supra).

Análisis de CLAR para estudio de difusión in vitro Las condiciones cromatográficas utilizados fueron como sigue: Columna: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex) (S/no.3-34070) Longitud de columna: 100 x 4.60 mm Temperatura de columna: 25°C Columna protectora: C18 Columbus (Phenomenex) (S/no. 202678) Longitud de columna protectora: 50 x 4,60 mm Fase móvil: 50% v/v amortiguador de amonio pH 4.5 / 50% v/v acetonitrilo Velocidad de flujo: 1.0 ml/min Longitud de onda UV: 230 nm Volumen de inyección: 10 µ? Tiempo de producción: 35 mis Resultados Estabilidad del I3A en solventes y excipientes La tabla 3, a continuación, proporciona una indicación de la estabilidad del I3A en los diferentes sistemas solventes. La estabilidad del I3A en los solventes y excipientes después de 14 días (a menos que se indique de otra manera) a temperatura ambiente se cuantificó en términos del índice de la isoforma 'b' a las isoformas 'a' y 'c', con un predominio de 'b' que iguala la estabilidad. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Se asume que para un excipiente en el cual I3A no es estable, otros excipientes similares no serán adecuados. Tabla 3. Síntesis de los resultados del estudio de estabilidad del I3A en varios solventes y excipientes *10 días de estudio **7 días de estudio ***2 días de estudio Estudio de difusión in vitro preliminar La tabla 4 da una comparación del flujo entre las formulaciones del I3A como se determinó de la cantidad acumulativa del I3A impregnada por área unitaria. DMSO es uno de los mejoradores de penetración tempranos y más ampliamente investigados, y se ha mostrado para mejorar la penetración percutánea de muchos . fármacos en experimentos in vitro e in vivo. Como tal, DMSO fue un excipiente comparador útil para confirmar la penetración del estrato córnea de la piel por I3A. Sin embargo, dada la naturaleza altamente tóxica de este solvente y el hecho de que produce daño a la piel irreversible, DMSO no será utilizado en una formulación final. No hubo ninguna impregnación del I3A observada con la formulación del Miglyol. Una explicación posible para esta carencia de difusión del I3A del Miglyol a través del estrato córnea de la piel es que I3A es altamente soluble en este excipiente. Tabla 4. Comparación del flujo entre formulaciones del I3A como se determinó de la cantidad acumulativa del I3A impregnada por área unitaria (promedio ± s.e.m, n = 3 y 4, respectivamente).

Los resultados muestran que I3A se difunde a través del estrato córnea de la piel (el cual forma la barrera principal para la difusión de la mayoría de los fármacos) a niveles detectables. Estudio de estabilidad a 4-8°C La estabilidad del I3A en varios solventes a 4-8°C se investigó. Una solución de reserva de 1.26 mg del I3A se pesó y disolvió en 2 mi de acetona. Esta solución de reserva se utilizó para preparar las muestras de estabilidad como sigue: Las alícuotas de 100 µ? de solución de reserva se transfirieron a los frascos de CLAR de vidrio individuales vía una jeringa de Hamilton, con enjuague y secado cuidadosos de la jeringa entre cada muestra. Las muestras se secaron mediante chorro de aire y después 0.5 mi del sistema de solvente de prueba apropiado se agregaron. Los sistemas de solventes se probaron en triplicado y se litaron a continuación: 1. 100% v/v de acetona 2. 100% v/v de acetonitrilo 3. 100% v/v de metanol 4. 70% v/v de metanol: 30% en p/p de agua 5. 100% en p/p de agua Las muestras en blanco también se prepararon en triplicado usando 100 µ? de acetona en lugar de la solución de reserva. Las muestras en blanco entonces se secaron y se agregaron 0.5 mi de acetona a cada frasco. Los frascos todos se prensaron, sellaron con parafilm® y colocaron a 4-8°C para la duración del estudio de estabilidad. El análisis de CLAR se realizó en las muestras el día 0, día 1, día 5 y día 14 del estudio de estabilidad. Las muestras se prepararon para el análisis de CLAR como se describe abajo: Las muestras de estabilidad se eliminaron a 4-8°C y dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las alícuotas de 100 µ? se transfirieron a frascos de CLAR de vidrio nuevos usando una jeringa de Hamilton, con enjuague y secado cuidadoso de la jeringa entre cada muestra. Para facilitar el secado de las muestras, se agregaron 0.5 mi de acetona a cada frasco y después las muestras se secaron mediante chorro de aire. Las muestras se reconstituyeron con 1 mi de acetonitrilo y se analizaron mediante CLAR usando las condiciones cromatográficas especificadas antes. Así, I3A es estable en acetona y acetonitrilo a 4-8°C, como se reflejó en el predominio de máxima de 'b' para ambos solventes durante los 14 días. En solventes próticos, la formación del isómero 'a' y después el isómero 'c' aumentó rápidamente. Estabilidad a Vario pH's La estabilidad del I3A se investigó a pH 4.5 en dos amortiguadores es decir fosfato monopotásico / fosfato de disodio y ácido acético / acetato de amonio durante 24 h a temperatura ambiente. El análisis de CLAR mostró que I3A es estable en ambos amortiguadores a pH 4.5 es decir seguía estando un predominio de la isoforma 'b' (Figura 1) después de 24 h. La estabilidad del I3A se investigó a pH 5.5, 6.5 y 7.0 durante 14 días a temperatura ambiente, y se encontró una disminución con un incremento en pH, es decir la formación de la isoforma 'a' y posteriormente la isoforma 'c' ocurre por el día 14. Estabilidad en DMSO El I3A se investigó para la estabilidad en DMSO a temperatura ambiente y a 37°C durante un período de tiempo de 10 días. Una muestra control del I3A en acetonitrilo se guardó bajo mismas condiciones que la muestra de prueba. Las muestras se analizaron por CLAR al inicio del experimento (Día 0), después de 48 horas (Día 2) y otra vez después de 10 días. Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron como sigue: Columna: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex) (S/no.3-34070) Longitud de columna: 100 x 4.60 mm Temperatura de columna: 25°C Columna protectora: Ci8 Columbus (Phenomenex) (S/no. 202678) Longitud de columna protectora: 50 x 4.60 mm Fase móvil: 50% v/v amortiguador de fosfato pH 4.5 / 50% v/v de acetonitrilo Longitud de onda UV: 230 nm Volumen de inyección: 0 µ I Tiempo de producción: 35 mins Tiempo de retención: 15 mins, 24 mins El I3A parece ser estable en DMSO a temperatura ambiente y a 37°C durante 10 días. EJEMPLO 2 Gel de isopropanol pH 6.5 La estabilidad del. I3A 'b' en una preparación de gel de isopropanol (pH 6.) se investigó. El protocolo fue como sigue: Composición del gel de isopropanol (pH 6.5) El carbopol se dispersó en el agua y glicerina y se disolvió calentando a 40 °C en un baño de agua. El alcohol propílico después se agregó a esta solución. La ciclometicona se disolvió en alcohol isopropílico y esta segunda solución se mezcló bien con la solución de carbopol®, y después se agregó agua, con agitación, al 100%. El pH del gel se llevó a 6.5 con la adición gota a gota de etanolamina. El gel de isopropanoi se almacenó a 2-8°C hasta uso. Para investigar la estabilidad del I3A 'b' en el gel de isopropanoi (pH 6.5), se prepararon y dividieron 0.02% (p/p) del I3A 'b' / formulación del gel de isopropanoi en tres muestras para almacenamiento a 2-8°C, RTP y 40°C. En puntos de tiempo regulares las muestras se analizaron en duplicado para la estabilidad del I3A 'b' en términos de la formación de la isoforma 'a', con los resultados dados en la Figura 2. 13A 'b' cambia a la isoforma 'a' y posteriormente a la isoforma 'c'. Esto puede atribuirse posiblemente al pH mayor y p¾psencia de agua en el gel de isopropanoi que facilita esta conversión del I3A 'b' a las isoformas 'a' y 'c'. I3A 'b' en 30% en p/p de alcohol isopropíl ico/amortiguador de citrato pH 3.0 La estabilidad del I3A 'b' (Lote No. 240902) en 30% en p/p de IPA/amortiguador de citrato (pH 3) después de almacenada a 2-8°C y 40°C se investigó en duplicado, con los resultados dados en la Figura 3. Preservativos Varios preservativos se investigaron para su conveniencia para uso en las formulaciones del I3A 'b' a concentraciones probablemente para pasar una prueba eficacia preservativa. Los preservativos se prepararon inicialmente en amortiguador de citrato (pH 3) y se analizaron mediante CLAR para comprobar los máximos en los cromatogramas que pudieron interferir con el ensayo para las isoformas del I3A. Los resultados se resumen en la Tabla 5. Tabla 5. Análisis de CLAR de los preservativos No es deseable tener muchas máximas de interferencia en los cromatogramas de los preservativos, pues esto conduce a dificultades en el análisis del fármaco en formulaciones, y podría ser necesaria la introducción de un análisis separado para los preservativos. El I3A de 'b' (0.05% en p/p) se disolvió por separado en los preservativos seleccionados (alcohol bencílico y fenoxietanol), almacenados a 2-8°C, RTP y 40°C y comprobados para saber si hay estabilidad en duplicado en términos de la formación de la isoforma 'a' en intervalos regulares. Los resultados de este estudio de estabilidad se dan en las Figuras 4 y 5. Los resultados indican que el alcohol bencílico es el preservativo más adecuado de los probados.

Preparación de las formulaciones del I3A de 'b' Las siguientes tres formulaciones y sus placebos respectivos se prepararon: A. 0.1% (p/p) del I3A de 'b7 crema de macrocetiléter con 1.0% (p/p) alcohol bencílico como preservativo B. 0.1% (p/p) del I3A de 'bV30% (p/p) de IPA/1.5% (p/p) de HEC/1.0% (p/p) de alcohol bencílico/citrato pH 3 C. 0.1% (p/p) del I3A 'b'/9.5% (p/p) de ciclometicona/9.5% (p/p) de IPM/1.0% (p/p) de alcohol bencílico/Elastómero 10 Una solución de reserva del I3A de 'b' se preparó en alcohol bencílico (Tabla 6) y esta reserva se utilizó para preparar las formulaciones. Para los placebos, el alcohol bencílico solamente se utilizó en lugar del I3A 'b'/reserva de alcohol bencílico. Las masas exactas de los componentes de las formulaciones del I3A de 'b' se detallan en las Tablas 7-9. Las formulaciones y sus placebos respectivos se prepararon como sigue: Formulación A: I3A 'b'/crema de macrocetiléter El ungüento emulsionante del macrocetiléter se pesó exactamente en un frasco de vidrio y después se derritió en un baño de agua a 60°C. El amortiguador de citrato preparado recientemente (pH 3) se pesó exactamente en un frasco de vidrio separado, se calentó en el baño de agua y después se incorporó gradualmente en el ungüento emulsionante fundido con agitación constante hasta enfriarse. Este proceso produjo la crema del macrocetiléter. Para preparar la formulación, el I3A de 'b' en alcohol bencílico se pesó exactamente en un frasco de vidrio y la crema de macrocetiléter se pesó gradual y exactamente en este, con agitación constante.

