JP2001508309A

JP2001508309A - ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーのメンバー

Info

Publication number: JP2001508309A
Application number: JP53443598A
Authority: JP
Inventors: ドナルドソン，デブラ・ディ; コリンズ，メアリー; ネベン，タムリン; ホイッターズ，マシュー
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2001-06-26
Also published as: AU5733898A; EP1005552A1; WO1998031811A1

Abstract

(57)【要約】Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを開示する。Ｕ４蛋白およびその製造方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーのメンバー発明の分野本発明は、蛋白のなかでも哺乳動物ヘマトポイエチンスーパーファミリーの新たなメンバー（ヒトおよびネズミの受容体蛋白を包含するがこれらに限らない）、そのフラグメントならびにかかる蛋白の発現に有用な組み換えポリヌクレオチドおよび細胞に関する。発明の背景ヘマトポイエチンとして知られる種々の調節分子が同定されており、それらは造血細胞または血液細胞の種々の集団の発達および増殖に関与している。大部分のヘマトポイエチンは、標的細胞表面の受容体との相互作用により、特定の生物学的活性を示す。通常には、サイトカイン受容体は１、２または３本の鎖からなっている。多くのサイトカイン受容体およびＩＬ−１２ｐ４０のごときいくつかのサイトカインは蛋白のなかでもヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーの新たなメンバーの同定は、造血の調製、免疫応答の調節ならびにサイトカインおよび受容体を包含するヘマトポイエチンスーパーファミリーの他のメンバーの同定において有用でありうる。これまで不明であったヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーのメンバーのＤＮＡおよび蛋白配列を同定し決定することが望ましいであろう。発明の概要本発明によれば、Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーの鎖をコードするポリヌクレオチドが開示され、それはネズミおよびヒト由来のものを包含するが、これらに限らない。特定の具体例において、本発明は、（ａ）配列番号：４のヌクレオチド２４２からヌクレオチド１３９６までのヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：６のヌクレオチド７１からヌクレオチド１２２５までのヌクレオチド配列；（ｃ）遺伝学的コードの縮重の結果として（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチド配列とは異なっているヌクレオチド配列；（ｄ）厳密な条件下で（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列；（ｅ）（ａ）または（ｂ）に示す配列の種相同体をコードするヌクレオチド配列；および（ｆ）（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチド配列の対立遺伝子変種からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、ヌクレオチド配列は、Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖の生物学的活性を有する蛋白をコードする。ヌクレオチド配列を発現制御配列に作動可能に連結してもよい。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、配列番号：４のヌクレオチド２４２からヌクレオチド１３９６までのヌクレオチド配列；配列番号：４のヌクレオチド１２２から１３９６までのヌクレオチド配列；配列番号：６のヌクレオチド７１からヌクレオチド１２２５までのヌクレオチド配列；または配列番号：６のヌクレオチド１１からヌクレオチド１２２５までのヌクレオチド配列を含む。また本発明は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までのアミノ酸配列；および（ｅ）Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｄ）のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。他の好ましい具体例は、配列番号：５のアミノ酸配列；配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までのアミノ酸配列；配列番号：７のアミノ酸配列；および配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までのアミノ酸配列をコードする。該ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞も提供される。他の具体例において、本発明は、Ｕ４蛋白の製造方法を提供する。該方法は、（ａ）適当な培地で本発明宿主細胞の培養物を増殖させ、ついで（ｂ）培養物からヒトＵ４蛋白を精製することを含む。これらの方法により製造される蛋白も提供される。また本発明は、（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までのアミノ酸配列；および（ｅ）Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｄ）のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離Ｕ４蛋白を提供する。好ましくは、該蛋白は、配列番号：５のアミノ酸配列；配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までのアミノ酸配列；配列番号：７のアミノ酸配列；および配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までのアミノ酸配列を含む。他の好ましい具体例において、アミノ酸配列は融合蛋白（Ｕ４由来でない、さらなるアミノ酸配列との融合蛋白）の一部である。好ましい融合蛋白は、Ｆｃフラグメントのごとき抗体フラグメントを含む。本発明蛋白および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供される。さらに本発明は、本発明蛋白と特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。好ましい具体例の詳細な説明本発明者らは、Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖（以下、「Ｕ４」または「Ｕ４蛋白」という）をコードするポリヌクレオチド（ネズミおよびヒトのＵ４をコードするポリヌクレオチドを包含するが、これらに限らない）を初めて同定し、これを提供した。ヒトＩＬ−５受容体（LMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMCREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKP LREWFVIVIMATICFILLIL、配列番号：１）の７９個のアミノ酸の領域を用い、ＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いてＧｅｎＢａｎｋＥＳＴデータベースを検索した。ＥＳＴＷ６６７７６はこの領域に対して相同性があると同定され、これが新規ヘマトポイエチン受容体をコードしている可能性が示唆された。ＧＣＧマッププログラムを用いるこのＥＳＴの逆相補物の翻訳により、ヘマトポイエチン受容体中に見いだされる保存されたＷＳＸＷＳモチーフを含む第２の読み枠中の蛋白配列が明らかとなった。しかしながら、この読み枠中には、ヌクレオチド２２７のところにストップコドンも存在し、このＥＳＴは新規ヘマトポイエチン受容体でないか、あるいは該ＥＳＴ中のＤＮＡ配列が正しくないことが示された。このＥＳＴ配列がヘマトポイエチン受容体に関連している可能性があるかどうかを調べるために、我々は、配列CTTGGCTTGG AAGAGGAAAT CCTTGAGAGC（配列番号：２）であるオリゴヌクレオチドプローブを用いてネズミ胚ライブラリーをスクリーニングした。全長ｃＤＮＡクローンＵ６−３（１Ａ）が同定され、完全配列が得られた。ネズミ蛋白のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：４および配列番号:５に示す。ネズミ蛋白はヘマトポイエチン受容体ファミリーの新規メンバーをコードしている。それはリーダー配列を有し、このファミリーに特徴的な保存されたシステインペアーＰＰ、およびＷＳＸＷＳモチーフを有する。