BRPI0302172B1

BRPI0302172B1 - Método para produzir uma substância alvo

Info

Publication number: BRPI0302172B1
Application number: BRPI0302172-6A
Authority: BR
Inventors: Yukiko Ishikawa; Akira Imaizumi; Kazuhiko Matsui; Hiroyuki Kojima
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2002-07-12
Filing date: 2003-07-08
Publication date: 2019-05-28
Also published as: KR20040007337A; CN1492038B; BR0302172A; PE20040651A1; CN1492038A; AU2003205041A1; PL361216A1; DE60315925D1; US7090998B2; TWI316957B; ES2291568T3; EP1382686A1; TW200500462A; EP1382686B1; US20040180404A1; RU2003121547A; DE60315925T2; ATE371743T1; KR101178437B1

Abstract

"gama-proteobactéria, e, método para produzir uma substância alvo". em um método para produzir uma substância alvo usando um microorganismo, que compreende cultivar uma <sym>-proteobactéria em um meio para produzir e acumular a substância alvo no meio ou células e coletar a substância alvo, usa-se uma cepa em que a proteína arca não funciona normalmente na célula por meio de, por exemplo, rompimento do gene arca no cromossomo.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA ALVO”.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma técnica usada na indústria de fermentação, mais precisamente, a um método para produzir eficientemente uma substância alvo como L-aminoácidos por fermentação usando um microorganismo.

Descrição da Técnica Relacionada

As células bacterianas tem sido modificadas em suas vias metabólicas, vias respiratórias e outras a fim de serem adaptadas a vários meios ambientes. No metabolismo de energia, Arc (controle de respiração aeróbica) e Fnr (redução de nitrato fumarato) são conhecidos como sistemas de controle desempenhando papéis importantes. Estes consistem de proteínas reguladoras globais e existentes universalmente em E. coli e outras espécies análogas. A primeira é codificada pelo gene arcA existente na posição de 0 minuto de cromossomo de E. coli, a última é codificada pelo gene fnr existente na posição de 29 min de cromossomo de E. coli, e ambos adaptam a célula a um meio ambiente por controle de muitos fatores sob uma condição anaeróbica. Além disso, foi elucidado que a proteína ArcA e a proteína Fnr são fatores de transcrição, e elas controlam positivamente ou negativamente a expressão de um gene de marcação no cromossomo de E. coli sob uma condição anaeróbica por ligação direta a uma região de promotor do gene de marcação (S. Iuchi et al, Cell, 66, 5-7 (1991)).

Recentemente, os perfis de expressão de cepas em que genes codificando reguladores globais como proteína ArcA e proteína Fnr derivadas de E. coli são rompidas são coletados em um banco de dados por uso de técnicas de micromatriz de DNA e acessíveis ao público (http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext?Exp_DB+-n+Bgetbin/get_htext?Exp_DB+-n+B).

• · · • ········ ·· ·

Assim, sabe-se que a proteína AfcA cdhtrdla tfôgíftfvàmeíttlfe a expressão dos genes para o ciclo de ácido tricarboxílico (S. Iuchi et al, Cell, 66, 5-7 (1991)) e a expressão dos genes para o ciclo de ácido tricarboxílico é aumentada na cepa rompida arcA no banco de dados. Por outro lado, sabe-se 5 que a proteína Fnr controla positivamente a expressão do gene para a via respiratória que funciona sob uma condição anaeróbica.

Como para os perfis de expressão nas cepas rompidas no fator global, a cepa rompida dam pode ser mencionada como uma cepa em que a expressão de genes para o TCA é aumentada como a cepa rompida arcA (H.

φ 20

Mori, Nara Institute of Science and Technology, pronunciamento verbal no simpósio “Green Biotechnology of Genome Age”, 2001, organizado pela Japan Bioindustry Association, Resource Biotransformation Study Group). A proteína Dam é uma metilase para fatores de modificação envolvidos em sistemas de modificação de restrição intracelular, e é codificada pelo gene dam existente na posição de 76 minutos de cromossomo E. coli (Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 87 (23) 9454-9458 (1990)).

Não foi registrada até agora melhora na produção de substâncias através do controle de expressão dos fatores globais como os genes arcA, fnr e dam.

Descrição da Técnica Relacionada

Um objeto da presente invenção é melhorar a eficácia /4 a uv produção na produção de uma substância utilizável por fermentação utilizando uma γ-proteobactéria como bactéria Escherichia.

Os inventores da presente invenção conduziram várias 25 pesquisas a fim de alcançar o objeto acima mencionado, e eles descobriram que a produção de substância por uma γ-proteobactéria poderia ser melhorada por modificação de um gene codificando para uma proteína reguladora existindo universalmente em γ-proteobactérias. Isto é, eles verificaram que uma capacidade para produzir uma substância alvo poderia ser melhorada por

······· · · rompimento do gene arcA em uma γ-prôteoKâctéria *e, âssíní, Tfe*alIzarãMi a presente invenção.

Isto é, a presente invenção provê o seguinte. (1) uma γproteobactéria tendo uma capacidade para produzir uma substância alvo e 5 modificada de modo que uma proteína ArcA não funciona normalmente.

(2) a γ-proteobactéria de acordo com (1), em que a proteína ArcA que normalmente funciona é uma proteína definida nos seguintes (A)

ou (B):

(A) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;

(B) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 32, incluindo substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e melhorando uma capacidade para produzir uma substância alvo quando a proteína não funciona normalmente na γ15 proteobactéria comparado com o caso em que a proteína funciona normalmente.

(3) A γ-proteobactéria de acordo com (1), em que a proteína

ArcA que normalmente funciona é uma proteína tendo 70% ou mais de homologia para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 e melhorando 20 a capacidade de produzir uma substância alvo quando a proteína não funciona normalmente na γ-proteobactéria comparado com o caso onde a proteína funciona normalmente.

(4) A γ-proteobactéria de acordo com (1), em que a proteína

ArcA que normalmente funciona é uma proteína tendo a seqüência de 25 aminoácidos de SEQ ID NO: 32 incluindo substituição, deleção, inserção ou adição de 2 a 20 aminoácidos e melhorando uma capacidade para produzir uma substância alvo quando a proteína não funciona normalmente na γproteobactéria comparado com o caso onde a proteína funciona normalmente.

(5) A γ-proteobactéria de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que a proteína ArcA não funciona nôrmalmentê pôr mêib dê* um rompimento de um gene arcA em um cromossomo.

(6) A γ-proteobactéria de acordo com (5), em que o gene arcA é DNA definido nos seguintes (a) ou (b):

(a) DNA contendo a seqüência de nucleotídeos dos números de nucleotídeos 101 a 817 de SEQ ID NO: 31;

(b) DNA hibridizável com a seqüência de nucleotídeos de números de nucleotídeos 101 a 817 de SEQ ID NO: 31 ou uma sonda que

pode ser produzida a partir da seqüência de nucleotídeos sob a condição

limitada e codificando para uma proteína que melhora uma capacidade para produzir uma substância alvo quando a proteína não funciona normalmente comparado com o caso onde a proteína funciona normalmente.

(7) A γ-proteobactéria de acordo com qualquer um dentre (1) a (6), que é uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia.

(8) A γ-proteobactéria de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que a substância alvo é um L-aminoácido.

(9) A γ-proteobactéria de acordo com (8) em que o Laminoácido é selecionado dentre o grupo consistindo de L-lisina, L-ácido glutâmico e L-arginina.

(10) Um método para produzir uma substância alvo, que compreende cultivar a γ-proteobactéria de acordo com qualquer um dentre (1) a (9) em um meio para produzir e acumular a substância alvo no meio ou células e coletar a substância alvo do meio ou células.

De acordo com a presente invenção, quando uma substância utilizável como L-aminoácidos é produzida por uso de uma γ-proteobactéria, a eficácia de produção pode ser melhorada.

Breve Explicação do Desenho

A figura 1 mostra padrões de acúmulo em WC196, WC196ÁarcA, WC196âdam e WC196Áfnr.

<7

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	• · ·	• ·	• ·· ·	• · ·	•	·· ·

• 20

Explicação Detalhada da Invenção

A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.

(1) -γ-proteobactéria da presente invenção

A γ-proteobactéria usada para a presente invenção não é particularmente limitada desde que seja um microorganismo pertencendo a γproteobactérias, como do gênero Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella ou semelhantes e tenha uma capacidade para produzir uma substância alvo. Especificamente, podem ser usadas as classificadas nas γ-proteobactérias de acordo com a taxonomia usada no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin- post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=l 236& 1 v 1 =3&keep-1 &srchmodel&unlock).

Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia incluem E. coli e assim em diante. Exemplos das pertencendo ao gênero Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e outros.

Estas são algumas espécies de Enterobacter agglomerans recentemente re-classificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii agglomerans e outras com base na análise de seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. Na presente invenção, a bactéria pode pertencer a ou o gênero Enterobacter ou Pantoea, desde que seja classificada em γ-proteobactérias e tenha o gene arcA.

Quando E. coli é criado por uso de técnicas de engenharia genética, a cepa Kl2 de E. coli e derivados da mesma podem ser usados.

Além disso, quando Pantoea ananatis é criado usando técnicas de engenharia genética, Pantoea ananatis cepas AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615) e AJ13601 (FERM BP-7207) e derivados das mesmas podem ser usadas. Apesar das cepas acima mencionadas serem identificadas como Enterobacter agglomerans, quandô elas' fóraiú isòlacfâs,ésfas êèpas foram re-classificadas em _PantOea ananaUs com base na anáhse de seqüênc.a de nucleotídeos de 16S rRNA etc, como descrito acima.

