BRPI9814369B1 - sequência de dna, gene quimérico, vetor de clonagem, processo de transformação de células vegetais, processo de controle das ervas daninhas e processo de cultura das plantas - Google Patents

Abstract

"seqüência de adn, gene quimérico, proteína de fusão, vetor de clonagem ou de expressão, processo de transformação de células vegetais, célula vegetal, planta transformada, semente, processo de controle das ervas daninhas em uma superfície de um campo e processo de cultura das plantas transformadas com um gene quimérico" a presente invenção trata de uma seqüência de adn, elemento de regulação em 5' que permite a expressão de um gene heterólogo em uma célula vegetal de planta monocotiledônea, caracterizado pelo fato de compreender no sentido da transcrição uma primeira seqüência de adn, fragmento funcional da seqüência do promotor h3c4 de milho, e uma segunda seqüência de adn, fragmento funcional da seqüência do primeiro íntron da actina de arroz. a presente invenção trata também de um gene quimérico que compreende a referida seqüência de adn e as plantas transformadas com o referido gene.

Description

“SEQUÊNCIAS DE DNA, GENE QUIMÉRICO, VETOR DE CLONAGEM, PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO DAS CÉLULAS VEGETAIS, PROCESSO DE CONTROLE DAS ERVAS DANINHAS E PROCESSO DE CULTURA DE PLANTAS” Campo da Invenção A presente invenção trata de uma nova sequência de regulação em 5’ que permite a expressão nas plantas monocotiledôneas de uma sequência heteróloga à referida sequência de regulação que codifica uma proteína de interesse. A presente invenção trata também de um gene quimérico que compreende a referida sequência de regulação, uma sequência heteróloga que codifica uma proteína de interesse e uma sequência de regulação em 3’ que permite a expressão da proteína de interesse em uma célula vegetal de planta monocotiledônea, bem como uma planta monocotiledônea transformada que compreende o referido gene quimérico e os meios necessários à transformação das células vegetais e das plantas.

Antecedentes da Invenção Diversos promotores que permitem a expressão de sequências que codificam proteínas de interesse nas plantas são conhecidos, descritos na literatura, e já permitiram o desenvolvimento em estágio comercial de plantas modificadas por engenharia genética. Trata-se de sequências promotoras de genes que se expressam naturalmente nas plantas, em particular promotores de origem bacteriana, vital ou vegetal, como, por exemplo, o de um gene da pequena subunidade de ribulose-bifosfato carboxilase/oxigenase (US 4,962,028) ou de um gene de vírus de planta, como por exemplo, o do mosaico da couve flor (US 5,352,605). Promotores que permitem a expressão de genes heterólogos nas plantas estão descritos em particular nas patentes e nos pedidos de patentes indicados a seguir: US 5,086,169, ΕΡ 0 353 908, US 5,139,954, US 5,378,619, US 5,563,328, US 5,589.583, US 5,633,363, US 5,633,439, US 5,633,440, US 5,633,447, US 5,635,618, US 5,639,948 e US 5,639,952.

Todavia, alguns desses promotores, e mais particularmente os promotores de origem vegetal, não são funcionais nas monocotiledôneas. Já se conhece, por exemplo, promotores de histona de Arabidopsis sp. descritos no pedido de patente EP 0 507 698, particularmente eficazes para permitir a expressão de um gene heterólogo nas plantas dicotiledôneas como o tabaco, a colza ou a soja, que não são funcionais nas monocotiledôneas como o milho. O promotor da actina do arroz é um promotor conhecido por permitir a expressão de genes heterólogos nas plantas monocotiledôneas (US 5,641,876). Persiste, todavia, o problema de identificar novas sequências de regulação em 5’ funcionais para a expressão de sequências heterólogas nas plantas monocotiledônea.

Descrição da Invenção A presente invenção trata de uma sequência de DNA, elemento de regulação em 5’ que permite a expressão de um gene heterólogo em uma célula vegetal de planta monocotiledônea, sendo que a referida sequência de DNA compreende no sentido da transcrição uma primeira sequência de DNA, fragmento funcional da sequência do promotor H3C4 de milho, e uma segunda sequência de DNA, fragmento funcional da sequência do primeiro íntron da actina de arroz. A sequência do promotor H3C4 de milho está descrita em particular por Brignon & coll. (Plant-Mol. Biol., 22·. 1007-1015, 1993). Trata-se do fragmento Alui do promotor H3C4 de milho, de aproximadamente 1 kb, que corresponde às bases -7 a -1029 relativas ao ATG da sequência que codifica a histona H3C4 de milho. A sequência do primeiro íntron da actina de arroz está descrita em particular na patente US 5,641,876.