このクローンは膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有しない。このクローンをＧｅｎＢａｎｋ中のＥＳＴと並置比較したところ、ＥＳＴがフレームシフト突然変異を有していないことが明らかとなった。配列番号：４は、ネズミＵ４をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。配列番号：５は受容体鎖の推定アミノ酸配列を示し、アミノ酸１から４０までの推定シグナル配列を含む。成熟ネズミＵ４は、配列番号：５のアミノ酸４１〜３８３の配列を有すると考えられる。ＧｅｎＢａｎｋ中のさらなる関連配列を同定するために、Ｗ６６７７６配列を用い、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いてＧｅｎＢａｎｋを検索した。ヒトゲノムＤＮＡ由来の、密接に関連したＥＳＴ、Ｈ１４００９が同定された。ついで、このＥＳＴ由来のオリゴヌクレオチドCTGAGCGTGC GCTGGGTGTCGCCAC（配列番号：３）を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離した。全長成熟蛋白相同体（ホモログ）をコードするｃＤＮＡクローン（ＨＵ４−３Ｂ）が完全に配列決定された。このクローンは完全なシグナル配列を有していないが、推定全長成熟蛋白の全体をコードしている。該ヒトクローンはマウスクローンに対してＤＮＡレベルで８５％の相同性を有する。推定アミノ酸配列は、ヒトおよびマウス間で９５％の同一性を有する。ヒトＵ４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：６および配列番号：７に示す。配列番号：６は、ヒトＵ４をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。配列番号：７は、受容体鎖の推定アミノ酸配列を示し、アミノ酸１から２３までの推定シグナル配列を含む。成熟ヒトＵ４は、配列番号：７のアミノ酸２４〜３８０の配列を有すると考えられる。ネズミおよびヒトのクローンを、１９９７年１月日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、それぞれ受託番号ＡＴＣＣおよびＡＴＣＣを付与された。ヒトリーダー配列をネズミリーダー配列に置き換えることにより、あるいはヒトリーダー配列をネズミ配列のアミノ酸１〜１４（MPAGRPGPVA QSAR、配列番号：８）を用いて伸長させることにより、ヒトＵ４蛋白を発現させることができる。さらに、本明細書開示の配列をプローブとして用いて、実際のヒトリーダーをコードしている、より長いｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離することもできる。全長未満のいずいれの形態のＵ４蛋白であっても本発明に包含され、全長形態および成熟形態とともにまとめて「Ｕ４」または「Ｕ４蛋白」と称される。全長Ｕ４蛋白をコードするポリヌクレオチド（配列番号：４または配列番号：６）の対応フラグメントを発現させることにより、全長未満のＵ４蛋白を製造してもよい。これらの対応ポリヌクレオチドフラグメントも本発明に包含される。適当な望ましい欠失変異体の構築、部位特異的突然変異法を包含する標準的な分子生物学的手法により、あるいは適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、上記の修飾ポリヌクレオチドを製造してもよい。本発明の目的からすれば、対応成熟Ｕ４蛋白の１またはそれ以上の生物学的活性を有する場合には、蛋白は「Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖の生物学的活性」を有するものである。Ｕ４またはその活性フラグメント（Ｕ４蛋白）を免疫グロブリンのごときキャリア分子に融合させてもよい。例えば、可溶性形態のＵ４を、「リンカー」配列を介して免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させてもよい。ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰとの融合蛋白のごとき他の融合蛋白を用いてもよい。また本発明は、配列番号：４または配列番号：６に示すヌクレオチド配列の対立遺伝子変種、すなわち配列番号：４または配列番号：６の単離ポリヌクレオチドの天然に存在する別形態（やはりＵ４蛋白をコードしており、好ましくはＵ４の生物学的活性を有する蛋白をコードしているもの）も包含する。また、非常に厳密な条件下（例えば、６５℃において０．１ｘＳＳＣ）で配列番号：４または配列番号：６に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする単離ポリヌクレオチドも本発明に包含される。Ｕ４蛋白をコードしているが、遺伝学的コードの縮重により配列番号：４または配列番号：６に示すヌクレオチド配列とは異なっている単離ポリヌクレオチドも本発明に包含される。点突然変異または誘導された修飾により生じる、配列番号：４または配列番号：６に示すヌクレオチド配列におけるバリエーションも本発明に包含される。また本発明は、他の動物種、特に、他の哺乳動物種由来の、ネズミまたはヒトのＵ４に対する相同体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書開示のネズミまたはヒトの配列由来のプローブまたはプライマーを作成し、例えば適切な種のＰＢＭＣ、胸腺または精巣から構築されたライブラリーのような適当なライブラリーをスクリーニングすることにより種相同体を同定することができる。本発明単離ポリヌクレオチドを、Kaufman et al.，Nucleic Acids Res．19， 4485-4490(1991)に開示されたｐＭＴ２またはｐＥＤベクターのごとき発現制御配列に作動可能に連結して、Ｕ４蛋白を組み換え生産してもよい。多くの適当な発現制御配列が当該分野において知られている。組み換え蛋白発現のための一般的方法も知られており、R．Kaufman，Methods in Enzymology 185，537-566(199 0)において説明されている。本明細書にいう「作動可能に連結」とは、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクション）された宿主細胞によりＵ４蛋白が発現されるように酵素的または化学的に連結されて本発明単離ポリヌクレオチドと発現制御配列との間に共有結合が形成されていることを意味する。多くの細胞は蛋白の発現に適した宿主細胞として作用しうる。哺乳動物の宿主細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常２倍体細胞、１次組織のインビトロ培養から由来の細胞株、１次外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｒａｔ２、ＢａＦ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ−１、ＰＣ１２３、Ｍ１ｘまたはＣ２Ｃ１２細胞を包含する。Ｕ４蛋白を１種またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることにより蛋白を得てもよい。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えばInvitrogen，San Dieg o，California，USAからのキット形態（MaxBac^Rキット）で市販されており、かかる方法は当該分野においてよく知られており、SummersおよびSmith，Texas Ag ricultural Experiment Station Bulletin No．1555（1987）(参照により本明細書に記載されているものとみなす)に記載のようなものがある。上記の適当な単離ポリヌクレオチドを用いて、可溶性形態のＵ４蛋白を昆虫細胞において製造してもよい。別法として、酵母のごとき下等真核細胞または細菌のごとき原核細胞において蛋白を製造することも可能である。潜在的に適当な酵母株は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または異種蛋白の発現能を有する酵母株を包含する。潜在的に適当な細菌株は、Escher ichiacoli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種蛋白の発現能を有する細菌株を包含する。細菌における発現は、組み換え蛋白を含有する封入体を生じるかもしれない。よって、活性物質またはより活性のある物質を得るためには組み換え蛋白の再生が必要であるかもしれない。細菌封入体から正しく折り畳まれた異種蛋白を得るための方法は当該分野において知られている。一般的には、これらの方法は、封入体から得た蛋白の可溶化、ついで、カオトロピック剤を用いる蛋白の完全変性を包含する。システイン残基が蛋白の１次アミノ酸配列中に存在する場合、ジスルフィド結合を正しく形成させうる環境（酸化還元系）での再生がしばしば必要である。再生のための一般的方法は、Kohno，Meth．Enzym.，185:187-195(1990) に開示されている。ＥＰ０４３３２２５および同時係属出願ＵＳＳＮ０８／１６３８７７には、他の適当な方法が記載されている。