A γ-proteobactéria da presente invenção é qualquer uma das bactérias acima mencionadas, e é uma bactéria tendo uma capacidade de produzir uma substância alvo. A “capacidade de produzir uma substância alvo” significa uma capacidade de produzir e acumular a substância alvo em células ou um meio em tal grau que, quando a bactéria da presente invenção é cultivada no meio, a substância alvo pode ser coletada das células ou meio.

A substância alvo a ser produzida de acordo com a presente invenção não é particularmente limitada, de modo que seja uma substância que é produzida por uma γ-proteobactéria e sintetizada via o ciclo de ácido tricarboxílico ou uma substância sintetizada a partir desta substância como um substrato. Exemplos incluem, por exemplo, os convencionalmente produzidos por γ-proteobactérias, isto é, vários aminoácidos como L-lisina, L-treonina, Lisoleucina, L-ácido glutâmico, L-glutamina e L-arginina, ácidos orgânicos como L-homosserina e ácido succínico e outros. Além disso, a presente invenção também pode ser aplicada a uma substância que não foi até agora industrialmente produzida por uso de γ-proteobactérias, desde que possa ser sintetizada a partir de uma substância sintetizada via o ciclo TCA como um substrato.

Como γ-proteobactérias produzindo L-lisina, podem ser exemplificados mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. Este análogo de L-lisina é uma substância que inibe o crescimento de cepa produzida de L-aminoacido, mas esta inibição e completamente ou parcialmente cancelada quando L-lisina co-existe no meio. Exemplos de análogo de L-lisina incluem oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)L-cisteína (AEC), γ-metil lisina, α-clorocaprolactama e outros. Mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se • ··· · ··· · · · ··· · * ♦ <*· · ♦ · ♦ · ·· » · * ·*····· · · « · * · » · · « · · · · · , · ······♦ · · « as γ-proteobactérias a um tratamento de mutâ^ênese ârtiflciâl’cõh’vêncibMal. Os exemplos específicos de cepa bacteriana usada para produzir L-lisina incluem E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; referência à publicação acessível ao público de patente JP (Kokai) no. 56-18596 e patente US 4 346 170 e E. coli VL611. Nestes microorganismos, a inibição da retroalimentação de aspartoquinase por L-lisina é dessensibilizada.

Além do acima, podem ser mencionados, por exemplo, bactérias produzindo L-treonina descritas abaixo, porque a inibição de aspartoquinase por L-lisina é geralmente eliminada também em bactérias produzindo L-treonina.

Nos exemplos descritos abaixo, a cepa WC196 foi usada como uma bactéria produzindo L-lisina de E. coli. Esta cepa bacteriana foi criada conferindo uma resistência AEC à cepa W3110 derivada de E. coli K-12. Esta cepa foi designada como E. coli AJ13069, e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology da Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, a corporação administrativa independente, Depositário do Organismo de Patentes Internacionais, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, código postal 3055466, Chuo-Dai-6, 1-Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibarakiken, Japão) em 6 de dezembro de 1994, e recebeu um número de acesso de FERM P-14690. Então, foi convertida em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e recebeu o número de acesso de FERM BP-5252 (fazer referência à publicação de patente internacional WO96/17930).

Exemplos de γ-proteobactérias produzindo L-treonina incluem

E. coli VKPM B-3996 (RIA 1867, fazer referência à patente US 5 175 107), cepa MG442 (fazer referência a Gusyatiner et al, Genetika (em Russo), 14, pag. 947-956, 1978) e outros.

Exemplos de microorganismos pertencendo a γ8 »· ··· · »»· · · • * · · · »»·· proteobactérias e tendo capacidade produtora âê ácido L-glutamico mcfuem, por exemplo, microorganismos deficientes em atividade a-cetoglutarato desidrogenase ou tendo reduzida atividade α-cetoglutarato desidrogenase. As bactérias pertencendo ao gênero Escherichia deficientes em atividade acetoglutarato desidrogenase ou tendo reduzida atividade a-cetoglutarato desidrogenase e métodos para a sua obtenção são descritos na publicação acessível ao público de patente JP (Kokai) no. 5 244970 e 7-203980. Especificamente, as seguintes cepas podem ser mencionadas.

E. coli W3110sucA::Km^r

E. coliAJYl&A (FERM BP-3853)

E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E. coli AJ12949 (FERM-BP-4881)

E. coli W3110sucA::Km^r é uma cepa obtida por rompimento de gene α-cetoglutarato desidrogenase (a seguir referido como “gene sucA”) 15 de E. coli W3110, que é uma cepa completamente deficiente em acetoglutarato desidrogenase.

Os microorganismos pertencendo a γ-proteobactérias e deficientes em atividade α-cetoglutarato desidrogenase ou tendo reduzida atividade α-cetoglutarato desidrogenase e métodos para obter os mesmos são 20 descritos em publicação acessível ao público de patente JP (Kokai) nos. 5 244970 e 7-203980.

Exemplos de γ-proteobactérias produzindo L-arginina incluem

E. coli em que o gene argA foi introduzido (publicação acessível ao público de patente JP no. 57-5693) e E. coli cepa 237 (patente russa no. 200117677) 25 ou semelhantes.

Exemplos de L-isoleucina produzindo γ-proteobactérias incluem E. coli KX141 (VKPM B-4781, fazer referência à publicação acessível ao público de patente européia no. 519.113).

Exemplos de L-homosserina produzindo bactérias Escherichia

··· · • 4· •· •· •· •··· e

• « • · • · • · incluem a cepa NZ10, que é um revertente Leu⁺ de cepa C600 (fazer referência a Appleyard R.K. Genetics, 39, pag. 440-452, 1954).

Como γ-proteobactérias produzindo ácido succínico, exemplos usando E. coli são conhecidos (Wang, X. et al, Appl. Biochem. Biotech. 70·· · • * • · ·· ·*· · · ······ • · · · • · · · • · · · · • · ··· ·

72,919-928(1998)).

Além disso, bactérias pertencendo ao gênero Escherichia tendo capacidade de produção de L-aminoácido podem ser também criadas por introdução de DNA tendo informação genética envolvida na biossíntese de L-aminoacidos e melhorando a capacidade usando uma técnicas de

recombinação de genes. Por exemplo, como para bactérias produzindo Llisina, exemplos de genes que podem ser introduzidos incluem, por exemplo, genes codificando para enzimas da via biossintética de L-lisina como fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartoquinase, dihidrodipicolinato sintetase, dihidrodipicolinato reductase, succinildiaminopimelato transaminase e succinildiaminopimelato deacilase. No caso de um gene de uma enzima sofrendo de inibição de retro-alimentação por ácido L-aspártico ou L-lisina como fosfoenolpiruvato carboxilase ou aspartoquinase e dihidrodipicolinato sintetase, é desejável usar um gene mutante codificando para uma enzima em que esta inibição é eliminada.

Além disso, como para bactérias produzindo ácido Lglutâmico, exemplos de genes que podem ser introduzidos incluem genes de glutamato dehidrogenase, glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato dehidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato dehidrogenase, piruvato quinase, fosfoenolpiruvato 25 sintase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase, gliceraldeído -3fosfato dehidrogenase, triose fosfato isomerase, fructose bis-fosfato aldolase, fosfofructoquinase, glucose fosfato isomerase e assim em diante.

Além disso, uma atividade de uma enzima que catalisa uma reação para produzir um composto diferente de um L-aminoácido de de alvo ··· · • · · • · • · por ramificação da via biossintética pelo L-aminoácido pode ser diminuída ou tomada deficiente. Por exemplo, exemplos desta enzima que catalisa uma reação para produzir um composto diferente de L-lisina por ramificação da via biossintética de L-lisina incluem homosserina desidrogenase (fazer referência à publicação de patente internacional WO95/23864). Além disso, exemplos de uma enzima que catalisa uma reação para produção de um composto diferente de ácido L-glutâmico por ramificação da via biossintética de ácido L-glutâmico incluem α-cetoglutarato desidrogenase, isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato quinase, acetohidróxi ácido sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato dehidrogenase, glutamato decarboxilase, 1-pirofosfato desidrogenase e assim em diante.

Na criação de γ-proteobactérias tendo esta capacidade produzir a substância alvo, como descrito acima, para introduzir um gene γ-proteobactérias para melhorar sua capacidade, pode-se usar um método que um vetor replicável de modo autônomo em uma célula de γproteobactéria é ligado ao gene para produzir DNA recombinante e γproteobactéria é transformada com o mesmo. Além disso, também é possível incorporar um gene de marcação em cromossomo hospedeiro por um método usando transdução, transposon (Berg, D.E. e Berg, C.M. Bio/Technol. 1, p. 417, 1983), fago Mu (publicação acessível ao público de patente JP (Kokai) no. 2-109985) ou recombinaçao homologa (Expeimieiits in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Além disso, o gene de marcação pode também ser introduzido por um método de ruptura de um gene usando um DNA linear produzido por PCR (Kirill A, Datsenko et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, (12), 6640-6645 (2000)).

