JP6056870B2

JP6056870B2 - 新規キシラナーゼ

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Publication number: JP6056870B2
Application number: JP2014542185A
Authority: JP
Inventors: 石川　一彦; 一彦石川; 井上　宏之; 宏之井上
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Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2017-01-11
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Description

本発明は、キシラナーゼ及びその遺伝子並びにこれらの利用に関する。

キシランは広く天然に存在する多糖の１つであり植物の主要構成成分である。その構造は、キシロースを単位とするβ-1,4キシロシド結合により重合した主鎖を有する高分子多糖である。キシランは、天然には、キシロースだけで構成されるホモキシラン以外に、アラビノースが分岐して主鎖に結合したアラビノキシランなどのヘテロキシランとして存在する。

キシラナーゼは、キシランを加水分解する酵素群の総称であり、動植物及び微生物に広く存在する。これまでに細菌、放線菌、酵母、カビ等に由来するキシラナーゼについて主に研究がなされてきた。キシラナーゼは、キシランからのキシロオリゴ糖やキシロースの製造及びバイオマス処理に利用されている。特に近年、バイオマス処理における酵素の利用という観点からキシラナーゼの有用性が注目されている。例えば、アルコール燃料用農業廃棄物の酵素分解、動物飼料中の糖を遊離させるための酵素処理、セルロース製造時にパルプを溶解させるための酵素処理、木材パルプ漂白における酵素処理などにおいてキシラナーゼの使用が挙げられる。

紙パルプ工業では、パルプの白色度向上あるいは品質の向上、パルプ漂白工程で使われる塩素系漂白剤等の化学漂白剤使用量の削減、故紙再生工程におけるパルプフリーネスの向上などへのキシラナーゼの応用に期待が高まっている。また、キシラナーゼは、飼料用や食品加工分野でも使用されている（特許文献１）。

本発明は、バイオマス分解、食品加工、パルプ漂泊、飼料、サイレージ等の用途に有効な新たな高活性キシラナーゼを提供することを目的とするものである。

特開平０６−２６１７５０

上記の現状の下、本発明は、各種の酵素学的性質に優れ、工業的な用途に適した新たなキシラナーゼを提供することを目的とする。

本発明者等は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、高温条件下でも十分なキシラナーゼ活性を有する新たなポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡの取得に成功した。また、本発明者等は、当該酵素の立体構造を解析し、触媒部位に存在する主要なアミノ酸を同定した。更に本発明者等は、当該ポリペプチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ中に、更なるキシラナーゼをコードする遺伝子群及び遺伝子断片の存在を確認し、さらに、これらの情報を基に、新規キシラナーゼが複数存在することを突き止めた。本発明者等は、かかる知見に基づき、更なる検討と改良を重ね、本発明を完成するに至った。

以下に代表的な本発明を示す。
項１．
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるポリペプチド：
（ａ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、キシラナーゼ活性を有する、ポリペプチド。
項２．
下記の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかであるポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号８〜２１のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；及び
（Ｃ）配列番号８〜２１のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
項３．
項２に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項４．
項３に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
項５．
項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、キシラナーゼの製造方法。
項６．
キシランを含む試料に項１に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、キシロース及び／又はキシロビオースを製造する方法。

本発明のポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有するため、キシランを含有する試料に作用させることにより、キシロース及び／又はキシロオリゴ糖を工業的に製造することができる。また、好適な実施形態において、本発明のポリペプチドは比活性が高く、熱安定性に優れているため、温度変化を伴う環境下や比較的高い温度（例えば、４０℃〜８０℃）での使用に適している。更に、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするため、当該ポリヌクレオチドを適当な宿主で発現させることにより、本発明のポリペプチド（即ち、キシラナーゼ）を効率的且つ大量に生産することが可能である。

図１は、実施例１で精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を示す。図２は、実施例２で測定した精製タンパク質のキシラナーゼ活性を示す。図３は、実施例３で測定したキシラナーゼの温度依存性を示す。図４は、実施例５において、ハンギングドロップ法を用いて結晶化したキシラナーゼの写真を示す。図５は、構造解析によって示された本発明のキシラナーゼの立体構造を示す。図６は、ゲノムＤＮＡ中にコードされる７つのキシラナーゼのアミノ酸配列のアライメントを示す。

１．キシラナーゼ活性を有するポリペプチド
本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド；又は（ｃ）配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、キシラナーゼ活性を有する、ポリペプチドである。

