BRPI9813021B1 - processo para a preparação microbiana de aminoácidos de l-lisina, l-treonina, l-homosserina e glutamato, vetor, e célula transformada - Google Patents

Abstract

patente de invenção:<b>"processo para preparação microbiana de aminoácidos da família do aspartato e/ou glutamato e agente empregável no processo"<d>. a presente invenção refere-se a um processo para preparação microbiana de aminoácidos da família do aspartato e/ou glutamato, pelo qual a atividade piruvato-carboxilase é elevada por modificação genética da enzima e/ou a referida expressão genética piruvato-carboxilase de um microorganismo produtor de aminoácidos é elevada. além disso a presente invenção refere-se a um gene piruvato-carboxilase assim como a outros agentes empregáveis no processo de acordo com a invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO MICROBIANA DE AMINOÁCIDOS DE L-LISINA, L-TREONINA, L-HOMOSSERINA E GLUTAMATO, VETOR, E CÉLULA TRANSFORMADA". A invenção refere-se a um processo para preparação microbiana de aminoácidos da família do aspartato e/ou do glutamato de acordo com as reivindicações de 1 até 17, genes piruvat-carboxilase de acordo com as reivindicações de 18 até 23, estruturas genéticas de acordo com a reivindicação 24, vetores de acordo com a reivindicação 25, células transformadas de acordo com as reivindicações de 26 até 31, assim como aplicações de acordo com as reivindicações de 32 até 37.

Aminoácidos são de grande interesse econômico, sendo que o emprego de aminoácidos é diversificado: assim por exemplo a L-lisina, como também L-treonina, L-metionina e L-triptofano, são necessárias como aditivos de forragem, L-glutamato como aditivo de tempero, L-isoleucina e L-tirosina na indústria farmacêutica, L-arginina e L-isoleucina como medicamento ou L-glutamato, L-aspartato e L-fenilalanina como substâncias de partida para a síntese de produtos químicos finos.

Um processo preferido para preparação desses mais diversos aminoácidos é a preparação biotecnológica por meio de microorganismos; porque desta maneira obtém-se diretamente a forma biologicamente eficaz e óticamente ativa dos respectivos aminoácidos, e podem ser empregadas matérias-primas simples e econômicas. Como microorganismos são empregados por exemplo Corynebacterium glutamicum e suas linhagens flavum e linhagem lactofermentum afins (Liebl e outros, Int J System Bacteriol 1991,41: 255 até 260), afins, como também, Escherichia coli e bactérias afins.

Essas bactérias produzem os aminoácidos normalmente apenas na quantidade necessária para o crescimento, de modo que também não são formados nem precipitados nem aminoácido em excesso. Isto é fundamentado pelo fato de que na célula a biossíntese dos aminoácidos é controlada de maneira variada. Conseqüentemente são conhecidos os mais diversos processos para aumentar a formação de produto através de desati- vação dos mecanismos de controle. Nesses processos são empregados por exemplo análogos de aminoácidos, para desligar o controle eficaz da bios-síntese. Assim, por exemplo, é descrito um processo pelo qual são utilizados gêneros de bactéria corine que são resistentes a análogos de L-tirosina e L-fenilalanina (JP 19037/1976 e 39517/1978). Igualmente são descritos processos, nos quais são empregadas bactérias resistentes contra análogos de 1-lisina e L-tionina, para suplantar os mecanismos de controle (EP 0 205 849, GB 2 152 509).

Além disso, também são conhecidos microorganismos construídos por recombinantes técnicos de DNA, pelos quais igualmente a regulação da biossíntese é aumentada, em que os genes são codificados, clona-dos e expressos para as enzimas-chave não mais feedback - inibíveis. Assim, por exemplo, é conhecida uma bactéria recombinante produtora de L-lisina com aspartaquinase resistente a feedback e codificada com plasmídeo (EP 0 381 527). Do mesmo modo, é descrita uma bactéria recombinante produtora de L-fenilalanina com pré-fenato deshidrogenase resistente a feedback (JP 123475/1986, EP 0 488 424).

Além disso foram alcançados elevados rendimentos de aminoácidos, codificados também pela sobreexpressão de genes, que não codificam as enzimas da síntese de aminoácido sensíveis a feedback. Assim, por exemplo, a formação de lisina é aperfeiçoada por síntese elevada da dihi-drodipicolinato sintase (EP 0 197 335). Da mesma forma alcança-se através de síntese elevada da treoninadehidratase uma formação de isoleucina aperfeiçoada (EP 0 436 886).