• · · · · · • · ······ • · · · · · • · · · · · ······· de em em φ 20

Exemplos de γ-proteobactérias criadas por técnicas de DNA recombinantes, como descrito acima, incluem, por exemplo, bactérias pertencendo ao gênero Escherichia tendo melhoradas atividades de dihidrodipicolinato sintase tendo uma mutação cancelando a inibição de retro25 • ·

• ·· · • ·· •· • · •· ,···· alimentaçao por L-lisina, • · · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · ······· · · V·· aspartoquinase, dihidrodipicolinato reductase, e assim em diante, dos quais a inibição de retro-alimentaçào por L-lisina é dessensibilizada, e tendo capacidade produtora de L-lisina (patente US no. 6 040 160), e bactérias pertencendo ao gênero Enterobacter (o gênero Pantoea) 5 tendo melhorada atividade de citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase ou glutamato desidrogenase e tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico (EP 0 952 221 A2, EP 0 999 282 A2, EP 1 078 989 A2).

A γ-proteobactéria usada para a presente invenção é uma bactéria tendo uma capacidade para produzir a substância alvo acima

mencionada e modificada de modo que a proteína ArcA não funciona normalmente em uma célula. A expressão “modificada de modo que a proteína ArcA não funciona normalmente em uma célula” significa que ela é modificada de modo que a função da proteína ArcA deve ser completamente eliminada, ou a função deve ser reduzida comparada com uma cepa não modificada de bactéria Escherichia como uma cepa selvagem. O estado onde a proteína ArcA não funciona normalmente pode ser, por exemplo, um estado onde a transcrição ou tradução do gene arcA é inibida, e assim o produto gênico do mesmo, a proteína ArcA, não é produzida ou a produção da mesma é reduzida, ou um estado onde a proteína ArcA produzida é mudada, e assim a φ 20 função apropriada da proteína ArcA é reduzida ou eliminada. Exemplos de γproteobactérias em que a proteína ArcA não funciona nomialrnente incluem, tipicamente, uma cepa rompida no gene, em que o gene arcA no cromossomo é rompido por uma técnica de recombinação genética, e uma cepa mutante em que uma seqüência regulatória da expressão ou região de codificação do gene 25 arcA no cromossomo é mudada, e assim a proteína ArcA funcional não é mais produzida.

Exemplos da proteína ArcA contida em uma cepa selvagem ou cepa não modificada usada para a criação da bactéria da presente invenção incluem, por exemplo, uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de

··· · · · ··· ··· i ;_<e

SEQ ID NO: 32. Além disso, exemplos de gene arcA incluem, por exemplo, DNA tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31. Além disso, o gene pode ter a seqüência em que qualquer códon é substituído com outro códon equivalente. Na presente invenção, o termo “DNA codificando para 5 uma proteína” significa que, quando o DNA é de filamento duplo, um dos filamentos codifica para a proteína.

Além disso, a proteína ArcA contida na cepa selvagem ou cepa não modificada não é limitada a uma proteína tipo selvagem, e pode conter substituição, deleção, inserção, adição ou semelhante de um ou mais dos

resíduos de aminoácidos desde que a proteína tenha a atividade de proteína ArcA. Apesar do número de “vários” resíduos de aminoácidos referidos aqui diferir dependendo da posição ou tipo de resíduos de aminoácidos na estrutura tri-dimensional da proteína, pode ser especificamente 2 a 30, preferivelmente 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10.

A “atividade da proteína ArcA” acima mencionada é uma atividade que melhora a capacidade de produzir uma substância alvo quando a proteína não funciona normalmente comparada com o caso onde a proteína funciona normalmente. Em outras palavras, a atividade da proteína ArcA significa que uma γ-proteobactéria modificada de modo que a proteína não 20 funciona normalmente produz e acumula uma maior quantidade de substância alvo em um meio comparado com uma cepa não modificada de γproteobactéria, com uma cepa selvagem. Exemplos de cepa selvagem de E. coli incluem, por exemplo, a cepa K12 e derivado da mesma como cepa MG1655 de E. coli (ATCC no. 47076) e cepa W3110 (ATCC no. 27325).

Além disso, exemplos de cepa não modificada de Pantoea ananatis (Enterobacter agglomerans) incluem as cepas AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615) e AJ 13601 (FERM BP-7207).

As acima mencionadas substituição, deleção, inserção, adição, inversão ou semelhantes de resíduos de aminoácidos também incluem

mutações de ocorrência natural ou variações devido â cíi*íerênçâ”em indivíduos, espécies, cepas ou semelhantes dos microorganismos contendo a proteína ArcA.

Exemplos destes mutantes ou variantes do gene arcA, como descrito acima, incluem DNA que é hibridizável com uma seqüência de nucleotídeos compreendendo a seqüência de números de nucleotídeos 101 a 817 em SEQ ID NO: 31 ou uma sonda que pode ser produzida a partir de seqüência de nucleotídeos sob a condição limitada e codifica para uma proteína tendo uma atividade similar à de ArcA. A “condição limitada” usada aqui é uma condição sob a qual se forma um assim chamado híbrido específico, e um híbrido não específico não é formado. É difícil expressar claramente esta condição por uso de qualquer valor numérico. No entanto, por exemplo, a condição limitada é exemplificada por uma condição sob a qual

DNAs tendo alta homologia, por exemplo DNAs tendo homologia de 50% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, são hibridizados um com o outro, mas DNAs tendo homologia menor do que acima não são hibridizados um com o outro. Mais especificamente, a condição limitada é exemplificada por uma condição sob a qual DNAs são hibridizados um com o outro em uma concentração de sal correspondendo a φ 20 uma condição normal de lavagem em hibridização Southem, isto é, 1 x SSC,

0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60 °C.

Como a sonda, uma seqüência parcial da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31 também pode ser usada. Esta sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos produzidos com base na 25 seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31, como iniciadores e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 31 como um gabarito. Quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bps é usado como a sonda, as condições de lavagem para a hibridização podem consistir de 50 °C, 2 x SSC e 0,1% SDS.

·· : · ! .... . .- ,· • · ····.·. . * . ·

Os termos gene arcA e proteína ArcA usados abaixo nao sao limitados ao tendo a seqüência de nucleotídeos ou seqüência de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 31 ou 32, mas incluem mutantes ou homólogos dos mesmos. Como um exemplo de homólogo, a seqüência de nucleotídeos do gene arcA e a seqüência de aminoácidos de ArcA de Pantoea ananatis são mostrados na SEQ ID NO: 19 e 20.

A bactéria da presente invenção é uma bactéria modificada de modo que a proteína ArcA não funciona normalmente, especificamente, uma γ-proteobactéria da qual o gene arcA é rompido, por exemplo. Esta bactéria pode ser obtida, por exemplo, por substituição de um gene arcA que não funciona normalmente (a seguir também referido como um “gene arcA rompido” ) para o gene arcA no cromossomo por recombinação homóloga usando uma técnica de recombinação genética (Experiments in Molecular

Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972), Matsuyama, S. e

Mizushima, S. J., Bacteriol. 162,1196 (1985)).

O mecanismo da recombinação homóloga é como a seguir.

Quando um plasmídeo ou semelhante transportando uma seqüência demonstrando homologia com uma seqüência cromossômica é introduzido em uma célula bacteriana correspondente, ocorre a recombinação em um sítio da φ 20 seqüência homóloga em uma certa freqüência, e assim o plasmídeo introduzido como um todo é integrado no cromossomo. Então, ao causar novamente a recombinação no sítio da seqüência homóloga no cromossomo, o plasmídeo pode ser removido novamente do cromossomo. No entanto, dependendo da posição em que a recombinação é causada, o gene rompido pode permanecer no cromossomo, enquanto o gene normal original pode ser removido do cromossomo junto com o plasmídeo. Por seleção desta cepa bacteriana, uma cepa bacteriana em que o gene arcA normal é substituído com o gene arcA rompido pode ser obtida.

Esta técnica de rompimento de gene baseada na recombinação • ·

...............

homóloga já foi estabelecida, e um método usando um DNA linear, um método usando um plasmídeo sensível à temperatura ou semelhante pode ser usado para a mesma. O gene arcA também pode ser rompido por uso de um plasmídeo que contém o gene arcA inserido com um gene marcador como um 5 gene de resistência a drogas, e não pode replicar em uma célula microbiana de marcação. Isto é, em um transformante que foi transformado com este plasmídeo e assim adquiriu resistência a droga, o gene marcador é integrado no DNA cromossômico. É provável que este gene marcador tenha sido integrado pela recombinação homóloga do gene arcA presente em ambos os

lados do marcador com estes genes no cromossomo, e assim uma cepa rompida no gene pode ser selecionada de modo efetivo.

Exemplos de plasmídeo sensível à temperatura funcionando em bactérias Escherichia incluem pMAN997 (publicação de patente internacional WO99/03988), pHSG415, pHSG422 (Hashimoto-Gotoh, T. et 15 al, Gene, 16, 227-235 (1981)) e assim em diante.

Especificamente, um gene arcA rompido usado para o rompimento do gene pode ser obtido por deleção de uma certa região do gene arcA por meio de digestão com enzima(s) de restrição e religação, por inserção de outro fragmento de DNA (gene marcador, etc) no gene arcA, ou por introdução de substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou mais nucleotídeos em uma seqüência de nucleotídeos de região de codificação de gene arcA, sua região de promotor ou semelhante por meio de mutagênese específica para sítio (Kramer W. e Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) ou tratamento com um reagente químico como hipossulfito de sódio e hidroxilamina (Shortle, D. e Nathans, D. Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 75, 270, (1978)), ou outros, de modo que a atividade do repressor codificado pode ser reduzida ou eliminada, ou transcrição do gene arcA deve ser reduzida ou eliminada. Dentre estes métodos, um método usando deleção de uma certa região do gene arcA por digestão com uma ♦ ♦ * · * . . ' • · · · * . : , ····.,, - ' · · · ~ - - . . · enzima de restrição ou re-ligação ou inserção de outro fragmento de DNa no gene arcA é preferido em vista de confiabilidade e estabilidade.