Formulación B: I3A de 'b'/30% de gel de IPA El I3A de 'b'/alcohol bencílico se pesó exactamente en un frasco de vidrio. Los componentes restantes se pesaron exactamente en esta solución en el orden de IPA, después amortiguador de citrato y después HEC, con mezclado vigoroso entre cada adición. Formulación C: I3A 'b'/siliconas El I3A 'b'/alcohol bencílico se pesó exactamente en un frasco de vidrio. Los componentes restantes se pesaron exactamente en esta solución en el orden del elastómero 10, después ciclometicona y después IPM, con mezclado vigoroso entre cada adición. Análisis de formulación Las formulaciones se analizaron al inicio del estudio para confirmar la concentración del I3A de 'b' (p/p) en las formulaciones y se encontraron para ser aproximadamente 0.1% (p/p) del ?3? de 'b'. De este contenido del I3A de 'b' total, había menos de 0.7% de la isoforma 'a' y ningún isoforma 'c' en las formulaciones. Las formulaciones se comprobaron, para la presencia de la isoforma 'a' para el tiempo de la conclusión del estudio y donde se muestra que tiene menos de 0.3% de la isoforma 'a' cuando se almacenaron a 2-8°C. La isoforma 'c' no se detectó en ninguna de las formulaciones.

Tabla 6. Solución de reserva de I3A de 'b'/Alcohol bencílico Tabla 7. Formulación A Tabla 8. Formulación B Tabla 9. Formulación C Estabilidad de las isoformas 13A en los sistemas de solventes de ensayo durante 72 h La estabilidad de las isoformas de I3A de 'a', 'b' y 'c' en tres sistemas de muestra durante 72 h (equivalente a la longitud posible máxima de tiempo de las muestras se pudo sostener en el automuestreador durante una serie analítica de CLAR largo) se confirmó como sigue. Los estándares de las tres isoformas del I3A (aproximadamente 100 pg/ml) se prepararon recientemente en acetonitrilo, acetonitrilo/amortiguador de citrato (pH 3) y acetonitrilo/amortiguador acetato de amonio (pH 4.5) y analizado inmediatamente por CLAR. Los estándares después cada uno se dividió en tres volúmenes iguales y se colocaron a 2-8°C, temperatura ambiente y 40°C durante 72 h y después de nuevo se analizados por CLAR. Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 10. La conversión mayor del I3A de 'b' a la isoforma 'a' a temperatura ambiente ocurrió con la muestra preparada en 100% v/v de acetonitrilo mientras el estándar del I3A de 'b' en acetonitrilo/citrato (pH 3) mostró la conversión muy pequeña a la isoforma 'a' incluso a 40°C, sugiriendo que este sistema de solvente pudo ser el más apropiado para asegurar las muestras que sigan siendo estable durante el tiempo de muestreq.

Tabla 10. Estabilidad de las isoformas 'a', 'b' y 'c' en diferentes sistemas solventes kcetonitrilo 15 EJEMPLO 3 Un estudio de estabilidad de pH del I3A de 'b' en los geles de IPA preparados con amortiguador de citrato en el intervalo de pH de 2.5 a 4.0 se condujo a 2-8°C y 40 (estabilidad acelerada). MATERIALES MÉTODOS Preparación de geles del I3A de 'b' y placebos usando el amortiguador de citrato en el intervalo de pH de 2.5 a 4.0. Las composiciones de geles de IPA activos y de placebo preparados para el estudio de estabilidad del intervalo de pH se dan en las tablas 11 y 12, respectivamente. Las cantidades mayores de placebo se prepararon para facilitar la medida del pH de los geles de placebo en el Tiempo 0. Las cantidades pequeñas del gel activo es decir 30 g de cada una se prepararon puesto que la cantidad de fármaco disponible para el estudio se limitó. Los estudios de estabilidad anteriores conducidos en el gel de IPA del I3A, en los cuales los pH aparentes del gel de placebo y activo se supervisaron durante 12 meses, han mostrado que no hay diferencia notable entre los dos. Además, el mismo pH aparente se midió para los geles activos y de placebo. Así, solamente el pH de los geles de placebo se midió, para determinar el pH aparente de los geles al inicio del estudio de estabilidad. Después de la hidratación durante la noche, los geles se analizaron para el punto de tiempo T = 0 y los valores de pH aparentes de los placebos se midieron. Las muestras se dividieron igualmente en los frascos de vidrio de soda de 7 mi para evitar la ciclización de temperatura del material cuando el muestreo en los diferentes puntos de tiempo y los frascos se almacenó a 2-8°C y 40°C (estabilidad acelerada), respectivamente.

Tabla 11. Composición de geles de IPA activos preparados con amortiguador de citrato en el intervalo de pH de 2.5 a 4.0 Tabla 12. Composición de geles de IPA de placebo preparados con amortiguador de citrato en el intervalo de pH de 2.5 a 4.0 5 10 15 La medida del pH aparente de los geles de placebo de IPA preparados usando el amortiguador de citrato en el intervalo de pH de 2.5 a 4.0. El pH aparente de los geles de placebo de IPA preparados usando el amortiguador de citrato en el intervalo de pH de 2.5 a 4.0 se midió usando un medidor de pH Jenway 3320. Extracción del I3A de los geles de IPA El fármaco se extrajo de los geles de IPA como sigue. Un gramo de cada uno de los geles o sus placebos respectivos se pesó exactamente en un matraz volumétrico de 10 mi en duplicado o triplicado. Las muestras primero se mezclaron con 1 mi de amortiguador de citrato (pH 3) por mezclado vigoroso y repetitivo en un mezclador de vórtice fijó a velocidad máxima y después de dejó agitando en un agitador orbital durante 30 minutos en 400 rpm. Los matraces volumétricos entonces se hicieron a la marca de volumen con acetonitrilo en CLAR-grado y las muestras se sometieron otra vez a mezclado vigoroso mezclándose repetitivamente en un mezclador de vórtice fijado a velocidad máxima y después se dejó agitando en un agitador orbital durante 60 minutos en 400 rpm. Las alícuotas se transfirieron a los frascos de CLAR para análisis. La extracción del I3A del gel se realizó en triplicado es decir tres pesados-salidas separados con inyecciones duplicadas por los puntos de Tiempo 0 y Tiempo = tres meses (muestras 2-8°C) y en duplicado es decir dos pesados-salidas separados con inyecciones duplicadas por el Tiempo = una semana y cuatro semanas (muestras 40°C). Análisis de CLAR El análisis se realizó usando los siguientes sistemas y condiciones: Instrumentos Waters Alliance 2695 Separations Module (S/no. B98SM4209M). Detector de Absorbencia Waters 2487 Dual ? (S/no. M97487050N). Waters Alliance 2695 D Separations Module (S/no. G98SM8039N). Detector de Absorbencia Waters 2487 Dual ? (S/no. L02487106M) Empower Pro Empower™ Software Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron como sigue: Columnas: Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex) S/no.3-34070 y S/no. 1034024A Longitud de Columna: 100 x 4.60 mm Temperatura de Columna: ambiente Columnas Protectoras: C 8 Columbus (Phenomenex) S/no. 202678 and S/no. 74554-7 Longitud de Columna Protectora: 50 x 4.60 mm, Fase Móvil: 50% v/v de amortiguador de acetato sódico pH 4.5 / 50% acetonitrilo (v/v) Velocidad de Flujo: 1.0 ml/min Longitud de onda UV: 230 nm Volumen de Inyección: 30 µ? Tiempo de producción: 35 mins Temperatura del automuestreador: 8°C ± 2°C Tiempos de Retención: 13 mins ± 2 mins de isoforma 'a'; 22 mins ± 2 mins de isoforma 'b'; 23 mins ± 2 mins de isoforma 'c'; máxima no asignada con tiempo relativo de retención a la isoforma "b' de 0.93 ± 0.02.

RESULTADOS Medida del pH aparente de los geles de placebo en el Tiempo 0 Los resudados para la medida del pH aparente de los geles de placebo se dan en la Tabla 13. No se tomó ninguna medida de pH en cualquiera de los puntos de tiempo de estabilidad.

Tabla 13. Medida del pH aparente de los geles de placebo de IPA (n = 1) Determinación del porcentaje de purezas máximas de las isoformas del I3A en los geles activos El porcentaje de purezas máximas del I3A de 'b' en los geles activos al inicio del estudio de estabilidad (T = 0), y después de una semana de almacenamiento a 40°C, cuatro semanas de almacenamiento a 40°C, y después de tres meses de almacenamiento a 2-8°C, se dan en las Tablas 14, 15, 16 y 17, respectivamente. El porcentaje de pureza máxima del I3A de 'b' fue mayor del 98% mientras que el porcentaje de pureza máxima de la isoforma 'a' fue menor de 1.2% para todos los geles después de tres meses de almacenamiento a -28°C. Para el estudio de estabilidad acelerado a 40°C, la disminución mayor en el porcentaje de pureza máxima de 'b' durante las cuatro semanas fue observada con el gel con el valor del placebo aparente de 4.74. Puesto que I3A de 'b' se ha mostrado para convertir a la isoforma 'a', la formación de la isoforma 'a' también sé examinó como un marcador de estabilidad. Los incrementos en el porcentaje de pureza máxima de la isoforma 'a' del Tiempo 0 después de una semana y cuatro semanas de almacenamiento a 40°C, y después de tres meses de almacenamiento a 2-8°C se calcularon, con los resultados dados en la Tabla 18.

Tabla 14. Porcentaje de purezas máximas de las isoformas del I3A en los geles activos (n = 3, medio ± desviación estándar, UAP = máxima no asignada, RRT = tiempo de retención relativo) en el Tiempo 0 Tabla 15. Porcentaje de purezas máximas de las isoformas del I3A en los geles activos (n = 2, medio ± intervalo, UAP = máxima no asignada, RRT = tiempo de retención relativo) después de una semana de almacenamiento a 40°C Tabla 16. Porcentaje de purezas máximas de las isoformas del I3A en los geles activos (n = 2, medio ± intervalo, UAP = máxima no asignada, RRT = tiempo de retención relativo) después de cuatro semanas de almacenamiento a 40°C Tabla 17. Porcentaje de purezas máximas de las isoformas del I3A en los geles activos (n = 3, medio ± desviación estándar, UAP = máxima no asignada, RRT = tiempo de retención relativo) después de tres meses de almacenamiento a 2-8°C Tabla 18. Incremento calculado en el porcentaje de máximas de la isoformas 'a' del I3A en el Tiempo 0 geles de IPA Los datos sugieren que el pH tiene un efecto en la formación de la isoforma 'a' incluso cuando el gel se almacena a 2-8°C por tres meses. Un incremento en el porcentaje del área máxima de la isoforma 'a' de 0.21% se midió con el gel preparado con amortiguador de citrato de pH 3.00 comparado a un incremento de 0.44% en el porcentaje del área máxima de la isoforma 'a' para el gel preparado con amortiguador de citrato de pH 3.5. Por T=4 semanas a 40°C, las diferencias entre los geles en términos de los incrementos en el porcentaje de purezas máximas de la isoforma 'a' se amplificaron. EJEMPLO 4 Formulaciones de Aceite MATERIALES METODOS Selección de aceites/excipientes adecuados El aceite de sésamo, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena promedio), aceite de soja, aceite de maíz, y aceite de cacahuete, se identificaron como vehículos para la administración parenteral. Cada uno puede utilizarse hasta un nivel del 100%. Otros excipientes, que pueden incluirse en las formulaciones parenterales de aceite, se muestran más adelante, junto con las concentraciones máximas usadas.