Por fragmento funcional, entendemos segundo a presente invenção toda sequência de DNA proveniente da sequência do promotor H3C4 de milho ou da sequência do primeiro íntron da actina de arroz, que reproduz a função da sequência de onde ela é proveniente.

Segundo um modo de realização da presente invenção, o fragmento funcional da sequência do promotor H3C4 de milho compreende a sequência de DNA descrita pelo identificador de sequência n° 1 (SEQ ID NO^l) ou uma sequência homóloga da referida sequência. De maneira preferencial, o fragmento funcional da sequência do promotor H3C4 de milho consiste na sequência de DNA descrita pelo identificador de sequência n° 1.

Segundo um modo de realização da presente invenção, o fragmento funcional do primeiro íntron da actina de arroz compreende a sequência de DNA descrita pelo identificador de sequência n° 2 (SEQ ID NO;2) ou uma sequência homóloga da referida sequência. De maneira preferencial, o fragmento funcional do primeiro íntron da actina de arroz consiste na sequência de DNA descrita pelo identificador de sequência n° 2. A sequência de DNA, elemento de regulação em 5’ segundo a presente invenção pode compreender ainda entre a primeira e a segunda sequência de DNA, fragmentos de DNA neutros, geralmente necessários para a construção da sequência segundo a presente invenção. Trata-se de fragmentos de DNA que compreendem até 30 pares de bases, preferencialmente até 20 pares de bases. Por fragmentos de DNA neutros, entendemos segundo a presente invenção fragmentos de DNA que não vêm modificar substancialmente as respectivas funções das primeira e segunda sequências de DNA da sequência segundo a presente invenção.

Segundo um modo preferencial de realização da presente invenção, a sequência de DNA segundo a presente invenção compreende a sequência de DNA representada pelo identificador de sequência n° 3 (SEQ ID NO'3) ou uma sequência homóloga da referida sequência. Mais preferencialmente, a sequência segundo a presente invenção consiste na sequência de DNA representada pelo identificador de sequência n° 3.

Por “homóloga”, entendemos segundo a presente invenção uma sequência de DNA que apresenta uma ou mais modificações de sequência em relação à sequência de DNA de referência descrita pelos identificadores de sequência n° 1, 2 ou 3, e que reproduz a função das sequências precitadas. Essas modificações podem ser obtidas segundo as técnicas usuais de mutação, ou ainda escolhendo oligonucleotídeos sintéticos que podem ser empregados na preparação da referida sequência por hibridação. De maneira vantajosa, o grau de homologia será de pelo menos 70 % em relação à sequência de referência, de preferência de pelo menos 80 % e mais preferencialmente ainda de pelo menos 90 %. A presente invenção trata também de um gene quimérico (ou cassete de expressão) que compreende uma sequência codificadora bem como elementos de regulação em posição 5’ e 3’ heterólogas que podem funcionar nas células vegetais de plantas monocotiledôneas, na qual os elementos de regulação em 5’ compreendem a sequência de DNA segundo a presente invenção definida acima.

Por “célula vegetal”, entendemos segundo a presente invenção toda célula proveniente de uma planta monocotiledônea e que pode constituir tecidos indiferenciados como calos, tecidos diferenciados como embriões, partes de plantas monocotiledôneas, plantas monocotiledôneas ou sementes.

Entendemos por “planta monocotiledônea” segundo a presente invenção, todo organismo multicelular diferenciado capaz de fotossíntese, em particular plantas de cultura destinadas ou não à alimentação animal ou humana como trigo, cevada, aveia, arroz, milho, sorgo, cana de açúcar, etc.

Segundo a presente invenção, podemos também utilizar, em associação com a sequência de regulação promotora segundo a presente invenção, outras sequências de regulação, que estão situadas entre o promotor e a sequência codificadora, como as sequências que codificam peptídeos de trânsito, simples ou duplos, e nesse caso eventualmente separados por uma sequência intermediária, ou seja, compreendendo, no sentido da transcrição, uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, uma parte de sequência da parte madura N- terminal de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, e depois uma sequência que codifica um segundo peptídeo de trânsito de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial constituída de uma parte de sequência da parte madura N-terminal de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, tal como descreve o pedido de patente EP 508 909. Como peptídeo de trânsito, podemos também citar o peptídeo sinal do gene PR-la do tabaco descrito por Cornelissen & Coll.