A seqüência de gene arcA por si é conhecida, e assim o gene arcA pode ser facilmente obtido pelo método PCR ou método de hibridização 5 com base na seqüência. É suficiente que o gene arcA usado para o rompimento do gene deva ter homologia em tal grau que a recombinação homóloga com o gene arcA contido na bactéria de marcação deve ser causada. Especificamente, é suficiente que a homologia deve ser geralmente 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais.

O rompimento do gene de marcação pode ser confirmada por análise do gene no cromossomo usando Southem blotting ou método PCR.

Os métodos para obter vários genes, hibridização, PCR, preparação de DNA plasmídeo, digestão e ligação de DNA, transformação, 15 etc, usados para a presente invenção são descritos em Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1.21 1989.

Além disso, uma cepa mutante em que proteína ArcA funcional não é mais produzida pode ser obtida submetendo-se uma γ20 proteobactéria a irradiação ultravioleta ou tratamento da mesma com um agente mutante usado para o tratamento de mutação comum como N-metilN'-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso.

Por cultivo de microorganismo γ-proteobactéria tendo uma capacidade para produzir uma substância alvo e modificada de modo que a proteína ArcA não funciona normalmente, que pode ser obtida como descrito acima, em um meio para produzir e acumular a substância alvo no meio ou células e coletar a substância alvo do meio ou células, a substância alvo pode ser produzida. De acordo com a presente invenção, a eficiência de produção da substância alvo pode ser melhorada por uso de γ-proteobactéria tendo as

«... .. .. .. . ... .

-- . . . , · · · · ^SÍ? * » S.

. .5- SS S® » «s » ·» s® _w « β »» ’® características acima mencionadas. Estima-se que o gene arcA é expresso em uma cepa selvagem de y-proteobactéria com referência ao gene arcA durante a cultura e inibe a expressão dos genes envolvidos no ciclo TCA, enquanto em uma cepa em que a proteína ArcA não funciona normalmente, esta 5 inibição de expressão para o genes de ciclo TCA é cancelada, e assim o efeito

acima deve ser obtido.

O meio usado para a presente invenção pode ser um meio comum contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos como requerido. Como a fonte de carbono, 10 pode-se usar sacarídeos, como glucose, sacarose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xilose, trehalose, ribose e hidrolisado de amido, álcoois como glicerol, mannitol e sorbitol e ácidos orgânicos como ácido glucônico, ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico. Como a fonte de nitrogênio, pode-se usar sais de amônio inorgânico, como sulfato de amônio, cloreto de 15 amônio e fosfato de amônio, nitrogênio orgânico como hidrolisado de proteína de soja, gás amônia, amônia aquosa e outros. Como nutrientes orgânicos em quantidade de traço, é desejável adicionar substâncias requerida, por exemplo vitaminas, como vitamina B], ácidos nucleicos como adenina e RNA ou extrato de levedura ou outros para o meio em quantidades 20 apropriadas. Além do acima, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íon feno, íon manganês e outros são adicionados em quantidades pequenas, como requerido.

A cultura pode ser realizada sob condições bem conhecidas, convencionalmente usadas, dependendo da cepa bacteriana usada. Por exemplo, a cultura é preferivelmente realizada sob condição aeróbica durante a 72 horas. A temperatura da cultura é preferivelmente controlada para estar entee 30 °C a 45 °C e pH é preferivelmente controlado para ser 4,5 a 8 durante a cultura. As substâncias inorgânicas ou orgânicas, ácidas ou alcalinas, assim como gás amônia e outros podem ser usadas para ajuste de ρΗ. '

Para coletar a substância alvo a partir do meio ou células, qualquer método especial não é requerido para a presente invenção. Isto é, ele pode ser realizado por uma combinação de técnicas convencionalmente bem conhecidas, como os métodos usando resinas de troca de íons, precipitação ou outras técnicas dependendo do tipo de substância alvo. Além disso, a substância alvo acumulada nas células pode ser coletada, após as células serem fisicamente ou enzimaticamente rompidas, a partir do extrato de células ou fração de membrana dependendo da substância alvo. Além disso, dependendo da substância alvo, as células contendo a substância alvo podem ser também usadas como elas são um catalisador microbiano ou semelhante. Exemplos

A seguir, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos- seguintes exemplos.

Exemplo.....1 -Rompimento de genes arcA, tfom e/^r de £. coli

A completa sequência de nucleotídeos de DNA genômico de E. coli cepa K.-12 já foi elucidada (Blattner F.R. Plunkett G. Bloch C.A. et al, Science, 227,1453-1474 (1997);

ftp7/ftp.genetics.wisc.edu/pub/seqüence/ecolim52.seq.gz).

Com base nas sequências de nucleotídeos conhecidas de genes arcA, dam e fnr, as cepas rompidas em genes para cada um dentre arcA, dam e fnr foram produzidas. No seguinte procedimento, sistema QIAGEN-Genomic-tip (produzido por QIAGEN) foi usado para a extração de DNA genômico.

(1) Rompimento de gene arcA de E. coli

Os iniciadores foram sintetizados com base na sequência de nucleotídeos relatada de arcA, e fragmentos N e C -terminais de gene arcA e fragmentos N e C terminais de gene arcA foram amplificados por método

PCR usando o DNA genômico de E. coli cepa MG1655 como um gabarito.

Polimerase de DNA Pyrobest (produzido por Takara Shuzo) foi usado para

PCR, e PCR foi realizado de acordo com as instruções dos fabricantes. Os © iniciadores 1 e 2 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificação de fragmento N-terminal, e iniciadores 3 e 4 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificação de fragmento C-terminal. O iniciador 1 foi projetado para conter um sítio íffndIII, e iniciador 4 foi projetado para conter um sítio Abai.

Iniciador 1: cccaagcttaaagccctttacttagctta (seqüência complementar aos números de nucleotídeos 5482 a 5501 de seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso ΑΕΟΟΟ510 adicionado com ccc 10 e sítio Hindíll na extremidade 5', SEQ ID NO: 1).

Iniciador 2: tccgcgccatctgtcgcttc (seqüência de números de nucleotídeos 4851 a 4870 da seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000510, SEQ ID NO: 2).

Iniciador 3: gaagcgacagatggcgcggaaaagctacaagttcaatggt (seqüência complementar aos nucleotídeos números 4541 a 4560 da seqüência de nucleotídeos do GenBank número de acesso AE000510 adicionado à extremidade 5' com uma seqüência complementar aos nucleotídeos números 4851 a 4870 da seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso ΑΕ000510, SEQ IDNO: 3).

Iniciador 4: gggtctagaggttgaaaaataaaaacggc (seqüência de nucleotídeos números 4188 a 4207 da seqüência de nucleotídeos do GenBank número de acesso AE000510 adicionado com ggg_: e sítio Abai na extremidade 5’, SEQ IDNO: 4).

Após PCR, os fragmentos de DNA amplificados foram cada purificados por uso de kit de purificação de PCR QIAquick (produzido por QIAGEN). O fragmento de DNA N-terminal e fragmento de DNA C-terminal purificados, iniciadores 1 e 4 foram usados para o método de PCR “permutação” (A. J. Link, D. Phillips, G.M. Church, Joumal of Bacteriology, 179, 6228-6237 (1997)) para obter um fragmento arcA rompido. O fragmento de DNA purificado foi digerido com /fíwdlll e Xbal (produzido por Takara Shuzo ) e submetido a tratamento com fenol/ clorofórmio e precipitação com etanol. Este fragmento foi ligado com um plasmídeo sensível a temperatura pMAN997 (publicação de patente internacional WO99/ 03988) também digerido com Hindlll e Xbal por uso de kit de ligação de DNA ver. 2 (produzido por Takara Shuzo). As células competentes para JM109 (produzidas por Takara Shuzo) foram transformadas com esta solução de ligação e aplicadas a uma placa de agar LB contendo 25 pg/ml de ampicilina (produzido por Sigma) (LB + placa de ampicilina). Após as células serem cultivadas a 30 °C durante um dia, as colônias em crescimento foram cultivadas em tubos de teste a 30 °C em meio LB contendo 25 pg/ml de ampicilina, e plasmídeos foram extraídos por uso de um extrator de plasmídeos automático PI-50 (produzido por Kurabo Industries). Os plasmídeos obtidos foram digeridos com Hmdll e Xbdl e submetidos a eletroforese de gel agarose e o plasmídeo inserido com o fragmento de marcação foi designado como plasmídeo pMAN_ AarcA paro rompimento de arcA. O pMAN997 acima mencionado é um plasmídeo obtido por troca de fragmentos Fs/jI -ffindIII de pMANO31 (S. Matsuyama e S. Mizushima, J. Bacteriol. 162,1196 (1985)) e pUCl 9 (produzido por Takara Shuzo).