Preparación del I3A y formulaciones del placebo para estudios de estabilidad preliminar. Esterilización del aceite de coco fraccionado Aproximadamente 50 g del aceite de coco fraccionado (CRODAMOL GTC/C) se pesaron en un matraz cónico dé 100 mi (vidrio de borosilicato), tapado (tapón de vidrio de borosilicato) y se colocó un horno precalentado (horno de caja caliente Gallenkampf con ventilador, Tamaño 2) a 173 ± 5°C durante 1 h. Después de este procedimiento, el aceite se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de uso Adición del I3A al aceite esterilizado Aproximadamente 10 mg del I3A se pesó exactamente en un frasco de vidrio de 28 mi y se agregaron aproximadamente 200 mg de alcohol bencílico (peso exacto conocido), que se habían filtrado previamente a través de un filtro de 0.22 pm MILLEX-GV. Esta mezcla se sometió a vértice periódicamente por aproximadamente 2 h hasta que el I3A se había disuelto en el alcohol bencílico. A esta mezcla aproximadamente 9.79 g del aceite esterilizado se agregaron y se sometió a vértice por aproximadamente 5 minutos hasta que una solución homogénea se obtuvo. El placebo se preparó de una manera similar excepto que aproximadamente 9.80 g (en comparación con 9.79 g) del aceite esterilizado (peso exacto conocido) se utilizó para compensar al I3A. Las composiciones de peso y porcentaje se muestran en las Tablas 19 y 20 para las formulaciones activas (I3A) y de placebo. Tabla 19. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite del I3A * Redondeado hasta 3 d.p. Tabla 20. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación del aceite de placebo * Redondeado hasta 3 d.p. Condiciones de almacenamiento para I3A y formulaciones del placebo Las alícuotas de cada formulación (placebo o activo) se dispensaron en frascos de vidrio ámbar con tapa roscada de 2 mi (vidrio de borosilicato), sellados y almacenados en dos condiciones de almacenamiento es decir 2-8°C y 25 ± 2°C. Las formulaciones se probaron usando el método descrito abajo en los tiempos de almacenamiento hasta e incluyendo un mes. Estabilidad preliminar del I3A en aceite de coco fraccionado La Tabla 21 resume la estabilidad del I3A en aceite de coco fraccionado almacenado a 2-8°C y 25°C durante 43 días. Los datos de estabilidad indican que no aparecen estos incrementarse en el porcentaje de la isoforma 'a' durante el almacenamiento a 2-8 y 25°C después de 43 días, comparable al porcentaje de la isoforma 'a' de un lote nuevo del I3A en los días t=0 y t=43. Tabla 21. El porcentaje de la isoforma 'a' como un porcentaje de la isoforma 'a' y I3A de 'b' almacenado en dos condiciones durante 43 días.

RESULTADOS Esta diferencia no fue significativa (p>0.05) en el tiempo del área máxima y retención de las isoformas 'a' y 'b' del I3A entre las muestras inyectadas en acetonitrilo o acetonitrilo/aceite.

De la lista de aceites dos disponibles fueron considerados adecuados para la formulación del I3A es decir, aceite de coco fraccionado y aceite de sésamo. La esterilización recomendada de aceite del sésamo es 2 h a 170°C mientras que para el aceite de coco fraccionado es 1 h a 170°C. Esto tiene ventajas con respecto a la cantidad de tiempo y energía consumida para la preparación de la formulación. Debido a la inestabilidad del I3A al calor (experimentalmente probado, los datos no se muestran), el aceite tiene.que esterilizarse por separado y el I3A agregado asépticamente (filtrado) como una solución disuelta en alcohol bencílico. Un medio de filtro se ha identificado para ser adecuado para la filtración de la mezcla del l3A/alcohol bencílico es decir un filtro de 0.22 µ?? MILLEX-GV, sin embargo, la adsorción del I3A en la membrana de filtro todavía requiere investigación. Si se desea, debido a la viscosidad relativamente baja de este aceite (aproximadamente 30 mPas comparada al aceite de sésamo que tiene una viscosidad de aproximadamente 44 mPas) la formulación también podría prepararse in situ con l3A/alcohol bencílico y la formulación completa esterilizada mediante filtración.

EJEMPLO 5 Formulaciones Orales Un número de excipientes se seleccionaron para las formulaciones bucales, y 17 formulaciones no acuosas se prepararon y evaluaron visualmente para la consistencia y solvatación. Una variedad de polímeros fue como los vehículos mucoadhesivo potenciales. Debido a la inestabilidad inherente del I3A en sistemas acuosos, las formulaciones investigadas no fueron acuosas, sustituyendo el glicerol y polietilenglicol (PEG) para la fase acuosa. MATERIALES METODOS Investigación visual preliminar de formulaciones del placebo Diecisiete formulaciones del placebo se prepararon inicialmente y identificaron visualmente para la consistencia y solvatación (Tabla 22). Brevemente, las cantidades requeridas de PEG 400 y carbopol 934 se agitaron en los frascos de vidrio de 28 mi durante 10 minutos con una espátula y los otros ingredientes se agregaron en el siguiente orden, g I ice rol , alcohol bencílico y metilcelulosa ó HEC o HPC. Las formulaciones después se mezclaron con un agitador Silverson 14RT en aproximadamente 10,000 rpm por aproximadamente 2-3 minutos. Todas las formulaciones del placebo mezcladas se dejadas a solvato durante la noche (> 24 h) antes de la investigación visual.

Tabla 22. Composición de las formulaciones del placebo para el gravamen visual Investigación reológica de formulaciones del placebo (mucoadhesión) Un proceso para el estudio de la mucoadhesión es la caracterización reológica de interfaz mucoadhesiva. Se basa en la suposición que el grado de interpenetración puede detectarse midiendo las diferencias en parámetros reológicos entre los geles de polímero y sus mezclas con mucina. El incremento sinérgico en viscosidad se ha propuesto como un índice de la fuerza de enlace de bioadhesión. A partir de la identificación visual, cinco formulaciones del placebo se eligieron basadas en viscosidad y solvatación, para la valoración reológica adicional usando mucina porcina. Las formulaciones elegidas se listan en la Tabla 23. Tabla 23. Formulaciones elegidas para identificación reológica Preparación de muestras para valoración reológica Preparación de mucina porcina Brevemente, se pesaron 15 g de polvo de mucina porcina en un vaso de laboratorio y formaron en 150 g usando agua desionizada para dar una concentración final de 10% en p/p de mucina. Esto se dejó hidratar a 2-8°C por aproximadamente 2-3 h. La mucina hidratada se diluyó adicionalmente con agua desionizada para obtener una concentración final de 5% en p/p de mucina en agua desionizada. Esto se dejó hidratar durante la noche en el refrigerador a 2-8°C. Preparación de la mezcla de f ormulación/mucina Las formulaciones seleccionadas (Tabla 23) se prepararon como se describe antes. A cada una de las formulaciones en peso igual de 10% en p/p de mucina se agregó y agitó suavemente con una espátula. Esto se dejó hidratar a 2-8°C durante la noche. Además, las formulaciones seleccionadas también se diluyeron (50:50 p/p) con agua desionizada y se dejó hidratar durante la noche en el refrigerador a 2-8°C. Procedimiento de prueba reológico dinámico (oscilatorio) La identificación reológica se realizó usando un reómetro Cammed CSL2. Aproximadamente 0.5 g de la muestra de prueba se colocaron entre la plataforma y la geometría de placa paralela. Una vez que la muestra se comprimió entre la plataforma y placa cualquier exceso de muestra se retiró cuidadosamente usando una espátula a ángulos rectos a la geometría. Cada muestra se probó a un total de cinco veces dando por resultado el espectro mecánico. Los parámetros resultantes obtenido de G', G" y tan d se utilizaron para determinar la fuerza mucoadhesiva de las formulaciones, donde G' es el módulo elástico, G" el módulo viscoso y tan d el índice de G' a G". Optimización y preparación de formulaciones activas y de placebo seleccionadas Después de la prueba reológica de dos formulaciones se seleccionaron para la optimización adicional (Formulación 16 y 17) con respecto a la preparación del lote de la formulación para estabilidad. El proceso de fabricación optimizado se utilizó para preparar los lotes de formulaciones activas (conteniendo I3A) y placebo (25 g de cada uno). La Figura 6 muestra la preparación de la formulación activa y placebo 16 con las cantidades objetivo de excipientes/fármaco usados. Brevemente, la cantidad requerida de carbopol T34 se agregó al PEG 400 en una botella de borosilicato y se calentó a 50°C por aproximadamente 2 h hasta que la mezcla se solvató completamente. Esta mezcla se enfrió a temperatura ambiente; la cantidad requerida de glicerol se agregó y la mezcla se calentó a aproximadamente 60°C en un baño de agua durante 2 h hasta que se formó una goma homogénea. La cantidad requerida de HEC se agregó y agitó en la mezcla enfriada usando un mezclador Silverson L4RT fijado a aproximadamente 10,000 rpm durante 2-3 minutos. Esta mezcla entonces se dejó completamente al solvato durante la noche (aproximadamente 12 h) a temperatura ambiente. Como en la se figura 6 se muestra esto produce una 'formulación base'. La formulación activa se preparó inicialmente disolviendo el I3A en alcohol bencílico. La cantidad requerida de l3A/alcohol bencílico se agregó a la formulación base solvatada y se agitó suavemente con una espátula para dar una concentración final de 0.1% en p/p de I3A. Similarmente, la formulación del placebo se preparó agregando el alcohol bencílico a la mezcla solvatada y se agitó suavemente. La formulación 17 se preparó de una manera similar. La tabla 24 muestra el % en p/p objetivo de excipientes/l3A en las formulaciones activas y de placebo. Aproximadamente 1 g del placebo y formulaciones .activas se sometieron a alícuota en los frascos con tapa roscada de 2 mi y se colocaron en estabilidad a 2-8°C, 25°C y 40°C (la última temperatura se utilizó para estudios de estabilidad acelerados a corto plazo). Tabla 24. % en p/p objetivo (a 1 d.p.) en las formulaciones activas y de placebo optimizadas Análisis del I3A en la formulación Extracción del I3A de la formulación activa Para los propósitos de la evaluación del producto de fármaco un método de extracción estableció para evaluar la degradación del I3A de 'b' a la isoforma 'a' (pureza máxima cromatográfica). La extracción del I3A de la formulación activa fue como sigue (el mismo procedimien.to también se utilizó para la formulación del placebo). Brevemente, de manera aproximada 1 g de la formulación se pesó exactamente en un matraz volumétrico de 10 mi seguido por 1 mi de amortiguador de citrato (pH 3). Esto se sacudió suavemente a mano por aproximadamente 5 minutos hasta homogeneidad y estableció a volumen con metanol grado de CLAR. El matraz después se agitó en una agitador mecánico por aproximadamente 2 h. El contenido del matraz después se transfirió a un tubo de polipropileno de 15 mi y se centrifugó durante 5 minutos a 2200 rpm. El sobrenadante se sometió a alícuota en frascos de CLAR y se analizó. Los datos recuperados preliminares (no mostrados) indicaron que aproximadamente 80% o más del I3A de 'b' se recuperaron de la formulación activa y más significativamente, fue sin ninguna interferencia de cualquiera de los excipientes en la formulación. Método de CLAR El método de análisis para el análisis del I3A en la formulación bucal se muestra a Continuación. Columna: Simetría Ci8 - 5 µ?t? (aguas) (S/no.T636515 07, P/no. WAT054205) Longitud de columna: 150 x 3.90 mm Temperatura de columna: 30°C Columna protectora: Simetría C-i 8 - 5 pm (aguas) (P/no. WAT054225) Longitud de columna protectora: 20 x 3.90 mm Fase móvil: 0.02% en v/v de TFA en agua (A); 0.02% en v/v de TFA en acetonitrilo (B) A:B; 50:50 (composición de inicio) (GRADIENTE, ver Tabla más adelante) Velocidad de flujo: 1.0 ml/min Longitud de onda UV: 230 nm (PDA) Volumen de inyección: 10 Tiempo de producción: 20 minutos Temperatura del automuestreador: 8°C Las muestras y placebos se probaron en tiempo cero. En aproximadamente 1-2 semanas, las muestras se almacenaron a 40°C también se probaron para obtener ciertos datos de estabilidad acelerada.