Outras tentativas para elevação da produção de aminoácidos objetivam uma preparação aperfeiçoada dos metabolitos primários celulares da troca celular central. Assim é conhecido, que a sobreexpressão da trans-quetolase, obtida através das técnicas recombinantes, possibilita uma formação de produto aperfeiçoada de L-triptofano, L-tirosina ou L-fenilalanina (EP 0 600 463). Além disso, a redução da atividade fosfoenolpiruvato-carboxilase nas bactérias corine leva à formação aperfeiçoada de aminoácidos aromáticos (EP 0 3331 145), enquanto que a elevação da atividade de fosfoenolpiruvato-carboxilase nas bactérias corine leva ao elevado desprendimento de aminoácidos da família aspartato (EP 0 358 940).

Durante o crescimento e especialmente sob condições de preparação de aminoácidos, o ciclo de ácido tricarboxílico deve ser preenchido continuamente e eficazmente com compostos C4, por exemplo oxalacetato para substituir os produtos intermediários extraídos da biossíntese de aminoácido. Até pouco tempo pressupôs-se que fosfoenolpiruvato-carboxilase era responsável para essas funções denominadas anapleróticas na bactéria corine a (Kinoshita, Biology of industrial micro-organisms 1985: 115 até 142, Benjamin/Cummings Publishing Company, Londres; Liebl, The Prokaryotes II, 1991: 1157 até 1171, editora Springer Verlag, Nova Iorque; Vallino e Stephanopoulos, Biotechnol Bi-oeng 1993, 41: 633 até 646). Verificou-se entretanto, que mutantes fosfoenolpi-ruvato-carboxilase-negativas em comparação aos respectivos gêneros de partida em todos os meios testados cresceríam igualmente (Peters-Wendisch e outros, FEMS Microbiology Letters 1993, 112:269 até 274; Gubler e outros, Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857 até 863). Este resultado mostrou, que a fosfoenolpiruvato-carboxilase não é essencial para o crescimento e para as reações anapleróticas não desempenha nenhum ou apenas um papel subordinado. Além disso, o resultado acima comprovou que na bactéria corine deve haver pelo menos uma outra enzima, que é responsável pela síntese de oxalacetato e que é necessária para o crescimento. Recentemente, verificou-se também efetivamente uma atividade de piruvato-carboxilase nas células permeabi-lizadas de bactéria corine glutamicum (Peters-Wendisch e outros, Microbiology, 1997, 143: 1095 até 1103). Essa enzima é eficazmente inibida por AMP, ADP e acetil-coenzima A e formada na presença de lactato como fonte de carbono em quantidade elevada. O aparecimento de uma piruvato-carboxilase na bactéria corine glutamicum também foi demonstrado ou confirmado por um outro grupo de trabalho por meio de espectroscopia 13 C-RMN e GS-MS (Park e outros, Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 47: 430-440). Já que foi necessário se partir do princípio de que essa enzima em primeiro lugar é responsável pelo preenchimento dos ciclos de ácido tricarboxílico no crescimento, era de se esperar que uma elevação da expressão genética ou da atividade enzimática ou conduz a um aumento menor, ou em todo caso ligeiramente maior dos aminoácidos pertencentes à família do aspartato. Além disso, era de se esperar que um aumento da expressão genética ou da atividade enzimática da piruvato-carboxilase igualmente não teria nenhuma influência na produção de aminoácidos de outras famílias.