Como seqüência de regulação terminadora ou de poliadenilação, podemos utilizar toda seqüência correspondente de origem bacteriana, como, por exemplo, o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, ou ainda de origem vegetal, como por exemplo, um terminador de histona tal como descrito no pedido europeu EP 633 317. A seqüência codificadora do gene quimérico segundo a presente invenção pode compreender qualquer seqüência codificadora de uma proteína de interesse que desejamos expressar em uma célula vegetal ou em uma planta monocotiledônea.

Pode se tratar de um gene que codifica um marcador de seleção como de um gene que confere à planta monocotiledônea transformada novas propriedades agronômicas ou de um gene de aperfeiçoamento da qualidade agronômica da planta monocotiledônea transformada.

Entre os genes que codificam marcadores de seleção, podemos citar os genes de resistência aos antibióticos, os genes de tolerância aos herbicidas (bialafos, glifosato ou isoxazóis), genes que codificam enzimas facilmente identificáveis como a enzima GUS, genes que codificam pigmentos ou enzimas que regulam a produção de pigmentos nas células transformadas. Esses genes marcadores de seleção estão descritos em particular nos pedidos de patente WO 91/02071 e WO 95/06128.

Entre os genes que conferem novas propriedades agronômicas às plantas monocotiledônea s transformadas, podemos citar os genes que conferem uma tolerância a certos herbicidas, os que conferem uma tolerância a certos insetos, os que conferem uma tolerância a certas doenças, etc. Esses genes estão descritos em particular nos pedidos de patente WO 91/02071 e WO 95/06128. , Como seqüência de regulação terminadora ou de poliadenilação, podemos utilizar qualquer seqüência correspondente de origem bacteriana, como por exemplo o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, ou ainda de origem vegetal, como por exemplo um terminador de histona tal como descrito no pedido EP 0 633 317. A presente invenção é particularmente apropriada para a expressão de genes que conferem às células vegetais e às plantas monocotiledônea transformadas uma tolerância a certos herbicidas. Entre os genes que conferem uma tolerância a certos herbicidas, podemos citar o gene Bar que confere tolerância ao bialafos, o gene que codifica uma EPSPS apropriada que confere resistência aos herbicidas que têm a EPSPS como alvo, como o glifosato e seus sais (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), o gene que codifica a glifosato oxidorredutase (US 5,463,175), ou ainda um gene que codifica uma HPPD que confere tolerância aos herbicidas que têm por alvo a HPPD como os isoxazóis, em particular o isoxafutol (FR 95 06800, FR 95 13570), as dicetonitrilas (EP 496 630, EP 496 631) ou as tricetonas, em particular a sulcotriona (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195). Esses genes que codificam uma HPPD que conferem tolerância aos herbicidas que têm por alvo a HPPD estão descritos no pedido de patente WO 96/38567 e no pedido de patente não publicado FR 97 14264, depositado em 7 de novembro de 1997, cujo conteúdo está incorporado por referência.

Entre os genes que codificam uma EPSPS apropriada que conferem resistência aos herbicidas que têm a EPSPS como alvo, citaremos mais particularmente o gene que codifica uma EPSPS vegetal, em particular de milho, que apresenta duas mutações 102 e 106, descrito no pedido de patente FR 2 736 926, denominado abaixo EPSPS duplo mutante, ou ainda o gene que codifica uma EPSPS isolada de Agrobacterium descrito pelas sequências ID 2 e ID 3 da patente US 5,633,435, denominado a seguir CP4. t Entre os genes que codificam uma HPPD que conferem tolerância aos herbicidas tendo por alvo a HPPD, citaremos mais particularmente a HPPD de Pseudomonas e a de Arabidopsis, descritas no pedido de patente WO 96/38567.

No caso dos genes que codificam EPSPS ou HPPD, e mais particularmente os genes acima, a sequência que codifica essas enzimas é vantajosamente antecedida por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito, em particular o peptídeo de trânsito denominado peptídeo de trânsito otimizado descrito nas patentes US 5,510,471 ou US 5,633,448 cujo conteúdo está incorporado aqui por referência.

