BRPI9816319B1 - métodos para produção de material de propagação e produtos de colheita de uma planta contendo células de planta que contêm uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína com a atividade enzimática de uma frutosil transferase (fft) - Google Patents
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Abstract
métodos para fabricação de frutosil transferase (fft), célula hospedeira transformada, célula de planta transgênica, um tecido de planta transgênica ou planta transgênica, para produção de material de propagação e produtos de colheita de uma planta. as moléculas de ácido nucléico são descritas codificando proteinas com uma atividade enzímática de frutosil transferase. estas enzimas são frutosil transferases (fft). além disso, vetores e células hospedeiras são descritos contendo as molécuias de ácido nucléico da invenção, particularmente células de plantas transformadas, tecido de planta e plantas regeneráveis a partir daí, que expressam o fft descrito. além disso, processos para a produção de inulina de cadeia longa por uso de proteínas descritas, hospedeiros, particularmente as células de plantas e/ou fft produzido pelas mesmas, são descritos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE MATERIAL DE PROPAGAÇÃO E PRODUTOS DE COLHEITA DE UMA PLANTA CONTENDO CÉLULAS DE PLANTA QUE CONTÊM UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO CODIFICANDO UMA PROTEÍNA COM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE UMA FRUTOSIL TRANSFERASE (FFT)".
Pedido dividido do PI 9813968-1, depositado em 06.11.1998. A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico codificando proteínas com a atividade enzimática de uma frutosil transferase (FFT). A invenção também se refere a vetores contendo estas moléculas de ácido nucléico assim como a células hospedeiras transformadas com referidas moléculas de ácido nucléico, particularmente células de planta, tecido de plantas, e plantas. Além disso, processos para a produção de plantas trans-gênicas são descritos que sintetizam inulina de cadeia longa devido à introdução de moléculas de ácido nucléico codificando um FFT. A presente invenção também se refere a processos para produzir FFT e à produção de inulina de cadeia longa em vários organismos hospedeiros, particularmente plantas, assim como em processos in vitro para produzir inulina de cadeia longa por meio de FFT da invenção. A presente invenção ainda refere-se às células hospedeiras da invenção e à inulina obtenível pelos processos da presente invenção.
Os polímeros lineares, solúveis em água, permitem várias aplicações, por exemplo para aumentar a viscosidade em sistemas aquosos, como detergentes, como agentes de suspensão ou para acelerar a sedimentação, para complexar e, no entanto, também para ligar água. Os polímeros que são baseados em sacarídeos, como frutosil polissacarídeos, são matérias-primas particularmente interessantes como são biodegradáveis.
Além de sua aplicação como matérias-primas regeneráveis para a produção industrial e processamento, polímeros de frutosila são também considerados como aditivos em alimentos, por exemplo como adoçantes. Para vários usos, polímeros com variados comprimentos de cadeia são necessários. Apesar de polímeros de cadeia curta e média serem particular- mente preferidos na indústria de processamento de alimentos, polímeros com um alto grau de polimerização (DP) são necessários para uso técnico, como a produção de tensoativos.
Assim, somente processos para produzir polissacarídeos de fru-tan de cadeia longa em plantas foram descritos em que frutosil transferases de origem bacteriana são espressas. A maior parte das frutosil transferases bacterianas sintetizam levano, um polímero frutosil ligado a β-2,6, que tem numerosas ramificações β-2,1. Devido às suas numerosas ramificações, levano tem desvantagens decisivas quando chega a processamento técnico e é, assim, consideravelmente menos significante como uma matéria-prima técnica do que inulina. Até agora, somente um gene bacteriano é conhecido, cujo produto genético está envolvido na síntese de inulina, ou seja o gene ftf de Streptococcus mutans. É possível, em princípio, expressar o gene em plantas, se o gene tiver sido previamente geneticamente engenheirado. No entanto, o rendimento em inulina obtido de plantas transgênicas é tão baixo que a utilização econômica das plantas transgênicas está fora de questão.
Além disso, um processo para produzir plantas transgênicas expressando frutosil transferases de Helianthus tuberosus é conhecido. A expressão destes genes em plantas transgênicas leva à produção de inulina com um grau médio de polimerização de DP=6 a DP=10. Os polímeros com este grau de polimerização podem não ser referidos como inulina de cadeia longa. Inulina com uma DP=6 a DP=10 médio é inapropriada para a maior parte dos usos técnicos.
Os processos para a produção econômica de inulina de cadeia longa em plantas ou para síntese de enzimas para a produção de inulina de cadeia longa não são conhecidos. PCT/US 89/02729 descreve a possibilidade de síntese de polímeros carboidratos, particularmente dextrano ou polifrutose, em células de plantas transgênicas, específicamente nas frutas de plantas transgênicas. A fim de produzir plantas modificadas deste modo, o uso de sucrases de levano a partir de microorganismos, particularmente de Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius e Bacillus subtilis, ou de sucrases de dextrano de Leuconostoc mesenteroides, é proposto. Nem a formação das enzimas ativas nem de levano ou dextrano ou a produção de plantas transgênicas é descrita. PCT/EP 93/02110 descreve um processo para produzir plantas transgênicas expressando o gene Isç de sucrase de levano da bactéria gram negativa Erwinia amylovora. As plantas produzem um levano fortemente ramificado, de alto peso molecular. PCT/NL 93/00279 descreve a transformação de plantas com genes quiméricos contendo o gene sacB de Bacillus subtilis ou o gene ftf de Streptococcus mutans. As plantas transgênicas expressando o gene sacB produzem um levano ramificado. As plantas expressando o gene ftf sintetizam inulina de alto peso molecular, o rendimento, no entanto, é tão baixo que a utilização econômica não é possível. PCT/NL 96/00012 descreve seqüências de DNA codificando enzimas sintetizando polímeros carboidratos assim como a produção de plantas transgênicas por meio destas seqüências de DNA. As seqüências descritas são derivadas de Helianthus tuberosus. De acordo com PCT/NL 96/00012, as seqüências descritas podem ser usadas a fim de modificar o perfil de frutan de petúnia e batata, mas também de próprio Helianthus tuberosus. Quando expressando o SST e o gene FFT em plantas transgênicas, é possível produzir inulina. O grau médio de polimerização de inulina, no entanto, está na faixa entre DP=6 e DP=10. A produção de inulina de alto peso molecular não é possível por meio do processo descrito em PCT/NL 96/00012. PCT/EP 97/02195 descreve um processo para produzir plantas transgênicas, produzindo inulina, por meio do gene ftf de Streptococcus mutans. O rendimento de inulina de alto peso molecular é baixo, como é o caso com as plantas descritas em PCT/NL 93/00279. DE 197 08 774.4 descreve a produção de inulina de cadeia curta por meio de enzimas demonstrando atividade de frutosil polimera-se. A inulina de cadeia curta pode ser produzida em plantas transgênicas. O rendimento de inulina de cadeia curta é alto e em batata corresponde ao teor celular de sacarose. A produção de inulina de cadeia longa, no entanto, não é descrita. A síntese de inulina em plantas foi completamente examinada (Pollock & Chatterton, Fructans, The Biochemistry of Plants, vol. 14 (1988), Academic Press, pp. 109-140). No entanto, a inulina de ocorrência natural em plantas é frutan de cadeia curta com um grau máximo de polimerização de aproximadamente DP = 35 (Pollock & Chatterton, 1988, loc.cit). A síntese e metabolismo de frutans em planta são baseados na atividade de pelo menos três enzimas, uma sacarose frutosil transferase dependente de sacarose (SST) formando a cestose de três sacarídeos, uma frutan-frutosil transferase dependente de frutan (FFT) que transfere resíduos de frutosil de moléculas de frutan com um grau mínimo de polimerização de DP = 3 (cestose) para sacarose e frutans superiores, e uma frutan exohidrolase (FEH) que remove resíduos de frutose de moléculas de frutan. Não se sabe se diferenças em peso molecular médio da inulina em várias espécies de plantas, por exemplo cerca de 2x103 no caso de Allium cepa e 5 x103 no caso de Helianthus tube-rosus, são baseados nas diferentes propriedades de seus SST, FFT ou FEH.