RESULTADOS Identificación visual La identificación visual se realizó cualitativamente y proporcionó un método relativamente eficiente de pre-identificación de un número de formulaciones con respecto a la viscosidad y solvatación. Las formulaciones del placebo se determinaron por dos asesores independientes y rechazaron en la base donde la viscosidad fue demasiado alta o demasiado baja. Además, cualquier formulación, que no se solvató totalmente, también se rechazó. Fue absolutamente aparente que de acuerdo con el método de preparación una concentración de carbopol 934 mayor de 1.5% en p/p produjo geles no acuosos los cuales fueron demasiado viscosos y/o no se solvataron completamente. Una reducción en la cantidad de carbopol 934 a 0.5% en p/p y adición de metilcelulosa en una concentración de 2.0% en p/p produjo un gel de viscosidad baja. Sin embargo, el incremento de la concentración de carbopol 934 a 1.0% en p/p y reducción concomitantemente de la concentración de metilcelulosa a 1.0% en p/p todavía dieron un gel el cual fue bajo en viscosidad. De las observaciones visuales parecería que la adición de metilcelulosa no influenció la viscosidad en gran parte comparada a la adición del carbopol 934. Sin embargo, la metilcelulosa se ha mostrado por tener propiedades mucoadhesivas y por lo tanto otras formulaciones se prepararon que contuvieron 1.0 y 1.5% en p/p de metilcelulosa en combinación con 1.5 % en p/p de carbopol 934. La valoración visual de estas formulaciones mostró que fueron homogéneas y tienen la consistencia requerida para la evaluación adicional. Similarmente, HPC se encontró para no afectar la viscosidad con relación a la adición del carbopol 934. Sin embargo, puesto que HPC también se ha involucrado como un mucoadhesivo potencial, las formulaciones que contienen HPC en 1.0 y 1.5% en p/p junto con carbopol 934 en 1.5 %/p/p se encontraron visualmente aceptables para la valoración reológica adicional. La formulación 4 también se encontró para ser visualmente aceptable con respecto a la viscosidad y solvatacion y esta incluye HEC (otro polímero mucoadhesivo potencial). Por lo tanto cinco formulaciones (formulación 4, 14, 15, 16 y 17) fueron reológicamente determinadas por su fuerza mucoadhesiva usando mucina de cerdo. Valoración reológica de las formulaciones 4, 14, 15, 16 y 17 El módulo elástico G' es una medida de resistencia de muestra a la deformación elástica (es decir una reflexión de la conectividad de red del polímero) y G" es una medida de resistencia de muestra a la deformación viscosa. La G' y G" promedio en 5 Hz, promediadas durante 5 muestras se extrajeron de los datos resultantes para permitir las comparaciones entre diferentes formulaciones. Una expresión que permite la determinación de diferencias sinérgicas, en términos de G' y G"; entre la mezcla de formulación/mucina y los componentes individuales de esa mezcla se dan en la ecuación 1.

Cuanto más altos, los valores de G' relativos mayor es la interacción de la formulación con el mucina.

G' relativa = Ecuación 1 Una ecuación similar puede utilizarse para calcular G". La tan d se calculó usando los valora de G' y G" relativos usando la Ecuación 2.

Re lativa promedio Re lativa promedio Ecuación 2 La Figura 7 muestra los valores de G' y G" relativos para todas las cinco formulaciones probadas y la Figura 8 muestra los valores de tan d correspondientes. Masado en la valoración Teológica, la orden para el incremento en fuerza mucoadhesiva se encuentra por ser la formulación 17 > Formulación 16 > Formulación 14 > Formulación 15 > Formulación 4. Sin embargo, las formulaciones 14 y 15 exhibieron variaciones mayores (como se observó con las desviaciones estándar mayores). Esto podrá deberse a las interacciones no homogéneas de estas formulaciones con mucina. Además, la G' generada para las formulaciones en agua desionizada también se encontró por tener variaciones grandes así indicando que estas formulaciones exhibieron hidratación no homogénea. La formulación 4 se encontró por tener los valores de G' mayores cuando se mezcló con la mucina, sin embargo, el valor de G' relativo fue significativamente menor (p<0.05) comparado con todas las otras formulaciones probadas. Esto se atribuyó al hecho que los valores de G' para la Formulación 4 dispersada en agua fue considerablemente mayor comparada con todas las formulaciones dispersadas en agua. Parecerá que la Formulación 4 produjo un gel viscoelástico relativamente bueno en agua (comparada a las otras formulaciones en agua), no obstante esto parecerá ser una interacción relativamente pequeña con mucina puesto que el valor de G' relativo, que elimina el efecto de la formulación (así como el efecto de la mucina) fue significativamente menor. De acuerdo con los valores de G' relativo, las Formulaciones 16 y 17 muestran la interacción mayor con mucina de cerdo que interfiere que estas dos formulaciones pudieran utilizarse como formulaciones mucoadhesivas potenciales. Las formulaciones 14 y 15 muestran una cierta interacción con mucina, no obstante la hidratación/interacción de estas formulaciones podría ser no homogénea como se consideró por las desviaciones estándares mayores. La formulación 4 mostró el valor de G' menor y por lo tanto la interacción menor. Los valores de tan d correspondientes son una medida relativa de la viscoelasticidád, la tan d menor indica que una complicación relativamente mayor e inversamente la tan d mayor indica una complicación relativamente baja (debido a un componente viscoso relativamente mayor) y así soportando estas observaciones.

Optimización y preparación de formulaciones activas y placebo seleccionadas. El procedimiento de optimización se realizó para reducir el tiempo de preparación para las formulaciones de aproximadamente 24 h a aproximadamente 12 h. Las formulaciones 16 y 17 se eligieron para los estudios de optimización y estabilidad. Análisis de CLAR de las formulaciones del I3A La tabla 25 muestra el porcentaje de purezas máximas para el I3A de 'b' así como el porcentaje de área, de la isoforma 'a' y otros máximos no asignados (UAP) para las Formulaciones 16 y 17 tomados en tiempo cero. También se muestra como un comparador es el porcentaje de pureza máxima de 0.1% en p/p de muestra de gel del I3A de IPA en tiempo cero. Todas las máximas para las formulaciones bucales se integraron y compararon manualmente a las formulaciones del placebo respectivas. Tabla 25. Porcentaje de purezas máximas de formulaciones en tiempo cero.

La tabla 26 muestra el porcentaje de purezas máximas para I3A de 'b' así como el porcentaje de área de la isoforma 'a' y otras máximas no asignadas (UAP) para las Formulaciones 16 y 17 tomadas en aproximadamente dos semanas después del almacenamiento a 2-8°C y 40°C (estabilidad acelerada). También tabulado como un comparador es el porcentaje de pureza máxima de 0.1% en p/p de gel de IPA del I3A almacenado a 40°C durante una semana. Todas las máximas para las formulaciones bucales se integraron manualmente comparadas a las formulaciones del placebo respectivas. Tabla 26. Porcentaje de purezas máximas cromatográf icas de formulaciones en tiempo de aproximadamente 1-2 semanas almacenadas a 2-8°C y 40°C.

* Pureza máxima después de una semana; ND - no determinado No parece ser aparente la diferencia en el porcentaje de pureza máxima del I3A en cualquiera de las formulaciones, en tiempo cero al valor inicial en recepción (99.3% del I3A de "b\ reporte PB21001/24). Además, el porcentaje de área de la isoforma 'a' en recepción fue 0.40%, que es similar al porcentaje de área máxima para la isoforma 'a' en tiempo cero (Tabla 25). No se incremento notablemente en el porcentaje de la isoforma 'a' después de aproximadamente 1 a 2 semanas de almacenamiento de de las formulaciones bucales, a 2-8°C (Tabla 26), mientras que un incremento en el porcentaje de la isoforma 'a' se observó para todas las muestras bucales almacenadas a 40°C. Sin embargo, el incremento en el porcentaje de la isoforma 'a' observado para 0.1% en p/p de gel de IPA fue mayor (1.60%) después de 1 semana de almacenamiento a 40°C. Basado en el porcentaje de purezas máximas, estos datos preliminares parecerían indicar que las formulaciones bucales del I3A son por lo menos tan estables como el 0.1% de gel de IPA del I3A y posiblemente aún más estable. EJEMPLO 6 Formulaciones de Poloxámero Cuatro formulaciones de se investigaron. MATERIALES MÉTODOS Elección de excipientes Antes de los estudios de preformulacion, varios excipientes adecuados para formulaciones de poloxámero se identificaron, y se listaron más adelante, junto con concentraciones recomendadas máximas.

* Utilizado para la formulación de control Preparación de formulaciones para estudios reológicos Varias formulaciones de poloxámero 407 del placebo se prepararon usando los excipientes listados antes para evaluar el comportamiento reológico. Preparación del amortiguador de citrato de pH 3 El monohidrato del ácido cítrico (Mp 211 g/mol) se preparó en agua desionizada en una concentración de 0.1 M. Una solución de dihidrato de citrato trisódico, 0.1 M, (Mp 294.1 g/mol) también se preparó en agua desionizada. La solución del amortiguador de citrato de pH 3 se preparó mezclando 40% en v/v solución de monohidrato del ácido cítrico (0.1 M), 10% en v/v de solución dihidrato de citrato trisódico (0.1 M) y 50% en v/v de agua desionizada y el pH final se midió usando un medidor de pH (3320 JENWAY). Preparación de soluciones 'base' de poloxámero 407 Los estudios del preliminar indicaron que las soluciones del poloxámero 407 en un intervalo de concentración entre p/p 18- 20% fue adecuado, para proporcionar un intervalo de viscosidades con valores variantes de cmt. Las soluciones del poloxámero se prepararon usando el método frío descrito por Schmolka (1972). Brevemente, las cantidades requeridas del poloxámero 407 (Tabla 27) se agregaron al amortiguador de citrato de pH 3 o propilenglicol/amortiguador de citrato de pH 3 en botellas Duran de vidrio de borosilicato de 100 mi. El del propilenglicol/amortiguador de citrato de pH 3 se preparó previamente pesando la cantidad apropiada de propilenglicol y amortiguador de citrato de pH 3 (Tabla 27) y se agitó durante 1-2 minutos hasta estar visualmente homogénea. Las botellas Duran que contenían los ingredientes se taparon y colocaron en un baño de hielo/agua durante 4 h con agitación frecuente cada 15 minutos, hasta que las soluciones claras se produjeron. Estas soluciones se almacenaron a 2-8°C hasta requerirse. Procedimiento de la esterilización Puesto que los geles se requieren para la terapia intralesional, la esterilización es importante. Para realizar la esterilización, los geles preparados se esterilizaron usando el método de BP, donde aproximadamente 100 g de cada uno de los geles listados en la Tabla 27 se colocaron en botellas Duran de 100 mi y se esterilizaron durante 15 minutos a 121°C. Después de este procedimiento, los geles se dejaron enfriar a temperatura ambiente, y después se almacenaron a 2-8°C hasta requerirse.