Segundo um modo preferencial de realização da presente invenção, o gene quimérico segundo a presente invenção compreende no sentido da transcrição, uma sequência de regulação em 5’ segundo a presente invenção tal como definida acima, ligada de maneira funcional a uma sequência que codifica uma proteína de fusão peptídeo de trânsito/proteína de interesse, ligado de maneira funcional a uma sequência de regulação em 3’, sendo que os diversos elementos do gene quimérico estão definidos acima, e a proteína de interesse é de preferência uma enzima que confere tolerância a certos herbicidas, mais preferencialmente as enzimas de tipo EPSPS ou HPPD definidas acima.

Sequências que codificam proteínas de fusão peptídeo de trânsito/EPSPS, e mais particularmente OPT7 EPSPS duplo mutante, estão descritas nas patentes US 4,940,835, US 5,633,448 e FR 2 736 926.

Para a proteína de fusão OTP/CP4, o técnico no assunto saberá construir o gene correspondente tomando a sequência codificadora para o CP4 descrita na patente US 5,633,435 e seguindo o modo de operação descrito nas patentes US 4,940,835, US 5,633,448 e FR 2 736 926 ou nos exemplos a seguir. A presente invenção trata também de um gene quimérico que compreende no sentido da transcrição, uma sequência de regulação em 5’ apropriada para assegurar a expressão de um gene heterólogo em uma célula vegetal, ligada de maneira funcional a uma sequência que codifica uma proteína de fusão OTP/CP4, ligada de maneira funcional a uma sequência de regulação em 3’. Os elementos de regulação em 5’ compreendem não apenas os elementos de regulação em 5’ segundo a presente invenção definido acima, mas também todos os elementos de regulação apropriados para permitir a expressão de genes heterólogos nas células vegetais de plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas conhecidas do técnico no assunto ou que surgirão no futuro, em particular os descritos acima.

As sequências que codificam proteínas de fusão peptídeo de trânsito/HPPD estão descritas no pedido de patente WO 96/38567. A presente invenção trata também de um vetor de clonagem e/ou de expressão para a transformação de uma célula vegetal ou de uma planta monocotiledônea, as células vegetais e plantas transformadas que contêm pelo menos um gene quimérico tal como definido acima. O vetor segundo a presente invenção compreende além do gene quimérico acima pelo menos uma origem de replicação. Esse vetor pode ser constituído por um plasmídeo, um cosmídeo, um bacteriófago ou um vírus, transformados pela introdução do gene quimérico segundo a presente invenção. Esses vetores de transformação de células vegetais e de plantas monocotiledôneas são bem conhecidos do técnico no assunto e amplamente descritos na literatura. De maneira preferencial, o vetor de transformação das células vegetais ou das plantas segundo a presente invenção é um plasmídeo. A presente invenção tem ainda por objeto um processo de transformação das células vegetais por integração de pelo menos um fragmento de ácido nucléico ou um gene quimérico tais como definidos acima, transformação essa que pode ser obtida por qualquer meio conhecido apropriado com o vetor segundo a presente invenção.

Uma série de métodos consiste em bombardear células ou tecidos celulares com partículas aos quais estão fixadas as sequências de DNA. Outra série de métodos consiste em utilizar como meios de transferência para a planta um gene quimérico inserido em um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou Ri de Agrobacterium rhizogenes. Podem ser utilizados outros métodos como a micro-injeção ou eletroporação, ou ainda a precipitação direta através de PEG. 0 técnico no assunto fará então a escolha do método apropriado em função da natureza da célula vegetal ou da planta. A presente invenção tem ainda por objeto células vegetais ou plantas transformadas e contêm pelo menos um gene quimérico segundo a presente invenção definido acima. A presente invenção tem ainda por objeto as plantas que contêm células transformadas, em particular as plantas regeneradas a partir das células transformadas. A regeneração é obtida por qualquer processo apropriado que depende da natureza da espécie.

Para os processos de transformação das células vegetais e de regeneração das plantas monocotiledôneas, citaremos em particular Gordon-Kamm, W.J. et tal. (Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants, The Plant Cell, vol. 2, 603-618, julho de 1990), cujo conteúdo está incorporado aqui por referência, e as patentes e pedidos de patente indicados a seguir: US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 e WO 95/06128. A presente invenção trata também das plantas transformadas provenientes da cultura e/ou do cruzamento das plantas regeneradas acima, bem como das sementes das plantas transformadas.

