BR0211435B1 - Método de produção de polipeptídeo glp-1 insulinotrópico (7-36) e/ou análogos de glp - Google Patents
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Description
Método de produção de polipeptídeo GLP-1 insulinotrópico (7-36) e/ou análogos de GLP.
Campo da Invenção A presente invenção descreve um método de produção de peptídeo similar a glucagon polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de peptídeo 1 similares a glucagon através da ligação dos genes de forma conjunta. Também são descritos os polipeptídeos recombinantes produzidos através deste método. A administração exógena de GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 pode simular a secreção de insulina.
Antecedentes da Invenção GLP-1 (peptídeo 1 similar a glucagon é um hormônio de peptídeo secretado por células do intestino humano, que se desenvolveu a partir da divisão proteolígica de proglucagon por uma protease produzida por células L e, portanto, é denominado peptídeo 1 similar a glucagon. Diversos estudos demonstraram que a administração exógena de GLP-1 aumenta os efeitos da secreção de insulina. Quando a glicose no sangue for de mais de 6 mmol/l, por exemplo, concentração muito baixa de GLP-1 pode desempenhar papel significativo no aumento da secreção de insulina. Após a restauração da glicose do sangue a nível normal, a adição adicional de GLP-1 não deverá ter mais nenhum efeito sobre a secreção de insulina. GLP-1 está presente em duas formas no corpo humano; uma é GLP-1 (7-36)-NH2, que compreende trinta resíduos de aminoácidos com seu terminal C amidado. O outro é GLP-1 (7-37) que compreende 31 resíduos de aminoácidos. Tanto GLP-1 (7-36)-NH2 e GLP-1 (7-37) pode apresentar fortes efeitos aprimoradores sobre a secreção de insulina. Com relação ao efeito aprimorador de GLP-1 (7-36)-NH2, descobriu-se que a amidação no terminal C não é necessariamente exigida, pois o peptídeo GLP-1 (7-36)-OH (designado a seguir GLP-1 (7-36)) possui efeitos aprimoradores sobre a secreção de insulina.
Estudos anteriores demonstraram que GLP-1 possui mais vantagens que a insulina no tratamento de diabetes mellitus do tipo II. Como GLP-1 pode: 1) aumentar a regulagem da transcrição e tradução do gene pró-insulina; 2) aumentar a secreção de insulina e peptídeo C; 3) aumentar a sensibilidade de receptor de insulina celular; 4) aumentar as contagens de células β. Além disso, GLP-1 pode também abaixar ou reduzir: 1) a resistência à insulina; 2) a quantidade de glicohemoglobina (HbA1c), frutosamina, glucagon e ácidos graxos (Nielsen, J. H. et al, Regulation of Beta-Cell Mass by Hormones and Growth Factors, Diabetes, 50, supl. 1: S25-9, 2001; Hui, H. et al, Glucagon-like Peptide 1 Induces Differentiation of Islet Duodenal Homeobox-1-positive Pancreatic Ductal Cells into Insulin-secreting Cells, Diabetes, 50 (4): 785-96 (2001).
Mais notadamente, observa-se que GLP-1 é capaz de aumentar a divisão das células β e, portanto, aumentar as contagens de células β, o que não foi encontrado em nenhum outro remédio utilizado para o tratamento de diabetes até agora. Além disso, GLP-1 é eficaz para os pacientes que deixaram de responder ao tratamento de administração de sulfonil uréia. Adicionalmente, a administração de GLP-1 não aumenta a secreção de insulina quando a concentração de glicose no sangue é restaurada a nível normal. Desta forma, ela não resulta em hipoglicemia. Por todas as razões mencionadas acima, GLP-1 é considerado remédio desejável para o tratamento de diabetes mellitus. Isso também é verificado por estudos clínicos substanciais (Rachman, J. et al, Normalization oflnsulin Response to Glucose by Overnight Infusion of Glucagon-like Peptide 1 (7-36) Amide in Patients with NIDDM, Diabetes, 45 (11): 1524-30, 1996; Doyle, M. F. et al, Glucagon-like Peptide-1, Recent Progress in Hormone Research, 56: 377-99, 2001; Daniel J. Drucker, Minireview: The Glucagon-Like Peptides, Endocrinology, 142 (2): 521-527, 2001).
Entretanto, o custo da síntese química de GLP-1 é bastante alto. O preço de varejo para GLP-1 em grau de reagente é de $ 400/mg, o que restringe grandemente sua aplicação na clínica. Alguns pesquisadores tentaram utilizar métodos de engenharia genética para a produção do GLP-1 recombinante, seja na forma de proteína de fusão, seja na forma de proteína de secreção. O rendimento e o custo desta abordagem para produzir GLP-1 foram ainda muito aquém do satisfatório, tornando a produção de GLP-1 em larga escala a baixo custo impossível neste estágio. A presente invenção busca desenvolver método inovador de produção de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1 através da ligação de genes de forma conjunta. O método conforme a presente invenção pode ser utilizado para simplificar o processo, reduzir o custo de produção e, desta forma, possibilitar a produção de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1 em larga escala.
Breve Resumo da Invenção A presente invenção refere-se a um método de produção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) insulinotrópico e/ou análogos de GLP-1, composto de: (a) introdução de dois locais de divisão de endonuclease restritiva individuais capazes de formar um local híbrido para os dois terminais do gene que podem codificar o polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1; (b) ligação das extremidades coesivas para formar um local híbrido após a digestão com endonucleases restritivas e clonagem em um vetor de N cópias do gene GLP-1 (7-36) ligado em série, gene análogo a GLP-1 ou genes ligados interativamente que codificam polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1, em que N é um número inteiro de 1 a 32; (c) transformação do vetor que contém o gene ligado em série em célula hospedeira; (d) expressão na célula hospedeira de proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é número inteiro de 1 a 32, em que a mencionada proteína de fusão contém o polipeptídeo GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 ou sua combinação, mas sem nenhuma proteína veículo; (e) divisão da proteína de fusão; e (f) separação e purificação dos polipeptídeos GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1.
As duas endonucleases restritivas mencionadas acima capazes de formação de híbridos podem incluir, mas sem limitar-se a Bgl II e BamH I, Sal e Xho I. O vetor no método conforme a presente invenção pode conter N genes GLP-1 (7-36) ligados em série ou ligados interativamente e/ou genes análogos a GLP-1, em que N é um número inteiro de 1 a 32. Preferencialmente, N é um número inteiro de 8 a 32. De maior preferência, N deverá ser 16 ou 32.
As células hospedeiras utilizadas no método conforme a presente invenção podem expressar proteína de fusão que contém N cópias de polipeptídeo GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1, em que N é um número inteiro de 1 a 32. A proteína de fusão pode conter N cópias de polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1. Ela pode também conter diversas cópias de polipeptídeo GLP-1 (7-36) e análogos de GLP-1 com o número total de cópias igual a N. Preferencialmente, N é um número inteiro de 8 a 32. De maior preferência, N é um número inteiro de 16 ou 32.