Tabla 27. Cantidades actuales y objetivo de soluciones 'basde' de poloxámero Tabla 28. Cantidades actuales y objetivo de formulaciones de placebo para la evaluación reológica 5 10 Preparación de formulaciones del poloxámero de placebo para la evaluación reológica Debido a la inestabilidad del I3A a la esterilización por calor, las formulaciones que contienen I3A debe prepararse disolviendo el I3A en un solvente apropiado seguido por la adición aséptica (es decir filtración aséptica) a las soluciones del poloxámero 'base' esterilizadas en autoclave. El solvente de opción fue alcohol bencílico. Sin embargo, para la valoración reológica solamente las formulaciones del poloxámero de placebo se prepararon conteniendo alcohol bencílico debido a la disponibilidad limitada del I3A. Preparación de solución de alcohol bencílico/amortiguador de citrato de pH 3 La cantidad de amortiguador de citrato agregada al alcohol bencílico fue 2.5% en p/p, la cual estaba por debajo de la solubilidad del amortiguador de citrato de pH 3 en alcohol bencílico. Brevemente, de manera aproximada 0.5 g del amortiguador de citrato de pH 3 se agregó a 19.5 g de alcohol bencílico para dar un porcentaje final del amortiguador de citrato de 2.5 % en p/p en alcohol bencílico. Esta solución después se filtró a través de un filtro Millipore (0.22 µ?t? M I LLEX-G V, MILLIPORE) para imitar la condición de la filtración aséptica. Adición de la solución de alcohol bencílico/amortiguador de citrato de pH 3 a soluciones 'base' de poloxámero Las formulaciones del placebo (Tabla 28) se prepararon agregando la cantidad requerida de alcohol bencílico/amortiguador de citrato filtrado de pH 3 a las soluciones 'base' del poloxámero esterilizadas preparadas antes. Brevemente, de manera aproximada 9.90 g (peso exacto anotado en la Tabla 28) de cada solución 'base' del poloxámero se pesaron en un frasco de vidrio de soda de 20 mi y este se enfrió en hielo/agua para formar un líquido (a temperatura ambiente estas soluciones forman los geles). A la 'base' del poloxámero enfriada aproximadamente 0.10 g (peso exacto mostrado en la Tabla 28) del alcohol bencílico/amortiguador de citrato de pH 3 filtrado se agregó y se sometió a vértice durante 2 minutos hasta que se obtuvo una solución visualmente clara, homogénea. Estas formulaciones después se almacenaron a 2-8°C hasta requerirse. Evaluación reológica La evaluación reológica se realizó usando un reómetro Cammed CSL2. Aproximadamente 0.4 g de la muestra de prueba se colocaron entre fa plataforma y geometría de placa paralela. Una vez que lá muestra se comprimió entre la plataforma y placa cualquier exceso de muestra se retiró cuidadosamente usando una espátula en ángulos rectos a la geometría. Cada muestra se probó en un total de tres veces y las viscosidades resultantes se registraron en función de temperatura. Preparación de formulaciones activas y placebos relativos para estudios de estabilidad y liberación Siguiendo de la valoración reológica, las formulaciones activas (I3A) y poloxámero del placebo se prepararon para estudios de estabilidad y liberación. Además, las formulaciones de PEG 400 del placebo y activas (0.1% en p/p del I3A) también se prepararon como formulaciones control para la prueba de liberación.

Preparación del I3A base en alcohol bencílico/amortiguador de citrato Aproximadamente 50 mg (cantidad objetivo) del I3A se pesó exactamente en un frasco tipo bijou de vidrio de 7 mi junto con 500 mg (cantidad objetivo) de alcohol bencílico/amortiguador de citrato de pH 3. Esta mezcla se sometió a vértice periódicamente durante 5 minutos hasta que se disolvió el 13A.

Preparación de formulaciones activas y poloxámero de placebo Las formulaciones del placebo se prepararon como se describe antes (Tabla 28). Las formulaciones activas del poloxámero (I3A) que contenían una concentración objetivo de 0.1% en p/p del I3A de 'b' se prepararon de una manera similar a las formulaciones del placebo excepto que el peso adicional debido a la adición del I3A de 'b' se compensó por una reducción similar en la cantidad agregada de solución 'base' del poloxámero (Tabla 29). Brevemente, de manera aproximada 110 mg (peso exacto conocido) del l3A/alcohol bencílico/amortiguador de citrato de pH 3 se agregaron a 9.89 g de la solución 'base' del poloxámero enfriada, esterilizada y sometida a vértice durante aproximadamente 2 minutos hasta que se obtuvo una solución visiblemente clara, homogénea. Los pesos exactos y pesos objetivo se muestran en la Tabla 29.

Tabla 29. Cantidades actuales y objetivo de Formulaciones del poloxámero activo para estudios de estabilidad y liberación 5 15 *I3A exacto en alcohol bencílico/amortiguador de citrato de pH 3 Tabla 30. Cantidades actuales y objetivo de Formulaciones control de placebo y PEG400 activo para estudios de liberación 10 *I3A exacto en alcohol bencílico = 0.09155 g/g Preparación de formulaciones control de PEG400 Seguido de un procedimiento similar, 12.5 mg del I3A se agregó a 125 mg de alcohol bencílico, que se había filtrado previamente a través de un filtro Millipore (0.22 2 pm MILLEX-GV, MILLIPORE). Esta solución se sometió a vértice por aproximadamente 5 minutos hasta que se disolvió totalmente el I3A. Para preparar las formulaciones control activas aproximadamente 110 mg de esta mezcla se agregó a una solución de 7,912 g de PEG400 y 1.978 g de amortiguador de citrato de pH 3. Los placebos se prepararon de una manera similar excepto que se utilizaron aproximadamente 7.92 g de PEG400 y 1.98 g de amortiguador de citrato y 100 mg de alcohol bencílico esterilizado. Los pesos exactos y pesos objetivo se muestran en la Tabla 6 para el placebo y las formulaciones de PEG 400 activas, respectivamente. Condiciones de almacenamiento para formulaciones activas y dei poloxámero de placebo Las alícuotas de cada una de la formulación del poloxámero 407 (placebo o activo) se dispensaron en frascos de vidrio ámbar con tapa roscada de 2 mi (vidrio de borosilicato), sellados y almacenadas en tres condiciones de almacenamiento particularmente 2-8°C, 25 ± 2°C y 40 ± 2°C para estudios de estabilidad. Prueba de estabilidad del I3A en formulaciones del poloxámero Para el propósito de evaluación del producto de fármaco un método de extracción se estableció para evaluar la degradación del I3A de 'b' al isoforma 'a' (pureza máxima cromatográfica). La extracción del I3A de la formulación activa fue como sigue (el mismo procedimiento también se utilizó para la formulación del placebo). Brevemente, de manera aproximada 0.5 g de la formulación se pesaron exactamente en un matraz volumétrico de 5 mi y se formó para marca con acetonitrilo grado de CLAR/amortiguador de citrato de pH 3 (90:10 en v/v). La solución se sometió a alícuota en frascos de CLAR y se analizó. Los datos recuperados preliminares (no mostrados) indicaron que aproximadamente 80% o más del I3A de 'b' se recuperaron de la formulación activa y más significativamente, sin ninguna interferencia de cualquiera de los excipientes en la formulación. Las formulaciones se analizaron en t=0 y los estudios de estabilidad acelerada (40°C) se condujeron en las semanas de t=5. Estudios de liberación del I3A preliminares La liberación del I3A de 'b' de las formulaciones a través de la membrana sintética se investigaron usando células de difusión de Franz bajo condiciones ocluidas. Elección del fluido de reserva El fluido de reserva utilizado para intentar y mantener las condiciories de inmersión fue 20% en v/v de etanol/amortiguador de citrato (pH 3.0) y esto se incorporó en la célula de Franz y se agitó constantemente con un agitador magnético. Los estudios de estabilidad preliminares se condujeron en I3A en 20% de v/v de etanol/amortiguador de citrato (pH 3.0) a 37°C durante aproximadamente 18 h. El incremento del porcentaje de área máxima en la isoforma 'a' después de 18 h se encontró por ser 0.26%. Para el propósito del estudio de la célula de Franz esto se consideró aceptable. La solubilidad cinética del I3A en 20% en v/v de etanol/amortiguador de citrato (pH 3.0) se determinó para ser 509.7 ± 3 pg/ml a 25°C. Estudios de liberación in vitro (célula de Franz) Las células de difusión de Franz calibradas individualmente con un área superficial difusional promedio de 0.53 cm2 y un volumen reservado promedio de 1.85 ± 0.02 mi se utilizaron para conducir el estudio de liberación. Las membranas de celulosa regeneradas (MWCO 12000-14000) se prepararon, cortaron y montaron en células de Franz. Las membranas se dejaron equilibrar con la fase de reserva durante 30 minutos antes de aplicar las formulaciones. Una dosis infinita de 0.5 g de cada formulación se aplicó sobre la superficie de membrana usando un Finnpipette® desplazamiento positivo. Una lectura de muestra se investigó (26 h después de la aplicación de gel) por lo cual 200 µ? del fluido de reserva se retiró cuidadosamente del brazo de la célula de Franz. A través del experimento, cualquier pérdida en el fluido de reserva debido a la evaporación de las células de Franz se sustituyó para mantener un volumen constante. El experimento se realizó bajo condiciones ocluidas (la superficie de las células donantes superior se cubrió con Parafilm®), para todas las formulaciones (n = 3 de células de Franz por formulación activa y n = 1 de célula de Franz por formulación del placebo). Las muestras se analizaron vía CLAR, como se describe en el Ejemplo 1, y la concentración del I3A de 'b' liberado evaluado utilizó una serie de estándares de calibración preparados en 80% en v/v de amortiguador de citrato / 20% en v/v de etanol. RESULTADOS Esterilización de soluciones 'base' del poloxámero Inmediatamente después de la esterilización de las soluciones 'base' del poloxámero, Polox-01 y Polox-02 sin propileno mostró la separación de fase. Una vez enfriadas en hielo/agua estas soluciones llegaron a ser las fases claras, homogéneas. Sin embargo, las soluciones 'base' que contienen propilenglicol, Polox-pg-01 y Polox-pg-02 no muestran ninguna separación de fase inmediatamente después de la esterilización, sugiriendo que la adición del propilenglicol inhibe este fenómeno. Valoración reológica Los estudios reológicos se realizaron en formulaciones del placebo de poloxámero y la viscosidad (Pa.s) se determinó como una función de temperatura (°C), sobre el intervalo de temperatura 4-40°C. El valor de cmt se determinó tomando el punto medio de la inflexión. Para todas las formulaciones del placebo hubo un incremento pequeño en viscosidad con incremento en temperatura hasta en cierto punto, en la cmt, hubo un incremento dramático en viscosidad con un incremento pequeño en temperatura. El valor de cmt se encontró por ser dependiente de la concentración, es decir cuanto más baja es la concentración del poloxámero 407, más alto es el valor de cmt. Además, la adición del propilenglicol a las formulaciones del placebo del poloxámero además redujo la cmt. Sin embargo, sobre la cmt, las viscosidades para las mismas muestras se incrementaron aproximadamente 1.5-2 veces comparadas a las formulaciones libres de propilenglicol respectivas. Por ejemplo, a 37°C la viscosidad de Polox-01 -placebo se encontró por ser aproximadamente 1.2 Pa.s mientras que la formulación del placebo de propilenglicol respectiva (Polox-pg-01 -placebo) se encontró por ser 2.4 Pa.s. Por lo tanto, la adición de propilenglicol parecería incrementar la viscosidad sobre el valor de cmt, no obstante se reduce el valor de la cmt actual. La Tabla 31 resume los valores de cmt y las viscosidades a 37°C para todas las formulaciones. Tabla 31. Valores y viscosidades de Cmt (a 37°C) para todas las formulaciones del placebo del poloxámero (n = 3 ± SEM) Estudios de estabilidad del I3A en formulaciones del poloxámero La Tabla 32 muestra los porcentajes de purezas máximas para I3A de 'b' así como el porcentaje de área de la isoforma 'a' y otras máximas no asignadas (UAP) para todas las formulaciones del poloxámero activas tomadas en tiempo cero. También muestra como un comparador es el porcentaje de pureza máxima de 0.1% en p/p de gel de IPA del I3A en tiempo cero. Todas las máximas se integraron y compararon manualmente a las formulaciones del placebo respectivas. Tabla 32. Porcentaje de purezas máximas de formulaciones en tiempo cero.