Por esta razão, é agora possível em vista do presente conhecimento com relação à síntese de inulina em plantas identificar seqüências de DNA apropriadas por meio do que inulina de alto peso molecular pode ser sintetizada em plantas em quantidades economicamente interessantes.
Assim, o problema técnico subjacente à presente invenção é prover moléculas de ácido nucléico e processos que permitem a produção de organismos geneticamente modificados, particularmente plantas, capazes de formar inulina de cadeia longa.
Este problema é resolvido pela provisão das formas de realização caracterizadas nas reivindicações.
Assim, a presente invenção se refere a moléculas de ácido nucléico codificando proteínas com atividade enzimática de um FFT, selecionado dentre o grupo consistindo em : (a) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido indicada sob SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4; (b) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos indicada sob SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência de ribonucleotídeo correspondente, (c) moléculas de ácido nucléico hibridizando para um filamento complementar da molécula de ácido nucléico sob (a) ou (b) sob condições estringentes, e (d) moléculas de ácido nucléico compreendendo um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c).
No contexto da presente invenção, uma frutosil transferase (FFT) é uma proteína capaz de catalisar a formação de ligações β- 2,1- gli-cosídicas e/ou β-2,6- glicosídicas entre unidades frutose. Assim, um resíduo de frutosila a ser transferido pode ser derivado de 1-cestose ou de um polímero frutan. Em conexão com a presente invenção, um frutan de alto peso molecular é um polímero cujas moléculas contêm um número médio de mais que 20, preferivelmente mais que 25 e ainda mais preferivelmente pelo menos 32 resíduos frutosila. Além disso, o frutan de elevado peso molecular é preferivelmente um polímero cujas moléculas contém em média menos que 3000, mais preferivelmente menos que 300 e particularmente preferido menos que 100 resíduos frutosila. Os resíduos frutosila podem ser ou glicosidi-camente ligados por ligações β-2,1 ou por ligações β- 2,6. No caso de inuli-na, os resíduos são geralmente ligados por ligações glicosídicas β-2,1. Em um baixo grau, também ligações β-2,6 podem ocorrer, particularmente em menos que 5%, preferivelmente em menos que 3%, mais preferivelmente em menos que 1,5% e mais preferivelmente em menos que 0,5%. O polímero frutosila pode transportar, em sua extremidade, um resíduo glucose que é ligado via o grupo C1- OH da glucose e o grupo OH C-2 de um resíduo frutosila. Neste caso, uma molécula de sacarose está também contida no polímero frutosila.
De modo surpreendente, altas quantidades de inulina de alto peso molecular são formadas durante a expressão de moléculas de ácido nucléico da invenção em plantas transformadas. A inulina formada nas plantas demonstra um grau médio de polimerização de claramente mais que DP = 20. Isto foi inesperado porque uma enzima similar de Helianthus tuberosus está envolvida na síntese de inulina com um grau médio de polimerização de menos que DP = 20 em plantas transgênicas (PCT/NL 96/00012).
As moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser moléculas de DNA assim como RNA. As moléculas de DNA correspondentes são por exemplo moléculas de DNA ou cDNA genômicas. As moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas de fontes naturais, preferivelmente de alcachofra, ou podem ser sintetizadas de acordo com processos conhecidos. Por meio de técnicas de biologia molecular convencionais, é possível (ver por exemplo Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) introduzir várias mutações nas moléculas de ácido nucléico da invenção, que leva à síntese de proteínas com propriedades biológicas provavelmente modificadas. Neste aspecto, é possível, por um lado, produzir mutan-tes de deleção, em que moléculas de ácido nucléico são produzidas ao prosseguir com deleções na extremidade 5'ou 3' da seqüência de DNA de codificação. Estas moléculas de ácido nucléico levam à síntese de proteínas correspondentemente encurtadas. Por meio destas deleções na extremidade 5' da seqüência de nucleotídeos, é por exemplo possível identificar seqüên-cias de aminoácidos que são responsáveis pela translocação da enzima no vacúolo (peptídeos de trânsito). Isto permite a produção marcada de enzimas que, devido à remoção das seqüências correspondentes, não estão mais localizadas no vacúolo mas dentro do citosol, ou em outros compartimentos devido à adição de outras seqüências de sinal.
Por outro lado, é também concebível introduzir mutações de ponto em posições em que uma modificação da seqüência de aminoácido por exemplo influencia a atividade da enzima ou a regulagem da enzima. Deste modo, por exemplo, mutantes podem ser produzidos que demonstram um valor Km modificado, ou que não são mais o assunto de mecanismos de regulagem ocorrendo na célula, como regulagem aloestérica ou modificação covalente.
Além disso, mutantes podem ser produzidos que demonstram um substrato modificado ou produzem especificidade. Além disso, mutantes com um perfil de temperatura-atividade modificado podem ser produzidos.
