BRPI9906426B1

BRPI9906426B1 - Composição líquida e em pó, e, usos das composições

Info

Publication number: BRPI9906426B1
Application number: BRPI9906426-0A
Authority: BR
Inventors: Alain Sabatier; Neville Marshall Fish; Nigel Paterson Haigh
Original assignee: Adisseo France Sas
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-06
Publication date: 2015-08-18
Also published as: EP0976838A1; AU769386B2; AR019272A1; DK1007743T3; UA77381C2; EP1007743A2; EP1007743B1; JP2002513595A; KR100877086B1; CN1321178C; KR100856364B1; US6534101B1; ZA200000075B; ES2335721T3; BR9906426A; WO1999057325A3; CA2295570C; KR20070105387A; US7374925B2; US8043844B2

Description

"COMPOSIÇÃO LÍQUIDA E EM PÓ, E, USOS DAS COMPOSIÇÕES" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições de mistura de enzimas, sua preparação e seu uso na indústria de ração, alimento e outras indústrias, incluindo, mas não limitadas à indústria de papel e à indústria têxtil.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Enzimas são usadas há muito tempo para várias diferentes aplicações industriais. Exemplos são conhecidos na indústria de panificação, na indústria de vinhos e sucos de fruta (onde as enzimas são usadas para romper pectinas e β-glucanos), na indústria têxtil (onde celulases são usadas para obter tecidos celulósicos lisos e macios) e também, que não é a aplicação menos importante, para ração animal. Neste caso, as enzimas melhoram a digestibilidade de fontes vegetais.

Esta última possibilita aos animais de criação digerir a ração mais eficazmente. O valor de uma ração pode ser medido por FCR (Relação de Conversão de Ração), uma relação nutritiva da quantidade de ração consumida relativa ao ganho de peso do animal. Um decréscimo em FCR, para uma ração, indica que o animal ganha proporcionalmente mais peso para uma quantidade dada de ração; isto é, o animal é capaz de utilizar a ração mais eficazmente.

Digestibilidade fraca dos componentes da ração (amido, gordura, proteína/aminoácidos) é um aspecto observado de rações baseadas em cereais, particularmente as que contêm um teor em trigo ou cevada alto.

Nestes casos, pode ser necessário formular a ração para conter níveis mais altos de energia de outras fontes e outros suplementos como aminoácidos. Estas enzimas aumentam o valor da Energia Metabolizável Aparente dos cereais incorporados na ração.

Outra abordagem para resolver este problema é adicionar suplementos enzimáticos, celulases, endo-1,3(4)-P-glucanases, endo-l,4^-xilanases (xilanases) etc., ou misturas de atividades enzimáticas, nestas rações baseadas em cereais. Suplementos enzimáticos podem ter um uso específico para hidrolisar os β-glucanos, ou para hidrolisar os arabinoxilanos, encontrados nos cereais (tipicamente, cevada e trigo). A adição de enzimas tem objetivos diferentes. Uma vantagem que prova claramente a eficácia de suplementos enzimáticos na ração é a redução na viscosidade de materiais no intestino dos animais que recebem ração baseada em cereais contendo o suplemento enzimático apropriado. A viscosidade mais alta é devido, em parte, a β-glucanos e arabinoxilanos encontrados na cevada e no trigo. A viscosidade mais baixa, resultante de ação enzimática, permite uma absorção mais fácil de componentes nutricionais no intestino de animais. A outra vantagem é a liberação de nutrientes aprisionados pelas paredes de células dos cereais, diminuindo o requisito de outros suplementos de ração mais caros. No total, o resultado é uma redução significativa no custo da ração com um efeito similar ou benéfico, como medido por FCR.

Descrevem-se preparações de enzimas originadas de uma faixa de microorganismos diferentes para melhorar a digestibilidade de ração.

Se os requerentes considerarem a arte anterior relacionada ao uso de enzimas na ração animal, pode ser mencionada a patente européia n2 0.699.762 que descreve o uso de uma fitase emitida de Schwanniomyces occidentalis. Esta fitase é uma fitase obtida de organismo modificado geneticamente obtido incluindo gene clonado que os requerentes gostariam de evitar na presente invenção.

Se os requerentes considerarem o pedido de patente WO 95/26398, novamente uma celulase modificada é obtida por inclusão de sequência de DNA estranho em uma célula hospedeira que modifica a natureza da cepa original que é selecionada na seguinte relação de microorganismos: Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Schizosaccharomvces, Aspergillus. Na presente invenção, o principal objetivo dos requerentes foi evitar a inclusão de gene estranho no microorganismo que é o produtor da enzima.

No pedido de patente WO 96/05739, uma mistura de enzimas (xilanase, protease e, opcionalmente, β-glucanase) é obtida de diferentes microorganismos. Os autores dão exemplo (página 5) de mistura de enzimas com uma relação da atividade de xilanase para atividade de β-glucanase da ordem de 1:5. Verificou-se que quando uma xilanase é incluída em uma dieta baseada em cereais em ou próximo de seu nível de dosagem ótima, a co-presença de enzimas possuindo atividade de β-glucanase aumenta a FCR da ração o que é, de fato, desvantajoso. Consequentemente, os autores advertem contra a presença de β-glucanase, eles recomendam a relação máxima da atividade de xilanase para atividade de β-glucanase de 1:0 - 0,25.

Em alguns casos, a fim de assegurar que todas as atividades enzimáticas relevantes na aplicação de ração estejam presentes, preparações são feitas a partir de preparações de mais do que um microorganismo. Em um número de casos, as preparações de enzima são obtidas de microorganismos submetidos a modificação genética usando técnicas de DNA recombinante.

Os requerentes descobriram e revelaram um novo microorganismo pertencente à classe de Penicillium funiculosum, que contém novas enzimas e uma mistura de atividades enzimáticas que podem ser usadas com sucesso para aumentar principalmente a digestibilidade de rações animais baseadas em cereais.

SUMÁRIO DA INVENCÀO

Consequentemente, a presente invenção se refere a um novo microorganismo derivado de Penicillium funiculosum e a um processo para cultivar estes microorganismo e para recuperar as enzimas produzidas por este microorganismo.

Além disso, de acordo com esta invenção, provê-se novas enzimas emitidas deste microorganismo, sequências de ácido nucleico das mesmas e novas composições contendo estas enzimas.

Além disso, de acordo com esta invenção, é provido um processo para melhorar a digestibilidade de aminoácidos e aminoácidos e rações animais baseadas em cereais.

Outro objeto da presente invenção é a redução de excreção de fósforo e excreção de amônia da batería onde os animais são alimentados. DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO A. A nova cepa Penicillium funiculosum Esta nova cepa do fungo Penicillium funiculosum é depositada sob o número MI 378536 em uma autoridade depositária internacional reconhecida no Tratado de Budapeste (1977). o International Mycological Institute (IMI), Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TW20 9TY, Reino Unido.

Genealogia A nova cepa é obtida de Penicillium funiculosum IMI 134756 após tratamento sucessivo com UV e β-irradiações de esporos, incluindo triagem no meio seletivo. Nenhuma modificação genética é obtida por técnicas de DNA recombinante usando inclusão de DNA ou RNA estranho. Identificação e tipagem Penicillium funiculosum IMI 378536 é caracterizado por crescimento em agar Czapek Dox a 25°C. Características de colônia e micromorfologia são típicos de Penicillium funiculosum. A identificação do microorganismo como um Penicillium funiculosum é confirmada no International Mycological Institute, Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TW20 9TY, Reino Unido. O crescimento é como um feltro basal rígido, com crescimento aéreo, como cordas ou feixes de hifas (funiculose), micélio é branco com coloração vermelha subjacente no substrato, as margens são pálidas reversas, mas coloridas de vermelho em direção aos centros e podem tomar-se vermelho escuro. Este penicílio é típico, mostra conidioforos curtos na maioria surgindo de células conidiogenosas de funículos, biverticilatos, acerose, conídias são elípticas e lisas. O microorganismo usado para a produção da preparação de enzimas desta invenção cresce sob condições aeróbicas em um meio que contém celulose, licor de maceração de milho, carbonato de cálcio e sulfato de amônio. B. Processo de fermentação Estes novo fungo é fabricado por fermentação da cepa depositada primeiro em um meio de semente, preferivelmente constituído de (em peso): - licor de maceração de milho 1 a 4% - antiespumante exatamente para evitar espuma -água a 100% - NaOH suficiente para ajustar o pH a cerca de pH 3,0 a 6,0, antes de esterilização do meio;

Temperatura de incubação 27°C a 36°C. O meio de produção tem preferivelmente a seguinte constituição (em peso): - licor de maceração de milho 0 a 4,0% - celulose em batelada e alimentada 0,8 a 14% - Sal de Ca 0 a 0,8% - Sulfato de amônio 0 a 1,0% - Antiespumante exatamente para evitar espuma - Água suficiente para obter 100% - NaOH suficiente para ajustar o pH a cerca de pH 3,0 a 6,0, antes de esterilização do meio - H2S04 suficiente para manter o pH a cerca de 3,0 a 6,0; - Amônia como gás ou líquido suficiente para manter o pH a cerca de pH 3,0 a 6,0;

Temperatura de incubação 27°C a 36°C.

Para a fermentação, carregar o fermentador com água suficiente, adicionar os ingredientes à água em recipiente agitado apropriado, agitar até os ingredientes terem se dissolvido. Esterilizar, selando o fermentador e aumentando o teor para tipicamente 121°C. O vaso de fermentação é inoculado com o fermentador de semente. A fonte principal de carbono que é adicionada durante o processo de fermentação é celulose; dentre as diferentes fontes de celulose, os requerentes preferem usar ARBOCEL, SOLKAFLOC, CLAROCEL, ALPHACEL, FIBRACEL com graus diferentes. O pH, durante a fermentação, é preferivelmente controlado pela adição de ácido sulfurico, ou outro ácido, e amônia na forma de gás ou liquido, ou outra base.

Ao término do período de fermentação, sólidos eliminados por separação líquido-sólido como filtragem ou centrifugação, coletar a fase líquida e concentrar, por exemplo, por ultrafiltragem na membrana orgânica ou mineral.

Estas enzimas também podem ser fabricadas por meio de tecnologia de DNA recombinante e, assim, ser produzidas por espécies homólogas recombinantes ou espécies heterólogas. O hospedeiro para a transferência do gene codificando a enzima pode ser selecionado dentre uma espécie fímgica, uma célula bacteriana ou uma célula de planta. Qualquer técnica convencional pode ser usada para inserir o gene codificando a enzima de interesse na célula hospedeira como plasmídeos (integrativos ou não), vetores de fago e vetores virais. O Penicillium funiculosum compreendendo genes heterólogos de modificação ou inclusão do genoma com genes homólogos por inclusão, deleção ou modificação de referido gene homólogo fazem também parte desta invenção.

De acordo com a invenção, a enzima pode ser provida como uma preparação de enzimas pura isolada ou como uma preparação em bruto como o meio de cultivo em que Penicillium funiculosum cresce.

Pode ser também possível incluir esta ou outras enzimas em composições contendo uma outra enzima, o tipo da qual dependendo do uso pretendido da composição. As enzimas adicionadas podem ser selecionadas de, por exemplo, carboidrases, lipases e proteases. C. Composições da “mistura de atividades enzimáticas” 1. Composição líquida Para composição líquida, após adição de agentes antimicrobianos, medição da concentração de enzimas e diluição correta para produzir resistência é realizada. A composição preferida da solução líquida, em peso, é a seguinte: - Produtos microbianos como sólidos orgânicos totais 4% -10% - agente antimicrobiano 0,005-0, 35% preferencialmente 0,01 -0,25% - sorbitol 20% - 50% - eventualmente agentes anti- congelamento 0-40% mais preferivelmente 15% - 40% - aldo de fermentação filtrado concentrado 0,3 a 76% - Tamponado e ajustado em pH 3 a 5 Antimicrobianos são selecionados dentre produtos como ácido sórbico e sais, ácido benzóico e sais, 4-hidroxibenzoato de metila e 4-hidroxibenzoato de n-propila, ácido fumárico, sais e ésteres. Sais como cloreto de sódio ou cloreto de potássio também podem ser usados.

Os agentes anti-congelamento mais preferidos são 1,2-propandiol, etileno glicol, glicerol. 2. Composição em pó Para preparações em pó, a solução concentrada obtida é secada com eventualmente a presença de um veículo. O pó obtido após secagem da solução concentrada, na ausência de um veículo, pode ser ainda misturado com um veículo apropriado. A composição da forma em pó preferida é a seguinte: - Produtos microbianos como sólidos orgânicos totais 16% - 40% - Veículo 59% - 83% - outros componentes do caldo de fermentação secado 1% Veículos preferidos são selecionados de farinha de trigo, amido, gesso, maltodextrina, sólidos de milho, subprodutos do processamento de cereal como grânulos de milho, produtos inferiores de trigo, farelo de trigo, restos de centeio, mistura de minerais. D. Enzimas características Os requerentes obtêm uma nova mistura de enzimas produzidas por Penicillium funiculosum. Esta mistura de enzimas contém novas enzimas como celulases, β-glucanases, xilanases, enzimas acessório xilanase como arabinofuranosidase e esterases de feruloila. 1. Procedimento A preparação de enzimas é caracterizada por testes que incluem testes para atividades de celulase, celobio-hidrolase, β-glucosidase, endo-l,3(4)^-glucanase, laminarinase endo-1,4-^-xilanase (usando substratos diferentes), β-xilosidase, arabinofuranosidase e esterases de feruloila (usando substratos diferentes).

1.1 Celulase pelo processo DNS CMC O teste para atividade de celulase é baseado na hidrólise enzimática das ligações glicosídicas em carboximetilcelulose (CMC), um β-1,4 glucano. Os produtos da reação, oligossacarídeos β-1,4 glucano, são determinados pelo aumento resultante no valor de redução (como glucose).

Uma solução contendo 1 ml de uma solução de CMC a 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 (ou em valores de pH diferentes); 1 ml da solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 10 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 2 ml de uma solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS (1% (p/v), hidróxido de sódio 1,6% (p/v), (+)-tartrato de sódio potássio 30% (p/v) em água destilada). A solução é misturada e colocada em um banho de água em ebulição, mínimo de 95°C, durante 5 minutos, depois resfriada para 25°C. Dez ml de água destilada são adicionados à solução e a absorbância é medida em 540 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 2 cm. O resultado é convertido em pmoles de açúcar de redução (como glucose) por comparação com uma curva padrão para 2 ml soluções de glucose a 0,00 - 0,04% (p/v) tratada com solução de DNS de um modo equivalente. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de DNS é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de celulase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de equivalentes.min'1 de glucose nas condições do teste (50°C e pH 5,0 ou outro pH). 1.2 - Celobio-hidrolase pelo processo de β-D-celobiopiranosídeo p-nitrofenial O teste de celobio-hidrolase é baseado na hidrólise enzimática de β-D-celobio-piranosídeo p-nitrofenila. Um produto da reação, p-nitrofenol é determinado colorimetricamente.

Uma solução contendo 1 ml de um β-D-celobio-piranosídeo p-nitrofenila em água destilada; 1 ml de água destilada; 1 ml de tampão acetato de sódio 0,2M, pH 5,0; 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 30 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 4 ml de solução de glicina 0,4M. A solução é misturada e resfriada a 20°C. A absorbância é medida em 400 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 1 cm. O resultado é convertido em pmoles de p-nitrofenol por comparação com o coeficiente de extensão molar de p-nitrofenol nestas condições. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de glicina é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de celobio-hidrolase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de p-nitrofenol de β-D-celobiopiranosídeo p-nitrofenila por minuto, nas condições do teste (50°C e pH 5,0). 1.3 - Glucosidasepelo processo de β-D-glucopiranosídeo p-nitrofenila O teste de β-glucosidase é baseado na hidrólise enzimática de β-D-glucopiranosídeo p-nitrofenila. Um produto da reação, p-nitrofenol é determinado colorimetricamente.

Uma solução contendo 1 ml de um β-D-glucopiranosídeo p-nitrofenila a 0,1% (p/v) e, água destilada; 1 ml de água destilada; 1 ml de tampão acetato de sódio 0,2M, pH 5,0; 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 30 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 4 ml de solução de glicina 0,4M. A solução é misturada e resfriada a 20°C. A absorbância é medida em 400 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 1 cm. O resultado é convertido em pmoles de p-nitrofenol por comparação com o coeficiente de extensão molar de /?-nitrofenol nestas condições. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de glicina é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade da atividade de β-glucosidase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 qmol de p-nitrofenol de β-D-glucopiranosídeo p-nitrofenila por minuto, nas condições do teste (50°C e pH 5,0).

1.4 - Endo-1,3(40-β-glucanasepelo processo de β-glucano de cevada DNS

Um teste para atividade de endo-1,3(4)^-glucanase é baseado na hidrólise enzimática das ligações glicosídicas em β-glucano de cevada, um β-1,3(4)^1υΰ3ηο. Os produtos da reação, oligossacarídeos p-l,3(4)-glucano, sào determinados pelo aumento resultante no valor de redução (como glucose).

Uma solução contendo 1 ml de uma solução de β-glucano de cevada a 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 (ou em valores de pH diferentes); 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 10 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 2 ml de uma solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS (1% p/v), hidróxido de sódio a 1,6% (p/v), (+)-tartrato de sódio potássio (30% p/v) em água destilada). A solução é misturada e colocada em um banho de água em ebulição, mínimo de 95°C, durante 5 minutos, depois resfriada para 25°C. Dez ml de água destilada são adicionados à solução e a absorbância é medida em 540 nm usando um célula de vidro de comprimento de via de 2 cm. O resultado é convertido em pmoles de açúcar de redução (como glucose) por comparação com uma curva padrão para 2 ml de soluções de glucose a 0,00 - 0,04% (p/v) tratada com solução de DNS de um modo equivalente. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de DNS é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade da atividade de endo-l,3(4)-P-glucanase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de equivalentes.min'1 de glucose nas condições do teste (50°C e pH 5,0 ou outro pH). 1.5 - Endo-1,3(4)~P~glucanase pelo processo de β-glucano de azo-cevada Um teste para atividade de endo-l,3(4)-p-glucanase é baseado na hidrólise enzimática de um β-glucano de cevada que tem um cromóforo de ligação (β-glucano de azo-cevada). Os produtos da reação, oligômeros que são solúveis após precipitação com etanol, são determinados pelo aumento resultante na absorbância em 590 nm.

Uma solução contendo 0,5 ml de substrato de β-glucano de azo-cevada (forma pronta para uso) e 0,2 ml de diluição de enzima (contendo entre 0,15 a 0,60 unidades.ml'1 em tampão de acetato de sódio 0,01M, pH 4,6) foi incubada a 30°C, exatamente durante 20 minutos. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 2,5 ml de solução de precipitação (contendo 18,1 g de acetato de sódio e 3,0 g de zinco misturado em 300 ml de frasco de água destilada, pH ajustado em pH 5,0 com ácido hidroclórico, teores de transferência a um frasco volumétrico de 1 1 e disposta em volume com 96% v/v de etanol). A solução é misturada e deixada permanecer em temperatura ambiente durante 10 minutos. A solução é transferida em tubo de centrífuga e centrifugada a 1000 g durante 10 minutos em uma centrífuga topo de bancada. A absorbância do sobrenadante é medida em 590 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 1 cm. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de precipitação é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade da atividade de endo-l,3(4)^-glucanase é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa o substrato para dar uma absorbância de 0,820 unidades a 590 nm, usando um substrato padrão, nas condições do teste (30°C e pH 4,6). 1.6 - Laminarinase (endo-1,3~P~glucanase) pelo processo de laminarina DNS O teste para atividade de laminarinase (endo-1,3(4)-β-glucanase) é baseada na hidrólise enzimática das ligações glicosídicas em laminarina, um β-13-glucano. Os produtos da reação, oligossacarídeos β-1,3-glucano, são determinados pelo aumento resultante no valor de redução (como glucose).

Uma solução contendo 1 ml de uma solução de laminarina a 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0; 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 10 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 2 ml de uma solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS al% (p/v), hidróxido de sódio a 1,6% (p/v), (+)-tartrato de sódio potássio 30% (p/v) em água destilada). A solução é misturada e colocada em um banho de água de ebulição, mínimo de 95°C, durante 5 minutos, depois resfriada para 25°C. Dez ml de água destilada são adicionados à solução e a absorbância é medida em 540 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 2 cm. O resultado é convertido em pmol de açúcar de redução (como glucose) por comparação com uma curva padrão para 2 ml de soluções de glucose a 0,00 - 0,04% (p/v) tratada com solução de DNS de um modo equivalente. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância realizando uma reação em que a solução de DNS é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de laminarinase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de equivalentes.min'1 de glucose nas condições do teste (50°C e pH 5,0). 1.7 - Endo-1 Α-β-xilanase pelo processo dexilano de madeira de vidoeiro Um teste para atividade de endo-1,4-P-xilanase é baseado na hidrólise enzimática das ligações xilosídicas em xilano de madeira de vidoeiro, um P-l,4-xilano. Os produtos da reação, oligossacarídeos β-1,4-xilano, são determinados pelo aumento resultante no valor de redução (como xilose).

Uma solução contendo 1 ml de uma solução de xilano de madeira de vidoeiro a 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 (ou em valores de pH diferentes); 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 10 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 2 ml de uma solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS (1% (p/v), hidróxido de sódio 1,6% (p/v), (+)-tartrato de sódio potássio 30% (p/v) em água destilada). A solução é misturada e colocada em um banho de água em ebulição, mínimo de 95°C, durante 5 minutos, depois resfriada para 25°C. Dez ml de água destilada são adicionados à solução e a absorbância é medida em 540 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 2 cm. O resultado é convertido em pmoles de açúcar de redução (como xilose) por comparação com uma curva padrão para 2 ml de soluções de xilose a 0,00 - 0,03% (p/v) tratada com solução de DNS de um modo equivalente A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de DNS é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de endo-l,4-P-xilanase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de equivalentes.min'1 de xilose nas condições do teste (50°C e pH 5,0 ou outro pH). 1.8 - Endo- 1,4-beta-xilanase pelo processo de arabinoxilano de trigo em DNS

Um teste para atividade de endo-1,4-P~xilanase é baseado na hidrólise enzimática das ligações xilosídicas em arabinoxilano de trigo, um P-l,4-xilano substituído com arabinose. Os produtos da reação, oligossacarídeos arabino-β-1,4-xilano, são determinados pelo aumento resultante no valor de redução (como xilose).

Uma solução contendo 1 ml de uma solução de arabinoxilano de trigo a 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 (ou em valores de pH diferentes); 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 10 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 2 ml de uma solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS (1% (p/v), hidróxido de sódio 1,6% (p/v), (+)-tartrato de sódio potássio 30% (p/v) em água destilada). A solução é misturada e colocada em um banho de água em ebulição, mínimo de 95°C, durante 5 minutos, depois resfriada para 25°C. Dez ml de água destilada são adicionados à solução e a absorbância é medida em 540 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 2 cm. O resultado é convertido em pmoles de açúcar de redução (como xilose) por comparação com uma curva padrão para 2 ml de soluções de xilose a 0,00 - 0,03% (p/v) tratada com solução de DNS de um modo equivalente A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de DNS é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de endo-l,4-P-xilanase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de equivalentes.min'1 de xilose nas condições do teste (50°C e pH 5,0 ou outro pH). 1.9 - Endo-l,4-fi-xilanase pelo processo de araboxilano de trigo viscométrico Um teste para atividade de endo-l,4-p-xilanase é baseado na hidrólise enzimática de uma solução de arabinoxilano de trigo padrão, a atividade sendo determinada pela redução em tempo contra viscosidade relativa.

Uma solução contendo 1 ml de uma solução de arabinoxilano de trigo a 1% (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,5 (ou em valores de pH diferentes); 3 ml de água destilada e 1% de solução enzimática apropriadamente diluída é injetada em um microviscosímetro Haake (usando uma bola de ouro calibrada em 0,1 - 2,0 mPa.s) e o tempo de queda da bola (Tteste) medido (em ms acima do comprimento de queda definido) a cada 30 segundos durante um período de 15 -2 0 minutos a 30°C. Tempos de queda de bola médios são medidos para água (5 ml de água destilada) e substrato (1 ml de uma solução de arabinoxilano de trigo a 1 % (p/v) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,5 e 4 ml de água destilada) como Tágua e Tsubstral0, respectivamente. Os controles são medidos de um modo equivalente. A fluidez relativa (Fr) é calculada para cada valor de Tleste como a seguir: Uma inclinação de um gráfico de Fr contra tempo (o tempo decorrido em que cada medição de Tteste é feita) é calculada na troca de fluidez relativa por minuto (AFr.min1) e é proporcional à concentração de enzimas. Uma unidade de atividade de endo-1,4-p-xilanase é definida como a quantidade de enzima que hidrolisará o substrato, reduzindo a viscosidade da solução, para dar uma troca em fluidez relativa de 1 (unidade não dimensional).min'' nas condições do teste (30°C e pH 5,5 ou outro pH). 1.10- β-Xilosidase pelo processo de β-D-xilopiranosídeo p-nitrofenila O teste de β-xilosidase é baseado na hidrólise enzimática de β-D-xilopiranosído p-nitrofenila. Um produto da reação, p-nitrofenol, é determinado colorimetricamente.

Uma solução contendo 1 ml de um β-D-xilopiranosídeo p-nitrofenila a 0,1% (p/v) em água destilada; 1 ml de água destilada; 1 ml de tampão acetato de sódio 0,2M, pH 5,0; 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubada a 50°C durante 30 minutos. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 4 ml de solução glicina 0,4M. A solução é misturada e resfriada a 20°C. A absorbância é medida em 400 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 1 cm. O resultado é convertido em pmoles de p-nitrofenol por comparação com o coeficiente e extensão molar de p-nitrofenol nestas condições. A absorbância de reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de glicina é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de xilosidase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de p-nitrofenol de β-D-xilopiranosídeo p-nitrofenila por minuto, nas condições de teste (50°C e pH 5,0). 1.11- a-N-arabinofuranosidase pelo processo de a-L-arabinofuranosídeo p-nitrofenila O teste de α-Ν-arabinofuranosidade (arabinofuranosidade) é baseado na hidrólise enzimática de α-L-arabinofuranosídeo p-nitrofenila. Um produto da reação, p-nitrofenol, é determinado colorimetricamente.

Uma solução contendo 1 ml de uma a-L-arabinofuranosídeo p-nitrofenila a 0,1% (p/v) em água destilada; 1 ml de água destilada; 1 ml de tampão acetato de sódio 0,2M, pH 5,0; 1 ml de solução enzimática apropriadamente diluída foi incubado a 50°C durante 30 minutos. A reação enzimática é interrompida pela adição de 4 ml de solução de glicina 0,4M. A solução é misturada e resfriada a 20°C. A absorbância é medida em 400 nm usando uma célula de vidro de comprimento de via de 1 cm. O resultado é convertido em pmoles de p-nitrofenol por comparação com o coeficiente de extensão molar de p-nitrofenol nestas condições. A absorbância da reação enzimática observada é corrigida para absorbância não específica realizando uma reação em que a solução de glicina é adicionada à mistura antes da solução enzimática. Uma unidade de atividade de arabinofúranosídeo é definida como a quantidade de enzima que produz 1 pmol de p-nitrofenol de α-L-arabinofúranosídeo p-nitrofenila por minuto nas condições do teste (50°C e pH 5,0).

1.12- Esterase de feruloila pelo processo de FAXX

Um teste de esterase de feruloila (esterase de ácido ferúlico) é baseado na hidrólise enzimática de 0-[5-0-(trans-feruloil)-a-L-arabinofuranosil]-(l—»3)-0-p-D-xilopiranosil-(l-»4)-D-xilopiranose (FAXX). FAXX é preparado de farelo de trigo hidrolisado com enzima, purificado e caracterizado por RMN. Hidrólise de FAXX é medida espectrofotometricamente. A reação enzimática segue em 325 nm, usando uma célula de comprimento de via de 1 cm, em solução contendo FAXX 0,050mM em tampão MOPS 0,1M, pH 6,0 a 37°C.

Uma unidade de atividade de esterase de feruloila em FAXX é definida como a quantidade de enzima que converte 1 pmol de substrato em produto por minuto nas condições do teste (37°C e pH 6,0).

1.13- Esterase de feruloila pelo processo Ara2F

Um teste de esterase de feruloila (esterase de ácido ferúlico) é baseado na hidrólise enzimática de Ara2F (1,2 ligado a ácido ferúlico em arabinose). Ara2F é preparado de pasta de beterraba sacarina hidrolisada com enzima, purificada e caracterizada por RMN. Hidrólise de Ara2Fé medida espectrofotometricamente. A reação enzimática segue em 325 nm, usando uma célula de comprimento de via de 1 cm, em solução contendo Ara2F 0,05 OmM em tampão MOPS 0,1M, pH 6,0 a 37°C.

Uma unidade de atividade de esterase de feruloila em Ara2Fé definida como a quantidade de enzima que converte 1 pmol de substrato em produto por minuto nas condições do teste (37°C e pH 6,0). 1.14- Esterase de feruloila pela hidrólise de ésteres metílicos: processos de ácido metil ferúlico (MFA); ácido metil cafeico (MCA); ácido metil sinápico (MSA); ácido metil p-cumárico (MpCA).

Um teste de esterase de feruloila (esterase de ácido ferúlico) é baseado na hidrólise enzimática de ésteres metílicos de ácido ferúlico (MFA), ácido cafeico (MCA), ácido sinápico (MSA) e ácido /7-cumárico (MpCA). Hidrólise de éster metílico é medida em tampão MOPS 0,1M, pH 6,0 a 37°C. Testes são baseados em duas técnicas diferentes.

No processo espectrofotométrico a concentração de substrato; éster metílico é 0,1 OmM e hidrólise de éster segue em 325 nm usando uma célula de comprimento de via de 1 cm. Neste processo, a concentração de substrato inicial é limitada.

No processo de HLPC, a concentração de substrato éster metílico é 1,0mM e hidrólise de éster segue medindo-se a liberação de ácido livre por HPLC após intervalos de 10-30 minutos. Neste processo, não existe nenhum limite na concentração de substrato e as atividades medidas são consideravelmente mais altas do que as para o processo espectrofotométrico.

Uma unidade de atividade de esterase de feruloila é definida como a quantidade de enzima que converte 1 pmol de substrato em produto por minuto nas condições do teste (37°C e pH 6,0). 1.15 - Concentração de proteína pelo teste de proteína de ligação a Coomassie blue de Bradford modificado 0 teste de concentração de proteína é baseado no teste de proteína de ligação a azul Coomassie de Bradford modificado usando Azul Brilhante G (Azul Coomassie), medido em um espectrofotométrico em 595 nm, usando cubas de vidro de trajeto de 1 cm. O processo (Sigma B 6916) é padronizado usando albumina de soro bovino (Sigma P 094). 1.16- Ponto isoelétrico por focalização isoelétrica Pontos isoelétricos de proteínas são determinados por processos padrões usando géis verticais pré-fundidos de poliacrilamida a 5% como géis de NOVEX® para pH 3 - 10 (TL) na faixa de desempenho de 3,5-8,5) ou pH 3,7 (faixa de desempenho pl 3,0-6,5) na mini-célula Xcell II™ da NOVEX ®. Catodo NOVEX®, anodo e tampões de amostra IEF para pH ou pH 3-7 são usados. Protocolo padrão de NOVEX® para focalização isoelétrica, fixação, coloração com coloração azul Coomassie R-250, e descoloração são usados. 1.17 - SDS-PAGE (eletroforese de gel poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio) A separação analítica e determinação do peso molecular de proteína são realizadas por processos SDS-PAGE padrões. Géis pré-fundidos NOVEX® NuPAGE™ (NuPAGE™), géis Bis- Tris ou Géis tris-acetato NuPAGE™ com tampões de corrida recomendados pela NOVEX®, são usados na Mini-célula XCell II™ da NOVEX®. Uma preparação de amostra NOVEX® e tampões de corrida e padrões de peso molecular são usados. O protocolo padrão NOVEX® para SDS-PAGE, fixação, coloração com coloração azul Coomassie R-250 e descoloração são usados. 2. Resultados da mistura de enzimas 2.1 - pH ótimo 2.11 - Atividade endo-l,3(4)-P-glucanase O teste de endo-l,3(4)-p-glucanase de Penicillium funiculosum foi realizado em condições padrão a 50oC usando um processo de β-glucano de cevada em DNS. A atividade enzimática foi medida entre pH 3,0 e pH 7,0. O pH ótimo para atividade enzimática é pH 4,0-5,0. 2.1.2 - Atividade de endo-1,4-P-xilanase O teste de endo-1,4- β-xilanase de Penicillium funiculosum foi realizado em condições padrão a 50°C, usando o processo de xilano de madeira de vidoeiro em DNS 2.2 - Temperatura ótima 2.2.1 - Atividade de endo-l,3(4)^-glucanase O teste de endo-l,3(4)^-glucanase de Penicillium funiculosum foi realizado em condições padrão em pH 5,0 (o pH ótimo para esta enzima), usando o processo de β-glucano de cevada em DNS. A atividade enzimática foi medida entre 30 e 70°C. A temperatura ótima está entre 50 e 60°C com a atividade maior sendo medida a 60°C. Os resultados em detalhe são dados na forma de uma tabela vs. temperatura: 2.2.2 - Atividade endo-1,4-β-xilanase O teste de endo-1,4- β-xilanase de Penicillium funiculosum foi realizado em condições padrão em pH 5,5 e pH 3,5, usando o processo de xilano de madeira de vidoeiro em DNS. A atividade enzimática foi medida entre 30 e 70°C. A temperatura ótima está entre 50 e 60°C, com a atividade maior sendo medida a 50°C para pH 5,5 e a 60°C para pH 3,5. Os resultados, em detalhe, são dados na forma de uma tabela vs. temperatura.

Enzimas produzidas por Penicillium funiculosum têm níveis altos de celulase, endo-1,3(4)-P~glucanase e outras atividades glicanolíticas. Além disso, elas também são caracterizadas pelos níveis altos de atividades de endo-1,4-β-xilanase e de enzimas acessórias de xilanase. O espectro amplo de enzimas hemicelulolíticas é uma característica de preparações de enzima deste microorganismo.

Cada atividade medida pode ser descrita como uma relação em uma atividade maior para a preparação. Um exemplo de resultados obtidos é mostrado na tabela A. Estas relações podem se alterar nas preparações de diferentes bateladas de fermentação.

Tabela A: Atividades relativas contra substratos diferentes relevantes 3- Propriedades de componentes na mistura de enzimas 3.1 Processos de purificação Cromatografia de Interação Hidrófoba A preparação obtida após filtragem e concentração do meio de fermentação, em 112,6 mg/ml de concentração de proteína, foi diluído 1/1 com tampão de cromatografia de interação hidrófoba (HIC) (tampão acetato 50 mM, pH 7,0/1,7 M (NH4)2S04/0,04% azida de sódio), trocado em tampão de HIC (10 colunas PD; Pharmacia). Porções (10 ml) foram aplicadas a uma coluna (10 x 5 cm de diâmetro, 200 ml) de gel HIC de alto desempenho de PhenylSepharose™ (Pharmacia) e separadas usando um gradiente de redução de concentração de sulfato de amônio (NH4)2S04 (1,7 - 0,0 M) a 10 ml/min. Frações (10 ml) foram coletadas e testadas para atividade de xilanase. HIC deu dois picos maiores de atividade de xilanase. O primeiro, denominado A, eluiu da coluna quando a concentração de (NH4)2S04 foi reduzida a cerca de 0,6 M, enquanto o segundo, denominado B, eluiu em concentração de (NH4)2S04 de cerca de 0,25 M. Frações compreendendo os picos A e B de cada injeção foram reunidas separadamente. A fração A total correspondeu a 2,8% da atividade de xilanase total, enquanto a fração B correspondeu a 97,2% da atividade de xilanase total. O rendimento foi 77%.

Cromatografia de troca iônica Frações reunidas para o pico A e B de HIC foram precipitadas aumentando a concentração de (NH4)2S04 para 100% de saturação seguido por centrifugação (lO.OOOxg durante 30 minutos). Pelotas foram redissolvidas em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0/0,04% azida de sódio e dessalinizadas no mesmo tampão usando 10 colunas PD. Amostras (5 ml) foram aplicadas a uma coluna de troca aniônica 10/10 HR MonoQ™ (Pharmacia), previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0/0,05% azida de sódio e eluídas em 2 ml/min com concentração crescente de cloreto de sódio (NaCl (0 - 1 M) no mesmo tampão. Frações (2 ml) foram coletadas e testadas para atividade de xilanase.

Pico A: Separação do pico A por cromatografia de troca aniônica deu um pico único de atividade de xilanase que eluiu em cerca de NaCl 0,3M. As frações mais ativas foram reunidas e analisadas por SDS-PAGE (eletroforese de gel poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio). Isto mostrou uma banda maior única de peso molecular 48 kDa. A recuperação da atividade de xilanase após IEF (focalização isoelétrica) confirmou que esta banda colorida com Coomassie maior era uma xilanase.

Pico B: Separação do pico B por cromatografia de troca aniônica deu dois picos maiores de atividade de xilanase, um que eluiu no vazio (material não ligado; pico B-I) e o outro em NaCl 0,1 M (pico B-II). Houve também dois picos menores eluindo em NaCl 0,13 M e 0,19 M. As frações ativas correspondentes a cada pico foram reunidas e analisadas por SDS-PAGE, mas nenhuma das amostras era pura.

Cromatografia de filtração de gel Frações reunidas compreendendo B-I e B-II foram secadas por congelamento, redissolvidas em água e dessalinizadas (usando 10 colunas PD). Amostras (0,2 ml) foram aplicadas a uma coluna 75 HR Superdex™ (Pharmacia) e eluídas em 0,04 ml/min com tampão Bis-Tris 20 mM, NaCl pH 6,0/0,2 M/ 0,04% azida de sódio. Frações (0,4 ml) foram coletadas e testadas para atividade de xilanase. 3.2 - Propriedades de xilanases 3.2.1 - Ponto isoelétrico por focalização isoelétrica Pontos isoelétricos são determinados por processos padrão usando pré-disposição vertical de géis poliacrilamida a 5% de NOVEX® para pH 3 - 10 e pH 3 - 7. Catodo de NOVEX®, anodo e tampões de amostra padrão, e protocolo padrão para focalização isoelétrica, fixação, coloração com Coomassie R-250 Blue Stain e descoloração, são usados.

Para xilanase A, uma amostra seguindo MonoQ foi usada. Para xilanase B-I e B-II, uma amostra seguindo HIC, xilanase B, foi usada. Para cada um de A e B, uma amostra pequena (10 μΐ) foi carregada em um reservatório único e uma amostra grande (50 μΐ) foi carregada em um reservatório triplo. Após focalizar as amostras, o gel foi cortado na metade, de modo que uma metade continha as duas amostras pequenas (A+B) e os marcadores de peso molecular (esta metade foi colorida com Coomassie), enquanto a outra metade continha as duas amostras grandes. A metade de gel contendo as amostras grandes foi cortada para separar as duas trilhas de amostras e, subsequentemente, cada trilha foi fracionada em frações de 2 mm. Cada fração de 2 mm foi embebida separadamente durante a noite em tampão MOPS 100 mM, pH 6,0/0,04% azida de sódio. As frações foram testadas para atividade de xilanase.

Para amostra de xilanase A, o gel IEF colorido mostrou uma banda maior única de marcador pl 3,55 e umas poucas bandas contaminantes menores. A atividade de xilanase foi encontrada somente na fração correspondente a esta banda, confirmando a banda maior de xilanase.

Para amostra de xilanase B, o gel IEF colorido indica várias bandas em uma faixa de valores pl. A atividade de xilanase ocorreu em duas frações separadas do gel não colorido, e correspondendo a proteínas de pl 4,2 e 4,8.

3.2.2 - Peso molecular por SDS-PAGE

Para confirmar os pesos moleculares de xilanases nos picos B de HIC, as frações com atividade de xilanase eluídas do gel IEF foram dessalinizadas, secadas por congelamento e separadas por SDS-PAGE. PAGE desnaturante foi realizado usando 10% de géis Tris-glicina (NOVEX®) com ditiotreitol (DTT 50 mM) incluídos no tampão de amostra como um agente de redução. O gel colorido indicou que ambas as xilanases eram puras, com pesos moleculares de 36 kDa e 15 kDa para xinalase B-I e xilanase B-II, respectivamente.

Todas as três xilanases purificadas foram submetidas a análise SDS-PAGE: a fração A de xilanase após cromatografia de troca aniônica, frações B-I e B-II de xilanase após cromatografia de filtração de gel. Xilanase A deu uma banda única de peso molecular 48 kDa. Xilanase B-I deu uma banda maior e quatro menores após coloração com Coomassie. A banda maior foi confirmada como a xilanase, uma vez que o peso molecular foi 36 kDa. A pureza é estimada em 90%. Xilanase B-II deu uma banda maior de peso molecular 15 kDa e 2-3 bandas menores. Esta xilanase é aproximadamente 95% pura. 3.2.3 - Atividade enzimática Os testes para medição da atividade enzimática são descritos previamente.

3.2.3.1 - Análise de xilanase A [Proteína] 0,4 (mg/ml) nd não determinado n/a não aplicável Atividade de xilanase em xilano de madeira de vidoeiro vs pH

3.23.2 - Análise de xilanase B-I ÍProteínal 0,096 (mg/ml) nd não determinado n/a não aplicável Atividade de xilanase em xilano de madeira de vidoeiro vs pH

3.2.3.3 - Análise de xilanase B-II [Proteína] 0,165 (mg/ml) nd não determinado n/a não aplicável Atividade de xilanase em xilano de madeira de vidoeiro vs pH 3.2.4 - Sequências Uma forma de realização da presente invenção é relacionada à sequência de aminoácidos e de ácido nucleico das proteínas descritas acima ou suas variantes.

Para este fim, as sequências para xilanases foram identificadas de sequências de aminoácidos de proteínas purificadas (xilanase A, xilanase B-I e xilanase B-II) e de comparações de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos de xilanases fúngicas conhecidas.

Compreende-se para a invenção que variantes se refere a qualquer polipeptídeo ou qualquer análogo de proteína, fragmento de proteína, proteína que sofreu mutação ou derivada da proteína nativa ou polipeptídeo e tendo as mesmas funções biológicas como a referida proteína nativa ou polipeptídeo. Variantes diferentes podem existir no estado natural. As variantes podem ser, por exemplo, variantes alélicas caracterizadas por diferenças na sequência de genes codificando referida proteína ou podem resultar de rejunção diferencial ou de modificações pós-translacionais. Variantes são obteníveis por substituição, deleção, adição e/ou modificação de um ou mais aminoácidos. Todas as modificações são bem conhecidas e podem ser realizadas por qualquer processo conhecido dos versados na arte.

Variantes são moléculas tendo, por exemplo, mais afinidade para seu substrato ou tendo propriedades biológicas novas.

Outro objeto da presente invenção também é o uso das sequências para a expressão das proteínas ou polipeptídeos descritos eru células hospedeiras de organismos uni- ou pluricelulares. Para este fim, as referidas sequências podem estar compreendidas no genoma de um vetor. O referido vetor pode ser um plasmídeo, um fago ou um vírus. Consequentemente, outra forma de realização da invenção é uma célula isolada do hospedeiro de organismo uni- ou pluricelulares, transfectados ou infectados por um vetor como descrito acima. Em uma forma de realização preferida, a célula hospedeira é uma bactéria. O uso de referidos vetores compreendendo a sequência de ácido nucleico das proteínas descritas para a expressão de referida protéína em qualquer célula hospedeira é outra forma de realização da presente invenção.

3.2.4.1 - Sequências de Xilanase C A produção de sondas foi baseada em comparações de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos de xilanases fúngicas conhecidas. Regiões conservadas foram identificadas e usadas para designar iniciadores de PCR, cujos produtos podem ser usados para triar uma biblioteca genômica de Penicillium funiculosum.

Dois pares de iniciadores degenerados foram preparados. O primeiro par foi designado para ampliar um produto de 200 bp (aproximado) de um gene de xilanase do tipo B (ou tipo 2). O segundo par foi designado para ampliar um produto de 250 bp de um gene de xilanase do tipo A (ou tipo D- Uma banda de 258 bp foi produzida com iniciadores 3 e 4. Após clonagem em pGEMT e sequenciação este foi verificado ter similares de sequência significativa em xilanase fúngica do tipo A/l. O plasmídeo contendo o produto do clone é denominado pPFXYLA. A sequência completa de xilanase C é mostrada na figura 1 e na SEQ ID NO. 1.

3.2.4.2 - Sequências de xilanase BI A sequência de aminoácidos interna, junto com alinhamentos de sequência de outras celobio-hidrolases fúngicas foi usada para designar iniciadores de PCR degenerados (SEQ ID NOS. 2 e 3). Um produto de 290 bp (SEQ ID NO. 4) foi ampliado e clonado em pGEMT (Promega) para criar pGEMTCB2 e sequenciado. Como mostrado na figura 2, as sequências de iniciadores estão sublinhadas. Este produto PCR é atualmente usado para triar uma biblioteca genômica IMI134756 de Penicillium funiculosum.

3.2.4.3 - Sequências de xilanase BII A sequência total do gene de xilanase BII inclui 1,3 kb da região 5’ a montante e não traduzida e 0,85 kb de 3’ não traduzida, um intron de 54 bp e 669 bp codificando uma proteína de aminoácido 223. PCR de transcrição reversa (RT-PCR) foi usada para provar a existência do intron de 54 bp. RNA total foi isolado de micelia de culturas IMI-134756 de Penicillium funiculosum, coletado após 4 dias de crescimento em 1 % (p/v) de xilano de espelta de aveia. Iniciadores foram designados para ampliar fragmento de ate 395 bp do RNA mensageiro (249 bp de DNA genômico) e até 433 bp (487 bp com DNA genômico).

Sequenciação de 3 kb na extremidade 3’ do plasmídeo (pPFXYNC2, revelou um gene (designado por A) que contém dois introns putativos e codifica um polipeptídeo de aproximadamente 570 aminoácidos. O polipeptídeo mostrou similaridade de sequência significativa com permeases de aminoácidos fiíngicas.

3.2.4.4 - Sequência de Xilanase A A sequência interna de xilanase A foi obtida e é representada pela seguinte sequência de aminoácidos: AEAINYNQDY 3.3 - Propriedades de esterases de feruloila 3.3.1 - Purificação É realizada seguindo os mesmos processos como para xilanases. A mistura de enzimas contém pelo menos duas esterases de feruloila distintas. Uma destas (FaeB) tem um peso molecular de 38.945 -41.051 Da por espectrometria de massa (35.450 Da da sequência de aminoácidos primária e 37 kDa por SDS-PAGE). FaeB tem um pl de 4,2, é uma esterase de feruloila do tipo B e é específica para substratos MqCA e Ara2F (atividade contra MpCA, MCA, MFA e Ara2F; mas não contra MS A e FAXX). A outra esterase de feruloila (FaeA) tem um peso molecular de 29 kDa (por SDS-PAGE). FaeA tem um pl de 4,65, é uma esterase de feruloila do tipo A e é específica para substratos FAXX e MSA (atividade contra MSA, MCA, MFA e FAXX, mas não Ara2F MpCA. 3.3.2 - Ponto isoelétrico por focalização isoelétrica Pontos isoelétricos de proteínas são determinados pelos processos padrão. A mistura de enzimas foi aplicada como uma tira ampla (cerca de 20 mm) em um gel IEF e submetida a eletroforese em temperatura reduzida (5°C). Após focalizar e ajustar a banda, o gel foi cortado no meio da trilha da amostra. Uma metade da trilha de amostra e os padrões de IEF foram fixados, coloridos e descoloridos usando o protocolo padrão. A outra metade da trilha foi cortada em seções amplas de 2 mm e cada seção embebida durante a noite em 1 ml de tampão MOPS 100 mM, pH 6,0. Atividade de esterase de feruloila foi determinada para cada seção do gel usando MFA, MpCA e MSA como substratos. O gel IEF colorido indica a presença de muitas proteínas em celulase com pl’s na faixa de muito acídico (pl 2,4) a cerca de pl 7. A maior parte das proteínas é acídica (pl na faixa de 2,4-5). Dois picos de atividade de esterase de feruloila foram detectados em frações de corte do gel. Um, correspondente a FaeB, tinha um pl de 4,2 e atividade somente contra MFA e MpCA (não MSA). O outro, correspondente a FeaA, tinha um pL de 4,65 e atividade contra todos os três substratos testados.

3.3.3 - Peso molecular por SDS-PAGE

Pesos moleculares foram analisados por SDS-PAGE usando géis de Tris-Glicina a 10%. Geís de SDS-PAGE foram testados, fixados, coloridos com Coomassie Blue Stain e descoloridos usando o protocolo padrão. A mistura de enzimas contém pelo menos duas esterases de feruloila distintas. Um, correspondente a FaeB (pl 4,2), tem um peso molecular de 37 kDa. O outro, correspondente a FaeA (pl 4,65), tem um peso molecular de 29 kDa. O peso molecular de FaeB é estimado em 34.450 Da da sequência de aminoácidos primária, e 38.945 - 41.051 Da por espectrometria de massa. 3.3.4 - Atividade de esterase de feruloila Testes de atividade de esterase de feruloila realizados na mistura de enzimas usando o processo espectrofotométrico A mistura de enzimas contém atividade contra todos os substratos testados. Com os ésteres metílicos, a atividade é mais alta contra MpCA e mais baixa contra MSA. As atividades contra Ara2F e FAXX são mais altas do que contra os ésteres metílicos, o que é indicativo de que as atividades de esterase são devido a esterase de feruloila verdadeira e não esterases gerais ou atividades colaterais de outras esterases de degradação de parede de células (por exemplo, acetil xilano esterase, esterase de pectina). 3.3.5 - Sequências 3.3.5.1 - Sequência de FEA-A

De acordo com os digestos de tripsina da proteína interna purificada, sequências de aminoácidos internas foram obtidas como mostrado a seguir: Sequência 1 QYTLTLPSNYNPNK Sequência 2 AVAVMSGANL Sequência 3 TEYSG(C/A)DSEHPVWWIAFDGP Sequência 4 DTFVKDDHCTPTNPPAPAAGSGTHIKYV Vários iniciadores de PCR degenerados foram designados de sequências de aminoácidos obtidas da proteína purificada. Muitos produtos foram clonados em pGEMT (Promega) e sequenciados.

Verificou-se por PCR que um plasmídeo denominado pGEMTD19 (180 bp) (figura 3) contém sequência que foi reconhecível como sequência de peptídeo 4 mostrada acima. Como mostrado na figura 3, as sequências de iniciadores são sequências conhecidas anteriormente, sublinhadas duplamente, sublinhada unicamente.

As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos de FAE-A são descritas em SEQ ID NO. 5.

3.3.5.2 - Sequência de FEA-B

Iniciadores designados de sequência de peptídeos de FAE-B foram usadas para ampliar até uma sonda, que foi subsequentemente usada para triar uma biblioteca genômica de Penicillium funiculosum. Um clone de 2291 bp foi isolado e sequenciado (SEQ ID NO. 6). O gene codifica um polipeptídeo de 304 aminoácidos e tem um intron putativo. A sequência de aminoácidos predita é mostrada na figura 4 em que a proteína madura (comprimento de proteína madura=338) está em negrito. Esta proteína compreende dois domínios distintos separados por um ligador altamente glicosilado. Como mostrado na figura 4, o domínio catalítico está em negrito, enquanto o domínio de ligação está em negrito duplamente sublinhado e o ligador é representado na linha em negrito pontilhada. A proteína é também representada por um motivo de sítio ativo putativo (serina=nucleófilo), como mostrado em sublinhado na figura 4 com a seguinte tríade catalítica putativa: (1) S136/D174/H216 (2) S136/D220/H276. A proteína FAE-B compreende também uma sequência de secreção (353) e 10 cisteínas. 3.4 - Propriedades de glucanases A mistura de enzimas foi submetida a eletroforese de gel 2D. IEF foi realizado usando pré-disposição vertical de géis poliacrilamida a 5% de NOVEX® para um pH 3-7 (desempenho de pl na faixa de 3,0 - 6,5) na XCell II Mini-Cell NOVEX®. Catodo NOVEX®, anodo e tampões de amostra IEF para pH 3 - 7 e o protocolo padrão NOVEX® para focalização isoelétrica são usados. Uma trilha foi cortada e submetida a eletroforese na segunda dimensão usando um gel SDS-PAGE Laemmli a 10%. Uma segunda trilha foi separada do gel, cortada em 35 frações, as tiras de gel embebidas em tampão, e as frações testadas para atividade enzimática. A terceira trilha foi deixada no gel, colorida com Coomassie R-250 Blue Stain e descolorida usando o protocolo padrão NOVEX®.

Atividades de celulase (processo CMC DNS)e de endo-1,3(4)-β-glucanase (processo de β-glucano de cevada em DNS) foram encontradas em frações correspondentes a proteínas com pl 4,2, M.W. 36 kDa e pl 5,4, M.W. 27 kDa. Para eliminar xilanase B-I como estando em uma das frações, as frações foram testadas para atividade usando o processo de xilano de madeira de vidoeiro em DNS. Nenhuma atividade de xilanase foi detectada nas frações correspondentes a atividades de β-glucanase e celulase.

Relação dos Desenhos Figura 1: Sequência de aminoácidos da proteína C de xilanase de Penicillium funiculosum Figura 2: Sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do produto PCR de xilanase NI (XynBI) Figura 3: Sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do produto PCR de esterase de feruloila (faeA) Figura 4: Sequência de aminoácidos (FAE-V ou FAE-I) da proteína B (faeB) de esterase de feruloila de Penicillium funiculosum. E. Usos de mistura de enzimas em rações animais Exemplo 1: Avaliação da preparação de enzimas produzidas por eficácia de Penicillium funiculosum no valor de energia de dieta mista de trigo-cevada sobre frangos para assar (AMEN) O objetivo é demonstrar a eficácia de enzimas (atividade de β-glucanase: 100 U.kg'1 e atividade de xilanase: 1100 U.kg'1) em energia metabolizável aparente corrigida para equilíbrio de nitrogênio (AMEN) de uma dieta contendo 50% de trigo e 22% de cevada.

Experiências são levadas sobre Controle e Preparação de Enzimas (atividade de β-glucanase: 100 U.kg'1 e atividade de xilanase: 1100 U.kg'1) usando o European Reference Method (Bordillon et al., 1990), com ração ad libitum e coleta de fezes total entre 18 e 21 dias de idade, a. Material e Métodos Pássaros: Raça e condições de procriação Frangos para assar Ross do sexo masculino de um dia de idade são criados em uma batería de gaiolas coletivas até 12 dias de idade. Eles são alimentados com uma dieta inicial padrão. No dia 12, pássaros são pesados e igualmente distribuídos em 10 gaiolas individuais por tratamento e, então, alimentados com dietas experimentais durante o período de adaptação (5 dias no mínimo).

Programas de umidade e temperatura padrão são aplicados. O programa de iluminação é mantido no claro 23 horas direto e 1 hora no escuro até o término da experiência.

Rações: Aves receberam uma dieta inicial de um dia de idade a 12 dias e, então, as rações experimentais.

Dietas experimentais Rações continham 50% de trigo e 22% de cevada (tabela 1.1). A preparação de enzimas foi pulverizada em 20 kg de migalhas.

Recuperações de enzima na ração são medidas por processo viscométrico (Sebatier e Fish, 1996).

Medição de energia metabolizável O equilíbrio inicia D 18 de acordo com o seguinte procedimento: D 17, pássaros ficaram em jejum durante a noite; D 18, pesando pássaros, bandejas de coleta limpas; D 19, fezes foram coletadas e congeladas; D 20, fezes foram coletadas e congeladas, jejum durante a noite; D 21, fezes foram coletadas e congeladas, pássaros pesados e realimentados.

As fezes são então secadas por congelamento e trituradas como ração (1 mm, triturador Retsch). Energia total de ração e fezes são medidas em um calorímetro adiabático C5000 IKA. Teores de proteína (N*6.25, processo Z130 Kjeldahl) e lipídeo (processo Z160) são também determinados. A correção para equilíbrio de nitrogênio foi aplicada usando 18% de proteína no ganho de peso. b. Resultados e discussão Energia metabolizável aparente corrigida para equilíbrio de nitrogênio (AMEn) Desempenhos zootécnicos e energia metabolizável sâo apresentados na tabela 1.2. Não há nenhuma diferença nos desempenhos zootécnicos entre tratamentos.

Em frangos para assar em crescimento, preparação de enzimas melhora AMEN de uma dieta baseada em 50% de trigo e 22% de cevada em 6,2% (+204 kcal/kg DM (matéria seca)).

Além disso, variabilidade na digestibilidade de energia foi diminuída de 80 para 60 kcal.kg DM.

Este desempenho alto demonstra o interesse de ambas as atividades (xilanase e β-glucanase) produzida por Penicillium funiculosum para hidrolisar polissacarídeo de amido não solúvel de trigo e cevada.

Tabela 1.1: Ingredientes principais e características analisadas de dietas experimentais _________________________________________ Tabela 1.2: Efeito de preparação de enzimas produzido por Penicillium funiculosum no desempenho de crescimento e energia metabolizável aparente em frangos para assar recebendo uma dieta baseada de 50% de trigo e 22% de cevada.

Exemplo 2: Efeito de preparação de enzimas produzida por Penicillium funiculosum na digestibilidade de ração em frangos para assar alimentados com trigo A experiência para determinar o efeito de preparação de enzimas produzida por Penicillium funiculosum (atividade de β-glucanase: 100 U.kg'1 e atividade de xilanase : 1100 U.kg'1) em Energia Metabolizável Aparente (AME), digestibilidades de proteína e lipídeo em frangos para assar alimentados com uma dieta contendo 54% de metal. A interação com trituração foi também investigada. (1) Controle 1 (54% de trigo triturado) (2) Controle 1 + preparação de enzimas (atividade de β-glucanase : 100 U/kg-1 e atividade de xilanase : 1100 U.kg'1) (3) Controle 2 (30% de trigo total, 22% de trigo triturado) (4) Controle 2 + preparação de enzimas (atividade de β-glucanase : 100 U.kg'1 e atividade de xilanase : 1100 U.kg'') de acordo com o processo de referência européia (ração ad libitum e coleta de fezes total de 18 a 21 dias de idade) (Bourdillon et al., 1990). a. Material e Métodos Pássaros: Raça e condições de procriação Pintinhos do sexo masculino Ross de um dia de idade são criados em baterias de gaiolas coletivas até 12 dias de idade.

Eles são então transferidos para baterias de gaiolas individuais para equilíbrio digestivo.

Programas de umidade e temperatura padrão são aplicados. O programa de iluminação foi 23 horas no claro e 1 hora no escuro até 8 dias de idade. Foi então modificado para 15h30 no claro, 8h30 no escuro devido a uma experiência de poedeira realizada na mesma construção.

Rações: Pássaros receberam dieta inicial até 12 dias de idade e depois as rações experimentais.

Dietas experimentais Dietas experimentais continham 54% de trigo. Características são dadas na tabela 2.1, A composição da dieta é descrita na tabela 2.2. Medição da energia metabolizável aparente O equilíbrio inicia no dia 17 de acordo com a seguinte escala: D 17, pássaros ficaram em jejum durante a noite; D 18, pesando pássaros, bandejas de coleta limpas; D 19, fezes foram coletadas e congeladas; D 20, fezes foram coletadas e congeladas, jejum durante a noite; D 21, fezes foram coletadas e congeladas, pássaros pesados e realimentados.

Fezes foram então secadas por congelamento e trituradas como ração (1 mm, triturador Retsch). Energia total da ração e fezes são medidas em um calorímetro adiabático C5000 IKA. Teores de proteína (N*6.25, processo Ζ130 Kjeldahl para rações e Z135 para fezes) e lipídeo (processo Z160) são também determinados.

Um perfil de aminoácido é também realizado por HPLC (processo Z100 para fezes e Z080 para fezes). Teor de fósforo de rações e fezes foram medidos usando o processo AFNOR (NFV18-106). b. Resultados e discussão Energia Metabolizável Aparente (AME) Dados de desempenho de crescimento e energia metabolizável são apresentados na tabela 2.3. O desempenho (ganho de peso, consumo da ração), medido durante o período de três dias, não difere entre tratamentos. AME da dieta de controle contendo 54% de trigo triturado foi 3173 kcal/kg. Energia metabolizável da dieta contendo a mesma quantidade total de trigo, mas da qual 30% é como grão total, é aumentada por 100 kcal/kg comparado com o valor teórico. Além do mais, variabilidade apreciada pelo desvio padrão dos critérios diferentes medido é também reduzida com trigo total.

Enzimas produzidas por Penicillium funiculosum (atividade de β-glucanase: 100 U/kg'1 e atividade de xilanase: 1100 U.kg'1) melhora o valor de energia metabolizável de uma dieta baseada em 54% de trigo + 3,4% (122 kcal/kg DM) se todo o trigo é triturado e em + 2,7% (101 kcal/kg DM) se 30% do trigo estão incluídos como grãos totais.

Digestibilidade aparente de nutrientes (lipídeos, proteínas e aminoácidos) Quando todo trigo é triturado, digestibilidades de proteína e de lipídeo aparentes são aumentadas em 7 e 2,7%, respectivamente, com preparação de enzimas de Penicillium funiculosum. Com parte do trigo como grãos totais, o aumento é menor: + 3 e + 0,5%, respectivamente, devido a uma digestibilidade de nutriente melhorada total. Naturalmente, digestibilidade de nutriente com dieta de controle contendo trigo total foi similar à da dieta experimental contendo somente trigo triturado, mas suplementado com preparação de enzimas.

Os efeitos da preparação de enzimas sobre a digestibilidade de aminoácidos aparente são apresentados na tabela 2.4. A melhora com preparação de enzimas alcança em média + 2,9% com trigo total como trigo triturado e + 1,1% com grãos totais, confirmando o efeito sobre a digestibilidade de proteínas aparente.

Retenção de fósforo aparente e excreção de fósforo O efeito da preparação de enzimas sobre retenção de fósforo aparente é apresentado na tabela 2.5. Retenção de fósforo aparente é significativamente aumentada com adição de preparação de enzimas: + 8,0%. Este aumento é maior do que os observados para os outros nutrientes (+ 2,9 a + 3,5%, dependendo do critério: AME, proteínas, lipídeos, aminoácidos). Este aumento pode, assim, resultar da digestibilidade de nutriente aparente (efeito direto de xilanase e β-glucanase). mas também de uma ação melhor da fitase de trigo. Quando se hidrolisa polissacarídeos não amido, xilanase e β-xilanase dão mais acessibilidade a ácido fítico para a fitase de trigo endógena.

Esta utilização digestiva melhor de fósforo reduz, assim, excreção de fósforo: -8% quando expressada como g de fósforo por kg de ganho de peso.

Tabela 2.1: Características do trigo (%) Tabela 2.2: Composição e características de dietas experimentais Tabela 2.3: Efeito de preparação de enzimas (atividade de β-glucanase: 100 U.kg'' e atividade de xilanase: 1100 U.kg'1) sobre AME de uma dieta baseada em trigo (54% de trigo triturado ou 25% de trigo triturado + 30% de trigo total) em frangos para assar em crescimento. ': Análise de variância de uma só direção, efeito da dieta, n = 47; a, b: valores seguidos com as mesmas letras superescritas não diferem em p < 0,05. 2: análise de variância de uma só direção, n = 47 (trigo: 54% triturado ou 25% triturado + 30% total; enz: sem ou com 0,21/t xilano). 3: FCR: Relação de Conversão de Alimentação (g ração : g ganho) Tabela 2.4: Efeito de preparação de enzimas sobre digestibilidade aparente de aminoácidos (%) de uma dieta baseada em 54% de trigo em frangos para assar em crescimento (uma amostra de fezes misturada por tratamento).

Tabela 2.5: Efeito de preparação de enzimas sobre excreção de fósforo (P) e retenção aparente de fósforo de dieta baseada em trigo (54% trigo triturado) em frangos para assar em crescimento (n=l 2).

Exemplo 3: Avaliação de preparação de enzimas sobre AMEN de uma dieta baseada em trigo em perus em crescimento. O objetivo deste teste é demonstrar a eficácia de preparação de enzimas de Penicillium fimiculosum (atividade de β-glucanase: 100 U.kg'1 e atividade de xilanase: 1100 U/kg"1) sobre Energia Metabolizável Aparente (AME) de uma dieta baseada em trigo de acordo com o seguinte projeto experimental: (1) Controle; (2) EP 1: Preparação de enzimas (atividade de β-glucanase: 100 U.kg'1 e atividade de xilanase: 1100 U.kg'1); (3) EP 2: Preparação de enzimas (atividade de β-glucanase: 150 U.kg'1 e atividade de xilanase: 1650 U.kg'1); usando o processo de referência europeu (Bourdillon et al., 1990) com uma ração ad libitum e coleta de fezes total entre os dias 33 e 37 de idade. a. Material e Métodos Pássaros: Raça e condições de procriação Perus BUT9 do sexo masculino Ross de um dia de idade são criados em baterias de gaiolas coletivas até 20 dias de idade.

Eles foram então transferidos para baterias de gaiolas individuais para equilíbrio digestivo após um período de adaptação de pelo menos 7 dias.

Programas de umidade e temperatura padrão são aplicados. O programa de iluminação foi mantido 23 horas constantes no claro e 1 hora no escuro durante as duas primeiras semanas e depois reduzido a 15 horas no claro por 9 horas no escuro até o término da experiência.

Rações: Pássaros receberam dieta inicial de um dia de idade até 21 dias de idade e depois as rações experimentais.

Dietas experimentais Dietas experimentais continham 47% de trigo e 33% de farinha de soja (tabela 3.1). Pulverização de enzima foi feita sobre pelotas de 20 kg de dietas de controle.

Medição da energia metabolizável aparente No dia 21, pássaros foram pesados e distribuídos igualmente em gaiolas individuais por tratamento e foram então alimentadas as dietas experimentais. O equilíbrio inicia no dia 33 de acordo com o seguinte procedimento: D 32, pássaros ficaram em jejum durante a noite; D 33, pesando pássaros, bandejas de coleta limpas; D 34, fezes foram coletadas e congeladas; D 36, fezes foram coletadas e congeladas, jejum durante a noite; D 37, fezes foram coletadas e congeladas, pássaros pesados e realimentados.

Fezes foram então secadas por congelamento e trituradas como ração (1 mm, triturador Retsch). Energia total da ração e fezes são medidas em um calorímetro adiabático C5000 IKA. A AME é corrigida para equilíbrio de N levando em conta o ganho de peso do corpo (g) e seu teor de nitrogênio (21% de proteína crua).

Fezes foram então secadas por congelamento e trituradas como ração (1 mm, triturador Retsch). Energia total da ração e fezes são medidas em um calorímetro adiabático C5000 IKA. Proteína (N*6.25, processo Z130 Kjeldahl para rações e Z135 para fezes) é também determina e um perfil de aminoácido realizado por HPLC (processo Z100 para rações e Z080 para fezes), b. Resultados e discussão Energia Metabolizável Aparente (AME) Desempenhos zootécnicos e energia metabolizável são apresentados na tabela 3.2. Não houve nenhuma diferença significativa no desempenho do crescimento durante o equilíbrio entre tratamentos.

Em perus em crescimento, preparação de enzimas melhora AMEn de uma dieta baseada em trigo em 2,2 e 5,4% para EP 1 e EP 2, respectivamente. A melhora elevada observada demonstra o interesse de ambas as atividades (xilanase e β-glucanase) contidas na preparação de enzimas para polissacarídeos não amino hidrolisados de trigo, para melhorar o valor de energia deste cereal em perus em crescimento.

Tabela 3.1: Ingredientes principais e características analisadas de dietas experimentais.

Tabela 3.2: Efeito de preparação de enzimas sobre energia metabolizável aparente corrigida para equilíbrio de nitrogênio (AMEN) de uma dieta baseada em trigo em perus em crescimento (dias 32 a 37) (média ± SD) 1 Análise de variância de uma só direção: Efeito de enzima: n=60 : a,b : médias não seguidas pela mesma letra são significativamente diferentes em p < 0,05; Efeito de dosagem: 0, 0,2, 0,3 1/t.

2 Média ± SEM

Exemplo 4: Avaliação de preparação de enzimas produzida por eficácia de Penicillium funiculosum de dieta de ração completa baseada em trigo em porcos em crescimento. O objetivo é avaliar o efeito da suplementação enzimática de dietas baseadas em trigo sobre a digestão de enzimas no intestino delgado de porcos em crescimento. Atividade de nível normal de preparação de enzimas é 1100 U.kg'1 para xilanase e 100 U.kg'1 para β-glucanase. a. Material e Métodos Animais Os tratamentos foram testados de acordo com o projeto de quadrado Latin com três dietas e três períodos e dois porcos por período de dieta*. As dietas foram alimentadas em níveis fixados de acordo com o peso do porco em todo o período de teste.

Dieta Experimental Uma dieta a base em trigo de baixa qualidade e equilibrada com outros ingredientes de ração típicos foi alimentada a seis porcos em crescimento (ver tabela 4.1). A dieta foi dada ou: 1. não suplementada (basal); 2. suplementada (1) com preparação de enzimas a nível lx (atividade de β-glucanase: 100 U.kg*1 e atividade de xilanase: 1100 U.kg*1); 3. suplementada (2): com preparação de enzimas a nível 2 x (atividade de β-glucanase: 200 U.kg*1 e atividade de xilanase: 220 U.kg'1); A dosagem precisa da dieta foi obtida por diluição a preparação de enzimas com amido de milho para criar uma pré-mistura que foi então adicionada à dieta, como apropriado.

Coleta de amostra Sucos do íleo foram coletados durante um período de 48 horas cada semana de acordo com os procedimentos padrões nos laboratórios RPNA. Uma amostra do suco ileal e das dietas de teste foi analisada para energia por calorimetria de bomba por Sanders para determinar a energia digerível. Alíquotas das amostras foram armazenadas para outra análise, se necessário.

Análise estatística A digestibilidade da energia crua foi calculada a partir dos resultados da calorimetria de bomba dos sucos do íleo, ração e ingestão de ração. A análise da variância foi realizada nos cálculos de digestibilidade.

Tabela 4.1: Ingrediente e especificação de nutrientes da dieta basal Porcentagem de Inclusão Ingredientes Trigo 60,0 Cevada 9,7 Ervilhas 11,4 Farinha de peixe 5,0 Farinha de semente de girassol (30) 10,0 Lisina 0,15 Minerais e vitaminas 3,75 Total 100,0 Nutrientes Proteína 14,9 Matéria seca 84,9 Energia digerível (kcal/kg) 3150 Fibra 5,1 Dig. de lisina 0,8 b. Resultados e discussão A suplementação de xilanase de dietas de porcos aumentou a digestibilidade de energia em pelo menos seis por cento. Isto indica que a enzima está aumentando por ruptura das paredes de célula de material cru (particularmente trigo), e a liberação de energia adicional no intestino delgado.

Tabela 4.2: Efeito de suplemento de preparação de enzimas de dietas baseadas em trigo sobre a digestibilidade de energia de rações dadas a porcos em crescimento.

Exemplo 5: Efeito de preparação de enzimas produzida por Penicillium funiculosum no desempenho de palha, silagem de milho, dietas de silagem de grama e feno em ruminantes. O teste HFT (Hohenheimer Futterwertesten, Menke et ai, 1979, 1988) é um teste de incubação in vitro permitindo a medida de degradação de matéria prima através do volume de gás produzido pela fermentação destes produtos alimentícios em um suco para ruminantes tamponado. a. Materiais e processos 200 mg de substrato seco e triturado são incubados com 10 ml de suco para ruminantes mais 20 ml de tampão em seringas que foram suavemente agitadas em um rotor em um incubador de temperatura controlada (39°C). O volume de gás produzido foi registrado a 24 horas. O controle em branco (sem substrato), controle de feno padrão, e controle de concentrado padrão (com valor conhecido de produção de volume de gás líquido) são usados para corrigir os resultados e calcular um volume líquido de gás produzido em 24 horas. O valor de energia e OMD (digestibilidade de material orgânico) de substrato são calculados usando volume de gás produzido em 24 horas e equações de previsor propostas por Menke et al (1988). O suco de ruminante é coletado em 2 vacas, o rúmen canulado e alimentado a 8 horas e 17 horas com uma ração composta de 6 kg de feno e 2kg de concentrado (relação 75/25). A coleta do suco de rúmen é realizada logo antes da alimentação de manhã. O suco do rúmen é filtrado para evitar passagem de partículas alimentares e é mantido em condições anaeróbicas estritas. O objetivo desta tentativa é testar o efeito de aplicação de preparação de enzimas na forragem 15 horas antes da incubação de HFT.

Pré-tratamento com preparação de enzimas: a solução de enzima é espalhada na forragem no piso sobre feno, silagem de milho, forragem de feno e grama. A pulverização é realizada com 1 ml de preparação de enzima sobre um material seco de forragem de 2 kg. A forragem na borda (cerca de 10 cm) é rejeitada para melhorar a homogeneidade da amostra. Após tratamento, a forragem é misturada manualmente e deixada em temperatura ambiente durante 15 horas após pulverização. A incubação de HFT é realizada após 15 horas de contato da preparação de enzima através de uma série e 6 réplicas por tratamento, b. Resultados e discussão A produção de volume de gás líquida a 24 horas é dada na tabela 5.1 para palha, silagem de milho, forragem de feno e grama. A aplicação de celulase em palha através de pré-tratamento dá 18% de melhora de volume líquido de gás versus controle. Para silagem de milho, esta melhora é de 8%, para feno 9,5% e para silagem de grama 9%. OMD é dado na tabela 5.2 para a diferente forragem antes e após pré-tratamento. A digestibilidade de OM é respectivamente aumentada par a palha, silagem de milho, forragem de feno e grama versus controle: 8,5% palha, 5% de silagem de milho, 5,4% de feno e 5% de forragem de grama. 15 horas de pré-tratamento de forragens (palha, silagem de milho, feno, silagem de grama) com preparação de enzima melhora a intensidade de incubação de substrato de rúmen e digestibilidade OM do substrato.

Tabela 5.1: Produção de volume de gás puro em 24.horas Tabela 5.2: OMD

Exemplo 6: Efeito de preparação de enzimas produzidas por Penicillium funiculosum no desempenho de galinhas poedeiras alimentadas de trigo ou cevada O fim desta experiência é avaliar os efeitos de adição de preparação de enzimas em parâmetros produtivos de galinhas poedeiras alimentadas com dietas a base em trigo ou cevada, a. Material e processos Projeto experimental - 4 tratamentos x 8 réplicas x 5 gaiolas x 3 galinhas Tratamentos: 1. Controle 1 : 60% trigo 2. Controle 1 + preparação de enzimas 3. Controle 2 : 60% de cevada 4. Controle 2 + preparação de enzimas Animais, alojamento e administração A tentativa foi conduzida em quatrocentas e oitenta galinhas de cor marrom na cepa Hy-Line. Cada replicata foi formada por cinco galinhas, com um alimentador comum, isto é, um total de trinta e duas réplicas de quinze aves cada.

Distribuídas em duas salas idênticas, as réplicas tinham luzes e ventilação programáveis. O programa de iluminação começou com 14 horas de luz por dia na chegada das galinhas com 17 semanas de idade, aumentando a cada duas semanas em 30 minutos até um máximo de 17 horas de luz por dia.

As galinhas tinham 22 semanas de idade no começo da experiência, que durou durante os primeiros cinco meses de período de por os ovos.

Dietas e alimentação Foram feitas duas dietas experimentais com base em 60% de trigo (dieta 1) e 60% de cevada (dieta 2) e 10% de farinha de girassol. Sua composição é mostrada na tabela 6.1. As características dos cereais são apresentadas na tabela 6.2.

Controles Análise química - Amostras de ração O controle de qualidade de rações experimentais foi realizado por análise de material seco, proteína crua, gordura crua e cinza. A atividade de xilanase (T-l, T-2) e atividade de β-glucanase (T-3, T-4) foi determinada em rações amassada. - Medidas O consumo de ração e eficácia da ração foram registrados a cada quatro semanas. As galinhas foram pesadas no começo e no final da experiência. A produção de ovos, peso dos ovos, e porcentagem de ovos sujos e com defeitos foi registrada diariamente, durante cinco períodos de quatro semanas cada. A mortalidade foi verificada e registrada diariamente, incluindo a causa da morte, b. Resultados e discussão Tentativa de desempenho Os parâmetros produtivos obtidos durante a tentativa são mostrados nas tabelas 6.3 e 6.5. Nos primeiros dois períodos (da semana 22 a 30) e na experiência global, a porcentagem de ovos sujos foi estatisticamente afetada por tratamento (P > 0,005). Os animais alimentados com dieta de trigo sem enzima produziram mais ovos sujos. As diferenças estatisticamente significantes entre tratamentos foram verificadas na porcentagem de por ovos (P > 0,05) e no peso do ovo (P > 0,005) do segundo período no final da experiência. Os animais alimentados com dietas de cevada apresentaram maior porcentagem de ovos e produziram ovos mais pesados do que os animais alimentados com dietas de trigo. A preparação de enzima parece aumentar estes parâmetros mas não significativamente a um nível de probabilidade de 0,05.

Em todos os períodos experimentais, a ingestão de ração de animais de tratamentos T-3 e T-4 (dietas com cevada) foi maior do que o consumo de animais alimentados com dietas de trigo, devido aos níveis de energia de ambas as dietas (dietas de cevada foram formuladas a 2600 kcal/kg de energia enquanto as dietas de trigo continha 2800 kcal/kg). Levando em conta os diferentes valores de energia de ambos os tipos de dietas e consumo de ração de animais, no período global, todos os animais apresentaram o mesmo consumo de energia diária. A eficiência de ração (expressa como g ração/ g de ovo) de dietas experimentais durante o primeiro período foi muito alta devido à baixa taxa de pôr ovos das galinhas durante este período de tempo. Nos primeiros dois períodos, a eficiência da ração para tratamentos com trigo foi melhor do que a obtida com tratamentos de cevada; mas no terceiro período, quando maiores porcentagens de produção de ovos foram registradas, ambos os tipos de dietas apresentaram efíciências similares. Da semana 34 até o final da experiência, as dietas com cevada apresentaram maiores efíciências de ração do que os tratamentos com trigo. A enzima tende a melhorar a eficiência da ração (P > 0,05). No período global, β-glucanase melhorou a eficiência da ração da dieta com cevada (com um P = 0,066). A tabela 6.4 mostra que as galinhas poedeiras alimentadas com trigo suplementado com preparação de enzimas tendem a demonstrar maiores taxas de produção de ovos (+ 1,5 pontos absolutos), maior peso médio do ovo (+ 0,37 g) e menor relação de conversão de ração (- 2,7%) do que as não suplementadas. A tabela 6.5 mostra que a adição de preparação de enzima para galinhas poedeiras alimentadas com cevada melhorou a taxa de produção de ovos (+ 4%), peso médio do ovo (+ 0,7%) e relação de conversão de alimentação (- 5,7%) comparado com as dietas de cevada de controle.

Tabela 6.1: Composição de dietas em galinhas poedeiras experimentais (*): um quilo de ração contém: Vitamina A 800UI, Vitamina D3: 1600UI; Vitamina E: 5 mg; Vitamina K3: 2 mg; Vitamina Bl: 1,5 mg; Vitamina B2: 4 mg; Vitamina B6: 3 mg; Vitamina B12: 11,8 μg; ácido fólico: 0,35 mg; Biotina: 150 μg; Pantotenato de cálcio: 10 mg; Ácido nicotínico: 20 mg; Mn: 30 mg; Zn: 50 mg; I: 0,3 mg; Fe: 50 mg; Cu: 6 mg; Se: 0,1 mg; Etoxiquin: 125 mg.

Tabela 6.2: Composição analítica de cereais Tabela 6.3: Parâmetros de produtividade de 22 a 42 semanas (protocolo experimental completo) comparação com galinhas perfeitas geneticamente (valor dado pelo fornecedor de galinhas) Valores são médias de oito réplicas de 15 galinhas. Nas colunas, médias seguidas por um superescrito diferente são signifícativamente diferentes (P < 0,05) Tabela 6.4: Efeito de xilano sobre desempenho em galinhas poedeiras alimentadas com trigo (em valores1 absolutos e porcentagem2 comparados com controle). 3. Durante o período de 22-42 semanas Tabela 6.5: Efeito de preparação de enzimas sobre desempenho de galinhas poedeiras alimentadas com cevada (em valores1 absolutos e porcentagem2 comparados com controle) -_Para o período de 22-42 semanas.

Claims

1. Composição liquida, caracterizada pelo fato de conter: - agente antimicrobiano 0,005-0,35% - sorbitol 20% - 50% - agentes anti-congelamento 0-40% - caldo de fermentação filtrado concentrado produzido por Penicillium funiculosum IMI 378536 0,3 a 76% - tamponado e ajustado em pH 3 a 5, em que dita composição líquida compreende 4%· - 10% de produtos microbianos de caldo de fermentação filtrado concentrado produzido por Penicillium funiculosum IMI 378536 como sólidos orgânicos totais com relação ao peso da composição completa.

2. Composição líquida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato dc que o agente antimicrobiano é escolhido dentre ácido sórbico e saís, ácido benzóico e sais, 4-hidroxibenzoato de metila, 4-hidroxibenzoato de n-propila, ácido fumárico, sais e ésteres, cloreto de sódio, ou cloreto de potássio.

3. Composição líquida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que os agentes anti-congelamento são escolhidos dentre 1,2-propanodiol, etileno glicol, glicerol.

4. Composição em pó, caracterizada pelo fato de conter: - produtos microbianos como sólidos orgânicos totais 16%-40% - 59%- 83% de veículo - 16%-40% dc caldo de fermentação seco de P. funiculosum IMI 378536 como sólidos orgânicos totais com relação ao peso da composição completa - 1% de outros componentes de caldo de fermentação seco de P, funiculosum IMI 378536.

5. Composição em pó de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os veículos são escolhidos dentre farinha de trigo, amido, gesso, maltodextrina, sólido de milho, subprodutos de processamento de cereais, como grânulos de milho, produtos inferiores de trigo, farelo de trigo, restos de centeio.

6. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para alimentar animais de fazenda como aves domésticas, suínos, ruminantes.

7. Uso da composição como definida na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser para melhorar a digestibilidade de cereais, como trigo, cevada, centeio, triticale, aveia, arroz; sementes oleígenas, como soja, girassol, semente de colza; e subprodutos de cereais como farelo de trigo.

8. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para diminuir a excreção de fósforo.

9. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para aumentar a utilização digestiva de fósforo.

10. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para melhorar a digestibilidade de aminoácidos.

11. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para reduzir a amônia no ar das baterias.