Verificou-se então surpreendentemente que, após o aumento da atividade piruvato-carboxilase através de modificação genética da enzima e/ou após aumento da expressão genética de piruvato-carboxilase, a preparação microbiana de aminoácidos da família do aspartato e/ou da família do glutamato é elevada. Mostrou-se, particularmente que gêneros com índice de cópia elevado do gene piruvato-carboxilase precipitam cerca de 50% mais lisina, 40% mais treonina e 150% mais homosserina no meio de cultura. Verificou-se além disso, que surpreendentemente também a produção de glutamato é significantemente elevada (comparar particularmente com o exemplo de execução 6 e tabela 4). A modificação genética da piruvato-carboxilase para elevação da atividade enzimática ocorre de preferência por mutação do gene endógeno. Este tipo de mutações podem ou ser preparadas por processos clássicos não-direcionados, como por exemplo por irradiação UV ou por produtos químicos encadeadores de mutação ou objetivamente por meio de processos gen tecnológicos como dele-ção(ções), inserção(ções) e/ou troca(s) de nucleotídio(s). A expressão piruvalato-carbóxilase genética é elevada através do aumento do índice de cópias genéticos. Então, de preferência pode ocorrer no âmbito da transcrição um reforço dos elementos regulatórios pelo fato de que, particularmente, os sinais de transcrição são elevados. Isto pode ocorrer, por exemplo, por modificação da seqüência promotora acionada no gene estrutural do promotor em sua eficácia ou pelo fato do promotor ser trocado completamente por promotores mais eficazes. Também pode ocorrer um reforço da transcrição através da respectiva influência de um gene regulador de piruvato-carboxilase agregado ao gene regulador. Além disso, opcionalmente através de mutação de uma seqüência genética regulatória, pode-se influenciar de tal modo a eficácia da ligação de uma proteína regulatória no DNA do gene de piruvato-carboxilase, que assim a transcrição é reforçada e assim a expressão genética é elevada. Além disso, também podem estar disponíveis os denominados “melhoradores” comoseqüências re-gulatórias do gene piruvato-carboxilase, que atuam em uma seqüência de troca aperfeiçoada entre RNA polimerase e DNA e igualmente uma elevada expressão genética de piruvato-carboxilase. Além disso, também é possível um reforço da translação, na qual por exemplo é aperfeiçoada a estabilidade do m-RNA.

Para aumento do índice de cópias de gene, o gene piruvato-carboxilase é montado em uma construção genética ou vetor. O gene construtor contém asseqüências regulatórias dispostas particularmente ao gene de piruvato-carboxilase, de preferência aquelas que reforçam a expressão genética. Para a construção do gene de piruvato -carboxilase em um gene construtor, o gene é isolado de preferência a partir de uma linhagem de microorganismos do gênero de linhagem bactéria corine e transformado em uma linhagem de microorganismos produtores de aminoácidos, particularmente bactérias corine ou em Escherichia coli ou Serratia marcescens. Para o processo de acordo com a invenção são apropriados genes de C. glutami-cum ou linhagem C. glutamicum flavum ou linhagem glutamicum C lactofer-mentum. Após isolamento do gene e da recombinação in vitro com vetores conhecidos (comparar por exemplo com Simon e outros, Bio/Technology 1983, 1: 784 até 791; Eikmanns e outros, Gene 1991, 102: 93 até 98) ocorre a transformação nas linhagens produtoras de aminoácidos por eletropora-ção (Liebl e outros, FEMS Microbiology Letteres 1991, 65: 299 até 304) ou conjugação (Schàfer e outros, J. Bacteriol 1990, 172: 1663 até 1666). Como linhagens hospedeiras são empregadas de preferência aqueles produtores de aminoácidos, que são desregulados na síntese dos respectivos aminoácidos e/ou que apresentam uma elevada atividade exportadora de veículo para os respectivos aminoácidos. Além disso, são preferidas aquelas linhagens que contêm uma elevada fração de tais metabolitos de troca de matéria-prima central, que tomam parte na síntese dos respectivos aminoácidos, e/ou linhagens que contêm uma fração mais baixa de metabolitos de matéria-prima central que não tomam parte na síntese dos respectivos aminoáci- dos, particularmente metabolitos que são responsáveis pelas reações concorrentes; isto é, são preferidas tais linhagens, para as quais transcorre um caminho para a biossíntese dos respectivos aminoácidos com atividade amino reduzida concorrente ao caminho de biossíntese dos aminoácidos correspondentes. Assim é particularmente apropriada uma linhagem de microorganismos corineformes resistentes contra β-metiléster de ácido aspa-ragínico (AME), com atividade citrato sintase reduzida (EP 0 551 614).

Após isolamento são obteníveis genes de piruvato-carboxilase comseqüências de nucleotídio que codificam a seqüência de aminoácido SEQ ID N° 2 abaixo indicada ou suas variações alel ou que apresentam a seqüência de nucleotídios do nucleotídio 165 até 3587 de acordo com a SEQ ID N° 1 ou apresentam essencialmente uma seqüência de DNA com efeito equivalente. Além disso, são obteníveis genes com um promotor da seqüência pré-conectada em série de nucleotídios 20 até 109 de acordo com a SEQ ID N° 1 ou uma seqüência de DNA de efeito essencialmente equivalente. Variações alel ouseqüências de DNA de efeito equivalente abrangem particularmente derivados funcionais, que são obteníveis por de-leção(ções), inserção(ções) e/ou substituição(ões) de nucleotídios das res-pectivasseqüências, sendo que a atividade enzimática ou função enzimática permanecem ou mesmo são elevadas. Esses genes de piruvato-carboxilase são de preferência empregados no processo de acordo com a invenção.