Preferencialmente, as células hospedeiras conforme a presente invenção para a expressão de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1 são células procarióticas. A presente invenção também se refere aos polipeptídeos de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1 produzidos através do método conforme a presente invenção. O peptídeo GLP-1 (7-36) produzido através do método conforme a presente invenção contém a seqüência de aminoácidos exibida na fórmula I.
Breve Descrição dos Desenhos - A Figura 1 ilustra o processo de construção de vetor de expressão que contém uma cópia do gene que codifica polipeptídeo GLP-1 (7-36). - A Figura 2 exibe a seqüência de DNA resultante que codifica o polipeptídeo GLP-1 (7-36) após a ligação de fragmentos (1), (2), (3) e (4). - A Figura 3 exibe a seqüência de DNA resultante que codifica o polipeptídeo GLP-1 (7-36) após a ligação de fragmentos (1’), (2’), (3’) e (4’). - A Figura 4 ilustra o processo de construção de plasmídeo que contém de duas a 32 cópias de genes GLP-1 (7-36) em conjunto. - A Figura 5 exibe a curva de crescimento de células bacterianas elaboradas geneticamente durante o processo de fermentação. - A Figura 6 exibe o resultado da análise de HPLC do polipeptídeo GLP-1 (7-36) recombinante. - A Figura 7 exibe os resultados de análise de amínoácidos do polipeptídeo GLP-1 (7-36) recombinante. - A Figura 8 exibe os resultados de análise de espectro de massa do polipeptídeo GLP-1 (7-36) recombinante. - A Figura 9 exibe a variação da concentração de insulina no sangue de camundongos após a injeção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) nos camundongos. - A Figura 10 exibe a variação da concentração de peptídeo C em sangue de camundongos após a injeção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) nos camundongos. - A Figura 11 exibe a variação da concentração de glicose em sangue de camundongos após a injeção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) nos camundongos.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção fornece projeto delicado de seqüências de DNA que apresenta os locais híbridos para ligar diversas cópias de genes que codificam GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 em conjunto. A expressão dos fragmentos de DNA ligados interativamente ou ligados em série resultantes pode gerar proteína de fusão que contém diversas cópias de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1. Após a divisão da proteína de fusão e purificação adicional, podem ser obtidas em seguida grandes quantidades de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1. O GLP-1 (7-36) conforme a presente invenção contém a seqüência de amínoácidos conforme exibido na Fórmula 1. “Análogos de GLP-1” utilizado no presente designa os polipeptídeos que podem ser obtidos através de alteração, substituição ou modificação de um ou mais resíduos de amínoácidos na seqüência, conforme exibido na Fórmula I, ou na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo GLP-1 (7-37)-OH de ocorrência natural.
Estudos anteriores demonstraram que muitos análogos de GLP-1 possuem características similares de aumento da secreção de insulina. Representantes de análogos de GLP-1 incluem os descritos na Patente Norte-Americana n° 5.545.618 e na Patente Internacional n° WO 01/98331 A2. Estes análogos são obtidos através de alteração de um ou mais resíduos de aminoácidos no polipeptídeo GLP-1 (7-37) OH de ocorrência natural na posição 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 33, 34 ou 35. Análogos de GLP-1 representativos podem incluir, mas sem limitar-se a Gly8-GLP-1 Preferencialmente, os análogos de GLP-1 conforme a presente invenção podem conter resíduo(s) de aminoácidos de substituição conservadora. De maior preferência, estes análogos de GLP-1 podem conter resíduo(s) de aminoácidos de substituição altamente conservadora. “Substituição conservadora” é a substituição de aminoácido que contém a mesma carga eletrônica líquida e aproximadamente o mesmo tamanho e forma. “Substituição altamente conservadora” é a substituição de um aminoácido com outro aminoácido que contém o mesmo grupo funcional na cadeia lateral e praticamente o mesmo tamanho e forma. Aminoácidos com cadeias laterais de aminoácidos alifáticos ou alifáticos substituídos, por exemplo, possuem praticamente o mesmo tamanho quando o número total de carbono e heteroátomos nas suas cadeias laterais difere em não mais de dois. Eles possuem praticamente a mesma forma quando contêm o mesmo número de ramificações nas suas cadeias laterais. Exemplos de substituição altamente conservadora incluem valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico por ácido glutâmico e fenilglicina por fenilalanina. Exemplos de substituições que não são altamente conservadoras incluem alanina por valina, alanina por serina e ácido aspártico por serina. A presente invenção refere-se, portanto, a um método de produção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) insulinotrópico e/ou análogos de GLP-1 composto de: (a) introdução de dois locais de divisão de endonuclease restritiva individuais capazes de formar um local híbrido para os dois terminais do gene que pode codificar o polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1; (b) ligação das extremidades coesivas para formar um local híbrido após a digestão com endonucleases restritivas e clonagem em um vetor de N cópias do gene GLP-1 (7-36) ligado em série, gene análogo a GLP-1 ou genes ligados interativamente que codificam polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1, em que N é um número inteiro de 1 a 32; (c) transformação do vetor que contém o gene ligado em série em célula hospedeira; (d) expressão na célula hospedeira de proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é número inteiro de 1 a 32, em que a mencionada proteína de fusão contém o polipeptídeo GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 ou sua combinação, mas sem nenhuma proteína veículo; (e) divisão da proteína de fusão; e (f) separação e purificação dos polipeptídeos GLP-1 (7-36 e/ou análogos de GLP-1.
As duas endonucleases restritivas que podem ser utilizadas para formar um “local híbrido” podem incluir, mas sem limitar-se a Bgl II e BamH I, Sal I e Xho I. A seqüência básica reconhecida por Bgl II, por exemplo, é A|GA TCT, enquanto a reconhecida por BamH I é G|GA TCC. Após a digestão das duas seqüências com enzimas restritivas correspondentes, ligação das extremidades coesivas complementares resultantes pode formar seqüência de AGA TCC ou GGA TCT, que não pode ser dissecada através de Bgl II ou BamH I. Esta seqüência é denominada “local híbrido” e pode ser utilizada para ligar diversas cópias de certos genes em conjunto. A proteína de fusão conforme a presente invenção é composta de várias cópias de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1. Entre os dois peptídeos ligados (dois polipeptídeos GLP-1 (7-36), dois polipeptídeos análogos a GLP-1 ou um polipeptídeo GLP-1 (7-36) e um polipeptídeo análogo a GLP-1), existem um ou mais resíduos deaminoácidos. Para o propósito de divisão, a ligação de peptídeo formada entre o terminal N de cada polipeptídeo desejado (GLP-1 (7-36) ou análogo de GLP-1) e o(s) resíduo(s) mencionado(s) acima deve ser “ligação de peptídeo especificamente divisível”. “Ligação de peptídeo especificamente divisível” utilizada no presente designa ligação de peptídeo que pode ser especificamente reconhecida e dividida por certos reagentes químicos ou proteases. Como resultado da divisão, a cadeia de peptídeo é rompida. Os resíduos de aminoácidos utilizados no presente para formar ligação de peptídeo especificamente divisível com terminal N de GLP-1 (7-36) ou análogo de GLP-1 são denominados “aminoácidos formadores de ligação (BFAA)”. BFAA pode incluir, mas sem limitar-se a Met, que pode ser reconhecido por brometo de cinogênio, Arg que pode ser reconhecido por protease alcalina e a seqüência de aminoácidos de Asp Asp Asp Asp Lys, que pode ser reconhecida por enteroquinase.