A cepa WC196 de E. coli foi transformada com o plasmídeo pMA_AarcA de acordo com o método de C.T. Chung et al, e colônias foram selecionadas em uma placa de LB + ampicilina a 30 °G. Os clones selecionados foram cultivados durante a noite a 30 °C como cultura de líquido, então o caldo de cultura foi diluído a IO'³ de concentração e colocado em um placa de LB + ampicilina, e colônias foram selecionadas a 42 °C. Os clones selecionados foram aplicados a uma placa de LB + ampicilina e cultivados a 30 °C, então 1/8 das células na placa foram colocadas em suspensão em 2 mL de meio LB e cultivadas a 42 °C durante 4 a 5 horas com agitação. O caldo de cultura foi diluído a IO'⁵ de concentração e aplicado em

• ··· · φ · · · placa LB, e várias centenas de colônias dentre as colônias oblidâs fdfam inoculadas em uma placa LB e placa LB + ampicilina para confirmar o crescimento e, assim, selecionar cepas sensíveis a ampicilina. O PCR da colônia foi realizado para várias cepas sensíveis a ampicilina para confirmar a 5 deleção de gene arcA. Deste modo, uma cepa rompida de arcA derivada de E.

coli WC196, WC196AarcA, foi obtida.

(2) Rompimento de gene dam de E. coli

Uma cepa rompida de gene dam foi produzida de WC196 do

mesmo modo que em (1).

Os iniciadores foram sintetizados com base em seqüência de nucleotídeos de gene dam e fragmentos N-e C-terminais de gene dam foram amplificados por método PCR usando DNA genômico de cepa MG 1655 de E.

coli como um gabarito. Os iniciadores 5 e 6 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificar o fragmento N-terminal e iniciadores 7 e 8 foram usados como iniciadores para o PCR para amplificar o fragmento C-terminal.

O iniciador 5 foi projetado para conter um sítio HinâlII, e iniciadores 8 foi projetado para conter um sítio Xhal.

Iniciador 5: cccaagcttccgtggtatgtcctggtttc (seqüência complementar aos nucleotídeos números 5150 a 5169 de seqüência de 20 nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000414 adicionado com ccc e sítio //bzdlll na extremidade 5', SEQ ID NO: 5).

Iniciador 6: agactgatcaggtcgctatt (seqüência dos nucleotídeos números 47141 a 4760 da seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000414, SEQ ID NO: 6).

Iniciador 7: aatagcgacctgatcagtctgccttatgcaccgctgtctg (seqüência complementar aos nucleotídeos números 4361 a 4380 da seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000414 adicionada na extremidade 5'com uma seqüência complementar aos nucleotídeos números 4741 a 4760 de seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000414, SEQ ID NO: 7), .......* * ···

Iniciador 8: gggtctagacgtcagattgggaacatagt (seqüência de nucleotídeos números 3931 a 3950 de seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000414 adicionada com ggg e sítio xbal na extremidade 5 5', SEQ ID NO: 8).

Após PCR, os fragmentos de DNA amplificados foram cada purificados por uso de kit de purificação de PCR QIAquick (produzido por Qiagen). O fragmento de DNA N-terminal purificado e o fragmento de DNA

C-terminal, iniciadores 5 e 8, foram usados para o método PCR de

permutação para obter um fragmento dam de tipo deficiente. O seguinte procedimento foi realizado do mesmo modo que em (1) para obter um dam

WC196Adam de cepa rompida.

(3) Rompimento de gene fnr de E. coli

Uma cepa rompida em gene fnr foi produzida a partir de 15 WC196 do mesmo modo que em (1).

Os iniciadores foram sintetizados com base na seqüência de nucleotídeos reportada do gene fnr, e fragmentos N e C terminais do gene fnr foram amplificados por método PCR usando DNA genômico de E. coli cepa MG 1655 como um gabarito.

• 20 Os iniciadores 9 e 10 foram usados como os iniciadores para

PCR para amplificar um fragmento N-terminal, e iniciadores 11 e 12 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificar o fragmento C-terminal. O iniciador 9 foi projetado para conter um sítio HzndIII, e iniciador 12 foi projetado para conter um sítio Xbal. Uma cepa rompida em fnr foi produzida 25 a partir de WC 196 do mesmo modo que em (1).

Iniciador 9: cccaagcttgcaattgggccgtcctggcg (seqüência complementar aos nucleotídeos números 7981 a 8000 de seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000231 adicionada com ccc e sítio /fzúdlll na extremidade 5', SEQ ID NO: 9).

• 20 • · . . . .·. ··· · . · · .·

Iniciador 10: tcaagctgatcaagctcâfg (seqtiênCia*de nucleotídeos números 7501 a 7520 de seqüência de nucleotídeos do GenBank número de acesso AE000231, SEQ ID NO: 10).

Iniciador 11: caggagttgatcagcttgagaaaaatgccgaggaacgtc (seqüência complementar aos nucleotídeos números 7121 a 7140 da seqüência de nucleotídeos do GenBank número de acesso AE000231 adicionado à extremidade 5' com uma seqüência complementar aos nucleotídeos números 7501 a 7520 de seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000231, SEQ ID NO: 11),

Iniciador 12: gggtctagattggtcgtcctggttaggat (seqüência de nucleotídeos números 6671 a 6690 da seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000231 adicionada com ggg e sítio Xba\ na extremidade 5’, SEQIDNO: 12).

Após PCR, os fragmentos de DNA amplificados foram cada purificados por uso de kit de purificação PCR QIAquick (QIAGEN). O fragmento de DNA N-terminal purificado e o fragmento de DNA C-terminal, iniciadores 9 e 12, foram usados para o método PCR de permutação para obter um fragmento dam de tipo deficiente. O seguinte procedimento foi realizado do mesmo modo que em (1) para obter um WC196Aínr de cepa rompida fnr.

Exemplo 2 -Efeito de rompimento de arcA em produção de L-lisina em cepa de E. coli

A cepa rompida em gene arcA, cepa WC196AarcA, a cepa rompida em gene dam, WC196Adam, a cepa rompida em gene fnr, 25 WC196Afhr, e a cepa parental das mesmas, WC196, foram cultivadas e suas quantidades de produção de L-lisina foram medidas. O meio, cultura e método e método de análise para a medição são mostrados abaixo.

• · ·

[Meio de base: meio E-lOOf * .......· ·

Glucose	Concentração final 10g/l (esterilizado separado) 20 mM
•	NH₄CI
5	NaHPO₄	40 mM
	KH₂PO₄	30 mM
	CaCl₂	0,01 mM
	FeSO₄	0,01 mM
	MnSO₄	0,01 mM
10	Ácido cítrico	5 mM
•	Cloridreto de tiamina	2 mM (esterilizado separado)
	Ácido casamino	2,5 g/L(esterilizado separado)
	MES-NaOH (pH 6,8)	50 mM(esterilizado separado)

[Método de cultura]

Cultura de reabastecimento:

As bactérias de carga foram inoculadas.

Meio agar LB (droga foi adicionada como requerido) 37 °C, 24 h.

Cultura de semente:

φ 20 As bactérias sofreram a cultura de reabastecimento foram inoculadas em um volume de 2 mL para meio LB.

Meio LB (droga foi adicionada como requerido), 37 °C, durante a noite.

Cultura principal:

1/16 das bactérias na placa de célula de cultura de semente foi inoculado.

Meio E-100 (droga foi adicionada como requerido), 37 °C, 20 ml em volume de 500 ml frasco Sakaguchi.

[Método de análise]

O caldo de cultura foi

* ·	• · ·	•	• V ·	«	&
♦ · • · • ·	• • *	• · ♦ · • ·	• • •	• ♦ • · « ·	• · • •	• ·
— Λ_—		• · «	• ·	• ·	•

citi uni ··· · • · · • · ’5Ô0 piem um curso de tempo, e a concentração de glucose e acúmulo de L-lisina em caldo de cultura foi medido. A concentração de glucose e acúmulo de L-lisina foram medidos para sobrenadante do caldo de cultura obtido após 5 centrifugação a 15.000 rpm durante 5 min diluído em uma concentração apropriada com água por uso de Biotech Analyzer (Sakura Seiki). Os resultados são mostrados na figura 1.

Como resultado, observou-se que a cepa rompida em gene fnr demonstrou acúmulo de L-lisina equivalente ao da cepa de controle, e a cepa

rompida em gene dam demonstrou reduzido acúmulo comparado com a cepa de controle. Por outro lado, foi reconhecido que o acúmulo de L-lisina da cepa rompida em gene arcA foi melhorado em comparação com a cepa de controle.

Exemplo 3 -Efeito de rompimento de arcA em produção de ácido L-glutâmico 15 em cepa de E. coli

Porque o efeito de melhora do acúmulo de L-lisina foi observado no exemplo 2 pelo uso de rompimento de gene arcA, o efeito do gene arcA sobre a fermentação de ácido L-glutâmico foi examinada neste exemplo.

φ 20 A fim de confirmar o efeito da deficiência do gene arcA sobre a produção de ácido L-glutâmico em MG 1655 de E. coli, a cepa deficiente em sucA derivada de MG1655 de E. coli (MG1655AsucA) e cepa duplamente deficiente em sucA e arcA derivada de MG1655 de E. coli (MG1655AsucAAarcA) foram construídas.

(1) Rompimento de gene sucA de E. coli

Uma cepa rompida em gene sucA foi produzida a partir de MG 1655 do mesmo modo que no exemplo 1.

Os iniciadores foram sintetizados com base na seqüência de nucleotídeos registrada do gene sucA, e fragmentos N e C terminais do gene • ·

* ··· * · :: ·.’: · *: · • · · · · · - ····_··· • ·· · • ♦ · ·* ·* sucA foram amplificados pelo método PCÉ. us*ándo o DNA genômicó deíeepa

MG1655 de E. coli como um gabarito.