No caso do gene quimérico segundo a presente invenção compreender uma sequência que codifica uma enzima que confere tolerância a um herbicida particular, a presente invenção trata também de um processo de controle das ervas daninhas na superfície de um campo que compreende sementes ou plantas transformadas com o referido gene quimérico segundo a presente invenção, processo esse que consiste em aplicar sobre a referida superfície do campo uma dose do referido herbicida particular tóxico para tais ervas daninhas, sem todavia afetar substancialmente as sementes ou as plantas transformadas com o referido gene quimérico segundo a presente invenção que contém a referida sequência que codifica uma enzima que confere tolerância ao referido herbicida particular. A presente invenção trata também de um processo de cultura das plantas transformadas segundo a presente invenção com um gene quimérico segundo a presente invenção que compreende uma sequência que codifica uma enzima que confere tolerância a um herbicida particular definido acima, processo esse que consiste em plantar as sementes dessas plantas transformadas na superfície de um campo apropriado para a cultura de tais plantas, em aplicar sobre a referida superfície do referido campo uma dose tóxica para as ervas daninhas do referido herbicida particular em caso de presença de ervas daninhas, sem afetar de maneira substancial as referidas sementes ou as referidas plantas transformadas, e depois em colher as plantas cultivadas quando elas atingirem a maturidade desejada e eventualmente em separar as sementes das plantas colhidas.

Nos dois processos acima, a aplicação do herbicida particular pode ser feita segundo a presente invenção, tanto em pré-semeadura, em pré-emergência quanto em pós-emergência da cultura.

De maneira vantajosa, a enzima de tolerância a um herbicida é uma EPSPS apropriada, e nesse caso, o herbicida é o glifosato ou seus sais, ou a enzima é uma HPPD e o herbicida é escolhido entre os isoxazóis, particularmente o isoxaflutol, as dicetonitrilas ou as tricetonas, em particular a sulcotriona.

Os exemplos a seguir permitem ilustrar a presente invenção sem procurar limitar seu alcance. 1. Construção de um gene quimérico com uma sequência que codifica umaHPPD

Os plasmídeos a seguir são preparados de forma a criar um cassete de expressão que compreende um promotor histona H3C4 de milho associado com a região 5’ não traduzida do primeiro íntron do gene de actina de arroz (Actl) descrito por Mc Elroy D. et al. (Plant Molecular Biology 15·' 257-268 (1990) que conduz à expressão do gene OTP-HPPD de Pseudomonas fluorescens. pRPA-RD-195 O plasmídeo pRPA-RD-195 é um derivado do plasmídeo pUCJ-19 que contém um sítio de clonagem múltiplo modificado. Os oligonucleotídeos complementares 1 e 2 a seguir são hibridados a 65°C durante 5 minutos, seguido de um resfriamento lento até 30°C durante 30 minutos.