Uma proteína de fusão pode ser dividida nas “ligações de peptídeos especificamente divisíveis”, utilizando métodos adequados. Após a divisão, a proteína de fusão pode ser decomposta em várias cópias de polipeptídeos GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1, em que cada polipeptídeo contém vários aminoácidos ligados ao seu terminal C. O processo descrito acima é denominado divisão N-terminal do peptídeo alvo.
Tome uma proteína de fusão que consiste de várias cópias de GLP-1 (7-36) como exemplo, a divisão N-terminal da proteína de fusão pode gerar várias cópias de GLP-1 (7-36)-Xaa”’Xaa, em que Xaa”’Xaa representa um ou mais resíduos de aminoácidos conectados entre si. Como o resíduo de aminoácido no terminal C de GLP-1 (7-36) é Arg, o uso de certas proteases que podem reconhecer especificamente a ligação de peptídeo formada no carboxila de Arg para dividir GLP-1 (7-36)-Xaa’”Xaa resultará em várias moléculas de polipeptídeo GLP-1 (7-36). O processo que ocorre no terminal C do peptídeo alvo é denominado divisão C-terminal. A ordem para o processo de divisão N-terminal e o processo de divisão C-terminal pode ser trocada.
Tipicamente, o resíduo Arg é adicionado ao terminal N de GLP-1 (7-36) e é utilizada protease adequada para divisão, que reconhece especificamente a ligação de peptídeo formada no carboxila de Arg. A proteína de fusão pode, portanto, ser cortada em diversas moléculas de polipeptídeo GLP-1 (7-36) sem outro resíduo ligado, pois o resíduo de aminoácido no aminoácido C-terminal de GLP-1 (7-36) é Arg. Também é viável adicionar Met ao terminal N de GLP-1 (7-36). A ligação de peptídeo formada com este Met pode ser dividida em primeiro lugar por CNBr e, em seguida, o peptídeo resultante é dividido por uma protease adequada para gerar diversas moléculas de peptídeo GLP-1 (7-36), pois o aminoácido C-terminal de GLP-1 (7-36) é Arg. A ordem para a divisão N-terminal e a divisão C-terminal pode ser trocada. Também é possível adicionar a seqüência de aminoácidos de Asp Asp Asp Asp Lys para o terminal N de GLP-1 (7-36); esta seqüência pode ser dividida especificamente por protease enteroquinase. A divisão proteolítica por enteroquinase pode também gerar diversas moléculas de peptídeo GLP-1 (7-36). É preferível adicionar resíduo de Arg ao terminal N de polipeptídeo GLP-1 (7-36) e análogos de GLP-1.
Com base na seqüência de aminoácidos de GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1, o gene que codifica GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 pode ser sintetizado com a adição de “aminoácido formador de peptídeo” codificador de códons no terminal 5’ do fragmento sintético. A seqüência de ligação e a seqüência reconhecida pela enzima restritiva também são incluídas nas duas extremidades do gene sintético. Após esta modificação, pode ser formado um fragmento de DNA que contém o códon que codifica GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 e os pares base nas duas extremidades que são reconhecidos por endonucleases restritivas. Este fragmento pode ser utilizado para ligar diversas cópias de GLP-1 (7-36) ou análogo de GLP-1 em conjunto e é então chamado “gene para conexão em série”.
Também é possível modificar a seqüência de DNA de GLP-1 de ocorrência natural para gerar "gene para conexão em série”. É preferível utilizar métodos sintéticos de preparação do gene na presente invenção. É bem conhecido que um aminoácido pode ser codificado por diversos códons. Os técnicos no assunto podem deduzir e sintetizar várias seqüências de DNA e combinações de sequências que codificam GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1. Na presente invenção, são preferidos códons com alta frequência em E. coli. O gene que codifica GLP-1 (7-36) ou peptídeo análogo a GLP-1 pode ser gerado de duas formas. Uma forma é através da ligação de vários fragmentos sintéticos por extremidades coesivas ou extremidades obtusas para gerar o gene alvo e a outra é a síntese do gene alvo completo através de síntese química. É preferível sintetizar vários fragmentos e gerar em seguida o gene alvo através de ligação.
Os locais de divisão de endonuclease restritiva que podem formar locais híbridos para as extremidades 5’ e 3’ dos genes que codificam GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 para o propósito de ligar várias cópias de genes em conjunto necessitam de seleção cuidadosa e projeto adequado. A seleção de locais de reconhecimento de endonucleases restritivas para o propósito de clonagem é baseada nos locais de endonucleases em um vetor e a seleção de locais de reconhecimento disponíveis é relativamente abundante.
Em realização preferida da presente invenção, os inventores selecionam códons com alta freqüência em E. coli para sintetizar quatro fragmentos genéticos. Após a ligação, o gene GLP-1 (7-36) recombinante resultante contém locais de endonuclease restritiva de Bgl II e BamH I nas suas duas extremidades, respectivamente, que são necessárias para a ligação de genes em conjunto. Os locais de clonagem de EcoR I e Hind III são necessários para inserção em um vetor. As posições para os locais de reconhecimento de Bgl II e BamH I podem ser trocadas.
Em outra realização preferida da presente invenção, os inventores selecionam códons com alta freqüência em E. coli para sintetizar quatro fragmentos genéticos. Após a ligação, o gene GLP-1 (7-36) resultante contém locais de endonuclease restritiva de Sal I e Xho I, que são necessários para ligar os genes em conjunto. Os locais de clonagem de EcoR I e Hind III são necessários para inserção em vetor.
Diversas cópias de genes que codificam GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 podem ser ligados em conjunto utilizando os locais de endonuclease mencionados acima e podem ser clonados em seguida em um vetor. Estes genes ligados em conjunto podem também ser misturados e emparelhados. A expressão “misturar e emparelhar” designa qualquer número de fragmentos de DNA misturados que codificam GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1 ligados entre si em conjunto em qualquer ordem. Os vetores que são apropriados para este propósito podem ser vetor derivado de cromossomos, não derivado de cromossomos ou de DNA sintético. Estes vetores podem incluir, mas sem limitar-se a DNA micrófago, vírus bacillus, plasmídeo de bactéria, plasmídeo de levedura e vetores derivados da combinação de DNA de fago, plasmídeo e viral. O DNA viral pode incluir, mas sem limitar-se a vírus da varicela bovina e aviária, adenovírus e vírus pseudo-hidrófobos. Muitos dos vetores apropriados são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Qualquer plasmídeo ou vetor que exista e reproduza-se de forma estável em células hospedeiras pode ser utilizado na presente invenção.
