BRPI0207933B1 - polipeptídeo mutante de interleucina-18 e composição farmacêutica - Google Patents
polipeptídeo mutante de interleucina-18 e composição farmacêutica Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0207933B1 BRPI0207933B1 BRPI0207933-0A BRPI0207933A BRPI0207933B1 BR PI0207933 B1 BRPI0207933 B1 BR PI0207933B1 BR PI0207933 A BRPI0207933 A BR PI0207933A BR PI0207933 B1 BRPI0207933 B1 BR PI0207933B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- cells
- ifn
- mutant
- fact
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 title claims abstract description 152
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 title claims abstract description 151
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 6
- 102000044166 interleukin-18 binding protein Human genes 0.000 claims description 47
- 108010070145 interleukin-18 binding protein Proteins 0.000 claims description 47
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 102100035017 Interleukin-18-binding protein Human genes 0.000 abstract description 2
- 101710205006 Interleukin-18-binding protein Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 38
- 102220553782 APC membrane recruitment protein 1_K89A_mutation Human genes 0.000 description 37
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 34
- 102220554136 APC membrane recruitment protein 1_E42A_mutation Human genes 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 24
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 17
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 description 9
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 description 9
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 102000043959 human IL18 Human genes 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 6
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 6
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100038980 Exosome complex component CSL4 Human genes 0.000 description 2
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 206010050513 Metastatic renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 101800001476 Viral genome-linked protein Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 102000026898 cytokine binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008470 cytokine binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 101800000605 p13 Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 102000019506 tumor necrosis factor binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091016215 tumor necrosis factor binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 208000006586 Ectromelia Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001076418 Homo sapiens Interleukin-1 receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001019591 Homo sapiens Interleukin-18-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- -1 IFN- / Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100026016 Interleukin-1 receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 206010024503 Limb reduction defect Diseases 0.000 description 1
- 102000007557 Melanoma-Specific Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010071463 Melanoma-Specific Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000947 anti-immunosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000036624 brainpower Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003547 hepatic macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000031037 interleukin-18 production Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102200093155 rs104894030 Human genes 0.000 description 1
- 102200157658 rs1555229948 Human genes 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
MUTANTES DE INTERLEUCINA-18, SUA PRODUÇÃO E USO. A invenção refere-se a mutantes de IL-18 com afinidade menor com IL-18BP do que a molécula de IL-18 do tipo selvagem.
Description
[001] A presente invenção refere-se a mutantes de IL-18 tendo atividade biológica maior com relação à proteína do tipo selvagem.
[002] Em 1989, uma atividade de soro induzida por endotoxina que induzia interferon-γ (IFN-γ) obtido de células de baço de camundongo foi descrita (Nakamura e outros, 1989). Esta atividade do soro funcionou não como um indutor direto de IFN-γ mas pelo contrário como um co-estimulante junto com IL-2, IFN-/, TNF ou mitógenos. Uma tentativa de purificar a atividade do soro de camundongo pós-endotoxina revelou uma proteína de 50-55 kDa aparentemente homogênea (Nakamura e outros, 1993). Uma vez que outras citocinas podem agir como co-estimulantes para produção de IFN-γ, a falha em neutralizar anticorpos para IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 ou TNF para neutralizar a atividade do soro sugeriu que ela era um fator diferente. Em 1995, os mesmos cientistas demonstraram que o co-estimulante induzido por endotoxina para produção de IFN-γ estava presente em extratos de fígados de camundongos pré-condicionados com P. acnes (Okamura e outros, 1995). Neste modelo, a população de macrófago hepática (células Kupffer) expandiu e nesses camundongos, uma baixa dose de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), que em camundongos não pré-condicionados não é letal, se torna letal. O fator, chamado fator de indução de IFN-γ (IGIF) e mais tarde chamado Interleucina-18 (IL-18), foi purificado para homogeneidade a partir de 1.200 gramas de fígados de camundongo tratado com P. acnes. Oligonucleotídeos de degeneração derivados de seqüências de aminoácido de IL-18 purificada foram usados para clonar um cDNA de IL-18 de murino (Okamura e outros, 1995). RNAs mensageiros para IL-18 e Interleucina-12 (IL-12) são imediatamente detectados em macrófagos ativados. IL-18 não induz IFN-γ por si só, mas funciona principalmente como um co-estimulante com mitógenos ou IL-12. A seqüência de cDNA humano para IL-18 foi descrita em 1996 (Figura 1A SEQ ID NO:1).
[003] A Interleucina IL-18 compartilha características estruturais com a família de proteínas IL-1 (Nakamura e outros, 1993; Okamura e outros, 1995; Ushio e outros, 1996; Bazan e outros, 1996). Diferente da maior parte das citocinas, que exibem uma estrutura de feixe de quatro hélices, IL-18 e IL-1 β têm uma estrutura em folha pregueada β (Tsutsui e outros, 1996). Similarmente à IL-1 β, IL-18 é sintetizada como um precursor biologicamente inativo (pró IL-18), não tendo um peptídeo de sinal (Ushio e outros, 1996). Os precursores de IL-1 β e IL-18 são clivados por caspase 1 (enzima de conversão de IL-1 β ou ICE), que cliva os precursores após um resíduo de ácido aspártico na posição P1. As citocinas maduras resultantes são imediatamente liberadas da célula (Ghayur e outros, 1997 e Gu e outros, 1997).
[004] IL-18 é um co-estimulante para produção de citocina (IFN-γ, IL-2 e fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago) pelas células do tipo I (Th1) auxiliares de T (Kohnoet e outros, 1997) e também um co-estimulante para citotoxidez mediada por ligante FAS de clones de célula assassina natural de murino (Tsutsui e outros, 1996).
[005] Linfócitos de Th1 estão envolvidos nas respostas imune contra tumores (Seki e outros, 2000). As respostas de Th1 incluem a secreção das citocinas IL-2, IL-12, IL-18 e IFN-γ, bem como a geração de linfócitos T citotóxicos específicos reconhecendo antígenos de tumor específicos. A resposta de Th1 é também uma arma vital de defesa do hospedeiro contra muitos microorganismos. No entanto, a resposta de Th1 pode também estar associada a efeitos não-desejáveis tal como o desenvolvimento de várias doenças autoimunes, inflamação e rejeição de transplante de órgão.
[006] Tentativas de expressar a forma madura de IL-18 em E. coli usando um vetor codificando a proteína madura não proveu uma citocina completamente ativa. Um sistema de expressão eficiente para a geração da IL-18 humana completamente biologicamente ativa foi desenvolvido para usos terapêuticos, por exemplo, em males, ou qualquer condição onde a indução de IFN-γ for desejada (WO 00/61768). Nesse sistema, o sítio de clivagem de caspase-1 de precursor de IL-18 foi mudado para um sítio de fator Xa (ICE-Xa), e um vetor codificando o precursor de IL-18 ICE/Xa foi usado para transformação de E. coli. Seguindo a expressão deste precursor de IL-18 em E. coli, a IL-18 madura foi gerada pela clivagem de um fator Xa in vitro. Esta IL-18 madura gerada pela clivagem do fator Xa era completamente ativa.
[007] Proteínas de ligação de citocina (receptores de citocina solúveis) são geralmente os domínios de ligação de ligante extracelular dos seus respectivos receptores de citocina de superfície celular. Elas são produzidas ou através de união alternativa ou através de clivagem proteolítica do receptor de superfície celular. Esses receptores solúveis foram descritos no passado, por exemplo, os receptores solúveis de IL-6 e IFN-γ (Novick e outros, 1989), TNF (Engelmann e outros, 1989; Engelmann e outros, 1990), IL-1 e IL-4 (Maliszewski e outros, 1990), IFN-α/β (Novick e outros, 1994; Novick e outros, 1992). Uma proteína de ligação de citocina, chamada osteoprotegerina (OPG, também conhecida como fator de inibição de osteoclasto-OCIF), um membro da família TNFR/Fas, parece ser o primeiro exemplo de um receptor solúvel que existe apenas como uma proteína secretada (Anderson e outros, 1997; Simonet e outros, 1997; Yasuda e outros, 1998).