Para manipulação de DNA recombinante em células procarióti- cas, as moléculas de ácido nucléico da invenção ou partes destas moléculas podem ser inseridas nos plasmídeos que permitem uma mutagênese ou uma modificação de seqüência por recombinação de seqüências de DNA. Por meio de técnicas padrão, (conforme Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) as trocas de base que podem ser realizadas de seqüências naturais ou sintéticas podem ser adicionadas. A fim de ligar os fragmentos de DNA uns aos outros, adaptadores ou ligadores podem ser conectados com os fragmentos. Além disso, manipulações podem ser usadas que provêem sítios de restrição apropriados ou que removem DNA supérfluo ou sítios de restrição. Se se puder usar inserções, deleções ou substituições, mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição ou ligação podem ser usados. Como processo de análise, pode-se usar geralmente análise de seqüência, análise de restrição, ou outros processos bio-químicos-moleculares-biológicos.
No contexto da presente invenção, o termo "hibridização" significa hibridização sob condições convencionais, preferivelmente sob condições estringentes, como descrito por exemplo Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Um exemplo para condições de hibridização estringentes é uma hibridização em 50% de formamida, 5x SSC, 5 x solução de Denhardt, 40 mM de fosfato de sódio pH 6,8, 0,5% (p/v) BSA, 1% (p/v) SDS, 0,1 mg/ml DNA de esperma de arenque, a 42 °C. Um exemplo para condições de hibridização não estringentes, convencionais, é uma hibridização sob as condições acima mencionadas em que, no entanto, 30% de formamida são usados em vez de 50%. As condições de lavagem no caso de condições estringentes são preferivelmente 0,5 x SSC/0,5% SDS a 60 °C e no caso de condições não estringentes, preferivelmente 2 x SSC/0,5% SDS a 56 °C.
As moléculas de ácido nucléico que hibridizam nas moléculas da invenção podem, por exemplo, ser isoladas de bibliotecas de cDNA ou de genômicas produzidas a partir de organismos correspondentes, como alca-chofra.
Estas moléculas de ácido nucléico podem ser identificadas e isoladas por uso de moléculas da invenção ou partes destas moléculas, ou conforme o caso, os complementos reversos destas moléculas, por exemplo, por hibridização de acordo com técnicas padrão (ver, por exemplo Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Como sonda de hibridização, por exemplo, moléculas de ácido nucléico podem ser usadas que demonstram exatamente ou basicamente a seqüência de nucleotídeo indicada sob SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou partes da mesma. Os fragmentos usados como sonda de hibridização também podem ser fragmentos sintéticos produzidos por meio de técnicas de síntese comuns, e cuja seqüência é basicamente similar à de molécula de ácido nucléico da invenção.
As moléculas que hibridizam nas moléculas de ácido nucléico da invenção também compreendem fragmentos, derivados e variantes alélicos, de moléculas de ácido nucléico acima descritas codificando uma proteína da invenção. "Fragmentos" são supostos para ser partes das moléculas de ácido nucléico que são longas o suficiente a fim de codificar uma proteína da invenção. Neste contexto, o termo "derivado" significa que as seqüências destas moléculas diferem das seqüências das moléculas de ácido nucléico acima descritas em uma ou mais posições. No entanto, elas demonstram um alto grau de homologia nestas seqüências. Homologia significa uma identidade de seqüência de pelo menos 40%, particularmente uma identidade de pelo menos 60%, preferivelmente não mais que 80% e mais preferivelmente de mais que 90%. As proteínas codificadas por estas moléculas de ácido nucléico demonstram uma identidade de seqüência para a seqüência de a-minoácido indicada sob SEQ ID NO: 2 de, pelo menos 80%, preferivelmente 85%, e particularmente preferido de mais que 90%, mais preferido de mais que 95%, ainda mais preferido de mais que 97% e mais preferido de mais que 99%. Os desvios de moléculas de ácido nucléico acima descritas podem, por exemplo, resuitar de deleção, substituição, inserção e/ou recombi-nação.
As moléculas de ácido nucléico que são homologas às molécu- Ias acima descritas e representam derivados destas moléculas, são geralmente variações destas moléculas representando modificações com a mesma função biológica. Estas podem ser variações de ocorrência natural, por exemplo sequências de outros organismos, ou mutações, assim estas mutações podem ter ocorrido naturalmente ou podem ter sido introduzidas por meio de mutagênese marcada. Além disso, as variações podem ser seqüên-cias sinteticamente produzidas. Os variantes alélicos podem ser ou variantes de ocorrência natural ou variantes produzidos de modo sintético ou recombi-nante. As proteínas codificadas pelos vários variantes de moléculas de ácido nucléico da invenção demonstram algumas características comuns como atividade de enzima, peso molecular, reatividade imunológica, ou conformação ou propriedades físicas, como a mobilidade em eletroforese de gel, características cromatográficas, coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedades espectroscópicas, estabilidade, ótimo de pH, ótimo de temperatura, etc.
Em uma forma de realização preferida, as seqüências de ácido nucléico da invenção são derivadas de alcachofra (Cynara scolymus). A invenção ainda se refere a vetores contendo as moléculas de ácido nucléico da invenção. Estes são preferivelmente plasmídeos, cosmí-deos, vírus, bacteriofagos e outros vetores comuns em tecnologia de genes.
Dentro do vetor da invenção, a molécula de ácido nucléico da invenção é preferivelmente ligada de modo operativo a elementos regulató-rios, que asseguram a transcrição e síntese de um RNA traduzível em células procarióticas e/ou eucarióticas.
Os vetores de expressão da invenção permitem a produção de inulina de cadeia longa em vários organismos hospedeiros, particularmente em células procarióticas ou eucarióticas, como bactérias, fungos, algas, células de animais, e preferivelmente células de plantas e plantas. Os organismos hospedeiros preferidos são particularmente leveduras como por e-xemplo S. cerevisiae, e bactérias de ácido láctico como Streptococcus ther-mophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis. S. cremoris, Lacto-bacillus acidophilus, e Leuconostoc cremoris. As enzimas codificadas podem provavelmente também ser usadas fora dos organismos hospedeiros para a produção de inulina de cadeia longa. As células de plantas são particularmente preferidas.