Exemplos representativos mas não limitados dos vetores de expressão incluem aqueles utilizados em sistemas bacterianos, tais como plasmídeos pKK233-2, pKK223-3, pEZZ18, pUC18, pUC19 e pT7 disponíveis comercialmente (Amersham Pharmacia Biotech). O gene alvo é ligado a um promotor adequado sobre vetor de expressão. Um promotor é uma seqüência que pode regular e controlar a transcrição genética. Os exemplos representativos de promotor incluem lac, trp, tac de E. coli; T7 de fago; PL de λ fago e outros promotores conhecidos existentes em células procarióticas, eucarióticas e vírus para controlar a expressão genética. Vale a pena mencionar especialmente que estes promotores em bactérias incluem lac I, lac Z, T3, T7, peptídeo de sinal de Proteína A, gpt, λΡκ, PL e trp. A seleção dos promotores apropriados é evidente para os técnicos no assunto.
Além disso, o vetor de expressão preferido pode conter um ou mais genes marcadores de seleção, de forma a tornar as células hospedeiras selecionáveis. Os representativos incluem genes resistentes à penicilina e tetraciclina em E. coli, di-hidrofolato reductase e genes resistentes à neomicina em sistemas de expressão eucariótica.
Os vetores de expressão presentes na presente invenção podem conter N cópias dos genes ligados em conjunto, em que N é um número inteiro de 1 a 32. Preferencialmente, N deverá ser um número inteiro de 8 a 32. De maior preferência, N deverá ser 16 ou 32.
Em realização preferida da presente invenção, o vetor de expressão contém uma cópia do gene GLP-1 (7-36).
Em outra realização preferida da presente invenção, o vetor de expressão contém duas cópias do gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Em outra realização de exemplo preferida apresentada na presente invenção, o vetor de expressão contém quatro cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Em outra realização preferida da presente invenção, o vetor de expressão contém oito cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Em outra realização preferida da presente invenção, o vetor de expressão contém doze cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Em outra realização preferida da presente invenção, o vetor de expressão contém 16 cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Em outra realização de exemplo preferida apresentada na presente invenção, o vetor de expressão contém 32 cópias do gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Os inventores depositaram uma linhagem de bactéria que conduz o vetor de expressão recombinante pKK223-3 que contém 32 cópias de genes GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto. 0 número de depósito da linhagem é CGMCC n° 0599. O vetor apresentado na presente invenção que conduz várias cópias de gene(s) e promotores apropriados ou outros componentes reguladores da expressão genética pode ser transformado em células hospedeiras apropriadas para expressar a proteína de fusão nas células hospedeiras. A presente invenção também se refere, portanto, a células hospedeiras que são capazes de expressar GLP-1 (7-36) ou polipeptídeos análogos a GLP-1. O vetor de expressão pode ser introduzido em células hospedeiras através de métodos de engenharia genética, tais como transformação, transfecção ou infecção, tais como transformação com cloreto de cálcio, transfecção na presença de DHAE-dextran como veículo ou eletroperfuração. Estes métodos podem transferir eficientemente o vetor que contém várias cópias de gene(s) em células hospedeiras. O vetor designado no presente pode ser plasmídeo, partícula viral ou fago bacteriano.
As células hospedeiras apropriadas podem incluir, mas sem limitar-se a células bacterianas tais como E. coli, estreptococo e salmonela, e células eucarióticas, tais como leveduras, etc. A seleção das células hospedeiras apropriadas é evidente para os técnicos no assunto.
Para o propósito de redução do custo de produção, as células procarióticas são as células hospedeiras preferidas. Exemplos representativos incluem várias linhagens de Escherichia coli, tais como JM103, JM109, HB101 e DH5 a. A célula hospedeira conforme a presente invenção conduz vetor de expressão que contém N cópias de gene codificador de GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1, em que N é um número inteiro de 1 a 32. Conseqüentemente, as células hospedeiras expressam proteínas de fusão que contêm N cópias de GLP-1 (7-36) e/ou peptídeos análogos a GLP-1 ligados em conjunto, em que N é um número inteiro de 1 a 32; preferencialmente, N deverá ser número inteiro de 8 a 32 e, de maior preferência, N deverá ser número inteiro de 16 a 32. A proteína de fusão não contém nenhuma outra proteína veículo.
Em realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém uma cópia de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente modificadas contêm um gene GLP-1 (7-36).
Em outra realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém duas cópias de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente elaboradas podem expressar a proteína de fusão que contém dois polipeptídeos GLP-1 (7-36).
Em outra realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém quatro cópias de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente elaboradas podem expressar a proteína de fusão que contém quatro polipeptídeos GLP-1 (7-36).
Em outra realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém oito cópias de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente elaboradas podem expressar a proteína de fusão que contém oito polipeptídeos GLP-1 (7-36).
Em outra realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém doze cópias de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente elaboradas podem expressar a proteína de fusão que contém doze polipeptídeos GLP-1 (7-36).
Em ainda outra realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém 16 cópias de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente elaboradas podem expressar a proteína de fusão que contém 16 polipeptídeos GLP-1 (7-36).
Em ainda outra realização preferida da presente invenção, o plasmídeo de expressão que contém 32 cópias de gene GLP-1 (7-36) é transformado em células JM103 de E. coli. As células JM103 geneticamente elaboradas podem expressar a proteína de fusão que contém 32 polipeptídeos GLP-1 (7-36).
Segundo o “Tratado de Budapeste Sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Propósitos de Procedimentos de Patentes”, a linhagem de bactérias geneticamente elaboradas que podem expressar a proteína de fusão que contém 32 polipeptídeos GLP-1 (7-36) foi depositada no Centro Geral de Coleta de Cultivos Microbiológicos da China (CGMCC). A data de depósito é 11 de julho de 2001 e o número de depósito é CGMCC n° 0599. A linhagem depositada conduz um plasmídeo que contém 32 cópias ligadas em série de gene GLP-1 (7-36). O depósito destina-se à conveniência dos técnicos no assunto. Qualquer reprodução, uso ou venda do microorganismo depositado necessita de permissão específica dos inventores. Essas permissões não foram concedidas no presente. A linhagem bacteriana geneticamente elaborada apresentada na presente invenção pode ser cultivada sob condições apropriadas para produzir e acumular as proteínas de fusão compostas de N cópias dos polipeptídeos ligados. As condições de cultivo tais como meio de cultivo, temperatura, umidade e valor de pH são evidentes para os técnicos no assunto.
Após o crescimento das células hospedeiras até densidade apropriada, elas podem normalmente ser colhidas através de centrifugação. As células são decompostas através de métodos físicos ou químicos. O produto resultante da operação acima é recolhido e submetido a purificação adicional.
As células de microorganismos que expressam proteínas recombinantes podem ser decompostas através de qualquer meio convencional, que pode incluir, mas sem limitar-se a ciclos de congelamento e descongelamento, tratamento mecânico ou ultrassônico ou agentes de lise celular. A seleção de protocolo apropriado para decompor células hospedeiras é evidente para os técnicos no assunto.