[008] Uma proteína de ligação de IL-18 (IL-18BP) foi purificada com afinidade, em uma coluna de IL-18, a partir de urina (Novick e outros, 1999). A IL-18BP abole a indução pela IL-18 de IFN-γ e de IL-8, ativação de NF-kB in vitro e indução de IFN- in vivo. IL-18BP é uma proteína de circulação solúvel que é constitutivamente expressa no baço, e pertence à superfamília da imunoglobulina. A isoforma de IL-18BP mais abundante, a isoforma variante unida a, exibe uma alta afinidade para IL-18 com uma taxa de início rápida e uma taxa de término lenta, e uma constante de dissociação (Kd) de aproximadamente 400 pM (Kim e outros, 1999).
[009] Os resíduos envolvidos na interação de IL-18 com IL-18BP foram descritos através do uso de modelagem por computador (Kim e outros, 1999) e baseados na interação de IL-1 com o tipo I de IL1R (Vigers e outros, 1997). No modelo para ligação de IL-18 à IL-18BP, o resíduo Glu na posição 42 e o resíduo Lys na posição 89 de IL-18 foram propostos se ligarem a Lys-130 e Glu-114 em IL-18P, respectivamente (Kim e outros).
[0010] IL-18 está constitutivamente presente em muitas células (Puren e outros) e circula em humanos saudáveis (Urushihara e outros, 2000). A alta afinidade de IL-1BP para IL-18 bem como a alta concentração de IL-18BP encontrada na circulação (excesso molar de 20 vezes sobre a IL-18) representa uma situação única na biologia da citocina. Desse modo, a maior parte, se não todas, das moléculas de IL-18 na circulação é ligada à IL-18BP. A IL-18BP em circulação que compete com os receptores de superfície celular quanto à IL-18 pode agir como um antiinflamatório natural e uma molécula imunossupressiva.
[0011] Agentes virais codificam IL-18B como proteínas, por exemplo, proteínas virais MC53 e MC54 de M. contagiosum compartilham uma homologia significante com IL-18BP de mamífero (Novick e outros, 1999). Proteínas MC53 e MC54 de M. contagiosum possuem a habilidade de ligar e neutralizar IL-18 humana de uma maneira similar àquela de IL-18B (Xiang e Moss, 1999). A proteína p13 de poxvirus ectromelia, que é homóloga à IL-18BP, liga IL-18 humana e inibe sua atividade in vitro. Camundongos infectados com um vírus mutante de deleção de p13 exibem níveis menores de infectividade (Borne e outros, 2000). Desse modo, o grau de infectividade parece se relacionar com a presença de IL-18BP.
[0012] Os altos níveis de circulação de IL-18BP podem representar uma defesa natural contra uma resposta de Th1 fora de controle à infecção e desenvolvimento de doenças auto-imunes. No entanto, a IL-18 contribui para a resposta de Th1 que é importante na defesa do hospedeiro contra tumores. Desse modo, a IL-18BP pode causar falha do hospedeiro em desenvolver células T citotóxicas direcionadas contra células de tumor. Na verdade, há evidência de que a IL-18 promove defesa do hospedeiro contra tumores em camundongos. Por exemplo, em camundongos singenêicos, células de carcinoma de mama de murino expressando IL-12 de murino ou IL-18 de murino eram menos tumorigênicas e formaram tumores mais lentamente do que as células de não-expressão de controle (Coughlin e outros, 1998). Estudos de neutralização de anticorpo revelaram que os efeitos antitumor necessitaram de IFN-γ. Em um outro estudo, administração sistêmica de IL-18 a animais experimentais em combinação com melanoma B16 expressando B7-1 (CD80) resultou em supressão drástica de formação de melanoma, crescimento de tumor e uma melhora significante na sobrevivência (Cho e outros, 2000).
[0013] Citocinas são usadas como adjuvante para aumentar a eficácia da imunoterapia em câncer. Por exemplo, a IL-2 é administrada para carcinoma ou melanoma de célula renal (Gollob e outros, 2000). Muitas vezes, uma conseqüência importante do tratamento com citocinas são perfis de toxidez sistêmica grave. Uso de citocinas, expressas pelo próprio tumor do paciente ou células dendríticas, é uma solução lógica para o problema. Ainda, se IL-18 tiver que ser usada localmente, como adjuvante na imunoterapia de tumor, a habilidade dos níveis constitutivos de IL-18BP para neutralizar IL-18 no ambiente local seria ainda exercida e conseqüentemente sua eficácia seria diminuída bastante.
[0014] O uso de transplantes alogeneicos não-mieloablativos, os chamados minitransplantes, para tratar leucemia e tumores sólidos é muito útil na indução de reações de leucemia-versus-enxerto e de tumor-versus-enxerto (Slavin S., 2000; Slavin e outros, 2000). Dois estudos que usaram ou células tronco periféricas alogeneicas (Childs e outros, 2000) ou células dendríticas (Kugler e outros, 2000) para tratar pacientes com carcinoma de célula renal metastático encontraram um sucesso notável. Embora esses estudos precisem ser estendidos e confirmados, o conceito de que uma reação tumor-versus-enxerto que está acontecendo pode ser explorado para imunoterapia em câncer está ganhando aceitação (Slavin, 2000). Uma vez que a IL-18 parece estar envolvida nessas abordagens terapêuticas bem-sucedidas, um aperfeiçoamento adicional pode ser conseguido se o efeito de neutralização da IL-18BP puder ser abolido.
[0015] Mutantes de IL-18 (IFN-γ, fator de indução) são descritos na EP0845530. Os mutantes de IL-18 descritos são moléculas onde 1, 2, 3 ou todos os 4 resíduos de cisteína na IL-18 (Figura 1B) foram substituídos por resíduos serina ou alanina. Esses mutantes contidos em uma seqüência de consenso intacta (Figura 1B). Todos os mutantes isolados exibiram maior estabilidade do que a IL-18 do tipo selvagem. O grau de estabilidade dos mutantes é diretamente proporcional ao número de resíduos Cys substituídos na molécula. A EP0845530 é silenciosa quanto à habilidade da IL-18BP em neutralizar esses mutantes.
[0016] A geração e uso terapêutico de mutantes de IL-18 completamente ativos incapazes de se ligar ou se ligam com baixa afinidade à IL-18BP, é desse modo altamente vantajosa.
[0017] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo mutante de IL-18 compreendendo mutações em um ou mais resíduos de aminoácido que estão envolvidos em sua interação com a proteína de ligação IL-18. Mais especificamente, as mutações são substituições, de preferência adições ou deleções, não-conservativas. Os resíduos mutados no dito polipeptídeo podem ser selecionados de Glu-42, lle-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149 e Leu-189, de preferência, Glu-42 e Lys-89.
[0018] Em uma modalidade, o Glu-42 ou Lys-89 ou ambos Glu-42 e Lys-89 são substituídos com um aminoácido não-polar, de preferência alanina.
[0019] Em adição, a invenção provê um DNA codificando o dito polipeptídeo, de preferência codificando um polipeptídeo da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8.
[0020] Em uma modalidade, o DNA codificando a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8 é fundido a um peptídeo de sinal, de preferência aquele de hGH. No entanto, a invenção também provê um vetor compreendendo o dito DNA capaz de expressar o polipeptídeo codificado pelo dito DNA em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica.
[0021] Em adição, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo o dito polipeptídeo para o tratamento de doenças que são prevenidas ou aliviadas pelas respostas de Th1, de preferência para o tratamento de doença viral ou câncer.
[0022] A Figura 1A mostra a seqüência de nucleotídeo codificando o precursor de IL-18 WT e a localização dos iniciadores usados para construir as proteínas IL-18 mutadas diferentes. A seta grande indica onde a seqüência de codificação da proteína IL-18 começa.
[0023] A Figura 1B mostra a seqüência de aminoácido da IL-18 madura. A seqüência consenso dentre diferentes espécies de IL-18 está dentro das caixas brancas. As cistidinas estão sublinhadas. As caixas escuras mostram os resíduos mutados em IL-18 de acordo com esta invenção.