Um estudo com relação a vários sistemas de expressão pode ser encontrado em por exemplo Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544), Sawers et al., Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9, Bilemann-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-504, Hockney, Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463, e Griffiths et al., Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440. Sistemas de expressão para leveduras foram descritos em Hensing et al, Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279, Bussineau et al., Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19, Gellissen et al, Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer, Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496, Vedvick, Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745, e em Buckholz, Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072. Vetores de expressão foram descritos em uma grande extensão na técnica anterior. Além de um gene marcador de seleção e uma origem de replicação assegurando repiicação no hospedeiro selecionado, eles geralmente contêm um promotor viral ou bacteriano e, na maior parte dos casos, um sinal de terminação para transcrição. Se tem pelo menos um sítio de restrição ou um poliligador entre o promotor e o sinal de terminação que permite inserir uma seqüência de DNA de codificação. Se for ativa no organismo hospedeiro selecionado, a seqüência de DNA controlando naturalmente a transcrição do gene correspondente pode ser usada como uma seqüência de promotor. Esta seqüência também pode ser mudada com outras seqüências de promotor. Pode-se também usar promotores que levam a uma expressão constitutiva do gene, assim como de promotores indutíveis permitindo uma regulagem marcada da expressão do gene a jusante. As seqüências de promotor viral e bacteriano com estas propriedades foram extensivamente descritas na técnica anterior. As seqüências regulatórias para a expressão em microorganismos (como E. coli, S. cerevisiae) foram descritas de modo suficiente na técnica anterior. Promotores que permitem uma expressão particularmente forte do gene a jusante são, por exemplo, o promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), la-cuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez e Chamberlin (eds.), Pro-moters, Structure and Function; Praeger, New York (1 982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1 983), 21-25), λ p1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100). Geralmente, as quantidades de proteína são maiores do meio para o final da fase logarítmica do ciclo de crescimento dos microorganismos. Por esta razão, os promotores indutíveis são preferivelmente usados para a síntese de proteínas. Estes levam com freqüência a maiores rendimentos de proteína do que promotores constitutivos. O uso de promotores fortemente constitutivos com freqüência leva, via a transcrição permanente e tradução do gene clonado, à perda de energia para outras funções de célula essenciais, que retarda o crescimento da célula (Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademis-cher Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, p. 342). Assim, a fim de alcançar uma quantidade ótima de proteína, um processo em dois estágios é com freqüência usado. Primeiro, as células hospedeiras são cultivadas sob condições ótimas, até uma densidade de célula relativamente alta ser obtida. No segundo estágio, a transcrição é induzida dependendo do tipo de promotor usado. Neste contexto, um promotor tac indutível por lactose ou IPTG (= i-sopropil-β D- tiogalacto-piranosídeo) é particularmente apropriado (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983), 21-25). Os sinais de terminação para a transcrição são também descritos na técnica anterior. A transformação da célula hospedeira com o DNA codificando proteína correspondente pode ser geralmente realizada por meio de técnicas padrão, como descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2a. ed (1989), Cold Spring Harbor Press, New York). O cultivo de células hospedeiras ocorre em meio nutriente que corresponde às exigências respectivas das células hospedeiras usadas, particularmente considerando o valor de pH, temperatura, concentração de sal, ventilação, antibióticos, vitaminas, elementos de traço, etc. A purificação da enzima produzida pelas células hospedeiras pode ser realizada por meio de técnicas de purificação convencionais como precipitação, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, filtra-ção de gel, cromatografia de fase reversa HPLC, etc.
Modificando o DNA expressado nas células hospedeiras, um polipeptídeo pode ser produzido na célula hospedeira que pode ser mais fácil isolada do meio de cultura devido a certas propriedades. Assim, existe a possibilidade de expressar a proteína a ser expressada como uma proteína de fusão com uma outra seqüência de polipeptídeo, as propriedades de ligação específicas da qual permitem o isolamento da proteína de fusão via cromatografia de afinidade (por exemplo, Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).
Para expressão em células de planta, prefere-se elementos re-gulatórios do promotor B33 de patatina. Outros promotores preferidos são o promotor 35S CaMV e o promotor do gene de desidrogenase de álcool de Saccharomyces cerevisiae.
Os vetores da invenção podem possuir outras unidades funcionais que estabilizam o vetor em um organismo hospedeiro, por exemplo uma origem de replicação bacteriana ou o DNA de 2 mícrons para estabilização em Saccharomyces cerevisiae. Além do mais, eles podem conter seqüên-cias de borda direita e esquerda de T-DNA agrobacteriano, possibilitando assim uma integração estável no genoma das plantas.
Os vetores da invenção podem conter ainda terminadores funcionais, como o terminador do gene sintase de octopina de Agrobacteria.
Em outra forma de realização, a molécula de ácido nucléico da invenção é ligada a uma molécula de ácido nucléico no vetor da invenção, referida molécula de ácido nucléico codificando uma seqüência de sinal funcional, a fim de dirigir a enzima a vários compartimentos de células. Esta modificação pode, por exemplo, consistir em uma adição de uma seqüência de sinal N-terminai para a secreção no apoplasto de plantas superiores; no entanto, qualquer outra modificação levando à fusão de uma seqüência de sinal no FFT codificado também é uma matéria objeto da invenção. A molécula de ácido nucléico contida no vetor da invenção pode, em particular, con- ter uma sequência codificando uma sequência de aminoácidos que causa secreção. Neste contexto, usa-se, preferivelmente, o peptídeo de sinal de a-cGTase de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) ou de um peptídeo de sinal uma vez que ele é codificado pelos nucleotídeos 11529-11618 da seqüência com o número de acesso gene bank X 86014.
Em uma forma de realização particularmente preferida, a invenção se refere aos plasmídeos p35-csFFT e p33-csFFT, cuja construção é descrita nos exemplos (figuras 2 e 4).
Em uma outra forma de realização, a invenção se refere a células hospedeiras, que, transientemente ou estavelmente, contêm as moléculas de ácido nucléico ou vetores da invenção ou são derivadas destas células. Neste contexto, uma célula hospedeira é um organismo capaz de absorver DNA recombinado in vitro e, se aplicável, de sintetizar as proteínas codificadas pelas moléculas de ácido nucléico da invenção. As células hospedeiras podem ser células procarióticas bem como eucarióticas. Elas podem, em particular, ser microorganismos. No contexto da presente invenção, estes são todas as bactérias e protistas (como fungos, em particular leveduras e algas) como definidos, por exemplo, em Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2). Em conexão com organismos hospedeiros procarióticos, deve ser notado que influência positiva de inulina no crescimento de certos microorganismos, como bactérias bifido, do trato intestinal humano é mostrada com sucesso. Às bactérias bifido foi atribuído um efeito saudável (ver, por exemplo, Gibson et al., Int. Sugar J. 96 (1994), 381-386; Roberfroid et al., J. of Nutrition 128 (1998), 11-19). Um efeito de inibição de tumor também foi discutido (ver, por exemplo, Reddy et al., Carcinogenesis 18 (1997), 1371-1374; Singh et al., Carcinogenesis 18 (1997), 833-841). Por esta razão, as células hospedeiras da invenção como levedura (pão) ou bactérias de ácido láctico (iogurte, leitelho etc.) são apropriadas para uso na indústria de processamento de alimentos.