As proteínas de fusão apresentadas na presente invenção são compostas de diversos polipeptídeos. Os polipeptídeos podem ser GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1, ou uma mistura de ambos. Existem vários resíduos de aminoácidos entre os dois peptídeos vizinhos. Estes dois peptídeos podem ser dois peptídeos GLP-1 (7-36), dois peptídeos análogos de GLP-1 ou um polipeptídeo GLP-1 (7-36) e um análogo de GLP-1. Os aminoácidos ligados ao terminal N de cada GLP-1 (7-36) ou análogo de GLP-1 são “aminoácidos formadores de peptídeos”, da forma descrita acima, que formam “ligação de peptídeo especificamente divisível” com o resíduo de aminoácido N-terminal de cada peptídeo GLP-1 (7-36) ou peptídeo análogo a GLP-1. Sob condições apropriadas de divisão e com substâncias adequadas, a proteína de fusão pode ser dividida no terminal IM de cada GLP-1 (7-36) ou peptídeo análogo a GLP-1, produzindo vários GLP-1 (7-36) ou peptídeos análogos a GLP-1 com vários aminoácidos de ligação no seu terminal C. A proteína de fusão composta de N cópias de polipeptídeo GLP-1 (7-36) é dividida para gerar GLP-1 (7-36)-Xaa”’Xaa, em que Xaa’”Xaa representa um ou mais resíduos de aminoácidos em conjunto. Além disso, como o terminal C de GLP-1 (7-36) é um resíduo de Arg, a ligação de peptídeo formada entre o Arg e o Xaa”’Xaa pode ser dividida especificamente por protease adequada para gerar GLP-1 (7-36).
Como solução para simplificar o processo de divisão, Arg é selecionado como “aminoácido formador de peptídeo”. A protease é utilizada para dividir especificamente a ligação de peptídeo formada através do grupo carboxila de Arg. Desta forma, a proteína de fusão pode ser hidrolisada em várias moléculas do polipeptídeo, apenas através de uma etapa de divisão.
Em realização preferida da presente invenção, Met é selecionado como peptídeo formador de aminoácido. CNBr é utilizado para decompor a ligação de peptídeo formada através da participação do grupo carboxila de Met, seguida por protease (tal como clostripaina), que reconheceu especificamente a ligação de peptídeo formada através da participação do grupo carboxila de Arg. Este processo gera vários peptídeos GLP-1 (7-36) sem modificação de amidação C-terminal. A ordem das duas etapas de divisão mencionadas acima pode ser alterada. Em outra realização preferida da presente invenção, Arg é selecionado como “aminoácido formador de peptídeo”. Tripsina de protease pancreática pode dividir especificamente a ligação de peptídeo formada através da participação do grupo carboxila de Lys ou Arg. Alguns anidridos são utilizados neste processo para proteger Lys. Como resultado, tripsina pode ser utilizada para dividir especificamente a ligação de peptídeo formada através da participação do grupo carboxila de Arg. Uma etapa de divisão pode gerar, portanto, vários peptídeos GLP-1 (7-36) sem modificação de amidação C-terminal.
Após a divisão de proteínas de fusão, polipeptídeo de alta pureza pode ser obtido através de uma série de etapas de separação e purificação tais como métodos cromatográficos. Os métodos cromatográficos podem incluir, mas sem limitar-se a cromatografia de fase reversa, exclusão de tamanho, hidrofóbica e de troca de íons. Os meios utilizados nessas cromatografias podem ser adquiridos de fornecedores comerciais, tais como a Amersham Pharmacia Biotech, Whatman, Merk KGaA, Grace Vydac, etc. Cromatografia isolada ou uma combinação de várias etapas de cromatografia pode ser utilizada nos processos de purificação. De forma geral, HPLC é utilizada como meio de purificação. Tipicamente, é utilizada cromatografia de fase reversa C18 com sistema de TFA-CH3CN como fase móvel. Estes métodos cromatográficos são bem conhecidos dos técnicos no assunto.
Dever-se-á indicar que, embora o método de produção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) tenha sido descrito a seguir para ilustrar a presente invenção, deverá ser evidente para os técnicos no assunto que esse método pode também ser utilizado para produzir análogos de GLP-1, desde que o resíduo de aminoácido no terminal N e C de um análogo de GLP-1 possa formar “ligação de peptídeo especificamente divisível” com o(s) resíduo(s) de aminoácidos vizinho(s), enquanto a divisão não ocorrer internamente no interior do polipeptídeo. Portanto, os métodos de produção de análogos de GLP-1 através da ligação de genes de forma conjunta encontram-se dentro do escopo do que foi reivindicado na presente invenção.
Tipicamente, um análogo de GLP-1 contém Arg no seu terminal C, mas não contém Arg em nenhuma outra posição da seqüência de aminoácidos do análogo. Estes análogos de GLP-1 podem incluir, mas sem limitar-se a Em comparação com outros métodos de produção de GLP- 1 (7-36) e análogos de GLP-1, o método conforme a presente invenção possui méritos óbvios. A síntese química de GLP-1 é tecnicamente exigente e o custo é alto. Métodos de produção de GLP-1 recombinante através de abordagens de engenharia genética geraram pouco sucesso. Eles são geralmente descritos da forma a seguir: (1) Polipeptídeo que consiste de vinte a sessenta resíduos de aminoácidos expressos em células hospedeiras é facilmente degradado. Portanto, a expressão direta desse polipeptídeo não é viável. A fusão desse polipeptídeo com proteína veículo para formar corpos de inclusão insolúveis resulta em pouca degradação. O polipeptídeo, sob a maior parte das circunstâncias, somente conta 10% da proteína e fusão em termos de rendimento. Após a expressão da proteína de fusão, são conduzidas a separação e a purificação de corpos de inclusão. A divisão de proteína de fusão a seguir é normalmente conduzida com brometo de cianogênio em solução de ácido fórmico a 70%. Normalmente, a proteína veículo também é dividida em diversos pedaços de polipeptídeo quando a divisão é conduzida sobre proteína de fusão. Estes pedaços agregam etapas de processamento adicionais e custos ao processo de purificação e separação de proteínas a seguir. Caso GLP-1 (7-36) NH2 seja o produto final desejado, a amidação necessita ser realizada no terminal C do peptídeo recombinante. Em resumo, o rendimento do polipeptídeo recombinante utilizando o método descrito é baixo, o custo é alto e o processo de produção pode causar mais poluição ambiental. (2) Os métodos de produção de GLP-1, conforme descrito nas Patentes Norte-Americanas n° 5.512.459, 5.655.456, 5.707.826, 6.037.143 e 6.403.361 possuem algumas questões importantes que deverão ser solucionadas em primeiro lugar: divisão seletiva da proteína de fusão seguida por purificação eficiente, necessidade de substratos de dipeptídeo e tripeptídeo no processo de transpeptidação e garantir que somente Lys34 em GLP-1 (7-34)-Ala-Phe-Ala participe da transpeptidação, mas não Lys26. Esta metodologia é, portanto, complicada e de difícil controle. (3) Ligar um peptídeo de sinal a GLP-1 para produzi-lo na forma de proteína de secreção. Este método normalmente gera baixa quantidade de GLP-1 recombinante.