[0024] A Figura 2 mostra a representação esquemática dos mutantes de IL-18 de acordo com a invenção. A His-6 indica a localização das seis histidinas fundidas no terminal N da pró-peça do precursor de IL-18. A seta indica o sítio de clivagem de ICE conforme substituído pelo sítio de clivagem do fator Xa (x). WT indica a IL-18 madura do tipo selvagem. E42A indica Glu-42 para mutação Ala, K89A indica Lys-89 para mutação Ala e E42A/K89A indica mutação dupla. Com base no precursor /x/WT, três mutantes de IL-18 (E42A, K89A e E42A+K89A) foram gerados pelas duas etapas de PCR.
[0025] A Figura 3A mostra a indução de IFN- em células NKO pela IL-18 WT e proteína mutante em concentrações mostradas sob o eixo x na Figura 3B na presença de IL-12 (0,5 ng/ml).
[0026] A Figura 3B mostra a indução de IFN- em células PBMCs pela IL-18 WT e proteína mutante em concentrações mostradas sob o eixo x e na presença de IL-12 (1,0 ng/ml).
[0027] A Figura 4A mostra o efeito de IL-18BP em indução de IFN-por IL-18 WT humana e proteína mutante em células NKO. Mutante e IL-18 WT (30 ng/ml) foram pré-incubadas com IL-18BP nas concentrações indicadas sob o eixo x (da Figura 3B) por 1 hora em temperatura ambiente e adicionadas a células NKO estimuladas com IL-12 (0,5 mg/ml).
[0028] A Figura 4B mostra o efeito de IL-18BP em indução de IFN-por IL 18 WT humana e proteína mutante em células PBMCs. Mutante e IL-18 WT (30 ng/ml) foram pré-incubadas com IL-18BP nas concentrações indicadas sob o eixo x por 1 hora em temperatura ambiente e adicionadas a células PBMCs estimuladas com IL-12 (1,0 mg/ml).
[0029] A Figura 5 mostra a indução de IL-8 por IL-18 WT e proteína mutante. PBMCs foram incubadas com IL-18 WT ou mutante (30 ng/ml). Polimixina Β (1 g/ml) foi misturada com IL-18 por 30 minutos antes de ser adicionada às PBMCs. Após 24 horas os sobrenadantes foram removidos e avaliados quanto à concentração de IL-18 por ECL (exemplo 9). Um de três experimentos é mostrado.
[0030] A presente invenção refere-se a um mutante de IL-18 ou seu fragmento ativo, ou uma muteína, ou qualquer outra proteína ou seu derivado de peptídeo (IL-18M), que é menos suscetível à neutralização pela IL18BP conforme comparado com o tipo selvagem (IL-18 WT). Mais especificamente, um ou mais aminoácidos da IL-18 WT, de preferência não mais de 30, com mais preferência até 10 aminoácidos, podem ser substituídos com outros aminoácidos, ou eliminados, ou um ou mais aminoácidos podem ser adicionados, de preferência não mais de 30, com mais preferência até 10 aminoácidos a fim de gerar um mutante de IL-18 ativo que é menos suscetível à neutralização por IL-18BP. Aminoácidos podem ser substituídos por aminoácidos diferentes, as substituições de preferência sendo substituintes não-conservativas. Mais especificamente, as ditas mutações poderiam ser objetivo para resíduos previstos estar envolvidos na ligação à IL-18BP tal como Glu-42, lle-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149 e Leu-189, com mais preferência Glu-42 e/ou Lys-89 (Kim e outros, 1999).
[0031] IL-18M pode ser produzida em eucariotas ou sistemas de expressão eucariótica, intracelularmente, periplásmica ou podem ser secretadas no meio. A IL-18M pode ser recuperada na forma solúvel ou insolúvel (corpos de inclusão).
[0032] Um vetor compreendendo o cDNA de IL-18M precursora pode ser usado para expressão de IL-18M precursora de montagem correta em sistemas procarióticos. Subseqüentemente, a proteína completamente ativa madura pode ser gerada após clivagem por ICE in vitro. Uma seqüência codificando o sítio de clivagem específico para uma protease, de preferência fator Xa, pode substituir a seqüência ICE no precursor de IL-18M.
[0033] Um vetor de expressão codificando um peptídeo de sinal eficaz, de preferência o peptídeo de sinal de hormônio do crescimento humano, fundido ao cDNA da IL-18M madura pode ser usado para expressão e secreção eucariótica.
[0034] O cDNA de IL-18 de origem usado para a construção do mutante pode ser selecionado de espécies de camundongo ou humana.
[0035] A IL-18M pode ser marcada com epítopo, de preferência com histidina, para purificação conveniente. A IL-18M recombinante pode ser purificada através de métodos convencionais ou de afinidade. A quantidade de IL-18M produzida pode ser monitorada por um ELISA específico.
[0036] A IL-18M pode ser usada em uma formulação farmacêutica para o tratamento de doenças que são prevenidas ou reduzidas por respostas Th1, mais especificamente através de tratamento de IL-18, por exemplo, infecções por microorganismo e câncer. A vantagem de usar o mutante ao invés da versão do tipo selvagem da proteína reside em sua resistência à neutralização de IL-18BP.
[0037] Mais especificamente, IL-18M pode ser administrada sistemicamente ou localmente como um adjuvante para antígenos de tumor em imunoterapia de tumor.
[0038] Células de tumor derivadas de um paciente podem ser isoladas e geneticamente modificadas para secretar IL-18M e reenxertadas no mesmo paciente para vacinação local (Coughlin e outros, 1998). Fusão das células de tumor modificadas expressando IL-18M a células dendríticas alogeneicas (células apresentando antígeno) pode ser realizada para aumentar mais a antigeneicidade do tumor e conseqüentemente, a resposta antitumor.
[0039] A IL-18M pode ser administrada como um adjuvante em vacinação de DNA (Tuting e outros, 1989). De maneira similar àquela descrita para o uso de citocinas IL-12 e IFN-. Nesse caso, vacinação de antígeno de tumor transdérmica pode ser realizada usando uma pistola de gene. Isso pode resultar em transfecção de células dendríticas residentes na pele com DNA codificando ambos antígeno de tumor e IL-18M. Alternativamente, as células dendríticas podem ser construídas ex vivo seguido por uma transferência de adoção.
[0040] A IL-18M pode ser usada como um adjuvante em terapia de tumor versus enxerto. Células tronco alogeneicas podem ser usadas para transplantes de pacientes com câncer. Para aumentar a rejeição de tumor versus enxerto induzida por transplante das células alogeneicas, IL-18M pode ser administrada sistemicamente ou localmente, de preferência através de expressão de IL-18M em células dendríticas singeneicas geneticamente modificadas ou em células de tumor tomadas do paciente.
[0041] Deve ser entendido que embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as suas modalidades específicas preferidas, a descrição acima bem como os exemplos que seguem são pretendidos ilustrar e não limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo da invenção ficarão aparentes àqueles versados na técnica à qual a invenção pertence.
[0042] A fim de gerar a montagem correta de IL-18 em E. coli, o sítio de clivagem de ICE no precursor de IL-18 foi substituído por um sítio de clivagem Xa. Subseqüentemente, clivagem in vitro do precursor de IL-18 por Xa gera então a proteína ativa (WO 00/61768).
[0043] A seqüência de cDNA codificando o precursor de IL-18 humana (pró IL-18, número de acesso no banco de gene D49950, Figura 1) usada para geração do plasmídeo de expressão foi isolada conforme descrito (Ghayur e outros, 1997).
[0044] A substituição do sítio de clivagem de ICE com um sítio de clivagem de Xa foi conseguida usando 2 reações PCR (vide os iniciadores usados na Figura 1). Reação PCR 1: A pró-peça de cDNA de IL-18 foi gerada usando o iniciador de sentido (Pr 1) contendo o sítio EcoRI localizado a montante do ORF, 5’-ATATGAATTCATGGCTGCTGAACCAGTAG, (SEQ ID NO:11) e um iniciador reverso (Pr 2) designado para o sítio de ICE (33-LESD-36) onde 6 nucleotídeos foram mudados para codificar o sítio do fator Xa (33-IEGR-36), 5’-AAAGTAACGTCCTTCGATGTTTTC (SEQ ID NO: 12). O fragmento de DNA amplificado codificando a IL-18 madura foi gerado usando o iniciador de sentido (Pr 3) que é complementar a Pr 2,
[0045] 5’-GAAAACATCGAAGGACGTTACTTT, (SEQ ID NO: 13) e iniciador reverso (Pr 4) contendo o sítio BamHI a jusante da seqüência de codificação de IL 18 5’- AΤATGG ATCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG (SEQ ID NO: 14). A pró-peça de 108 pb e DNAs de IL-18 de 474 pb maduros foram analisados em eletroforese em 1% de agarose e eluídos por um sistema de extração de gel (GIBCO/BRL).