Em uma forma de realização particularmente preferida, uma célula hospedeira da invenção contém, adicionalmente, um gene codificando uma sacarose frutosil transferase dependente de sacarose (SST). Estas se-qüências foram, por exemplo, isoladas de alcachofra (pedido de patente a-lemã DE-A1 197 08 774), Cichorium intibus (de Halleux et al., Plant Physiol. 113 (1997), 1003-1013), Helianthus tuberosus (WO 96/21023) e Allium cepa (Vijn et al., Plant Physiol. 117(1998), 1507-1513). A invenção se refere, em particular, a células de plantas trans-gênicas transformadas com uma molécula de ácido nucléico da invenção ou contendo os sistemas de vetor da invenção ou derivados ou partes dos mesmos. Estes são capazes de sintetizar enzimas para a produção de inuli-na de cadeia longa devido à introdução dos sistemas de vetor da invenção, derivados ou partes do sistema de vetor. As células da invenção são, preferivelmente, caracterizadas em que a molécula de ácido nucléico da invenção introduzida tanto é heteróloga com respeito à célula transformada, isto é, não ocorre naturalmente nestas células, como está localizada em uma posição diferente no genoma do que a seqüência de ocorrência natural respectiva. Além disso, uma célula de planta transgênica da invenção contém, preferivelmente, uma seqüência de DNA codificando um SST. A presente invenção ainda se refere a proteínas codificadas pelas moléculas de ácido nucléico da invenção, bem como a processos para sua produção, em que a célula hospedeira da invenção é cultivada sob condições que permitem a síntese da proteína. A proteína é subseqüentemente isolada das células cultivadas e/ou do meio de cultura. A invenção se refere ainda a um FFT obtenível da célula hospedeira da invenção ou por um processo da invenção. A invenção se refere ainda a moléculas de ácido nucléico que, especificamente, hibridizam em uma molécula de ácido nucléico da invenção, a uma molécula complementar à mesma ou a uma parte destas moléculas. Existem, preferivelmente, oligonucleotídeos com um comprimento de pelo menos 10, em particular de pelo menos 15 e, particularmente preferido, de pelo menos 50 nucleotídeos. Os oligonucleotídeos da invenção podem, por exemplo, ser usados como iniciadores para uma reação PCR. Eles também podem ser componentes de construções anti-sentido ou de moléculas de DNA codificando ribozimas apropriadas. A presente invenção se refere também a um processo para a produção de células de plantas transgênicas e plantas compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucléico ou vetor da invenção em células de plantas, tecidos de plantas e plantas. Provendo as moléculas de ácido nucléico da invenção, é possível, por meio de técnicas de DNA recombinan-te, produzir inulina de cadeia longa em vários organismos, em particular em plantas, como foi até agora impossível por meio de processos convencionais, por exemplo, de reprodução. Aumentando a atividade de FFT da invenção, por exemplo superexpressando as moléculas de ácido nucléico da invenção, ou provendo mutantes que não são mais submetidos a mecanismos de regulação de células específicos e/ou demonstram dependências de temperatura distintas com respeito à sua atividade, é possível aumentar o rendimento de plantas correspondentemente modificadas por meio de técnicas de DNA recombinantes.
Assim, é possível expressar as moléculas de ácido nucléico da invenção em células de planta a fim de aumentar a atividade do FTT correspondente, ou introduzir o mesmo em células que não expressam normalmente esta enzima. Além do mais, é possível modificar as moléculas de ácido nucléico da invenção de acordo com processos conhecidos dos versados na técnica, a fim de obter os FFTs da invenção que não são mais submetidos a mecanismos de regulação de células específicos ou que demonstram dependências de temperatura modificadas, especificidades de substrato ou produto.
Para este fim, o versado na técnica pode utilizar vários sistemas de transformação de plantas. Assim, o uso de T-DNA para transformar células de planta é intensamente examinado e descrito em EP-A-120 516; Hoe-kema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblas-serdam (1985), capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 e An, EMBO J. 4(1985), 277-287.
Para transferir o DNA em células de planta, explantes de planta podem ser apropriadamente cultivados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Do material de planta infectado (por exemplo, pedaços de folhas, segmentos de caule, raízes, mas também protoplastos ou células de planta cultivadas em suspensão), plantas totais podem, então, ser regeneradas em um meio apropriado que pode conter antibióticos ou biocidas para a seleção de células transformadas. A planta obtida deste modo pode então ser examinada como se o DNA introduzido estivesse presente ou não. Outras possibilidades a fim de introduzir DNA estranho usando o processo biolístico ou transformando protoplastos são conhecidas dos versados na técnica (conforme, por exemplo, Willmitzer, L., 1993 Transgenic plantas. Em: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, a. Pühler, P. Stadler, editores), vol. 2, 627-659, VCH Wein-heim-New York-Basel-Cambridge).
Sistemas alternativos para a transformação de plantas monocoti-ledôneas são a transformação por meio da abordagem biolística, a absorção de DNA em protoplastos eletricamente ou quimicamente, a eletroporação de células parcialmente permeabilizadas, a macroinjeção de DNA em influores-cências, a microinjeção de DNA em microesporos e pró-embriões por meio de intumescimento (ver, por exemplo, Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571-582; Paszkowski, Biotechnology 24 (1992), 387-392). Enquanto a transformação de plantas dicotiledôneas por sistemas Ti-plasmídeo-vetor por meio de A-grobacterium tumefaciens é um processo bem estabelecido, estudos mais recentes indicam que a transformação com vetores baseados em Agrobacte-rium pode também ser usada no caso de plantas monocotiledôneas (Chan et al„ Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048). Três dos sistemas de transformação mencionados acima foram estabelecidos no passado para vários tipos de cereais: eletroporação de tecido de planta, transformação de protoplastos e a transferência de DNA por bombardeio de partícula em tecido re-generável e células (estudo dado em: Jãhne et al., Euphytica 85 (1995), 35-44). Na literatura correspondente, a transformação de trigo é descrita de vá- rios modos (estudado em Maheshwari et al., Criticai Reviews in Plant Science 14(2)(1995), 149-178).