Na presente invenção, os inventores introduzem habilmente locais híbridos nas duas extremidades do gene que codifica GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1 para ligar de uma a 32 cópias desse gene em conjunto. A proteína de fusão expressa contém vários monômeros de GLP-1 (7-36) ou polipeptídeos análogos a GLP-1 que são especificamente divisíveis. Este método de produção pode reduzir grandemente o custo de produção, racionalizar o fluxo do processo e gerar alto rendimento de GLP-1 (7-36) recombinante e/ou polipeptídeos análogos a GLP-1. A presente invenção possibilita fornecer grandes quantidades de GLP-1 (7-36) a clínicas e é uma solução eficaz para seu custo para pacientes com diabetes mellitus do tipo li.
Os exemplos a seguir são ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de nenhuma forma.
Exemplo 1 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém uma Cópia de Gene GLP-1 (7-36) Quatro fragmentos de DNA são projetados de acordo com a seqüência de aminoácidos de GLP-1 (7-36) após a seleção de códons que são freqüentemente utilizados por E. coli. O códon de Arg é adicionado ao terminal 5’ do gene GLP-1 (7-36) a fim de criar o local de divisão da proteína de fusão resultante. No terminal 5’ e 3’, os locais de divisão para endonucleases restritivas Bgl II e BamH I são respectivamente introduzidos e, desta forma, extremidades coesivas complementares surgem da digestão de restrição de Bgl II e BamH I, o que facilita a ligação de fragmentos de DNA em conjunto. O processo de construção para criar o plasmideo de expressão que contém uma cópia de gene GLP-1 (7-36) encontra-se ilustrado na Figura 1. 1. Síntese de fragmentos de DNA: Os quatro fragmentos são sintetizados com sintetizador de DNA ABI 3900® (Applied Byosistems). As seqüências de fragmentos são exibidas, respectivamente, conforme segue: (1) 5’-AAT TCC AGA TCT ATG ÇGT CAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC
EcoR I Bgl II Arg AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG -3’ (2) 5’-ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGT ACC TTC CGC GTG ACG CAT AGA TCT GG -3’ (3) 5’-GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGG CTG GTG AAA GGT CGT GGA TCC TAG A -3’ (4) 5’-AG CTT CTA GGA TCC ACG ACC TTT CAC CAG CCA CGC GAT
Hind III BamH I AAA TTC TTT CGC CGC CTG -3’ O fragmento (1) contém, no seu terminal 5’, os locais que podem ser reconhecidos por EcoR I e Bgl II e contém um códon CGT que codifica Arg. O fragmento (2) contém a seqüência que é complementar à do fragmento (1). O fragmento (4) contém os locais que podem ser reconhecidos por Hind III e BamH I no seu terminal 5’. O fragmento (3) contém a seqüência que é complementar à do fragmento (4). O local AGA TCT reconhecido por Bgl II no fragmento (1) pode ser intercambiado com CGA TCC conforme reconhecido por BamH I no fragmento (4). 2. Ligar os fragmentos de DNA para formar uma cópia do gene GLP-1 (7-36): A ligação é realizada conforme descrito em Molecular Cloning (segunda edição, Sam Brook et al, publicado por Cold Spring Harbor Press).
Encontra-se a seguir breve descrição: os quatro fragmentos de DNA (cada conteúdo: A26onm = 5) foram dissolvidos em 50 μΙ de água duplamente destilada em quatro tubos de microcentrifugação. Os quatro tubos foram marcados, respectivamente, como n° 1 (A), n° 2 (B), n° 3 (C) e n° 4 (D). 1 μΙ de solução dos tubos n° 1 e 2 foram removidos, respectivamente, para um tubo de microcentrifugação de 1,5 ml e misturados. De forma similar, 1 μΙ de solução do n° 3 e n° 4 foram colocados respectivamente com pipeta e misturados em outro tubo de microcentrifugação. 1 μΙ de 10x tampão de quinase de polinucleotídeo, 1 μΐ de 1 mM ATP e 1 μΙ de polinucleotídeo quinase foram adicionados aos dois tubos, respectivamente. Os tubos foram incubados a 37 °C por uma hora, seguidos por incubação a 90 °C por cinco minutos para desativar a quinase. Em seguida, os tubos foram resfriados gradualmente à temperatura ambiente (RT). O conteúdo desses dois tubos foi misturado com a adição de 1 μΙ de 1 mM de ATP, 1 μΙ de 10 x tampão de T4DNA ligase e 1 μΙ de T4DNA ligase. A mistura foi incubada por 16 °C por uma noite. O término da ligação foi verificado através de análise do tamanho dos fragmentos sobre gel de agarose a 1% em mancha com brometo de etídio (EB). 3. Clonagem de gene GLP-1 (7-36) em vetor de expressão: Plasmídeo pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech) foi digerido por duas vezes em primeiro lugar com EcoR I e Hind III sob as condições apropriadas. Em seguida, adicionou-se fenol-clorofórmio e a fase aquosa foi lavada por duas vezes com clorofórmio. O DNA de plasmídeo digerido foi precipitado por isopropanol à temperatura ambiente por uma hora antes da centrifugação. O solvente orgânico no precipitado foi removido através de vaporização. O gene GLP-1 (7-36) ligado foi misturado com a solução de plasmídeo digerida por duas vezes e foram adicionados 1 μΙ de 1 mM de ATP, 1 μΙ de 10x tampão T4DNA ligase e 1 μΙ de T4DNA ligase. A mistura foi incubada a 18 °C por uma noite. 4. Transformação: Colônia JM103 isolada foi selecionada e cultivada em seguida em 50 ml de meio líquido LB a 37 °C até que a absorção do espectro a 600 nm (Αβοοηπι) de cultivo bacteriano atingisse 0,6. Após centrifugação do cultivo bacteriano líquido, a massa bacteriana foi colhida e suspensa em seguida em 10 ml de solução de CaCI2 resfriada com gelo (60 mM de CaCI2, glicerol a 15%, 10 mM de PIPES, pH 7,0). A suspensão foi centrifugada a 3000 rpm e a massa bacteriana foi novamente suspensa em 2 ml de solução de CaCI2 resfriada em gelo e mantida em banho de gelo para uso posterior. 50 μΙ de células competentes foram misturados com 5 μΙ de plasmídeo clonado. A mistura foi aquecida a 42 °C por dois minutos e resfriada em seguida. Após a adição de 100 μΙ de meio LB, esta mistura foi incubada a 37 °C por uma hora. A mistura foi espalhada em seguida sobre placa de agarose LB contendo 50 pg/ml de ampicilina. A placa foi incubada por uma noite a 37 °C. As monocolônias que aparecem sobre a placa foram tomadas e cultivadas para extração de plasmídeos. O plasmídeo resultante pGt foi digerido por duas vezes com EcoR I e Hind III e os genes clonados foram testados através de eletroforese sobre gel de agarose a 1%. 5. Verificação de seqüenciamento de DNA: A seqüência de DNA do gene GLP-1 (7-36) conduzida pelo plasmídeo recombinante foi analisada pelo seqüenciador automatizado ABI PRISM® 310 (Applied Biosystems). O resultado da análise é idêntico ao exibido na Figura 2.
Exemplo 2 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém uma Cópia de Gene GLP-1 (7-36) Após substituição do local Bgl II no fragmento (1) do Exemplo 1 com o local Sal I, foi sintetizado o fragmento (1’). De forma similar, o fragmento (4’) foi sintetizado após a substituição do local BamH I no fragmento (4) do Exemplo 1 com o local Xho I. A sequência de fragmento (2’) é complementar à do fragmento (1’), enquanto a seqüência do fragmento (3’) é complementar à do fragmento (4’)· As seqüências de fragmento (1’) e (4’) são conforme segue: (1 ’) 5-AAT TCC GTC GAC ATG CGT CAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC EcoR I Sal I Arg AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG -3’ (4’) 5’-AG CTT CTA CTC GAG ACG ACC TTT CAC CAG CCA CGC GAT Hind III Xho I AAA TTC TTT CGC CGC CTG -3’ Segundo os procedimentos descritos no Exemplo 1, realizou-se ligação dos quatro fragmentos, digestão do vetor, inserção do gene GLP-1 (7-36), transformação do vetor de expressão (em E. coli JM109) e análise da seqüência de DNA. O resultado da análise está de acordo com o exibido na Figura 3.
Exemplo 3 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém uma Cópia de Gene GLP-1 (7-36) Substitua o códon Arg no fragmento (1) do Exemplo 1 com códon Met para sintetizar o fragmento (Τ’). A seqüência de fragmento (2") é complementar à de (Γ). As seqüências de fragmento (3) e fragmento (4) permanecem idênticas. As seqüências de (Γ) e (2”) são exibidas abaixo: (1 ”) 5’-AAT TCC AGA TCT ATG ATG CAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC EcoR I Bgl II Mer AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG -3’ (2”) 5’-ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAA GGT ACC TTC CGC GTG CAT AGA TCT GG -3’ A digestão do vetor, inserção do gene GLP-1 (7-36), transformação do vetor de expressão (em E. coli JM109) e análise de seqüência de DNA foram realizadas conforme descrito no Exemplo 1.
Exemplo 4 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Abriga Duas Cópias de Gene GLP-1 (7-36) Método 1: Conforme exibido na Figura 4, 5 μΙ do plasmídeo gerado no Exemplo 1 foram adicionados a um tubo microcentrifugador de 0,5 ml e, em seguida, 1 μΙ de 10x Bgl II, 1 μΙ de Bgl II e 1 μΙ de Hind III foram respectivamente adicionados ao tubo. A mistura foi incubada a 37 °C por uma hora. O fragmento de gene GLP-1 (7-36) liberado foi recuperado através de eletroforese sobre gel de agarose a 1%. 1 μΙ do plasmídeo gerado no Exemplo 1 foi misturado com 1 μΙ de 10x tampão BamH I, 1 μΙ de BamH I e 1 μΙ de Hind III. A mistura foi incubada a 37 °C por uma hora. O fenol-clorofórmio foi adicionado em seguida e a fase aquosa foi lavada por duas vezes com clorofórmio. O DNA de plasmídeo digerido foi precipitado por 60% de isopropanol à temperatura ambiente por uma hora antes da centrifugação. O solvente orgânico no precipitado foi removido através de vaporização. A pelota foi dissolvida em 10 μΙ de água.
Misture o fragmento de gene GLP-1 (7-36) digerido por duas vezes Bgl II e Hind III com o plasmídeo digerido por duas vezes Hind III e BamH I. Em seguida, foram adicionados 1 μΙ de 1 rriM de ATP, 1 μΙ de 10x tampão T4 DNA ligase e 2 μΙ de T4 DNA ligase. A mistura foi incubada por uma noite a 18 °C.
Transforme células de E. coli JM103 competentes conforme descrito no Exemplo 1. A suspensão bacteriana foi espalhada em seguida sobre placa de LB agarose contendo 50 pg/ml de ampicilina. A placa foi mantida por uma noite a 37 °C. Colônias isoladas que apareceram sobre a placa foram tomadas e cultivadas para extração de plasmídeos. O plasmídeo resultante foi digerido por duas vezes com EcoR I e Hind III. Selecione os que contenham duas cópias de gene GLP-1 (7-36) ligado em conjunto através de eletroforese sobre gel de agarose a 1%. A linhagem bacteriana que abriga o plasmídeo desejado foi armazenada. Método 2: Utilize plasmídeo gerado no Exemplo 2 em vez no Exemplo 1 e substitua as endonucleases de restrição Bgl II e BamH I descritas no Método 1 com Sal I e Xho I, respectivamente. Outros procedimentos foram realizados conforme descrito no Método 1 para construir uma linhagem bacteriana geneticamente elaborada que abrigue duas cópias de gene GLP-1 (7-36). Método 3: Utilize o plasmídeo gerado no Exemplo 3 para construir a linhagem bacteriana geneticamente elaborada que abriga duas cópias do gene GLP-1 (7-36). Outros procedimentos foram realizados conforme descrito no Método 1.
Exemplo 5 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém Quatro Cópias de Gene GLP-1 (7-36) Seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 4, foi realizada a ligação de genes GLP-1 (7-36) em conjunto. Transforme células bacterianas apropriadas como plasmídeo que conduz quatro cópias de gene GLP-1 (7-36) e selecione a linhagem bacteriana que abriga um plasmídeo de expressão que conduz quatro cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Exemplo 6 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém Oito Cópias de Gene GLP-1 (7-36) Seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 4, foi realizada a ligação de gene GLP-1 (7-36) em conjunto. Transforme linhagem de células bacterianas apropriadas com o plasmídeo que conduz oito cópias de gene GLP-1 (7-36) e selecione a linhagem bacteriana que abriga um plasmídeo de expressão que conduz oito cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Exemplo 7 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém Doze Cópias de Gene GLP-1 (7-36) Utilize os plasmídeos que conduzem quatro cópias de gene GLP-1 (7-36) e os plasmídeos que conduzem oito cópias de gene GLP-1 (7-36). Conduza digestão dupla destes dois tipos de plasmídeos, respectivamente. Seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 4, realize a ligação em conjunto e foi obtido o plasmídeo que conduz doze cópias de gene GLP-1 (7-36). Transforme a linhagem celular bacteriana apropriada com o plasmídeo e selecione a linhagem bacteriana que abriga um plasmídeo de expressão que conduz doze cópias de gene GLP-1 (7-36) ligadas em conjunto.
Exemplo 8 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém 16 Cópias de Gene GLP-1 (7-36) Seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 4, repita a ligação de gene GLP-1 (7-36) em conjunto. Transforme a linhagem celular bacteriana apropriada com o plasmídeo que conduz 16 cópias de gene GLP-1 (7-36) e selecione a linhagem bacteriana que abriga um plasmídeo de expressão que conduz 16 cópias de gene GLP-1 (7-36) ligado em conjunto.