La tabla 33 muestra el porcentaje de purezas máximas para I3A de 'b' así como el porcentaje de área de la isoforma 'a' y otros UAP's para todas las formulaciones activas tomadas en cinco semanas después del almacenamiento a 40°C (estabilidad acelerada). También tabulado como un comparador es la porcentaje de pureza máxima de 0.1% en p/p de gel de IPA del I3A almacenado a 40°C durante cuatro semanas. Todas las máximas se integraron manualmente comparadas a la formulación del placebo respectiva. Tabla 33. Porcentaje de purezas máximas cromatográficas de formulaciones en tiempo de cinco semanas, almacenadas a 40°C.

* Probado después cuatro semanas de almacenamiento a 40°C usando el método 1 de CLAR No hay diferencia, aparente en el porcentaje de pureza máxima del I3A en cualquiera de las formulaciones del poloxámero. En tiempo cero, sin embargo, el porcentaje de la isoforma 'a' es menor para estas formulaciones comparadas gel de IPA del I3A, posiblemente como un resultado de la adición de una cantidad pequeña de amortiguador de citrato de pH 3 agregado al alcohol bencílico durante la fabricación de las formulaciones. Un incremento en el porcentaje de la isoforma 'a' se observó para todas las formulaciones del poloxámero activas después del almacenamiento de cinco semanas a 40°C. Sin embargo, el incremento en el porcentaje de la isoforma 'a' observado para 0.1% en p/p de gel de IPA fue mayor (4.7%) después del almacenamiento de cuatro semanas a 40°C. Basado en las porcentaje de purezas máximas, estos datos parecería indicar que la estabilidad de las formulaciones del poloxámero del I3A es comparable al 0.1% de gel de IPA del I3A. Estudios de liberación preliminares La Figura 9 muestra la cantidad liberada (pg/cm2) después de 26 h, del I3A de 0.1% en p/p de gel del poloxámero y formulaciones de PEG 400. No se encontró ninguna diferencia significativa en la liberación (p>0.05) entre cualquiera de las formulaciones del poloxámero, sin embargo, la liberación de todas las formulaciones del poloxámero fue significativamente más lenta (p<0.05) que la liberación de la formulación de control de PEG400. La cantidad del I3A de 'b' liberada promediada para todas las formulaciones del poloxámero fue aproximadamente 16 pg/cm2, mientras que la cantidad liberada de la formulación de PEG 400 de control fue aproximadamente 53 pg/cm2; esto representa una reducción de aproximadamente 70% en la cantidad del I3A de 'b' liberada de todas las formulaciones del poloxámero comparada al control después de 26 h. RESULTADOS Cuatro formulaciones del poloxámero se investigaron en este estudio. Estos geles del poloxámero dieron un incremento en viscosidad (a 37°C) donde la viscosidad de polox-01 -placebo < polox-pg-01 -placebo < polox-02-placebo < polox-pg-02-placebo. Además, la adición del propilenglicol parecería incrementar la viscosidad sobre el valor de la cmt, no obstante se reduce el valor actual de la cmt. La estabilidad de los geles del poloxámero parece ser comparable a 0.1% de geles de IPA del I3A bajo condiciones aceleradas. Los estudios de liberación mostraron que no había diferencia significativa en la liberación (p>0.05) entre cualquiera de las formulaciones del poloxámero; sin embargo, la liberación de todas las formulaciones del poloxámero fue significativamente más lento (p<0.05) que la liberación de la formulación de control de PEG 400. Además, una reducción de aproximadamente 70% en la cantidad del I3A de 'b' liberada de todas las formulaciones del poloxámero se observó comparada a la del control, después de 26 h. EJEMPLO 7 La liberación in vitro del I3A de 'b' de formulaciones intralesionales basadas en aceite comparada con la formulación de control de PEG 400 se investigó. MATERIALES METODOS Preparación del I3A (activo) y formulaciones del placebo para estudios de liberación Tres formulaciones de aceite se prepararon con placebos respectivos. La cantidad de alcohol bencílico se guardó a 1% en p/p. La preparación de dos formulaciones implicó la adición de un antioxidante antes de la esterilización por calor del aceite o la adición del antioxidante después de la esterilización del aceite. Preparación de la formulación de aceite (como se describió en PB23001/2) 'Croda-BA' Esterilización del aceite de coco fraccionado Aproximadamente 100 g de aceite de coco fraccionado (CRODA OL GTC/C) se pesaron en un frasco cónico de 100 mi (vidrio de borosilicato), tapado (tapón de vidrio de borosilicato) y se colocó un horno precalentado (hornote caja caliente Gallenkampf con ventilador, Tamaño 2) a 170 ± 2°C durante 1 h. Después de este procedimiento, el aceite se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de uso. Adición del I3A al aceite esterilizado Aproximadamente 15 mg del I3A se pesó exactamente en un frasco de vidrio de 20 mi y se agregaron aproximadamente 150 mg de alcohol bencílico (peso exacto conocido), el cual se había filtrado previamente a través de un filtro de 0.22 µ?t? MILLEX-GV. Esta mezcla se sometió a vértice periódicamente por aproximadamente 2 h hasta que el I3A se disolvió en alcohol bencílico. A esta mezcla aproximadamente 14.835 g de aceite esterilizado se agregó y sometió a vértice por aproximadamente 5 minutos hasta que una solución homogénea se obtuvo. El placebo se preparó de una manera similar excepto que aproximadamente 14,85 g del aceite esterilizado (peso exacto conocido) se utilizó para compensar el I3A. Los pesos exactos y composiciones de porcentaje se muestran en la Tabla 34 y 35 para las formulaciones activas (I3A) y del placebo. Tabla 34. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite Croda/BA del I3A •Redondeado hasta 3 d.p. Tabla 35. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite Croda/BA del placebo •Redondeado hasta 3 d.p. Preparación de la formulación de aceite 'Croda-BA/Antiox' El almacenamiento de larga duración de aceites puede conducir a rancidez, que puede degradar el producto de fármaco. Por lo tanto, un antioxidante puede incluirse en la formulación (después de la esterilización por calor) para reducir este efecto. Las formulaciones del placebo y activas que contienen un antioxidante después de la esterilización por calor del aceite se prepararon de acuerdo a la siguiente metodología. Preparación de la mezcla de antioxidante/alcohol bencílico Aproximadamente 60 mg de antioxidante (BHT) se disolvieron en 2 g de alcohol bencílico y se filtraron a través de un filtro de 0.22 pm MI LLEX-GV. Adición del I3A al aceite esterilizado Aproximadamente 15 mg del I3A (Lote 0319) se pesaron exactamente en un frasco de vidrio de 20 ml y se agregaron a aproximadamente 154.5 mg de BHT/alcohol bencílico preparado como antes. Esta mezcla se sometió a vértice periódicamente por aproximadamente 2 h hasta que el I3A se había disuelto en alcohol bencílico. A esta mezcla aproximadamente 14.8305 g de aceite esterilizado enfriado se agregó y sometió a vértice por aproximadamente 5 minutos hasta que una solución homogénea se obtuvo. El placebo se preparó de una manera similar excepto que aproximadamente 14,8455 g de aceite esterilizado (peso exacto conocido) se utilizó para compensar el 13A. Los pesos exactos y composiciones de porcentaje se muestran en la Tabla 36 y 37 para las formulaciones activas (I3A) y del placebo. Tabla 36. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite Croda-BA/Antiox del I3A •Redondeado hasta 3 d.p.

Tabla 37. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite Croda-BA/Antiox del placebo *Redondeado hasta 3 d.p. Preparación de la formulación de aceite 'Croda/Antiox-B A' La esterilización por calor seco de aceites también puede conducir a la rancidez, que puede degradar el producto de fármaco. Por lo tanto, un antioxidante puede incluirse en la formulación para reducir este efecto antes de la esterilización por calor. Las formulaciones del placebo y activas que contienen una esterilización por calor anterior antioxidante del aceite se prepararon de acuerdo a la siguiente metodología.