Quando expressando as moléculas de ácido nucléico da invenção em plantas é, em princípio, possível que a proteína sintetizada pode estar localizada em qualquer compartimento desejado da célula de planta. A fim de obter a localização em um compartimento particular, a seqüência assegurando a localização no vacúolo deve ser deletada e a região de codificação restante deve, opcionalmente, ser ligada a seqüências de DNA que asseguram a localização no compartimento respectivo. Estas seqüências são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Braum, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29). A presente invenção também se refere a células de plantas transgênicas, tecido de plantas e plantas que foram transformadas com uma ou várias das moléculas de ácido nucléico da invenção, bem como a células de plantas transgênicas derivadas de células transformadas deste modo. Estas células podem conter uma ou várias das moléculas de ácido nucléico da invenção, em que esta/estas é/são preferivelmente ligadas a elementos de DNA regulatório que asseguram transcrição em células de plantas, em particular com um promotor. Estas células diferem de células de plantas de ocorrência natural em que contêm pelo menos uma molécula de ácido nucléico da invenção que não ocorre naturalmente nestas células ou em que uma molécula é integrada em uma posição com o genoma da célula onde ela não ocorre naturalmente, isto é, em outro ambiente genômico. Uma vez que 1-cestose é o substrato natural de FFT e é por si mesmo formado na reação de uma sacarose frutosil transferase dependente de sacarose (SST) com a sacarose, é particularmente vantajoso e, provavelmente, necessário prover um SST separadamente da molécula de ácido nucléico, vetor ou FFT da invenção. Assim, em uma forma de realização preferida, a presente invenção se refere a células de plantas transgênicas, tecido de plantas ou plantas que contêm, adicionalmente, um gene codificando uma sacarose frutosil transferase dependente de sacarose (SST). Estas podem, por exemplo, ser plantas ou células de plantas que já expressam naturalmente um SST como chicória, Helianthus tuberosus, ou dália ou plantas em que uma seqüência de DNA codificando SST foi introduzida por meio de técnicas de DNA recombinante. Referida seqüência pode ter sido introduzida independentemente ou simultaneamente com uma molécula de ácido nucléico ou vetor da invenção.
As células de plantas transgênicas e tecidos de plantas podem ser regeneradas em plantas totais por meio de técnicas conhecidas dos versados na técnica. As plantas obteníveis regenerando as células de plantas transgênicas da invenção também são uma matéria objeto da presente invenção. Uma outra matéria objeto da invenção são plantas que contêm as células de plantas transgênicas descritas acima. As células de plantas transgênicas podem, em princípio, ser qualquer tipo desejado de espécies de planta, isto é, monocotiledôneas bem como dicotiledôneas. Elas são, preferivelmente, plantas úteis, em particular plantas contendo sacarose como arroz, milho, beterraba, cana-de-açúcar ou batata, plantas vegetais (por exemplo, tomate, cenoura, alho-poró, chicória etc.), forragem ou capim de pasto, batata doce, trigo, cevada, colza ou soja. A invenção se refere também a material de propagação e produtos coletados das plantas da invenção como frutas, sementes, tubérculos, rizoma, arbustos, corte, calos, culturas de células, etc.
Uma outra matéria objeto da invenção é a inulina de cadeia longa obtenível de células hospedeiras da invenção, em particular de células de plantas transgênicas, tecidos de plantas, plantas bem como do material de propagação e de produtos coletados.
Em outra forma de realização, a invenção se refere a processos para produzir inulina de cadeia longa compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira, particularmente uma célula de planta, tecido de planta ou uma planta da invenção, em condições que permitem a produção de FFT e a conversão de 1-cestose, opcionalmente fornecido do exterior, ou de uma substância equivalente em inulina de ca- deia longa; e (b) recuperar a inulina assim produzida das células hospedeiras cultivadas, em particular células de plantas, tecidos ou plantas, ou do meio. em uma forma de realização, a invenção se refere a um processo para a produção de inulina de cadeia longa compreendendo: (a) levar 1-cestose ou um substrato equivalente em contacto com um FFT da invenção em condições que permitem a conversão em inulina de cadeia longa; e (b) recuperara inulina assim produzida. A recuperação da inulina de várias fontes, em particular de tecido de planta, foi, por exemplo, descrita em Gibson et al., Int. Sugar J. 96 (1994), 381-386; Baxa, Czech J. Food Sei. 16 (1998), 72-76; EP-A-787 745; De Leenheer, Carbohydr. Org. Raw Mater. III, Workshop (1996), Meeting Date 1994, 67-92, Verlag VCH Weinheim, Alemanha e patente russa RU 2001621C1. A presente invenção se refere ainda a um processo in vitro para produzir inulina de cadeia longa usando a sacarose substrato e uma combinação de enzima de um SST e um FFT da invenção. Em uma outra forma de realização, a presente invenção se refere a um processo in vitro para produzir inulina usando uma mistura contendo oligômeros de frutosila e um FFT da invenção. Neste contexto, um oligômero de frutosila é um oligômero consistindo em unidades de frutose com um DP de aproximadamente 2 a 7 que pode demonstrar um resíduo de glucose e seu fim. Quando realizando o processo da invenção, proteínas produzidas recombinantemente são preferivelmente usadas. No contexto da presente invenção, existem proteínas que foram produzidas introduzindo a seqüência de DNA codificando a respectiva proteína em uma célula hospedeira e expressando a mesma nelas. A proteína pode, subsequentemente, ser recuperada da célula hospedeira e/ou do meio de cultura. A célula hospedeira é, preferivelmente, uma célula hospedeira da invenção como acima definida. Em uma forma de realização preferida do processo da invenção, enzimas são usadas, as quais foram produzidas recombinantemente e secretadas no meio de cultura pela célula hospe- deira, de modo que não é necessário romper as células ou ainda purificar a proteína, uma vez que a proteína secretada pode ser obtida do sobrenadan-te. A fim de remover os resíduos do meio de cultura, técnicas de processamento convencionais podem ser usadas como processos de diálise, osmose reversa, cromatográficos etc. O mesmo é verdadeiro para concentrar a proteína secretada no meio de cultura. A secreção de proteínas por microorganismos é normalmente mediada por peptídeos de sinal N-terminais (seqüên-cia de sinal, peptídeo líder). Proteínas com esta seqüência de sinal podem penetrar a membrana celular do microorganismo. Uma secreção de proteínas pode ser obtida ligando a seqüência de DNA codificando o peptídeo de sinal à região de codificação da enzima correspondente. Usa-se, preferivelmente, o peptídeo de sinal de α-CGTase de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fie-dler et al., J. Mol. Bioí. 256 (1996), 279-291) ou de um peptídeo de sinal como é o codificado pelos nucleotídeos 11529-11618 da seqüência depositada no gene bank com o número de acesso X86014. As enzimas usadas no processo da invenção podem, alternativamente, ser produzidas não usando microorganismos, mas por meio de um sistema de translação e transcrição in vitro que leva à expressão das proteínas. Em uma forma de realização preferida da invenção, o FFT é produzido de protoplastos do tecido de folha em plantas. A invenção ainda se refere à inulina, que pode ser formada de uma célula hospedeira, em particular uma célula de planta, tecido de planta ou uma planta da invenção ou do material de propagação ou do produto coletado das plantas e célutas de plantas da invenção ou que é obtenível por um dos processos da invenção descritos acima. Esta inulina pode, preferivelmente, ser usada a fim de produzir tensoativos para aumentar a viscosidade em sistemas aquosos, como detergente, como um agente de suspensão, para acelerar a precipitação, para complexar ou para água de ligação.