Ｕ４蛋白をコードするポリヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるトランスジェニック動物の産生物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳の成分として本発明Ｕ４蛋白を発現させてもよい。所望蛋白の発現に必要な培養条件において形質転換宿主細胞培養物を増殖させることにより本発明Ｕ４蛋白を製造してもよい。ついで、得られた発現蛋白を培地または細胞抽出物から精製してもよい。可溶性形態の本発明Ｕ４蛋白をならし培地から精製することができる。全膜フラクションを発現細胞から得て、ついで、TritonX-100のごとき非イオン性界面活性剤で膜を抽出することにより、膜結合形態の本発明Ｕ４蛋白を精製することができる。当該分野において知られた方法を用いてＵ４蛋白を精製することができる。例えば、市販蛋白濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて本発明Ｕ４蛋白を濃縮することができる。濃縮工程後、ゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに濃縮物を適用することができる。別法として、アニオン交換樹脂、例えば、懸垂ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有するマトリックスまたは基材を使用することができる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に通常使用される他のタイプのものであってよい。別法として、カチオン交換工程を用いてもよい。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチルを含有する種々の不溶性マトリックスを包含する。スルホプロピル基（例えば、Ｓ−セファロース^Rカラム）が好ましい。培養上清からのＵ４蛋白の精製は、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール^Rまたはチバクロムブルー３ＧＡセファロース^Rのごときアフィニティー樹脂による１またはそれ以上のカラム工程、あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー、あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含してもよい。最後に、疎水性逆相高品質液体クロマトグラフィー媒体、例えば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いてＵ４蛋白をさらに精製することもできる。既知方法に従って、Ｕ４蛋白に対する抗体を含有するアフィニティーカラムを精製に使用してもよい。上記精製工程のいくつかまたは全部を、種々組み合わせて、あるいは他の既知方法と組み合わせて使用して、実質的に精製された単離組み換え蛋白を得ることもできる。好ましくは、他の哺乳動物蛋白を実質的に含まないように単離Ｕ４蛋白を精製する。本発明Ｕ４蛋白を用いて、Ｕ４に結合しうる作用剤をスクリーニングしてもよい。固定化された、あるいはされていない所望結合蛋白を用いる結合アッセイは当該分野においてよく知られており、本発明Ｕ４蛋白を用いて、この目的に利用できる。精製細胞によるスクリーニングアッセイまたは精製蛋白による（無細胞）スクリーニングアッセイを用いてかかる作用剤を同定してもよい。例えば、Ｕ４蛋白を精製形態として担体に固定化し、精製Ｕ４蛋白に対する結合または有効リガンドを測定してもよい。医薬上許容される担体と混合される場合、細胞由来の精製Ｕ４蛋白または組み換え生産された精製Ｕ４蛋白を医薬組成物として使用してもよい。かかる組成物は、（Ｕ４または阻害剤ならびに担体のほかに）希釈剤、充填剤、塩類、バッファー、安定化剤、可溶化剤、および当該分野でよく知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体の特性は投与経路に依存する。本発明医薬組成物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ −３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ− １０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、およびエリスロポイエチンのごときサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を含有していてもよい。医薬組成物はさらに抗サイトカイン抗体を含有していてもよい。医薬組成物は、プラスミノーゲンアクチベーターおよびファクターＶＩＩＩのごとき血栓溶解または抗血栓因子を含有していてもよい。さらに医薬組成物は他の抗炎症剤を含有していてもよい。かかるさらなる因子および／または作用剤を医薬組成物に含有させて、単離Ｕ４蛋白との相乗作用を発揮させ、あるいは単離Ｕ４蛋白により引き起こされる副作用を最小にしてもよい。逆に、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の処方に単離Ｕ４蛋白を含有させて、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子または抗血栓因子、または抗炎症剤の副作用を最小化させてもよい。本発明医薬組成物はリポソーム形態であってもよく、その中で本発明蛋白はさらに他の医薬上許容される担体、脂質のごとき両親媒性作用剤（水溶液中でミセルのような凝集体形態、不溶性単層、液状結晶またはラメラ層として存在）と混合されている。リポソーム処方に適する脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチジド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが、これらに限らない。かかるリポソーム処方の製造は当業者のレベルの範囲内であり、例えば、米国特許第４２３５８７１、４５０１７２８、４８３７０２８、および４７３７３２３号（参照によりそれらすべてを本明細書に記載されているものとみなす）に記載されたようなものである。本明細書の用語「治療上有効量」とは、有意な患者の利益、例えば、かかる症状の徴候の改善、治癒、治癒速度の増大を示すに十分な医薬組成物または方法の各有効成分の合計量を意味する。単独で投与される個々の有効成分について用いる場合、該用語は当該成分のみをいう。有効成分の組み合わせに用いる場合、逐次投与あるいは同時投与にかかわらず治療効果を生じる有効成分量の合計量をいう。本発明の治療方法または使用の実施において、治療上有効量の単離Ｕ４蛋白を哺乳動物に投与する。本発明方法に従って、単独またはサイトカイン、リンホカインもしくは他の造血因子のごとき他の治療薬とともに単離Ｕ４蛋白を投与してもよい。１種またはそれ以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子と共投与する場合、Ｕ４蛋白をサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓因子と同時または逐次投与してもよい。逐次投与する場合、担当医師は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓因子との組み合わせにおけるＵ４蛋白の適切な投与順序を決定するであろう。本発明医薬組成物中または本発明の実施に用いるＵ４蛋白の投与を種々の慣用的方法、例えば、経口的摂食、吸入、または皮内、皮下、または静脈注射で行うことができる。患者への静脈注射が好ましい。治療上有効量のＵ４蛋白を経口投与する場合、Ｕ４蛋白は錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発明医薬組成物はゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントをさらに含有していてもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５ないし９５％のＵ４蛋白、好ましくは約２５ないし９０％のＵ４蛋白を含有する。液体形態で投与する場合、水、ペトロレウム、動物または植物起源の油脂、例えばピーナッツ油、鉱油、大豆油、またはゴマ油、または合成油脂を添加してもよい。液体形態の医薬組成物は、生理食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール類（例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）をさらに含有していてもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は、約０．５ないし９０重量％のＵ４蛋白、好ましくは約１ないし５０％のＵ４蛋白を含有する。治療上有効量のＵ４蛋白を静脈、皮内または皮下注射により投与する場合、Ｕ４蛋白はパイロジェン不含で、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。適切なｐＨ、等張性、安定性を有するかかる非経口的に許容される蛋白溶液の調製は、当業者の範囲内である。