[0046] Reação PCR 2: Os dois fragmentos de DNA obtidos na reação PCR 1 foram misturados em uma razão 1:1 e usados juntos com os iniciadores Pr1 e Pr4 para gerar um cDNA de IL-18 humano completo onde o sítio ICE é substituído pelo sítio do fator Xa (ICE/Xa).
[0047] O cDNA pró IL-18 (ICE/Xa) era ligado ao plasmídeo BlueScript (Stratagene) pelos sítios de restrição EcoRI e BamHI (GIBCO/BRL). Este plasmídeo serviu para confirmação da seqüência. A seqüência de aminoácido prevista codificada é mostrada na SEQ ID NO:2. Para expressão de E. coli, a inserção de DNA de IL-18 foi religada no vetor pROEX HTa (GIBCO/BRL) com o uso de sítios EcoRI e Xbal (originando em BlueScript). Neste vetor, a proteína resultante é N-terminal fundida a uma lacuna de histidina.
[0048] As mutações em IL-18 foram criadas em resíduos previstos como sendo importantes para a ligação à IL-18BP inibidora (Kim e outros, 2000). Três mutantes: E42A, K89A e F-42A/K89A foram gerados. As mutações foram conseguidas através de duas reações PCR, conforme descrito no Exemplo 1, usando os iniciadores e moldes descritos abaixo (os iniciadores são mostrados na Figura 2).
[0049] Reação PCR 1- Os pares de iniciadores usados para preparação da E42A mutante foram:
[0050] par A - Pr 1 (Exemplo 1) e o iniciador reverso (Pr 5) 5’-TAA TTT AGA TGC AAG CTT GCC (SEQ ID NO:15) codificando alanina ao invés de ácido glutâmico (E 42),
[0051] e par Β - o iniciador de sentido (Pr 6) 5’-GGC AAG CTT GCA TCT AAA TTA (SEQ ID NO: 16) codificando Alanina ao invés do ácido Glutâmico (GAA a GCA) e o iniciador reverso Pr 4 (Exemplo 1), usando pró IL-18 (ICE/Xa) como um molde na reação de PCR.
[0052] Reação de PCR 2: Os dois fragmentos de DNA obtidos nas reações de PCR 1 foram usados como moldes para a segunda reação de PCR usando os iniciadores Pr 1 e Pr 4.
[0053] Reação PCR 1: O par de iniciadores usado para preparação do K89A mutante foi o par A Pr 1 (Exemplo 1) e o iniciador reverso (Pr 7) 5’-CTG GCT ATC TGC ATA CAT ACT (SEQ ID NO: 17) codificando alanina ao invés de lisina (K 89), e par Β o iniciador de sentido (Pr 8) 5’-AGT ATG TAT GCA GAT AGC CAG (SEQ ID NO: 18) codificando alanina ao invés de lisina (AAA a GCA) com o iniciador reverso Pr 4 (Exemplo 1) usando pró IL-18 (ICE/Xa) como o molde para a primeira reação de PCR.
[0054] Reação PCR 2: Os dois fragmentos de DNA obtidos na reação PCR 1 foram usados como moldes para a segunda reação PCR usando os iniciadores Pr 1 e Pr 4.
[0055] Para a mutação dupla de E42A/K89A, o iniciador usado foi o mesmo que o para a preparação da mutação F-42A e cDNA de K89A mutante foi usado como o molde na reação.
[0056] Cada um dos três genes mutados de IL-18 foi ligado ao vetor BlueScript para confirmação de seqüência. A seqüência de aminoácido prevista para os mutantes do precursor IL-18E 42A, K89A e E42A/K89A é mostrada nas SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5, respectivamente. Para expressão de E. coli, cada uma das três inserções de DNA de IL-18 foi religada no vetor pPROEX HTa (GIBCO/BRL) com o uso de sítios EcoRI e Xbal. A proteína resultante é N-terminal fundida à histidina (Figura 1).
[0057] Os precursores de mutante de IL-18 foram expressos em E. coli, afinidade purificada em virtude da lacuna de histidina e as respectivas moléculas maduras foram geradas através de clivagem proteolítica com fator Xa.
[0058] Cada um dos quatro plasmídeos pPROEX HTu/IL-18 (WT e os três mutantes) foi introduzido nas células de E. coli competentes da cepa DHQ (GIBCO/BRL) e expresso conforme descrito (11). Uma cultura de um dia para o outro de 25 ml serviu como inócuo para uma cultura de LB de 450 ml contendo 100 μg/ml de ampicilina e cresceu até atingir uma densidade de célula de 0,6-1 ΟD600. A expressão da proteína foi induzida através de tratamento com isopropiltiogalactosídeo (IPTG 0,3 mM) e a incubação continuou a 37°C com agitação por 3 horas. As células bacterianas cultivadas foram colhidas através de centrifugação (5.000 x g por 15 min a 4°C) e o pélete foi suspenso em 30 ml de tampão Talon (50 mM de NaH2PO4/20 mM de Tris-HCI/100 mM de NaCl, pH 8). As células foram lisadas através de sonificação (explosões de 2 x 30 s) em gelo. A proteína solúvel foi obtida através de centrifugação (4.000 xg por 30 min a 4°C) e aplicada a uma coluna mini-Talon de 3 ml (CLONTECH). A coluna Talon foi então lavada com 30 volumes de leito de tampão Talon e eluída com 6 ml de 100 mM de imidazol em tampão Talon. O eluente foi dializado contra tampão de fator Xa (20 mM de Tris-HCI/150 mM de NaCI/2 mM de CsCI2) a 4°C por 20 h. O 0,2 ml de His N-terminal purificado com afinidade de Talon x 6 de fusão de pró-IL18 foram incubados com 4 μg de enzima do fator Xa (New England Biolabs) por 4 h em temperatura ambiente na presença de 2 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (GIBCO/BRL). A quantidade de IL-18 produzida foi monitorada por um ELISA específico (R&D Systems). A seqüência de aminoácido prevista para os mutantes de IL-18 WT, E42A, K89A e E42A/K89A maduros é mostrada nas seqüências SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, respectivamente.
[0059] Os mutantes de IL-18 purificados foram submetidos à análise Western blot com um anticorpo policlonal e um anticorpo monoclonal específico para a IL-18 madura.
[0060] Quantidades iguais de precursor purificado com afinidade com Talon e proteína madura (após clivagem pelo fator Xa), as formas de WT e IL-18 mutante, foram analisadas através de SDS/PAGE (10% de acrilamida) sob condições de redução. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e então incubadas com os anticorpos primários (anticorpo policlonal de IL-18 anti-humano de coelho ou clone de anticorpo monoclonal 8-31-4 (lgG2a) que foram criados contra a forma madura recombinante de IL-18 humana (Puren e outros, 1999) que também reconhece o precursor IL-18). Após 24 horas de incubação, o segundo anticorpo correspondente, peroxidase IgG anticamundongo de cabra ou anticoelho de burro (Jackson Immuno Research), foi adicionado e desenvolvido através de ECL (New England Nuclear Life Science Products).
[0061] O tingimento de prolL-18 pela IL-18 anti-humana de coelho policlonal foi de igual intensidade para a WT e cada um dos três mutantes. Similarmente, os sinais obtidos com as formas maduras de WT e IL-18 e cada um dos três mutantes usando o anti-soro policlonal eram de igual intensidade. O peso molecular aparente indicou que as formas de IL-18 diferentes eram de tamanho correto. Em contraste, quando o anticorpo monoclonal é usado, os dois mutantes K89A e E42A/K89A parecem tingir mais intensamente do que o mutante WT e o E42A, sugerindo que a afinidade do anticorpo monoclonal é maior para esses mutantes. Esses resultados sugerem que os mutantes K89A e E42A/K89A possam ter uma conformação diferente resultando em maior afinidade.