Esterilización de la mezcla de antioxidante/aceite Aproximadamente 15 mg del antioxidante (BHT) se disolvió en aproximadamente 50 g de aceite en un matraz cónico de 100 mi (vidrio de borosilicato), tapado (tapón de vidrio de borosilicato) y se colocó en un horno precalentado (horno de caja caliente de Gallenkampf con ventilador, Tamaño 2) a 170 ± 2°C durante 1 h. Después de este procedimiento, el antioxidante/aceite se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de uso Adición del I3A al aceite esterilizado Aproximadamente 15 mg del I3A (Lote 0319) se pesó exactamente en un frasco de vidrio de 20 ml y se agregaron a aproximadamente 150 mg de alcohol bencílico, que se hubiera filtrado previamente a través de filtro de 0.22 2im MILLEX-GV. Esta mezcla se sometió a vértice periódicamente por aproximadamente 2 h hasta que el 3A se hubiera disuelto en alcohol bencílico. A esta mezcla aproximadamente 14.835 g de la mezcla esterilizada enfriada de antioxidante/aceite se agregaron y sometieron a vértice por aproximadamente 5 minutos hasta que una solución homogénea se obtuvo. El placebo se preparó de una manera similar excepto que aproximadamente 14.8455 g de aceite esterilizado (peso exacto conocido) se utilizó para compensar el I3A. Los pesos exactos y composiciones de porcentaje se muestran en las Tablas 38 y 39 para las formulaciones activas (I3A) y del placebo. Tabla 38. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite I3A Croda/Antiox-BA 'Redondeado hasta 3 d.p. Tabla 39. Cantidades objetivo y actuales (y % en p/p) para la formulación de aceite Croda/Antiox-BA del placebo 'Redondeado hasta 3 d.p. Las alícuotas de todas las formulaciones se almacenaron para estudios de liberación preliminares y el resto se sometieron a se sometieron a alícuota en los frascos de vidrio de borosilicato ámbar de 2 mi, se taparon y almacenaron a 2-8°C y 25°C para los estudios de estabilidad. Estudios de liberación del I3A preliminares La liberación del I3A de 'b' de las formulaciones a través de la membrana sintética se investigó usando células de difusión de Franz bajo condiciones ocluidas. Elección del fluido de reserva El fluido de reserva utilizado para intentar y mantener las condiciones de la piel fue 20% en v/v de de etanol/amortiguador de citrato (pH 3.0) y esto se incorporó en la célula de Franz y agitó constantemente con un agitador magnético. Los estudios de estabilidad preliminares se condujeron en I3A en 20% en v/v de etanol/amortiguador de citrato (pH 3.0) a 37°C por aproximadamente 18 h. El incremento del porcentaje del área máxima en la isoforma 'a' después de 18 h se encontró para ser 0.26%. Para el propósito del estudio de la célula de Franz esto se consideró aceptable. La solubilidad cinética del I3A en 20% en v/v de etanol/amortiguador de citrato (pH 3.0) se determinó para ser 509.7 ± 3 pg/ml a 25°C. Estudios de liberación in vitro (célula de Franz) Las células de difusión de Franz individualmente calibradas con un área superficial difusional promedio de 0.53 cm2 y un volumen reservado promedio de 1.85 ± 0.02 mi se utilizaron para conducir el estudio de liberación. Las membranas de celulosa regeneradas (MWCO 12000-14000) se prepararon, cortaron y montaron sobre las células de Franz. Las membranas se dejaron equilibrar con la fase de reserva durante 30 minutos antes de aplicar las formulaciones. Una dosis infinita de 0.5 g de cada formulación se aplicó sobre la superficie de la membrana usando un Finnpipette® desplazamiento positivo. Una lectura de muestra se investigó (26 h después de la aplicación de gel) por lo cual 200 µ? del fluido de reserva se retiró cuidadosamente del brazo de la célula de Franz. A través del experimento, cualquier pérdida en el fluido de reserva debido a la evaporación de las células de Franz se sustituyó para mantener un volumen constante. El experimento se realizó bajo condiciones ocluidas (la superficie de los pozos donantes superiores se cubrió con Parafilm®), para todas las formulaciones (n = 3 células de Franz por formulación activa y n=1 célula de Franz por formulación del placebo). Las muestras se analizaron vía CLAR y la concentración del I3A de 'b' liberada se evaluado usando una serie de estándares de calibración preparados en 80% en v/v de amortiguador de citrato / 20% en v/v de etanol. Método de CLAR El método de CLAR descrito previamente en el Ejemplo 1 se utilizó para la determinación del I3A. Resultados Estudios de liberación preliminares La Figura 10 muestra la cantidad del I3A de 'b' liberada (pg/cm2) después de 26 h, de 0.1% en p/p de aceite y formulaciones de PEG 400. No se encontró ninguna diferencia significativa en la liberación (p>0.05) entre cualquiera de las formulaciones de aceite. Sin embargo, la liberación del I3A de 'b' de todas las formulaciones de aceite fue significativamente menor (p<0.05) que la liberación de la formulación de control de PEG 400. La cantidad de 13A de 'b' liberada de todas las formulaciones de aceite fue aproximadamente 3.4 pg/cm2 sin embargo, la cantidad liberada de la formulación de PEG 400 de control fue aproximadamente 16 veces mayor (53 pg/cm2). Además, parecería que la adición de BHT (antioxidante) no afectó significativamente la liberación del I3A de 'b' de las formulaciones de aceite.

EJEMPLO 8 Estabilidad de formulaciones de gel de IPA La estabilidad (T=12 meses) del I3A de 'b' en formulaciones de gel de IPA preparadas usando diferentes amortiguadores de citrato de pH se determinó. El intervalo de pH fue de 2.5 a 4.0. MATERIALES METODOS Instrumentación y metodología de CLAR Las soluciones de muestra se analizaron para el porcentaje de pureza máxima por CLAR. Las condiciones cromatográficas para el método 2 de CLAR se detallan a continuación: Instrumentación Waters Alliance 2695 Separations Module plus Autosampler (SN: L96SM4656N) Detector Waters 996 PDA (SN: MX7AM7987M) Software Millennium32, Versión 4.00 Condiciones cromatográficas: Columna: Simetría C18-5 m (Waters) (SN: T70641T 12) Longitud de columna: 150 x 3.90 mm Temperatura de columna: 30°C ± 2°C Columna protectora: Simetría C18-5 µ?? (Waters) (PN: WAT054225) Longitud de columna protectora: 20 x 3.90 mm Fase móvil: 0.02% en v/v de TFA en agua (A); 0.02% en v/v de TFA en Acetonitrilo (B) A.B, 50:50 (iniciando la composición) Velocidad de flujo: 1.0 ml/min Temperatura del automuestreador: 8°C ± 2°C Longitud de onda UV: 230 nm Volumen de la inyección: 10 µ? Tiempo de producción: 20 minutos Gradientes Extracción del 13Ab de las formulaciones de gel de IPA l3Ab se extrajo de cada una de las formulaciones de gel de IPA como sigue; aproximadamente 0.5 g de cada formulación de gel activa o del placebo se pesaron exactamente en un matraz volumétrico de 5 mi de grado A. Esto se realizó en triplicado para cada formulación. El amortiguador de citrato (pH = 3.0, 0.5 mi) después se agregó a cada muestra de gel y se mezcló por medio de vórtice a velocidad máxima durante 1 minuto y después se transfirió a una agitador orbital y se agitó a 400 rpm durante 30 minutos. El acetonitrilo de grado CLAR se agregó, hasta volumen, a cada uno de matraces volumétricos y se mezcló por medio de vórtice otra vez a la velocidad máxima durante 1 minuto. Finalmente, los matraces volumétricos se transfirieron a un agitador orbital y se agitaron a 400 RPM durante 60 minutos. Las alícuotas después se transfirieron a los frascos de CLAR para análisis. Medida del pH aparente de los geles del placebo El pH aparente de los geles del placebo se midió usando un medidor de Jenway 3320 pH con un electrodo de combinación de pH. Brevemente, de manera aproximadamente 0.5 g de cada gel se transfirieron a los frascos de vidrio de 25 mi y se dejaron para ponerse a temperatura ambiente por al menos 1 h. El electrodo de combinación de pH se colocó en gel de IPA para asegurar toda la membrana del electrodo que se cubrió con gel. La lectura en el medidor de pH se dejó establecer por un mínimo de 1 minuto y el pH aparente del gel se registró. RESULTADOS Medida del pH aparente de geles del placebo a T=12mths El pH aparente de los geles de IPA del placebo a T = 0 y T=12 meses después del almacenamiento a 2-8°C se muestra en la Tabla 40.

Tabla 40. pH aparente de los geles de IPA del placebo a T T = 12 meses Los datos en la tabla 40 muestran que no hubo redistribución significativa en el pH aparente, después de 12 meses de almacenamiento a 2-8°C, para los geles de IPA del placebo preparados con pH 3.00, 3.50 y 4.00 de amortiguadores de citrato. Sin embargo, para los geles de IPA del placebo t preparados con pH 2.50 y 2.75 de amortiguadores de citrato hubo una reducción ligera en pH observada después de 12 meses de almacenamiento a 28°C. La reducción en pH observada para estos geles puede atribuirse a la evaporación de IPA del gel durante el almacenamiento o durante el análisis de muestra. Porcentaje de pureza máxima de isómeros del 13A en geles de IPA activos a T = 12 meses La tabla 41 muestra el porcentaje de pureza máxima de los isómeros del 13A para las diferentes formulaciones de gel de IPA activas (0.1% en p/p) después del almacenamiento por 12 meses a 2-8°C y la Tabla 42 muestra la comparación del porcentaje de pureza máxima del 13Aa a T=0 y T=12 meses. Tabla 41. Porcentaje de pureza máxima de isómeros del I3A para los geles de IPA activos después de 12 meses de almacenamiento a 2-8°C Datos analizados usando el método 2 de CLAR Los datos en la Tabla 41 muestran que, después de 12 meses de almacenamiento a 2-8°C, hay un incremento en el porcentaje de pureza máxima de la isoforma a con el incremento de pH aparente de la formulación de gel del placebo respectiva. Por ejemplo, un gel de IPA producido con pH 2.75 de amortiguador de citrato tiene un porcentaje de pureza máxima de isoforma a de 1.07% comparado a una formulación de gel de IPA preparada con pH 4.00 de amortiguador de citrato que tiene un porcentaje de pureza máxima de isoforma a de 4.92%. Estos datos destacan la estabilidad incrementada del I3A b en formulaciones de gel de IPA preparadas con amortiguadores de citrato de pH inferior. Tabla 42. Comparación del porcentaje de pureza máxima del l3Aa a T = 0 y T = 12 meses Datos analizados a T = 0 por el Método 1 de CLAR y datos analizados a T = 12 meses por el método 2 de CLAR Los datos en la Tabla 42 muestran que hay un incremento en el porcentaje de pureza máxima de la isoforma a en todas las formulaciones de gel de IPA activas después de 12 meses de almacenamiento a 2-8°C. Sin embargo, la formulación de gel de IPA preparada con pH 2.50 de amortiguador de citrato mostraron solamente un incremento ligero en el porcentaje de pureza máxima de la isoforma a (0.22%) comparada a, por ejemplo, la formulación de gel de IPA preparada con pH 4.00 de amortiguador de citrato que mostraron el incremento mayor en porcentaje de pureza máxima de la isoforma a (4.48%). Una vez más, estos resultados destacan la estabilidad incrementada del I3A b en formulaciones de gel de IPA preparadas con el pH de amortiguadores de citrato inferior. Como tal, la formulación de gel de IPA preparada con el pH de amortiguador de citrato inferior parece permanecer dentro de lo especificado (< 1% de isoforma a) durante 12 meses a 2-8°C. Así, después de 12 meses de almacenamiento a 2-8°C, las formulaciones de gel de IPA que proporcionaron la estabilidad mejorada para l3Ab fueron las que se prepararon con pH de amortiguadores de citrato inferiores (pH = 2.5-3,0). EJEMPLO 9 Estabilidad del I3A de 'b' en Soluciones de Premezclado de gel de pH y Temperatura variada Métodos Preparación de Soluciones de Premezclado de Gel Las soluciones de premezclado de gel se prepararon de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. Pesar el amortiguador de citrato directamente en una botella Duran seca limpia. 2. Pesar el IPA directamente en la botella de Duran de la Etapa 1. 3. Pesar la cantidad correcta del I3A de 'b' en una botella de muestra seca limpia. 4. Pesar la cantidad correcta de alcohol bencílico en la botella de muestra de la Etapa 3. 5. Colocar la botella de muestra de la etapa 4 en un agitador orbital y agitar a 400 rpm hasta que todo el I3A de 'b' se haya disuelto. 6. Agregar la solución de 13A de 'b'/alcohol bencílico de la etapa 5 a la botella de Duran de la etapa 2. 7. Suspender la mezcla hasta que se obtenga una solución homogénea. Las composiciones de las soluciones de premezclado de gel pueden prepararse y colocarse en estabilidad son: Tabla 43 Solución 1 de premezclado de gel Tabla 44 Solución de premezclado de gel 2 Tabla 47 Solución 5 de premezclado de gel Tabla 48 Solución 6 de premezclado de gel Tabla 50 Solución 8 de premezclado de gel Prueba de Estabilidad de Formulaciones de Premezclado de Gel Las soluciones de premezclado de gel preparadas antes se colocaron en estabilidad a 2-8, 25 y 40°C y se probaron en los puntos de tiempo a T=0 y 2 semanas. En cada punto de tiempo las soluciones de premezclado se determinaron para el contenido del I3A de 'b' de acuerdo al procedimiento detallado abajo. 1.1.3 Prueba de estabilidad de las Formulaciones de Premezclado del Gel Las soluciones de premezclado de gel preparadas se colocaron en estabilidad a 2-8, 25 y 40°C y se probaron en los puntos de tiempo a T = 0 y 2 semanas. En cada punto de tiempo las soluciones de premezclase se determinaron para I3A de 'b' contenido calculando el porcentaje del área máxima de CLAR del I3A de 'b' con relación a las áreas máximas del I3A de 'b' con a relación a la isoforma 'a' de sustancias e isoforma 'c' como se describe a continuación.