Os iniciadores 13 e 14 foram usados como os iniciadores para

PCR para amplificação de fragmento N-terminal e iniciadores 15 e 16 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificação de fragmento Cterminal. O iniciador 13 foi projetado para conter um sítio Hinálll, e iniciador 16 foi projetado para conter um sítio Xbal. Uma cepa rompida em sucA foi produzida a partir de MG 1655 do mesmo modo que em (1).

Iniciador 13: cccaagcttctgcccctgacactaagaca (seqüência de nucleotídeos números 10721 a 10740 da seqüência de nucleotídeos do

GenBank número de acesso AE000175 adicionada com ccc e sítio TfrndIII na extremidade 5 , SE^^115 blO. 13)

Iniciador 14: cgaggtaacgttcaagacct (seqüência complementar aos nucleotídeos números 11501 a 11520 da seqüência de nucleotídeos do 15 GenBank número de acesso AE0000175, SEQ ID NO: 14)

Iniciador 15: aggtcttgaacgttacctcgatccataacgggcagggcgc (seqüência de nucleotídeos números 12801 a 12820 de seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso AE000175 adicionado na extremidade 5' com a seqüência de nucleotídeos números 10501 a 11520 da 20 seqüência de nucleotídeos do GenBank número de acesso AE000175, SEQ ID NO: 15).

Iniciador 16: gggtctagaccactttgtcagtttcgatt (seqüência complementar ao nucleotídeo números 13801 a 13820 da seqüência de nucleotídeos do GenBank número de acesso AE000175 adicionada com ggg e 25 sítio Xba\ na extremidade 5', SEQ ID NO: 16).

Após PCR, os fragmentos de DNA amplificados foram, cada, purificados por uso de kit de purificação de PCR QIAquick (produzido por QIAGEN). O fragmento de DNA N-terminal e fragmento de DNA C-terminal purificados, iniciadores 13 e 16, foram usados para o método PCR de

• ·}·**······ · · · permutação para obter um fragmento sucA de tipo ‘deficiente.··© «seguinte procedimento foi realizado do mesmo modo que em (1) para obter uma cepa rompida em sucA, MG1655AsucA.

(2) Preparação de cepa duplamente deficiente em genes sucA e arcA de £. coli

Do mesmo modo que no exemplo 1, o gene arcA de

MG1655AsucA foi rompido para preparar uma cepa duplamente deficiente em genes sucA e arcA ( MG1655AsucAAarcA).

Similarmente, a cepa duplamente deficiente em sucA e dam (

MG1655AsucAAdam) e cepa duplamente deficiente em sucA e fnr ( MG1655AsucAAfnr) foram produzidas.

A fim de examinar o efeito de rompimento de gene arcA em fermentação de ácido L-glutâmico, as cepas duplamente deficientes para os genes, cepas MG1655AsucAAarcA, MG1655AsucAAdam, e

MG1655AsucAAfiir, assim como a cepa rompida em gene sucA, MG1655AsucA, como um controle, foram cultivadas, e as quantidades de produção de ácido L-glutâmico foram medidas. O meio, métodos de cultura e método de análise para a medida são mostrados abaixo.

φ 20

Glucose [Meio de base: meio MS]

Concentração final

40g/l (esterilizado separado)

MgSO₄. 7H₂O g/L (esterilizado separado) (NH₄)₂SO₄ g/L

KH₂PO₄

Extrato de levedura

FeSO₄

MnSO₄

CaCO₃ g/L g/L

0,01 g/L

0,01 g/L g/L (esterilizado separado) [Métodos de cultura] ,—„ — ,» . · · W “ V wwWWWwWW WwW

Cultura de reabastecimento: c . Ύ⁰

As bactérias de carga foram inoculadas.

Meio agar LB (droga foi adicionada como requerido) 37°C, 24 h.

Cultura de semente em tubo de teste:

As bactérias sofreram a cultura de reabastecimento foram inoculadas.

Meio líquido LB (droga foi adicionada como requerido), 37°C, 16 h.

Cultura principal:

10% de meio líquido para a cultura de sementes foram inoculados.

Meio liquido MS (droga foi adicionada como requerido),

37°C, 20 ml em frasco Sakaguchi de 500 ml de volume.

[Método de analise]

O caldo de cultura foi amostrado em um volume de 500 μΐ em um curso de tempo, e a concentração de glucose e acúmulo de ácido Lglutâmico em caldo de cultura foi medido. A concentração de glucose e concentração de ácido L-glutâmico foram medidos para sobrenadante do 20 caldo de cultura obtido após centrifugação a 15.000 rpm durante 5 min diluído em uma concentração apropriada com água por uso de Biotech Analyzer (Sakura Seiki). O acúmulo e rendimento de ácido L-glutâmico no ponto onde o sacarídeo foi depletado são mostrados na tabela 1.

Tabela 1 : Acúmulo e rendimento de ácido L-gíiitâmico dê cêpâ rompidi em sucA e arcA

Cepa	Acúmulo de ácido L- glutâmico (g/L)	Rendimento de ácido Lglutâmico (%)
MG1655AsucA	15,4	36,9
MG1655Asuc AAarc A	17,0	41,7
MG1655Asuc AAdam	14,2	35,5
MG1655AsucAAfhr	14,6	36,6

Como resultado, tanto o acúmulo como o rendimento de ácido

glutâmico foram levemente menores em cepa rompida em gene sucA e dam comparado com controle, e eles foram comparáveis aos do controle na cepa rompida em gene sucA e fnr. Por outro lado, foi reconhecido que tanto o acúmulo como o rendimento de ácido L-glutâmico foram melhorados na cepa rompida em gene sucA e arcA comparado com a cepa de controle.

Exemplo 4 -Rompimento de gene arcA de Pantoea ananatis <1> Aquisição de gene arcA de Pantoea ananatis (1) Construção de Pantoea ananatis sob uma condição de pH baixo.

ArcA é um regulador global de existência universal em E. coli e outras espécies relacionadas. Usando uma bactéria pertencendo ao gênero Pantoea, Pantoea ananatis AJ 13601, que é parente de E. coli, gene arcA de Pantoea ananatis foi obtido com base em uma seqüência de nucleotídeos conhecida de arcA de E. coli. A cepa AJ 13601 foi obtida como a seguir (fazer referência a EP 1 078 989 A2). Cepa AJ13355 foi isolada de solo em Iwatashi, Shizuoka, Japão, como ma cepa que pode crescer sob um pH baixo em um meio contendo ácido L-glutâmico e fonte de carbono. A partir da cepa AJ 13355, a cepa SC 17 foi selecionada como um mutante menos produtor de muco que mostra bom crescimento. A cepa SC17sucA, em que o gene acetoglutarato desidrogenase (aKGDH) é rompido, foi construído da cepa λ àa c % Rub:___&

SC 17. Para a cepa SC17sucA, o plasmídeo pSTVCB contendo um geriè^g,·^’ citrato sintase (gltÁ) derivado de Brevibacterium lactofermentum (pSTVCB), e o plasmídeo RSFCPG contendo gltA, gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e gene glutamato dehidrogenase (gdhÃ) derivados de E. coli foram introduzidos. A partir dos transformantes obtidos, a cepa AJ13601 foi selecionada como a cepa que tem uma aumentada resistência a concentração elevada de ácido L-glutâmico sob uma condição de baixo pH. A cepa AJ 13601 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human •·

Technology da Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, a corporação administrativa independente, Depositário do Organismo de Patentes Internacionais, National Institute of Advanced Industrial Science and

Technology,, Chuo-Dai-6, 1-Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibarakiken, Japão código postal 305-5466) em 18 de agosto de 1999, sob o número de acesso de FERM P-17516, e então, foi convertida em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e recebeu o número de acesso de FERM BP-7207 (fazer referência a EP ··

078 989 A2).

(2) Aquisição de gene arcA de Pantoea ananatis AJ13601

DNA genômico de Pantoea ananatis AJ 13601 foi extraído usando sistema QIAGEN-Genomic-Tip (produzido por QIAGEN). Por PCR usando DNA genômico como gabarito e os seguintes oligonucleotídeos como iniciadores, fragmento de DNA de 759 bp contendo ORF de gene arcA foi obtido. Polimerase de DNA Pyrobest (produzido por Takara Shuzo) foi usado para PCR e PCR foi realizado de acordo com as instruções dos fabricantes. Os iniciadores 17 e 18 foram usados como iniciadores PCR para amplificação. O iniciador 17 foi projetado para conter um sítio EcoRI, e iniciador 18 foi projetado para conter um sítio Sphl, respectivamente.

Iniciador 17: cccgaattccctgtttcgatttagttggc (seqüência complementar aos nucleotídeos números 4980-4999 da seqüência de nucleotídeos de GenBank número de acesso XEÜ0Õ51Õ adicionada* com sTlio EcoRI no término 5’: SEQ ID NO: 17).

Iniciador 18: cccgcatgcgattaatcttccagatcacc (sequência de nucleotídeos números 4245-4264 de GenBank número de acesso AE000510 5 adicionado com sítio Sph\ no término 5': SEQ ID NO: 18).

O fragmento de DNA obtido foi inserido no vetor de clonagem pSTV29 (produzido por Takara Shuzo )na direção dianteira como a direção de transcrição pelo gene lacZ usando sítios EcoRI e Sph\ projetados nos iniciadores para obter pSTV29_EaarcA. A seqüência de nucleotídeos da seqüência clonada é mostrada na SEQ ID NO: 19. A seqüência de aminoácidos deduzida codificada pelo ORF é mostrada em SEQ ID NO: 20.

O ORF obtido mostra cerca de 81,2% de identidade na seqüência de nucleotídeos e cerca de 92,1% na seqüência de aminoácidos do gene arcA de

E. coli. Assim, o ORF é considerado para codificar ArcA de Pantoea ananatis.

(2) Rompimento de gene arcA de Pantoea ananatis

Pantoea ananatis cepa G106S foi usado para construção de cepa rompida em gene arcA de Pantoea ananatis. Dentre os dois plasmídeos, RSFCPG e pSTVCB, abrigados pela cepa AJ13602, a cepa G106S abriga 20 RSFCPG sozinho e é deletado pSTVCB. A cepa rompida em gene arcA foi construída da cepa G106S. Então, pSTVCB foi introduzido para a cepa rompida em gene obtida para obter a cepa rompida em gene arcA de AJ13601. O procedimento será explicado abaixo em detalhes.

(1) Construção de um plasmídeo para transferência 25 conjugativa paro rompimento de gene arcA

Utilização de criação convencional por recombinação em cromossomo com um plasmídeo sensível a temperatura não é simples em um procedimento de recombinação para Pantoea ananatis devido às características de Pantoea ananatis que dificilmente pode crescer a 42 °C.

conjugativa, é necessário construir um plasmídeo que nào origem de replicação (ori) de Pantoea ananatis, isto é, um ········ ·· * · ·· · · · · · · · ·· · • ········ · · ·

Assim, uma técnica de recombinação em um ‘cromossomo ‘usando transferência conjugativa foi usada nesta experiência. Para o método de transferência contém uma plasmídeo que não pode replicar Pantoea ananatis. Assim, a região oriR6K e mobRP4 foi amplificada por PCR usando iniciadores 21 e 22, e um plasmídeo para transferência de Tn5, pUT/miniTn5-Cm (Lorenzo V. et al, Journal of Bacteriology, 172, 6568-(1990), Herrero M. et al, Journal of Bacteriology, 172, 6557 (1990) como um gabarito. Além disso, um fragmento contendo um sítio de múltipla clonagem e gene de resistência a cloranfenicol foi amplificado por PCR usando iniciadores 23 e 24, e pHSG399 como um gabarito. Cada um dos fragmentos amplificados obtido foi digerido com BglII (produzido por Takara Shuzo) e os fragmentos foram ligados com kit de ligação de DNA ver. 2 (produzido por Takara Shuzo).

Então, cepa de E. coli S17-1-Àpir (R. Simon, et al, BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) foi transformada

com a mistura de ligação, e aplicada sobre a placa agar LB contendo 30 pg/ml de cloranfenicol. Após cultura durante um dia a 37 °C, as colônias que apareceram foram cultivadas em meio LB contendo 30 pg/ml de cloranfenicol 20 em tubos de teste a 37 °C. Os plasmídeos foram obtidos de cada um dentre a cultura usando kit de coluna QIAprep Mini Spin (produzido por QIAGEN). Os plasmídeos obtidos foram digeridos com BglII, e um plasmídeo que tinha um sítio de reconhecimento único foi designado como o plasmídeo para transferência conjugativa, pUT399Cm.

Iniciador 21: tcatagatcttttagattgatttatggtgc (SEQ ID NO: 21)

Iniciador 22: ccacagatctaattcccatgtcagccgtta (SEQ ID NO: 22) Iniciador 23: ataaagatctgtgtccctgttgataccggg (SEQ ID NO: 23) Iniciador 24: ggggagatcttgcaaggcgattaagttggg (SEQ ID NO:

24).

Então, um gene de resistência a'canamicina Toi'introduzí dó em pUT399Cm e deletado o gene de resistência a cloranfenicol do plasmídeo de acordo com o seguinte procedimento. O gene de resistência a canamicina foi amplificado por PCR usando iniciadores 25 e 26, e pMW 219 (produzido por Nippon Gene) como um gabarito. Polimerase de DNA Pyrobest (produzido por Takara Shuzo) foi usado para PCR, e PCR foi realizado de acordo com as instruções dos fabricantes. Cada um dos iniciadores 25 e 26 foi adicionado com sítio Bglll no término 5'. O fragmento de DNA obtido e pUT399 foram digeridos com Bglll (produzido por Takara Shuzo) e ligados com kit de clonagem de ligação de DNA ver. 2 (produzido por Takara Shuzo). Então,

cepa de E. coli S17-1-Àpir (R. Simon, et al, BIO/TECHNOLOGY

NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) foi transformada com a mistura de ligação, e aplicada sobre a placa agar LB contendo 25 pg/ml de canamicina (LB + placa de canamicina). Após cultura durante um dia a 37 °C, as colônias que apareceram foram cultivadas em meio LB contendo 25 pg/ml de canamicina em tubos de teste a 37 °C. Os plasmídeos foram obtidos de cada um dentre a cultura usando kit de QIAprep Spin Miniprep (produzido por QIAGEN). Os plasmídeos obtidos foram digeridos com Bglll, e submetidos a eletroforese de gel agarose, e o plasmídeo inserido com o fragmento de 20 marcação foi designado como plasmídeo pUT399CmKm.

Iniciador 25 : cccagatctagttttcgccccgaagaacg (SEQ ID NO: 25)

Iniciador 26: cccagatctccagagtcccgctcagaaga (SEQ ID NO: 26)

Então o gene de resistência a cloranfenicol foi deletado de pUT399CmKm como descrito abaixo. pUT399CmKm foi digerido com 25 /TzndlII (produzido por Takara Shuzo) e foi ligado com kit de ligação de DNA ver. 2 (produzido por Takara Shuzo). Cepa de E. coli S17-1-Àpir (R. Simon, et al, BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) foi transformada com a mistura de ligação, e aplicada sobre a placa agar LB contendo 25 pg/ml de canamicina (LB + placa de canamicina). Após cultura durante um dia a 37 °C, as colônias que’apareceram’foram'culfivádas’em meio LB contendo 25 gg/rnl de canamicina e placa de agar LB contendo 30 pg/ml de cloranfenicol (produzido por Sigma) a 37 °C e uma cepa mostrando sensibilidade para cloranfenicol. A cepa foi cultivada em meio LB contendo 5 25 pg/ml de canamicina durante um dia a 37 °C e plasmídeo foi obtido da cultura usando o kit de coluna QIAprep Spin Miniprep (produzido por QIAGEN). Os plasmídeos obtidos foram designados pUT399km.

Os iniciadores foram preparados com base na seqüência de

nucleotídeos de gene arcA obtidos em (1) acima, e fragmento N-terminal e

fragmento C-terminal de gene arcA foram amplificados usando os iniciadores e pSTV29_EaarcA como um gabarito. Polimerase de DNA Pyrobest (produzido por Takara Shuzo) foi usado para PCR, e PCR foi realizado de acordo com as instruções dos fabricantes. Os iniciadores 27 e 28 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificação de fragmento N15 terminal, e iniciadores 29 e 30 foram usados como os iniciadores para PCR para amplificação de fragmento C-terminal. O iniciador 27 foi designado para conter um sítio EcoRl e o iniciador 30 foi designado para conter um sítio Sphl, respectivamente.

Iniciador 27: cccgaattcgcgaccgatggtgcagagat (SEQ ID NO: 27) φ 20 Iniciador 28: aaggcaaattcatggtgcgc (SEQ ID NO: 28)

Iniciador 29: gcgcaccatgaatttgccttacccaatgaagagcgtcgcc (SEQ

ID NO: 29)

Iniciador 30: cccgcatgcaccttcgccgtgaatggtgg (SEQ ID NO: 30).

Após PCR, os fragmentos de DNA amplificados foram cada purificados por uso de kit de purificação de PCR QIAquick (produzido por QIAGEN). O fragmento de DNA N-terminal e fragmento de DNA C-terminal purificados, iniciadores 27 e 30 foram usados para o processo PCR de permutação. (A. J. Link, D. Phillips, G.M. Church, Joumal of Bacteriology, ·· • · ·······

179, 6228-6237 (1997)) para obter um fragmento arcA rompido.*

O fragmento de DNA purificado foi digerido com EcoRI e Sphl (produzido por Takara Shuzo ) e submetido a tratamento com fenol/

clorofórmio e precipitação com etanol. Este fragmento foi ligado com um plasmídeo pUT399Km também digerido com EcoRI e Sphl por uso de kit de ligação de DNA ver. 2 (produzido por Takara Shuzo). Cepa de E. coli SI7-1Epir (R. Simon, et al, BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) foi transformada com a mistura de ligação, e aplicada sobre a placa agar LB contendo 25 pg/ml de canamicina. Após cultura durante um dia a

37°C, as colônias que apareceram foram cultivadas em meio LB contendo 25 pg/ml de canamicina em tubos de teste a 37 °C. O plasmídeo foi obtido de cada um dentre a cultura usando kit de coluna QIAprep Spin Miniprep (produzido por QIAGEN). Os plasmídeos obtidos foram digeridos com EcoRI e Sphl, e submetidos a eletroforese de gel agarose. O plasmídeo inserido com o fragmento de marcação foi designado como plasmídeo pUT399Km_AarcA paro rompimento de arcA.

(2) Rompimento de gene arcA de Pantoea ananatis por transferência conjugativa

O rompimento de genes usando método de recombinação φ 20 homóloga com o pUT399Km_ÁarcA acima mencionado. A cepa G106S foi usada como uma cepa doadora de plasmídeo. A triagem foi realizada com um meio compreendendo 5 g/L de glucose (produzido por Junsei Kagaku), 5 g/L de extrato de levedura (produzido por Difco), 10 g/L de triptona-peptona (Difco), 10 g/L de NaCI (Junsei Kagaku), 6 g/L de Na₂HPO₄. 3 g/L de 25 KH₂PO₄, 1 g/L de NH₄C1, e 1,5 g/L de CaCl₂. 2H₂O (a seguir referido coo meio “LBG-M9”) adicionado com e contendo 25 pg/mL de tetraciclina, 25 pg/ml de canamicina e agar (a seguir referido como placa “LBGM9+Tet+Km”). No meio de agar, a cepa G106S em que pUT399Km_AarcA foi incorporado em seu cromossomo, pode ser selecionada como uma cepa de • ··· · · · ··· · • ······· ··· • · · · ·· · · • ···· ·· · ······ · · · recombinação única, isto é, cepa rompida êm gene ‘arcA, pbrqüê b’J>lãsrrfítfeo derivado de pUT399 não pode replicar em Pantoea ananatis como descrito acima. Cepa de E. coli S17-1-Xpir (R. Simon, et al, BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)) foi transformada com pUT399Km_AarcA, e aplicada sobre a placa agar LB contendo 25 pg/ml de canamicina. Após cultura, o transformante obtido, SI 7-1 Àpir/pUT399Km_ÁarcA de E. coli, foi cultivado em meio LBG-M9 contendo 25 pg/ml de tetraciclina durante um dia a 37 °C. Além disso, a cepa G106S

foi cultivada em meio LBG-M9 contendo 25 pg/ml de tetraciclina durante um

dia a 34 °C. Cada meio de cultura foi centrifugado e as células obtidas foram colocadas em suspensão em 50 pl de meio LB, respectivamente. 25 pl de cada suspensão foram misturados e cultivados em meio de agar LBG-M9 durante uma hora a temperatura ambiente. Subseqüentemente, a cultura foi continuada durante 3 h a 34 °C para causar transferência conjugativa. Então, as células cultivadas diluídas a uma concentração de 10’ , 10' ou 10' foram aplicadas a placa LBG+M9+Tet+Km e cepas resistentes a tetraciclina e canamicina foram selecionadas. PCR de colônia foi realizado para algumas cepas dentre as cepas selecionadas para confirmar deleção de gene arcA. Assim, a cepa rompida em arcA, derivada de G106S, 6106SAarcA, foi obtida, φ 20 (3) Introdução de pSTVCB em 6106SAarcA e produção de ácido L-glutâmico

A cepa 6106SAarcA foi transformada com pSTVCB. O transformante obtido 6106SAarcA/ pSTVCB é equivalente a cepa rompida em gene arcA de AJ13601 acima mencionado (AJ13601AarcA). A cepa 25 6106SAarcA/ pSTVCB e a cepa AJ 13601 como um controle foram cultivadas e suas quantidades de produção de ácido L-glutâmico foram medidas, respectivamente. O meio, métodos de cultura e método de análise para medição são mostrados abaixo.

.

[Meio de avaliação para ácido T-glútârfiico’} ’ * · · ......

	Concentração final
Glucose	30g/L (esterilizado separado)
MgSO4.7H₂O	0,5 g/1 (esterilizado separado)
(NH4)₂SO₄	20 g/1
kh₂po₄	30 mM
Extrato de levedura	2 g/L
FeSO₄	0,02 g/L
MnSO₄	0,02 g/L
1ή,ΐϊ^χη£χ	0,2 g/L
Metionina	0,2 g/L
Diamino pimelato	0,2 g/L
PH 7 0 ^·Κ1ΟΙ I)
CaCO₃	30 g/L (esterilizado separado)

[Métodos de cultura]

Cultura de semente em tubo de teste:

As bactérias de carga foram inoculadas.

Meio agar LBG-M9 (droga foi adicionada como requerido), 34°C, 24 h.

Cultura principal:

Três laços de platina de cultura de semente foram inoculados.

Meio de base (droga foi adicionada como requerido) 34 °C, 24 horas.

ml por tubo de teste.

[Método de análise]

O caldo de cultura foi amostrado em um volume de 400 μΐ em um curso de tempo, e concentração de sacarose e acúmulo de ácido Lglutâmico no caldo de cultura foram medidos. A concentração de sacarose e concentração de ácido L-glutâmico foram medidos para sobrenadante do caldo de cultura obtido após centrifugaçâo**á 15.000 q>m’Uüfânte 5’fnin diluído em uma concentração apropriada com água por uso de analisador Biotech (Sakura Seiki). O acúmulo de ácido L-glutâmico e rendimento no ponto onde o sacarídeo foi depletado são mostrados na tabela 2.

Tabela 2-Acúmulo de ácido L-glutâmico e rendimentos de cepa rompida em gene em arcA

Cepa	Acúmulo de ácido L- glutâmico (g/L)	Rendimento ácido L-glutâmico (%)
G106(AJ13601)	16,3	50,8
G1 OÓAarc A( A J13601 Aarc A	17,4	54,3

Como resultado, foi reconhecido que tanto o acúmulo como o rendimento de ácido L-glutâmico foram melhorados na cepa rompida em gene arcA comparada com a cepa de controle.

Exemplo 5 -Efeito de rompimento de arcA em produção de L-arginina em cepa de E. coli

No exemplo acima 2, foi reconhecido que tanto o acúmulo como o rendimento de ácido L-glutâmico foram melhorados na cepa rompida em gene sucA e arcA comparada com a cepa de controle, cepa rompida em sucA.

Então, o efeito sobre a produção de L-arginina que é produzida rvl ί 14·Α « zx Λ azxw/x mw» zxx xl«xz>4-**zx4-zx z4zx ET Tirirtzlr* uballuLV aUuu giuudliliw ννΙΠΟ Um duOôiiaiu. VzUpa / Uv u. uuu íui üôdua como uma cepa produtora de L-arginina. A cepa 237 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganismis (VKPM) em 10 de abril de 2000, sob o número de acesso VKPM B-7925, e então, o depósito foi convertido em depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

(1) Construção de cepa rompida em gene arcA de cepa 237 de

E. coli

Um gene arcA da cepa 237 foi rompida para preparar uma cepa rompida em gene arcA, 237AarcA do’ mesmo modo que nó exemplo* T.

(2) Produção de L-arginina

Para avaliar um efeito de rompimento de gene arcA em fermentação de L-arginina, cepa rompida em gene arcA de 237, 237AarcA, e 5 a cepa 237 como um controle foram cultivados e suas quantidades de produção de L-arginina foram medidas. O meio, métodos de cultura e método de análise para a medição são mostrados abaixo.

[Meio de avaliação para L-arginina]

Concentração final

Glucose

MgSO₄.7H₂O (NH₄)₂SO₄

KH₂PO₄

Extrato de levedura

Tiamina

CaCO₃ g/L (esterilizado separado) g/L (esterilizado separado) g/L g/L g/L

0,1 mg/L

25g/L (esterilizado separado) [Métodos de cultura] φ 20

h.

Cultura de semente em tubo de teste:

Bactérias de carga foram inoculadas.

Meio agar LB (droga foi adicionada como requerido), 32 °C,

Cultura principal:

Um laço de platina de cultura de semente foi inoculado.

Meio de avaliação para arginina (droga foi adicionada como requerido), 32 °C, 3 dias.

ml por tubo de teste.

[Método de análise]

O caldo de cultura foi amostrado em um volume de 500 μΐ em ♦ · ··· · ··· · · » ··· · um curso no tempo, e concentração • ········ · * · de glucose e acúmulo dê‘L‘-arginmâ‘em

caldo de cultura foram medidos. A concentração de glucose e a concentração

de L-arginina foram medidas para sobrenadante do caldo de cultura obtido após centrifugação a 15.000 rpm durante 5 min diluído em uma concentração apropriada com água por uso de analisador biotech (Sakura Seiki) e analisador de aminoácidos L-8500 (HITACHI Keisokuki service). O acúmulo de L-arginina e rendimento no ponto onde o sacarídeo foi depletado são mostrados na tabela 3.

Tabela 3 -Acúmulo de L-arginina e rendimento de cepa rompida em arcA

Cepa	Acúmulo de L-arginina (g/L)	Rendimento de L-arginina (%)
237	4,04	6,73
2376AarcA	14,8	24,7

Reconhece-se que tanto o acúmulo como o rendimento de Larginina foram melhorados na cepa rompida em gene arcA comparada com a cepa de controle.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma substância alvo sintetizada via o ciclo TCA, selecionada a partir do grupo consistido em L-lisina, L-arginina e ácido L-glutâmico, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma γ5 proteobactéria em um meio sob uma condição aeróbica para produzir e acumular a substância alvo no meio ou células e coletar a substância alvo do meio ou células, em que a dita γ-proteobactéria tem uma capacidade para produzir a referida substância alvo, e foi modificada pelo rompimento de um gene arcA, compreendendo a sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 10 número 101 a 817 de SEQ ID NO:31 ou dos nucleotídeos número 41 a 757 de SEQ ID NO:19 em um cromossomo, em que a dita γ-proteobactéria é Escherichia coli ou Pantoea ananatis.