[0062] As formas maduras purificadas de IL-18/ICE/Xa foram analisadas quanto à co-indução de IFN-γ em células assassinas naturais humanas (NKO descrito no Exemplo 8), em PBMCs (descrito no Exemplo 7) e quanto à indução de IL-8 em PBMCs.
[0063] A IL-18 não induz IFN-γ nessas células a menos que IL-12 (ou IL-15) seja usada como um co-estimulador. Baixas concentrações de IL-12 (1-2 ng/ml 12 (PreproTech Rocky Hill, NJ)) induziram uma pequena quantidade de IFN-γ, no entanto, tratamento com IL-12 junto com IL-18 aumenta muito a produção de IFN-γ. O IFN-γ produzido foi monitorado na célula conforme descrito no Exemplo 9. A indução de IFN-γ em células NKO por IL-18/ICE/Xs WT e IL-12 foi verificada ser comparável com aquela induzida por IL-18 humana madura recombinante resultante de processamento ICE de prolL-18 (Gu e outros, 1997) e IL-12. Os resultados indicam que a IL-18 foi corretamente montada em E. coli e corretamente processada pelo fator Xa.
[0064] Para testar a atividade da IL-18 mutada, a indução de produção de IFN-γ através de estímulo com a mutante ou IL-18 WT junto com IL-12 foi avaliada em células NKO (análises estatísticas são descritas no Exemplo 10). Conforme mostrado na Figura 3, IL-18 WT era ativa como um indutor de IFN-γ, começando em 7,5 ng/ml e aumentando progressivamente até 60 ng/ml (a maior concentração testada). Cada uma das três formas IL-18 mutadas exibiu atividade biológica mais do que aquela de WT nessas células. Por exemplo, a mutação de E42A simples era duas vezes tão ativa quanto a forma WT em cada uma das concentrações testadas. A mutação de K89A simples era quatro vezes mais ativa do que a WT em uma concentração de 7,5 ng/ml. A mutação dupla de E2A/K89A resultou na IL-18 mais ativa. Conforme mostrado na Figura 3, a IL-18 mutada_E42A induziu 600 pg/ml de IFN-γ, a atividade máxima observada pelo pré-tratamento com 60 ng/ml de IL-18 WT, em uma concentração de 30 ng/ml, o mutante K89A em uma concentração de 15 ng/ml e o mutante duplo em uma concentração de 7,5 ng/ml. Os mutantes E42A, K89A e o mutante duplo eram então 2, 4 e 8 vezes mais potentes do que a WT, respectivamente.
[0065] Resultados similares foram observados quando a produção de IFN-γ foi testada em PBMCs humanas recém-isoladas (Exemplo 7). Nessas células, a co-estimulação de IL-12 e IL-18 resultou em produção de IFN-γ, enquanto que nenhuma das duas citocinas sozinhas podia induzir IFN-γ. O mutante de E42A/K89A duplo era o mais ativo (Figura 3B).
[0066] Os resultados indicam que a substituição dos dois aminoácidos carregados Glu 42 e/ou Lys 89 pelos resíduos Ala coerentemente causa um aumento na atividade biológica de IL-18.
[0067] IL-18 é sabida induzir IL-8 em células CD14+ em preparações de PBMC (descrito no Exemplo 7). Embora a IL-18 induza a produção de IL-8 nessas células sem a necessidade de co-estimulação de IL-12, a indução de IL-8 requer concentrações maiores de IL-18 do que a indução de IFN-γ. A indução de IL-8 pela IL-18 WT e a estimulação dos mutantes de PBMCs foram então testadas. A IL-8 produzida foi monitorada no meio celular através do ensaio específico descrito no Exemplo 9. A Figura 4 mostra que embora as duas mutações únicas fossem comparáveis com a WT na indução de II-8, a IL-18 mutada dupla induziu significantemente mais IL-8 (3,5 vezes) do que a versão do tipo selvagem.
[0068] Esses resultados indicam que o mutante duplo, E42A/K89A, exibe a maior atividade biológica.
[0069] As mutações foram criadas em resíduos previstos como sendo importantes para ligação de IL-18 através da IL-18BP inibidora. A habilidade da IL-18BP em neutralizar a atividade biológica da IL-18, por exemplo, produção de IFN-γ (Exemplo 8), foi desse modo especificamente avaliada.
[0070] Concentrações diferentes de IL-18BP (isoforma "a" de célula CHO produziu IL-18BP humana marcada em his-6 recombinante (fornecida pela Interpharm Laboratories, Ness Ziona, Israel Kim e outros, 2000)) foram pré-incubadas com IL-18 WT ou suas formas mutadas (concentração final de 30 ng/ml) e então adicionadas às culturas celulares.
[0071] Conforme mostra na Figura 4A, a concentração de 50% de inibição de IL-18BP para co-indução de IFN-γ pela IL-18 WT a partir das células NKO era de aproximadamente 15 ng/ml (supondo que nenhuma inibição aconteça em 3,7 ng/ml de IL-18BP e este valor representa 100% de atividade). A mutação simples de E42A resultou em uma concentração de inibição de dose similar pela IL-18BP.
[0072] No entanto, quando o mutante de K89A foi incubado com IL-18BP, sua habilidade em agir como co-indutor de INF-γ em células NKO foi neutralizada em um grau menor (Figura 5A). Apenas em uma concentração de 120 ng/ml uma redução estatisticamente significante na atividade podia ser observada. Em contraste, IL-18BP falhou em neutralizar o mutante de IL-18 duplo E42A/K89A.
[0073] Conforme mostrado na Figura 4B, IL-18 é mais sensível à neutralização pela IL-18BP quando testada em PBMCs ao invés de células NKO. A quantidade de IL-18BP necessária para neutralizar IL-18 WT era 3,7 ng/ml, a menor concentração testada. A mutação simples E42A se comportou similarmente à IL-18 WT, conforme estabelecido pela observação de que baixas concentrações de IL-18BP neutralizaram sua atividade biológica em PBMCs. Em contraste, a mutação simples de K89Afoi neutralizada em 120 ng/ml. Similar aos resultados referentes à neutralização de mutantes de IL-18 pela IL-18BP em células NKO, a mutação dupla de E42A/K89A foi apenas ligeiramente afetada pela IL-18BP em PBMCs.
[0074] Esses resultados mostram que o mutante E89A e o mutante duplo E42A/K89A são menos afetados pelo inibidor natural IL-18BP.
[0075] Leucócitos residuais de plaquetoferese de plaqueta de doadores humanos saudáveis foram enxaguados do tubo de sangue e submetidos à centrifugação sobre Histopaque. PBMCs foram aspiradas da interface, lavadas três vezes em solução salina sem pirogênio (Baxter Health Care, Mundelein, IL) e ressuspensas a 5 x 106 células por ml em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% (GIBCO/BRL, Grand Island, NY). As células foram cultivadas em placas de 96 cavidades de fundo piano (Becton Dickinson) com meio RPMI 1640 apenas (controle), concentrações variantes de IL-18 humano recombinante e IL-18 WT (ICF/Xa) ou os três mutantes, na presença de 1 ng/ml de IL-12. Em alguns experimentos, preparações de IL-18 foram primeiro misturadas com polimixina Β (1 μg/ml comprado da Sigma) antes de serem adicionadas às células. As células foram incubadas por 16-20 horas a 37°C em ar umidificado com CO2 a 5%, e os sobrenadantes da cultura foram então coletados para medição de IFN-γ.