Os genes piruvato-carboxilase subordinados, com ou sem o promotor pré-conectado em série e com ou sem reguladores de gene, podem ser posteriormente ligados uns após os outros, de modo que o gene está contido em uma estrutura genética.

Ao gene piruvato-carboxilase é de preferência pré-conectado em série o promotor tac (laclQ-gen), sendo que a elesseqüências particularmente regulatórias estão subordinadas.

Através de clonagem do gene piruvato-carboxilase são obtidas plasmídeos, que contêm o gene e são apropriadas para a transformação de um produtor de aminoácido. As células obteníveis por transformação, dentre as quais trata-se de preferência de células transformadas de bactéria cori- ne, contêm o gene na forma replicável, isto é em cópias adicionais nos cromossomos, sendo que as cópias de gene são integradas por recombinação em quaisquer locais do genoma, e/ou em uma plasmídeo ou vetor.

Exemplo de execução 1. Clonagem do gene de piruvato-carboxilase a partir de bactérias corine glutamicum Partindo-se de âmbitos conservados de todos os genes de piruvato-carboxilase (pyc), de sacaromices cerevisiae (J. Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol gene Genet 1991, 229: 307-315) seres humanos (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), Rato (Proc Natl Acad Sei, USA 1993, 90: 1766-1770), Aedes aegypti (EMBL-genBank: N° de acesso L36530) assim como Mycobacterium tubercolosis (EMBL-GenBank: N° de acesso U00024) foram sintetizados como primer PCR (MGW Biotech). O primer correspondeu às bases 810 até 831 e 1015 até 1037 do gene de M. tuberculosis. Com esses primers pode-se amplificar, por meio de PCR segundo o processo padrão de Innis e outros (Protocolo PCR. Um guia para processos e aplicações, 1990, Academic Press) para primers não-degenerados, primers homólogos, um fragmento de cerca de 200 bp de DNA cromossomal de C. glutamicum ATCC 13032, que foi descrito como em Eikmanns e outros (Microbiology 1994, 140: 1817 -1828). O tamanho de 200 bp correspondeu ao esperado para genes pyc. O produto PCR foi seqüenci-ado conforme descrito em Sanger e outros (Proc Natl Acad Sei USA 1977, 74: 5463-5467). A seqüenciação foi realizada com ddNTPs marcadas fluorescentemente com um aparelho de seqüenciação de DNA automático (Applied Biosystems).

Partindo-se desse fragmento de DNA de C glutamicum foram preparados os seguintes homólogos de oligonucleotídios: pyc 1 5’-CGTCTTCATCGAAATGAAC-3 pyc 2 5’-ACGGTGGTGATCCGGCACT-3 Os oligonucleotídios foram empregados como primer PCR para isolamento de uma sonda para o gene do piruvato-carboxilase (pyc) a partir de C. glutamicum. Os primers foram empregados em uma reação de PCR com DNA cromossomal de C. glutamicum e nucleotídios marcados Digoxi-genina. A reação foi realizada segundo as recomendações do “PCR DIG Labeling Kits” da firma Boehringer Mannheim. Com essa reação pode ser amplificado o fragmento de DNA marcado digoxigenina, que correspondeu ao tamanho esperado de cerca de 200 bp. A sonda pyc assim preparada foi então empregada para identificar com hibridização Southern-blot um fragmento de DNA no DNA cromossomal de C. glutamicum no qual está localizado um gene pyc. Aqui foram respectivamente cortados de 2 até 5 DNA cromossomais de C. glutamicum WT com as enzimas de restrição Hindlll, Sphl, Sall, Dral, EcoRI e BamHI, os fragmentos de DNA obtidos foram separados respectivamente a seu tamanho em um Agarosegel por eletroforese de gel por 16 h a 20V. os fragmentos de DNA encontráveis no gel de AGAROSEGEL foram desnaturizados e verificados quanto ao vácuo segundo um processo de Southern (J. Mol Biol 1975, 98: 503-517) e verificado quanto ao vácuo com o aparelho VacuGene Blot da Pharmacia LKB (Uppsala, Suécia) transferido da matriz de gel em uma membrana de nylon (Nytran N13 de Schleicher e Schüll, Dassel, Suíca), imobilizado, e a marcação de digoxigenina é comprovada por meio de reação NBT/X-fosfato por fosfatase alcalina. Desta forma puderam ser comprovados os seguintes fragmentos cromossomais com a sonda de DNA pyc hibridizantes: um fragmento de 17 kb Hindlll, um fragmento Sall 6,5 kb, e um fragmentos 1,35 kb EcoRI.