Estas e outras formas de realização foram descritas e são evidentes aos versados na técnica. Elas são compreendidas pela descrição e exemplos da presente invenção. Outra literatura que se refere a um dos processos mencionados acima, meios ou usos e que podem ser aplicados no sentido da presente invenção, pode ser tomada da técnica anterior, por exemplo, de bibliotecas públicas ou utilizando meios eletrônicos. Bases de dados públicas servem para este fim, como por exemplo "Medline" que pode ser acessado via Internet, por exemplo sob o endereço http://www.ncbi.nem.nih.gov/PubMed/medline.html. Outras bases de dados e endereços são conhecidos dos versados na técnica e podem ser tomados da Internet, por exemplo, sob o endereço http://www.lycos.com. Um exame de fontes e informações com respeito a patentes de biotecnologia ou pedidos de patente pode ser encontrado em Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
As figuras mostram: Figura 1 mostra a análise HPLC de um extrato de protoplasto completo. Os protoplastos foram transformados com vários vetores: A: a transformação foi realizada com vetor pA7 que não contém uma região de codificação fundida ao promotor 35S CaMV. B: a transformação se realiza com o vetor pA7-csFFT que contém a região de codificação de frutan:frutan frutosil transferase de alcachofra fundida ao promotor 35S CaMV. C: a transformação foi realizada com o vetor pA7-htFFT que contém a região de codificação da frutan:frutan frutosil transferase de Helianthus tuberosus como uma fusão no promotor 35S CaMV. Antes da análise, os extratos de protoplastos totais foram incubados em uma mistura de oligômeros de frutosila durante 12 h cada um. A análise foi realizada como descrito no exemplo 1.
Figura 2 mostra a construção do plasmídeo p35S-csFFT.
Figura 3 mostra a análise HPLC de plantas transgênicas que foram transformadas com a construção p35-csFFT. A análise mostra que moléculas de inulina de cadeia longa foram formadas em plantas transgênicas que expressam um SST bem como um FFT de alcachofra (35S-SST/FFT 22/19).
Figura 4 mostra a construção do plasmídeo p33-csFFT.
Figura 5 mostra a análise HPLC de plantas transgênicas que foram transformadas com a construção p33-csFFT. A análise mostra que moléculas de inulina de cadeia longa foram formadas em plantas transgêni- cas que expressam um SST bem como um FFT de alcachofra (B33-SST/FFT 47).
Os exemplos ilustram a invenção.
Exemplo 1: identificação, isolamento e caracterização de um cDNA codificando uma frutosil transferase de alcachofra (Cynara solymus) O RNA total foi isolado de receptáculos de alcachofra (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2- edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA). Poli(A)+ mRNA foi isolado por meio do sistema PolyATract de isolamento de mRNA (Promega Corporation, Madison, Wl, USA). DNA complementar (cDNA) foi produzido de 5 pg deste RNA por meio do kit de síntese cDNA-ΖΑΡ de Stratagene (Heidelberg), de acordo com as instruções do fabricante, e 2x106 clones de fato recombinante independentes foram obtidos. A biblioteca de cDNA ampliada foi triada de acordo com processos padrão em condições de estrin-gência baixa, por meio do fragmento de DNA rotulado com 32P correspondente ao cDNA de SST de alcachofra (fragmento Not I do plasmídeo pCy21, como descrito em DE 197 08 774.4). A seqüência do SST de alcachofra é descrita em DE 197 08 774.4. Clones positivos foram triados por meio da sonda de SST em estringência alta. Clones que reagiram positivamente durante esta triagem foram abandonados, uma vez que eram evidentemente cDNA de SST. Dos clones residuais, o inserto de cDNA foi isolado clivando o DNA do plasmídeo isolado em rotinas padrão por meio da enzima de restrição Notl e clonado no vetor pA7. As extremidades pegajosas do fragmento Notl foram cheias por meio da polimerase T4. Subseqüentemente, o fragmento foi ligado no sítio Smal de pA7. O vetor pA7 é um derivado de pUC18 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119), que contém um inserto do promotor 35S do vírus mosaico de couve-flor (nucleotídeo 7146 a 7464, de a-cordo com Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2871-2888) entre o sítio EcoRI e Saci do poliligador. À parte o promotor 35S, pA7 contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do T-DNA do plasmídeo Ti pTi ACH 5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846), nucleotídeos 11749 a 11939, que foi isolado como um fragmento Pvu II - Hind III do plasmídeo pAGV 40 (Herrera- Estrella, Nature 303 (1983), 209-213) e clonado entre o sítio Sphl e Hind III do poíiligador após adicionar ligadores Sph I ao sítio Pvu II.