[0076] A linhagem celular NK92 parenteral original foi obtida da Hans Klingerman (Gong e outros, 1994). A linhagem celular NKO humana usada nos presentes estudos era um subclone desta linhagem celular. Células NKO foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado contendo FBS a 10% e 50 pg/ml de IL-2 (R&D Systems) e 200 pg/ml de IL-15 (PreproTech). Para ensaios, as células NKO foram suspensas a 0,5 x 106 células por ml em meio RPMI 1640 e estimuladas em volumes de 0,2 ml em placas de 96 cavidades com 0,5 ng/ml de IL-12 (PreproTech Rocky Hill, NJ) e concentrações diferentes de IL-18 WT humana recombinante, IL-18 (ICE/Xa) ou mutantes de IL-18 E42A, K89A e E42A/X89A. Após 16-20 horas a 37°C em ar umidificado com CO2 a 5%, o sobrenadante da cultura foi coletado para medição de IFN-γ.
[0077] O método de eletroquimioluminescência de fase líquida (ECL) foi usado para medir IFN-γ (13) e IL-8 (12) em meio de cultura celular. A quantidade de ECL foi determinada com o uso de um analisador Origen (Igen, Gaithersburg, MD). O limite de detecção de IFN-γ e IL-8 era 62 pg/ml e 40 pg/ml, respectivamente.
[0078] Os dados são expressos como a média ±SEM. Médias de grupo foram comparadas através de ANOVA, com o uso da diferença significantemente mínima de Fisher. Significância estatística foi aceita dentro de 95% de limites de confiança. Análises ANOVA e de correlação foram realizadas com os pacotes estatísticos STATVIEW 512 + (Brain Power, Calabases, CA).
[0079] Para expressão e secreção de mutantes de IL-18 madura em células CHO, a seqüência de DNA codificando a proteína madura do tipo selvagem e o mutante de IL-18BP é ligada à seqüência da seqüência de DNA do peptídeo de sinal do hormônio de crescimento humano (hGH) através de duas reações PCR similarmente às reações descritas no Exemplo 1. O molde para a primeira reação PCR para a amplificação de cada mutante de IL-18 é o constructo correspondente do Exemplo 2 com iniciador de sentido (Pr 9) contendo seqüências de sobreposição de IL-18 e peptídeo de sinal de hGH e iniciadores reversos (Pr 10) codificando pelo menos 12 nucleotídeos da IL-18, um códon de parada e um sítio para uma enzima de restrição. Para a amplificação do peptídeo de sinal de hormônio do crescimento o plasmídeo pXGH é usado como o molde com um iniciador de sentido (Pr 11) contendo um sítio para uma enzima de restrição, para os primeiros 12 nucleotídeos do peptídeo de sinal de hGH e para o iniciador reverso (Pr 12), contendo seqüências de sobreposição com o peptídeo de sinal de hGH e proteína madura IL-18. Os moldes para a segunda PCR realizada para a amplificação do fragmento codificando o peptídeo de sinal do hGH fundido à seqüência madura da IL-18 são fragmentos amplificados purificados da primeira reação de PCR e os iniciadores Pr 10 e Pr 11 contendo os sítios de restrição. O fragmento de fusão é purificado, digerido com as enzimas de restrição apropriadas e clonado para um vetor de expressão de mamífero.
[0080] Os plasmídeos são usados para transfecção de células CHO (DHFR-) junto com um plasmídeo contendo o gene DHFR de camundongo como um marcador genético. As células resistentes são isoladas em um meio seletivo e avaliadas quanto à produção de IL-18 através de um ensaio ELISA.
[0081] As células estavelmente transfectadas são submetidas a vários ciclos de amplificação de gene aumentando as concentrações de MTX. No final do processo de amplificação de gene, clones são isolados através de diluição limitante. Após subclonagem o clone que mostra produtividade específica alta e maior estabilidade de produção é selecionado para produção.
REFERÊNCIAS
REFERÊNCIAS
- 1. Anderson, D.M. Maraskovsky, E., Billingsley, W.L., Dougall, W.C., Tometsko, M.E., Roux, E.R., Teepe, M.C., DuBose, R.F., Cosman, D., Galibert, L. (1997) "A homologue of the TNF receptor and its ligant enhance T-cell growth and dendritic-cell function." Nature, 390, 175-179.
- 2. Bazan, J.F., Timans, J.C. and Kaselein, R.A. (1996) "A newly defined interleukin-1" Nature, 379, 591.
- 3. Born, T.L., Morrison, L.A., Esteban, D.J., VandenBos, T. Thebeau, L.G., Chen, N., Spriggs, M.K., Sims, J.E., Buller, R.M. (2000) "A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response." J. Immunol 164, 3246-54.
- 4. Childs, R., Chernoff, A., Contentin, N., Bahceci, E., Schrump, D., Leitman, S., Read, E.J., Tisdale, J., Dunbar, C., Linehan, W.M., Young, N.S., Barrett, A.J. (2000) "Regression of metastatic renal-cell carcinoma after nonmyeloablative allogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation." N. England J. Med. 343, 750-8.
- 5. Cho, D., Kim., T.G., Lee, W., Hwang, Y.I., Cho, H.I., Han, H., Kwon, O., Kim, D., Park, H., Houh, D. (2000) "Interleukin-18 and the costimulatory molecule B7-1 have a synergistic antitumor effect on murine melanoma; implication of combined immunotherapy for poorly immunogenic malignancy" J. Invest. Dermatol., 114, 928-34.
- 6. Coughlin, C.M., Salhany, K.E., Wysocka, M., fruga, E., Kurzawa, H., Chang, A.E., Hunter, C.A., Fox, J.C., Trinchieri, G. e Lee, W.M. (1998) "Interleukin -12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis." J. Clin. Invest. Mar, 101, 1441-52.
- 7. Engelmann, H., Aderka, D., Rubistein, M., Rotman, D. and Wallach. D. (1989) "A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity." J. Biol. Chem. 264, 11974-11980.
- 8. Engelmann, H., Novick, D. and Wallach, D. (1990) "Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors." J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.
- 9. Ghayur, T., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, I., Carter, A., Quintal, L., Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., and Allen, H. (1997) "Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production". Nature 386, 619-623.
- 10. Gollob, J.A, Mier, J.W., Veenstra, K., McDermott, D.F., Clancy, D., M., Atkins, M.B. (2000) "Phase I trial of twice-weekly intravenous interleukin 12 in patients with metastatic renal cell cancer ou malignant melanoma: ability to maintain IFN-gamma induction is associated with clinical response." Clin. Cancer Res., 5,1678-92.
- 11. Gong, J.H., Maki, G.,Klingemann, H.G. (1994) "Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cell." Leukemia 8:652.
- 12. Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M.A., Hayashi, N., Higashino, K., Okamura, H., Nakanishi, K., Kurimoto, M., Tanimoto, T., Flavell, R., A., Sato, V. Harding, M.W., Livingston, D.J., and Su, M.S. (1997) "Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by interleukin-lbeta converting enzyme." Science 275, 206-209.
- 13. Kim, S.H., Eisenstein, M. Reznikov, L., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M. e Dinarello, C.A. (2000) "Structural requirements of six naturally occurring isoformas of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. "Pro. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1190-5.
- 14. Kohno, K., J. Kataoka, T. Ohtsuki, Y. Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, e M. Kurimoto (1997) "IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12." J. Immunol. 158:1541-1550.
- 15. Kugler, A., Stuhler, G., Walden, P., Zoller, G., Zobywalski, A., Brossart, P., Trefzer, U., Ullrich, S., Muller, C.A., Becker, V., Gross, A.J., Hemmerlein, B., Kanz, L., Muller, G.A., Ringert, R.H. (2000) "Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids. "Nat. Med., 3, 332-6.
- 16. Nakamura, K., Okamura, H., Wada, M., Nagata, K. e Tamura, T. (1989). "Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production." Infect. Immun., 57, 590-5 issn: 0019-9567.
- 17. Nakamura, K. Okamura, H., Nagata, Komatsu, T. and Tamura T. (1993) "Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma interferon production. "Infection. Immunol. 61, 64-70.
- 18. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D. and Rubinstein. Μ. (1989) "Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. "J. Exp. Med., 170, 1409-14.
- 19. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1992) "Soluble Interferon-alfa Receptor Molecules are Present in Body Fluids." FEBS Lett., 314, 445-8.
- 20. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1994) "The Human Interferon alpha-beta Receptor - Characterization and Molecular Cloning." Cell 77, 391-400.