O ligo 4: 5’ AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA GGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3’ Oligo 5: 5’ CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3’ Os oligonucleotídeos hibridados são tornados filamento duplo empregando-se 0 fragmento klenow da DNA polimerase 1 de E.coli para estender as extremidades 3’ de cada oligo empregando as condições padrão recomendadas pelo fabricante (New England Biolabs). O oligo de filamento duplo obtido é depois ligado ao plasmídeo pUC-19 previamente digerido com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII e tornados com extremidade livre empregando-se 0 fragmento klenow da DNA polimerase 1 de E.coli. Obtemos assim um vetor de clonagem que compreende um sítio de clonagem múltipla de forma a facilitar a introdução de cassetes de expressão em um vetor plasmídeo de Agrobacterium tumefaciens (figura l). PRPA-RD-2010: Inserção da sequência “promotor H4A748OTP-gene de EPSPS duplo mutante” de pRPA-RD-159 no plasmídeo pRPA-RD-195. O plasmídeo pRPA-RD-195 é digerido com a enzima de restrição Saci e desfosforilado com fosfatase alcalina dos intestinos de bezerro (New England Biolabs). O plasmídeo pRPA-RD*173 (descrito na patente FR 2 736 926) é digerido com a enzima de restrição Saci e o fragmento de DNA que contém o gene de EPSPS é purificado e ligado no plasmídeo pRPA-RD-195 preparado anteriormente. O clone obtido contém diversos sítios de restrição únicos que enquadram o gene de EPSPS duplo mutante. pRPA-RD-1002: Criação de uma cassete de expressão OTP-HPPD para uso nas monocotiledôneas. O plasmídeo pRP-P contém o peptídeo de trânsito otimizado (OTP) ligado à HPPD de Pseudomonas üuorescens seguido por um sítio de poliadenilação da nopalina sintase tal como descrito no pedido de patente WO 96/38567. Os elementos do plasmídeo pRP-P são os seguintes: ■ 0 peptídeo de trânsito otimizado (OTP) descrito nas patentes US 5,510,471 e US 5,633,448; esse OPT é constituído dos 171 pb do peptídeo de trânsito da pequena subunidade da Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase /oxigenase de Helianthus annuus (Waksman G. et al. 1987. Nucleic acids Res. 15^ 718) seguidas das 66 pb da parte matura da pequena unidade da Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase/oxigenase de Zea mays (Lebrun e al. 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360), elas próprias seguidas dos 150 pb do peptídeo de trânsito da pequena subunidade da Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase/oxigenase de Zea mays (Lebrun e al. 1987. Nucleics acids Res. 15: 4360). O conjunto é, portanto correspondente a 387 pb. ■ a região codificadora da HPPD de Pseudomonas üorescens descrita no pedido de patente WO 96/38567; e ■ o terminador do gene da nopalina sintase (nos) (zona de poliadenilação do gene nos isolado de pTi 37,250 pb; Bevan M. e al. Nucleics Acids Res. 11:369-385). O plasmídeo rRP-P é digerido com a enzima de restrição BstEII tratado com o fragmento klenow da DNA polimerase I de Eçoli para tornar o fragmento de extremidade livre, e seguido por uma digestão com a enzima de restrição Ncol O fragmento de DNA obtido que contém a região codificadora OTP-HPPD de aproximadamente 1,5 kb é depois purificado. O plasmídeo pRPA-RD-2010 obtido anteriormente é digerido com a enzima de restrição BlpI, tratado com o fragmento klenow da DNA polimerase I de E. colipara obter um fragmento com extremidade livre, e depois digerido com a enzima de restrição Ncol. O fragmento de DNA obtido que compreende as sequências do vetor plasmídeo, o promotor H3C4 associado com a região 5’ não traduzida e o primeiro íntron do gene actina de arroz é purificado e o sítio de poliadenilação NOS é purificado. Os dois fragmentos de DNA purificados são ligados de maneira a criar uma cassete de expressão OTP-HPPD que compreende o promotor de histona H3C4 de milho (Brignon & coll.) associado com a região não traduzida em 5’ e o primeiro íntron do gene de actina de arroz (Actí) (Actl 5’ UTR + íntron l) para controlar a expressão da região codificadora OTP-HPPD que incorpora o sítio de poliadenilação NOS (NOS polyA) (figura 2). 2. Construção de um gene quimérico com uma sequência que codifica a EPSPS DUPLO mutante: pRPA-RD-1010·· Criação de um cassete de expressão OTP-EPSPS duplo mutante para uso nas monocotiledôneas. O plasmídeo pRPA-RD-109 contém o gene de β-glucuronidase (GUS) de E. coli controlado pelo promotor de histona H3C4 de milho (Brignon & coll.) associado com a região não traduzida em 5’ e o primeiro íntron do gene de actina de arroz (Actl) descrito por Mc Elroy D. et al. (Plant Molecular Biology 15' 257-268 (1990). Um diagrama desse plasmídeo está representando na figura 3. O plasmídeo pRPA-RD-109 é digerido com as enzimas de restrição Ncole EcoRI, e o fragmento grande de DNA (cerca de 5 kb) que contém a sequência vetor, o gene GUS e o sítio de poliadenilação NOS é purificado. O plasmídeo pRPA-RD*2010 é digerido com as enzimas de restrição Ncole EcoRI, e o fragmento de DNA (cerca de 1,6 kb) que contém o promotor H3C4 associado com a região não traduzida em 5’ e o primeiro íntron do gene de actina de arroz (Actl) é purificado. Os dois fragmentos de DNA purificados são ligados para criar uma cassete de expressão OTP-EPSPS duplo mutante que compreende o promotor de histona H3C4 de milho (Brignon & coll.) associado com a região não traduzida em 5’ e o primeiro íntron do gene de actina de arroz (Actl) para controlar a expressão da região que codifica OPT-EPSPS duplo mutante incorporando o sítio de poliadenilação NOS. 3. Construção do gene quimérico de tolerância à fosfinotricina (gene bar)'· A fosfinotricina acetil transferase (PAT) codificada pelo gene barê uma enzima que inativa um herbicida, a fosfinotricina (PPT). A PPT inibe a síntese de glutamina e provoca um acúmulo rápido de amoníaco nas células provocando sua morte (Tachibana e al., 1986). O plasmídeo utilizado para introduzir a tolerância à fosfinotricina como agente de seleção é obtido por inserção do gene quimérico pDM 302 no vetor pSP72 de 2462 pb, comercializado pela Promega Corp. (Genbank/DDBJ database accession number X65332) e contendo o gene de resistência à ampicilina. O plasmídeo pDM 302 de 4700 pb foi descrito por Cao, J. e al. Plant Cell Report 11: 586-591 (1992).