O fragmento Hind III de 17 kb foi isolado e subclonado. Para isto empregou-se um banco genético Cosmid a partir de DNA cromossomal de C. glutamicum em Cosmid pHC79, que representou o genoma de C. glutamicum em 99% (Mol Microbiol 1992, 6: 317-326). A linhagem E. coli DH5a foi transformada com esse banco genético por meio do processo CaCI2 de Sambrook e outros (Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Habour Laboratory Press) colocadas em placas de cerca de 300 colônias por placa ágar LB com 50 pg/l de canamicina (no total 5000 colônias). Em seguida, os transformados obtidos foram reconduzidos ao filtro nitran N13 e esses foram incubados por 5 minutos em lise alcalina das células e desnaturação dos DNA em papel Whatmann embebidos em NaOH a 0,5 M e NaCI a 1,5 Μ. A neutralização que se seguiu ocorreu com tris/HCI a 1M pH 7,5 e NaCI a 1,5 M. Após a incubação do filtro em 2 x SSC, o DNA liberado foi fixado no filtro através de irradiação por UV a 366 nm. Em seguida os destroços celulares restantes foram removidos por agitação em 3 x SSC, 0,1% de SDS a 50°C. Os filtros foram empregados nesta forma descritos para a hibridização com uma sonda pyc específica, como em Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517). Identificou-se 3 transformantes, que hibridiza-ram contra a sonda pyc. Desses transformantes isolou-se o DNA cosmida por meio de preparação de plasmídeo de acordo com o processo da lise alcalina de Birnaboim (meth Enzymol 1983, 100: 243-255) e em seguida testou-se em relação à restrição e análise Southern-blot no fragmento Hindlll disponível. A cosmida pHC79-10, que continha um Insert de 40 kb, portou o fragmento Hindlll de 17 kb completamente e foi ainda analisado. Indicou-se que também após a restrição foram obtidos com o sall endonucleases e EcoRI os mesmos fragmentos hibridizantes como no DNA cromossomal, isto é, um fragmento de 6,5 kg Sall e um fragmento EcRI de 1,35 kb. O fragmento Hindlll foi isolado por restrição com Hindlll a partir de Cosmid e ligado no vetor E. coli pUC18, que igualmente foi cortado com Hindlll. Fez-se uma análise de restrição do fragmento no vetor resultante pUCpyc. A disposição física do fragmento é representada na Figura 1. 2. Seqüenciação do gene piruvat-carboxilase Em outras etapas de subclonagem sobrepôs-se um fragmento Sall-EcoRI de 0,85 kb, o fragmento EcoRI 1,35 kb, um 1,6 kb EcoRIO-EcoRI-Stul-fragmento assim como um fragmento Clal, que se sobrepôs parcialmente com 0,85 kb do fragmento Sall-EcoRI, por restrição com as respectivas enzimas de restrição da plasmídeo pUCpyc. Através da ligação os fragmentos foram clonados, nos respectivos vetores restringidos pUC18 e em seguida sequenciados como acima descrito segundo Sanger e outros (Proc Natl Acad Sei USA 1977, 74: 5463-5467).

Asseqüências de nucleotídio obtidas foram analisadas com o pacote de programa HUSAR (Release 3,0) do centro de pesquisa oncogêni-ca alemão (Heidelberg). A análise da seqüência dos fragmentos produziu um registro de leitura aberto de 3576 bp, que codificou uma seqüência de proteína de 1140 aminoácidos. Uma comparação da seqüência de proteína derivada de banco de dados genético EMBL (Heidelberg) produziu semelhanças a todas as piruvato-carboxilases descobertas. A maior identidade (62%) foi verificada para carboxilato a partir de mycobacterium turbeculosis (EMBL-GenBank: Número de acesso U00024). A semelhança, considerando-se a troca de aminoácidos conservados, foi de 76%. Uma comparação com a piruvato-carboxilases de outros organismos produziu aminoácidos 46 até 47% idênticos e 64 até 65% semelhantes (genes 1997, 191; 47-50; J Bacteriol 1996, 178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sei USA 1993, 90: 1766-1770; Biochem J 1996, 316: 631-637; Banco genético EMBL: número de acesso N° L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; moles de gene genet 1991, 229; 307-315). Desses resultados concluíu-se que o fragmento clonado porta o gene para a piruvato carboxilase de C. glutamicum. A seqüência de nucleotídio do gene está dada como SEQ ID N° 1 e a respectiva seqüência de aminoácido está dada como SEQ ID N° 2. 3. Sobreexpressão do gene piruvato-carboxilase Para a sobreexpressão do gene para a piruvato-carboxilase a partir de C. glutamicum, clonou-se o gene da plasmídeo tipo pUCpyc como 6,2 kb Sspl-Scal-fragmento no vetor pendular E. coli-C-glutamicum pEKO (gen 1991, 102 : 93-98), que foi cortado com as endonucleases de restrição EcoRI e Pstl. Por meio do tratamento de Klenow-polimerase as extremidades desalinhadas foram preenchidas em extremidades lisas (EcoRI) ou (Pstl), e o vetor linearisado foi ligado com 6,2 kb do fragmento Sspl-Scal. A construção pEKOpyc obtida foi primeiramente transformada na linhagem E. coli DH5a, o DNA-plasmídeo foi isolado dos transformados obtidos e controlado a partir das inserções por restrição. O DNA foi em seguida introduzido na linhagem SP733 por eletroporação (FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299-304). Essa linhagem trata-se de um mutante de restrição negativa C. glutamicum R127 (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323- 327, Verlag Chemie), que foi obtida por mutagenese química e distinguiu-se pelo fato de que ela não pode crescer em meios mínimos com piruvato e lactato como fonte única de carbono (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). Esse tipo de fenótipo é provocado por um defeito na piruvato-carboxilase e podería ser complementado por introdução do gene piruvato-carboxilase a partir de C glutamicum, isto é, a linhagem que porta a plasmídeo pEKOpyc, ao contrário das linhagens de partida estava novamente no lugar de meio mínimo com lactato como única fonte de energia. Assim também demonstrou-se que o gene codifica uma piruvato-carboxilase funcional.

Além disso, a plasmídeo pEKOpyc foi transformada no tipo selvagem C. glutamicum ATCC 13032 por eletroporação. A linhagem WT(pEKOpyc) resultante foi observada em comparação com o tipo selvagem ATCC 13032 em relação a sua atividade de piruvat-carboxilase. As linhagens foram cultivadas em meio complexo (Luria-Bertani, Molecular Clo-ning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) com 0,5% de lactato e um meio mínimo com 2% de lactato ou 4% de glucose, e o teste piruvato-carboxilase foi realizado com referência ao processo, conforme ele foi descrito por Peters-Wendisch e outros (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). O resultado das análises (tabela 1) indica que a atividade piruvato-carboxilase na linhagem portadora de pEKO-pyc era cerca de 4 vezes maior do que na linhagem de partida. 4. Acumulação aumentada de lisina por sobreexpressão do gene de piruvato - carboxilase na linhagem C. glutamicum DG52-5.