- 21. Novick, D., Kim, S., Fantuzzi, G., Reznikov, L.L., Dinarello, C.A. and Rubinstein, M. (1999) "Interleukin-18 Binding Protein: A Novel Modulator of the Th1 Cytokine Response. Immunity, 10, 127, 36.
- 22. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1995) "Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells." Nature, 378, 88-91.
- 23. Puren, A.J., Fantuzzi, G., Dinarello, C.A. (1999) "Gene expression, synthesis, and secretion of interleukin 18 and interleukin 1 beta are differentially regulated in human blood mononuclear cells and mouse spleen cells." Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96, 2256-61.
- 24. Seki, S., Habu, Y., Kawamura, T., Takeda, K., Dobashi, H., Ohkawa, T., Hiraide, H. (2000)" The liver as a crucial organ in the first line of host defense: the roles of Kupffer cells, natural killer (NK) cells and NK1.1 Ag + T cells I T helper 1 immune responses." Immunol Rev., 174, 35-46.
- 25. Simonet, W.S., Lacey, D.L., Dunstan, C.R., Kelley, M., Chang, M.S., Luthy, R., Nguyen, H.Q., Wooden, S., Bennett, L., Boone, T., Shimamoto, G., DeRose, M., Elliott, R., Colombero, A., Tan. H.L., Trail, G., Sullivan, J., Davy, E., Bucay, N., Renshaw-Gegg, L., Hughes, T.M., Hill, D. Pattison, W., Campbell, P., Boyle, W.J. (1997). "Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density". Cell, 89, 309-19.
- 26. Slavin, S. (2000) "Immunotherapy of cancer with alloreactive lymphocytes." N. Engl. J. Med., 343, 802-3.
- 27. Slavin, S., Or, R. Prighozina, T., Gurevitch, O., Aker, M., Panighari, S., Shapira, M., Nagle, A. (2000) "Immunotherapy of hematologic malignancies and metastatic solid tumors in experimental animals and man" Bone Marrow Transplant Suppl., 2:S54-7.
- 28. Tsutsui, Η., K., Nakanishi, K., Matsui, K., Higashino , H., Okamura, Y. Miyazawa, and K. Kaneda. (1996) "IFN-gamma inducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of murine natural killer cell clones." J. Immunol. 157, 3967-73 issn: 0022-1767.
- 29. Tuting, T., Wilson, C.C., Martin, D.M., Kasamon, Y.L., Rowles, J., Ma, D.I., Slingluff, C.L., Wagner, S.N., van der Bruggen, P., Baar, J. Lotze, M.T., Storkus, W.J. (1998) "Autologous human monocyte-derived dendritic cells genetically modified to express melanoma antigens elicit primary citotoxic T cell responses in vitro: enhancement by co-transfection of genes encoding the Th1-biasing cytokines IL-12 and IFN-alfa". J. Immunol., 160, 1139-47.
- 30. Urushihara, N., Iwagaki, H., Yagi, T., Kohka, H., Kobashi, K., Morimoto, Y., Yoshino, T., Tanimoto, T., Kurimoto, M., Tanaka, N. (2000) "Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in biliary atresia." J. Pediatr. Surg., 35, 446-9.
- 31. Ushio, S., Namba, M., Okura, T., Hattori, K., Nukuda, Y., Akita, Tanabe, F., Konishi, K., Micallef, M., Fujii, M., Torigoe, K., Tanimoto, T., Fukuda, S., Ikeda, M., Okamura, H., and Kurimoto, M. (1996) J. Immunol., 156, 4274-9.
- 32. Vigers, G.P., Anderson, L.J., Caffes, P., Brandhuber, B.J. (1997) "Crystal structure of the type-l interleukin-1 receptor complexed with interleukin-1 beta." Nature, 386, 190-4.
- 33. Xiang, Y. and Moss, B. (1999)" IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human poxvirus-encoded proteins." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11537-42.
- 34. Yasuda, H., Shima, N., Nakagawa, N., Mochizuki, S.L, Yano, K., Fujise, N. Sato, Y., Goto, M., Yamaguchi, K., Kuriyama, M., Kanno, T., Murakami, A., Tsuda, E., Morinaga, T., Higashio, K. (1998). "Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro." Endocrinology, 139, 1329-37.
[0082] As referências citadas acima e no relatório são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.
Claims (13)
- Polipeptídeo mutante de IL-18, caracterizado pelo fato de que compreende mutações em um ou mais resíduos de aminoácido que estão envolvidos em sua interação com a proteína de ligação IL-18,
sendo que a mutação está em um resíduo selecionado dentre Glu-42 e Lys-89, e
sendo que as mutações são substituições são não-conservativas. - Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação está em um resíduo Glu-42.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação está em um resíduo Lys-89.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação está em um resíduo Glu-42 e um resíduo Lys-89.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo Glu-42 é substituído com um aminoácido não-polar.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o Glu-42 é substituído com um resíduo Ala.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo Lys-89 é substituído com um aminoácido não-polar.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o Lys-89 é substituído com um resíduo Ala.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que ambos resíduo Glu-42 e resíduo Lys-89 são substituídos com um aminoácido não-polar.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que ambos resíduos Glu-42 e Lys-89 são substituídos com um resíduo Ala.
- Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
- Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é para o tratamento de câncer.
- Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é para o tratamento de doença viral.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27432701P | 2001-03-08 | 2001-03-08 | |
| US60/274,327 | 2001-03-08 | ||
| PCT/IB2002/002344 WO2002101049A2 (en) | 2001-03-08 | 2002-03-08 | Interleukin-18 mutants, their production and use |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR0207933A BR0207933A (pt) | 2004-03-02 |
| BRPI0207933B1 true BRPI0207933B1 (pt) | 2020-11-24 |
| BRPI0207933B8 BRPI0207933B8 (pt) | 2021-05-25 |
Family
ID=23047735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0207933-0 BRPI0207933B8 (pt) | 2001-03-08 | 2002-03-08 | polipeptídeo mutante de interleucina-18 e composição farmacêutica |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7524488B2 (pt) |
| EP (1) | EP1392830B1 (pt) |
| JP (1) | JP2004530432A (pt) |
| KR (1) | KR100862136B1 (pt) |
| CN (1) | CN100503829C (pt) |
| AT (1) | ATE315647T1 (pt) |
| AU (1) | AU2002324249B2 (pt) |
| BR (1) | BRPI0207933B8 (pt) |
| CA (1) | CA2438851C (pt) |
| DE (1) | DE60208692T2 (pt) |
| DK (1) | DK1392830T3 (pt) |
| EA (1) | EA005769B1 (pt) |
| ES (1) | ES2251610T3 (pt) |
| IL (2) | IL157800A0 (pt) |
| MX (1) | MXPA03008110A (pt) |
| SI (1) | SI1392830T1 (pt) |
| UA (1) | UA79235C2 (pt) |
| WO (1) | WO2002101049A2 (pt) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1925626A1 (en) * | 2003-07-21 | 2008-05-28 | Transgene S.A. | Novel multifunctional cytokines |
| DE602004031341D1 (de) | 2003-07-21 | 2011-03-24 | Transgene Sa | Multifunktionelle cytokine |
| US7820800B2 (en) * | 2003-11-05 | 2010-10-26 | Ares Trading S.A. | Process for the purification of IL-18 binding protein |
| WO2005097998A2 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Il-18 specific polypeptides and therapeutic uses thereof |
| AU2006254103B2 (en) | 2005-06-03 | 2012-09-06 | Ares Trading S.A. | Production of recombinant IL-18 binding protein |
| ATE529433T1 (de) | 2005-06-10 | 2011-11-15 | Ares Trading Sa | Verfahren zur reinigung eines il-18-bindenden proteins |