Por meio dos derivados de pA7 que continham um cDNA de al-cachofra, protoplastos de tabaco foram transformados de acordo com o processo de Negrutiu (Plant Mol. Biol. 8, (1987), 363-373). Os protoplastos transformados foram cultivados no meio K3 (Nagy e Maliga, Z. Pflanzenphy-siologie 78 (1976), 453-455) a 25°C, durante dois dias, no escuro. Subsequentemente, os extratos de células foram obtidos por congelamento e des-congelamento repetidos. Os extratos foram incubados com oligofrutans (67,5% de 1-cestose, 28,4% de nistose, 3,6% de nistose de frutosila, 0,5% de sacarose), durante 12 h a 28°C e, subseqüentemente, analisados por HPLC. A análise HPLC foi realizada com uma coluna de troca aniônica Car-boPac PA 100, que foi conectada a um sistema de cromatografia de gradiente DX-300 Dionex (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Monômeros de açúcar, oligômeros e polímeros foram detectados por meio de detecção pulsampe-rométrica. O ajuste do detector para este fim foi: Ti = 0,48s; T2 = 0,12s; T3 = 0,12s; Ei = 0,05V; E2 = 0.65V; E3 = -0,95V; sensibilidade = 0,1 pC; integração = 0,28-0,48s; meio de fluxo A = 0,15 M NaOH; meio de fluxo B = 1 M NaAc em 0,15 M NaOH; gradiente: 10 min 100% A; aumento linear de 2 min de 0% B a 100% B; 2 min 100% B; aumento linear de 2 min de = 0% A a 100% A; 5 min A. As amostras foram dessalinizadas e filtradas (microcon 10, ' amicon, Beverly USA) antes da aplicação. A velocidade de fluxo foi 1 ml min' \ Em alguns extratos, inulina de alto peso molecular pode ser encontrada (conforme figura 1).
Exemplo 2: Análise da seqüência do inserto de cDNA do plasmídeo pCy3 Um inserto de cDNA de um derivado de pA7 (pCy3) que mediou a síntese de inulina de alto peso molecular no teste de protoplasto foi se-qüênciado por meio da técnica de didesoxinucleotídeo (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467). O inserto do clone pCy3 é um DNA com um comprimento de 2073 bp. A seqüência de nucleotídeo é indicada na SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácidos é indicada na SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 é uma variante de SEQ ID NO: 1 que codifica a mesma prote- ína como a codificada por SEQ ID NO: 1. A análise da seqüência e uma comparação com seqüências já publicadas mostra que a seqüência indicada em SEQ ID NO: 1 é nova e compreende uma região de codificação demonstrando homologias em FFTs de outros organismos.
Exemplo 3: Síntese do plasmídeo p35-csFFT e integração do plasmídeo no genoma de batata O plasmídeo p35-csFFT (figura 2) contém três fragmentos A, B e C no vetor binário pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711, modificados de acordo com Becker, Nucleic Acids Res. 18 (1990), 203). O fragmento A contém o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV). Ele contém os nucleotídeos 7146 a 7464 (Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2871-2888) como um inserto entre o sítio EcoRI e Saci do poliligador de pBin19-Hyg. O fragmento B contém os nucleotídeos 1 a 2073 da seqüência SEQ ID NO: 1. O fragmento B foi obtido como um fragmento Not l do vetor pBK-CMV, em que ele foi inserido no sítio EcoRI via uma seqüência de liga-dor EcoRI/Not I. O fragmento C contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do T-DNA do plasmídeo Ti pTi ACH 5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846), nucleotídeo 11749 a 11939, que foi isolado como um fragmento pvu II - Hind III do plasmídeo pAGV 40 (Herrera-Estrella, Nature 303 (1983), 209-213) e clonado entre o sítio Sphl e Hind III do poliligador de pBin19-Hyg após adicionar ligadores Sph I ao sítio Pvu II. O plasmídeo p35-csSST foi introduzido em Agrobactéria (Hõfgen e Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877) e introduzido subseqüen-temente em plantas de batata via transferência do gene mediado com Agro-bacterium, de acordo com as técnicas padrão descritas acima. Referidas plantas de batata foram transformadas com uma seqüência de DNA codificando um SST de alcachofra (ver pedido de patente alemã DE-A1 197 08 774) e que expressa estas seqüências sob o controle do promotor 35S. Plantas intactas foram regeneradas de células transformadas. Extratos foram obtidos das folhas de uma faixa de plantas regeneradas e examinadas com respeito à presença de polímeros de frutosila. A análise foi realizada como descrito no exemplo 1. A análise de folhas de uma faixa de plantas transformadas com este sistema de vetor forneceu, de modo não ambíguo, a ocorrência de inulina de alto peso molecular, que resulta da expressão do gene FFT de alcachofra contido em p35-csFFT (conforme figura 3).
Tabela I
Análise do teor de inulina de tubérculos de batata transqênicos expressando um gene FFT e SST de alcachofra Exemplo 4: Produção do plasmídeo p33-csFFT e integração do plasmídeo no genoma de batata O plasmídeo -33-csFFT (figura 4) é idêntico ao plasmídeo p35-csFFT, com a exceção de que o fragmento A contém o promotor B33 do gene patatina b33 de batata em vez do promotor 35S de CaMV. Ele contém um fragmento Dral (posição -1512 a posição +14) do gene patatina b33 (Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29), que foi inserido entre o sítio EcoRI e Saci do poliligador de pBin19-Hyg. O plasmídeo p33-csFFT tem um tamanho de aproximadamente 14 kb. O plasmídeo p33-csSST foi introduzido em plantas de batata via a transferência do gene mediado com Agrobacterium, como descrito no exemplo 3. Referidas plantas de batata foram transformadas com uma sequência de DNA codificando um SST de alcachofra (ver pedido de patente alemã E-A1 197 08 774) e que expressaram estas seqüências sob o controle do promotor B33. Plantas intactas foram regeneradas de células transformadas. A análise de tubérculos de uma faixa de plantas transformadas com este sistema de vetor forneceu, de modo não ambíguo, a ocorrência de inulina de alto peso molecular, que resulta da expressão do gene FFT de alcachofra contido em p33-csFFT (conforme figura 5).
Claims (4)
1. Método para produção de material de propagação ou produtos de colheita de uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) transformar as células de planta utilizando um vetor que compreende uma sequencia de nucleotídeos codificando uma proteína com a atividade enzimática de uma frutosil transferase (FFT), a dita sequencia de nucleotídeos sendo indicada sob SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3; (ii) regenerar a planta transgênica a partir da célula de planta transformada obtida na etapa (i); e (iii) derivar o material de propagação ou produtos de colheita da planta transgênica da etapa (ii).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas etapas de transformar células de planta compreendem ainda a introdução de um gene codificando uma sacarose frutosil transferase dependente de sacarose (SST).
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta útil.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida planta útil é uma planta contendo sacarose.
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