Para verificação do efeito da sobreexpressão do gene para o piruvato-carboxilase na linhagem de produção de lisina DG52-5 (J gene Mi-crobiol 1988, 134: 3221-3229) foi empregado um vetor de expressão pVWEXI, que permitiu uma expressão induzível IPTG. Nesse vetor o gene pyc sem promotor foi clonado. Para tanto primeiramente sintetizou-se o pri-mer PCR (primer 1 = posição 112-133; primer 2 = posição 373 até 355 na seqüência de nucleotídio de acordo com a SEQ ID N° 1) e 261 bp do âmbito inicial sem promotor do gene de piruvato-carboxilase por meio de PCR amplificado. O primer foi escolhido de tal forma que o primer I determinou um local de corte Pstl e o primer 2 um local de corte BamHI. Após o PCR isolou-se o produto PCR 274 bp obtido, ligou-se em concatêmeros e em seguida cortou-se com as enzimas de restrição Pstl e BamHI. O produto de restrição foi concentrado por precipitação de etanol e em seguida ligado com o vetor pVWEXI cortado Pstl-BamHI. A construção obtida pVWXEI - PCR foi testada quanto à restrição. O término final do gene pyc foi isolado do vetor pEKOpyc por tratamento Rcal-KIenow-Sall e ligado no vetor pVWEXI-PCR tratado BamHI-KIenow-Sall. A construção obtida pVWEXI pyc foi analisada quanto à disposição da restrição. Um mapa físico da plasmídeo é indicado na Figura 2. A plasmídeo foi introduzida por eletroporação na linhagem C. glutamicum DG52-5. Como controles transformou-se a linhagem DG52-5 com o vetor pVWEXI sem inserção e a precipitação de lisina L respectivamente comparada a três diferentes transformantes. Além disso, cultivou-se DG52-5(pVWEX1) 1, 2 e 3 assim como DG52-5(pVWEX1pyc) 3, 4 e 6 no meio complexo (2 xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press; com 50 pg/l Kanamicina) e separou-se e vacinou-se o meio de fermentação CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) respectivamente das culturas prévias. O meio continha adicionalmente Ka-namycina, para manter a plasmídeo estável. Realizou-se paralela e respectivamente duas reações, sendo que em um balão foram adicionados 200 pg de IPTG/ml, enquanto que os dois balões não continham nenhum IPTG. Após o cultivo por 48 horas a 30° C no agitador rotativo a 120 rpm determinou-se a quantidade de lisina acumulada no meio. A determinação da concentração de aminoácido ocorreu por meio de cromatografia de líquido a alta pressão (J Chromat 1983, 266: 471-482). O resultado da fermentação é representado na tabela 2, sendo que os valores indicados representam valores médios a partir dos quais representam respectivamente três experimentos com diferentes clones. Verificou-se que a sobreexpressão do gene de piruvato-carbóxilase leva a uma acumulação 50% mais elevada de lisina no meio. Assim a utilização do gene descoberto e descrito representa um processo de enzima anaplerótica de piruvato-carboxilase, para aperfeiçoar visivelmente a formação de L-lisina. 5. Acumulação aumentada de treonina e homosserina através da so- breexpressão do gene de piruvato-carboxilase na linhagem C. glutami-cum DM368-3.

Analogamente aos experimentos para a formação de L-lisina foi também verificada a acumulação de treonina no resíduo de cultura através da sobreexpressão do gene para a piruvato-carboxilase. Aqui, conforme descrito no ponto 4, a linhagem de produção de treonina C. glutamicum DM 368-3 (Degussa AG) foi transformada com a plasmídeo pVWEXIpyc assim como para controle com a plasmídeo pVWEXIpyc, e foi pesquisada a sepa-ração/precipitação de treonina de respectivamente três diferentes transfor-mantes. Além disso, cultivou-se DM368-3(pVWEX1) 1, 2 e 3 assim como DM368-3(pVWEX1 pyc) 1, 2 e 3 no meio complexo (2 x TY com 50 pg/l Ka-namycina) e o meio de fermentação CGXII(J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) foi respectivamente vacinado separadamente das pré-culturas. Realizou-se duas preparações paralelas, sendo que foi adicionado um balão de 200 μg IPTG/ml, enquanto o segundo balão não continha nenhum IPTG. Após o cultivo por 48 horas a 30°C no agitador rotativo a 120 rpm, a quantidade de treonina acumulada no meio foi determinada. A determinação da concentração de aminoácido ocorreu igualmente por meio de cromatografia de líquido de alta pressão (J Chromat 1983, 266: 471-482). O resultado da fermentação está apresentada na tabela 3, sendo que os valores médios indicados representam respectivamente de três experiências apresentam 3 clones diferentes. Indicou-se que a sobreexpressão do gene piruvato-carboxilase leva a uma elevação de cerca de 40% na concentração de treonina no meio. Assim a utilização do gene descoberto e descrito para a enzima piruvato-carboxilase anaplerótica representa um processo para decisivamente aperfeiçoar a formação de L-treonina.