| CN101177454B (zh) * | 2007-05-09 | 2010-09-22 | 郑骏年 | Il-18突变体多肽及制备及用途 |
| WO2012078936A2 (en) * | 2010-12-10 | 2012-06-14 | Glaxosmithkline Llc | Methods to produce a purified peptide chain fraction |
| MX2020002542A (es) * | 2017-09-06 | 2020-07-20 | Univ Yale | Variantes de interleucina-18 y metodos de uso. |
| US12029778B2 (en) | 2019-05-13 | 2024-07-09 | Yale University | Interleukin-18 mimics and methods of use |
| JP2021170968A (ja) * | 2020-04-22 | 2021-11-01 | 国立大学法人 長崎大学 | マウスｉｌ−１８の製造方法及びそのための組換えｄｎａ |
| US20220056091A1 (en) * | 2020-08-19 | 2022-02-24 | Bright Peak Therapeutics Ag | Modified il-18 polypeptides and uses thereof |
| MX2023005068A (es) | 2020-11-02 | 2023-07-14 | Simcha Il 18 Inc | Variantes de interleucina-18 y métodos de uso. |
| US20240150421A1 (en) * | 2021-02-10 | 2024-05-09 | Nagasaki University | Novel human interleukin-18 variant and use thereof |
| WO2023010021A1 (en) | 2021-07-27 | 2023-02-02 | Xencor, Inc. | Il-18-fc fusion proteins |
| JP2023024168A (ja) | 2021-08-06 | 2023-02-16 | 国立大学法人 長崎大学 | がんの治療剤 |
| US20240425560A1 (en) * | 2021-09-29 | 2024-12-26 | Chimera Bioengineering, Inc. | IL-18 Variants and Uses Thereof |
| WO2023118497A1 (en) * | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Novel il-18 variants |
| AU2023226512A1 (en) | 2022-02-23 | 2024-08-29 | Bright Peak Therapeutics Ag | Immune antigen specific il-18 immunocytokines and uses thereof |
| CA3244053A1 (en) * | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Bright Peak Therapeutics Ag | MODIFIED IL-18 POLYPEPTIDES |
| US20240116997A1 (en) | 2022-02-23 | 2024-04-11 | Bright Peak Therapeutics Ag | Activatable il-18 polypeptides |
| WO2024044780A1 (en) * | 2022-08-26 | 2024-02-29 | Sutro Biopharma, Inc. | Interleukin-18 variants and uses thereof |
| WO2024102693A2 (en) | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Xencor, Inc. | Il-18-fc fusion proteins |
| WO2025085447A1 (en) | 2023-10-17 | 2025-04-24 | Xencor, Inc. | Pd-1 targeted il18-fc fusion proteins |
| US12134635B1 (en) | 2023-12-29 | 2024-11-05 | Sonnet BioTherapeutics, Inc. | Interleukin 18 (IL-18) variants and fusion proteins comprising same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4024366B2 (ja) * | 1996-11-29 | 2007-12-19 | 株式会社林原生物化学研究所 | ポリペプチド |
| TWI227136B (en) * | 1998-05-21 | 2005-02-01 | Smithkline Beecham Corp | Novel pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of cancer |
| IL129427A0 (en) | 1999-04-13 | 2000-02-17 | Yeda Res & Dev | Preparation of biologically active molecules |
-
2002
- 2002-03-08 SI SI200230280T patent/SI1392830T1/sl unknown
- 2002-03-08 AU AU2002324249A patent/AU2002324249B2/en not_active Expired
- 2002-03-08 KR KR1020037011581A patent/KR100862136B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-08 BR BRPI0207933-0 patent/BRPI0207933B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-03-08 CA CA2438851A patent/CA2438851C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-08 EP EP02758668A patent/EP1392830B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-08 MX MXPA03008110A patent/MXPA03008110A/es active IP Right Grant
- 2002-03-08 CN CNB02809803XA patent/CN100503829C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-08 JP JP2003503799A patent/JP2004530432A/ja active Pending
- 2002-03-08 DE DE60208692T patent/DE60208692T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-08 ES ES02758668T patent/ES2251610T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-08 EA EA200300987A patent/EA005769B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-03-08 DK DK02758668T patent/DK1392830T3/da active
- 2002-03-08 WO PCT/IB2002/002344 patent/WO2002101049A2/en not_active Ceased
- 2002-03-08 IL IL15780002A patent/IL157800A0/xx unknown
- 2002-03-08 AT AT02758668T patent/ATE315647T1/de active
- 2002-03-08 US US10/094,153 patent/US7524488B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-08-03 UA UA2003109084A patent/UA79235C2/uk unknown
-
2003
- 2003-09-08 IL IL157800A patent/IL157800A/en unknown
-
2009
- 2009-03-16 US US12/404,458 patent/US7875709B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1392830A2 (en) | 2004-03-03 |
| HK1084151A1 (zh) | 2006-07-21 |
| UA79235C2 (en) | 2007-06-11 |
| SI1392830T1 (sl) | 2006-06-30 |
| AU2002324249B2 (en) | 2007-04-05 |
| BR0207933A (pt) | 2004-03-02 |
| EA005769B1 (ru) | 2005-06-30 |
| EP1392830B1 (en) | 2006-01-11 |
| DE60208692T2 (de) | 2006-07-13 |
| KR100862136B1 (ko) | 2008-10-09 |
| DK1392830T3 (da) | 2006-05-08 |
| MXPA03008110A (es) | 2003-12-12 |
| EA200300987A1 (ru) | 2004-02-26 |
| US20090286855A1 (en) | 2009-11-19 |
| ATE315647T1 (de) | 2006-02-15 |
| KR20030088448A (ko) | 2003-11-19 |
| WO2002101049A3 (en) | 2003-12-18 |
| CN100503829C (zh) | 2009-06-24 |
| CA2438851A1 (en) | 2002-12-19 |
| US20020169291A1 (en) | 2002-11-14 |
| US7875709B2 (en) | 2011-01-25 |
| DE60208692D1 (de) | 2006-04-06 |
| CA2438851C (en) | 2011-07-26 |
| CN1764723A (zh) | 2006-04-26 |
| JP2004530432A (ja) | 2004-10-07 |
| US7524488B2 (en) | 2009-04-28 |
| IL157800A (en) | 2009-08-03 |
| BRPI0207933B8 (pt) | 2021-05-25 |
| WO2002101049A2 (en) | 2002-12-19 |
| IL157800A0 (en) | 2004-03-28 |
| ES2251610T3 (es) | 2006-05-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7875709B2 (en) | Nucleic acids encoding interleukin-18 mutants | |
| AU2002324249A1 (en) | Interleukin-18 mutants, their production and use | |
| KR100607609B1 (ko) | Ｉｌ-2 선택성 작용제 및 길항제 | |
| US5707616A (en) | Method for treating or preventing gastrointestinal disease with epithelium-derived T-cell factor | |
| JP3261124B2 (ja) | ナチュラルキラー細胞刺激因子 | |
| PT772624E (pt) | Interleucina-15 | |
| JP4024366B2 (ja) | ポリペプチド | |
| JP4828703B2 (ja) | ヒトｇｉｌ−１９／ａｅ２８９タンパク質、及び、同タンパク質をコードするポリヌクレオチド | |
| JP2003533488A (ja) | 免疫抑制を達成するための組成物および方法 | |
| AU2001261585A1 (en) | Compositions and methods for achieving immune suppression | |
| JP2001508309A (ja) | ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーのメンバー | |
| ES2307313T3 (es) | Nuevos polipeptidos, adn que codifican y utilizan estos polpeptidos. | |
| JPH09512165A (ja) | インターロイキン１５ | |
| US7625553B2 (en) | Method of treating cancer by administering an epithelum-derived T-cell factor | |
| HK1084151B (en) | Interleukin-18 mutants, their production and use | |
| JP3689111B2 (ja) | インターロイキン１５ | |
| JP2007143555A (ja) | ポリペプチド | |
| JP2002511268A (ja) | ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーの一員であるｕ４ | |
| JP2001506483A (ja) | ヒト▲ｉ▼型膜蛋白質およびそれをコードするｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B25G | Requested change of headquarter approved |
Owner name: ARES TRADING S.A. (CH) Free format text: ALTERADA A SEDE DO TITULAR CONFORME REQUERIDO NA PETICAO NO 055209/RJ DE 27/09/2004. |
|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B06T | Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/11/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
|
| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 08/03/2002 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |
|
| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 21A ANUIDADE. |
|
| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2713 DE 03-01-2023 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |