BRPI9810945B1 - formulações de agentes farmacológicos, métodos para sua preparação e métodos para uso das mesmas - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "formulações de agentes farmacológicos, métodos para sua preparação e métodos para uso das mesmas". de acordo com a presente invenção providencia-se composições e métodos de utilidade para liberação in vivo de agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água (tais como a droga anticâncer paclitaxel) em que o agente farmacologicamente ativo é liberado na forma de partículas suspensas revestidas com proteína (que atua como agente estabilizador). em particular, a proteína e agente farmacologicamente ativo num meio de dispersão biocompatível, são submetidos a alto cisalhamento, na ausência de quaisquer tensoativos convencionais, e também na ausência de quaisquer materiais de núcleo polimérico para as partículas. o procedimento produz partículas com um diâmetro inferior a cerca de 1 mícron. o uso da composição específica e as condições de preparação (por exemplo, adição de um solvente polar à fase orgânica), e seleção cuidadosa da fase orgânica adequada e fração de fase, capacita a produção em série de nanopartículas inusitadamente pequenas, de menos que 200 nm de diâmetro, que podem ser filtradas esterilmente. o sistema particulado produzido de acordo com a invenção pode ser convertido em um pó seco redispersável compreendendo nanopartículas da droga insolúvel em água, revestidas com uma proteína, e proteína livre à qual as moléculas do agente farmacológico são aderidas. isto resulta em um sistema de liberação singular, em que parte do agente farmacologicamente ativo é prontamente biodisponível (na forma de moléculas ligadas à proteína), e parte do agente está presente dentro de partículas sem qualquer matriz polimérica em seu interior.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE AGENTES FARMACOLÓGICOS COMPREENDENDO PACLITAXEL".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos para produção de veículos em partículas para administração intravenosa de agentes farmacologi-camente ativos, bem como a novas composições produzidas por eles. Num aspecto particular, a invenção refere-se a métodos para a liberação in vivo de agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água, (por exemplo, a droga anticâncer Taxol®). Em um outro aspecto, prove-se sistemas coloidais dispersáveis contendo agentes farmacologicamente ativos insolúveis em água. As partículas suspensas podem ser formadas de 100% de agente ativo, ou podem ser encerradas em um revestimento poli-mérico formulado a partir de um polímero biocompatível, e, têm um diâmetro inferior a cerca de 1 mícron. Sistemas coloidais da invenção podem ser preparados sem o uso de tensoativos convencionais ou qualquer matriz de núcleo polimérica. Em um aspecto atualmente preferido da invenção, propicia-se um método para preparação de partículas extremamente pequenas, que podem ser esterilmente filtradas. O revestimento polimérico contém partículas do agente farmacologicamente ativo e, opcionalmente, um agente de dispersão biocompatível, em que o agente farmacologicamente ativo pode ser ou dissolvido ou suspenso. Assim, a invenção propicia um sistema de liberação de droga, seja na forma líquida ou na forma de um pó redispersá-vel. Qualquer forma proporciona tanto moléculas de droga imediatamente biodisponíveis (ou seja, moléculas de droga que são molecularmente ligadas a uma proteína), quanto partículas de droga pura revestidas com uma proteína. A invenção também refere-se ao método de uso e preparação de composições (formulações) de drogas, tais como o agente anticanceríge-no paclitaxel. Em um aspecto, a formulação de paclitaxel, conhecida como Capxol, é expressivamente menos tóxica e mais eficaz do que Taxol®, uma formulação comercialmente disponível de paclitaxel. Em um outro aspecto, a nova formulação de Capxol localiza-se em determinados tecidos após a administração parenteral, aumentando, assim, a eficácia de tratamentos de câncer associados com esses tecidos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A liberação de droga intravenosa permite equilíbrio rápido e direto com a corrente sangüínea. a qual transporta a medicação para o resto do corpo. Para evitar os níveis de pico de soro que são alcançados em um curto tempo após injeção intravascular, a administração de drogas transportadas dentro de veículos estáveis permitiría a liberação gradual das drogas dentro do compartimento intravascular, em seguida a um bolo de injeção intraveno-sa das nanopartículas terapêuticas.

As nanopartículas de liberação controlada injetáveis podem prover uma duração pré-proqramada de ação que varia de dias a semanas, e até rneses, de uma única injeção. Elas também podem oferecer várias vantagens sobre os medicamentos convencionalmente administrados, incluindo a aquiescência automática assumida peio paciente com o regime de dosagem, bem como o endereçamento da droga aos tecidos ou órgãos específicos (Tice and Gilley, Journal of Controlíed fíelease 2:343-352 (1985)).

As micropartfculas e corpos estranhos presentes no sangue são geralmente retirados da circulação pelos “órgãos filtradores do sangue" ou seja, o baço, pulmões e ligado, A matéria particulada contida no sangue total normal compreende células sanguíneas vermelhas {tipicamente 8 mícrons de diárneiro), céiuias sangüíneas brancas (tipicamente 6-8 mícrons de diâmetro), e Disquetes (tipicamente 1-3 mícrons de diâmetro). A microcirculação na maior parte dos órgãos e tecidos permite a passagem livre dessas céiuias sanguíneas. Guando mlcrotrombos (coágulos sangüíneos) de tamanho maior do que 10-15 mícrons estão presentes na circulação, resulta em risco de enfarte ou bloqueio dos capiiares, levando à isquemia ou privação de oxigênio e possivelmente á morte do tecido. A injeção na circulação de partículas maiores do que 10-15 mícrons de diâmetro, consequentemente, deve ser evitada. Uma suspensão de partículas menores do que 7-8 mícrons é, contudo, reiativamente segura e tem sido usada para liberação dos agentes farmacologieamente ativos na forma de lipossomas e emulsões, agentes nutricionais e meio de contraste para aplicações de formação de imagem. O tamanho de partículas e seu modo de liberação determina seu comportamento biológico. Strand et a!, (in Microspheres-Biomedical Applications, Ed. 4 Hembaum. pãgs. 193-227, CRC Press (1933)) descreveram o fato das partículas serem dependentes de seu tamanho. Partículas na faixa de tamanho de uns poucos nanõmetros (nm) a 100 nm ingressam nos capilares linfàiicos em seguida a uma injeção intersticial, e pode ocorrer fagoci-tose dentro dos nodos linfáticos. Após injeção intravenosa/intra-arterial, as partículas menores do que cerca de 2 mícrons irão ser rapidamente levadas da corrente sanguínea pelo sistema retículo-endotelial (RES), também conhecido corno sistema de fagócitos mononucíeares (MPS). As partículas maiores do que cerca de 7 mícrons irão, após injeção intravenosa, ser aprisionadas nos capilares pulmonares. Após injeção intra-arterial as partículas são aprisionadas no primeiro leito capilar atingido. Partícuias inaladas são aprisionadas peios macróíagos aiveolares.

Produtos farmacêuticos que são insolúveis em água, ou fracamente hidrossolúveis e sensíveis ao meio ácido no estômago, não podem ser convencionalmente administrados (por exemplo, por injeção intravenosa ou administração oral). A administração parenteral de tais produtos farmacêuticos foi conseguida por emulsificação da droga solubilizada em óleo com um líquido aquose (tal como solução saiina normal) na presença de tensoa-iivos ou estabilizadores de emulsão para produzir microemulsões estáveis. Essas emulsões podem ser injetadas intravenosamer.te, contanto que os componentes da emulsão sejam farmacologieamente inertes, A Pater.te US n° 4.073.943 descreve a administração de agentes farmacologieamente ativos insolúveis em água dissolvidos em óleos e emulsificaclos com água na presença de tensoativos, tais como fosfatídeos de ovo, píurônlcos (copo!(meros de polipropileno glicol e polietileno glicol), oleato de policlicerol, etc.. A Publicação internacional PCT n':' WOS5/00011 descreve microgotículas farmacêuticas de um anestésico revestido com um fosfolipídec», tal como dimi-ristoil fòsfatidilcolina, tendo dimensões adequadas para injeção intradérmica ou intravenosa.

Um exemplo de uma droga insolúvel em água é Taxol®, um produto natural primeiro isolado da árvore Teixo Pacifico, Taxus· brevifolia of Wani et al., (J. Am. Chem. Soc., 93:2325 (1971)). Dentre os agentes antimi-toticos, Taxol®, que contém uma estrutura de carbono diterpeno, apresenta um modo singular de ação nas proteínas mierotubulares responsáveis pela formação do fuso mitótico. Em contraste com outros agentes antimitóticos tais como vinblastina ou colc.hicína, que evita o conjunto de tubuiina, o Ta-xol®’ é o único produto vegetal conhecido que inibe o processo de despolime-rização da tubuiina, evitando, assim, o processo de replicação celular.

TaxoP, um diterpenóide de ocorrência natural, ficou conhecido por ter eleitos antineopiásicos e anticáncer significativos no câncer ovariano refratàrio à droga. O Taxoí~' demonstrou excelente atividade antitumoral numa ampla variedade de modelos de tumor, tais como meianoma B16, leu-ceiTifac, !_ ί ^ i ·.', iumores oe mama rviX-i e xeno enxertos· de tumor de coion CS-1. Vários periódicos recentes denominaram o TaxoP como a nova e maravilhosa droga anticáncer. De fato, o Taxoíc foi recentemente aprovado pela Federal Drug Admiinistration para tratamento do câncer ovariano. A fraca solubilidade em água do TaxoP, contudo, apresenta um problema para administração humana. De rato, a liberação das drogas que são intrinsecamen-ie ínsoiuveis ou fracamente solúveis num meio aquoso pode ser seriamente comprometida, se a liberação orai não for eficaz. Consequentemente, formulações de TaxoF' atualmente usadas requerem um "Cremaphor" para solubi-lizar a droga. A faixa de dosagem clínica humana é de 200-500 mg. Esta dose é dissolvida em uma solução 1:1 de etano!:"CremaphcrM e diluída com solução salina em cerca de 300-1000 m! de fluido ministrado intravenosa-meníe. O "Cremaphor" atualmente usado é óleo de rícino poüetoxilado. A presença de ''Cremaphor nesta formulação foi ligada a reações de hiper-sensibilidade grave em animais (Lorenz et al. Agents Actions 1987, 7:63-67 and humans ÍWeiss et al., J. Gin Oncol. 1990, 8:1263-63 e conseqüente-mente, requer uma pré-medicação dos pacientes com corticosteróides (de-xametasona) e antihistaminas. A grande diluição resulta em grandes volu- mes de infusão (dose típica de 175 mg/m2) e tempos de infusão variam de 3 horas a 24 horas. Assim, existe uma necessidade para uma formulação menos tóxica alternativa de paclitaxel.

Em testes clínicos de fase I, o próprio Taxol'3’ não demonstrou excessivos efeitos tóxicos, mas graves reações alérgicas foram ocasionadas pelos emulsificantes empregados para solubilizar a droga. O regime atual de administração envolve o tratamento do paciente com aritihistamínicos e este-roides antes da injeção da droga, a fim de reduzii os efeitos colaterais alérgicos do "Cremaphor".

Num esforço de melhorar a soíubilidade em água do Taxol'3', vários investigadores modificaram sua estrutura química com grupos funcionais que conferem uma melhor soíubilidade em água. Dentre estes estão os derivados sulfonados (Kingston et ai., U.S. Patent 5.059.699 (1991)), e ésteres de arninoácidos (Mathew et al., -J. Med. Chem. 35: 1-15-151 (1992)) que demonstram sígnificante atividade biológica. Modificações em produzir um derivado hidiOSsoiúvei facilitam a liberação intravenosa do Taxol13' dissolvido em um veículo inócuo, tai como solução salina normal. Tais modificações, contudo, somam-se ao custo de preparação da droga, podem induzir reações colaterais iridesejadas e/ou reações alérgicas, e/ou podem diminuir a eficiência da droga.

Microesferas de proteína foram tidas na literatura como veículos de agentes farmacológicos ou do diagnóstico. Microesferas de albumina foram preparadas por desnaturação ao calor ou retieulaçâo química. Microesferas desnaiuradas ao calor são produzidas a partir de uma mistura emulsifi-cada (por exemplo albumina. o agente a ser incorporado e um óleo adequado), a temperaturas entre 100c'C e 150°C. As microesferas são a seguir lavadas com um solvente adequado e armazenadas. Leucuta et ai., (International Journal of Pharmaceutics 41:213-217 (1938)) descreve o método de preparação de microesferas desnaturadas ao calor. O procedimento para preparação de microesferas quimicamente reticuladas envolve o tratamento da emulsão com glutaraldeído para reticular a proteína, seguido por lavagem e armazenagem. Lee et al., (Science 213:233-235 (1981)) e Patente U.S. n° 4.671.954 ensina este método de preparação.

As técnicas acima para preparação de microesferas de proteína como veículos de agentes farmacologicamente ativos, embora adequadas para liberação de agentes hidrossoluveis, são incapazes de aprisionar os insolúveis em água. Esta limitação é própria da técnica de preparação, que confia na reticulacão ou desnaturacão com calor do componente protélco na fase aquosa de uma emulsão de água-em-óieo. Qualquer agente hidrosso-lúvel dissolvido na fase aquosa contendo proteína pode ser aprisionado dentro da matriz de proteína reticulada ou desnaturada com calor resultante, mas um agente fracamente solúvel em água ou solúvel em oleo não pode s er incorporado em uma matriz de proteína formada por essas técnicas.

Um método convencional para preparação de nanoparlículas contendo droga compreende dissolver ácido políláctico (ou outro polímero fciocompaíível, insolúvel em agua) em um soiveriie imiscívei em água (como cloreto de metileno ou ouírc» solvente olorado, alifático ou aromático), dissolvendo-se o agente farmacologicamente ativo em solução polimérica, adicio-nancio-se um tensoativo a fase oleosa ou á fase aquosa, formando uma emulsão de óleo-em-água por rneíos adequados, e evaporando-se a emulsão lentamente sob vácuo. Caso as goticulas cie óleo sejam suficientemente pequenas e estáveis durante a evaporação, obtém-se uma suspensão do polímero em água. Desde que a droga esteja inicialmente presente na solução polimérica, é possive! obter, por este método, uma composição, em que as moléculas da droga são aprisionadas dentro de partículas compostas de uma matriz polimérica. A formação de microesferas o nanopartíeulas usando o método de evaporação de solvente foi relatada por vários pesquisadores (ver por exemplo, Tice e Giüey. no Journal of Controlled Release 2:343-352 (1985); Bodmeier and McGinity, in Int. J. Pharmaceutics 43:179 (1983); Cavalier et al., em J. Pharm. Pharmacol 33:249 (1935); o D’Souza et al., WO 94/10980) enquanto usando várias drogas.

Bazile et al., em Biomateriais 13:1093 (1992), e Spenlehauer et ai., na Patente Francesa 2.660.556, relataram a formação de nanopartículas com o uso de dois polímeros biocompatíveis, um (por exemplo, polilactídeo) é dissolvido na fase orgânica, juntamente com um componente ativo, tal come* uma droga, e o outro polímero, tal como albumina, é usado como o agente ativo de superfície. Após emulsificação e remoção do solvente, são formadas nanopartículas em que a droga esiá presente dentro da matriz polimérica das partículas de polilactídeo.

As propriedades da solução polimérica, da qual é formada a matriz polimérica, são muito importantes para obter-se a emulsão adequada no primeiro estágio. Por exemplo, polilactídeo (o polímero comumente usado na preparação de nanopartículas injetáveis) tem uma atividade superficial que ocasiona a rápida adsorção destas na interface de diclorometano-água, ocasionando tensão ir.terfaciai reduzida, (ver por exemplo, Bourv et al., em Lanamuir 11:1636 (1995)), que, por sua vez, melhora o processo de emulsificação. Além disso, os rnesrnos pesquisadores descobriram que Albumina de Soro Bovino (BSA) interage com o polilactídeo e penetra na monocamada cie polilactídeo presente na interface de óleo-água. Portanto, espera-se, com base na referência acima, que a emulsificaçãu durante o método de evaporação de solvente convencionai seja, em muito, favorecida pela presença do polímero superficialmente ativo (polilactídeo) na fase orgânica não-aquosa. De fato, a presença do polilactídeo não é apenas uma condição suficiente, mas ela é, atualmente, necessária para a formação de nanopartículas de tamanho adequado.

Um outro processo que é baseado no método de evaporação do solvente compreende a dissolução da droga num solvente hidrofóbico (por exemplo, tolueno ou ciclohexano), sem qualquer polímero dissolvido no solvente orgânico, adição de um tensoativo convencional à mistura como um emulsificante, formação de urna emulsão de óleo-em-água mediante uso de sonicacão em equipamento de alto cisalhamento e, a seguir, evaporação do solvente, para obter-se partículas secas da droga (ver, por exemplo, Sjos-trom et al., em J. Dispersion Science and Technology 15:89-117 (1994)). Com a remoção do solvente nanopolar, ocorre a precipitação da droga dentro das gotículas do solvente, e obtém-se partículas submíeron.

Descobriu-se que o tamanho das partículas é principalmente controlado pelo tamanho inicial das gotículas da emulsão. Além disso, é interessante observar que é relatado que o tamanho final de partícula diminui com urna diminuição na concentração da droga na fase orgânica. Esta descoberta é contrária aos resultados aqui referidos, em que nenhum tensoativo convencional é usado para a preparação das nanopartículas (nas mesmas modalidades da invenção). Além disso, observou-se pelos autores do documento de Sjostrom que a droga usada, acetato de colesterii, é ativa na superfície em toíueno, e, daí pode ser orientada como a interface de óleo-água; portanto a concentração da droga na interface e maior, aumentando assim o potencial para precipitação. A formação de partículas submícron foi também conseguida por um processo de precipitação, corno descrito por Calvo et al., em J. Pharm. Sei. 85:530 (1996). O processo é baseado na dissolução da droga, (por exemplo, indometaein) e o polímero, (policaproiaciona) em cloreto de metiieno e acetona e, em seguida, verter a solução em uma fase aquosa contendo um tensoativo (Poloxamer 188) para produzir partículas de tamanho submí-cron (216 nm). Entreianto, o processo é realizado em concentrações de solvente nas quais nenhuma emulsão é formada. O TaxoP é um composto de ocorrência natural, que demonstrou uma grande promessa como uma droga anticâncer. Por exemplo, o Taxoí* demonstrou ser um agente ativo contra câncer ovariano refratário ã droga por NicGuire et al., Ver Taxoi: A Unique Anti-Neoplastic Agent With Signifi-caní Aciivity Against Advanced Ovarian Epithelíal Neoplasms" Ann. ini. Med. 111, 273-279 (1989). Todas as patentes, artigos científicos, e outros documentos aqui mencionados estão ora incorporados por referência, como se estivessem reproduzidos em sua totalidade abaixo, Infeüzmentc, ο Ta-χοΓ possui soiubiiidade extremamente baixa em agua, o que torna difícil prover uma forma de dosagem adequada. De fato, em testes clínicos de fase I, reações alérgicas graves foram ocasionadas pelos emulsificantes administrados em conjunto com Taxoí':', para compensar a fraca soiubiiidade do Taxoi1’ em água; pelo menos uma morte de paciente foi causada por uma reação alérgica induzida pelos emulsificantes. Toxicidades limitantes de dose incluem neutropenia, neuropatia periférica, e reações de hipersensibilidade.

Brown et a!., ern "A Phase I Trial of Taxol Given by A 6-Hour !n-travenous Infusion" J of Clin Oncol.. Vo 1.9 No 7, pp. 1261-1267 (julho/1991), relatam em um Teste de fase I que foi providenciado Taxol como uma infusão IV de 6 horas a cada 21 dias. sem pré-medicação. 31 pacientes receberam 64 procedimentos de avaliação com Taxol. Um paciente teve uma reação grave (ou aguda) de hipersensibilidade, que necessitou a descontinua-cão da infusão e tratamento imediato para salvar a vida do paciente. Um outro paciente experimentou uma reação de hipersensibilidade, porém não foi tão grave que precisasse descontinuar a infusão. A mielossupressão era dose-limitante, com dois casos fatais devido â septicemia. Toxicidade não hematológica era de Grau 1 e 2, exceto por um paciente com mueosííe Grau 3 e dois pacientes com neuropatia Grau 3. A neuropatia consistia em pares-tesias dolorosas reversíveis, necessitando descontínuaçâo do Taxol em dois pacientes Quatro respostas parciais foram verificadas (3 em pacientes com câncer de pulmão com ausência de células pequenas, e uma em um paciente com adenocarcinoma de câncer primário desconhecido). A dose máxima tolerada relatada foi de 275 mg/rrf, e a dose inicial de Fase II recomendada era de 225 mg/rrr. A incidência de reação de hipersensibilidade foi relatada como dependente do programa, com infusões de 6 a 24 horas de droga, com uma Incidência de 0% a 8% de reações de hipersensibilidade. Também relatou· se que as reações de hipersensibilidade persistiram com ou sem pré-medicação, apesar do prolongamento dos tempos de infusão. Visto que esses estudos de Fase ! foram conduzidos em pacientes terminalmente enfermos, sofrendo de uma série de cánceres, a eficácia dos tratamentos com Taxol não pôde ser determinada.

Em um estudo por Kris et al., o Taxol formulado com "C-rema-phor EL” em álcool desidratado foi dado como uma infusão IV de 3 horas cada 21 dias, com a dosagem administrada variando de 15 a 230 mg/nr em nove etapas de intensificação. Kris et al. concluíram que, "com a gravidade e modo imprevisível das reações de hipersensibilidade, um ulterior uso de Ta-xol não está indicado com esta formulação de droga, neste programa de administrarão". Ver Câncer Treat. fíep., Vol. 70, n° 5, maio de 1986.

Visto que tentativas anteriores usando uma injeção de bolo ou infusões curtas (1-3 horas) induziram reações anafiláticas ou outras respostas de hipersensibilidade, mais estudos foram realizados, em que o Taxol foi administrado somente após pré-medicação com esteróides (tais como de-xametasona), antihistaminas (tais como diíenilhidramina) e antagonistas de Hc (tais como cimetidina ou ranitidina), e o tempo de infusão foi estendido por 24 horas numa tentativa em eliminar reações alérgicas mais séiias. Vários resultados de estudos de Fase I e Fase li foram publicados utilizando-se infusões de 24 horas de Taxol com dosagens totais máximas de 250 mq/m2, geralmente com o tratamento sendo repetido cada 3 semanas. Pacientes foram pré-tratados com clexametasona, diíenilhidramina e cimetidina para desviar as reações alérgicas. Ver Einzig et a!., Phase II Tria! oí Taxol in Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma" Câncer Investigation 9(2) 133136 (1991), e A.B. Miller et al., "Reporting Results of Câncer Treatment" Caricer Vol 47, 207-214 (1981).

Koeiler et al., in "A Phase I Pharmacokinetic Study of Taxol Given By a Prolonged Infusion Without Premedication" Proceedings of ASCO, Vol. 8 (março de 1989) recomendam pré-medicação de rotina de modo a evitar o número significativo de reações alérgicas que se acredita serem ocasionadas pelo veículo "Cremophor” (oleo de rícino polietoxilado) usado para infusões de Taxoi. Os pacientes receberam dosagens variando de 175 mg/nr a 275 mg/rrr.

Wiernik et al., em "Phase I Clinicai and Pharmacokinetic Study of Taxol", Câncer Research, 47, 2486-2493 (1 de maio de 1987) também relatam a administração de Taxo! num veículo "Cremophor” por infusão IV durante um período de 6 horas num estudo de Fase I. incorreram reações de hipersensibilidade de Grau 3-4 em 4 de 13 testes. A dose inicial para o estudo foi de 15 mg/ητ (um terço da dosagem tóxica mais baixa em cachorros). As dosem foram intensificadas e tratou-se um mínimo cie 3 pacientes em cada nível de dose até a identificação da toxicidade e, a seguir, 4-6 pacientes foram tratados em cada nível subseqüente. O estudo concluiu que a neu-rotoxiciciade e leucopertia eram dose-limitantes e que a dose da tentativa de Fase II recomendada era de 250 mg/nr com pré-medicação.

Outros estudos exemplares com Taxol incluem: Legha et al., "Phase II Trial of Taxol in Metastatic Melanoma" Voi. 65 (junho de 1990) pp. 2476-2481; Rowinsky et al., "Phase I and Pharmacodynamic Study of Taxol in Refractoiy Acute Leukemias", Câncer Research, 49, 4640-4647 (15 de agosto de 1989); C-írem et al., "Phase I Study of Taxol Administered as a •Short IV Irifusion Daily For 5 Days" Câncer Treatment Reports, Vol. 71, n° 12 (dezembro de 1987); Donehower et al.. "Phase ! Tria! of Taxol in Patients With Advanced Câncer" Câncer Treatment Reports, vol. 71, nc' 12, (dezembro de 1987); Hoimes et al., "Phase II Study of Taxol in Patients (PT) with Metastatic Breast Câncer iMBC), " Proceeclings of the American Society of Clinicai Oncology. Vol. 10, pp. 60, (março de 1991) Ver também Sutfness, "Deveiopmení of Antitumor Natural Products at the National Câncer Insti-tute,” Gann Monograpf or Câncer Research, 31 (1989) pp. 21-44 (que recomenda a dosagem de Taxol somente como uma infusão de 24 horas.) Weiss et al., in "Hypersensiíivity Reactions from Taxol" Journal of Clinicai Oncology, Vol. 8, No 7 (julho de 1990) pp. 1263-1268 relatam que foi difícil determinar uma incidência globai confiável de reações de hipersen-sibiiidade HSRs, por causa das muitas variações nas doses Θ prCCjrâíTiaS Uç? Taxol usados, e do grau desconhecido da influencia que a alteração do programa de infusão e uso da pré-medicação tem sobre incidentes de reações de hipersensibilidade HSR. Por exemplo, de cinco pacientes que receberam Taxol em uma infusão de 3 horas, maior do que 190 mg/irt sem pré-medicação. trés tiveram reações, enquanto somente um de 30 pacientes, administrados com doses mesmo maiores durante uma infusão de 6 horas, sem pré-medicação, teve uma reação. Portanto, isto sugere que o prolongamento da infusão para além de 6 horas é suficiente para reduzir os incidentes de HSR. Não obstante, Weiss et al. descobriram que os pacientes que receberam 250 rng/m2 de Taxol administrado através de uma infusão de 24 horas ainda tiveram HSP.s definido. Assim, embora o prolongamento da infusão da droga para 6 ou 24 horas pode reduzir o risco de uma reação aguda, esta conclusão não pode ser confirmada, visto que 78% das reações de HSR ocorreram dentro de 10 minutos do início da infusão de Taxol, o que indica que o período de tempo planejado para a infusão total não teria relação alguma. Além disso, a concentração de Taxol na infusão pode também não fazer diferença, visto que números substanciais de pacientes tiveram reações a várias pequenas dosagens com Taxol. Finalmente, não apenas o mecanismo de Taxol HSR é desconhecido, como também não ficou claro se o próprio Taxol é indutor de HSRs, ou se as HSRs são devidas ao excipiente ("Cremaphor EL”; Badische Anilin und Soda Fabrik AG (BASF), Ludwigsha-fen Federal Repubíic of Germany). Apesar da incerteza se a pré-medicação teve alguma influência na redução da gravidade ou quantidade de HSRs, a terapia profilática foi recomendada, visto que não há perigo conhecido quanto a seu uso.

As recomendações conflituosas da técnica anterior com reiação à pré-medicação, se esta deve ser utilizada para evitar reações de hipersen-sibilidade quando do uso prolongado de infusões, e da falta de dados eficazes quanto à infusões feitas durante períodos de seis horas, levaram a utilização de uma infusão de 24 horas de altas doses (acima de 170 mg/m2) de Taxol em uma emulsão de "Cremaphor EL” como um protocolo aceito de tratamento do câncer.

Embora pareça possível minimizar os efeitos colaterais da administração de Taxoi em uma emulsão com o uso de uma infusão de duração longa, a duração prolongada da infusão é inconveniente para pacientes e é muito dispendiosa, devido á necessidade em se monitorar os pacientes por todas as 6 até 24 horas do período que dura a infusão. Alem disso, infusão de duração prolongada requer que os pacientes passem pelo menos uma noite em um hospital ou clinica de tratamento.

Dosagens maiores de paciitaxei também foram descritas na literatura. Para se determinar a dose máxima tolerada (MTD) de paciitaxei, em combinação com altas doses de ciclofosfamida e cisplatina seguido por su- porte autólogo celular de origem hernatopoiético (AHPCS), Stemmer et al., (Stemmer SM, Cagrioni PJ, Shpall EJ, et al: High-dose paclitaxel, cyclophosphamide. and cisplatin with suporte autologous hematopoietic progenitor-cell support: A phase I trial. J. Clin Oncol., 14:1463-1472 (1996)) conduziram a um teste de fase I ern quarenta e nove pacientes com câncer de mama de fraco prognóstico, linfoma diferente do de HodgkiiYs (NHL), ou câncer ovari-ano com doses intensificadas de paclitaxei em infusão durante 24 horas, seguido por ciclofosfamida (5,625 mg/rrr) e cisplatina (165 mg/m2 e AHPCS. A toxicidade limitadora de dose foi encontrada em dois pacientes a 825 mg/m2 de paclitaxel; um paciente morreu de falha orgânica múltipla e o outro desenvolveu toxicidade grau 3 respiratória, CNS e renal, que foi resolvida. Polineuropatia de grau 3 e toxicidade no CNS (sistema nervoso centra!) também foram observadas. A MTD desta combinação foi determinada ser paclitaxel (775 mg/m2), ciclofosfamida (5,625 mg/m2) e cisplatina (165 mg/πΥ), seguido por AHPCS. Polineuropatia e mucosite sensorial toram toxi-cidades proeminentes, mas ambas toram reversíveis e toleráveis. Dezoito de 33 pacientes (54%) com câncer de rnarna alcançaram uma resposta parcial. As respostas também foram observadas em pacientes com NHL (quatro de cinco pacientes) e câncer ovariano (dois de dois pacientes). A Patente US 5.641.803 relata o uso de Taxol em doses de 175 e 135 mg/nr administradas em uma infusão de 3 horas. Os protocolos de infusão requerem o uso de pré-medicação e relatam a incidência de reações de hipersensibiiidade em 35% dos paciente. Reiatou-se neurotoxicidade em 51% dos pacientes, com 66%. dos pacientes experimentando neurotoxicida-de no grupo de alta dosagem e 37% no grupo de baixa dosagem. Além do mais, observou-se que 48%. dos pacientes experimentaram neurotoxicidade por períodos de infusão mais longos de 24 horas, enquanto 54%. dos pacientes experimentaram neurotoxicidade pelo período de infusão mais curto, de 3 horas.

Existe evidência na literatura que doses maiores de paclitaxel resultam numa proporção de resposta maior. As doses ótimas e programas para paclitaxel estão ainda sob investigação. Para avaliar a possibilidade de que a intensidade de dose de paclitaxel pode ser importante na indução de resposta à droga, Reed et al., de NGt tReed E, Bitton R, Sarosy G, Kohn E: Paclitaxel dose intensity. Journal of Infusional Chemotherapy, 6:59-63, 1996) analisaram os dados do teste de fase II disponível no tratamento do câncer ovariano e câncer de mama. Seus resultados sugerem que a relação entre resposta da doença objetiva e intensidade de dose de paclitaxel no câncer ovariano recorrente é altamente e estatisticamente significativa com valor de P bilateral de 0,022. A relação no câncer de mama é ainda mais forte, com um valor de p bilateral de 0,004. A 135 mg/nr/21 dias, a proporção de resposta objetiva foi de 13,2% e a 250 mg/rrr/21 dias, a proporção de resposta objetiva foi de 35,9%, A proporção de resposta vista na dose intermediária cie 175 mg/mT foi linear «com os resultados de 135 mg/rrr e 250 mg/rrr e a análise de regressão linear mostra um coeficiente de correlação para esses dados de 0,946 (Reed et al., 1996).

Em um estudo por Holmes (Holmes FA, Walters RS, Theriault RL, et al: Phase II trial of Taxol, an active druq in the treatment of melastaiic breast câncer. J. Natl. Câncer Inst., 83:1797-1805, 1991), e a MSKCC (Reichman BS, Seidman AD, Crown JPA, et al: Paclitaxel and recombinant humari granulocyte colony-stimulating factor as initial chemotherapy for metastatic breast câncer. J. Clin. Oncoi, 11:1943-1951, 1993), foi demonstrado que closes maiores de Taxol de até 250 mg/rrr produziram respostas maiores (60%) do que a dose de 175 mg/nr, (26%) aíuaimerite aprovada para o Taxoi. Esses resuiiados contudo não toram reproduzidos, devido a maior toxicidade nessas doses mais altas. Esses estudos, contudo, colocam á prova o aumento potencial sobre a taxa de resposta em doses aumentadas de paclitaxel.

Visto que faz-se necessária uma pré-medicação para Taxol, que frequentemente necessita a internação do paciente no hospital, é favoravelmente desejável desenvolver-se uma formulação de paclitaxei que obvia a necessidade quanto a pré-iTíedicação.

Visto que faz-se necessário uma pré-medicação para Taxol, devido às HSR‘s associadas com administração da droga, é bastante desejável desenvolver-se uma formulação de paelitaxel que não cause reações de hi-persensibilídade. É também desejável desenvolver-se uma formulação de paelitaxel que não cause neurotoxicidade.

Visto que infusões de Taxo! são geralmente precedidas por pré-rnedicação, e necessitam monitoração pós-infusão e manutenção de registro, o que frequentemente necessita da internação do paciente no hospital, é adequadamente desejável desenvolver-se uma formulação de paelitaxel que permitiría aos receptores serem tratados em uma base fora do paciente.

Visto que demonstrou-se que doses maiores de Taxol conseguem respostas clínicas melhoradas, muito embora com maior toxicidade, é desejável desenvolver-se uma formulação de paelitaxel que pode alcançar essas doses sem esta toxicidade.

Visto que foi demonstrado que a toxicidade limitaníe de dose de Taxol é cerebral e neurotoxica, é desejável desenvolver-se uma formulação de paelitaxel que diminua tal toxicidade. É também desejável eiiminar a pré-medicação. visto que esta aumenta o desconforto do paciente e aumenta a despesa e duração do tratamento. É também desejável diminuir a duração da infusão de Taxol, atualmente administrada em 3 horas-24 heras, para minimizar a estadia do paciente em hospitais ou clinicas.

Visto que Taxol é atualmente aprovado para administração em concentrações entre 0,6-1,2 mg/ml, e uma dose típica em seres humanos é de cerca de 250-350 mg, isto resulta ern volumes de infusão tipicamente maiores do que 300 ml. É desejável reduzir esses volumes de infusão, desenvolvendo-se formulações de paelitaxel que sejam estáveis em concentrações mais altas, de modo a reduzir o tempo de administração.

Visto que a infusão de Taxol, está limitada ao uso de tubagem I.V e sacos ou garrafas especiais devido à iixiviação dos plastificantes pelo "Cremaphor" na formulação de Taxol, é desejável desenvolver-se uma formulação de paelitaxel que não tenha "Cremaphor" e que não filtre por lixivia-ção materiais potencialmente tóxicos das tubagens ou sacos plásticos con- vencionais usados para infusão intravenosa.

DESCRIÇÃO SUCINTA DA INVENÇÃO

Portanto, constitui um objetivo desta invenção a liberação de a-gerites farmacologicamente ativos (por exemplo, Taxol, taxano, Taxotere, e similares) na forma não modificada em uma composição que não ocasione reações alérgicas devido a presença de emulsificantes adicionados e agentes solubilizarites como os atualmente empregados na liberação da droga.

Constitui ainda um objetivo da presente invenção liberar os agentes farmacologicamerite ativos numa composição de micropartículas ou rianopartículas, opcionalmente suspensas em um líquido biocompatível adequado.

Constitui ainda um outro objetivo da presente invenção prover métodos para a formação de submícrons de partículas (nanopartículas) dos agentes farmacologicamente ativos por uma técnica de evaporação de solvente de uma emulsão de óleo-em-água. Alguns métodos utilizam proteínas como agentes estabilizadores. Alguns métodos são reaiizados na ausência de quaisquer tensoativos convencionais e na ausência de qualquer material de núcleo polimérico.

Esses e outros objetivos da invenção tomar-se-ão aparentes com a verificação do relatório descritivo e das reivindicações.

De acordo com a presente invenção, descobriu-se que, os agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água podem ser liberados na forma de micropartícuias ou nanopartículas, que são adequadas para administração parenteral ern suspensão aquosa. Este modo de liberação evita a necessidade de administração de agentes farmacologicamente ativos substancialmeníe insolúveis em água (por exempio Taxol) em uma emulsão contendo, por exemplo, etanoi e óleo de rícino poiietoxilado, diluído em solução salina normal (ver, por exemplo, Norton et ai., em Abstracts oí the 2ld. National Câncer Institute Workshop on Taxol & Tsxus. 23-24 de setembro de 1992). Uma desvantagem de iais comiposições conhecidas é sua propensão em produzir efeitos colaterais alérgicos.

Assim, de acordo com a presente invenção, são providenciados métodos para formação de nanopartículas de agentes ativos por uma técnica de evaporação de solvente de uma emulsão de óleo-em-água preparada sob uma série de condições. Por exemplo, altas forcas de cisalhamento (por exemplo, sonicação, homogeneização com alta pressão, ou similares) podem ser usadas na ausência de quaisquer tensoativos convencionais, e sem o uso de qualquer material polimérico de núcleo para formar a matriz das nanopartículas. Em vez disso, proteínas (por exemplo, aibumina de soro humano) são empregadas como um agente estabilizador. Em um método alternativo, as nanopartículas podem ser formadas sem a necessidade de quaisquer altas forças de cisalhamento, simplesmente selecionando materiais que formem espontaneamente as microemulsões. A invenção ainda propicia urn método para a formação reprodu-zivel de nanopartículas inusitadamente pequenas (menores do que 200 nm em diâmetro), que podem ser esterilmente filtradas através de urn filtro de 0,22 rnícrons. Isto pode ser conseguido por adição de um solvente hidrosso-lúvel (por exemplo etanol) à fase orgânica e por seleção cuidadosa do tipo de fase orgânica, da fração da fase e da concentração da droga na fase orgânica. A capacidade em formar nanopartículas de um tamanho que seja passível de ser filtrado por filtros de 0,22 mícron é de grande importância e significância, visto que as formulações que contêm uma quantidade slgnifi-cante de qualquer proteína (por exemplo aibumina), não podem sei esterilizadas por métodos convencionais, tais como submissão à autoclave, devido à coagulação por calor da proteína.

De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, desenvo!veram-se composições úteis para liberação in vivo de agentes far-macologicamente ativos substancialmente insolúveis em água. As composições da invenção compreendem agentes íarrnacoloqicamente ativos substancialmente insolúveis em água (como um sólido ou líquido) contidos em um envoltório polimérico. O envoltório polimérico é um polímero biocompatí-vel reticulado. O envoltório polimérico. contendo os agentes farmacologica-mente ativos substancialmente insolúveis em água no mesmo, podem então ser suspensos num líquido aquoso biocompatível para administração. A invenção ainda propicia um sistema liberador de droga em gue parte das moléculas do agente farmacologicamente ativo são ligadas à proteína (por exemplo, aíbumina de soro humano) e estão, portanto, imediata-merite biodisponiveis na administração a um mamífero. A outra parte do agente farmacologicamente ativo está contida dentro de nanopartículas revestidas pela proteína. As nanopartículas contendo o agente farmacologicamente ativo estão presentes como um componente ativo puro, sem diluição por qualquer matriz poliméhca.

Um grande número de agentes farmacologicamente ativos convencionais circulam na corrente sangüínea ligados às proteínas de transporte (através de interações hldrofóbicas ou iônícas), das quais o exemplo mais comum é a aíbumina de soro. Os métodos da invenção e as composições produzidas por ele propiciam um agente farmacologicamente ativo que é “pré-ligado" a uma proteína (através de interações hldrofóbicas ou iônícas) antes da aoniinistraç.ao. A presente invenção demonstra ambos os modos acima descritos de biodisporiibilidade para o Taxol (Paclita/el), uma droga anticàncer capaz de ligar-se á aíbumina do soro humano (ver por exemplo, Kumar et al., em Research Communications in Chemical Pathelogy and Pharmaco-logv. 30: 337 (1993)). A alta concentração de aíbumina nas partículas da invenção comparadas ao Taxol propicia uma quantidade significativa da droga na forma de moléculas ligadas à aíbumina, que é também o veículo natural da droga na corrente sanguínea.

Além disso, tira-se vantagem da capacidade da aíbumina de soro humano ligar-se ao Taxol, bem como a outras drogas, o que melhora a capacidade do Taxol em absorver na superfície das partículas. Visto que a aíbumina está presente nas partículas da droga coloidais (formadas com remoção do solvente orgânico), a formação de uma dispersão eoloidal. que é estável por períodos prolongados, é facilitada, devido a uma combinação de repulsão elétrica e estabilização estérica.

De acordo com a presente invenção, são também providenciadas partículas de submícrons na forma de pó, que podem ser reconstituídas facilmente em água ou solução salina. O pó é obtido após remoção da agua por íioíilização. Albumina de soro humano serve como um componente estrutural em algumas nanopartículas da invenção, e também como um clio-protetor e auxiliar de reconstituição. A preparação das partículas filtráveis por um filtro de 0,22 microns cie acordo com a presente invenção, como descrito antes, seguido por secagem ou liofilização, produz uma formulação sólida estéril útil para injeção intravenosa. A invenção propicia, num aspecto particular, uma composição de drogas antí-câncer, por exemplo, Taxol, na forma de nanopartículas em uma dispersão líquida ou como um sólido que pode ser facilmente reconstituído para administração. Devido às propriedades especificas cie algumas drogas, por exemplo Taxol, tais composições podem não ser obtidas por evaporação de solvente convencional que dependem do uso de tensoativos. Na presença de vários tensoativos, cristais de droga muito grandes, (por exemplo, com tamanho de 5 microns. a várias centenas de microns) são formados dentro de uns poucos minutos de armazenagem após o processo de preparação. O tamanho de tais cristais é tipicamente muito maior do que o tamanho permitido para injeção intravenosa.

Embora se reconheça que as partículas produzidas de acordo com a invenção podem ser cristalinas, amorfas, ou uma mistura destas, prefere-se geralmente que a droga esteja presente na formulação numa torma amorfa. Isto levaria a uma maior facilidade de dissolução e absorção, resultando em melhor biodisponibiiidade. O agente paclitaxei aniicâncer (1 axol, Bristol ívíyers Squibb, BMS) possui atividade clínica notávei em uma série de cânceres humanos, inciuindo cânceres do ovário, mama, pulmão, esôfago, cabeça e região do pescoço, bexiga e linfomas. É atualmente aprovado para tratamento de carcinoma ovariano. onde ele é usado em combinação com cisplatina, e para câncer de mama metastásico que tenha falhado no tratamento anterior com uma combinação de regime de quimioterapia. A limitação principal de Taxol é sua fraca solubilidade e, conseqüentemente, a formulação BMS contém 50% de "Cremaphor EL” e 50% de etanoi como veícuio soiubilizante. Cada frasco desta formulação contém 30 mg de paclitaxel dissolvidos numa concentração de 6 mg/ml. Antes da administração intravenosa, esta formulação deve ser diluída em solução salina 1:10 para uma solução de dosagem final contendo 0,6 mg/ml de paclitaxel. Esta formulação foi ligada a reações de hipersensibilidade graves em animais (Lorenz et al., Agents Actions, 1087, 7:63-67) e seres humanos (Weiss et al., -J. Clin. Oneol. 1990, 8:1263-1268) e, consequentemente, requer a pré-medicação de pacientes com corticoste-róicles (por exemplo, dexametasona) e antihistaminas. A grande diluição resulta ern grandes volumes de infusão (dose típica 175 mg/nr até 1 litro) e os tempos de infusão variam de 3 horas a 24 horas. Assim, há uma necessidade quanto a uma formulação alternativa menos tóxica de paclitaxel. üapxol™ e uma nova formulação, isenta de "Cremaphor", da droga anticâncer paclitaxel. Os inventores, com base em estudos em animais, acredHâsa-que uma formulação isenta de "Cremophor” será expressi-varnenie menos tóxica e não irã necessitar da pré-medicacão dos pacientes. A pré-medicação e necessária para reduzir a hipersensibilidade e anatilaxia que ocorrem como resultado do “Cremophor” na formulação de paclitaxel atualmente aprovada e comercializada pela BMS (Bristol Myers Squibb). Capxol™ é um pó liofilizado para reconstituição e administração intravenoss. Quando reconstituído com um meio aquoso adequado, tai como injeção de cloreto de sódio a 0,9% ou 5% de injeção de dextrose, Capxol™ forma uma solução coloidal estável de paclitaxel. O tamanho da suspensão coloida! pode variar de 20 nm a 8 rnícrons, com uma faixa preferida de cerca de 20-400 nm. Os dois componentes principais de Capxol™ são paclitaxel não modificado e alhumina de soro humano (HSA). Visto que HSA é livremente solúvel em água, Capxoi™ pode ser reconstituído em qualquer concentração desejada de paclitaxel. limitado somente peios iimites de solubilidade para HSA. Assim, o Capxoi™ pode ser reconstituído em uma ampla taixa cie concentrações, que variarn de diluído (0,1 mg/ml de paclitaxel) a concentrado (20 mg/ml de paclitaxel). Isto pode resultar em volumes favoravelmente pequenos de administração.

De acordo com a presente invenção, são providas composições e métodos úteis para liberação in vivo de produtos biológicos na forma de nanoparticuÍas que são adequadas para administração parenteral em suspensão aquosa. As composições da invenção incluem estabilização por um polímero. O polímeru e um material biocompatível, tal como albumina de proteína. Aplicação de composições da invenção para liberação de produtos biológicos elimina a necessidade de administração de produtos biológicos em diíuentes tóxicos de veículos, por exemplo, etanol e óleo de rícino polie-to.xiiado, diluído em solução salina normal (ver por exemplo, Norton et aí., em Ahstracts of the National Câncer Institute Workshop on Taxol & Ta-xus. 23-24 de setembro de 1992). Uma desvantagem de tais composições conhecidas é sua propensão em produzir graves efeitos coiaíerais alérgicos e outros.

Sabe-se que a liberação cios produtos biológicos na forma de urna suspensão particuiada permite direcionamento como alvo a órgãos como fígado, pulmões, baço, circulação linfática e similares, devido à absorção nesses órgãos cias partículas pelo sistema retícuío-endoteliai (RES) das células. O direcionamento como alvo ao RES contendo órgãos pode ser controlado através do uso de partículas de vários tamanhos e através da administração por vias diversas. Mas, quando administrado a ratos, descobriu-se que o Capxol inesperadamente e surpreendentemente acumulou-se em tecidos diferentes daqueles contendo o sistema retículo-endotelial, tais como próstata, pâncreas, testículos, tubulos seminííeros, osso, etc., até um nível expressivamente maior do que o Taxol em doses similares.

Assim, é muito surpreendente que, a formulação da invenção de paciitaxe!. Capxol. urna formulação de nanopariícuia, concentre-se em tecidos tais como a próstata, pâncreas, testículos, tubulos seminííeros, osso, etc., ou seja, em órgãos que não contêm o RES, a um nívei expressivamente maior do que uma formulação não particuiada de paclitaxel, tal corno Taxol. Assim, o Capxol pode ser utilizado para tratar cânceres desses tecidos com urna eficácia maior do que o Taxol. Entretanto, a distribuição em muitos outros tecidos é similar para Capxol e Taxol, portanto, espera-se que o Capxol mantenha a atividade anticáncer pelo menos igual àquela de Taxol em outros tecidos. A base para a localização dentro da próstata pode ser um resultado do tamanho de partícula da formulação (20-400 nm) ou à presença da proteína albumina na formulação, que pode causar localização em tecido prosíátieo através dos receptores de membrana específicos (gp 60, gp 18, gp 13 e similar) É também possível que outros polímeros biocompatíveis biodegradáveis diferentes da albumina possam mostrar capacidade específica para alguns tecidos, tais como a próstata, resultando em aiía concentração local do paclitaxel nesses tecidos, como resultado das propriedades acima descritas. Tais materiais biocompatíveis estão contemplados dentro do escopo desta invenção. Uma modalidade preferida de uma composição para conseguir altas concentrações locais de paclitaxel na próstata é uma formulação contendo paclitaxel e albumina com um tamanho de partícula na faixa de 20-400 nm, e isenta de “Cremophor”. Esta modalidade também demonstrou resultar em concentrações de nível maior de paciiiaxei no pâncreas, rim, pulmão, coração, osso, e baço, quando comparado com Taxol em doses equivalentes. Essas propriedades propiciam novas aplicações desta formulação do paclitaxel, incluindo métodos de baixar os níveis de testosterona para fins de orquiectomia, e providenciando concentrações iocais altas para vascuíatura coronária para o tratamento da restenose. É também muito surpreendente que o paclitaxel seja metaboli-zado em seus meíabóiitos a uma velocidade muito mais lenta do que o Taxol quando administrado em relação ao Capxoi. Isto representa atividade anti-cáncer incrementada por períodos mais longos com doses similares de pacli-taxel. É também multo surpreendente que, quando Capxoi e Taxol são administrados a ratos em doses equivalentes de paclitaxel, um grau muito maior de mielossupressão resulta para o grupo do Taxol comparado com o grupo do Capxoi. Isto pode resultar em incidências menores de infecções e episódios febris (por exemplo, neutropenia febril). Pode também reduzir o ternpo de ciclo entre tratamentos, que é atualmente de 21 dias. Assim, o uso de Capxoi pode prover vantagem substancial sobre Taxol.

Foi surpreendentemente descoberto que o veículo do Taxol, “Cremophor7etanol diluído em solução salina, sozinho, causou forte mielos-supressão e ocasionou graves reações de hipersensibilidade e morte em vários grupos de dose em camundongos. Nenhuma de tais reações foram observadas nos grupos de Capxol em doses equivalentes e maiores. Assim, Capxol, uma formulação de paelitaxel que é isenta do veículo do Taxol, é de substancial vantagem. É também muito surpreendente que quando C-apxol e Taxol são administrados a ratos em doses equivalentes de paelitaxel, uma toxicidade muito menor é sentida para o Capxol quando comparado ao Taxol, como evidenciado por valores LD50 significativamente maiores. Isto pode ocasionar doses maiores, mais terapeutieamente eficazes de paelitaxel, para administração aos pacientes. Existe uma evidência na literatura que mostra aumento de taxas de resposta ern doses mais elevadas de paelitaxel. A formulação de Capxol pode permitir a administração dessas doses maiores devido à menor toxicidade e, assim, explorar todo o potencial desta droga. , É também surpreendente que o Capxol, uma formulação da droga substancialmente insolúvel em água, paelitaxel, seja estável quando reconstituído em um meio aquoso em várias diferentes concentrações, que variam de, mas não limitado a, 0,1-20 mg/ml. Isto oferece vantagens substanciais sobre Taxol durante a administração da droga, à medida que resulta em volumes He infusão menores, supera surtos de instabilidade conhecidos para o Taxol (tais como precipitação) e evita o uso de um filtro em linha na linha de infusão Assim, o Capxol simplifica em muito e melhora a administração do paelitaxel a pacientes. " lí' É também surpreendente, que o Capxol, quando administrado a ratos em doses equivalentes de paelitaxel como Taxol, não mostre sinal de neurotoxiciciade, enquanto Taxol, mesmo em baixas doses, mostre efeitos neuTütüxicos. A formulação da invenção ainda permite a administração de pa-clitaxel, e outros agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água, empregando um volume muito menor de líquido e requeren- do um tempo de administração em muito reduzido, em relação a volumes de administração e tempos necessários pelos sistemas de liberação da técnica anterior.

Em combinação com uma matriz polimerica biocompativel, as formulações da invenção (Capxol) permite a liberação prolongada local de paclitaxel com menor toxicidade e atividade prolongada.

As descobertas surpreendentes acima para Capxol oferecem o potenciai de melhorar substancialmente a qualidade de vida dos pacientes recebendo paclitaxel.

Vantagens Potenciais da Formulação de Capxol TM para o Paclitaxel: • O Capxol™ é um pó liofilizado contendo somente paclitaxel e albumina de soro humano. Devido à natureza da solução coloidal formada com a reconstituição do pó liofilizado, emulsificantes tóxicos tais como “Cremo-phor” (em formulação BMS de paclitaxel) ou polisorbato 30 (como na formulação Rhorte Poulenc de docetaxsl) e solventes tais como etanol para soiubiiizar a droga, não são necessários. A remoção dos emulsificantes tóxicos irá reduzir as incidências de hipersensibilidade grave e reações anafiiáticas que são conhecidas ocorrer em produtos Taxol. • Além disso, nenhuma pré-medicação com esteróides e antihistamínicos são antecipados antes da administração da droga. • Devido ás toxicidades reduzidas, como se evidencia pelos estudos LDio/LDso, doses maiores podem ser empregadas para maior eficácia. • A redução na mielossupressão (quando comparado com a formulação de BMS) e esperada para reduzir o período do ciclo de tratamento (atualmente 3 semanas) e melhorar os resultados terapêuticos. • Capxol™ pode ser administrado em concentrações muito maiores (de até 20 mg/mi) comparado com a formulação de BMS (0,6 mg/mi), permitindo volumes muito menores de infusão e administração como um bolo intra-venosc». • Taxol pode ser feito em infusão somente com lotes de infusão de poliole-fina nitroglicerina devido ao lixiviamento dos plastificantes da tubagem de infusão padrão para a formulação. O Capxol não demonstra nenhum lixi- viamento e pode ser utilizado com qualquer tubagem de infusão padrão. Além disso, somente recipientes de vidro ou poliolefina devem ser usados para armazenar todas as soluções contendo “Cremophor”. A formulação de Capxol não tem tais limitações. • Um problema reconhecido com a formulação de Taxol é a precipitação do paolilaxel em cateteres internos. Isto resulta em dosagem fracamente controlada e passível de erro. Devido à estabilidade intrínseca da. solução coioidai da nova formulação, Capxol™, o problema da piecipiiação é aliviado. • A administração de Taxol requer o uso de filtros em linha para remover precipitados e outra matéria parliculada. Capxol não tem tais requisitos devido à sua estabilidade intrínseca. • A literatura sugere que partículas de baixa dimensão, na faixa de cem nanornetros, de preferência se dividem em tumores através de vasos sangüíneos lesados no ponto do tumor. As partículas coíoidais de pacli-taxel na íormuiaçáo de Capxol™ podem portanto, mostrar um efeito objetivo preferencial, reduzindo em muito os efeitos colaterais dc» paclitaxel administrado na formulação BMS.

Portanto, constitui um objetive· primário da presente invenção prover uma nova formulação de paclitaxel que propicie as características desejáveis supra.

Constitui um outro objetivo da presente invenção prover uma nova formulação de paclitaxel que iocahze paciitaxei em alguns tecidos, propiciando assim maior atividade anticancerígena nesses pontos.

Constitui um outro objetivo da invenção administrar o paclitaxel em concentrações maiores do que cerca de 2 mg/rnl, de modo a reduzir os volumes de infusão.

Constitui também um objetivo da invenção providenciar uma formulação de paclitaxel que seja isenta do veículo do Taxol.

Constitui um outro objetivo ainda da invenção providenciar uma formulação de paciitaxei que melhore a qualidade de vida dos pacientes recebendo Taxol para tratamento do câncer.

DESCRICÃO SUCINTA DOS DESENHOS A figura 1 apresenta os resultados da administração intravenosa de nanoparticulas de paclitaxel em camundongos portadores de tumor (n = 5 em cada grupo), mostrando uma completa regressão do tumor no grupo de tratamento (■) comparado com um grupo de controle recebendo solução salina (·). O crescimento tumoral virtualmente descontrolado é visto no grupo de controle. A dose para o grupo de tratamento é de 20 mg/kg de paclita-xel administrado como um bolo intravenoso por cinco dias consecutivos.

A figura 2 apresenta os resultados da administração intraperito-nial de nanoparticulas de paclitaxel em ratos que desenvolveram artrite em suas patas em seguida á injeção intradérmica de colágeno. Os volumes da pata são medidos e indicam a gravidade da doença. Os volumes da pata são normalizados em 100% no começo do tratamento. Dia 0 representa o início do tratamento. Existem 3 grupos - grupo de controle que recebe solução salina (n = 2, mostrado como uma linha delgada e rotulado na figura como “sem tratamento”); urn primeiro grupo de tratamento recebendo nanoparticulas de paclitaxel a uma dose de 1 mg/kg (n = 4, mostrado como uma linha grossa e rotulado na figura como "nanoparticulas de paclitaxel a 1,0 mg/kg") e um segunde* grupo de tratamento recebendo terapia combinada de nano-paríículas de paclitaxel a uma dose de 0,5 mg/kg e prednisona a uma dose de 0,2 mg/kg (n = 4, mostrado como uma linha grossa e lotulado na figura como "prednisona 0.2 mg/kg + nanoparticulas de paclitaxel 0,5 mg/kg"). Os dois grupos de tratamento mostram uma redução dramática no volume da pata com o tempo, indicando uma regressão da artrite, enquanto o grupo de controle mostrou um aumento no volume da pata durante o mesmo período. DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo corn a presente invenção, são providenciados métodos para reduzir a toxicidade hemaíologica de paclitaxel em um Indivíduo submetido a tratamento com paclitaxel, o referido método compreendendo a administração sistêmica do referido paclitaxel ao referido indivíduo em uma formulação farmaeeuticamente aceitável em um procedimento de pelo menos 175 mg/m2 durante um período de administração não excedente a duas horas.

De acordo com a presente invenção são também providos métodos para preparação de agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água para liberação in vivo, referido método compreendendo: a) combinação de i) um solvente orgânico com o referido agente ativo dissolvido no mesmo; ii) água ou uma solução aquosa; ui ) um tensoativo; e (iv) um co-tensoativo que, espontaneamente forma uma microemulsão; e b) remoção do referido solvente orgânico para produzir uma suspensão de nanoparticulas cio referido agente ativo na reíerioa água.

De acordo com mais; uma outra modalidade da presente invenção, é provido um sistema de liberação de droga compreendendo partículas de urn sólido ou líquido, um agente farmacologicamente ativo substancialmente insolúvel em água revestido com uma proteína, ern que o revestimento protéico possui proteína livre em associação com ele, em que uma parte do referido agente farmacologicamente ativo está contida dentro do revestimento proíéieo e uma parte do referido agente farmacologicamente ativo está associada com a referida proteína livre, e eni que o diâmetro medio das referidas partículas não é maior que cerca de 1 mícron.

As composições produzidas pelos métodos acima descritos são particuíarmente vantajosas, à medida que foram observadas prover uma torma de toxidez muito baixa de uma série de agentes farmacologicamente ativos. Também descreve-se aqui outros métodos de produção de formas de baixa toxicidade de agentes farmacologicamente ativos, por exemplo, pacli-taxel.

Numa modalidade preferida, o diâmetro médio das partículas a- cima descritas, não é maior do que cerca de 200 nm. Tais partículas são particularmente vantajosas, à medida em que podem ser submetidas à filtra-ção estéril, eliminando assim a necessidade de tratamento mais rigoroso para adquirir esterilização de soluções contendo o desejado agente íarmaco-logicamente ativo.

Como aqui empregado, a menos que especificado em contrário, o termo "paclitaxel" engloba todas as formas, modificações e derivados de paelitaxel, por exemplo, taxotere, e similares.

Capxol™ é a marca comercial para a formulação de paclitaxel a ser comercializada pelo cessionário do Pedido. Como aqui empregado, Capxol™ é puramente um meio prático de referencia de nanoparticulas de pacli-taxe! revestidas com proteína, produzidas pelo método do Exemplo 1. Capxol™ é uma formulação de nova propriedade, isenta de "Cremaphor" da droga anticánoer, paclitaxel. Os inventores, com base em estudos animais, acreditam que uma formulação isenta de "Cremaphor" irá ser expressivamente menos tóxica e não irá requerer pré-medicaeão dos pacientes. A pré-medicação é necessária para reduzir a hipersensibilidade e anafilaxia que ocorre como resultado do "Cremaphor" na formulação da BMS (Bristol Myers Squibb) atualmente aprovada e comercializada. Capxol™ é um pó liofilizado para reconstituição e administração intravenosa. Cada frasco de Capxol™ contém 30 mg de paclitaxel e aproximadamente 400 mg de albumina de soro humano. Quando reconstituído com um meio aquoso adequado, ta! como injeção de cloreto de sódio a 0,9% ou injeção de dextrose a 5%, o Capxol™ forma uma solução coioidal estável de paclitaxel. O tamanho das nanoparticulas coloidais é tipicamente menor do que 400 nm. As nanoparticulas são preparadas por homogeneização a alta pressão de uma solução de albumina de soro humano USP e uma solução de paciitaxel num solvente orgânico. O solvente é a seguir removido para gerar a suspensão coioidal ou solução de paclitaxel em albumina humana. Esta suspensão é filtrada esterilmeníe e liofilizada para obter-se Capxol™. A formulação não contém nenhum outro excipientes ou estabilizadores adicionados. A esterilidade do produto é assegurada por um processo de fabricação asséptico e/ou por fiítração estéril.

Os dois componentes principais de Capxol™ são paclitaxel não modificado e albumina de soro humano (HSA). Visto que a HSA é livremente solúvel em água, Capxol™ pode ser reconstituído em qualquer concentração desejada de paclitaxel, limitado somente pelos limites de solubilidade para HSA. Assim, Capxol™ pode ser reconstituído em uma ampla faixa de concentrações que variam de diluído (0,1 mg/ml de paclitaxel) a concentrado (20 mg/ml de paclitaxel). isto pode resultar em volumes favoravelmente pequenos de administração.

Como aqui empregado, o termo "liberação in vivo" refere-se à liberação de um agente farmacologicamente ativo pelas mencionadas vias de administração, conforme sejam, orai, intravenosa, subcutânea, intraperitoni-al, intratecai, intramuscular, por inalação, tópica, íransdérmica, siipositório (retal), vaginal, intra-uretral, intraportal, intra-hepãtico, iníra-arterial, intra-humorai, e simiiares.

Como aqui empregado, o termo "micron" refere-se à unidade de medida de um milionésimo de milímetro.

Como aqui empregado, o termo "biocompatível" descreve uma substância, que não altera ou afeta, de modo apreciável em qualquer modo prejudicial o sistema biológico ao qual ela é introduzida.

Agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água. contemplados para uso na prática da presente invenção, incluem agentes farmaceuticamenie ativos, agentes de diagnostico, agentes de valor nutricional, e simiiares. Exemplos de agentes farmaceuticamenie ativos incluem: analgésicos/antipiréticos, (por exemplo aspirina, acetaminofen, ibuproíen, naproxen sódico, cloridrato de buprenorfina, cloridrato de propoxi-feno, napsilato de propoxifeno, cloridrato de meperidina, cloridrato de hidro-morfina, sulfato de morfina, cloridrato de oxicodona, fosfato de codeína, bi-tartarato de diidrocodeína, cloridrato de pentazocina, bitartarato de nidroco-dona, tartarato de levorfanoi, diflunisal, salicilato de trolamina, cloridrato de nalbufina, ácido mefenâmico, tartarato de butorfanol, salicilato de colina, bu-talbital, citrato de feniitoioxamina, citralu de difenidramina, cloridrato de ci- namedrina, rnetotrimeprazina, meprobamato e similares; anestésicos (por exemplo ciclopropano, enflurano, halotano, iso-flurano, metoxiflurano, oxido nitroso, propofol, e similares); antiasmáticos, (por exemplo, Azelastina, Cetotifen, Traxanox, Amlexanox, Cromolyn, Ibudilast, Montelukast, Nedocromil, Oxatomida, Pran-lukast, Seratrodast, Tosilaío de Suplatasí. Tiaramida, Zafiriukast, Zileuton, Beclometasona, Budesonida, Dexametasona, Flunisolida, Trincinolona Ace-tonida, e similares); antibióticos (por exempio, neomicina, estreptomicina, cloranfeni-col, cefalosporina, ampicilina, penicilina, tetraciclina e similares); antidepressivos (por exemplo, nefopam, oxipertina, cioridrato de doxepiri, amoxapina, cioridrato de trazodona, cioridrato de amitriptilina, cioridrato de maprotilina, sulfato de fenelzina, cioridrato de desiprarniria, cioridrato de nortriptilina, sulfato de tranilcipromina cioridrato de íluoxetina, cioridrato de docpina, cioridrato de imipramina, pamoato de imipramina, nortriptilina, cioridrato d« amitriptilina, isocarboxazid, cioridrato de desiprarnina, maleato de trirnipramina, cioridrato de protriptilina e similares); antidiabétic.os (por exemplo, biguanidas, hormônios, derivados de stilfonilureia, e similares); agentes antifungicos (por exemplo, griseofulvin, cetoconazol, an-fotericiria B, Nistatin, candicidina, e similares); agentes antihipertensivos (por exemplo, propanolol, propafeno-na, oxiprenolol, Nifedipina, reserpina, camsilato de trimetafan, cioridrato de fenoxibenzamina, cioridrato de pargilina, deserpidina, diazoxida, monosulfato de guanetidina, minoxidil, rescinamina, nitroprusseto de sódio, serpentina rauwolfia, alseroxilon, mesilato de fentolamina. reserpina, e similares); antiiníiamaiónos (por exemplo, indometacin, naproxen, ibupro-fen, ramifenazona. piroxican (nao-esteroidais). cortisona, dexametasona, fíuazacort, hidrocortisona, prednisolona, prednisona (esteroidais) e similares); antineopiásicos (por exemplo, adriamicina, ciclofosfamida, acti-nomicina, bleomicina, duanorubicina, doxorubicina, epirubicina, mitomicina, metotrexato, fiuorouraoil, carboplatina, carmusíina, ÍBCNU), metil-CCNU, cisplatina, etoposídeo, interferons, camptotecin e derivados dos mesmos, íeriesteriria, Taxol e derivados do mesmo, taxotere e derivados do mesmo, vinblastina, vincristina, tamoxiíen, etoposídeo, piposulfan, e similares); agentes anti-ansiolíticos (por exemplo, lorazepam, c.loridrato de buspirona, prazepam, cloridrato de olordiazepóxido, oxazepam, dipotássio de clorazepato, diazepam, pamoato de hidroxizina, cloridrato de hidroxizina, alprazolam. droperidol, halazepam, clormezanona, dantrolene e similares); agentes imunodepressores (por exemplo, ciclosporina, azatiopri-na, mizoribina, FK506 (tacrolimus) e similares); agente anti-enxaqueca (por exemplo, tartarato de ergotamina, cloridrato de propanoioi, rnucato de isometepteno, dicloralfenazona e similares); sedativos/hipnoticos (por exemplo, barbituratos (por exemplo, pentobarhitaS. pentobarbital de sódio, secobarbitai de sódio), benzodiazepi-nas (por exemplo, cloridrato de flurazepam, triazolam, tomazeparm, cloridrato de midazolam) e similares); agentes antianginais (por exeiriplo, bloqueadores beta-adrenérgicos, bloqueadores do canal de cálcio (por exemplo, nifedipina, clo-ridralo de diltiazem, e similares), nitratos (por exemplo, nitroglicerina, dinitra-to de isosscrbeio, tetranitraio de peníaeritritol, tetranitrato de eritritila. e similares)); agentes antipsicóticos (por exemplo, haloperidol, suocínato de ioxapina, cloridrato de loxapina, tioridazina, cloridrato de tioridazina, cloridrato de iaxapina, tiotixeno, cloridrato de flufenazina, decar.oatc» de fluíenazina, enantato de flufenazina, cloridrato de tritluoperazina, cloridrato de clorpro-rnazina, perfenazina, ciíraío de lítio, prociorperazina e similares): agentes ar.tí maníacos, (por exemplo, carbonato de lítio); antiarríímicos (por exemplo, tosilato de bretílio, cloridrato de es-molol, cloridrato de verapamil, amiodarona, cloridrato de encainida, digoxin, digitoxin, cloridrato de mexiletina, fosfato de disopiramida, cloridrato de pro-cainarnida, suifato de quinidina, gluconato de quinidina, poligaíacturonato de quinidina, acetato de flecainida, cloridrato de tocainida, cloridrato de lidocaí-na e similares); agentes antiartríticos (por exemplo, fenilbutazona, suiindac, pe-nicilamina, salsalato, piroxicam, azatioprina, indometacin, meclofenamato de sódio, tiomalato sódico de ouro, cetoprofen, auranofin, aurotioglicose, íolme-tin de sódio e similares); agentes antigotoeos (por exemplo, colchicina, alopurinol, e similares); anticoagulantes (por exemplo, heparina, heparina de sódio, war-farina de sódio, e similares); agentes trombolíticos (por exemplo, uroquinase, estreptoquina-se, altoplase, e similares); agentes antifibrinolíticos (por exemplo, ácido aminocaproioo); agentes hemo-reoiógic-os (por exemplo, pentoxiíilina); agentes antiplaquelas (por exemplo, aspirina, empirina, ascripti-na e similares); antic-onvulsivos (por exemplo, ácido valproico, divalproato de sódio, fenitoína, fenitoína de sódio, clonazepam, primidona, fenobarbitol, íeno-barbitol de sódio, carbamazepina, amobarbital de sódio, metsuximida, me-tarbital, rneíobarbital, mefenitoina, fensuximida, parametadiona, etotoína, fenacemida, secobarbiíoi sódico, ciorazepato dipotássico, trimetadiona, e similares); agentes antiparkinsoriianos (por exemplo, eiosuxirnida, e similares); antihistaminas/antipruriticos (por exemplo, cloridrato de hidroxi-zina, cloridrato de diíenidramina, maleato de cSorfeniramina, maleato de bromfenirarnina, cloridrato de ciprohepíadina, íerfenadina, fumarato de c!e-maslina, cloridrato de triprolidina, maleato de carbinoxamina. cloridrato de difenilpiralina, tartarato de fenindamina, maleato de azatadina, cloridrato de tripelenamina, maleato de dexclofeniramina, cloridrato de metdilazina, tartarato de trimprazina e similares); agentes úteis para regulação do cálcio (por exempio, caiciionina, hormônio parati reóide, e similares); agentes antibacterianos, (por exemplo, sulfato de amicacin, az-treonam, cloranfenicol, palmitaio de cloranfenicol, succinato de cloranfenicol sodico, cloridrato de ciprofloxacin, cloridrato de clindarnicina, palmitato de clindamicina, fosfato de clindarnicina, meíronidazol, cloridrato de metronida-zol, sulfato de gentamicina, cloridrato de lincomicina, sulfato de tobramicina, cloridrato de vancomicina, sulfato de polimixina E, coüstimetato de sódio, sulfato de coíistina e similares); agentes antivirais (por exemple·, gama interferon, zidovudina, cloriflrato de arnantadina, ribavirin, aciclovir e similares); antimicrobianos (por exemplo, cefalosporinas (por exemplo, ce-fazolina sódica, cefradina, cefaclor, cefapirina sódica, ceftizoxima sódica, cefoperazona sódica, cefotetan dissódico, cefutoxima azotil, ceíotaxima de sódio, cefadroxil monohldraíado, ceftazidima, cefalexina, oefaiotina sódica, cloridrato de cefalexina rnonohidratado, nafato de cef amando!, cefoxitina sádica, cefonicida sódica, ceforanida, ceftriaxona sódica, ceftazidima, cefadroxil, cefradina, cefuroxima sódica e similares); penicilinas, (por exemplo, ampicilina, amoxicilina, penicilina G benzatina, ciciacilina, ampicilina sódica, penicilina G potássica, penicilina V potássica, piperaeilina sódica, oxacilina sódica, cloridrato de bacampicilina, cloxaciiina sódica, ticarcilina dissódica, azlocilina sódica, carbenicilin indanil sódica, penicilina G potássica, penicilina G procaína, meticiiina sódica, naíci-lina sódica e similares); eritromicinas (por exemplo, etilsuccinato de eritromicina, eritro-micina, estolato de eritromicina, lactcbionato de eritromicina, siearato de eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, e similares); tetracidinas (por exemplo, cloridrato de tetraciclina, hiclato de doxiciclina, cloridrato de rniriociclina e similares); antiinfecciosos (por exemplo, GM-CSF); broncodilatadores (por exernplo, simpatomiméticos (por exemplo, cloridrato de epinefrina, sulfato de metaproterenol, sulfato de terbutalina, isoetarina, mesilato de isoetarina, cloridrato de isoetarina, sulfato de albute- rol, albuterol, bitoltetol, doridrato de mesilato de isoproterenol, sulfato de ter-butalina, bitartarato de epinefrina, sulfato de metaproteremol, e pinefrina, bitartarato de pinefrina), agentes anticolinérgicos, (por exemplo, brometo de ipratrópio), xantinas (por exemplo, arninofilina, difilina, sulfato de metaprote-renol. arninofilina) estabilizadores de célula tronco (por exemplo, cromolina sódica), coiiicosteróides para inalação (por exemplo, dipropionaio de flurisoleto de beclometasona, dipropionaio de beclometasona monohidratado), salbutamoi, i dipropionaio de beclometasona (BDP), brometo de ipratrópio, budesonida, cetotifen, salmeterol, xinafoato, sulfato de terbutalina. triamcinolona, teofilina, nedocromií cie sódio, sulfato de metaproterenoi, aibuieroi, fiuriisolina e similares); hormônios (por exemplo, androgenos (como, danazol, oipionato ' de iesíosterona, íluoximesterona, eiiiíesíosterona, enanihato de testosterona, metiltestosterona, fluoximestorona, oipionato de testosterona), estrogenos (por exemplo, estradiol, estropipato, estrogenos conjugados), progestinas (por exemplo, acetato de metoxiprogesterona, acetato de noretindrona), corticosteroides (por exemplo, triamcinolona, betametasona, fos) fato betametasona de sódio, dexametasona, fosfato cie dexametasona de sódio, acetato de dexametasona, prednisona, acetato em suspensão de me-tilpreclnisolona, acetonida de triamcinolona, metilprednisolona, fosfato de prednisolona de sódio, succinato de metilprednisolona de sódio, succinato de hidrocortisona de sódio, succinato de metilprednisolona de sódio, hexaca-> íoniua triamcinolona, hidrocortisona, oipionato de hidrocortisona, prednisoio-na, acetato de íiuorcortisona, acetato de parameiasona, tebulato o'e prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sódica, succinato de hidrocortisona sódica, e similares), hormônios da tireóide (por exemplo, levotiroxina sódica) e similares; ) agenles hipoglicêmicos (por exemplo, insulina humana, insulina de boi purificada, insulina de porco purificada, glibureto, clorpropamina, glipi-zida, tolbutamida, tolazamida e similares); agentes hipolipidêmicos (por exemplo, ciofibrato, dextrotiroxina de sódio, probucol, lovastatin, niacina, e similares); proteínas (por exemplo, DNase, alginase, superoxido dismutase, lipase e similares); ácidos nucléicos, por exemplo ácido nucleico sentido ou anti-sentido codificando qualquer proteína terapeuticamente eficaz, incluindo quaisquer proteínas aqui descritas, e similares; agentes úteis para estimulação de eriíropoiese (exemplo, entro- poietina); agentes antiúlcera/anti-refluxo (por exemplo, famotidina, cimeti-dina, cloridrato de ranitidina, e similares); antinauseantes/antiernêticos (por exemplo, cloridrato de meclizi-ria, natilona, proclorperazina, dimenidririato, cloridrato de prometazina, tietil-perazina, acopoiamina, e similares); vitaminas iipossoiúveis (por exemplo, vitamineis A. D, E, K, e similares); e assim como outras drogas, tais como mitotano, visadina, haloni-trosouréias, antrociclínas, elipticina e similares;

Exemplos de agentes de diagnóstico contemplados para uso na prática da presente invenção incluem agentes de contraste de ultra-som, agentes para rádio-coníraste (por exemplo, iodooctanos, halocarbonetos, renografina e similares), agentes de contraste magnéticos, (por exemplo, fiuorocarbonos, compostos paramagnéticos Iipossoiúveis, e similares), bem como outros agentes de diagnóstico que não podem ser prontamente liberados sem alguma modificação física e/ou química para acomodar a natureza subsíancialrnente insolúvel em água deles.

Exemplos de agentes de valor nutricional contemplados para uso na prática da presenie invenção, incluem aminoácidos, açúcares, proteínas, carboidratos, vitaminas Iipossoiúveis (por exemplo, vitaminas A, D, E, K, e similares), gorduras ou combinações de quaisquer dois ou mais destes.

A. FORMACÀO PE NANOPARTÍCULAS USANDO HOMOGENEIZAÇÃO DE ALTO CISALHAMENTO

Diferenças chave entre os agentes farmacologicamente ativos contidos num envoltório polimérico de acordo com a invenção e microesferas de proteína da técnica anterior estão na natureza da formação e no estado fina! da proteína apôs formação da partícula, e sua capacidade em transportar agentes fracarnente hidrossolúveis ou agentes aquosos substancialmente insolúveis. De acordo com a presente invenção, o polímero (por exemplo, uma proteína) pode ser reticuiado como resultado da exposição a condições de alio cisalhamenlo em um homogeneizados* de alta pte_s.3Ão.._Alto cisalha-mento é usado para dispersar um agente de dispersão contendo o agente farmacologicamente ativo dissolvido ou suspenso em uma solução aquosa de um polímero biocompatível, opcionalmente transportando grupos sulfidrila ou dissulfeto (por exemplo, albumina), pelo que é formado um envoltório de polímero reticuiado em torno de finas gotículas do meio não-aquoso. As condições de alto cisalhamento produzem caviíacão no líquido, o que ocasiona um aquecimento iocai enorme e resulta na formação de ibns superoxi-do, que são capazes de reticular o polímero, por exemplo, por oxida cão dos resíduos sulfidrila (e/oii rompendo ligações de dissulfeto existentes) para formar novas ligações de dissulfeto de reticulação.

Em contraste com o processo da invenção, o método da técnica anterior de reticulação de glutaraldeído é não especifico e, essenciaimente reativo com qualquer grupo nucleofilico presente na estrutura de proteína (por exemplo, aminas e hidroxüas). A desnaturação com o calor, conforme ensinada pela técnica precedente, altera de modo significativo e de forma irreversível a estrutura da proteína. Em contraste, a formação de dissulfeto contemplada pela presente invenção não desnatura a proteína de modo substancial. Além disso, partículas de agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água contidas dentro de um envoltório diferem das microesferas de proteína reticuiada ou desnaturada com eaíoi da técnica anterior, porque o envoltório polimérico produzido pelo processo da invenção é relativamente delgado comparado com o diâmetro da partícula revestida. Determinou-se (por microscopia eletrônica de transmissão), que a "espessura do envoltório" do revestimento polimérico é de aproximadamente 25 nanometros para uma partícula revestiría com um diâmetro de 1 míeron (1000 nanometros). Em contraste, microesferas da técnica anterior não possuem envoltórios proteicos, ao contrário, possuem proteína dispersa por todo o volume da microesfera.

Assim, de acordo com a presente invenção um agente farmaco-logicamenle ativo é dissolvido em um solvente adequado (por exemplo, clorofórmio, cloreto de metileno, acetato de etila, etanol, tetrahidrofurano, dio-xano, butanol, acetato de butiia, acefonitriia, acetona. dimetilsulíóxido, dime-tilformamida, metilpirrolidinona, ou similares, bem como misturas de quaisquer dois ou mais dos acima). Solventes adicionais contemplados para uso na prática da presente invenção incluem óleo de soja, óleo de coco, óleo de oliva, óleo de açafrão, óíec* de caroço de algodão, óleo de gergelim, óleo de laranja, óleo de limão, álcoois Cm-o, esteies C2.20, cetonas C3-20 polietüerio-glicóis. hidrocarbonatos aliféticos, hidrocarbonetos aromáticos, hicirocarbo-netos halogenados e combinações destes.

Diferente de métodos convencionais para formação de nanopar-tículas, um polímero (por exemplo, ácido poliláctieo) não ó dissolvido no solvente. A fase oleosa empregada na preparação das composições da invenção tipicamente contém apenas 0 agente farmacologicarnente ativo dissolvido no solvente. A seguir, uma proteína (por exemplo, albumina de soro humano) é adicionada (à fase aquosa) para atuar como um agente estabilizante para a formação de nanogoticulas estáveis. A proteína é adicionada em uma concentração na faixa de cerca de 0,05 a 257o (peso/voiume), mais preferivelmente na faixa de cerca de 0.5%-5% (peso/volurne). Diferente çíe métodos convencionais para formação de nanopartícula nenhum tensoativo (por exemplo, lauril sulfato de sódio, lecitina, tween 80, pluronic F-63, e simiiares) sao adicionado? â mistura. A seguir, forma-se uma emulsão por homogeneização sob alta pressão e altas forças de cisalhamento. Essa homogeneização é convenientemente realizada em um homogeneizador de alta pressão, tipicamente operado a pressões que variam de cerca de 21 até 414 MPa (3.000 até 60.000 psi). De preferência, tais processos são realizados a pressões na faixa de cerca de 41 até 276 MPa (6.000 até 40.000 psi). A emulsão resultante compreende nanogotículas muito pequenas do solvente não-aquoso, (contendo o agente farmacologicamente ativo dissolvido) e nanogotículas muito pequenas do agente estabilizador de proteína. Métodos aceitáveis de homogeneização incluem processos que conferem alto cisalhamento e cavitação, tais como homogeneização com alta pressão, misturadores de alto cisalhamento, soriicação, propulsionador de alto cisalhamento e similares.

Finalmente, o solvente é evaporado sob pressão reduzida para produzir um sistema coloidal composto de nanopartículas revestidas com proteína. Métodos aceitáveis de evaporação incluem o uso de evaporadores rotativos, evaporadores de película exiraível, secadores por pulverização, secadores por congelamento, e similares. A ultrafiltração pode também ser usada para remoção do soivente.

Seguinte à evaporação do solvente, a suspensão líquida pode ser seca para obter-se um pó contendo o agente farmacologicamente ativo e a proteína. O pó resultante pode ser redisperso em qualquer ocasião conveniente, em um meio aquoso adequado, tal como solução salina, solução salina tamponada, água, meio aquoso tamponado, soluções de aminoácidos, soluções de vitaminas, soluções de carboiüratos, ou similares, bem como combinações de quaisquer dois ou mais destes, para obter uma suspensão que pode ser administrada aos mamíferos. Métodos considerados para obter este pó incluem secagem por congelamento, secagem por pulverização e similares.

De acordo com uma outra concretização da presente invenção, é providenciado um método alternativo para a formação de partículas de submíerons ínusitadamente pequenas (nanopartículas) ou seja. partículas com menos de 200 nanômetms de diãmeiio. Tais partículas são capazes de ser filtradas esterilmente antes do uso na forma de uma suspensão líquida. A capacidade de filtrar esterilmente o produto final do processo de formulação da invenção (ou seja, as partículas da droga) é da maior importância, desde que é impossível esterilizar dispersões que contém altas concentra- r.ões cie proteína (por exemplo, albumina de soro) por meios convencionais, tais como tratamento em autoclave.

De modo a obter-se partículas esterilmente filtráveis (ou seja, partículas <200 nm), o agente farrnaeologicamente ativo e inicialmente dissolvido num solvente orgânico substancialmente imiscível em água (por e-xernplo, um solvente com menos que cerca de 5% de solubilidade em água, tal como por exemplo, clorofórmio) em alta concentração, pelo que formar-se uma fase oleosa contendo o agente farrnaeologicamente ativo. Solventes adequados estão exemplificados acima. Diferente de métodos convencionais para formação da nanopartícula, um polímero (por exemplo, ácido polilàcti-co) não e dissolvido no solvente. A fase oleosa empregada no processo da presente invenção contém somente o agente farrnaeologicamente ativo dissolvido no solvente. A seguir, um solvente orgânico misoível em água. (por exemplo, um solvente com mais que cerca de 10% de solubilidade em água, tai como por exemplo, elanol) é adicionado à fase oleosa em uma concentração final na faixa de cerca de 1%-99% v/v, mais preferivelmente na faixa de cerca de 5%-25% v/v, da fase orgânica totai. O solvente orgânico miscível em água pode ser selecionado de tais solventes como acetato de etila, etanol, tetrahi-drofurano, dioxano, acetonitrila, gutanoí, acetona, propilenoglicol, glicerol, dimetilsulíóxido, dimeíiiformamida, meíiipirrolidinona e similares. Alternativamente, a mistura de solvente imiscível em água com o solvente miscível em água é preparada primeiro, seguido por dissolução do agente farmacolo-gicameníe ativo na mistura. A seguir, albumina de soro humano ou outro agente estabilizanís adequado conforme descrito acima é dissolvido no meio aquoso. Este componente age como um agente estabiiizante para a formação de nanogotíc-u-las estáveis. Opcionaimente, uma quantidade suficiente do primeiro solvente orgânico (por exemplo, clorofórmio) é dissolvido na fase aquosa para trazê-lo próximo da concentração de saturação. Uma quantidade separada, medida da fase orgânica (que agora contém o agente farrnaeologicamente ativo, o primeiro solvente orgânico e o segundo solvente orgânico) é adicionada à fase aquosa saturada, de modo que a fração de fase da fase orgânica fica entre 0,5%-15% v/v, e mais preferivelmente entre 1% e 8% v/v. A seguir, uma mistura composta de micro e nanogotículas é formada por homogeneização em f«orças de cisalhamento baixas, isto pode ser realizado em uma série de modos, como pode ser prontamente identificado pelos peritos cia técnica, empregando, por exemplo, um homogeneizador convencional de laboratório operado na taixa de cerca de 2.000 até cerca de 15.000 rpm. Segue-se a homogeneização sob alta pressão (ou seja, na faixa de cerca de 21 a 414 MPa (3.000 até 60.000 psi)). A mistura resultante compreende uma solução de proteína aquosa (por exemplo, albumina de soro humano) o agente farmacologicamente ativo insolúvel em água, o primeiro solvente, e o segundo solvente. Finalmente, o solvente é rapidamente evaporado sob vácuo para produzir um sistema de dispersão coloidal (agente farmacologicamente ativo e proteína) na forma de nanopartículas extremamente pequenas (ou seja, partículas na faixa de cerca de 10 nm-200 nm cie diâmetro), que podem ser filtradas esterilmente. A faixa de tamanho preferida das partículas fica entre cerca de 50 nm-170 nm, dependendo da formulação e parâmetros operacionais.

Sistemas coloidais preparados de acordo com a presente invenção podem ser ainda convertidos em forma de pó pela remoção da água destes, por exemplo, por lioíiiização ou secagem por pulverização, em um perfil de ternpo-temperatura adequado. A proteína (por exemplo, albumina de soro humano), atua por si mesma como um crioprotetor ou lioprotetor, e o pó é facilmente reconstituído por adição de água na solução salina ou tampão, sem necessidade do uso de crioprotetores convencionais como msnitoí, sacarose, gücina e similares. Embora rião necessário, fica, naturalmente entendido que crioprotetores convencionais podem ser adicionados às formulações da invenção, caso se deseje. O sistema coloidal do agente farmacologicamente ativo permite a liberação de altas doses do agente farmacologicamente ativo em volumes relativamente pequenos. Isto minimiza o desconforto do paciente em receber grandes volumes de fluido e minimiza a internação em hospital. Além disso, as paredes do envoltório ou revestimento poiimérico são, em geral, completamente degradáveis in vivo por enzimas proteolíticas, (por exemplo, quando o polímero é uma proteína), resultando em substancialmente nenhum efeito colateral oriundo do sistema de liberação, que está em contraste marcante com os efeitos colaterais significativos ocasionados por formulações atuais.

Uma série de polímeros biocompatíveis podem ser empregados na prática da presente invenção para a formação do envoltório poiimérico que circunda os agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água. Essencialmente qualquer polímero, natural ou sintético, opcionalmente transportando grupos sulfidrila ou ligações de dissulfeto dentro de sua estrutura, pode ser utilizado para a preparação de um invólucro reti-culado de dissulfeto em torno de partículas dos agentes farmacologicamente ativos substancialmente insolúveis em água. Os grupos sulfidrila ou ligações de dissulfeto podem ser preexistentes dentro da estrutura pclimcrica ou eles podem ser introduzidos por uma modificação química adequada. Por exemplo, polímeros naturais, tais como proteínas, peptídeos, ácidos polinucleicos, polissacarídeos, (por exemplo, celulose, amido, dextranas, alginatos, quito-sana, pectina, ácido hiaiurònico, e similares), protoglic-ans, lipoproteínas, e outros, são candidatos para tal modificação.

Proteínas consideradas para uso como agentes estabilizantes de acordo com a presente invenção, incluem albuminas (que contém 35 resíduos de cisternas), imunoglobulinas, caseínas. insulinas, (que contém 6 cisteínas) hemoglobinas (que contém 6 resíduos de clsteína por unidade &2p2), lísozimas (que contém 8 resíduos de clsteína), imunoglobulinas, alía-2-macroglobuüna, fibronectinas. viíronectinas, íibõnogênios, lipase, e similares. Proteínas, peptídeos, enzimas, anticorpos, e combinações destes, são classes genéticas de estabilizadores examinados para uso na presente invenção.

Uma proteína atualmente preferida para uso como um agente estabilizador é albumina. Opcionalmente, proteínas tais como a!fa-2-macroglobulina, uma opsonina conhecida, pode ser usada para intensificar a apreensão de partículas encerradas no envoltório dos agentes farmacoiogi- camente ativos substancíalmente insolúveis em água por células similares ao macrófago, ou para melhorar a apreensão das partículas encerradas no envoltório para o fígado e baço. Anticorpos específicos podem também ser utilizados para direcionar as nanopartícuías a localizações especificas. Outras proteínas funcionais, tais como anticorpos ou enzimas, que poderiam facilitar o direcionamento do agente ilógico a um sítio desejado, podem também ser usadas como componentes da proteína estahilizadora.

Similarmente, polímeros sintéticos são também bons candidatos para formação das partículas com um envoltório polimérico. Além disso, po-lialquileno glicóis (por exemplo, cadeia ramificada ou linear), álcooi poliviníli-cc», poliacrilatos, metacrilato de polihidroxietila, ácido poliacrilico, polietiloxa-zolina, noliacrilarnidas, poliisopropii acrilamidas, polivinilpirrolidinona. polilac-tídeo/glicolideo, e similares, e combinações destes, são bons candidatos para o polímero biocompatível na formulação da invenção.

Similarmente, polipeptídeos sintéticos são também bons candidatos para agentes estsbiiizantes para os agentes farmacoiogicamente ativos substancialmente insolúveis em água. Aiern disso, materiais considerados para uso na prática da presente invenção são materiais como poliami-noácidos sintéticos contendo resíduos de cisteína e/ou grupos dissulfeto; álcool polivinílico modificado para conter grupos sulfidrila livres, e/ou grupos dissulfeto; metacrilato polihidroxietila modificado para conter grupos sulfidrila livre e/ou grupos dissulfeto; ácido poliacrilico modificado para conter grupos sulfidrila livras e/ou grupos dissulfeto; poüotüóxazoüna modificada para conter grupos sulfidrila livres e/ou grupos dissulfeto; po!iacri!amida modificada para conter grupos sulfidrila livres e/ou grupos dissulfeto; poiivinll pirrolidino-na modificada para conter grupos suifidriia livres e/ou grupos dissulfeto; poíi-aiquileno glicóis modificados para conter grupos sulfidrila livres e/ou grupos dissulfeto; polilactídeos, poliglicolídeos, policaprolactonas, ou copolímeros dos mesmos, modificados para conter grupos sulfidrila livres e/ou grupos i dissulfeto, bem como mistura de quaisquer dois ou mais destes.

Na preparação das composições da invenção, uma ampla variedade de meio orgânico pode ser empregada para suspender ou dissolver o agente farmacologicamente ativo substancialmente insolúvel em água. O meio orgânico considerado para uso na prática da presente invenção inclui qualquer líquido não-aquoso que seja capaz de suspender ou dissolver o agente farmacologicamente ativo, mas não reaja quimicamente com quaisquer polímeros empregados para produzir o envoltório ou o próprio agente farmacologicamente ativo. Exemplos incluem óleos vegetais (por exemplo, óleo de soja, óleo de oliva, e similares, óleo de coco. óleo de açafrão, óleo de caroço de algodão, óleo de gergelim, óleo de laranja, óleo de limão, hi-drocarbonetos alifáticos, cicloalifáticos, ou aromáticos, contendo de 4-30 átomos de carbono (por exemplo, n-doclecano, n-decano, n-hexano, ciclohe-xano, tolueno, benzeno e similar), álcoois alifáticos ou aromáticos contendo de 2-30 átomos de carbono, (por exemplo octanol, e similares), esteies alifáticos ou aromáticos tendo 2-30 átomos de carbono (por exemplo, caprilato de etila (octanoato) e similares) éteres alquílicos, arüicos ou cíclicos com de 2-30 átomos de carbono (por exemplo, éter dietilico, tetrahidrofurano e similares), halogenetos de alquila ou arila contendo de 1-30 átomos de carbono (e, opciunalrnente, mais de um substituinte halogênio, por exemplo, CH3CI, CHaCb, CHoCI-CHçCI, e similares), cetonas contendo de 3-30 átomos de carbono, (por exemplo, acetona, metil etil cetona, e similares), polialquileno giicóis (por exemplo, polielileno glicol, e similares), ou combinações de quaisquer de dois ou mais destes.

Combinações especialmente preferidas de meio orgânico consi- i i r» λ «.*, c. , I-! .4 1·. »·r« /.♦.λλ?'.*·. λ « 4· 4 »·’, ι ι »-»·κ uliouu ι^οιη ι ira jji ΟΛΚΌ. (JO i.ji niyc! upItjO.HIC! ‘IC (ζ!»π u»'» μνΐ ,lU de ebulição não maior do que 20QC'C, e inclui líquidos voláteis tais como di-ciorcmetano, clorofórmio, acetato de etila, benzeno, etanol, butanol, acetato de butila, e similares (ou seja, solventes que tem um alto grau de solubilida-de para este agente farmacologicamente ativo e são solúveis no outro meio orgânico empregado), juntamente com um meio orgânico de peso molecular maior (menos volátil). Quando adicionado ao outro meio orgânico, esses aditivos voláteis ajudam a direcionar a solubilidade do agente farmacologicamente ativo ao meio orgânico, o que é desejável, visto que esta etapa é normalmente muito extensa. A seguir á dissolução, o componente volátil po- de ser removido por evaporação (opcionalmente sob vácuo).

Partículas do agente farmacoiogicamente ativo associado com urn envoltório polimérico, preparadas como escrito acima, são liberadas como uma suspensão num liquido aquoso biocompatível. Este líquido pode ser selecionado dentre água, solução salina, uma solução contendo tampões apropriados, uma solução contendo agentes nutritivos, tais como aminoáci-dos, açúcares, proteínas, carboidratos, vitaminas ou gordura, e similares.

Esses materiais biocompatíveis podem também ser empregados em várias formas físicas, tais como géis (reticulados ou não reticulados), para prover matrizes das quais o ingrediente farmacoiogicamente ativo, por exemplo, paclitaxel, pode ser liberado por difusão e/ou degradação da matriz. Os materiais sensíveis à temperatura podem também ser utilizados corno matriz de dispersão para a formulação da invenção. Assim, por exemplo, o Capxol™ pode ser injetado em uma formulação líquida do material sensível s temperatura (por exemplo, copolimeros de poliacrilamidas ou c o polímeros de polialquileno glicóis e polilactídeo/glicolideos) que gelatinizam no local do tumor e propiciam liberação lenta do Capxol. A formulação de Capxol pode ser dispersa em uma matriz dos polímeros biocompatíveis supramencio-nados para propiciar uma formulação de liberação controlada de paclitaxel, que através das propriedades da formulação de Capxol talbumina associada com paciitaxei) resulta ern menor toxicidade ao tecido cerebral, bem como a uma toxicidade sistêmica mais baixa conforme acima exposto. Esta combinação de Capxoi ou outros agentes quimioterápicos formulados de modo similar ao Capxol, juntameníe com uma matriz poümérica biocompatível, pode ser de utilidade oara a liberação controlada local de agentes quimioterápicos para tratamento de tumores sólidos no cérebro e peritônio (câncer ova-riano) e em aplicações locais a outros tumores soíidos. Essas formulações combinadas nac· estão limitadas ao uso do paclitaxel, e podem ser utilizadas com uma série variada de ingredientes farmacoiogicamente ativos, incluindo antiinfecciosos, imunodepressores, e outros quimioterapéuiicos, e similares.

Partículas coloidais substancialmente e completamente contidas dentro de uma camada de estabilização polimérica ou associada com esta, preparadas conforme aqui descrito, são liberadas, no estado puro ou opcionalmente como uma suspensão, em um meio biocompatível. Este meio pode ser selecionado dentre agua, meio aquoso tampcnado, solução salina lam-ponada, opcionalmente soluções salinas de aminoácidos, opcionalmente soluções tamponadas de proteínas, soluções tamponadas de açúcares, opcionalmente soluções tamponadas de carboidratos, opcionalmente soluções tamponadas de vitaminas, opcionalmente soluções tamponadas de polímeros sintéticos, emulsões contendo lipídeo, e similares.

Além disso, as partículas coloidais podem, opcionalmente, ser modificadas por um agente adequado, em que o agente está associado com a camada polimérica através de uma ligação covalente opcional. Ligações covalentes consideradas para tais ligações incluem ésier, eter, uretano, diés-ter, arnida, amina secundária ou terciária, ester de fosfato, éster de sulfato, e similares. Agentes adequados considerados para esta modificação opcional rio envoitorio poiimérico incluem poli meros sintéticos (polialquileno glicois (por exemplo, polietiieno giicoi de cadeia linear ou ramificada), álcool poliví-nilico, polihidroxielil rnetacrilato, ácido poliacrílico, polietiloxazolina, poliacri-lamida, p»olivinit pirrolidinona, e similares), fosfolipídeos (tais como fosfatidi! colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidil inositol (PI), esfingomielina, e similares), proteínas (tais como enzimas, anticorpos, e similares), polissa-carídeos (tais como amido, celulose, dextranas, aiginaíos. qutíosana, pecíi-na, ácido hialurônico e similares), agentes modificadores químicos (tais como piridoxa! 5‘-fosfato, derivados de piridoxal, dialdeídos, ésleres diaspiríni-cos, e similares) ou combinações de quaisquer de dois ou mais destes.

Variações sobre o tema gerai de partículas coloidais estabilizadas são possíveis. Uma suspensão de partículas finas do agente farmacêutico em um agente de dispersão biocompaíívei pode ser usada (no luqar de um agente de dispersão biocompaíívei contendo um produto biológico dissolvido) para produzir um envoltório poiimérico contendo partículas suspensas do agente de dispersão do produto biológico. Em outras palavras, o envoltório poiimérico poderia conter uma solução saturada do produto biológico no agente de dispersão. Uma outra variação é um envoltório poiimérico con- tendo um núcleo solido de produto biológico produzido pela dissolução inicial do produto biológico em um solvente orgânico volátil, (por exemplo, benze-no) formando o envoltório polimérie-o e evaporando o solvente volátil sob vácuo, por exemplo, em um evaporador, secagem por pulverização ou secagem por congelamento de toda a suspensão. Isto resulta numa estrutura com um núcleo sólido de produto biológico circundado por um revestimento polimérico. Este ultimo método é particularmente vantajoso para liberação de altas doses de produto biológico ruim volume relativamente pequeno. Em alguns casos, o material biocompatível que forma o envoltório em forma do núcleo pode, ele próprio, ser um agente terapêutico ou para diagnóstico, por exemplo, no caso de insulina, que pode ser liberada como parte de um envoltório polimérico formado no processo descrito acima. Em outros casos, o polímero que forma o envoltório podería participar na liberação de um produto biológico, por exemplo, no caso de anticorpos usados para direcionamento. ou no caso da hemoglobina, que pode ser liberada como parte de um envoltório polimérico formado no processo de irradiação ultra-sônica descrito acima, propiciando assim um substituto do sangue com uma capacidade de alta ligação para o oxigênio.

Os versados na técnica reconhecerão que várias variações são possíveis dentro do escopo e espírito deste aspecto da invenção. O meio orgânico dentro do envoltório polimérico pode variar, uma grande variedade de agentes farmacologicamente ativos podem ser utilizados e uma ampla faixa de proteínas, bem como outros polímeros naturais e sintéticos, podem ser utilizados na formação das paredes do envoltório polimérico. As aplicações são tarnbém de faixa bastante ampla. Diferentes das aplicações bio-médicac, tais como liberação de drogas, agentes de diagnóstico (em aplicações de formação da imagem), sangue artificial e agentes de nutrição paren-terais, as estruturas de envoltório polimérico da invenção podem ser incorporadas em aplicações cosméticas, tais como cremes para a peie, ou produtos i de tratamento do cabelo, em aplicações de perfumaria, em tintas sensíveis à pressão, e similares.

Este aspecto da invenção será agora descrito em maiores dela- lhes com referência aos seguintes exemplos não-limitantes.

Exemplo 1 Preparação de Nanoparttcuias por Homogeneização de Alta Pressão Dissolveu-se 30 mg de paclitaxel em 3,0 ml de cloreto de metiIene. A solução foi adicionada a 27,0 ml de solução de albumina de soro humano (1% peso/volume). A mistura foi homogeneizada por 5 minutos a baixa RPM (homogeneizado!' Vitris modelo Tempest I.Q.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Avestin). A emulsificação foi realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 psi) enquanto se reciclava a emulsão por pelo menos 5 ciclos. O sistema resultante foi transferido para um evaporador rotativo Rotary, e o cloreto de meti-ieno foi rapidamente removido a 40°C, a pressão reduzida (30 mm Hg), por 20-30 minutos. A dispersão resultante era translúcida e o diâmetro típico das partículas de paclitaxel resultante era de 160-220 nm (média Z, Malvern Ze-tasízeri. A dispersão foi ainda iiofiiizada por 48 horas sem adicionar qualquer crioprotetor. A torta resultante pode ser facilmente reconstituída à dispersão originai por adição de água estéril ou solução salina. O tamanho de partícula após reconstituição era o mesmo de antes da liofilização.

Exemplo 2 Uso de Tensoativos Convencionais e de Proteínas Resulta na Formação de Grandes Cristais O exemplo a seguir demonstra o efeito da adição de tensoativos que são usados no método de evaporação cie solvente convencional. Uma i série de experimentos foi conduzida empregando-se um procedimento similar ao descrito no Exemplo 1, mas um tensoativo tal como Tween 80 (1% a 10%) e adicionado ao solvente oiqánico. Descobriu-se que, após remoção do cloreto de metileno, um grande número de cristais de paclitaxel são obtidos com um tamanho médio de 1-2 mícrons, conforme visto por microscopia l óptica e sob luz polarizada. Os cristais crescem dentro de umas poucas horas até formai cristais semelhantes a agulhas muito grandes, com um tamanho na faixa de cerca de 5-15 rnícrons. Um fenômeno simiiar se observa com outros tensoativos comumente usados, tais como Pluronic F-68 Pluronic-F-127, Cremophor EL o Brij 58.

Desses resultados pode-se concluir que o método de evaporação de solvente convencional utilizando tensoativos convencionais, em combinação com uma proteína tal como albumina, não è adequado para a formação de partículas de droga em submícrons (por exemplo, Paclitaxeí) sem um núcleo polimérico, enquanto se usa um solvente polar (por exemple, cloreto de metileno).

Exemplo 3 Uso de Tensoativos Convencionais Sozinhos Resulta na Formação de Grandes Cristais Este exemplo demonstra que não é possível formar nanopartícu-las enquanto se usa tensoativos convencionais, sem um material de núcleo polimérico, com agentes farmacologicameníe ativos que sãc solúveis em solventes polares, imiscíveis em água (por exemplo, clorofórmio). São dissolvidos 30 mg de Taxol em 0,5 ml de clorofórmio e 0,05 ml de etanol. A solução é adicionada a 29,4 ml de solução de Tween 80 (1% peso/volume) que é pré-saturada com clorofórmio a 1%. A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (homogeneizador Vitris, modelo: Tempesí I.Q.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Avestin). A emulsificação é realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 ρε'η, enquanto se recicla a emulsão para peio menos 6 ciclos. O sistema resultante foi transferido para um evaporador rotativo Rotary, e o clorofórmio foi rapidamente removido a 40°C, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 15-30 minutos. A dispersão resultante era opaca, e continha grandes cristais semelhantes à agulha da droga. O tamanho iniciai dos cristais (observados também por luz polarizada) era 0,7-5 mícrons. O armazenamento da dispersão por várias horas à temperatura ambiente levou a mais aumento no tamanho dos cristais e, por fim, à precipitação.

Exemplo 4 Preparação de Nanopaitículas Esterilmente Filtráveis com Menos de 200 nm Este exemplo descreve um processo pelo qual partículas de droga esterilmente filtráveis podem ser obtidas. Assim, 30 mg de Taxol são dissolvidos em 0,55 ml de clorofórmio e 0,05 ml de eíanol. A solução é adicionada a 29,4 ml de solução de albumina de soro humano (17o pe-so/volume) que é pre-saturada com cloreformro a 1%. A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (homogeneizador Vitris, modelo: Tempest I.Q.) de modo a formar urna emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Avestin). A emuls>ficação é realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 6 ciclos. O sistema resultante é transferido para um evaporador rotativo Rotary e o clorofórmio é rapidamente removido a 40*0, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 15-30 minutos. A dispersão resultante é translúcida, e o diâmetro típico das partículas resultantes de Taxol é de 140-160 nm (média Z, Dimensionador Malvern Zeta). A dispersão é filtrada através de um filtro cie 0,22 mícron (Millipore). sem qualquer mudança significativa cia tur-vaçãu, ou tamanho da partícula. A análise por HPLC do teor de Taxol revelou que mais de 97% do Taxol toram recuperados após filtrarão, propiciando assim uma dispersão estéril de Taxol. A dispersão estéril foi ainda liofilizada por 48 horas sem adicionar qualquer crioproietor. A torta resultante pode ser facilmente reconstituída á dispersão original por adição de agua estéril ou solução salina. O tamanho de partícula, após reconstituição era o mesmo de antes da liofilização.

Exemplo 5 Preparação de Nanopartículas Esterilmente Filtráveis com Menos de 200 nm - Este exemplo descreve um processo pelo quai partículas da droga esterilmente filtráveis podem ser obtidas. Assim. 225 rng de Taxol são dissolvidos em 2,7 mi de clorofórmio e 0,3 ml de etancl. A solução é adicionada a 97 mi de soiução^de albumina de soro humano 3%· peso/voíume). A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (homogeneizador Viiris modelo: Tempest I.Q.) de modo a formar urna emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Avestin). A emul-sificaçãü é realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 6 ciclos. O sistema resultante é transferido para um evaporador r«;<tativo Rotary 8 o clorofórmio é rapidamente removido a 40&C, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 15-30 minutos. A dispersão resultante e translúcida, e o diâmetro típico das partículas resultantes de Taxol e de 140160 nm (média 2, Dimensionador Malvern Zeta). A dispersão é filtrada através de um filtro de 0,22 mícron (Sartorius, sartobran 300), sem qualquer mudança significativa na turvação, ou tamanho de partícula. A análise por H-PLC do teor de Taxol revelou que, 70-100¾. do Taxol foram recuperados após filtrarão, dependendo das condições empregadas, obtendo-se assim, uma dispersão estéril de Taxol. A dispersão estéril foi ainda asséptica mente enchida em frascos de vidro estéreis e liofilizada sem adicionar qualquer crioprotetor. A torta resultante pode ser facilmente reconstituída à dispersão original por adição de água estéril ou solução salina. O tamanho de partícula após reconstituição era o mesmo de antes da liofilização.

Exemplo 8 Formação de Nanopartícula de uma Droga Modelo São dissolvidos 30 mg de Isoreserpina (uma droga modelo) em 3,0 ml cie cloreto de metilenc. A solução é adicionada a 27,0 ml de solução de albumina cie soro humano (1% peso/volume). A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (homogeneizador Vitris, modelo: Tempest !.Q.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pres são (Avestin). A emulsificação e realizada a 62124 Mr’a (9000-18.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 5 ciclos. O sistema resultante é transferido para um evaporador rotativo Rotary e o cloreto de metile.no é rapidamente removido a 40°C, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 20-30 minutos. A dispersão resultante è translúcida, e o diâmetro típico das partículas resultantes de paclitaxel de é 120-140 nm (média Z, Dimensionador Malvern Zeta). A dispersão é filtrada através de um filtro de 0,22 mícron (Millipore). A dispersão estéril foi ainda liofilizada por 48 horas sem adicionar qualquer crioprotetor. A torta resultante pode ser facilmente reconstituída à dispersão original por adição de água estéril ou solução salina. O tamanho de partícula após reconstituição era o mesmo de antes da liofilização. Exemplo 9 Formação de Partícula Extremamente Pequena com uma Droga Modelo O efeito da adição do etanol na redução do tamanho de partícula é demonstrado para Isoreserpina. Assim, 30 mg de Isoreserpina são dissolvidos em 2,7 ml de cloreto de metileno e 0,3 ml de etanol. A solução é adicionada a 27,0 mi de solução de albumiria de soro humano (1% pe-so/vo!ume). A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (ho-mogerieizador Vitris, modelo: Tempest I.Q.) de modo a formar urna emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Aves-tin). A emulsificação é realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 5 ciclos. O sistema resultante e transferido para um evaporador rotativo Rotary e o cloreto de metileno é rapidamente removido a 40°C, a pressão reduzida (30 mm Hg), por 20-30 minutos. A dispersão sesulíanít^ e translúcida, e o diâmetro tipicc oas patiicuias resultantes de paditaxel é de 90-110 nm (média Z, Dimensionador Maivem Zeia). A dispersão e filtrada através de um filtro de 0,22 rníeron (Millipore). A dispersão estéril foi ainda liofilizada por 48 horas sem adicionar qualquer crioprotetor. A torta resultante pode ser facilmente reconstituída á dispersão original por adição de água estéril ou solução salina. O tamanho de partícula após reconstituição era o mesmo de antes da iioíiiização. Exemplo 10 Uso de um Único Solvente Miscível em Água, Supersaturado com Droga -Não Adequado para o Processo da Invenção 30 mg de Taxol são dissolvidos em 0,6 ml de etanol. Nesta concentração (50 mg/ml), o Taxoi não é compietamente soiúvei e forma uma dispersão supersaíurada. A dispersão é adicionada a 29,4 mi de aihumina de soro humano (1% peso/volume). A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (homogeneizador Vitris, modelo: Tempest I.Q.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para um homiogeneizador de alta pressão (Avestin). A emulsificação é realizada a 62-276 MPa (900040.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 6 ciclos. O sis- tema resultante é transferido para um evaporador rotativo Rotary e o etanol é rapidamente removido a 40°C, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 15-30 ithΓιutos. O tamanho de partícula oa oispersao resuitante e exiremameníe amplo, variando de cerca de 250 nm a vários mícrons.

Observação sob o microscópio revelou a presença de grandes partículas e cristais em forma de agulha típicos de Taxol. Essas partículas eram muito grandes para injeção intravenosa. Este experimento demonstra que o uso de solventes como etanol, que são livremente miscíveis em água, no processo da invenção resulta na formação de grandes partículas corn distribuição de tamanho de partícula muito amplo, e, como tal, não podem ser usados sozinhos, para o processo da invenção. Assim, a invenção espe-cifícamente exclui o uso de solventes miscíveis em água quando usados sozinhos. para dissolução ou dispersão do componente da droga. O processo da invenção requer que tais solventes, quando utilizados devam ser misturados nr.m solventes essenoiaimente imiscíveis em água para permitir a produção das rianopartioulas inventivas.

Exemolo 12 Determinação do Estado Físico de Paclitaxel na Forma de Nanopartícuia cor Difracãu de Pó em Raio-X A matéria prima paclitaxel está normalmente presente como cristais conformados em agulha de tamanhos variados, tipicamente entre 5-500 mícrons. A presença de cristais riurria formulação de droga para injeção in-travenoss o coviamente prejudicial, caso estejam presentes custais em tamanho acima ue uns poucos mícrons, devido ao potencial bloqueio dos capiiares. Além disso, a solubiiidade dos cristais de droga, geralmente, iria ser menor do que a droga amerfa, baixando, por isso, a biodisponibiüdade da droga resultante de uma administração intravenosa. Sabe-se também que à medida que aumenta a carga da droga numa formulação, aumenta também a tendência para a cristalização. Assim, é vantajoso que a formulação contenha a droga na forma essencialmente amorfa. A difração de pó em raio-X foi usada para determinar a natureza cristalina ou não cristalina do paclitaxel na formulação em pó liofilizada. As amostras a seguir foram analisadas: Amostra 1 - pó de Paciitaxel; Amostra 2 - albumina de soro liofilizada; Amostra 3 - uma mistura física de paciitaxel e albumina; e Amostra 4 - formulação de paciitaxel. Cada amostra foi passada por raio-X de ângulos 2° a 70° 2-teta usando radiação CuKa. urna tensão de aceleração de 40KeV/30mA, um tamanho de etapa de 0,05° 2-teta, e um tempo de aquisição de dados de 2,0 segundos por etapa. A amostra 1 mostrou picos fortes típicos de uma amostra cristalina. O pico de paciitaxel mais intenso foi localizado a 5,1° 2-teta. A amostra 2 mostrou amplos picos típicos do material amorfo. A amostra 3 mostrou amplamente os vastos picos da Amostra 2, mas além disso o pico em 5,1° 2-teta de paciitaxel era visível. Na amostra 4, o paciitaxel formulado não mostrou evidencia de cristalinidade, característica atribuída ao paciitaxel, e pareceu idêntico à Amostra 2, indicando a presença cio agente farmacologicamente ativo substancialmente amorfo na amostra formulada. A natureza amr.rfa das nanoparfículas produzidas de acordo com a invenção repousa em contraste direto aos produtos produzidos por outros métodos descritos na técnica para produção de nanoparfículas. Por exemplo, o uso de técnicas de triiuracão, conforme descrito na Patente U.S. 5.145.684 (Liversidge et al.,) e como descrito por Liversidge-Merisko et al., Pharmaceutical Research 13(2):272-278 (1996), produz um produto substancialmente cristalino.

Exemolo 13 Preparação de Nanopartícuias de Ciclosporina (Cansortna I.V.) por Homogeneização de Alta Pressão São dissolvidos 30 mg de ciclosporina em 3,0 m! de cloreto de metileno. A solução é adicionada a 27,0 ml de solução de albumina de soro humano (1% peso/volume). A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (homogeneizador Vitris, modelo: Tempesí I.Q.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Avestin). A emulsificação é realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 5 ciclos. O sistema resultante é transferido para um vaporizador rotativo Rotavap e o cloreto de metileno é rapidamente removido a 40°C, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 20-30 minutos. A dispersão resultante é translúcida, e o diâmetro típico das partículas resultantes de ciclosporina é de 160-220 nm (média Z, Di-mensionador Malvem Zeía). A dispersão toi ainda lioíilizada por 48 horas sem adicionar quai-quer orioprotetor. A torta resultante pôde ser facilmente reconstituída à dispersão original por adição de água estéril ou solução salina. O tamanho de partícula após reconstituição era o mesmo de antes da liofilização.

Exemplo 14 Preparação de Nanouotícula de Ciclosporina (Capsorina Oral) por Homogeneização de Alta Pressão São dissolvidos 30 mg de ciclosporina em 3,0 mil de um oleo adequado (óleo de gergelim contendei 10% de óleo de laranja). A solução é adicionada a 27,0 ml de solução de albumina de soro humano (1% pe-so/volume) A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixa rotação (ho-mogeneizador Vitris, modelo: Tempest !.G.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para um homogeneizador de alta pressão (Aves-tin). A emulsificação é realizada a 62-276 MPa (9000-40.000 psi), enquanto se recicla a emulsão por pelo menos 5 ciclos. A dispersão resultante tem um diâmetro típico das partículas resultantes de 160-220 nm (média Z, Dimensi-onador Malvem Zela). A dispersão estéril foi ainda lioíilizada por 48 horas, por adição opcional de um crioprotetor. A torta resultante pode ser facilmente reconstituída à dispersão originai por adição de água estéril ou solução salina. B. Formação de Nanopartícuias Usando Sonicacão ~ toi ( '/*71 Similarmente ao uso da homogeneização de alto cisaihamsnío, o uso da sonicacão para formar nanopartícuias revestidas de proteína de agentes farmacologicamente ativos insolúveis em água é acreditada funcionar pelo ligamento cruzado de proteínas através da formação das ligações inter-rnoieculares de dissufíiio. Muitas das vantagens sobre a técnica anterior apreciadas pela homogeneização de alto cisalhamento descritas acima apli-carn-se iguaimente aos métodos de sonicacão descritos abaixo.

Em relação aos solventes orgânicos, proteínas, e polímeros não-proteináceos que podem ser usados no método de sonicação, é feita referência a aqueles componentes descritos acima em relação ao método de homogeneização de alto cisalhamento. Todos os componentes idênticos são esperados funcionar igualmente bem em ambos os métodos.

Este aspecto da invenção será agora descrito em maiores detalhes por referência aos seguintes exemplos não-limilantes.

Exemplo 15 Formulação para Inalação de Droga Antiasmática Produtos farmacêuticos antiasmáticos foram preparados usando-se técnicas de micropartícula para produzir formulações eficazes para inalações de pó seco (DPI). Começando com uma droga esteroidal (por e-xernplo, beclorrietasona, dipropionato de beclometasona, budesonida, de-xametasona, flunisolida, triamcinolona acetonida e similares), preparou-se uma formulação seca de tamanho de partícula apropriado e características de liberação para assegurar liberação eíicaz no sistema respiratório. A formulação é preparada usando-se técnicas de sonicação, ou homogeneização, em que droga ativa dissolvida em um solvente é dispersa em uma solução de proteína aquosa para formar uma emulsão de nanopar-tículas. Esta emulsão é em seguida evaporada para remover os solventes, deixando a droga ativa revestida com proteína em solução. Esta amostra líquida contendo as partículas de droga coloidal é medida por Malvem Zeta-sizer e confere um iamariho médio Σ de 2G0 nm. Mu ma modalidade proferida, a faixa de tamanhos dessas partículas coloidais é de cerca de 50-1.000 n, e mais preferivelmente cerca de 70-400 nm.

Nesta forma líquida, outros excioientes podem ser dissolvidos. Tais excipientes incluem (mas não estão limitados a estes), manitol 0,5-15% lactose 0,1-5% e mallodextrina. Neste estágio, a solução resultante da droga ativa, proteína e excipiente podem ser, ou seca por pulverização ou íiofiiiza-da e moída para dar um po seco. Após secagem por pulverização, o tamanho de partícula seca é determinado por Maivern Mastersizer como D (v.0,5) de cerca de 1-10 μηΊ. A faixa de tamanho preferida para essas partículas é 0,5-15 μιη, com uma faixa mais preferida de 0,7-8 pm.

Este pó seco por pulverização é a seguir misturado com um pó veiculo excipiente. Novamente, vários veículos estão disponíveis, incluindo lactose, trehalose, Pharmatose 325 M. Sacarose, rnanitol e similares. O tamanho do pó transportador é expressivarnente maior do que aquele das partículas da droga formulada (“63-90 pm para lactose, 40-100 pm para Pharmatose). A eficácia da formulação de pó seco é demonstrada por ensaio com um dispositivc* de impacto em cascata de oito estágios Andersen. Os resultados dos testes de compactação mostram uma fração de partícula fina (FPF) de “60%. Isto indica uma liberação eficaz de partículas, apropriadamente dimensionada para deposição respiratória. Esta FPF é surpreendentemente alta e é um resultado da composição de formulação que contém nanopartículas coloidais da droga dentro de partículas de formulação maiores.

Esta formulação mostra a capacidade aplicativa das micropartí-culas e técnicas de secagem por pulverização no processamento e composição das formulações de pó seco para liberação aerossol via DPI. Os resultados de alio FPF mostrados indicam urna abordagem eficaz e promissora para formulações DPI.

Exemolo 16 Resumo do Processo de Fabricação Atualmente Preferido Começando com 1 grama de Paclitaxel como o BDS

Preparar urna solução de USA a 3%. A 51,7 ml de 25% de Albu-teln adicionar 379,3 ml de água para injeção. Misturar cuidadosamsnte e filtrar a soiução através de um equipamento de filtro descartável Nalgene de 0,22 pm estéril. Manter a 4°C até o final.

Pesar 1,0 g de paclitaxel em uma garrafa de vidro. Combinar CHCb e álcool etilico em proporções apropriadas em um frasco. Misturar bem. Ao paclitaxel, adicionar 13,33 ml de mistura clorofórmio/álcool etilico. Agitar para certificar-se que todo o paclitaxel se dissolve na solução. Filtrar a solução através de um filtro Teflon estéril de 0,22 mícron e coletar numa gar- rafa de vidro estéril. Â solução de paelitaxel dissolvida na garrafa de vidro, adicionar a solução de HSA (aibumina de soro humano). Usar o misturador Microprocessador Seritry para misturar o paclitaxel/solução de HSA. Quando a solução estiver misturada, despejar o conteúdo em uma câmara do Homogenei-zador. Revolver a mistura através do hornogeneízador a uma pressão até que o tamanho de partícula desejado seja obtido. Coletar a amostra do ho-mogeneizador em um frasco es téril, de fundo redondo, Kontes.

Prender o frasco com a amostra final ao evaporador rotativo Rotary. Ligar o vácuo e a rotação ao máximo no evaporador rotativo, e evaporar o solvente orgânico. Isto resulta na solução ooioidal de paelitaxel em al-burnina humana. Guardar 3 ml desta amostra submetida ao evaporador para análise do tamanho de partícula. •Sob uma campánula estéril, filtrar a solução ooioidal usando filtro gotgrjj rjo CÇ45/0 ΟμΓη c. ooletar num vaso recepécr estéril. Guardar 3 m! da amostra filtrada para análise por HPLC quanto a concentração de paelitaxel.

Determinar o volume de enchimenio para obier 30 mg (ou outra quantidade derivada) de paelitaxel por frasco. Encher a amostra filtrada estéril, em frascos de 30 ml submetidos à autoclave Wheaton a aproximadamente 27 ml cada fiasco (com base no ensaio). Fechar os frascos com tampões ae π asco para amo Wbeciion aubriratídoa a ciUtuL.lave. Cada ficíauo d^ve conter aproximadamente 30 mg de paelitaxel.

Lioiilizar as ainusiras nu iiofilizadoi de bandeja FTS Sysietn Stoppering usando um ciclo predeterminado de iiofiiização. Após as mostras terem sido lioíilizadas, fechar os frascos e vedar os frascos achatando-os com tampas de abrir por düaceramentc- de alumínio Wheaton de 20 mm. Rotular as amostras· apropriadamente. Todo o processe* é realizado em um anv bi.r,·'!lironr, c-,->K f-rinHirZ.fiO 3ccór-.ti^c<0 Hi« | 11·«.* lílilj*'-' W*»-.* ν·.Μ l\J>' ·ννΟ As amostras liofiíizadas contêm solvente residual a níveis de <1000 ppm, e, mais preferivelmente, <500 ppm, ou até mesmo, <100 ppm.

Flltracão Estéril do Produto Finai: A seguir a remoção do solvente por evaporação, a solução de paelitaxel coloidal no frasco é filtrada este- rilmente através de uma combinação de filtro esterilizador de 0,45/0,2 mí-cron. A solução filtrada é coletada em um béquer estéril e enchida esteril-rneníe em frascos cJe 3o ml. Os frascos sao a seguir colocados no lioíilizs-dor. Seguinte ao término do ciclo de liofilização, os frascos são cobertos por uma cobertura de gás nitrogênio seco e estéril e vedados sob a cobertura de nitrogênio.

Deve-se observar que os processos de homogeneização com alta pressão são utilizados para romper e aniquilar bactérias e outras células para extrair seus conteúdos.

Exemplo 17 Preparação do Envoltório de Proteína Contendo óleo Três ml de uma solução de albumina de soro humano a 5% (United Staies Pharmacopeia) USP (Alpha Terapeutic Corporation) foram colocados num vaso cilíndrico, passível de ser ligado a uma sonda de sonicação (Heat Systems, Model XL2020). A solução de albumina foi colocada em camadas com 6,5 ml de óleo de soja grau USP (óieo de soja). A ponta da sonda sonicadora foi levada para a interface entre as duas soluções e o conjunto foi mantido em um banho frio a 20°C. C sistema foi deixado equilibrar e o sonieador girado por 30 segundos. Ocorreu vigorosa misturação e obteve-se uma suspensão leitosa branca. A suspensão foi diluída 1:5 com soiucão sa-iina normal. Um contador de partículas (Particle Data Systems, Elzone, Model 260 PC) foi utilizado para determinar a distribuição do tamanho e con- λ.-.»λΪγολ0λ íHAí» rir* i“.rr.TOi»*\o ptfâ*.ro/^i·*. r.ir,i jç» £, .·/-.! f,*. ri rNr· rio r.rr._ ui 'J·.'».· vi i vviiUi 1U0 vv.· |·Ί·.ηνιι ια winvii'-J·.' νινυ. vo Ci ι νν,’ΐινι lUo UO |··ιν tema resultantes foram determinados para terem uma dimensão máxima em seção transversal de cerca de 1,35 mais ou menos 0,73 micron e a concentração total determinou-se serem -109 envoltórios/ml na suspensão original - Como um controle, os componentes acima, sem a proteína, não formaram uma microemulsão estável quando submetidos à irradiação ultra-sônica. Este resultado sugere que a proteína é essencial para formação das microesferas. Confirmou-se isto por micrografia eletrônica de varredura e estudos de micrografia eletrônica de transmissão como abaixo descrito. Exemplo 16 Preparação dos Envoltórios Poliméricos Contendo Pac-litaxel Dissolvido O Taxol foi dissolvido em óleo de soja grau USP a uma concentração de 2/mq/ml. 3 ml de uma solução de alhumina de soro humano a 5% USP foi levada para um frasco cilíndrico que pode ser ligado a uma sonda de equipamento de sonicação. A solução de albumina foi sobreposta em camadas com 6,5 ml de solução de óleo de soja/Taxol. A ponta da sonda do equipamento de sonicação foi levada para a interface entre as duas soluções e o conjunto foi mantido em equilíbrio e o equipamento de sonicaçao girado por 30 segundos. Ocorreu vigorosa rnisturaoão e uma suspensão leitosa branca e estável foi obtida, a qual continha envoltórios poliméricos revestidos com proteína encerrando a solução de óleo/Taxo!.

De maneira a obier-se uma carga maior da droga no envoltório protéico reticulado, um solvente mútuo para o oleo e a droga (em que a droga tem uma solubilidade consideravelmente maior) pode ser misturado com o óieo. Gontanio que este soiveníe seja reiaiivamente não-tóxico (por exemplo, acetato de etiia), este pode ser injetado juntamente com o veículo original. Em alguns casos, pode ser removido por evaporação do líquido sob vácuo, s eguindo à preparação dos envoltórios poliméricos.

Reconhece-se que vários métodos diferentes podem ser empregados para conseguir-se as características físicas da formulação da invenção. As propriedades biológicas associadas com esta formulação de concentrações locais mais altas em pontos orgânicos específicos (próstata, pulmão, pâncreas, osso, rim, coração), bem como toxidez mais baixa (LD5o aumentado, mielossupressão diminuída, toxicidade cerebral diminuída) associadas com maiores eficácias são independentes do método de fabricarão.

Exemplo i9 Preparação das Nanopartícuias por Sonicacão 20 mg de paciitaxeí são dissoividos em i ,0 mi de cioretc· de meti-leno. A solução e adicionada a 4,0 ml de solução de albumina de soro humano (5% peso/volume) A mistura é homogeneizada por 5 minutos a baixo RPM (homogeneizador Vitris modelo: Tempest I.O.) de modo a formar uma emulsão bruta, e a seguir transferida para uma célula do equipamento de sonicaoão a 40 kHz. O tratamento com o sonicador é realizado a 60-90% de potência a 0 grau por 1 minuto (Sonic Dis.membrator 550). A mistura é transferida para um evaporador rotativo Rotary, e o cloreto de metileno é rapidamente removido a 40°C, à pressão reduzida (30 mm Hg), por 20-30 minutos. O diâmetro típico das partículas resultantes foi de 350-420 nm (média Z, Malvern Zetasizer). A dispersão foi ainda liofilizada por 48 horas sem adição de qualquer erioprotetor. A torta resultante podia ser facilmente reconstituída à dispersão original por adição de água estéril ou solução salina. O tamanho da partícula após reconstituição era o mesmo de antes da liofilização. Exemplo 20 Biodistribuioão in vivo de Envoltórios de Proteína Reticulados Contendo um Fluoróforo.

Para determinar-se a absorção e biodistribuição do líquido encerrado dentro dos envoltórios polimericos de proteína apos injeção inírave-nosa, um corante fluorescente (rubreno, disponível da Aidrich) foi colocado dentro de urn envoltório polimerico de proteína de albumina de soro humano (HSA) e usado como um marcador. Assim, o rubreno foi dissolvido em tolue-no e os envoltórios de albumina contende· tolueno/rubreno foram preparados como acima descrito por irradiação ultra-sônica. A suspensão leitosa resultante foi diluída cinco vezes em solução salina normal. Dois ml da suspensão diluída foram a seguir injetados na veia da cauda de um rato, durante 10 minuios. Um animai foi sacrificado urna hora após a injeção r um outro 24 horas após a injeção.

Pedaços congelados de 100 mícrons de pulmão, fígado, rim, baço e medula espinha! foram examinados sob um microscópio fluorescente quanto à presença Ho corante fluorescente encerrado no envoltório poliméri-co cu corante liborado. Em uma hora, a maior parle dos envoltórios poliméri-cos pareceram estar intactos, (ou seja, pareceram como partículas brilhantemente fluorescentes, de cerca de 1 micron de diâmetro), e localizados nos pulmões e fígado. Em 24 horas, o corante foi observado no fígado, pulmões, baço e medula espinhal. Um manchamento generalizado do tecido foi tam- bem observado, indicando que, a parede envoltória dos envoltórios poliméri-cos foi digerida, e o corante liberado do interior. Este resultado era coerente com as expectativas, e demonstra o uso potencial das composições da invenção para liberação prolongada ou controlada de um agente farmacêutico encerrado, tal corno Taxol.

Exemplo 21 Toxicidade dos Envoltórios Poliméricos Contendo óleo de Soia (sBQ) Envoltórios poliméricos contendo óleo de soja foram preparados como des crito no Exemplo 15. A suspensão resultante foi diluída em solução salina normal para produzir duas diferentes soluções, uma contendo 2% de SBO e a outra contendo 30% de SBO.

Intralipídeo, urn agente TPN comercialmente disponível, contem 20% cie SBO. O LDf.0 para Int rali [.'ideo em camundongos é de 120 ml/kg, ou cerca de 4 ml para um camundorigo de 30 g, quando injetado a 1 cnr/min.

Dois grupos de camundongos (três camundongos em cada grupo; eacla camundorigo pesando cerca de 30 g) foram tratados com a composição da invenção contendo SBO como a seguir. Cada camuridonqo foi injetado com 4 ml cia suspensão preparada de envoltórios poliméricos contendo SBO. Cada elemento de um grupo recebeu a suspensão contendo SBO a 20%, enquanto cada elemento do outro grupo recebeu a suspensão contendo SBO a 30'%.

Todos os três camundongos no grupo que receberam a suspensão contendo SBO a 20% sobreviveram a tal tratamento e não demonstraram toxicidade visível em quaisquer tecidos ou órgãos quando observados uma semana após tratamento com SBO. Somente um dos três camundongos no grupo que recebeu a suspensão contendo 30% de SBO morreu após a injeção. Esses resultados demonstram obviamente que o óleo contido dentro dos envoltórios poliméricos de acordo com a presente invenção não é tóxico em sua dose LD5o, se comparado com uma formulação de SBO comercialmente disponível (Intralipid). Este efeito pode ser atribuído à lenta liberação (ou seja, velocidade controlada de tornar-se biodisponível) do oleo, de dentro do envoltório polimérieo.

Tal liberação lenta evita a obtenção de uma dose letal de óleo, em contraste com as altas dosageris de óleo obtidas com emulsões comercialmente disponíveis.

Exemolo 22 Biodisponibilidade In Vivo do Óleo de Soia Liberado dos Envoltórios Polimé-ricos Realizou-se um teste para a determinação da liberação lenta ou mantida do material encerrado no envoltório polímerico seguinte à injeção de uma suspensão dos envoltórios poliméricos na corrente sanguínea de ratos. Envoltórios poliméricos revestidos com proteína reticulada (albumina) contendo oleo e soja (SBO) foram preparados por sonicação como acima descrito. A suspensão res ultante dos envoltórios poliméricos contendo óleo foi diluída em solução salina até uma suspensão final contendo 20'.¾. de óleo. Cinco ml desta suspensão foram injetados na veia jugular externa canulada de ratos durante um período de 10 minutos. O sangue foi coielado desses ratos a intervalos de tempo seguinte à injeção e o nívei de trigiicerideos (oleo de soja é predominantemente triqlicerídeo) no sangue determinado por análise de rotina.

Cinco ml de uma emulsão gordurosa comerciaimente disponível (Intralipid, um agente nutricional parenteral aquoso contendo 20% de óleo de soja, 1,2% de fosfoiipídeos de gema de ovo e 2,25% de glicerina) foram usados como um controle. O controle utiliza fosfatídeo de ovo como um emul-sificante para estabilizar a emulsão. Uma comparação dos níveis sorológicos dos trigiicerideos nos dois casos daria uma comparação direta da biodispc-nibHida.de do «óleo como uma função do tempo. Além da suspensão dos envoltórios poliméricos contendo 20%. de óleo, 5 mi de uma amostra de envoltórios poliméricos «contendo óieo em soiução salina a uma concentra«oão final de 30%. de óleo iarnbém foram injetados. Dois ratos foram usados em cada um dos írês grupos. Os níveis sanguíneos dos trigiicerideos em «cada caso foram tabula«:los na Tabela 1, em unidades de mg/dl.

Tabela 1 Os níveis·, sanguíneos antes da injeção são mostrados na coluna marcada "Pré". Obviamente, para o controle do Intralipídec·, níveis muito altos de triglicerídeos são vistos seguinte à injeção. Os níveis de triglicerídeos são então vistos consumirem cerca de 24 horas para baixarem a níveis de pré-injecão. Assim o óleo é tido como imediatamente disponível para metabolismo seguinte à injeção. A suspensão dos envoltórios poiiméricos contendo óieo, contendo a mesma quantidade de oleo total como intraiipid (20%), demonstram uma disponibilidade dramaticamente diferente de triglicerídeos detestáveis no soro. O nível eleva-se a cerca de duas vezes seu valor normal e é mantido neste nível por muitas· horas, indicando uma liberação ienta ou sustentada dos triglicerídeos no sangue, a níveis bastante próximos do normal. O grupo que recebe os envoltórios poiiméricos contendo óleo tendo 30%. de óleo demonstra um nível maior de triglicerídeos (concomitante com a dose mais eievada administrada) que cai para o normal dentro de 43 horas. Novamente, os níveis dos triglicerídeos no sangue não se elevam astronomi-camente neste grupo, comparados com o grupo de controle que recebe ln-íralipid. Este, novamente, indica a disponibilidade lenta e mantida do óleo da composição da invenção, que tem a vantagem de evitar os níveis perigosa-rr.eníe altos no sangue de maieriai contido dentro dos envoltórios poliméri-cos e disponibilidade durante um período extenso em níveis aceitáveis. Evidentemente, as drogas liberadas dentro dos envoltórios poiiméricos da presente invenção conseguiríam estas mesmas vantagens.

Um tal sistema de envoltórios poiiméricos contendo óleo de soja podería ser suspenso numa solução aquosa de aminoácidos, eletrólitos essenciais, vitaminas e açúcares, para formar um agente de nutrição parenteral completo (TPH). Um tal TPN não pode ser formulado a partir de emulsões gordurosas atualmente disponíveis (por exemplo, Intralipid) devido à instabilidade da emulsão na presença de eletrólitos.

Exemplo 23 Preoaracão de Envoltórios. Poliméricos Revestidos com Proteína Contendo um Núcleo Sólido do Agente Farrnacoloqicamente ativo Um outro método de liberar um droga fracamente hidrossoluvel como Taxol dentro de um envoltório polimérico é preparar um envoltório de material polimérico em torno de um núcleo sólido da droga. Essa partícula de droga 'revestida com proteína' pode ser obtida como segue. O procedimento descrito no Exemplo 16 é repetido usando um solvente orgânico para dissolver o Taxol ern uma concentração relativamente alta. Os solventes geralmente usados são produtos orgânicos tais como benzeno, tolueno, liexa-no, éter etílico, clorofórmio, áiccoi e similares. Os envoltórios poliméricos são produzidos como descritos no Exemplo 15. Cinco ml da suspensão leitosa dos envoltórios poliméricos contendo Taxol dissolvido são diluídos em 10 ml ern solução salina normal. Esta suspensão é colocada num evaporaclor rotativo e os voláteis orgânicos removidos por vácuo. A suspensão resultante é examinada por microscopia para revelar núcleos opacos, indicando a remoção de substancialmente todo o solvente orgânico e a presença do Taxol sólido. A suspensão pode ser congelada e armazenada indefinidamente e usada diretamente ou lioíiüzada em uma ocasião posterior.

Alternativamente, os envoltórios poliméricos com núcleos de droga dissolvida contendo soivente orgânico são secos por congelamento para obter-se um pó que pode ser fragmentado, seco, que pode ser ressus-penso em solução salina (ou outro líquido adequado) per ocasião do uso. Embora a proteína aiualmente preferida para uso na formação do envoltório polimérico seja albumina, outras proteínas como ct-2-macroglobulina, uma opsonina conhecida, podem sei usadas para melhorar a absorção dos envoltórios poliméricos pelas células semelhantes a macrófagos. Alternativa- mente, moléculas como PEG podem ser incorporadas às partículas para produzir um envoltório polimerico que incrementa o tempo de circulação in vivo. C. Formação de Nanooartfculas por Microemuisão espontânea É também possível íorrnar nanopartículas sem o uso de sonica-ção, homogeneização de alto cisalhamento, ou qualquer ouira técnica de alta energia. Assim, è possível formar uma suspensão (ou pó seco) da droga essencialmente pura, caso se deseje.

Uma microemuisão é um sistema de emulsão termodinamica-mente estável que é formado espontaneamente quando todos os seus componentes são levados em contato, na ausência do uso de equipamento de alto cisalhamento ou outra agitação substancial. Microemulsões são substancialmente não-opaeas, ou seja, eia? são transparentes ou translúcidas.

As microemulsões compreendem uma fase dispersa, em que o tamanho de gotícula típico fica abaixo de 1000 Angstrons (Â), daí sua transparência óptica. As gotícuias ria microemuisão são tipicamente esféricas, embora outras estruturas, tais como cilindros alongados, sejam também e-xeqüiveis. (Para mais argumentação ver por exemplo, Rosof, Frogress in Surface and Membrane Science, 12, 405, Academic Press (1975), Friberg S., Dispersien Science and Technology, 5, 317 (1985)).

Como será. demonstrado abaixo, a presente invenção utiliza as características singulares da microemuisão como uma primeira etapa no sentido de obter nanopaiiícuids «xiremamentô pequenas, apos remoção da fase oleosa.

Como descrito anteriormente, as micropariíeulas e nanoparíícu-las podem ser formadas por vários processos, dentre eies o méiodo de evaporação do solvente. Este método está baseado, em princípio, na formação de um único óleo na ernulsãc» aquosa, na presença do agente tensoativo, embora aplicando-se altas forças de cisalhamento por meio de vários equipamentos como misturadores rotor-estator, equipamento de sonicação, ho-mogeneizadores de alta pressão, moinhos coloidais etc. Após formação de uma tal emulsão, que contém um polímero e uma droga dissolvida nas gotí- cuias de óleo dispersas, a fase oleosa é removida por evaporação, tipicamente à pressão reduzida e a alta temperatura, e são formadas as micropar-tículas ou nanopartioulas da droga dissolvida e do polímero. Obviamerite, o tamanho das partículas é dependente do tamanho das gotículas da emulsão; quanto menores as gotículas menores serão as partículas resultantes. Gotículas pequenas da emulsão podem ser conseguidas somente com aplicação de alta energia, e mesmo assim, pelo uso de homogeneizadores de alta pressão mais avançado, tais como o Microfluidizer, não é prática a obtenção de gotículas de emulsão abaixo de 75 nm. Visto que as emulsões são sistemas intrinsecamente instáveis, e passam por processos tais como agregação e coal*scência das gotículas, os processos de evaporação do solvente para tais emulsões podem resultar em partículas maiores. O novo método, que supera os problemas associados com aplicação do rnétodo de evaporação do solvente em emulsões convencionais, consiste nas seguintes etapas: a. Dissolver a droga insolúvel em água num solvente que tem fraca solubilidade em água e maior pressão de vapor do que a água. A droga é dissolvida sem qualquer aglutinante polimérico adicional, embora, em principio, tal aglutinante possa estar presente. b. Misturar o solvente com um tensoativo(s) adequado e um co-íensoativo(s) hldrossolúve!, c. Adicionar uma quantidade adequada de água ou de solução aquosa a esta mistura, formando assim espontaneamente uma microemul-são de óíeo-em-água, sem o uso de qualquer equipamento de alto cisalha-mento. A solução aquosa pode conter eletrólitos, aminoácidos ou qualquer outro aditivo que possa afetar a formação da microemuísão durante o primeiro estagio de preparação- d. Opcionalmente, adicionar uma solução de proteína à microemuísão. e. P.ernover o solvente por evaporação à pressão reduzida, ocasionando assim, precipitação da droga, na forma de nanopartículas arnorfas extremamenie pequenas, com um tamanho típico abaixo de 1000 Angs- troms. As partículas neste estágio são dispersas e estabilizadas no meio aquoso, o qual contém terisoativos, co-tensoativos e, opcionalmente, agentes protetores tais como proteínas, açúcares, etc. Métodos aceitáveis de evaporação incluem o uso de evaporadores rotativos, evaporadores de película que pode ser retirada, secagem por pulverização, secagem por congelamento, e outras técnicas, de evaporação padrão tipicamente utilizadas na indústria. f. Opcionalmente, pode-se remover o íensoaiivo e co-tensoativo por diálise, ultrafiltração, adsorção etc., obtendo-se assim, nanopartículas, as quais são estabilizadas pela proteína. g. Seguinte à evaporação do solvente, a dispersão líquida de nanopartículas pode ser seca para obter-se um pó contendo o agente far-macologicamente ativo e, opcional mente, a proteína, a qual pode ser redis-pHr$3 em um me·*.^ aquos*.* adequado, et < om*i, sjlüLe.o salina, idrrijjdO, agua, e similares, para obter-se uma suspensão que pode ser administrada a uma forma de vida, tendo um tamanho de partícula abaixo de 1000 Angstroms. Métodos aceitáveis de obtenção deste pó são por secagem por congelamento, secagem pc*r pulverização, e similares. Caso a conversão na forma sólida seja realizada por liofiíização, vários crioprotetores podem ser adicionados, tais como manitol, lactose, albumina, carboximetilcelulose, poli-vinilpirrolidona. maltodextrinas, e/ou polietileno glicol.

Essas nanopartículas podem ser ainda misturadas com excipien-les adicionais ou materiais formadores de matriz, de modo a obter o sistema de liberação da dioga, com alia biodisponibiiidade, características de iibera-cao controlada e proteção no suco oastnco. O produto final pode ser introduzido em um mamífero como um comprimido, cápsula, líquido reconstituído, ou similares. A formulação da presente invenção possui vantagens significativas sobre os rnéíodos anteriormente utilizados para preparação de nano e micropartículas e o uso de microemulsões ou !l concentrado de nré-microemulsão".

Existem muitas vantagens realizadas mediante o uso do proces- so da invenção. A microemulsão é formada espontaneamente, caso sejam selecionados os componentes adequados, e não existe a necessidade de equipamento caro e gasto de energia. O tamanho da gotfcula é menor em cerca de uma ordem de grandeza do que as gotícuias de emulsão menores obtidas por equipamento de alto cisalham*nto, e, portanto, podem ser obtidas nanopartículas extrema mente pequenas. As microemulsões são termo-dinamicamente estáveis, e, portanto, os problemas usuais que estão associados com instabilidade da emulsão le portanto uma dependência temporal do tamanho das partículas resultantes) serão prevenidos. Todo o processo é muito mais simples do que o método de evaporação do solvente da emulsão convencional, e merios sensível a vários parâmetros. Visto que apenas a misturação simples está envolvida no processo, a escalação ascendente para volumes em grande produção é muito simples, comparado à emulsiíi-cação com equipamento tal como homogerieizador de alto cisalhamento. Visto que o tamanho de partícula obtido pelo novo processo é muito pequeno, de uma ordem de grandeza inferior ao tamanho do poro das membranas usadas para filtrarão estéril, o processo de esterilização é muito eficaz, sem problemas associados com o bloqueio de membrana, tal como pressão aumentada na filtração, e elevada perda da droga durante o processo de filtra-cão. Visto que não existem forças de cisalhamento no processo de emulsifi-cação, não existe aumento da temperatura durante a emulsificação e, portanto, mesmo as drogas sensíveis à temperatura podem ser processadas pelo método inventivo. A droga na formulação líquida da presente invenção possui estabilidade química incrementada, porque ela contem nanopartícu-ias dispersas comparada com microemulsões convencionais que contém nanogotículas dispersas, ou seja, mais reações químicas ocorrem no estado líquido (microgotícula) versus estado sólido (nanopartícuia). A presenie invenção possui estabilidade química aumentada como uma formulação seca, comparada com microemulsões convencionais que são liquidas como a fase continua da microemulsão. A formulação sólida permite a inclusão da droga ern várias formas de dosagem sólida, tais como comprimidos, grânulos, e cápsulas, comparada com microemulsões convencionais ou ''concentrados de pré-microemulsão" que estão presentes numa forma líquida. A distribuição de tamanho muito estreita, combinada com tamanho de partícula médio muito pequeno, assegura adsoroão maior da droga de um modo mais uniforme do que as microparticulas e nariopartículas preparadas por métodos convencionais, assim esperando-se uma maior biodisponibilidade.

Embora os exemplos apresentados na seção a seguir refiram-se a duas moléculas insolúveis em água, os agentes farmacologicos considerados como úteis na preparação das nanopartículas incluem, mas não estão limitados a, drogas, agentes de diagnóstico, agentes de valor terapêutico, agentes nutricionais e similares. Uma lista não-limitativa das categorias de droga e compostos incluem, mas rião estão limitados a, todos os compostos enumerados acima para uso no aspecto de homogeneização com alto cisa-Ihamento da invenção.

Os solventes descritos nos exemplos a seguir são tolueno e acetato de butila, contudo, qualquei solvente ou mistura de solvente que seja capaz de dissolver a droga requerida irá ser adequado para uso no processo da invenção, contanto que uma mícroemulsão adequada possa ser formada antes da remoção do solvente. Tais solventes podem ser clorofórmio, cloreto de metileno, acetato de etila, acetato de butila, acetato de isobutila, acetato de propila, éter terc-butilmetílico, butanol, propilerioglicol, heptano, anisol, cumeno, etil íormiato de etanol, propanol, tetrahidrofurano, dioxano, aeetoni-trila, acetona, dimetilsulíóxido, dimetilformamida, metilpirroiidinona, óleo de soja. oleo c,c coco. oleo da mciuo. oleo de oliva, oieo ut* ciçaitau, uieu ue caroço de algodão, álcoois C1.20· éstores C2-20, cetonas C3.20, polietilenoglicóis, hidrocarbonetos aíiíãticos, hidrocarbonetos aromáticos, hidrocarbonetos ha-Iogenados, d-íimoneno, combinações destes e similares. A proteína (ou uma mistura de várias proteínas) usada no processo deve ser de tal forma que não precipite durante a misturação inicial ou durante 0 estagio de evaporação. Existem munas de iais proteínas, incluindo albuminas (por exemplo, BSA, HSA, ovo), gelatina, colageno, IgG, várias enzimas, iactoglobulina, easeína, proteínas da soja, e similares.

Os tensoativos utilizados nesta invenção devem ser capazes de formar espontaneamente microemulsões de oleo-em-água, na presença de um co-tensoativü e solvente adequado, sem ocasionar precipitação da droga ou da proteína (caso presente). Os tensoativos podem ser não-iônicos (Tween, Span, Triton, Pluronic, ésteres de poliglicerol, e similares), aniònicos (SD3, coiatos e desoxicolatos, sabões de ácido graxo e similares), catiôni-cos (cloreto de oetiltrimetil arnônio, e similares) ou zwiteriônicos (lecitina, a-minoácidos, e similares). O co-tensoativo deve possuir a capacidade de formar espontaneamente microemulsões com os tensoativos selecionados, semi ocasionar precipitação das moléculas da droga dissolvidas (ou proteínas, caso presente) e sem induzir a formação de grandes materiais cristalinos. Os co-tensoativos podem ser, ou hidrossoiúveis, ou lipossolúveis, tais como buta-nol, propilenoglicol, álcool benzilico, propanol, e similares. A conversão da dispersão liquida das nanopartículas através da Siofilização pode precisar da adição cie agentes crioproietores, tais como ma-nitol, lactose, aminoácidos, proteínas, polissacarídeos, e similares.

Fica claro que os princípios descritos nesta invenção podem ser aplicados de várias maneiras do processo, por exemplo, 1. A formação das partículas da droga pode ser induzida por diluição da microemulsão num solvente adequado, no qual o solvente seja miscívei. Por exemplo, caso o solvente tenha uma baixa solubilidade em água, seria possível diluir-se a microemulsão até um ponto em que o solvente lique abaixo de seu limite de solubilidade em água. 2. O solvente e, opcionalmente, o tensoativo e co-tensoaíivo, podem ser removidos pelo uso de um extrator seletivo, o qual não dissolve a droga. 3. O tensoaiivo e o co-iensoaíivo podem ser removidos por ultra-filtração, enquanto se usa filtros tendo um corte abaixo do peso molecular da proteína. Dialise simples é também uma opção. 4. A formulação pode conter apenas componentes que sejam aceitáveis para o uso pretendido da formulação final (seja oral, IV, tópica, etc.), portanto não ha necessidade para sua remoção. 5. Similarmente, cotens cativos que podem permanecer no produto final, tais como glicerol, álcool benzílico, etc. podem ser utilizados. 6. É possível a adição de várias moléculas hidrossolúveis que podem afetar o diagrama de fase da microemulsão (eletrólitos, etanol, etc.) conlrolando, assim, a relação entre os vários componentes para conferir a carga ótima da droga. 7. A etapa de emulsificação espontânea pode ser realizada a uma temperatura diferente da temperatura ambiente, de modo a afetar o diagrama de fase (e as proporções do componente que conduzem á formação de urna microemulsão). Em particular, pode ser possível usar-se a temperatura (em tensoativos etoxiiados) para alterar o sistema de uma microemulsão de óleo-em-água para uma de água-em-óleo. 8. É possíveí adicionar outros componentes à fase de solvente, de modo a afetar a biodisponibilidade da droga. Em particular, prefere-se a adição de um óleo como óleo de soja, para melhorar a absorção orai, e para proteger a droga da degradaçao química e smzíí ít^iíca. 9. Simiiarmente, pode ser feita a adição de um polímero formador de matriz (tal como PVP) ao solvente, juntamente com a droga. 10. A estabilização e propriedades de forma sólida podem ser alteradas por adição de um polímero hidrossoluvel diferente da proteína (CMC, gomas, e similares) para a fase aquosa externa da microemulsão. 11. As propriedades de fiuxo do po em forma sólida resultante podem ser alteradas adicionando-se partículas coloidais (por exemplo, sílica) como uma carga, ou adição de auxiliares de reconstiluição/anliagiomeracão. 12. Os mesmos princípios descritos nesta invenção podem ser aplicados para formar partículas hidrossolúveis, enquanto realizando o estágio de emulsificação na faixa da composição em que se forma uma microemulsão de água-em-óleo. O processo pode ser usado, por exemplo, para formar nanopaitícuias de proteína extrema mente pequenas.

Exemolo 22 Preoaração de Nanooartículas de Ciciosoorina A 115 mg de ciclosporina A são dissolvidos em 1 ml de acetato de butila e misturados com 2 gramas de uma solução 4:1 de Triton X-100:n-butanol. Um sistema límpido é obtido. 10 g de água são adicionados gota a gota, enquanto se agita ligeiramente. É obtida uma microernulsão límpida de óleo-em-água. 10 g de solução de caseína a 1% são adicionados, enquanto se agita iigeiramente. O sistema torna-se ligeiramente turvo. Remove-se o acetato de butila em um Rotovap, a 40°C, SOmm de Hg. O sistema torna-se completamente Iímpido. O tamanho de partícula foi medido por espectroscopia de correlação com fóton. Descobriu-se que o tamanho Z-médio é 25-33 nm, enquanto o tamanho por distribuição de volume ou numérico é somente 9 nm. Nenhuma partícula foi observada sob microscopia óptica, nem sob luz polarizada. Este resultado indica a ausência de partículas cristalinas. A dispersão líquida dessas nanopartículas foi liofilizada, após a-dioionar lactose (2% peso/peso).

Um material branco, sólido, foi obtido, que, com reconstituição em água, produziu um sistema límpido, similar àquele de antes da Üoíiiiza-ção. O tamanho de partícula nesta amostra reconstituída era muito seme-inanie ao daquela formulação original média Σ de cerca de 40 nm, e diâmetro por volume e distribuição numérica entre 10-12 nm.

Exemnlo 25 Preparação das Nanopartículas de Ciciosporina A 119 mg de ciciosporina A são dissolvidos em acetato de butila e misiurados com 2 gramas Ce uma soiução oe luion X-lüüipropMleno gli-col. Um sistema límpido é obtido. 7 g de água são adicionados gota a gota, enquanto se agita ligeiramente. Obtém-se uma microernulsão de óleo-em-água. 7 g de solução de caseína a 1% são adicionados, enquanto se agita Iigeiramente. O sistema torna-se Iigeiramente turvo. A arnostra é diluída com água 1:1 antes da evaporação com solvente. Remove-se o acetato de butila em um Rotovap, a 40°C, SOmm de Hg. O sistema torna-se compleiamente límpido. Este processo também produziu nanopartículas extremamente pequenas: média Z 45 nm e diâmetro por volume e distribuição numérica de 11 nm. A dispersão líquida dessas nanopartículas foi liofilizada, após adicionar lactose (2% peso/peso).

Um material branco, sólido, foi obtido, que, com reconstituição em água, produziu um sistema límpido, similar àquele de antes, da liofiliza-ção. O tamanho de partícula nesta amostra reconstituída era muito semelhante ao daquela formulação originai media Z de cerca de 25 nm, e diâmetro por volume e distribuição numérica entre 9-11 nm.

Exemplo 26 Nanopartículas de Ciclosporina Foram feitas microemulsões com a seguinte composição: 50 mg de ciclosporina, 0,5 g de acetato de butila, 3,04 g de Tween 80: propileno qiicol (1:1! e 5,8 g de água A microemulsão foi evaporada para dar um líquido límpido contendo 5 mg/ml de ciclosporina. Em um experimento de controle, realizado com os componentes acima, por misturação simples, porém sem acetato de butila, mesmo após 17 horas, a ciciosporina não foi dissolvida.

Existem várias possibilidades para tensoativos incluindo polisor-batos (Tween) ésteres de sorbitano (dimensão), esteies de sacarose, leciti-na, monodiglicerídeos, oopolímeros de bloco de polietileno-polipropileno (pluronics), sabões (estearato de sódio, etc.), sais de bile de glicolato sódico, óleo de rícino etoxilado, estearoil-laciilato de sódio, ácidos graxos eloxilados, (myrj), àlcoois graxos etoxilados (Brij), dodecil sulfato de sódio (SDS), e similares. Ainda, geraimente, bipolímeros, tais como amido, gelatina, derivados de celulose, etc.., podem ser utilizados. Ainda, para aplicações orais, todos os tensoativos de grau alimentício aceitáveis podem ser usados, bem como os tensoativos apresentados em McCutcneon Handbook of Surfactants ou CTFA Index, Os possíveis co-solventes ou co-tensoativos para a microemulsão induem propilenoglicol, etanol, glicerol, butanol, ácido oléico, e similares.

Exemplo 27 Preparação das Nanopartícula de BHT 110 mg de hidroxitolueno butilado (BHT) são dissolvidos em 1 m! de toluerio, e misturados com 2 ml de uma solução 4:1 de Triton X-100: n-butanol. 32 g de solução de caseina a 1% foram adicionados e uma microe-mulsão se formou espontaneamente. A microemulsão foi evaporada sob pressão reduzida, 80 mm de Hg, a 40c'C, até se tornar clara. O tamanho das partículas resultantes é: média Z 30 nm, diâmelro por volume e distribuição numérica é 16 e 15 nm, respectivamente.

Exemolo 28 Preparação de Nanopartículas de BHT

Foi realizado um processo similar àquele descrito no Exemplo 24, embora usando-se água no lugar de solução de caseína. Após evaporação a 40C'C, 80 mm de Hg, o sistema tornou-se límpido, tendo um tamanho médio Z de -10 nm.

Exemplo 29 Preparação de Nanopartículas de Paclitaxel 30 mg de paclitaxel foram dissolvidos em 2 m! de acetato de bu-iiia e adicionados a 4 gramas de Triton Χ-100'propüenogüco! 4:1. 40 ml de água foram adicionados e o sistema ficou ligeiramente turvo. Após evaporação, o sistema tornou-se completamente límpido. O tamanho médio de Z era 6 nm, tamanho por volume e distribuição numérica foi de 7-9 nm. O mesmo tamanho foi medido após um dia, a 4CC. D. Diferentes exemplos relevantes de todos os métodos de formação de na- nopartículas Exemolo 30 Identificação dos Diagramas de Fase da Microemulsão Ac composições que produziram microemulsões foram identificadas, e que podem ser utilizadas para obter nanopartículas pelo método de evaporação de solvente. Essas composições devem conter um solvente míscível em água capaz de dissolver moléculas hidrofóbicas, uma solução aquosa como o meio contínuo, tensoativos e, possivelmente, co-íensoativos.

As microemulsões de acetato de butila em água podem ser formadas em várias composições que são descritas pelo diagramas de fase (acetato de butila & classificado corno solvente com composição residual bastante aceitável no produto final). Além disso, ambos o tensoativo e co-tensoativo são usados em aplicações farmacêuticas e alimentícias: Tween 80 (monooleato de sorbitano etoxilado) e propileno glicol. Experimentos preliminares foram conduzidos com o uso de partículas na faixa de tamanho de 20-50 nm. Após filtração por filtros de 0,2 μτη, cerca de 100% do BHT passou pela membrana.

Os diagramas; de fase de várias combinações de tensoaíivos/co-tensoativo foram obtidos por submissão ao vortex do solvente com uma mistura de terisoativos/co-tensoativos (preparados antes da misturação com o solvente, em várias proporções), seguido por adição gota a gota de água. A turbidez das várias composições ao longo da "linha de água'1 foi observada e as composições gue produziram sistemas translúcidos foram ainda analisadas por difusão de luz. Com o uso de várias relações de solvente-tensoaiivo/co-tensoativo, as áreas no diagrama de fase que produziram rni-croemulsões foram identificadas (somente um pequeno número dos componentes selecionados produziram microemulsões). O mesmo procedimento foi usado para sistemas, nos quais BHT foi dissolvido em acetato de butila antes de começar os experimentos de diagrama de fase. A "capacidade de filtração" da microemulsão e das nanopartícu-las que contêm o BHT foi avaliada comparando-se os espectros de absorção UV aníes e depois da filtração (0,2 μίτο. As nanopartícuSas foram obtidas por evaporação a vácuo do acetato de butila (60 mm Hg, 40°C). Deve-se enfatizar que poi lodo o processo não foi usado nenhum equipamento de cisa-Ihamento.

Os sistemas de microemulsão foram identificados, os quais poderíam ser de utilidade para liberação oral. Acetato de n-bulila foi escolhido como uir. solvente. Os tensoativos e co-tensoativos a seguir foram avaliados em várias proporções: Tween 80:gliceroi 5:1 Tween 80:glicerol 4:1 Tween 80:glícerc>l 3:1 Tween 80:gliceroi 2:1 Tween 30:glicerol 1:1 Span 30:glicerol 4:1 Span SOrglicerol 3:1 Tween 80:propiieno glicol 4:1 Tween 80:propileno glicol 3:1 Tween 80:propileno glicol 2,5:1 Tween 80:propileno glicol 1,5:1 Tween 80:propileno glicol 1:1 Tween 80:propileno glicol 1:2 ((Tween 80 + Span 80) 7:1):propileno glicol 3,5:1 ((Tween 80 + Span 80) 7:1):propileno glicol 1:1 ((Tween 80 e Span 80) 6:'i):propileno glicol 4:1 ((Tween 80 + Span 80) 5:1):propileno glicol 1:1 Tween 80:((propileno glicol + Gliceroi) 1:1,2) 2:1 Urna composição adequada é corno segue: Tween 60 como um tensoativo e propilenoglicol como um co-tensoativo em uma proporção de 1:1. Todo o diagrama de fase foi avaliado para o sistema acetato de n-butila, Tween 80:propileno glicol 1:1, agua. Dois solventes adicionais foram testados: acetato de sec-buiiía e acetato de terc-butila. Os diagramas de fase para esses sistemas foram os mesmos daqueles com acetato de n-butila. O sistema acetato de n-butila, Tween 80: propiieno glicol 1:1, agua foi avaliado depois. A medição do tamanho de partícula para a amostra de acetato de butila a 7%, tenscativo/PG a 30%, água a 63%, foi realizada. A média Z de cerca de 20 nm foi encontrada. O processo de formação de nanopartícula foi realizado para um corante insoiúveí em água, Sudan íii, a uma concentração de cerca de 10 mg em 1 g de acetato de butiia (acetato de butiía a 5%, tensoativo/PG a 23%, água 72%·). O tamanho de partícula de cerca de 17 nm foi encontrado. O processo de formação de nanopartículas foi também conduzido para BHT ern urna concentração de 100 mg em 1 g de acetato de butila. O diagrama de fase para este sistema foi determinado. O tamanho de partícula de cerca de 20-50 nm foi encontrado, dependendo da composição.

Foram conduzidos experimentos de controle com Sudan III e BHT. 14,4 g de água foram adicionados a 10 mg de Sudan III e 4,6 g do ten-soalivo/PG foram adicionados à mistura. A amostra foi agitada por 24 horas com um agitador magnético. Observou-se a dissolução de Sudan III. Entretanto, quando o mesmo experimento foi realizado com BHT (100 mg de BHT em 9 g de água e 4,3 g de lensoativo/PG) não se observou nenhuma dissolução de BHT. Neste estágio, a evaporação foi realizada (temperatura de 40°C, pressão de cerca de 60 mm Hg). A medição do tamanho de partícula para as amostras foi realizada antes e após evaporação. Foram encontradas médias Z de c erca de 20-50 nm e 30 nm para as amostras antes e após e-vaporacão, respectivamente.

As amostras apôs evaporação foram filtradas por filtros cie 0,2 μ m, e a concentração do BHT antes e após íiltração foi medida por absorção de luz IJV. Descobriu-se que não houve diferença entre as duas amostras. Este resultado é obviamente uma indicação do tamanho muito pequeno das nanoparíiculas de BHT.

Duas amostras foram preparadas (a composição dessas amostras: amostra n° 1: 4% de acetato de hutila; 14% de tensc*ativo:/PG; 80% de água; amostra n':' 2: BHT 123 mg/y de acetato de butila; 5% de acetato de hutila; 13% cie tensoativo/PG; 77%. de água).

Exemplo 31 Alternativas na Lscolha du Equipamento do Processo O equipamento do processo usado para produzir as presentes baieladas será escalonado para produção clinica. Existem vánas alternativas disponíveis na escolha do equipamento em escala maior para produção de Capxol™. Algumas dessas alternativas estão descritas abaixo: Exemolo 32 Sistemas de Liberação Intravenosa Formulados· a Partir de uma Série de Materiais Os materiais usados para preparação dos sistemas de liberação intravenosa podem ser poliméricos (por exemplo, tubagem em poiietiieno, polivínila, polipropileno, e similares) ou vidro. Tubagem de grau medico padrão» e conhecida por conter porções hidrofóbicas nas superfícies internas da mesma. Essas porções são, assim, disponíveis para estarem ern contato com a solução da injeção, P.ealmente, íai tubagem e dimensionada especificamente, como o são os cateter^s, para apresentação das porções hidrofó-bicas em contato com a solução de tratamento, de modo a reduzir a absorção do material aquoso para a tubagem. Contudo, quaisquer porções hidro-fóbicas na solução de tratamento irão, similarmente, ligar-se a ambos, a tubagem do cateter e outros componentes do sistema de liberação. Como resultado, uma parle substanciai de um agente farmacologicamente ativo hi-drofóbic.o pode ser sequestrada nas paredes internas do cateter da tubagem e vaso de liberação. Consequentemente, a dosagem dos agentes farmacologicamente ativos hidrofóbicos podem ser passíveis de erre», visto que uma parte substancia! do agente ativo pode ser absorvida r.as paredes da tubagem. Em tratamentos terapêuticos críticos, onde o agente farmacoiogica-mente ativo hidrofobico é usado para tratar uma doença, uma redução significativa na dose eficaz do agente alivc» pode levar a uma falha terapêutica. A falha é paríicularmente contundente quando do emprego de porções terapêuticas que necessitem que o agente ativo esteja presente acima de um certo nível, ainda que o espectro terapêutico seja estreite».

Um novo método para introdução intravenosa de um agente farmacologicamente ativo hidrofóbico foi agora descoberto. Protegendo-se as porções hidrofóbicas do agente ative», através da associação com as porções hidrofóbicas de um revestimento biocornpatível (por exemplo, albumi-na), a propensão do agente ativo em tornar-se ligado à tubagem é dramaticamente reduzida. Assim, a presente invenção permite o uso de drogas ai-tamente hidrofóbicas em combinação com polímeros de grau médico padrão e vidros hidrofóbicos, em que a droga é protegida, e, portanto, não-absorvida na superfície. O método da invenção compreende colocar um revestimento protetor de um polímero biocornpatível (por exemplo, aibumina) ern torno da droga hidrofóbica e colocar a composição resultante num sistema de liberação poliméric.o hidrofóbico. Os métodos da invenção, são, portanto, capazes de melhorar a liberação de uma série de produtos terapêuticos hidrofóbicos. Exemolo 33 Análise por HPLC do Paclitaxel Sistema Cromatográficc»: HPLC: Shimadzu LC-10AS Sisiema de Liberação do Sol- vente Shimadzu SIL-10A Auto-injetor Shimadzu SCL-10A Controlador do Sistema Shimadzu SPD-M10AV Detetor das preparações do Diodo Shimadzu CTO-IOA forno de coluna Coluna: Curosü-PFP, 5,u.m, 4,6 mm x 25 cm, Phenomenex; ou C-18 Fase móvel: água/acelonitrila 65:45 Velocidade de Fluxo: isocráticc» 1,0 mi/min Detecção: 228 nm Identidade da Substância de Droga em Massa Paclitaxel ÍBDS) C paclítaxe! BDS e o paclitaxel padrão 99,9%, Hauser Chemical Research, Inc., Lote 1782-105-5) foram quantitativamente dissolvidos em acetonitrila e injetados em HPLC separadamente. 10 μί de 1,00 mg/ml de paclitaxel BDS e 10 μ! de 2,07 mg/ml de paclitaxel padrão foram injetados. O tempo de retenção do pico dominante do paclitaxel BDS é igual ao tempo de retenção do paclitaxel. padrão da Hauser.

Potencialidade do Paclitaxel BDS O paclitaxel BDS e o paclitaxel padrão foram injetados em HPLC como acima descrito. A potência do paclitaxel foi derivada com base na relação da área de pico do paclitaxel BDS sobre o paclitaxel padrão e a potência conhecida do paclitaxel padrão.

Perfil da Impureza do Paclitaxel BDS O sistema de cromatograíia supradescrito é capaz de providenciar uma alta resolução de taxanos. 10-20 μΙ de 1,0 mg/ml de paclitaxel BDS em acetonitrila, que se enquadra na faixa de resposta linear do nosso sistema HPLC, foram injetados em HPLC. O perfil da impureza foi determinado por área de pico relativa.

Ensaio de Potencialidade do Paclitaxel em Capxol™ As soluções padrão (60, 100, 120, 140 e 160 pig/ml) foram preparadas por dissolução quantitativa de paclitaxel BDS em 3% de HSA. As amostras de Capxol™ foram diluídas em solução salina a -100 pg/m! em concentração de paclitaxel. As soluções padrão e amostras de Capxol™ foram fixadas com cefalurnanina como um padrão interno, seguido por Extração da Fase Sólida ou Extração da Fase Liquida (ver abaixo). Injetar volumes iguais separadamente (20-30 μΙ) das preparações padrão e preparações da amostra de Capxol™ em HPLC, para medir a relação de resposta cie pic*í-? *ίΠυ e ρ'αυίίίοχο I e a cefalomanina de padrão interno. Uma curva de c-aSibraçâo foi gerada pela regressão ao quadrado menos comum dos resultados das injeções padrão. A potencialidade do paclitaxel no Capxol™ é determinada comparando-se a reiação de resposta do pico das injeções da amostra com as injeções padrão.

Perfil de Impureza do Paclitaxel no Capxol™ Capxc-l™ foi submetida à Extração de Fase Sólida ou Extração de Fase Liquida (ver abaixo) antes da injeção para a HPLC. 30 μΐ de -1 mg/ml de paclitaxel extraído de Capxol™ foram injetados para investigar o perfil de impureza como acima.

Extração de Fase Sólida Uma amostra de Capxol™ é reconstituída até aproximadamente 100 pg/ml em solução salina. Uma coluna de extração de fase sólida, Bond-Elut (C-18), é condicionada com água. A coluna é carregada com a amostra que é extraída pela coluna usando um vácuo. A coluna é a seguir lavada com água, seguido por eiuição do paciitaxel com acetonitriía. O eluato contendo paclitaxel extraído em acetonitriía é injetado na coluna de HPLC. Extração de Fase Liquida Uma amostra de Capxol™ é reconstituída até aproximadamente 100 μο/ηη! em solução salina. A aproximadamente 200 μΙ desta amostra adiciona-se 300 μΙ de acetonitriía. A mistura é submetida a vortex por 80 segundos e a seguir centrifugada a 3.000 g por 5 minutos. O sobrenadante é removido e coletado. O pélete é ressuspenso em 200 μΙ de solução salina e a etapa de extração é repetida. O segundo sobrenadante é agrupado com o primeiro. O extrato reunido é concentrado por evaporação, seguido por injeção na HPLC.

Exemplo 34 Distribuição do Tamanho de Partícula por Esoectroscopia de Correlação de Foton (PCS) A distribuição do tamanho de partícula do Capxol™ reconstituído foi analisada por espectroscopia de correlação de foton (PCS) no Malvern Zetasizer, Malvern Instruments Ltd. O Zetasizer foi calibrado por NIST trace-cibie Mar.osphsrc™ Size Standards. Duke Scientific Corporation. Q procedimento para medição do tamanho de partícula do Capxol™ no Malvern Zetasizer incluiu ajustes dos seguintes parâmetros: Temperatura: 2ü,70cC, Ângulo de difusão: 90° Dispersante do índice Refrativo: 1,33 Comprimento de onda: 633 nm Viscosidade (auto): 0,99 índice refrativo real: 1,59 índice refrativo imaginário: 0 Após preparar o Zetasizer, determinar a seguir a diluição da amostra necessária para uma boa medição do tamanho das leituras kcts/sec (para começar, captar uma alíquota de 200μΙ da amostra em uma pipeta, a seguir diluir com aproximadamente 2 ml de 0,22 μηι de água destilada filtrada). Colocar a pipeta em um retentor cie pipeta dentro do Zetasizer e come-car a medição. Logo que comece a medição, aparecerá o mostrador do Controle do Correlacioriador. Do "menu", escolha mostrar medidor de velocidade. A velocidade deve estar na faixa média de 100-250 kcts/segundos. Se a velocidade for ou muito alta ou muito baixa, prep»arar uma outra amostra em diluição mais alta ou mais baixa, respectivamente. O tamanho do Capxol™ reconstituído foi analisado, feita a média e registrado por análise mulíimodal após tres auto-operações. O tamanho médio de partícula foi de 155 nrn ± 23 nm para 25 bateladas de Capxol™. ΕχθπίρΙρ 35 Envoltórios Polimóricos corno Veículos cara Construcios. Enzimas e vacinas de Polinucleotideo Á medida que a terapia genética se torna mais amplamente aceita como uma opção terapêutica viável (atualmente, cerca de 40 propostas de transferencia genética humana foram aprovadas pelas juntas de exame NiH e/ou EDA) uma das barreiras para superar ria implementação desta abordagem terapêuiica é a reiuiância do uso cie vetores virais para incorporação de material genético no aenoma de unia célula humana. Os vírus são intrinse-camente tóxicos. Assim, os riscos embutidos no uso de vetores virais na terapia genética, especialmente para o tratamento de doenças não-genéticas, não-letais, são inaceitáveis. !nfe!izment.e, os plasmídeos transferidos sem o uso de um vetor viral, normalmente não são incorporados no genoma da célula alvo. Além disso, como com as drogas convencionais, tais plasmídeos têm urna meia-vida finita no corpo. Assim, uma iimitacão gerai a implementação da terapia genética (bem cerno terapia anti-sentido, que é uma forma inversa da terapia genética, onde um ácido nucleico ou oligoriucleotídeo è introduzido para impedir a expressão genética) tem sido a incapacidade de liberar eficazmente ácidos nucléicos ou oligonucleotídeos, os quais são mui- to grandes para permear a membrana celular. A encapsuíação de DMA, P.NA, plasmídeos, oligonucleotídeos, enzimas, e similares, em envoltórios de microcápsula de proteína como aqui descrito pode facilitar sua liberação mirada no fígado, pulmão, baço, linfa, e medula espinhai. Assim, de acordo com a presente invenção, tais produtos biológicos podem ser liberados aos locais intracelulares sem o risco assistido associado com o uso de vetores virais. Este tipo de formulação facilita a absorção não-específica ou endocitose dos envoltorios poliméricos diretamente da corrente sangüínea para as células do RES (sistema relículo-endotelial), para células musculares por injeção intramuscular, ou por injeção direta aos tumores. Além disso, anticorpos monoclonais contra receptores nucleares podem ser usados para direcionar como alvo o produto encapsu-lado ao núcleo de alguns tipos de célula.

Doenças, que podem ser direcionadas como alvo por tais cons-tructos incluem diabetes, hepatite, hemofilia, fibrose cística. esclerose múltipla, cánceres em gerai, gripe, AIDS, e similares. Por exemplo, o gene para fator de crescimento similar à insulina (IGF-1) pode ser encapsulado em envoltórios cie proteína para liberação para tratamento de neuropatia periférica diabética e caquexia. Os genes codificando Fator IX e Fator VIII (úteis para o tratamento da hemofilia) podem ser direcionados para o fígado como alvo por encapsuíação em envoltórios de microcápsula de proteína da presente invenção. Similarmente, o gene para o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LD!) pode ser direcionado para o fígado como aivo para tratamento da arterioesclerose por encapsuíação em envoltórios de microcápsula de proteína da presente invenção.

Outros genes úteis na prática da presente invenção são genes que reestimulam a resposta imune do corpo contra células cancerosas. Por exemplo, antígenos tais como HLA-B7, codificado por DNA contido num plasmídeo, pode ser incorporado em um envoltório de proteína da presente invenção para injeção diretamente a um tumor (tal como câncer de pele). Uma vez no tumor, o antigeno irá restaurar-se para células específicas tu-morais, as quais elevam o nível de eitocinas (por exemplo, IL-2), que tornam o tumor um alvo para ataque do sistema imunológico.

Como um outro exemplo, plasmídeos contendo porções do ge-rioma do vírus adeno-associado são considerados para encapsulação em envoltórios de microeápsula de proteína da presente invenção. Além disso, os envoltórios de microeápsula de proteína da presente invenção podem ser usados para liberar genes terapêuticos para células CDS + T, para imunote-rapia adotada contra uma série de tumores e doenças infecciosas.

Envoltórios de proteína da presente invenção podem também ser usados como um sistema de liberação para curar doenças, infecciosas através da liberação direcionada de um nucleotídec» anti-sentido, por exemplo, contra o vírus da Hepatite B. Um exemplo de um tal oligonucleotido anti-sentido é um fosforotioato de 21-mer, contra o sinal de poliadenilação do vírus da hepatite B.

Os erivoltóric-s de proteína da presente invenção podem também ser usados para liberação do gene regulador da transmembrana de íihrose cística (CFTR). Seres humanos que carecem deste gene desenvolvem fibrosa cística, que pode ser tratada por envoltórios de microeápsula de proteína para nebulizacão da presente invenção contendo o gene CFTR, e inalando diretamente aos pulmões.

As enzimas podem também ser liberadas usando os envoltórios de proteína da presente invenção. Por exemplo, a enzima, DNAse, pode ser encapsulada e liberada ao pulmão. De modo similar, ribozimas podem ser ώΠΟ^ιΓιόΐ «Zs ρ Γ,ΓΛ+ρίπρο nn.^c.rronrjr*· uín ir· *-m i 11 fj irvf VI '.· Mil VVIVI IU<.4UC Cl Ml '.'('Vil WI » I t-ll I ‘JV V I | UMi MU UMIUIUU II IIMU tadas por vírus, por ligação de anticorpos adequados para o exterior do envoltório poíimérico. Vacinas podem também ser encapsuiadas nas microcáp-suías poiiméricas da presente invenção e usadas para liberação subcutánea, intramuscular, ou intravenosa.

Exemplo 36 Tratamento Localizado de Tumores Cerebrais e Tumores na Cavidade Peritoneal A liberação dos agentes quimioíerapeuticos locaimente a um tumor é um método eficaz para exposição a longo prazo à droga, enquanto se minimiza os efeitos colaterais limitantes de dose. Os materiais biocompa-tiveis acima expostos podem também ser empregados em várias formas físicas, tais como géis, reticulados ou não, para propiciar matrizes das quais o ingrediente farmacologicamente ativo, por exemplo, pciclitaxel, pude ser liberado por difusão e/ou degradação da matriz. Capxol pode ser disperso dentro de uma matriz do material biocompatível para propiciar uma formulação de liberação prolongada de paclitaxe! para o tratamento de tumores cerebrais e tumores dentro da cavidade peritonea! (câncer do ovário e doenças metaestásicas). Os materiais sensíveis à temperatura podem também ser utilizados como matiz dispersante para a formulação da invenção. Assim, por exemplo, o Capxol pode ser injetado numa formulação liquida de materiais sensíveis a temperatura ipor exemplo, copoiímeros de poiiac-niarnidas ou eopolimeros de polialquilenoglicóis e polilaetideo/glicoletos e similar), que gelatiniza no local do tumor e propicia liberação lenta do Capxol. A formulação de Capxol pode ser dispersa em uma matriz dos polímeros bíocompaíi-veis supramencionados para propiciar urna formulação de liberação controlada do paclitaxel, que, através das propriedades da formulação de Capxol (albumina associada com paclitaxel). resulta em menor toxicidade ao tecido cerebral bem como toxicidade sistêmica baixa como acima exposto. Esta combinação de Capxol ou outros agentes quirnioterápicos formulados similares ao Capxol, juntamente com uma matriz polimérica biocompativei, pode ser útil para a liberação controlada local de agentes quimioterapéuticos para o tratamento de tumores sólidos no cérebro e peritónio (câncer ovariano) e em aplicações iocais a outros tumores sólidos. Essas formulações combinadas não estão limitadas ao uso do paclitaxel e podem ser utilizadas com uma ampla série de ingredientes farmacologicamente ativos, incluindo antiin-fecciosos. imunodepressores e outros agentes quimioterapéuticos, e similares.

Exemplo 37 Estabilidade do Capxol™ Seguinte à Reconstituição O Capxol liofilizado em frascos de vidro foi reconstituído com solução salina normal estéril a concentrações de 1, 5, 10 e 15 mg/ml, e arma- zenado à temperatura ambiente e sob condições refrigeradas. As suspensões foram encontradas homogêneas por pelo menos três dias, sob essas condições. Medições do tamanho da partícula realizadas em várias ocasiões indicaram nenhuma alteração na distribuição do tamanho. Nenhuma precipitação foi observada sob essas condições. Esta estabilidade é inesperada e supera problemas, associados com o Taxol, que precipita dentro de cerca de 24 horas após reconstituição nas concentrações recomendadas de 0,6-12 mg/rnl.

Além disso, o Cãpxol reconstituído era estável na presença de materiais de tubagem políméríca diferentes, tais como teflon, silástico, polie-tileno, tvgon e outros materiais de tubagem para infusão padrão. Isto é a vantagem principal sobre o Taxol, que está limitado a conjuntos de infusão de polietileno e garrafas para infusão de vidro.

Exemplo 36 Formas de Dosagem Unitária para Capxol™ O Capxol e preparado como um pó liofilbado em frascos de tamanho adequado. Assim, uma dosagem desejada pode ser enchida num recipiente adequado e liofilizado para obter um pó contendo esseneiaimente albumina e paolitaxel na quantidade desejada. Tais recipientes são então reconstituídos com solução salina normal estéril ou outro diluente aquoso até o volume adequado no ponto de uso, para obter-se uma suspensão homogênea de paclitavel no diluente. Esta solução reconstituída pode ser direta* mente administrada a um paciente, seja por injeção ou infusão com equipamentos .nfusao i.v. j^duiàu.

Além disso o Capxol™ pode ser preparado como uma solução congelada, pronta-para-uso em garrafas ou sacos, que seria descongelada por ocasião do uso e administrada simplesmente ao paciente. Isto evita a etapa de íiofilização no processo de fabricação. É bastante surpreendente que, quando a formulação da invenção e Taxoi são administrados a taxas em dosagens equivalentes de pacli-taxel, um grau muito maior de mielossupresão resulta do grupo do Taxol comparado com o grupo da formulação da invenção. Isto pode resultar em incidências menores de infecções ou episódios febris (por exemplo, neutro- penia febril). Pode também reduzir o tempo de ciclo entre tratamentos, que é atualmente de 21 dias. Com o uso de composições farmacêuticas· prepararias· de acordo com a presente invenção, este ciclo de tempo pode ser reduzido para 2 semanas ou menos, permitindo maior eficácia do tratamento de cânce-res. Assim, o uso de composições farmacêuticas preparadas de acordo com a presente invenção pode propiciar vantagem substancia! sobre o Taxol.

Exemolo 39 Liberação Oral das Prosas Taxol é muito fracamente absorvido por via oral. Formulações particuladas, tais como Capxol, podem intensificar em muito a absorção das drogas, tais como paclitaxel. Além disso, as formulações da invenção de pa-ciilaxel preparadas pelos processos oe rnicroemuis&ü/evsporaçâo sãc> utess para administração oral de drogas. O uso de tensoativos, em combinação com essas formulações, intensifica de modo surpreendente a biodisponibili-dade oral dessas drogas. Descofcnu-ss que uso de üpidens, tensoativos, inibidores enzimáticos, intensificadores de p&rmeação, agentes de parea-mento de íon, inibidores do metabolismo, aumenta, de modo surpreendente, a absorção ora! das formulações de paclilaxel da invenção. Exemplos de agentes de pareamento de íon incluem, sem limitação a, tricloroacetato, saii-cilato de tricloroacetato, ácido naftaleno sulfonico, glicina, carbonato de bis-N.N-dibutiíaminoetileno, n-alquii sulfonatos, e n-alqui! sulfates. Exemplos de intensificadores de permeação de membrana incluem, sem limitação a, ca-prato de sódio, giicerídeos de aciia, aiquii poiioxieíiieno acii éteres camitinas, c-olato de sódio, iaurocolato de sódio, taurodihidrofusidato de sódio, EDTA, salicilato de sódio, metoxissalicilato de sódio. Uma listagem não-limitante de tensoativos e lipídeos que podem ser usados para as formulações da invenção foram aqui descriios.

Exemolo 40 Modo de Administração do Capvol e Formulação da Invenção de Outras Drogas As formulações da invenção podem ser administradas por infusão intravenosa, bolo intravenoso, injeção intraperitonial, injeção infra- arterial, injeção intraportal, embolização hepática, injeção intraturnoral ou implante, injeção intra-uretrai ou por iontoforese, injeção intramuscular, injeção subcutânea, injeção iniratecal, inalação do pó seco ou liquido riebuiiza-do e similares.

Exemplo 41 Uso do Capxol para a Vasculatura Anaioaénica Objetivada A arigiogênese foi implicada como uma causa e/οιι fator de exacerbação no progresso de doenças tais como câncer, artrite reumatóide, e reíinopatia. Descobriu-se, surpreeridentemente, que o Capxol pode reverter ou reduzir a gravidade da artrite reumatóide, bem como curar tumores em modelos de animais. É portanto possível que o Capxol possua atividade an-tiangiogenica. Para tomar o Capxol ainda mais eficaz, é possívei alvejar a vasculatura angiogêniea através da ligação de peptídeos adequados ao Capxol. Exemplo de um tal peptideo é RGD (ácido arginina-glicina aspárti-co). Muitos outros peptídeos com atividade similar podam ser ligados ao Capxol, ou outras drogas preparadas pelo processo da invenção, para terapia direcionada. O peptídeo/Capxo! pode ser administrado por meios convencionais a pacientes em necessidade do mesmo.

Exemplo 42 Uso do Capxol™ para Tratamento de Doença do Fígado Careinoma hepatocelular em estágio final e outros câneeres do fígado podem ser tratados por administração de Capxol intraportalmente. A embolização diretamente ao fígado aumenta em muito a dose que atinge o fígado. Além disso, doses muito mais altas do que do Taxol convencional podem ser utilizadas para tratar as doenças mais eficazmente. Também, agentes de direcionamento adequados, tais como proteína ou peptídeos que se localizam no tecido do fígado, podem ser combinados corn Capxol para uma maior eficácia terapêutica. E. Exemplos Envolvendo ou Diretamente Relacionados aos Estudos Pré- ciínicos Exemplo 43 Estudo da Toxicidade/Mielossupresão de Paclitaxel - Comparação da For- muiacão BMS e Capxol™ para Estudo de Dose de Administração Única em Ratos Um resumo do estudo é apresentado abaixo.

Planejamento: 1X, Infusão iníravenosa de dose única (1o dia) Animais: Ratos Sprague Dawley, 40 machos, 40 fêmeas 5 ratos/agrupados por sexo Peso: 300 ± 50 g Duração do estudo: 15 dias Grupos de iraiameuio: BMS (i veículo + 3 grupos tratados) Capxol™ (1 veículo* + 3 grupos tratados) Doses: BMS (0, 3, 6 e 9 mg/kg) Capxol™ (0. 6, 9 e 12 mg/kg) Concentração da dose: 0,6 mg/rnl (todos os ratos) Volume da dose: BMS (15, 5, 10, 15 m!/kg) Capxol™ (20, 10, 15, e 20 ml/kg) Velocidade de infusão: aproximadamente 0,7 5 ml/hora (todos os ratos) Via da dosagem: Infusão intravenosa, veia da cauda Ohs. clínica 1 yJ dia Acompanhamento clínico: Dias 0 (antes do tratamento) 1, 3, 7, 11 15. Listagem padrão para NCI Tox Branch Pesos corporais: Dias -1. 1, 3, 8 e 15 (* o veículo é preparado por processo idêntico ao descrito na seção de fabricação, com exceção da adição de pacütaxe! que έ emitida). Exemplo 44 Estudo da Mieiossuoressão piloto (Toxicidade Hematoióqica) Antes do início do estudo formal, foi realizado um estudo piloto com 3 ratos no grupo do Capxol™ e 3 ratos no grupe do BMS para determinar as consequências. A dose usada foi de 5 mg/kg com um volume de dosagem de 7 ml/kg. A dose foi fornecida como um bolo intravenoso pela veia da cauda. Os resultados deste estude* estão resumidos no gráfico (ver figura 3), o qua! mostra a alteração percentual em contagens WBC (contagem da série branca do sangue) (um indicador da mielossupressão) para cada formulação como uma função do tempo.

Conclusões do Estudo de Mielossupressão Piloto: Os dados mostram contagens expressivamente mais baixas de WBC (média + SD) no grupe» do BMS comparado com o grupo do Capxol™ indicando um maior grau de mielossupressão para a formulação BMS (supressão máxima de WBC de >70% para BMS; supressão máxima de WBC de <30% para Capxol™). A análise dos dados mostra uma diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) entre os dois grupos para todos os pontos de dados, com exceção para o dia 0, 13 e 14. Além disso, níveis normais de WBC são recuperados dentro de 6 dias no grupo que recebe Capxol™, enquanto que são necessários 14 dias para recuperação de níveis normais de WC no grupo do BMS. Isto indica uma toxicidade hematológica expressivamente reduzida para o Capxol™. Caso resultados similares sejam vistos em tentativas clínicas humanas, estes dados podem sugerir que o tempo do cicio (atualmente 3 semanas para Taxol·?») entre ciclos subseqüentes de tratamento poderíam ser expressivamente reduzidos (possivelmente para 2 semanas ou mesmo 1 semana ou menos quando do uso do Capxol™. Exemolo 45 Estudo Piloto da Eficácia Antitumoral Antes do inicio do estudo acima, um estudo piloto com Capxol™ foi realizado para determinar as faixas de dose objetivas e a eficácia Os camundongos (n = 10) foram implantados subeutaneamente com o tumor mamário MX-1 e o tratamento foi iniciado quando o tumor atingiu aproximadamente 150-300 mg de tamanho. Isto ocorreu pelo dia 12 e o tratamento iniciou-se no dia 13 após a implantação inicial. Capxol ™ foi reconstituído em solução salina para obter-se uma solução coloidai de nanopartículas de pa-clitaxei. Os camundongos portadores de tumor (n = 5) foram tratados com Capxol™ reconstituído, a uma dose de 20 mg/kg (identificado por VIV-1), dado por injeção de bolo na veia caudal, iodo dia, por cinco dias consecutivos. O grupo portador de tumor de controle (n = 5) recebeu somente solução salina no mesmo programa. O tamanho dos tumores foi monitorado como uma função do tempo. O grupo de controle mostrou um tremendo aumento no peso turnoral até uma média de mais de 4500 mg e todos os animais neste grupo foram sacrificados entre o dia 28 e dia 39. O grupo de tratamento, por outro lado, mostrou uma eficácia notável e todos os animais não tiveram tumores mensuráveis pelo dia 25. Os animais deste grupo foram todos sacrificados no dia 39, em cuja ocasião não mostraram nenhuma evidência de recorrência e nenhuma evidência de tumor. Os resultados são mostrados na Figura 4. CONCLUSÃO: Este estudo mostrou atividade antitumoral notável para o Cap-xol™. Assim, a atividade antitumoral do paclitaxel é preservada na formulação de Capxol™. Este estudo indica que a administração intravenosa de nanopartíoulas de paclitaxel pode ser tao eficaz quanto a administração da droga na forma solúvel. Assim, o Capxol™ mostra eficaz e potente atividade antitumoral sem os efeitos tóxicos vistos na formulação BMS contendo "Cremaphor" aprovada e comercializada.

Nota: Com base nos dados da literatura e ria experiência de cientistas do SRI (Southern Research Institute) foi estabelecido que a dose máxima tolerada (MTD) de paclitaxel dissolvido em diluente 12 ("Crema-phor"/etanol, que é o mesmo diluente usado na formulação BMS) é 22,5 mg/kg para esta linhagem particular de camundongos atfmicos. Este resultado é obtido por diluição do paclitaxel a uma concentração muito maior em diluente 12 comparado com a formulação BMS comercializada (paclitaxel BMS, 6 mg/ml em "CremaphorVetanoi). Faz-se isto para minimizar a quantidade de “CremaphorVetanoi administrado ao camundongo. para evitar toxicidade veicular. Em uma dose de 22,5 mg/kg, o paclitaxel em diluente 12 possui mesma eficácia do que aquela do Capxol™ acima.

Exemplo 46 Tratamento da Artrite Reumatoide em um Modelo Animal com Nanopartfcu-las de Paclitaxel O modelo de artrite induzida por colágeno em ratos Louvain foi usado para testar o efeito terapêutico das nanoparticulas de Paclitaxel na artrite. Os tamanhos das patas dos animais experimentais foram monitorados para avaliara gravidade da artrite.

Após a artrite ter sido completamente desenvolvida (normalmente 9-10 dias após injeção de eolágeno), os animais experimentais foram divididos em grupos diferentes para receóer seja nanoparticulas de paclitaxei, 1 mq/kg q.o.d, ou nanoparticulas de paclitaxei 0,5 mg/kg + prednieona 0,2 mg/kg q.o.d (tratamento combinado) intrapentonialmente para 6 doses, a seguir uma dose por semana durante três semanas. Os tamanhos das patas foram medidos no corneco do tratamento (dia 0) e cada vez que a droga foi injetada. Um grupo recebeu somente solução salina normal como controle. No final do experimento, o grupo que recebeu nanoparticulas de paclitaxei conseguiu uma redução de 42% no tamanho da pata, o grupo de tratamento combinado mostrou uma redução cie 33%. no tamanho da pata, enquanto» o grupo de controle tinha cerna de 20% de aumento no tamanho da pata. O tamanho da pata original antes da artriie ser induzida eta de 50%. Os resultados podem ser vistos na Figura 2.

Concluindo-se, as nanoparticulas contendo paclitaxei demonstraram efeito terapêutico na artrite. Para evitar efeitos colaterais do uso prolongado de ambos o paclitaxei e o esteroide, é provavelmente meihor escolher um tratamento combinado que ofereça efeito similar, mas somente a metade da dosagem de cada droga.

Exemplo 47 O Efeito do Capxol na Restenose Arterial A proliferação muscular lisa vascular ariormai (VSMP) está associada com distúrbios cardiovasculares tais como arteriosclerose. hipertensão, e a maioria dos procedimentos endovascuiares. VSMP anormal é uma complicação comum de angiopiasia coronária transluminar percutánea (PT-CA). A incidência da restenose crônica resultando de VSMP seguinte a uma PTCA foi relatada como elevada quanto 40-50% dentro de 3-6 meses. A alta incidência de reoclusão vascular associada com PTCA conduziu ao desenvolvimento do modelo animai in vivo de restenose e da busca para agentes na sua prevenção. O estudo a seguir descreve o uso do Capxol na ibinição da restenose seguinte a um trauma intimo da artéria.

Ratos Sprague-Dawley machos (Charles River) pesando 350400 gm são anestesiados com Ketamin e Rompum e a artéria carótida comum direita é exposta por uma distância de 3 cm. O tecido aderente é limpo para permitir que dois grampos DIETRICH micro bulldog sejam colocados em cerca de 2 cm distantes, em torno da carótida, sem ocasionar dano por esmagamerito ac· nervo vago ou gânglio cervical superior associado e cordão simpático. Nenhuma ramificação estava presente junto com este segmento do vaso. Uma agulha de calibre 30 unida a uma válvula de 3 saídas é primeiro inserida e a seguir retirada da extremidade inferior do segmento isolado, para produzir um orifício na parede do vaso, e a seguir inserida na extremidade superior para injeção. 2-3 ml de solução salina tamponada com fosfato é injetada para enxaguar todo o sangue dentro cio segmento isolado, a seguir a válvula de 3 saídas é girada para outra conexão a uma fonte regulada de ar comprimido. Uma suave corrente d* ar (25 ml por minutos) é cassada ao longo do iúmen do vaso por 3 minutos para produzir dano por secagem do endoíélio. O segmento é a seguir novamente enchido com solução salina anies da remoção da agulha do vaso. Antes dos grampos serem removidos, os orifícios da agulha na parede do vaso são cuidadosamente cau-terizados para evitar sangramento. Um chumaço embebido com soiução salina pode ser usado para pressionar os orifício? da agulha para também interromper o sangramento. A pele é fechada com grampos de metal ue 7,5 mm e lavada com Betadina.

Todos os animais receberam a cirurgia descrita acima e foram sacrificados no 14c' dia após a cirurgia. A artéria carótida de cada lado foi reconstituída por exame patológico. O lado não-operado servirá como autocontrole. Os grupos experimentais receberam diferentes tratamento como segue: Grupo 1: Tratamento com alta dose de Capxoi Paclitaxel 5 mg (peso/100mg albumina humana)/kg/semana, iv. Grupo 2: Tratamento com doses baixas de Capxol Paclitaxel 1 mg (peso/20 mg de albumina humana)/kg/sernana, iv.

Grupo 3: Controle de veículo da droga Albumina humana 100 mg/kg/semana, iv.

As amostras do bioensaio da artéria carótida são preservadas em Formalina e seguidas de seções transversais (S pm) são cortadas a partir dos blocos de parafina e manchadas com hematoxilina e eosina. As áreas de seção transversal das túnicas dos vasos sanguíneos (intima, mediana e adventíeia) são quantificadas.

As artérias carótida danificadas no grupo de controle mostraram acúmulo notável de células musculares lisas intimas e invasão VSMC da membrana fundamental. A espessura global da parede da artéria carótida é dobrada. Os grupos de tratamento mostraram uma diminuição estatística significativa na espessura da parede íntima comparados aos de controle. Exemolo 46 Obietivacão !n Vivo das Nanooartículas Mediante incorporação de algumas partes alvo, tais como proteínas, anticorpos, enzimas, peptídeos, olinc-gucleotídeos, açúcares, polissa-carídeos e similares, no interior do revestimento protéico das nanopartículas é possível objetivar sítios específicos no corpo. Esta capacidade de direcionamento pode ser utilizada para propósitos terapêuticos ou de diagnostico. Exemplo 4P

Obietivacão do Anticorpo de Envoltórios Poiiméricos A natureza dos envoltórios poiiméricos de alguns aspectos da invenção permite a ligação de anticorpos monoclonais ou poiicíonais ao envoltório poümáríco. Anticorpos podem ser incorporados aos envoltórios poli-rnéricos â medida que o envoilorio de microcápsula polimérico é formado, ou os anticorpos podem ser ligados ao envoltório polimérico após sua preparação. Técnicas padrão de imobilização da proteína podem ser usadas para esta finalidade. Por exemplo, com microcápsulas· de proteína preparadas de uma proteína, tal como aibumina, um grande número de aminogrupos em resíduos de lisina albumina estão disponíveis para ligação de anticorpos adequadamente modificados. Como exemplo, agentes antitumorais podem ser distribuídos a um tumor por incorporação de anticorpos contra o tumor ao envoltório polimérieo, a medida em que este se forma, ou os anticorpos contra o tumor podem ser ligados ao envoltório polimérieo após preparação deste. Como um outro exemplo, produtos genéticos, podem ser distribuídos a células específicas (por exemplo, hepatócitos ou algumas células de origem na medula óssea) por incorporação dos anticorpos contra receptores nas células-aivo para o envoltório polimérieo ã medida ern que este se forma, ou anticorpos contra receptores nas células alvo podem ser ligados ao envoltório polimérieo após preparação deste. Além disso anticorpos mono-elonais contra receptores nucleares podem ser usados para objetivar o produto encapsuladc» ao núcleo de alguns tipos de célula.

Exemplo 50 Objetivarão do Agente Irnunossuoressivo a órgãos Transplantados Usando Liberação Intravenosa dos Envoltórios Polirnericos Contendo Tais Agentes Agentes imunossupressivos são usados extensivamente seguinte à um transplante de órgão, para prevenção de episódios de rejeição. Em particular, a ciclosporina, um potente agente imunossupressivo, prolonga a sobrevivência de transplantes alogenicos envolvendo peie, coração, rim, pâncreas, medula óssea, intestino delgado, e pulmão, em animais. A ciclosporina demonstrou reprimir alguma imunidade humoral e, em uma maior extensão, reações mediadas por célula, tais como rejeição de aioenxerio, hi-persensibilidade retardada, encefalomielite alérgica, artrite adjuvante de Fre-und, e uma doença enxerto versus hospedeiro em muitas espécies animais para uma série de órgãos. Transplantes alogénieos de rim, fígado e coração, que obtiveram sucesso, foram realizados em seres humanos com o uso da ciciospoprina. A ciclosporina é atualmente distribuída na forma oral, seja como cápsulas contendo uma solução de ciclosporina em álcool, como em óleos tais como óleo de milho, gücerídeos polioxietilados e similares, ou como uma solução em oleo de oliva, glicerídeos polioxietilados e similares. Também é administrado em injeção intravenosa, em cujo caso é dissolvido numa solução de etanol (aproximadamente 30¾.) e "Cremaphor" (oleo de rícino polio- xietilado), que deve ser diluído 1:20 a 1:100 em solução salina normal ou em 5% de dextrose antes da injeção. Comparado a uma infusão intravenosa (i.v), a biodisponibilidade absoluta da solução oral e de aproximadamente 30% (Sandoz Pharmaceulical Corporation, Publication SDI-Z10 (A4) 1990). Ern geral, a liberação i.v. de cicloaporina sofre de problemas similares aos atualmente praticados quando da liberação i.v de Taxol ou seja, reações a-nafiláticas e alérgicas em que se acredita ser devido ao "Cremaphor", o veículo liberador empregado para a formulação i.v. Além disso, a liberação intravenosa da droga, (por exemplo, ciclosporina) encapsulada como aqui descrito, evita os picos de níveis sanguíneos perigosos, imediatamente seguinte à administração da droga. Por exemplo, uma comparação de formulações atualmente disponíveis para ciclosporina com a forma encapeuiada supradescrita de ciclosporina, demonstrou uma diminuição de cinco vezes nos picos de níveis sanguíneos da ciclosporina, imediatamente seguinte à injeção.

De modo a evitar problemas associados com o "Cremaphor", a ciclosporina contida dentro dos envoltórios polimérieos como acima descrito pr.de ser liberada por injeção i.v. Ela pode ser dissolvida num óleo biocom-patível, ou numa série de outros solventes, e a seguir pode ser dispersa nos envoltórios polimérieos por sonicacão como descrito acima. Além disso, uma vantagem importante na liberação da ciclosporina (ou outro agente imuno-depressivo) em envoltórios polimérieos têm a vantagem da objetivação local devido à absorção do material injetado pelo sistema RES no fígado. Isto pode, até um determinado ponto, evitar toxicidade sistêmica e reduzir as dosa-gens eficazes devido à objetivação local.

Exemplo 51 Uso do Caoxol para Objetivação de Anticorpo Anticorpos monoclonais contra vários tumores ou tecidos podem ser ligados ao Capxol para permitir a objetivação do Capxol, ou de outras drogas preparadas pelo processo da invenção, aos locais da doença. Por exemplo, os anticorpos contra câncer ovariano ligados ao Capxol e administrados iníraperitonialmenie seriam de grande benefício aos pacientes com câncer ovariano.

Exemolo 52 Administração intravenosa de Produtos Terapêuticos A administração intravenosa dos produtos terapêuticos, por exemplo. drogas, agentes rle formação de imagem, e similares, predispõe o produto terapêutico a pelo menos uma passagem pelo fígado. Â medida que este produto terapêutico é fiitrado através do fígado, uma parte significativa deste produto terapêutico é retirado e sequestrado pelo fígado, e, portanto, não fica disponível para distribuição sistêmica. Além disso, uma vez retirado pelo fígado, existe a probabilidade de ser metabolizado e os subprodutos metabòlicos resultantes, freqüentemente, têm toxicidades sistêmicas genéricas. Pela enoapsuiação da droga ou outro agente terapêutico num revestimento de acordo com a presente invenção (por exemplo, usando uma proteína como albumina) o sequestro pelo fígado, por administração intravenosa, e aliviado. A âlbüiTiii iã, por ηχθηipHO, e conuecida passar através do íigado e tornar-se geralmente distribuída por todo o paciente. Assim, o seqüestro da albumina pelo fígado não ocorre no mesmo grau de compostos tóxicos ou drogas que possuem receptores hepáticos (ou outro mecanismo) que iniciam processos que resultam na sua remoção cia corrente sanguínea. Protegendo o prodiito terapêutico corn um revestimento de um polímero biocompatívei (por exemplo, um revesiimento de albumina humana), a droga a seguir desvia-se do fígado e é geralmente distribuída por todo o sistema orgânico. De acordo c.om um aspecto da presente invenção, é providenciado um novo método para desvio do fígado, que compreende a encapsuiação de uma droga numa albumina do fígado (essencialmente um componente fisiológico). Desta maneira, mais da droga tomar-se disponível para terapia sistêmica. Além da disponibilidade incrementada da droga, há uma diminuição na produção de subprodutos metabòlicos de degradação da droga hepatocelu-lar. Ambos, o aumento no desvio do fígado e diminuição dos subprodutos do metabolismo da droga, propiciam um melhoramento sinérgico na eíicacia total da droga. Esta eficácia aperfeiçoada se estende a todas as drogas e materiais que são encapsulados em albumina humana.

Exemolo 53 Efeitos da Redução Mielossupressora (Toxicidade hematoloqica) e Toxicidade Geral da? Drogas Várias drogas quimioterápicas possuem toxicidade limitante de dose devido a seus efeitos rriielossupressores. O Taxol (paditaxel) é um exemplo clássico de uma tal droga. Quando administrado em sua formulação atualmente aprovada de "CremaphorVetanol, o Taxol produz efeitos mielos-s upressores que limitam a repetição da administração da droga e impossibilitam o novo tratamento de um paciente por pelo menos 3 semanas, de modo a permitir que as contagens sanguíneas do paciente voltem ao normal. Postulou-se que, devido à natureza biocompaíível não-tóxica do veiculo da droga de alguns aspectos- da presente invenção, ou seja, albumina humana, o efeito colateral tóxico da mielossupressão pode ser, em muito, diminuída. A ratos; Sprague Dawley foi administrado paditaxel ern formulação comercia! (disponível da Bristoi Mvers Squibb (BMS) em “Crema-phor”/etano!, ern seguida referido como Taxol), ou preparado por um método inventivo como nanopartículas com albumina. Ambas as formulações foram administradas via injeção na veia da cauda. Um unico nível de dose de 5 mg/kg foi administrado para a formulação de Taxol, enquanto dois; níveis cie dose de 5 mg/kg e 12 mg/kg foram administrados para a formulação da invenção. A contagem de células sanguíneas brancas dos ratos foi monitorada diariamente após a administração, como um índice de mielossupressão.

Para a formulação de Taxoi (5 mg/kg) descobriu-se que a contagem de WBC (contagem da serie branca do sangue) caiu em 47,6% e 53,5% no dia 1 e dia 2 após a administração, respectivamenie, enquanto que para a formulação da invenção a 5 mg/kg a contagem WBC aumentou em 14,7%. e 2,4% no dia 1 e dia 2, respectivamenie. Para a dose mais alta da formulação da invenção a 12 mg/kg, a contagem de WBC aumentou em 6,5%. e 3,6%. no dia 1 e dia 2, respectivamente.

Esses resultados indicam que, a mielossupressão a curto prazo e em muito reduzida, administrando-se a droga na formulação da presente invenção.

Um outro indicador da toxicidade geral é o peso corporal do animal. Pesos corporeos dos ratos foram também monitorados seguinte à administração de paclitaxei. Em uma dose de 5 mg/kg, a formulação de Ta-xol resultou numa redução do peso corporal em 10,4% em 3 dias seguinte à administração, enquanto que a mesma dose de paclitaxei administrada na formulação da invenção resultou em apenas urna queda de 3,9% no peso corporal, indicando a toxicidade em muito reduzida da formulação da invenção. É muito surpreendente que, quando a formulação da invenção e Taxol são administrados a ratos em doses equivalentes de paclitaxei, resulta um grau muito mais alto de mielossupressão para o grupo do Taxol comparado com c* grupo da formulação da invenção. Isto pode resultar em incidências mais baixas de infecções e episódios febris (por exemplo, neutropenia febril). Pode-se também reduzir o tempo de ciclo entre tratamentos, o qual é atualmente de 21 dias para TaxorÊ*. Com o uso das composições farmacêuticas preparadas de acordo com a presente invenção, este tempo de ciclo pode ser reduzido para 2 semanas, 1 semana, ou até menos, permitindo um tratamento mais eficaz para canceres. Assim, o uso das composições farmacêuticas preparadas de acordo com a presente invenção pode propiciar vantagem substancial sobre o Taxol.

Exemplo 54 Administração da Dose em Bolos de Formulação de Nanopartículas A droga anticâncer, paclitaxei, em sua formulação comerciai BMS com "CremaphorVetanoi, não pode ser administrada como um bolo intravenoso. Isto se deve à extensa toxicidade do veiculo que resulta em graves reações anafiláíicas e requer que o paciente que receba a droga seja pré-medicado com esteróides, antihistaminicos, e similares. A formulação de Taxol'B> é administrada como uma infusão intravenosa que perdura entre 1 a 24 horas. Em contraste, as formulações de acordo com a presente invenção, devido ao uso de um veiculo não-tóxico, podem ser administradas a um paciente prontamerite como um bolo intravenoso, (ou seja num período inferior a 1 hora) sem os problemas de toxidez encontrados na formulação de Ta- χοΙ'Ε* que é usado clinicamente hoje em dia. A dose eficaz do paclitaxel para um paciente tipicamente fica entre 200-500 mg, dependendo do peso corporal do paciente ou superfície corporal. O Taxol·!» tem de ser administrado em uma concentração cie dosagem final de 0,6 mg/ml, requerendo grandes volumes de infusão (tipicamente na faixa de cerca de 300-1000 ml) Em contraste, as formulações da invenção não tem essas limitações e podem ser administradas em uma concentração desejada. Isto permite especialistas em trabalhos clínicos tratarem pacientes através de um bolo intravenoso rápido que pode ser administrado tanto em pouco tempo quanto em poucos minutos. Por exemplo, se a formulação da invenção for reconstituída para uma concentração de dosagem de 20 mg/ml, o volume da infusão para uma dose total de 200-500 rng é somente de 10-25 ml, respectivamente. Isto é uma grande vantagem na prática clínica.

Exemolo 55 Redução na Toxicidade cio Paclitaxel na Formulação de Nanopartícuia Comparada com o Taxol Sabe-se que a droga anticãncer, paclitaxel, em sua formulação comercial com “CremaphorVetanol (ou seja, Taxol) possui extensa toxicidade que resulta em graves reações anafilátioas e requer que o paciente que receba a droga seja pré-medicado com esteróides, antihisíarnínicos e similares. A toxidez da formulação BMS foi comparada com a formulação de na-nopartícula da presente invenção.

Assim, as formulações íoram injetadas intravenosamente através da veia da cauda da camundongos G57BL em diferentes níveis de dose, e os efeitos tóxicos foram monitorados por observação geral dos camundongos após a injeção.

Para Taxol, a dose de 30 mg/kg foi uniformemeníe leiai dentro de 5 minutos de administração intravenosa. Para a mesma dose, a formulação de nanopartícuia de acordo com a presente invenção não mostrou efeitos tóxicos aparentes. A formulação de nanopartícuia a uma dose de 103 mg/kg mostrou alguma redução no peso corporal dos camundongos, mas mesmo esta alta dosagem não foi letal. Doses de aproximadamente 1000 mg/kg, 800 mg/kg e 550 mg/kg foram todas letais, porém diferentes no tempo para a letalidade, a qual variou entre umas poucas horas até 24 horas. Assim, a dose letal da formulação da invenção é maior do que 103 mg/kg. mas inferior a 550 mg/kg.

Fica portanto claro que a dose letal da formulação de paclitaxe! da invenção e substancialmente maior do que a da formulação de Taxol. Isto tem uma grande significação na prática clinica, onde doses maiores cie drogas quimioterápicas podem ser administradas para atividade oncolftica mais eficaz, com toxicidade em muito diminuída.

Exemolc» 56 Determinação do LDm em Camundongos para o Taxol Produzido pelos Métodos Inventivos e Taxol Seguinte a uma Única Administração intravenosa O LDscí de Capxo!™, Taxol e seus veículos de transporte foi comparado em seguida a uma única administração intravenosa. üm iotai de 48 camundongos CD1 foram usados. Doses cie paclitaxel de 80, 103, 367, 548 e 822 mg/kg foram testadas para Capxol™ e doses de 4, 6, 9, 13,4 e 20,1 mg/kg de paclitaxel para Taxol. A dose para albumina humana, o veiculo do Capxol™ foi somente testada a 4,94 g/kg (corresponde a uma dose de 548 rng/ml de Capxol™) porque a albumina humana não é considerada tóxica para humanos. As doses testadas para o veículo do Taxoi (Cremophor EL'B>) foram de 1.5, 1,9, 2,8, e 3,4 mi/kg, o que corresponde a doses de 9, 11,3. 16,6 c ?0,1 mg/kg de paclitaxel, respectivamente. Três a quatro camundongos foram dosados com cada concentração. Os resultados indicaram que, o paclitaxel administrado em Capxol™ é menos tóxico do que Ta-xoi'Ê» ou o veículo do mesmo administrado sozinho. O LD*o e LD10 para Capxol™ foram 447,4 e 371,5 mg/kg de paclitaxel, 7,53 e 5,13 mg/kg de paclitaxel em Taxol e 1325 e 794 mg/kg de veículo de Taxol (o que corresponde a uma dose de 15,06 e 9,06 mg/kg de Taxol. Neste estudo, o LD50 para Capxol™ foi 59 vezes maior do que Taxol e 29 vezes maior do que o veiculo de Taxol sozinho. O LD10 para paclitaxel em Capxol™ foi 72 vezes maior do que paclitaxel no Taxol. Um exame de todos os dados neste estudo sugere que o veículo do Taxol é responsável por muito da toxicidade do Taxol. Viu-se que os camundongos que receberam Taxol e veículo de Taxol mostraram sinais clássicos de hipersensibilidade grave, indicado por coloração na pele rosa brilhante, logo após a administração. Nenhuma de tais reações foi observada para os grupos do Capxol™ e veículo de Capxol™. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 Essas doses altas, de Capxol™ foram administradas como injeções cie bolos e representam a dose equivalente de aproximadamente 82000 rng/m2 em humanos. O LD10 ou dose máxima tolerada de Capxol™ neste estudo é equivalente a aproximadamente 1000 mg/m2 em humanos. Isto é significantemenle maior do que a dose humana aprovada de 175 mg/m2 para Taxol.

Com surpresa, descobriu-se que o veículo, “Cremophor7etanoi, sozinho, ocasionou graves reações de hipersensibilidade e morte em vários grupos de dose dos camundongos. Os dados LD5o para veículo do Taxol sozinho mestra que ele é consideravelmente mais tóxico do que Capxol™ e contribuí expressiva mente para a toxicidade do Taxo!. Permanece obscuro na literatura a causa da hipersensibilidade, contudo, com base nesses dados, acredita-se que as HSR's podem ser atribuídas ao veículo do Taxol. Exemplo 57 Determinação do LD^n em Camundongos de Taxol# e Taxol em Seguida à Administração Intravenosa Múltipla O LD50 de Capxol™ e BMS-Taxol e seu veícuío foram comparados em seguida à administração intravenosa única. Um tota! de 32 camun-dongos CD1 foram utilizados. O Capxol™ com doses de paclitaxel de 30, 69, e 103 mg/kg foram administradas diariamente por cinco dias consecutivos. Taxol com doses de paclitaxel de 4, 6, 9, 13,4 e 20.1 mg/kg foi administrado diariamente por 5 dias consecutivos. Quatro camundongos foram dosados com cada concentração. Os resultados estão apresentados na Tabela 3 Tabela 3 Administração Múltipla Intravenosa Os resultados indicaram que o Capxol™ é menos tóxico do que Taxol. O LD50 e LDio de Capxol™ foram 76,2 e 64,5 mg/kg de paclitaxel, respectiva mente, comparado comí o,u/ e a,o mg/xg oe paciitaxsi em laxoi, respectivamente. Neste estudo, o LD50 para Capxol™ foi de 9,4 vezes maior do que para Taxol. O LDk. para Capxol™ foi 15 vezes mais aito para Cap-xoí™ do que para Taxol. Os resultados deste estudo sugerem que o Capxol™ é menos tóxico do que Taxol quando administrado em múltiplas doses a intervalos diários.

Exemplo 58 Toxicidade e Eficácia das duas Formulações de Capxol™ e Taxol1!1 Realizou-se um estudo para determinar a eficácia do Capxol™, Taxei, e veículo de Capxol™ em camundongos fêmeas atímicos NCrnu implantados com fragmentos de tumor mamário humano M.X-1. A grupos de 5 camundongos cada, foram dadas injeções intra-venosas de formulações de Capxol™ VR-3 ou VR-4 a doses de 13,4, 20, 30, 45 mg/kg/dia por 5 dias. A grupos de 5 camundongos foram dados também injeções intravenosas de Taxol a doses de 13,4, 20 e 30 rng/kg/dia por cinco dias, Um grupo de controle de dez camundongos foi tratado com uma injeção intravenosa de controle com veículo de Capxol™ (albumina humana, 600 mg/kg/dia) por 5 dias. Os parâmetros de avaliação foram o número de regressões do tumor totais, a duração média da regressão total, sobreviventes isentos de tumor e recorrências do tumor. O tratamento com formulação de Capxol™ VR-3 resultou em completa regressão do tumor em todos os níveis de dose. As duas maiores doses resultaram em 100% de sobrevivência após 103 dias, A formulação de Capxol™ VR-4 resultou em completa regressão tumoral nos três maiores grupos de dose e 60% de regressões a 13,4 mg/kg/dia. As taxas de sobrevivência apòs 103 dias foram um pouco menores do que com a formulação VR-4. O tratamento com Taxol a 30, 20 e 13,4 mg/kg/dia resultou em taxas de sobrevivência de 103 dias de 40%., 20%·, e 20%, respectivamente. O tratamento com o veículo de controle não teve efeito no crescimento tumoral e os animais foram sacrificados após 33 a 47 dias. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4 CR = Regressão tumoral completa TFS = Sobrevivência livre de tumor TR = Recorrência tumoral DCR = Dias de regressão completa.

Esses inesperados e surpreendentes resultados mostram uma eficácia aumentada para as formulações de Capxol™, comparadas com Ta-xol. Além disso, doses maiores de paclitaxel são alcançadas nos grupos do Capxol™ devido à menor toxicidade da formulação. Essas altas doses, foram administradas como injeções de bolo.

Exemplo 40 Cinética Sanqüínea e Distribuição Tissular no H^-TaxoKg» e Capxol™ em Seguida a uma Urtioa Dose Intravenosa no Rato Realizou-se dois estudos para comparar a farmacocinética e distribuição tissular do H3-paclitaxel formulado em Concentrado de Injeção de Capxol™ e Taxol. Quatorze ratos machos foram injetados intravenosamente com 10 mg/kg de H3-Ta>;oi e 10 ratos com 4,9 my/kg. Dez ratos machos foram injetados intravenosamente com 5,1 mg/kg de H3-Capxol no estudo acima. Níveis de radioatividade íota! e do paciiiaxei declinam bifasicamente no sangue dos ratos seguinte a doses, de bolo de 5 mg/kg de ou H3-Taxol ou H3-Capxol™. Contudo, os níveis de radioatividade total e de paclitaxel foram expressivamente mais baixos seguinte à administração cie H3-Capxoi™ a seguir uma dose similar de H3-Taxol. Este nível mais baixo é mais rapidamente distribuído para fora oo sangue. O perfil de HPLC do sangue mostra um padrão similar de metabolismo para metabólitos altamente polares para ambos, Hs-Capxol™ e H3-Taxol. Contudo, a velocidade de metabolismo parece ser expressivamente mais baixa para H3-Oapx**»l quando 44,2%. de radioatividade no sangue permanece como paciiiaxei 24 horas após a dose versus 2f,/% para hT-Taxoí. m excreção oe raQioativids.de ocorre rrsuitc pouco na urina e predorninaniemente nas fezes para H3-Gapxoi™, que é similar aos padrões de excreção relatados para Hc‘-Taxol. A cinética do sangue para radioatividade total e paclitaxel seguinte a administração IV de H?-Capxol™ ou H3-Taxol a 5 mg/kg esta apresentada na Tabela 5.

Tabela 5 Os níveis de radioatividade tissular são maiores em seguida a uma administração de hP-Capxol™ do que administração de H3- Taxol para 12 ou 14 tecidos. As relações ppm tecido/sangue são mais altas em todos os tecidos para animais dosados com Hs-Capxol™ a medida que os níveis sanguíneos são mais baixos. Isto suporta a rápida distribuição do Hy-Capxol™ do sangue para os tecidos sugeridos pelos dados ciriéticos do sangue. H3-Pao!ita>:e! formulado em Capxoi™ mostra um perfil farmacc-cinético simiiar para H3-pac!itaxel formulado em Taxol*!» para concentrado injetável, rnas relações ppm tecido/sangue e velocidades do metabolismo diferem expressivamerile. Um nível expressivamente mais baixo de radioatividade total para animais tratados com Capxoi™ do que para animais tratados com Taxol·!' nos dois minutos pos-administração da amostra sanguínea indica que o H3-Capxc«l é mais rapidamente distribuído no sangue. Contudo, a velocidade de metabolismo parece expressivamente mais lenta para HJ-Capxol™ quando 44% da reaíividade do sangue permanecer como paciiía-xel em 24 horas pós-administração versus 28%. para l-U-Taxol·!».

Esta descoberta para Capxoi™ é surpreendente e propicia uma nova formulação para alcançar a atividade prolongada do paclitaxel comparado ao Taxol. Tomados juntos com altas concentrações locais, esta atividade incrementada deve resultar em maior eficácia para o tratamento de tumores primários ou metástases em órgãos com concentrações íocais alias. As distribuições de tecido estão apresentadas na Tabela 6 abaixo. Os dados representam a média e desvios padrão de 10 ratos em cada grupo (Cap-xol™ e Taxol).

Tabela 6 Resíduos Radioativos em Tecidos de Ratos Machos, Expressos como ppm. em Seguida a uma Única Dose Intravenosa de HJ-Capxol™ e H3-Ta>:ol»l| a 5 rna/kq Os dados mostram níveis expressivamente maiores de acúmulo de Capxol™ em vários órgãos quando comparado ao Taxol<B>. Esses órgãos incluem próstata, pâncreas, rim, pulmão, coração, osso e baço. Assim, o Capxol™ pode ser rnais eficaz do que TaxoHB» no iraiamenio dê cânceres desses órgãos a níveis equivalentes de paclitaxel. Níveis no tecido da próstata são de particular interesse no tratamento do câncer prostático. Esse surpreendente e inesperado resultado possui implicações para tratamento de câncer da próstata. A tabela 7 abaixo mostra os dados para ratos individuais (10 em cada grupo) mostrando acúmulo incrementado de paclitaxel na próstata para Capxol™ em comparação ao Taxol'£>. A base para a localização na próstata poderia ser um resuítado do tamanho de partícula da formulação (20-400 nm) ou a presença de albu-mina de proteína na formulação, que pode ocasionar localização no tecido prostático por receptores de membrana específicos (gp 60, gp 18, gp 13 e similares) É também provável que outros· polímeros biodegradáveis biocom-patíveis diferentes da albumina podem mostrar capacidade específica para alguns tecidos, tais corno a próstata, resultando em alta concentração local de pacütaxel nesses tecidos como um resultado das propriedades descritas acima. Tais materiais biocompaiíveis são considerados incluídos no escopo desta invenção. Uma modalidade preferida de uma composição para aquisição de altas concentrações locais de paclitaxel na próstata é uma formulação contendo paclitaxel e albumina com um tamanho de partícula na faixa de 20-400 nm, e isenta de “Cremophor”. Esta modalidade também foi demonstrada resultar em concentrações maiores de nível de paclitaxel no pâncreas, rim, pulmão, coração, osso e baço, quando comparado com o Taxol em doses equivalentes.

Tabela 7 Dados para 10 ratos em cada grupo Dose de 5 mq/kg de paclitaxel Estes dados mostram que a localização do Capxol™ na próstata é de cerca de 150% em comparação com Taxol®».

Esta localização inesperada do paclitaxel na próstata, na formulação do Capxol™, pode ser explorada para liberação de outros agentes farmacologicamente ativos na próstata para o tratamento de outros estados doentios que afetem aquele órgão, por exemplo, antibióticos numa formula- cão similar para o tratamento de prostatite (inflamação e infecção da próstata), agentes terapêuticos eficazes para o tralamento de hipertrofia prostátiea benigna podem ser formulados de uma maneira similar a adquirir elevada liberação local. De modo similar, a descoberta surpreeenderite de que Cap-xol™ propicia altas concentrações locais ao coração pode ser explorada para o tratamento da restenose, bem como de doença arterioescierótica nos vasos coronários. Paclitaxel tem dernunsirado possuir um efeito terapêutico na prevenção da restenose e arteriosclerose e Capxoi™, assim, é um veiculo ideal. Além do mais, demonstrou-se que a albumina polimerizada de preferência se liga aos vasos endoteliais inflamados, possivelmente através dos receptores gp6Q, gp18 e gp13.

Exemolo 60 Ciriética do Sangue e Distribuição Tissular do Paclitaxel em Seguida a Níveis de Dose Intravenosa Múltipla de Capxol™ emi Ratos O estudo usando HJ-CapxoÍ™ foi siiplemeniado por tratamento de quatro grupos adicionais de ratos com uma única dose de boio de 9,1 mg/kg, 26,4 mg/kg, 116,7 rng/kg e 143,1 rng/kg de paclitaxel em Capxol™. O sangue foi coletado da veia da cauda e calcu!ou-se AUCo-24. Em 24 horas a amostras do sangue forami coletadas, extraídas e o extrato injetado em H-PLC para determinar o nível do composto de origem no sangue. A ciriética do sangue para radioatividade total e paclilaxe! seguinte a administração IV de H3-Capxol™ estão apresentados na Tabela 3.

Tabela o  medida em que a dose de paclitaxel foi aumentada, a área sob a curva foi proporcionalmente aumentada. O nívei do composto de origem apos 24 horas aumentou em um fator de 8,5 (0,04 ppm- 0,34 ppm), indo da dose de 9 mg/kg para a dose de 148 mg/kg.

Exemolc» 61 Determinação da Toxicidade em Ratos do Capxol™ e Taxol em Seguida a uma Administração Intravenosa Unica C» objetivo do estudo foi determinar a toxicidade do Capxol™ em seguida a uma única administração IV em ratos machos e fêmeas. Capxol™ foi administrado a G ratos machos e 6 ratos fêmeas a doses de 5, 9, 80, 90 e 120 mg/kg. Metade dos animais de cada grupo de dose foram sacrificados e necropsiados no Dia 8. Os animais restantes foram riecropsiados no Dia 31. Os resultados dos animais tratados com Capxol™ foram comparados com os resultados dos grupos de controle de solução salina normal e de veiculo, bem como a resultados com animais tratados com 5, 9 e 30 mg/kg de Taxol.

Os animais foram examinados imediatamente após a dosagem, 1 hora e 4 horas pós-admiriistração, e uma vez diariamente a seguir. O sangue foi coletado de cada animal para determinação sorológica e hematológi-ca antes da eutanásia.

Ocorreram treze mortes durante o período de observação de 30 dias. Todos os 12 animais tratados com Taxol a unia dose de 30 mg/kg de paclitaxel morreram pelo dia 4. Apenas um animai tratado oom Capxol™ morreu. O animal tratado com Capxol™ recebeu 90 mg/kg de paclitaxel e foi encontrado morto no dia 15. Nenhum outro anima! tratado com Capxol™ morreu na dosagem de 90 mg ou 120 mg/kg, portanto a morte não foi consi-ueiada estar reiacicnacia ao tratamento.

Durante as primeiras quatro horas do período de observação, to-ram observados ereção dos pelos e andar cambaleante na maioria dos animais tratados com Taxol, possivelmente devido ao teor de álcool da droga. A piloerenão foi observada em uns poucos animais tratados com Capxol™ Os animais tratados com Taxol a uma dose de 30 mg/kg de paclitaxel foram observados com ereção cios pêlos e letargia, e foram encontrados mortos pelo dia 4. Nenhum sinal evidente de toxicidade foi observado nos animais tratados com Capxol™, com exceção de uns poucos incidentes de ereção de pêlo em níveis de dose de 90 mg/ml e 120 my/ml.

Nenhuma anormalidade foi relatada em animais tratados com Capxol™. Resultados, de necrópsia completa no dia 8 e dia 31 foram normais. Alterações relacionadas com a dosagem significativas foram vistas- em órgãos reprodutores dos machos, em animais tratados com Capxol™. Uma degeneração e cavidades vaeuclares em células epiteliais do dueto do epi-dídimo, frequentemente acompanhadas por infiltração liníoeííiea intersticial multifocal, foi observada. Houve um aumento grave da atrofia dos túbulos semimferos observados nos testes à medida que a dose de Capxol™ aumentou. Na opinião do patologista, houveram significativas lesões nos -órgãos reprodutores dos machos nos animais tratados com 9, 30, 90 e 120 mg/kg de Capxol™. Essas alterações envolveram degeneração difusa e necrose dos testículos;, Lesas alterações foram as mais predominantes rios animais que receberam doses mais altas de Capxol™. Nenhuma alteração foi vista nos testículos de animais de controle não-tratade-s, animais de controle com veiculo, ou os uaíaoos com i axol.

Esta descoberta é inesperada e tem implicações terapêuticas significativas para o tratamento de cânceres dependente de hormônio, tal como o câncer de próstata. A remoção dos testículos, (orquiotomia) é urna abordagem terapêutica para o tratamento do câncer da próstata. O Capxol™ representa uma nova formulação para o tratamento desta doença, por alcançar alta concentração locai de paciitaxel neste ponto, por atividade prolongada do ingrediente ativo, mediante redução da função testicular e sem o veiculo tóxico "Cremophor”. O tratamento com Capxol™ permite, assim, a redução dos níveis de lestosterona e de outros hormônios andrógenos. A necrose cortica! -'erebra! foi vista no nível de dose mediano dos animais tratados com Taxol. isto pc-de explicar as mortes dos animais tratados com doses mesmo mais afias de Taxol. Nenhuma lesão cerebral foi vista em animais tratados tom Capxol™.

Esta falta de toxicidade neurológica ou cerebral é surpreendente e tem implicações significativas em ambos os tratamentos de tumores cerebrais e da capacidade em se conseguir altas dc-ses sistêmicas variando de 5-120 mg/kg em ratos (equivalente a 30-700 mg/m2 de dose em humanos).

Resumindo, Capxol™ foi consideravelmente menos tóxico que Taxoi. Nenhum animal testado com Taxol sobreviveu a doses maiores que 9 mg/kg. Com exceção de uma morte acidental a 90 mg/kg de Capxol™, todos os anumais que receberam Capxol™ sobreviveram a doses de até, e inclusive, 120 mg/kg. Ocorreu um efeito relacionado com aita dosagem do Capxol™ nos órgãos reprodutores masculinos e uma supressão no peso corporal masculino. Camundongos-fêmeas não demonstraram nenhum efeito tóxico pela administração do Capxol™ a doses de até, e inclusive, 120 mg/kg. Essas altas doses foram administradas corno injeções de bolo e representam o equivalente a 30-700 mg/ητ de dose em humanos.

Exemolo 62 Dados Farmacociriéticos (PK) para Nanouartículas de Ciciosoorina (Caoso-rina I.V) em Seguida á Administração Intravenosa Comparação com Sandi-mumne I.V. (Formulação Atualmente Comercializada pela Sandoz) Nanopartículas de dclosporina (Capsorina I.V.) preparadas corno descrito acima (Exemplos 13 e 14) foram reconstituídas em solução salina e administradas a um primeiro grupo de 3 ratos Sprague Dawley por bolos intravenoso. A um segundo grupo de 3 ratos foi dado Sandimmune I.V., que contém "CremaphorVetanol, após diluição em solução salina. Cada grupo recebeu a mesma dose cie 2,5 rng/kg de dclosporina. As amostras sanguíneas foram tomadas a intervalos de 0, 5, 15, e 30 minutos e 1,2, 4, 8, 24, 36 e 48 horas. Níveis de dclosporina no sangue foram avaliados por HPLC e parâmetros PK típicos foram determinados. As curva PK mostraram queda típica com o tempo, como a seguir: Além disso, devido à toxidez da formulação de Sandimmune I.V., 2 de 3 ratos naquele grupo morreram em 4 horas, após a dosagem. Assim, a formulação de nanopariícula (Capsorina I.V.) de acordo com a presente invenção mostrou uma ACC maior e nenhuma toxicidade comparada com a formulação comercialmente disponível (Sandimmune I.V.).

Exemplo 63 Dados Farmacocineticos <PK) para Nanoaotículas de Ciclosporina (Capsori-na Oral) Seguinte à Comparação da Administração Oral com Neoral (Formulação Atualmente Comercializada pela Sandoz) Nanogotículas de ciclosporina preparada acima foram administradas; em suco de laranja a um primeiro grupo de 3 ratos Sprague Dawley por gavagem oral. A um segundo grupo de 3 ratos foi dado Neoral, uma formulação de microemulsão comercial mente disponível contendo emulsifican-tes, após diluição em suco de laranja, também por gavagem oral. Cada grupo recebeu a mesma dose de 12 mg/kg de ciclosporina num volume idêntico de s uco de laranja. As amostras de sangue foram tomadas a períodos de 0, 5, 15, 30 minutos e 1,2, 4, 8, 24, 3G e 48 horas. Os níveis de ciclosporina no sangue foram avaliados por HPLC e os parâmetros PK típicos foram determinados. AS curvas PK mostraram queda típica com o tempo como segue: Assim, a formulação de nanogoticula (Capsorina oral) da presente invenção mostra um comportamento PK similar à formulação comercialmente disponível (Neoral).

Exemnlo 6-t Investigação Clínica com Capxoi™ Objetivos e Vantagens O fundamento racional para a seleção da dose inicial para os testes de Fase l/S! será baseado nos dados de toxidez pré-ciínicos dramaticamente menores para a formulação de Capxoi™ comparados com os da formulação de Taxol. Os dados pré-ciínicos acima indicam que, os níveis de dosagem iniciais de Capxoi™ para estudos de Fase l/ll utilizarão o MTD estabelecido (dose máxima tolerada) para paclitaxel na formulação de Taxol. Com base nos dados pré-ciínicos atuais, preconiza-se neste ponto que os objetivos clínicos para aprovação comercial serão eliminar a necessidade para uma pré-medicacão antes da administração do paclitaxel; determinar doses equivalentes de Capxol™ para Taxol, ou seja, determinar a dose à qual a resposta antitumoral equivalente é obtida; e eliminar a necessidade para uma infusão i.v. contínua (3 a 24 noras) para administração do paclitaxel e substituir por administração em períodos de tempo muito mais curtos (< i hora ou bolos).

Existem muitas vantagens potenciais na formulação de Capxol™ para paclitaxel. O Capxol™ é um pó liofilizado contendo somente paclitaxel e aibumina de soro humano. Devido á natureza da solução coloidal formada com a reconstituição do pó liofilizado, emulsificantes tóxicos, tais como "Cremaphor" (na formulação da BM3 de paciitaxei) ou polisorbatc* 80 (como na formulação da Rhone Poulenc de docetaxel) e solventes, tal como etanol, para solubilizar a droga, rião são necessários. A remoção dos emulsificantes tóxicos reduzirá a incidência de hiperscnslbiüdade grave e reações anafiiáti-cas que se sabem ocorrer de produtos como Taxol.

Além disse, nenhuma pré-medicação com esteróides e antihis-tamínicos são necessários antes da administração da droga.

Devido às toxicidades reduzidas, como se evidencia pelos estudos de LD10/LD50, doses mais altas podem ser empregadas, as quais resultarão em maior eficácia. A redução da mielossupressão (se comparado com Taxol) é esperada reduzir o período do ciclo de tratamento (atualmente de 3 semanas) e melhorar os efeitos terapêuticos.

Capxol™ pode ser administrado em concentrações muito maiores (de até 20 mg/m!) comparado com 0 Taxol (0,6 mg/rnl), permitindo infusões em volume muito menores e, possivelmente, a administração como um bolo intravenoso.

Um problema reconhecido com Taxol é a precipitação do paclitaxel em cateteres internos. Isto resulta em dosagem fracarnente controlada e passível de erro,. Devido à estabilidade intrínseca da solução coloidal da nova formulação, Capxol™, 0 problema da precipitação é aliviado. A literatura sugere que partículas na faixa de tamanho de cento e poucos nanometros preferenciaimeriíe divide-se em tumores pelos vasos sanguíneos rompidos no ponto do tumor. Espera-se que as partículas coloi-dais de paclitaxe! na formulação de Capxol™ demonstrem um efeito de alvo preferenciai, reduzindo em muito os efeitos colaterais do paclitaxe! administrado na formulação BMS.

Exemolo 65 Perfil da Configuração do Teste Clinico com Capxol™ Indicação: Câncer de Mama Metastásico Plano cie dosagem: O fundamento para seleção da dose inicial para testes da Fase l/ll será baseado nos dados de toxicidade pré-clínicos signiflcantemente mais baixos (dados LD10 da dose única em camundongos) para formulação de Capxol™ comparado com a formulação BMS. A LD-io da ciose única em camundongos e determinada como 398,1 mg/kg. A conversão desta dose em uma base de área superficial (3 vezes o vaior mg/kg) confere uma estimativa de 1194,3 ou cerca de 1200 mg/m2. Uma dose inicial conservadora 1/10 deste vaior para humanos resulta numa dose de 120 mg/m2. Contudo, já está bem estabelecido que o paclitaxel é seguro a uma dose de 175 mg/m2, e com base num estude· piloto com Capxol™ mostrando mielossupressão mais baixa em raios, uma dose de 175 mg/m2 deve ser segura para a formulação de Capxoi™. A. solução de Capxol™ será liberada em aproximadamente 15-30 minutos ou menos, caso possível.

Exemplo 66 Períií do Programa de Desenvolvimento Clinico do Capxol™ Estudo de Descoberta de Dosagem na Combinação de Fase l/il/Teste de Eficácia Limitada Pacientes/finalldade: Pacientes com doença metastásica de mama avançada, refratários a terapias padrão. A meta deste teste será estabelecer a velocidade de resposta para Capxol™ como um único agente em pacientes com câncer de mama em metástase.

Dosagem - Componente de Fase I: A dose inicia! a ser usada no componente de Fase I do teste será a dose máxima tolerada (MTD) para Paclitaxel (175 mg/nrr). Doses subseqüentes serão incrementadas em 25% em etapas, até que seja atingido a MTD. Terão 3 pacientes de cada nível das dosagens iniciais de CapxolT*, expandindo a 6 pacientes no MTD. A capacidade para deslocamento ao nível de dose próximo será baseada no padrão de eventos adversos. Ou seja, o estudo será descontinuado sempre que 2 ou mais pacientes, dentre 6 em um nível de dose particular, apresentem toxicidade não-mieiossupressiva de Grais 3 ou toxicidade mielossupres-siva de Grau 4 (na escala de Toxicidade VVHO). A dose para Capxol™ será designada como a dose imediatamente precedente da dose á qual o teste foi descontinuado. Programas alternativos de administração de droga, tais como infusões diárias x 5 ou 24 horas, podem também ser explorados, caso necessário, com base nos resultados do programe-: inicial de baios de dose única.

Farmacocinética: Para pacientes selecionados, um estudo completo íarmacociné-tico será realizado usando soro retirado em apropriados períodos de tempo designados. Os parâmetros tais como t'/2 (fase a e β) AUC, Cma·:, liberação e volume de distribuição serão determinados.

Pacientes - Componente de Fase II: Com a fixação da MTD, os pacientes com câncer de marna similar ao utilizado nos testes de Paclitaxel originais serão selecionados para componentes de Fase li. O número será baseado no desejo em se fixar uma velocidade de resposta tumoral com precisão aceitávei ao nível de segurança de 95%. Assim, o estudo será unicamente arquitetado com o objetivo de estabelecer equivalência com o Pa-clitaxe! padrão, mostrando que o intervalo de confiança contém as velocidades de resposta esperadas para Capxol™. A quantidade para a amostia de paciente usada será de 30 pacientes, que é comum para o componente de Fase li de um estudo de Fase l/ll.

Medição: O primeiro resultado será a velocidade de resposta tumoral (CR/PR) para os pacientes listados. Além disso, o tempo para a resposta, duração da resposta, e tempo de sobrevivência, serão monitorados. A segu- rança do tratamento também será avaliada por avaliações de ocorrências adversas e alterações nos parâmetros laboratoriais padrão.

REIVINDICAÇÕES

Claims (22)

1. Formulação líquida, caracterizada pelo fato de que compreende água e nanopartículas compreendendo paclitaxel e, como envoltório pro-teico, albumina, em que o paclitaxel está em uma concentração entre 5 mg/ml e 15 mg/ml, em que a formulação é estável por pelo menos três dias sob pelo menos uma dentre temperatura ambiente ou condições refrigeradas, em que as nanopartículas são menores do que 200 nm em diâmetro, em que as nanopartículas apresentam um envoltório polimérico que é fino quando comparado ao diâmetro da partícula revestida, em que a formulação é essencialmente isenta de tensoativos, e em que a formulação é essencialmente isenta de agentes solubi- : lizantes.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que formulação é ressuspensa em um líquido aquoso biocompa-tível. |

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as nanopartículas são filtráveis por um filtro de 0,22 ; micron. ■

4. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada ; pelo fato de que as nanopartículas têm uma faixa de tamanho de 10-200 nm.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as nanopartículas têm uma faixa de tamanho de 50 a 170 nm.

6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as nanopartículas são esterilmente filtradas.

7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o paclitaxel na nanopartícula é amorfo.

8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as nanopartículas têm um núcleo que é substancialmente livre de uma matriz polimérica.

9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a albumina é albumina de soro humano.

10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que está em um volume inferior a 250 mL.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que está em um volume inferior a 150 mL.

12. Formulação de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que está em um volume inferior a 60 mL.

13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer.

14. Formulação de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer pancreático, ou tumor cerebral.

15. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento da restenose.

16. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o dito paclitaxel é administrado oralmente, intramuscularmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intra-arterialmente, intra-uretralmente, intratecalmente ou por inalação.

17. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que é seguramente administrada utilizando-se equipamento médico selecionado dentre o grupo consistindo em tubo, cateter, saco para infusão, garrafa e seringa.

18. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que é administrada sem o uso de um filtro em linha.

19. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que é uma suspensão aquosa estável reconstituída a partir de um pó liofilizado estéril.

20. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende paclitaxel em uma concentração de 5 mg/mL.

21. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que há substancialmente ausência de precipitação de paclitaxel por pelo menos três dias sob pelo menos uma dentre temperatura ambiente ou condições refrigeradas.

22. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o tamanho médio da nanopartícula substancialmente não se altera por pelo menos três dias sob pelo menos uma dentre temperatura ambiente ou condições refrigeradas.