Além disso, a determinação da concentração de aminoácido mostrou que, surpreendentemente, a linhagem com o gene piruvato-carboxilase sobreexpresso entregou cerca de 150% mais homosserina no meio do que a linhagem com o gene não sobreexpresso. Os respectivos resultados são igualmente representados na tabela 3. Eles tornam visível que, pelo processo de acordo com a invenção, tanto a formação de treonina como também a formação de homosserina pode ser visivelmente aperfeiçoadas. 6. Acumulação aumentada de glutamato através da sobreexpressão do gene para a piruvato-carboxilase no tipo selvagem de C. glutamicum Analogamente aos experimentos para a formação de L-lisina, L-treonina e L-homosserina (ver acima sob 4 e 5) verificou-se também a acumulação de glutamato no resíduo de cultura através da sobreexpressão do gene para o piruvato-carboxilase. Aqui, conforme descrito no ponto 4, o tipo selvagem C.glutamicum ATCC 13032 foi transformado com a plasmídeo pVWEXIpyc assim como para o controle com a plasmídeo pVWEXI e o precipitado de glutamato de respectivamente dois diferentes transformantes. Para tanto cultivou-se C. glutamicum ATCC 13032 (pVWEXI pyc) D1 e D2 assim como C. glutamicum ATCC 13032 (p VWEXIpyc) 1 e 2 no meio complexo (2 x TY com 50 μg/I de Kanamycina) e o meio de fermentação CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) foi respectivamente vacinado separadamente da pré-cultura. O meio continha adicionalmente Kanamicina, para manter estável plasmídeos. Para indução da precipitação de glutamato, cerca de 6 horas após a inoculação foram adicionados ao meio a 25 mg de Tween 60 por ml. Realizou-se duas preparações paralelas, sendo que adicionou-se a um balão 200 pg IPTG/ml, enquanto que o segundo balão não continha nenhum IPTG. Após o cultivo por 48 horas a 30°C, no agitador de rotação a 120 rpm, foi determinada no meio a quantidade de glutamato acumulada. A determinação da concentração de aminoácido ocorreu igualmente por meio de cromatografia de líquido a alta pressão (J Chromat 1983, 266: 461-482). O resultado da fermentação está representado na tabela 4, sendo que os valores indicados representam valores médios a partir de respectivamente dois experimentos com diferentes clones. Indicou-se que a sobreexpressão do gene de piruvato-carboxilase leva a um acréscimo da concentração de glutamato no meio. Assim a utilização do gene descoberto e descrito para a enzima anaplerótica representa um processo de piruvato-carboxilase, para aperfeiçoar decisivamente a formação de L-glutamato.

Tabela 3 Tabela 4 PROTOCOLO DE SEQÜÊNCIA (1) DADOS GERAIS: (i) REIVINDICANTE: (A) NOME: Forschungszentrum Juelich GmbH (B) RUA: Caixa postal 1913 (C) LOCAL: Juelich (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO DE ENDEREÇAMENTO POSTAL (CEP): 52425 (ii) DENOMINAÇÃO DA INVENÇÃO: Piruvato Carboxilase (iii) NÚMERO DAS SEQÜÊNCIAS: 2 (iv) FORMA LEGÍVEL DE COMPUTADOR (A) UNIDADE DE SAÍDA: Disco flexível (B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

Claims (7)

1. Processo para preparação microbiana de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em L-lisina, L-treonina, L-homosserina e glu-tamato, caracterizado pelo fato de que a atividade de piruvato-carboxilase é sobre-expressada em um organismo que produza os referidos aminoácidos, em que a sobre-expressão do gene de piruvato-carboxilase é alcançada pela transformação do referido microorganismo com um vetor de expressão que transporta o gene de piruvato-carboxilase, o qual compreende sequência de nucleotídeos dos nucleotídeos 165 a 3587 conforme a SEQ ID NO: 1.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene de piruvato-carboxilase é incorporado em um vetor, de modo a elevar o índice de cópias de gene.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o microorganismo produtor dos referidos aminoácidos é transformado com o vetor contendo o gene.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o microorganismo do gênero Corynebacterium é transformado com o vetor contendo o gene.

5. Vetor caracterizado pelo fato de que contém um gene de piruvato-carboxilase, sendo que o referido gene compreende a sequência de nucleotídeos 165 a 3587 conforme a SEQ ID NO: 1 e está operacionalmente ligado ao promotor tac (laclQ-gen).

6. Célula, caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor, como definido na reivindicação 5, sendo que a referida célula é selecionada do grupo consistindo em Corynebacterium, Escherichia coli e Serra-tia marcescens.

7. Célula transformada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Corynebacterium.