静脈、皮内、または皮下注射用の好ましい医薬組成物は、Ｕ４蛋白のほかに、注射用塩化ナトリウム、リンゲル溶液、注射用デキストロース、注射用デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、注射用乳酸含有リンゲル溶液、または当該分野で知られている他の担体を含有すべきである。本発明医薬組成物は、安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加物を含んでいてもよい。本発明医薬組成物中のＵ４蛋白の量は、治療すべき症状の性質および重さ、ならびに患者がすでに受けていた治療の性質による。最終的には、担当医師が、各患者を治療すべきＵ４蛋白量を決定するであろう。まず、担当医師は、低用量のＵ４蛋白を投与し、患者の応答を観察する。最適治療効果が得られるまで、より高用量のＵ４蛋白を投与してもよく、最適治療効果が得られた時点で用量をさらに増加させない。本発明方法を実施するための種々の医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇないし約１００ｍｇのＵ４蛋白を含有すべきである。本発明組成物を用いる静脈投与による治療の期間は、治療すべき疾病の重さならびに各患者の状態および固有の応答により変化させられるであろう。Ｕ４蛋白の各適用期間は、連続静脈投与の場合１２ないし２４時間の範囲であると考えられる。最終的には、担当医師が、本発明医薬組成物を用いる静脈投与による治療の期間を決定するであろう。本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白は、下記の１またはそれ以上の用途または生物学的活性（本明細書に引用されたアッセイに関連するものも含む）を示すと考えられる。本発明蛋白に関して説明された用途または活性は、かかる蛋白の投与または使用により、あるいはかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの投与または使用(例えば、遺伝子治療においてまたはＤＮＡ導入に適したベクターに入れて)により提供されうる。サイトカインおよび細胞増殖／分化活性本発明蛋白はサイトカイン活性、細胞増殖活性（誘導もしくは阻害）または細胞分化活性（誘導もしくは阻害）を示しうるか、またはある種の細胞集団において他のサイトカインの産生を誘導しうる。今日まで見いだされてきた多くの蛋白性因子（すべての既知サイトカインを包含）は、１またはそれ以上の因子依存的細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、よって、アッセイはサイトカイン活性の便利な確認法として役立つ。本発明蛋白の活性は、細胞系（３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢＭ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを包含するが、これらに限らない）のための多くの常套的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれかにより確認される。本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい：Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖についてのアッセイは、 Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Marg ulies,E.M.Shcvach,W Strobcr,Pub.Grccnc Publishing Associates and Wiley-I nterscience(Chapter3,In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function3.1-3.1 9;Chapter7,Immunologic studics in Humans);Takai et al.,J.Immunol.137:349 4-3500,1986;Bertagnolli et al.,J.Immunol.145:1706-1712,1990;Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,1991;Bertagnolli,et al.,J.Immunol .149:3778-3783,1992;Bowman et al.,J.Immunol.152:1756-1761,1994 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン生成および／または増殖に関するアッセイは、 Polyclonal T cell stimulation，Kruisbeek,A.M.and Shevach,E.M.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.3.12.1-3.12.14,John Wiley and Sons,Toronto.1994;and Measurement of mouse and human Interfer on γ，Schreiber,R.D.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.6.8.1-6.8.8,John Wiley and Sons,Toronto.1994 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。造血およびリンパ生成細胞の増殖および分化についてのアッセイは、 Measurcmcnt of Human and Muine Interleukin 2 and Interleukin 4,Bottomly, K.,Davis,L.S.and Lipsky,P.E.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.C oligan eds.Vol 1 pp.6.3.1-6.3.12,John Wiley and Sons,Toronto.1991;deVrie s et al.,J.Exp.Med.173:1205-1211,1991;Moreau et al., Nature 336:690-692,1988;Green berger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80: 2931-2938,1983;Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan,R.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1 pp.6.6.1-6.6.5 ,John Wiley and Sons,Toronto.1991;Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83:1857-1861,1986;Measurement of human Interleukin 11-Bennett,F.,Giannot ti,J.,Clark,S.C.and Tumer,K.J.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a .Coligan eds.Vol 1 pp.6.15.1 John Wiley and Sons,Toronto.1991;Measurem ent of mouse and humman Interleukin9-Ciarletta,A.,Giannotti,J.,Clark,S.C .and Turner,K.J．In Current Protocols In Immunology.J.E.c.a.Coliga neds. Vol 1pp.6.13.1,John Wiley and Sons,Toronto.1991 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。抗原に対するＴ細胞クローンの応答についてのアッセイ（特に、増殖およびサイトカイン産生を測定することによりＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用ならびに直接的なＴ細胞の効果を同定する）は、 Current Protocols in Immnunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Mar gulies,E.M.Shevach,W Strobcr,Pub.Greene Publishing Associatcs and Wiley- Interscience(Chapter3,In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function;Chapt er 6,Cytokines and their cellular receptors;Chapter 7,Immunlogic studies in Humans);Weinberger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci．USA 77:6091-6095,1980; Weinberger et al.,Eur.J.Immun.11:405-411,1981;Takai et al.,J.Immunol.137 :3494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512，1988 に記載されたものを包含するが、これらに限らない。免疫刺激または抑制活性また本発明蛋白は、本明細書記載のアッセイにおける活性（これらに限らない）を包含する免疫刺激または免疫抑制活性を示すものであってもよい。蛋印ま、種々の欠乏症および障害（重症の免疫欠乏合併症（ＳＣＩＤ）を包含）において有用である可能性があり、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の増殖をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることにおいて、ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性を有効ならしめることにおいて有用でありうる。これらの免疫欠乏症は遺伝的なものであってもよく、またウイルス（例えば、ＨＩＶ）ならびに細菌または真菌感染により引き起こされるものであってもよく、あるいは自己免疫疾患により引き起こされるものであってもよい。より詳細には、ウイルス、細菌、真菌または他の感染物質により引き起こされる感染性疾患、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、レシュマニア、マラリアおよびカンジダ種のごとき種々の真菌感染症を、本発明蛋白を用いて治療可能である。もちろん、この点において、免疫系に対するブーストが指示される場合、すなわち、癌の治療において、本発明蛋白を用いてよい。本発明蛋白を用いて治療してもよい自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、Guilla in-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本発明のかかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応および症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）および関連呼吸器系の問題を包含）を本発明蛋白を用いて治療してもよい。免疫抑制が望まれる他の状態（例えば、器官移植を包含）を、本発明蛋白を用いて治療してもよい。本発明蛋白を用いて、多くのやり方で免疫応答を可能にすることもできる。ダウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形態のものであってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むものであってもよい。Ｔ細胞応答を抑制することにより、あるいはＴ細胞中に特異的な耐性を誘導することにより、あるいはその両方により活性化Ｔ細胞の機能を阻害してもよい。一般的には、Ｔ細胞応答の免疫抑制は活性のある、非抗原特異的なプロセスであり、Ｔ細胞を抑制剤に連続的に曝露することを必要とする。耐性とは、Ｔ細胞における非応答性またはアネルギーを意味し、一般的には抗原特異的であり耐性化剤への曝露を止めた後も持続するという点で免疫抑制とは異なる。操作上は、耐性化剤の不存在下で特異的抗原に曝露した際のＴ細胞応答の欠如により耐性が示されうる。１またはそれ以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えばＢ７のごとき）を包含するが、これに限らない）をダウンレギュレーションすることまたは妨害すること、例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成の妨害は、組織、皮膚および器官の移植および対宿主移植片疾患（ＧＶＨＤ）において有用であろう。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは組織移植における組織破壊を減少させるはずである。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶反応は、組織片がＴ細胞により外来のものと認識されることにより開始され、次いで、移植片を破壊する免疫反応が起こる。免疫細胞上でのＢ７リンパ球抗原とその本来的なリガンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子（別のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）の活性を有するモノマー形態のペプチドと混合された、あるいは単独の、Ｂ７−２活性を有する可溶性でモノマー形態のペプチド）の移植前の投与は、応答的な同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞上の本来のリガンドへの分子の結合を誘導する可能性がある。この点においてＢリンパ球抗原機能をブロックすることは、Ｔ細胞のごとき免疫細胞によるサイトカイン合成を妨害し、かくして、免疫抑制剤として作用する。そのうえ、同時刺激の欠如はＴ細胞の反応を失わせるのに十分でありうる。Ｂリンパ球抗原ブロッキング試薬による長期の耐性の誘導により、これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の必要性が回避されうる。対象において十分な免疫抑制または耐性を達成するためには、Ｂリンパ球抗原の組み合わせの機能をブロックすることも必要かもしれない。器官移植拒絶反応またはＧＶＨＤを妨害することにおける個々のブロッキング試薬の有効性を、ヒトにおける有効性を推定しうる動物モデルを用いて評価することができる。使用可能な適当な系の例は、ラットにおける同種心臓移植片およびマウスにおける異種膵臓島細胞移植片を包含し、それらは両方ともインビボでのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白の免疫抑制効果を試験するために使用された(Lenscho w et al.，Science 257:789-792(1992)およびTurka et al.，Proc Natl．Acad． Sci．USA，89:11102-11105(1992)に記載されている)。さらに、ＧＶＨＤのネズミモデル(Pauled.，Fundamental Immunology，Ravan Press，New York，1989，p p.846-847参照)を用いて、インビボでの当該疾患の進行に対するＢリンパ球抗原機能のブロッキング効果を決定することができる。また、抗原機能をブロックすることは自己免疫疾患の治療にとり治療的に有用でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾病の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適当な活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化を妨害することは疾病の徴候を減少または除去しうる。Ｂリンパ球抗原の受容体：リガンド相互作用を破壊することによりＴ細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与を用いてＴ細胞活性化を阻害し、疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはＴ細胞由来のサイトカインの産生を妨害することができる。さらに、ブロッキング試薬は、疾病の長期の寛解を導く可能性のある自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的耐性を誘導しうる。自己免疫疾患の予防または改善におけるブロッキング試薬の有効性を、ヒトの自己免疫疾患についての十分に特徴づけられた多くの動物モデルを用いて決定することができる。例は、ネズミの実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ１ｐｒ／１ｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性深在性エリトマトーデス、ネズミ自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、およびネズミの実験的重症筋無力症（Paul ed.，Fundamental Immunology，Raven Press，N ew York，1989，pp.840-856）を包含する。免疫応答をアップレギュレーションするための手段としての抗原機能(好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能)のアップレギュレーションは治療に有用でもある。免疫応答のアップレギュレーションは存在している免疫応答を促進する形態または最初の免疫応答を除去する形態であってよい。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を刺激することによる免疫応答の促進は、ウイルス感染の場合に有用でありうる。