配列番号１で示されるアミノ酸配列は、後述する実施例においてキシラナーゼ活性を有することが確認されている。構造解析の結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１１９位及び２１０位のグルタミン酸が触媒部位に相当すると考えられ、これらのアミノ酸は配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列において保存されている。また、前記１１９位及び２１０位のアミノ酸の周辺のアミノ酸配列についても、配列番号１〜７のアミノ酸配列において高度に保存されている。更に、配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列とは、各々３７％、４２％、３５％、３７％、４７％及び４１％の同一性を有する。従って、配列番号１〜７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドはキシラナーゼ活性を有すると考えられる。配列番号２２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列にシグナルペプチドが付加されたものである。また、配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列もＮ末端にシグナルペプチドが付加されている。

上記（ｂ）のポリペプチドに関し、「数個」とは、キシラナーゼ活性を有する限り、また好ましくは優れた温度依存性を有する限り、特に制限されないが、例えば、５０個、４５個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、３個、又は２個である。キシラナーゼ活性の有無は、例えば、ソモギ-ネルソン法等の公知に手法を用いて確認することができる。（ｂ）のポリペプチドの具体例としては、配列番号２〜７及び２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。

当該変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は、特に制限されないが、ポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、同様の性質を有するファミリーに分類することができる。よって、アミノ酸置換は、もとのアミノ酸配列に存在するアミノ酸と同一の上記カテゴリーに属する他のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。

（ｂ）のポリペプチドにおいて、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加等の変異は、ポリペプチドの高次構造に顕著に影響しない領域や触媒活性に直接的に関与しない領域において成されることが好ましい。そのような領域としては、例えば、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、又は配列番号１〜７の間の保存性が低い領域を挙げることができる。例えば、Ｎ末端及び／又はＣ末端にシグナル配列が付加されていてもよい。シグナル配列としては、特に制限されないが、例えば、３〜５０個、好ましくは５〜３０個のアミノ酸からなるものを挙げることができる。

保存性が比較的低い領域としては、例えば、配列番号１の２〜２９位、３４〜３９位、４１〜４４位、４６〜５２位、５８〜６０位、７０〜７３位、７５〜８６位、１１１〜１１７、１４２〜１４９位等を挙げることができる。従って、これらの領域において、好適に１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入及び／又は付加することができると考えられる。配列番号１の１１９位及び２１０のグルタミン酸はキシラナーゼ活性の触媒部位に直接関与すると考えられる。よって、キシラナーゼ活性を低下させないという観点からは、これらのアミノ酸を中心とした前後１０個、好ましくは５個、より好ましくは３個、更に好ましくは２個、特に好ましくは１個のアミノ酸には変異を加えないことが好ましい。また、配列番号１〜７のいずれかで示されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニンは欠失していてもよい。

１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加は、配列番号１〜７のいずれのアミノ酸配列に対して成されてもよいが、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して行うことが好ましい。配列番号１〜７のような特定のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異を加える技術は当該技術分野において公知であるため、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法等を利用して行なうことができる。

（ｃ）のポリペプチドに関し、アミノ酸配列の同一性は、配列番号１〜７のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。また、一実施形態において、（ｃ）のポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して上記の同一性を有するポリペプチドであることが好ましい。

アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、
ClustalW ver2.1 Pairwise Alignment（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を使用し、デフォルトのパラメータを用いて算出することができる。また、解析全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ。（Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。

本発明のポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有し、至適活性温度が約７０℃であることが好ましく、約４０℃〜８０℃において十分な活性を示すことが好ましい。ここで十分な活性とは、至適活性温度における活性を１００％として６０％以上、好ましくは７０％以上の活性を有することを意味する。また、本発明のポリペプチドは、ｐＨ約５〜６．５に至適ｐＨを有することが好ましい。

本発明のポリペプチドは、後述する本発明のポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。また、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜７に示されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することも可能である。

２．ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記１．のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。本発明の代表的なポリヌクレオチドは、配列番号８〜２１のいずれかによって示される塩基配列を有するポリヌクレオチドである。配列番号８及び９の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号１０及び１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドは配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号１２及び１３の塩基配列を有するポリヌクレオチドは配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号１４及び１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドは配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号１６及び１７の塩基配列を有するポリヌクレオチドは配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号１８及び１９の塩基配列を有するポリヌクレオチドは配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号２０及び２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドは配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０の塩基配列は、イントロンに相当する領域がない配列であり、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１の塩基配列にはイントロンに相当する領域が含まれる。

（Ｃ）のポリヌクレオチドに関し、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、好ましくは６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。尚、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素は、上記温度条件以外にも種々知られており、当業者はそれらを適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。

上記のような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、部位特異的な変異を加えることで回避可能であり、公知の手法で酵素活性を測定して容易に取り除くこともできる。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、通常、プローブとして使用するポリヌクレオチドと一定以上の相同性を有する。その相同性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、一層好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。尚、配列番号８に示される塩基配列と比較した配列番号９〜２１で示される塩基配列の相同性は、順に、９９％（配列番号９）、５８％（配列番号１０）、６０％（配列番号１１）、６２％（配列番号１２）、６３％（配列番号１３）、５７％（配列番号１４）、６２％（配列番号１５）、６３％（配列番号１６）、６２％（配列番号１７）、６４％（配列番号１８）、６７％（配列番号１９）、５９％（配列番号２０）、及び６１％（配列番号２１）である。これらは、ClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を使用し、デフォルトのパラメータで算出した値である。

塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、ＡｄｖａｎｃｅｄＢＬＡＳＴ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、単離された状態で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離されたＤＮＡ」は、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まないことを意味する。

本発明のポリヌクレオチドは、配列番頭８〜２１に示される塩基配列の情報に基づいて、化学的なＤＮＡの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。

３．発現ベクター
本発明の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含み、且つ、当該ポリヌクレオチドの発現が可能である限り特に制限されず、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含んでいてもよい。

ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。

大腸菌で発現可能なベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、及びpET等を挙げることができる。酵母で発現可能なベクターとしては、例えば、pBR322、pJDB207、pSH15、pSH19、pYepSec1、pMFa、pYES2等を挙げることが出来る。昆虫で発現可能なベクターとしては、例えば、pAc及びpVL等を挙げることが出来る。

宿主細胞として真核細胞を使用する場合は、発現ベクターとして、発現しようとするポリヌクレオチドの上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを好適に使用することができ、更に必要により複製起点、エンハンサー、及び／又は選択マーカーを有していてもよい。

４．形質転換体
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターで形質転換されている。形質転換に使用される宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでも良い。具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア・コリ属細菌（例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等）、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞；、サッカロミセス属、ピシア属及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属及びアクレモニウム属等の真菌細胞；、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞；並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、麹菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、ポリペプチドを培地中に生産させることもできる。

組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等の種々の方法が挙げられる。コリネ型細菌への導入方法としては、具体的には例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，１０６７−１０７０）（１９８９））等を使用することができるが、これらに限定されない。

本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドを産生可能であるため、本発明のポリペプチドを製造するために用いることが可能であり、また形質転換体の状態で、キシランを含む試料からキシロース及び／又はキシロオリゴ糖を製造するために使用することもできる。

５．形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法
本発明の形質転換体を培養し、培養物からキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行うことができる。また、培養は、形質転換体の内外に生産されたポリペプチドの活性を指標にして、適当量得られるまで実施することができる。

培地としては、宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。例えば、大腸菌の培養にはＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加した培地を用いることができる。

培養条件も宿主の種類に応じて適宜設定することができる。通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。キシラナーゼ発現のために誘導型プロモーターを用いる場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。

培養上清からのキシラナーゼの精製又は単離は、公知の手法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等の溶媒沈殿、透析、限外濾過、酸抽出、及び各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）等を用いた手法が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、例えば、キシラナーゼに対する抗体を結合させた担体や、キシラナーゼにペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合した担体を利用することもできる。

キシラナーゼが宿主の細胞内に蓄積される場合は、形質転換細胞を破砕し、破砕物の遠心上清から上記と同様にしてキシラナーゼを精製又は単離することができる。例えば、培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０〜１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕し、破砕処理液を１００００〜１５０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心して上清を得ることができる。遠心後の沈殿は、必要に応じて塩酸グアニジウム又は尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。

得られたポリペプチドのキシラナーゼ活性の測定は、キシランを含むバイオマス（例えばバガス）を基質とした糖化試験により確認することができる。また精製された酵素の活性測定は、例えば、Bailey et al. J. Biotech. 23(1992) 257-270記載の方法によって測定することができる。

６．本発明のポリペプチドを用いたキシロース／キシロオリゴ糖の製造方法
キシラナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを、キシランを含む試料（例えば、バイオマス資源）に接触させることにより、バイオマス資源を分解し、キシロース及び／又はオリゴキシロースを含む糖液を製造することができる。また、キシランを含む試料として、バイオマス資源を使用する場合は、本発明のポリペプチドに加えて、他のセルラーゼ等の酵素を併用し、より効率的に糖液を製造することもできる。

キシランを含む試料の種類は、本発明のポリペプチドによって分解可能である限り特に制限されないが、例えば、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等を挙げることができる。本発明においてはバガスを用いることが望ましい。

キシランを含む試料からキシロース及び／又はオリゴキシロースを含む糖液を製造する方法は、公知の手法に従って行うことができる。利用するバイオマス資源は、乾燥物でも、湿潤物でもよいが、処理効率を高めるために予め１００〜１０００μｍサイズに粉砕されていることが好ましい。粉砕はボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の装置を用いて行うことができる。そして、粉砕したバイオマス資源を水性媒体中に懸濁し、本発明のキシラナーゼとセルラーゼを加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化することができる。キシラナーゼは、単独で用いても良いが、効率的にバイオマスを分解するという観点からは、他のセルラーゼ等と組み合わせて試料に添加することが好ましい。

本発明のポリペプチドを水溶液中でキシランを含む試料に接触させる場合は、反応液のｐＨおよび温度は、キシラナーゼが失活しない範囲であればよい。本発明のキシラナーゼは、至適温度が比較的高く、温度安定性にも優れているため、至適温度又はその付近の温度で反応を行うことが効率的に試料を分解し、糖液を得るという観点から好ましい。例えば、本発明の製造方法は、常圧の下、５〜９０℃、好ましくは１５〜８０℃、より好ましくは３０〜７５℃、５０〜７０℃又は５０〜６５℃、ｐＨ４〜９の条件で実施することができる。添加する本発明のポリペプチドの量は、特に制限されないが、例えば、０．１〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。

本発明の方法で得られるキシロース及び／又はオリゴキシロースを含有する糖液は、そのまま利用しても良く、水分を除去して乾燥物として使用しても良く、目的に応じて、更に化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解することも可能である。糖液又はその分画物は、例えば、発酵法によりメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールの原料として使用することができる。

実施例１キシラナーゼの取得
配列番号８で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを、発現プラスミドベクターpET11aにライゲーション反応によって導入した。この組換え発現ベクターを用いて大腸菌株BL21(DE3)を形質転換した。これをLB培地（0.1mg/mLアンピシリン含む）に植菌し、37℃でOD0.6になるまで振盪培養後、0.1mM IPTGを加えて30℃で一晩振盪し、タンパク質の発現を誘導した。培養終了後、菌体を遠心分離で回収し、-20℃で凍結後、50mLの20mM Tris-HCl pH8.0で懸濁・溶解し、遠心分離により上清溶液を回収した。得られた上清を陰イオンクロマトグラフィ（HiTrap Q HPカラム：GEヘルスケア社製）を用いて、0.0-1.0M NaClにてグラジェント溶出を行い、ポリペプチド（XYLC-R1）を精製した。陰イオンクロマトグラフィは、溶出速度3ml/minで行った。得られた精製画分について、SDS-PAGEにより分子量及び均一性を調べた（図１）。

実施例２精製タンパク質の活性測定
50mMの酢酸ナトリウムバッファー（pH5.5）に0.5μMの精製タンパク質（XYLC-R1）及び0.5質量%キシランを加え（各々最終濃度）、50℃で酵素反応を開始した。反応開始後０、１０、２０、３０及び６０分の時点でソモギ-ネルソン法により還元糖濃度を測定した（図２）。図２に示される通り、測定の結果、十分な還元糖の遊離が確認され、精製タンパク質がキシラナーゼであることを確認した。

実施例３酵素活性の温度依存性
反応温度の酵素活性への影響を調べるため、実施例２と同様の酵素活性の測定を、反応温度を30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、及び80℃に変化させて行った。また比較対象として同濃度のトリコデルマ由来キシラナーゼについても20〜50℃の範囲で同様に活性を測定した。結果を図３に示す(■は実施例１で精製したキシラナーゼであり、◆はトリコデルマ由来のキシラナーゼである。)。図３から、本発明のキシラナーゼは、測定された温度範囲において、トリコデルマ由来のキシラナーゼよりも格段に高い活性を有することが確認された。

実施例４酵素活性のｐＨ依存性
実施例２でキシラナーゼであることを確認した酵素について、ｐＨの値が３〜１０のバッファーを用いて、キシラナーゼ活性への影響を調べたところ、ｐＨ５〜６．５が至適ｐＨであることが判明した。

実施例５酵素タンパク質の結晶化
実施例１で精製したタンパク質を、ハンギングドロップ法を用い、次の条件で結晶化させた：酵素濃度（10mg/mL）；結晶母液（0.8M NaH2PO4, 0.8M KH2PO4, 0.1M BisTris pH5.5）；結晶化温度（25℃）；結晶化日数（約3日）。得られた結晶の写真を図４に示す。Ｎ末端領域の約10〜13残基の電子密度が見えないため、これらのアミノ酸残基（Ｎ末端領域の約10〜13残基）は、酵素の構造および機能には必要ないことが推察される。

実施例６酵素タンパク質の結晶構造解析
SPring８において、酵素結晶が反射するX線の反射点をHKL2000で収集積分した後、スケーリングしたデータを用いて、相同タンパク質をモデルとして分子同型置換法により位相決定し、精密化した後、本キシラナーゼの構造を決定した。構造解析の結果、へリックス及びベーターシート構造が確認され、触媒部位に存在するアミノ酸残基として119位及び210位のグルタミン酸が同定された（図５）。

実施例７更なるキシラナーゼの同定
上述する実施例でキシラナーゼであることが確認されたタンパク質（XYLC-R1）をコードするＤＮＡ配列を基に当該ＤＮＡが由来する生物のゲノムＤＮＡとの相同性検索を行った。相同性検索は、市販ソフトウエアin silico Molecular Cloningを用いて行った。ClustalW Ver.2 Multiple Alignmentのデフォルトのパラメータを用いて多重アライメントの解析を実施した。その結果、キシラナーゼであることが推測されるアミノ酸配列が更に６個見つかった。これらのアミノ酸配列のアライメントを図６に示す。図６において、＊は完全に保存されているアミノ酸を意味し、「・」は中程度に保存されているアミノ酸を意味し、「・・」は高度に保存されたアミノ酸を意味する。XYLAのアミノ酸配列は配列番号２で示され、XYLBのアミノ酸配列は配列番号３で示され、XYLDのアミノ酸配列は配列番号４で示され、XYLEのアミノ酸配列は配列番号５で示され、XYLFのアミノ酸配列は配列番号６で示され、XYLGのアミノ酸配列は配列番号７で示される。

実施例８キシラナーゼ活性の確認
実施例７において、キシラナーゼを構成することが推測されたタンパク質（XYLA、XYLB、XYLD、XYLE、XYLF、及びXYLG）をコードする塩基配列をゲノムDNAから取得するためのプライマーを下記の表の通り設計した。

これらのプライマーは、５’末端側に制限酵素部位HpaI（GTTAAC）又はSbfI（CCTGCAGG）を含んでいる。各プライマーセットを用いて、常法に従ってゲノムDNAを鋳型として、XYLA, XYLB, XYLC, XYLD, XYLE, XYLF, XYLGをコードするポリヌクレオチド断片を増幅した。それらをHpaI及びSbfIで切断し、制限酵素部位（EcoRV-SbfI）を有するプラスミドに導入し、各タンパク質を発現させるための７種の組換えプラスミドを得た。

各種組換えプラスミドを、公知の方法に従ってウラシル要求性微生物株の染色体中に、プロトプラスト-PEG法を用いて非相同的に組み込み、７種の形質転換体を取得した。これらを、２％デンプンを炭素源とする培地で培養し、培養液を取得してキシラナーゼ活性を実施例２と同様にして確認した。その結果を下記の表２に示す。

上記の通り、XYLD以外全てのタンパク質についてキシラナーゼ活性が確認された。また、組換え発現させた各タンパク質をカラムクロマトグラフィーによって均一に精製し、N-末端配列を決定して目的の組換え酵素であることを確認した。確認された各タンパク質のN-末端配列を下記の表３に示す。

Claims

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
請求項２に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、キシラナーゼの製造方法。
キシランを含む試料に請求項１に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、キシロース及び／又はキシロビオースを製造する方法。