Os diversos elementos desse plasmídeo são·' - o promotor do gene actina de arroz descrito por Mc Elroy D. e al. (Plant Molecular Biology 15: 257-268 (1990) constituído de 840 pb; - o primeiro éxon do gene actina de arroz constituído de 80 pb; - o primeiro íntron do gene actina de arroz, constituído de 450 pb; - a região codificadora do gene bar de 600 pb do qual foi excisado o plasmídeo pIJ41404 descrito por White J. et al. Nuc. Acids res. 18·' 1862 (1990); - o terminador do gene da nopalina sintase (nos) (zona de poliadenilação do gene nos isolado de pTi 37,250 pb Bevan M. e al. Nucleics Acids Res. 11:369-385). 4. Transformação das células de milho: A técnica de bombardeamento de partículas é utilizada para introduzir a construção genética. Os plasmídeos são purificados sobre coluna Qiagen e co-precipitados sobre partículas de tungstênio M10 segundo o processo Klein (Nature 327! 70*73, 1987).

Uma mistura de partículas metálicas do plasmídeo pRPA-RD-1002 e do plasmídeo do exemplo 3 descritos acima é depois bombardeada sobre células embriogênicas de milho segundo o protocolo descrito por W.J. et al. (Transformation ofMaize Cells andRegeneration ofFertile Transgenic Plants, The Plant Cell, vol. 2, 603-618, julho de 1990). 5. Regeneração e utilização do geme bar como agente de seleção: Os calos bombardeados são selecionados sobre glufosinato até o aparecimento de setores verdes. Os calos positivos resistentes ao glufosinato são então convertidos em embriões somáticos, e depois colocados em condições que favorecem a germinação segundo as condições operatórias descritas por W.J. et al. (Transformation ofMaize Cells and Regeneration of Fertile TransgenicPlants, The Plant Cell, vol. 2, 603-618, julho de 1990). As plantas jovens são transferidas para estufas para a produção de sementes. 6. Análise da descendência das plantas transformadas: As plantas transformadas obtidas acima são supostas em parte transgênicas, compreendendo um gene heterólogo que codifica OTP/HPPD que confere uma tolerância aos isoxazóis como o isoxaflutol. Essas plantas transformadas emitiram pólen, que fecundou óvulos de um milho selvagem não transgênico. As sementes obtidas são selecionadas sobre areia após tratamento com isoxaflutol. O procedimento de seleção é o seguinte: 800 ml de areia de Fontainebleau são colocados em um recipiente de 15 x 20 cm de lados. Esses recipientes são então regados com água e mantidos hidratados por meio de uma solução nutritiva constituída de 5 ml de Quinoligo {La Quinoléine) por litro de água. Vinte sementes de milho são colocados em recipientes, que são então tratados com isoxaflutol por pulverização à razão de 100 g de matéria ativa por hectare (300 μg de matéria ativa por recipiente). Os recipientes são depois colocados em cultura em estufa. A fitotoxidez é determinada 14 após a plantação. Segundo as condições acima, as plantas não transformadas apresentam 100 % de fitotoxidez, enquanto as plantas transformadas não apresentam fitotoxidez.

Um estudo comparativo foi realizado com 20 linhagens de milho transformado segundo a presente invenção e 20 linhagens de milho transformado com um gene correspondente para o qual a sequência que codifica o primeiro íntron da actina de arroz foi substituído pela sequência que codifica o íntron adh I de milho. Após tratamento por pulverização com doses muito elevadas de isoxaflutol à razão de 200 g de matéria ativa por hectare (600 μg de matéria ativa por recipiente), obtivemos os seguintes resultados: Os resultados acima demonstram que a associação do promotor H3C4 de milho com o primeiro íntron da actina de arroz segundo a presente invenção aperfeiçoa de maneira substancial a expressão de uma proteína de interesse nas plantas monocotiledôneas transformadas em relação à associação do mesmo promotor H3C4 de milho com outro íntron do estado da técnica.