さらに、インフルエンザ、通常のかぜ、および脳炎のごとき全身的なウイルス性疾患を、刺激性形態のＢリンパ球抗原を全身投与することにより改善してもよい。別法として、Ｔ細胞を患者から取り、本発明ペプチドを発現するＡＣＰｓを付加したウイルス抗原とともにインビトロにおいてＴ細胞を同時刺激するか、または刺激性形態の本発明可溶性ペプチドと一緒にし、次いで、インビトロで活性化されたＴ細胞を患者体内に再導入することにより、感染患者における抗ウイルス免疫応答を促進してもよい。抗ウイルス免疫応答を促進するもう１つの方法は、感染細胞を患者から取り、本明細書記載の本発明蛋白をコードする核酸をそれらにトランスフェクションして細胞がその表面に蛋白全体または一部を発現するようにし、次いで、トランスフェクション細胞を患者体内に再導入することであろう。すると、感染細胞はインビボにおいて同時刺激シグナルをＴ細胞に伝えることができ、そのことによりＴ細胞を活性化することができよう。もう１つの適用例において、抗原機能(好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能)のアップレギュレーションまたは促進は腫瘍免疫性の誘導において有用でありうる。本発明の少なくとも１種のペプチドをコードする核酸でトランスフェクションされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫）を対象に投与して対象中の腫瘍特異的耐性を克服することができる。所望ならば、腫瘍細胞をトランスフェクションしてペプチドの組み合わせを発現させることができる。例えば、患者から得た腫瘍細胞を、Ｂ７−２様活性を有するペプチドのみ、またはＢ７−１様活性および／またはＢ７−３様活性を有するペプチドと組み合わせて発現することを指令する発現ベクターで、エクスビボにおいてトランスフェクションすることができる。トランスフェクションされた腫瘍細胞を患者に戻して、トランスフェクションされた細胞の表面上にペプチドを発現させる。別法として、遺伝子治療法を用いてインビボでのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的化することができる。腫瘍細胞表面上におけるＢリンパ球抗原の活性を有する本発明ペプチドの存在は、Ｔ細胞に必要な同時刺激シグナルを提供して、Ｔ細胞により媒介されるトランスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠く腫瘍細胞、あるいは十分量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現できない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白およびβ₂マイクログロブリン蛋白またはＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白の全体または一部（例えば、末端切断蛋白の細胞質ドメイン）をコードしている核酸でトランスフェクションして、そのことによりクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ蛋白を細胞表面上に発現させることができる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと組み合わせた適当なクラスＩまたはクラスＩＩＨＭＣの発現は、Ｔ細胞により媒介されるトランスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。所望により、不変鎖のごとき、ＭＨＣクラスＩＩ結合蛋白の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードしている遺伝子を、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードしているＤＮＡとともに同時トランスフェクションして腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘導こともできる。よって、ヒト対象におけるＴ細胞により媒介される免疫応答の誘導は、対象における腫瘍特異的耐性を克服するに十分でありうる。本発明蛋白の活性を、特に、下記方法により測定してもよい：胸腺細胞または脾臓細胞の細胞毒性に適したアッセイは、 Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Marg ulics,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-I nterscience(Chapter 3,In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function3.1-3. 19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Herrmann et al.,Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 78:2488-2492,1981;Hermmann et al.,J．Immunol.128:1968-1974,19 82;Handa et al.,J.Immunol．135:1564-1572，1985;Takai et al.,J.Immunol.13 7:3494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512，1988;Herrmnann et a l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2488-2492,1981,Hemnarm et al.,J．Immunol.12 8:1968-1974,1982;Handa et al.,J.Immunol.135:1564-1572,1985;Takai et al., J.Immunol.137:3494-3500,1986:Bowmanet al.,J.Virology 61:1992-1998;Takai et al.,J.Immunol．140:508-512，1988;Bertagnolli et al.,Cellular Immunolo gy 133:327-341，1991;Brown et al.,J.Immunol.153:3079-3092，1994に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびイソタイプスイッチングのためのアッセイ（特に、Ｔ細胞依存性抗体応答を転調させ、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響する蛋白を同定する）は、Maliazewski,J.Immunol.144:3028-3033,1990に記載されているアッセイを包含するが、これに限らず、さらにＢ細胞の機能のアッセイは、In vitro antibody production,Mond,J.J.and Brunswick,M.In Current Protocols in Immunology J.E.Coligan eds.Val 1 pp.3.8.1-3.8.16,John Wile y and Sons,Tronto 1994に記載のアッセイを包含する。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（特に、主としてＴｈ１およひＣＴＬ応答を発生させる蛋白を同定する）は、 Current Protocols in Immunology,Ed byJ.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margu lics,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-In terscience(Chapter 3,In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3. 19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Takai et al.,J.Immunol.137:3 494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512，1988;Bertagnolli et al .,J.Immunol.149:3778-3783,1992 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。