Instrumentación y metodología de CLAR Todas las muestras a analizarse para I3A de 'b' se analizaron usando el Método 2 de CLAR. La instrumentación y condiciones cromatográficas para el Método 2 de CLAR son como sigue: Instrumentación: Waters Alliance 2695 Separations Module plus Autosampler Detector Waters 996 PDA Software Empower, versión 2.00 Condiciones cromatográficas: Columna: Simetría C18-5 µ?t? (Waters) Longitud de columna: 150 x 3.90 mm Temperatura de columna: 30°C ± 2°C Longitud de Columna protectora: 20 x 3.90 mm Fase móvil: 0.02% en v/v d TFA en agua (A); 0.02% en v/v de TFA en Acetonitrilo (B) A:B, 50:50 (iniciando la composición) (Gradiente, ver Tabla 51 a continuación) Velocidad de flujo 1.0 ml/min Temperatura del automuestreador Longitud de onda UV: 230 nm umen de inyección 10/40 µ? Tiempo de producción: 20 minutos Tabla 51. Tabla de Gradiente para el método 2 de CLAR Datos de estabilidad para I3A de 'b' en intervalo de pH de soluciones premezcladas de gel de 2.75 a 4.00 a 2-8, 25 y 40°C (promedio, n = 3) Datos de estabilidad para 13 A de 'b' en intervalo de oH de soluciones de premezclado de gel 2.75 a 4.00 a 2-8, 25 y 40°C (promedio, n = 3) Conclusiones: El almacenamiento de todas las soluciones de premezclado de gel a 2-8°C proporciona la mejor estabilidad para I3A de 'b\ basada en el porcentaje de pureza de CLAR máxima mayor obtenido para I3A de 'b' comparado al almacenamiento de las soluciones de premezclado de gel a 25 y 40°C. Las dos soluciones de premezclado de gel que proporcionaron la mejor estabilidad para I3A d 'b', basada en el porcentaje de pureza máxima de CLAR, fueron los números 1 y 5. Estas soluciones de premezclado contuvieron el amortiguador de citrato en el pH inferior usado en el estudio (pH = 2.75). Las dos soluciones de premezclado de gel que proporcionaron la menos estabilidad para I3A de 'b', basadas en el porcentaje de pureza máxima de CLAR, fueron los números 4 y 8. Estas soluciones de premezclado contienen el amortiguador de citrato en el pH mayor usado en el estudio (pH=4.00). Bajando la temperatura y el pH del amortiguador de citrato en las soluciones de premezclado de gel proporcionó la mejor estabilidad para I3A de 'b' donde el porcentaje de pureza máxima de CLAR del I3A de 'b' se utilizó como un indicador de estabilidad en este estudio. REFERENCIAS: Ho VC, Griffiths CEM, Ellis CN, Gupta AK, McCuaig CC, Nickoloff BJ, Cooper KD, Hamilton TA and Voorhees JJ. J Am Acad Dermatol 22:94-100, 1990. Ford JL. Parenteral produets In: Pharmaceutics, The Science of dosage form design (Ed ME Aulton), Churchill Livingstone, London, 1988. Wade A and Weller PJ. Handbook of Pharmaceutical Excipientes 2nd Edición. American Pharmaceutical Association, Washington, 1994. Barichello JM, Morishita M, Takayama K and Nagai T, Absorción de insulina de geles pluronicos F-127 seguido por administración subcutánea en ratas. Int J Pharm 184:189-198, 1999. Tobiyama T, Miyazaki S, and Takada M, Uso de geles pluronicos F-127 como un vehic-ulo para absorción percutánea. Yakuzaigaku 54:205-213, 1994. Morikawa K y colaboradores, Mejoramiento de efectos terapéuticos de interleucina-2 recombinante en un fibrosarcoma de rata transplantable por el uso de un vehículo de liberación sostenida, Gel Plurónico. Cáncer 47:37-41 , 1987 Katakama M y colaboradores, Liberación controlada de la hormona de crecimiento humana en ratas seguido de la administración parenteral de geles del Poloxámero. J Control Reí 49:21-26, 1997. Wasan KM, Subramanian R, K ong M, Goldberg IJ, Wright T and Johnston TP, Alteraciones mediadas por Poloxámero 407 en las actividades de enzimas que regulan el metabolismo del lípido en ratas. J. Pharm Sci. 6 189-197, 2003. Powell MF, Nguyen T and Baloian L. Compendium of Excipientes for Parenteral Formulations. PDA J , Pharm Sci Tech 52:238-311, 1998. Schmolka IR, Artificial skin I. Preparación y propiedades de geles plurónicos F-127 para el tratamiento de quemaduras. J. Biomed. Mater. Res., 6, 571-582, 1972.

Claims (46)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de angelato de ingenol para el uso en la terapia, en donde el ingenol,. el angelato se ha disuelto en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, la formulación adicionalmente comprende un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable que es por lo menos parcialmente compatible con el solvente y que proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5.

2. Una formulación de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente de acidificación se ha agregado subsiguiente a la preparación de una solución de angelato de ingenol en el solvente aprótico.

3. Una formulación de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el angelato de ingenol es 3-angelato de ingenol.

4. Una formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el angelato de ingenol, presente en la formulación es por lo menos 99% 3-angelato de ingenol.

5. Una formulación de conformidad con la reivindicación 4, en donde la cantidad de 3-angelato de ingenol es por lo menos 99.5%.

6. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el solvente aprótico es seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicol, metiletilcetona, acetato de etilo, dietiléter, alcohol bencílico, y sus mezclas.

7. Una formulación de conformidad con la reivindicación 6, en donde el solvente aprótico consiste esencialmente de alcohol bencílico.

8. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el agente de acidificación es un ácido.

9. Una formulación de conformidad con la reivindicación 8, en donde el agente de acidificación es un ácido orgánico.

10. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el agente de acidificación es un amortiguador ácido.

11. Una formulación de conformidad con la reivindicación 10, en donde el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato, y amortiguador citrato-fosfato.

12. Una formulación de conformidad con la reivindicación 10, en donde el amortiguador es amortiguador de citrato.

13. Una formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el pH del amortiguador, antes de la adición de la formulación, está entre un pH 2.5 y pH 4, inclusive.

14. Una formulación de conformidad con la reivindicación 13, en donde el pH del amortiguador está entre pH 2.7 y pH 3.5, inclusive.

15. Una formulación de conformidad con la reivindicación 14, en donde el pH del amortiguador está entre pH 2.7 y pH 3.0 inclusive.

16. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que tiene un pH aparente de entre pH 3 y pH 4.

17. Una formulación de conformidad con la reivindicación 16, que tiene un pH aparente de 3.5.

18. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que consiste de angelato de ingenol, alcohol bencílico y pH 2.5 de amortiguador de citrato, en donde el amortiguador está presente en una cantidad de entre 1 y 10% en p/p de la formulación.

19. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que adicionalmente comprendiendo un antioxidante.

20. Una formulación de conformidad con la reivindicación 19, en donde el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de retinol, ácido ascórbico, licopeno, tocoferol, hidroxitolueno butilado, y sus mezclas.

21. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el solvente y agente de acidificación son capaces de formar una sola fase.

22. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que adicionalmente comprende un preservativo seleccionado de: un parabeno, ácido benzoico, alcohol bencílico, y sus mezclas.

23. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que adicionalmente comprende un mejorador de penetración.

24. Una formulación de conformidad con la reivindicación 23, en donde el mejorador de penetración es seleccionado del grupo que consiste de alcohol isopropílico, sulfóxido, azono, pirrolidona, alcanol, glicol, ácido graso, agua, tensioactivo, terpeno, fosfolípido, y sus mezclas.

25. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, que adicionalmente comprendiendo un mucoadhesivo.

26. Una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en la forma de una preparación adecuada para la administración tópica.

27. Una preparación de conformidad con la reivindicación 26, que comprende una mayoría de un amortiguador ácido en peso.

28. Una preparación de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, que adicionalmente comprende un gelante.

29. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en la forma de un gel, crema, ungüento o pintura.

30. Una preparación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el angelato de ingenol es por lo menos 99% de 3-angelato de ingenol y en don no más de 1% de redistribución de la Isoforma 'a' tiene lugar después de 3 meses.

31. Una preparación de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde el angelato de ingenol es por lo menos 99% de 3-angelato de ingenol y en donde no más del 0.5% de redistribución de la jsoforma 'a' tiene lugar después de 3 meses.

32. El uso de una formulación de conformidad con cualquier reivindicación anterior en el tratamiento de un el cáncer superficial.

33. Uso de angelato de ingenol en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer de la piel, en donde el angelato de ingenol se disuelve en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, la formulación adicionalmente comprende un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable que es por lo menos parcialmente compatible con el solvente y que proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5.

34. Uso de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, en donde la formulación es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

35. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en donde el cáncer de la piel es un cáncer de célula escamosa o basal.

36. Un proceso para preparar una formulación de angelato de ingenol, que comprende disolver el angelato de ingenol en un solvente farmacéuticamente aceptable, aprótico, el proceso comprende la adición de un agente de acidificación farmacéuticamente aceptable que es por lo menos parcialmente compatible con el solvente y que proporciona la formulación con un pH aparente no mayor de 4.5, el agente de acidificación es agregado con, antes de, o después del angelato de ingenol.

37. Un proceso de conformidad con la reivindicación 36, en donde la formulación es como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 29.

38. Un proceso de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, en donde el angelato de ingenol es sustancialmente 3-angelato de ingenol, y la adición del agente de acidificación y condiciones se seleccionan como para prevenir más del 1% del 3-angelato de ingenol redistribuido en la isoforma 'a'.

39. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en donde el angelato de ingenol es substancialmente 3-angelato de ingenol, y la adición del agente de acidificación y condiciones se seleccionan como para prevenir más del 0 5% del 3-angelato de ingenol redistribuido en la Isoforma 'a'.

40. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, en donde el agente de acidificación, confiere un pH aparente de entre pH 3 y pH 3.5 en la formulación.

41. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40., en donde el agente de acidificación es agregado en una cantidad de entre 1 y 10% en p/p el la formulación.

42. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, en donde la formulación es hecha con sólo los componentes definidos, antes de la adición de cualquier componente deseado adicional.

43. Un proceso de conformidad con la reivindicación 42, en donde un componente deseado adicional es un exceso de amortiguador acídico.

44. Un proceso de conformidad con la reivindicación 42 ó 43, en donde un componente deseado adicional es el polietilenglicol.

45. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, en donde un componente deseado adicional es un gelante.

46. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, en donde la formulación es posteriormente almacenada a una temperatura de entre el congelamiento y 8°C.