Reivindicações

Claims (17)

1, SEQUÊNCIA DE DNA, caracterizada pelo fato de que compreende, no sentido da transcrição, uma primeira sequência de DNA que consiste na SEQ ID NO: 1, e uma segunda sequência de DNA que consiste na SEQ ID NO: 2, em que dita sequência é para expressão de genes heterólogos que conferem resistência à herbicida em plantas monocotiledôneas.

2, SEQUÊNCIA DE DNA, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de DNA representada pelo identificador de sequência n° 3 (SEQ ID NO:3), em que dita sequência é para expressão de genes heterólogos que conferem resistência à herbicida em plantas monocotiledôneas,

3, GENE QUIMÉRICO, que compreende uma sequência codificadora bem como elementos de regulação em posição 5' e 3’ heterólogos que funcionam em células vegetais de plantas monocotiledôneas ou nas plantas monocotiledôneas, caracterizado pelo fato de que os elementos de regulação em 5' compreendem a sequência de DNA conforme definida em uma das reivindicações 1 a 2,

4, GENE, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene que confere tolerância a certos herbicidas é escolhido entre o gene Bar que confere tolerância ao bialafos, um gene que codifica uma EPSPS apropriada que confere resistência aos herbicidas que têm a EPSPS por alvo, o gene que codifica a glifosato oxidorredutase e um gene que codifica uma HPPD que confere tolerância aos herbicidas que têm por alvo a HPPD,

5, GENE, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o gene que confere tolerância a certos herbicidas é escolhido entre um gene que codifica uma EPSPS e um gene que codifica uma HPPD,

6, GENE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene que codifica uma EPSPS é escolhido entre a EPSPS duplo mutante e o CP4.

7. GENE, de acordo com uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma EPSPS ou uma HPPD é antecedida por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito.

8. GENE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de trânsito é um peptídeo de trânsito otimizado, constituído dos 171 pb do peptídeo de trânsito da pequena subunidade da Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase /oxigenase de Helianthus annuus seguidas das 66 pb da parte matura da pequena unidade da Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase/oxigenase de Zea mays, elas próprias seguidas dos 150 pb do peptídeo de trânsito da pequena subunidade da Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase/oxigenase de Zea mays.

9. GENE, caracterizado pelo fato de que compreende, no sentido da transcrição, uma sequência de regulação em 5’ conforme definida em uma das reivindicações 1 ou 2, ligada de maneira funcional a uma sequência que codifica uma proteína de fusão peptídeo de trânsito/proteína de interesse, ligada de maneira funcional a uma sequência de regulação em 3’.

10. GENE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é uma enzima que confere tolerância a certos herbicidas conforme definida em uma das reivindicações 7 a 9.

11. GENE, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica uma proteína de fusão peptídeo de trânsito/proteína de interesse é escolhido entre a sequência que codifica a proteína de fusão OPT/EPSPS duplo mutante e a sequência que codifica a proteína de fusão OTP/CP4.

12. VETOR DE CLONAGEM, ou de expressão para a transformação de uma célula vegetal ou de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende além do gene quimérico conforme definido em uma das reivindicações 3 a 11, pelo menos uma origem de replicação.

13. VETOR, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é um plasmídeo.

14. PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO DAS CÉLULAS VEGETAIS, caracterizado pelo fato de que é integrado um gene quimérico conforme definido em uma das reivindicações 3 a 11.

15. PROCESSO DE CONTROLE DAS ERVAS DANINHAS, em uma superfície de um campo, caracterizado pelo fato de que consiste em aplicar sobre a referida superfície do campo, que compreende sementes ou plantas transformadas com o gene quimérico conforme definido em uma das reivindicações 3 a 11, uma dose de herbicida tóxico a ervas daninhas, em que as sementes ou plantas são tolerantes a tal herbicida.

16. PROCESSO DE CULTURA DE PLANTAS, caracterizado pelo fato de que consiste em plantar sementes modificadas com o gene quimérico conforme descrito em uma das reivindicações 3 a 11 em um campo; em cultivar as plantas das sementes; em aplicar sobre a superfície do campo uma dose de herbicida que é tóxica a ervas daninhas, em que as sementes ou plantas são tolerantes a tal herbicida; e colher as plantas cultivadas quando chegarem à maturidade.

17. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato do herbicida particular é aplicado em pré-semeadura, em pré-emergência ou em pós-emergência da cultura.