樹枝状細胞依存的アッセイ（特に、無処理のＴ細胞を活性化する樹枝状細胞により発現される蛋白を同定する）は、 Guery et al.,J.Immunol.134:536-544,1995;Inaba et al.,Journal of Experime ntal Medicine 173:549-559,1991;Macatonia et al.,Joumal of Immunology 154 :5071-5079,1995;Porgador et al.,Joumal of Experimental Medicine 182:255- 260,1995;Nair et al.,Jounlal of Virology 67:4062-4069,1993;Huang et al., Science 264:961-965,1994;Macatonia et al.,Joumal of Experimental Medici ne 169:1255-1264,1989;Bhardwajctal.,Journal of Clinical Invcstigation 94 :797-807,1994;and Inaba et al.,Journal of Experimental Medicine 172:631 -640,1990 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（特に、超抗体誘導後のアポトーシスを防止する蛋白、ならびにリンパ球のホメオスタシスを調節する蛋白を同定する）は、Darzynkiewicz et al.,Cytometry 13:795-808,1992;Gorczyca et al.,Leu kemia 7:659-670,1993;Gorczyca et al.,Cancer Research 53:1945-1951,1993;I toh et al.,Cell 66:233-243,1991;Zacharchuk,Joumal of Immunology 145:4037 -4045,1990;Zamai et al.,Cytometry 14:891-897,1993;Gorczyca et al.,Intern ational Joumal of Oncology 1:639-648,1992 に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。初期段階のＴ細胞のコミットメント(commitment)および発達のアッセイは、An tica et al.,Blood 84:111-117,1994;Fine et al.,Cellular Immunology 155:11 1-122,1994;Galy et al.,Blood 85:2770-2778,1995;Toki et al.,Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 88:7548-7551,1991に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。造血調節活性本発明蛋白は、造血の調節において有用であり、それゆえ、骨髄およびリンパ球欠乏症の治療において有用である。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系を支持する最低限の生物学的活性でさえも、造血の調節への関与を示している。例えば、赤血球系前駆細胞のみの増殖を支持すること、あるいは他のサイトカインと組み合わされて、例えば種々の貧血の治療に有用性を示すこと、あるいは放射線療法／化学療法と組み合わされて赤芽前駆細胞および／または赤芽細胞の産生を刺激すること;顆粒球のごとき骨髄細胞および単球／マクロファージの増殖を支持すること(すなわち、伝統的なＣＳＦ活性)、例えば、化学療法と組み合わされて、引き続き起こる骨髄抑制を防止することに有用であり；巨核細胞の増殖、次いで、血小板の増殖を支持すること、またそれにより血小板減少症のごとき種々の血小板疾患を予防または治療することに有用であり、また一般的には血小板輸液の代わりにあるいはそれと相補的に使用され；さらに／あるいは造血幹細胞（成熟して上記のすべての造血細胞となり、それゆえ、種々の幹細胞疾患（通常には、移植により治療される疾患であり、例えば、再生不良性貧血および発作性ヘモグロビン尿症）において有用性がわかる）の増殖を支持することに有用であり、さらにはインビボまたはエクスビボでの放射線／化学療法後（すなわち、骨髄移植と組み合わされる）、あるいは遺伝子治療のために遺伝子操作された後の幹細胞コンパートメントの正常細胞としての再増殖においても有用である。本発明蛋白の活性を、特に、下記方法測定してもよい。種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイはすでに引用されている。胚の幹細胞の分化のアッセイ（特に、胚の分化造血に影響する蛋白を同定する）は、Johansson et al.Cellular Biology 15:141-151,1995;Keller et al.,Mol ecular and Cellular Biology 13:473-486,1993;McClanahan et al.,Blood81:29 03-2915,1993に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。幹細胞生存および分化のアッセイ（特に、リンパー造血を調節する蛋白を同定する）は、 Methylcellulose colony forming assays,Freshney,M.G.In Culture of Hematop oietic Cells.R.I. Freshtey,et al.eds.Vol pp.265-268,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.1994;Himy ama et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5907-5911,1992;Primitive hematopoie tic colony forming cells with high proliferative potential,McNiece,I.K.a nd Briddell,R.A.In Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Frecshney,et al ed s.Vol pp.23-39,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.1994;Neben et al.,Experiment al Hematology 22:353-359,1994;Cobblestone area forming cell assay,Ploema cher,R.E.In Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp .1-21,Wiley-Liss,Inc..,New York,NY.1994:Long term bone marrow cultures i n the presence of stromal cells,Spooncer,E.,Dexter,M.and Allen,T.In Cult ure of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.163-179,Wiley- Liss,Inc.,New York,NY.1994;Long term culture initiating cell assay,Suthe rland,H.J.In Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.139-162,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.1994 に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。研究用途および有用性本発明により提供されるポリヌクレオチドは、研究集団によって種々の目的に使用されうる。分析用に、特徴づけまたは治療用途に、対応蛋白が優先的に発現される(構成的に、または組織分化もしくは発達の特定段階において、または疾病状態において発現される)組織のマーカーとして、さらにはサザンゲルの分子量マーカーとして、染色体の同定または関連遺伝子位置のマッピングのための染色体マーカーまたはタグとして（標識された場合）、患者の内在性ＤＮＡと比較して潜在的な遺伝病の同定を行うために、ハイブリダイゼーションするプローブとして用いて新規な関連ＤＮＡ配列を発見するために、遺伝学的フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを得るための情報源として、他の新規ポリヌクレオチドを発見するプロセスにおいて既知配列を「差し引く」ためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に結合させるためにオリゴマーを選択し作成するために、発現パターンの試験のために、ＤＮＡ免疫法を用いて抗蛋白抗体を生成させるために、ならびに抗ＤＮＡ抗体を生成させ、あるいはさらなる免疫応答を誘導するための抗原として、ポリヌクレオチドを使用することができる。別の蛋白に結合または潜在的に結合（例えば、受容体−リガンド相互作用におけるように）する蛋白をコードしている場合、結合する他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するための相互作用トラップアッセイ（例えば、Gyuris et al.，C ell 75:791-803(1993)に記載されたような）においてポリヌクレオチドを使用することができる。本発明により提供される蛋白は、高処理量スクリーニングのための一群の多数の蛋白を含む、生物学的活性を決定するためのアッセイに；抗体の生成または他の免疫応答を誘導するために；生物学的液体中の蛋白（またはその受容体）のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識試薬を包含）として；対応蛋白が優先的に発現される（構成的に、または組織分化もしくは発達の特定段階において、または疾病状態において発現される）組織のマーカーとして；ならびに、もちろん関連受容体またはリガンドを単離するために用いてもよい。蛋白がもう１つの蛋白に結合または潜在的に結合する場合、結合する他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するために蛋白を使用することができる。これらの結合相互作用に関与する蛋白を用いて、結合相互作用に関するペプチドまたは小型分子状阻害剤またはアゴニストのスクリーニングを行うこともできる。これらの研究用途のいずれかまたはすべては、研究用製品として商品化するために試薬グレードまたはキットのフォーマットへと発展させることができる。上記使用を実行するための方法は当業者によく知られている。かかる方法を開示する文献は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，2nd ed.，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T．Maniatis e ds.,1989，および"Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techni ques"，Academic Press，Berger，S.L．and A.R．Kimmel eds.，1987を包含するが、これらに限らない。栄養としての用途本発明ポリヌクレオチドおよび蛋白を栄養源または添加物として使用することができる。かかる用途は、蛋白またはアミノ酸添加物としての用途、炭素源としての用途、窒素源としての用途および炭水化物源としての用途を包含するが、これらに限らない。かかる場合、本発明蛋白またはポリヌクレオチドを特定の生物のエサとして添加してもよく、あるいは粉末、ピル、溶液、懸濁液またはカプセルの形態のごとき別個の個体または液体調合物として投与することもできる。微生物の場合、微生物が培養される培地に本発明蛋白またはポリヌクレオチドを添加することができる。本発明Ｕ４蛋白を用いて動物を免疫して、Ｕ４蛋白と特異的に反応でき、受容体へのリガンドの結合を阻害することのできるポリクーナルおよびモノクローナル抗体を得てもよい。Ｕ４全体を免疫原として用いて、あるいはＵ４のフラグメントを用いることにより、かかる抗体を得てもよい。Ｕ４の小型フラグメントを用いて動物を免疫してもよい。さらに、ペプチド性免疫原はカルボキシル末端にシステイン残基を含んでいてもよく、キーホルリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のごときハプテンと抱合される。チロシン残基を硫酸化チロシン残基に置き換えることにより、さらなるペプチド性免疫原を得てもよい。かかるペプチドの合成方法は当該分野において知られており、例えば、R.P.Merrifield,J.Amer.Chem .Soc.85,2149-2154(1963);J.L.Krstenansky，et al.，FEBS Lett．211，10(1987 )にある。Ｕ４蛋白に結合する中和または非中和抗体（好ましくはモノクローナル抗体）もまた、ある種の腫瘍の有用な治療剤となる可能性があり、さらに上記症状の治療において有用な治療剤となる可能性がある。これらの中和モノクローナル抗体は、Ｕ４受容体鎖へのリガンド結合をブロックしうる。実施例Ｕ４蛋白の発現全長のネズミＵ４蛋白をコードするＤＮＡを、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコードするスペーサー配列にＰＣＲにより融合させ、ついで、ＣＯＳ−１発現ベクターｐＥＤ．Ｆｃ中のヒトＩｇＧ１のヒンジＣＨ２、ＣＨ３領域をコードする配列に、フレームを合わせて連結した。ＤＮＡをＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、蛋白のＩｇＧ１部分を検出する抗体を用いるＥＬＩＳＡにより、融合蛋白の発現を検出した。これにより、ＣＯＳ細胞における蛋白の発現および分泌が可能であることが示された。本明細書に引用した特許および文献を、参照により全体が本明細書に記載されているものとみなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者コリンズ，メアリーアメリカ合衆国01760マサチューセッツ州ナティック、ユークリッド・アベニュー27 番 (72)発明者ネベン，タムリンアメリカ合衆国01720マサチューセッツ州アクトン、ダガン・ロード13番 (72)発明者ホイッターズ，マシューアメリカ合衆国01749マサチューセッツ州ハドンズ、ビナル・ストリート９番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：４のヌクレオチド２４２からヌクレオチド１３９６までのヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：６のヌクレオチド７１からヌクレオチド１２２５までのヌクレオチド配列；（ｃ）遺伝学的コードの縮重の結果として（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチド配列とは異なっているヌクレオチド配列；（ｄ）厳密な条件下で（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションしうるヌクレオチド配列；（ｅ）（ａ）または（ｂ）に示す配列の種相同体をコードするヌクレオチド配列；および（ｆ）（ａ）または（ｂ）に示すヌクレオチド配列の対立遺伝子変種からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。２．該ヌクレオチド配列がＵ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリー鎖の生物学的活性を有する蛋白をコードするものである請求項１のポリヌクレオチド。３．該ヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に連結されている請求項１のポリヌクレオチド。４．配列番号：４のヌクレオチド１２２からヌクレオチド１３９６までのヌクレオチド配列を含む請求項１のポリヌクレオチド。５．配列番号：６のヌクレオチド１１からヌクレオチド１２２５までのヌクレオチド配列を含む請求項１のポリヌクレオチド。６．請求項３のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。７．該細胞が哺乳動物細胞である請求項６の宿主細胞。８．（ａ）適当な培地中で請求項６の宿主細胞の培養物を増殖させ、ついで（ｂ）培養物からＵ４蛋白を精製することを含む、Ｕ４蛋白の製造方法。９．（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までのアミノ酸配列；および（ｅ）Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーの鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｄ）のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離Ｕ４蛋白。１０．配列番号：５のアミノ酸配列を含む請求項９の蛋白。１１．配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までの配列を含む請求項９の蛋白。１２．配列番号：７のアミノ酸配列を含む請求項９の蛋白。１３．配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までの配列を含む請求項９の蛋白。１４．請求項９の蛋白および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。１５．請求項８の方法により製造される蛋白。１６．請求項９の蛋白と特異的に反応する抗体を含む組成物。１７．（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸４１から４２５までのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号：７のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：７のアミノ酸２４から４０８までのアミノ酸配列；および（ｅ）Ｕ４ヘマトポイエチン受容体スーパーファミリーの鎖の生物学的活性を有する（ａ）〜（ｄ）のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドまたは蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。１８．該アミノ酸配列が融合蛋白の一部である請求項９の蛋白。１９．Ｆｃフラグメントを含む請求項１８の蛋白。