Exemplo 9 Construção de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Contém 32 Cópias de Gene GLP-1 (7-36) Seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 4, repita a ligação do gene GLP-1 (7-36) em conjunto. Transforme a linhagem celular bacteriana apropriada com o plasmídeo que conduz 32 cópias de gene GLP-1 (7-36) e selecione a linhagem bacteriana que abriga plasmídeo de expressão que conduz 32 cópias de genes GLP-1 (7-36) ligados em conjunto.
Exemplo 10 Fermentação de Linhagem Bacteriana Geneticamente Elaborada que Abriga Gene GLP-1 (7-36) A fermentação de linhagem bacteriana geneticamente elaborada que abriga gene GLP-1 (7-36) foi conduzida segundo o método descrito por Aizhen Wu et al em A Study of Fermentation Process of a Genetically Engineered E. coli (Chinese Journal of Biotechnology, Vol. 12 suplemento, págs. 53-57, 1996). 1. Cultivo de bactérias semeadoras: O meio de cultivo de bactérias semeadoras contém 10 g/l de peptona, 5 g/l de extratos de levedura (da Difen, Sigma ou Oxoid), 20 ml de 0,2M tampão de fosfato a pH 7,0 e CaCI2, Ni(N04)3, CoCI3, MgS04 e FeCI3 (1 mg/l de cada sal). O meio foi colocado em autoclave por vinte minutos a 120 °C. Após resfriamento a 37 °C, adicionou-se 50 mg/l de ampicilina, 20 ml de desespumante, 20 ml de semeador e 5 ml de glicose a 20%. O valor do pH foi ajustado a 6,8-7,2 com 2 M NaOH e 2 M HCI. Foi conduzida a fermentação em seguida. 2. Fermentação: A fermentação foi conduzida em biorreator de 5, 15 ou 150 litros (B. Braun Biostat). As condições de fermentação foram as seguintes: temperatura de 37 °C, PL 30-42 °C, velocidade de agitação de 500 rpm, pH 6,8-7,2, ventilação de 5 l/min, 15 l/min ou 150 l/min, respectivamente, e D02 (C02 ?) a 50%. 3. Medições de concentração bacteriana durante a fermentação: A concentração bacteriana foi medida de hora em hora, tomando-se 1 ml de cultivo de fermentação. Após a centrifugação do cultivo a 8000 rpm por dez minutos, o sobrenadante foi removido e a massa úmida de massa bacteriana foi pesada. Alternativamente, a concentração pode ser medida através de detecção da densidade a OD600nm· Conforme exibido na Figura 5, após doze a dezesseis horas de fermentação, a densidade de bactérias no fermentador foi de 150 g/l (massa úmida). Foi atingido o estágio de repouso e encerrou-se a fermentação.
Exemplo 11 Extração do Corpo de Inclusão Após a fermentação, o meio de cultivo foi centrifugado a 4000 rpm. A massa bacteriana foi colhida e homogeneizada por duas vezes para rompimento sob pressão de 50 MPa em homogeneizador. A suspensão de fragmentos celulares foi centrifugada a 6000 rpm e o sobrenadante resultante foi removido. Com outra rodada de centrifugação a 10.000 rpm, o corpo de inclusão foi recolhido e lavado em seguida por duas vezes com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo 10 mM de EDTA e NaCI a 1%. Após a dissolução do corpo de inclusão em solução de 8M de uréia, as impurezas não dissolvidas foram removidas através de centrifugação. Utilizou-se ultrafiltragem para remover uréia no sobrenadante e, em seguida, o corpo de inclusão foi colhido com centrifugação.
Exemplo 12 Divisão do Corpo de Inclusão Proteólise de uma etapa: Os corpos de inclusão que resultaram da fermentação da linhagem bacteriana geneticamente elaborada construída com o Método 1 ou 2 no Exemplo 4 podem ser divididos através dos procedimentos a seguir. I. Uso de clostripaino protease: Clostripaina pode dividir especificamente a ligação de peptídeo formada através da participação de carboxila de resíduo de Arg. O corpo de inclusão gerado no Exemplo 11 foi suspenso em 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,5). A clostripaino protease foi adicionada em razão de 1000:1 (peso seco de proteína: quantidade de clostripaina). A mistura foi incubada a 37 °C, amostrada continuamente e monitorada através de HPLC até que todos os corpos de inclusão estivessem completamente divididos. As impurezas de moléculas grandes foram removidas com ultrafiltragem (MWCO de 10.000). GLP-1 (7-36) foi purificado com HPLC em escala de preparação e liofilizado para gerar o peptídeo desejado com pureza de mais de 99%. II. Uso de tripsino protease: Protease tripsina pancreática pode dividir a ligação de peptídeo formada através da participação de carboxila do resíduo Lys ou resíduo Arg. Quando o resíduo Lys for protegido por anidrido, a ligação de peptídeo formada através da participação de carboxila de Arg pode ser dividida especificamente por tripsina.
Dissolva 200 gramas (peso líquido) dos corpos de inclusão resultantes do Exemplo 11 em cinco litros de 20 mM de solução de NaHC03 com um grama de anidrido de citraconila para conduzir a reação de acilação sob pH de 8,0 por duas horas. As moléculas pequenas foram removidas com ultrafiltragem (10.000 MWCO). A tripsina foi adicionada em razão de 1000/1 (entre a proteína em peso seco e a protease). A reação proteolítica foi conduzida a 37 °C e monitorada com HPLC até o término da divisão dos corpos de inclusão. GLP-1 (7-36) foi purificado adicionalmente com HPLC em escala de preparação e liofilizado para gerar o peptídeo desejado com pureza de mais de 99%.
Divisão em duas etapas: Os corpos de inclusão que resultaram da fermentação da linhagem de bactéria geneticamente elaborada construída com o Método 3 no Exemplo 4 podem ser divididos através do método a seguir. A proteína de fusão do corpo de inclusão foi dissolvida em ácido fórmico a 70% ou solução de 8M de uréia para atingir faixa de concentração de cerca de 2 a 100 mg/ml (peso seco). Adicione brometo de cianogênio (CNBr) sob razão molar de 1:100 (entre proteína de fusão e brometo de cianogênio). A mistura foi agitada no escuro por oito a 24 horas. Sob estas condições, CNBr divide especificamente a ligação de peptídeo formada pelo carboxila de Met. Esta foi a primeira etapa do processo de divisão em duas etapas. A solução da primeira divisão foi filtrada com membrana 1000 MWCO para remover moléculas pequenas. Em seguida, siga os procedimentos no Exemplo 12 para conduzir a segunda divisão com protease sobre a ligação de peptídeo formada pelo carboxila de Arg para gerar peptídeo GLP-1 (7-36). GLP-1 (7-36) foi adicionalmente purificado com HPLC em escala de preparação e liofilizado para gerar o peptídeo desejado com mais de 99% de pureza.
Exemplo 13 Análise Química de Polipeptídeo GLP-1 (17-36) 1. Análise de pureza: Utilize HPLC Agilent 1100 e coluna de cromatografia C18 Zorbax SB com diâmetro interno de 4,6 mm e comprimento de 150 mm. A fase móvel A foi TFA a 0,1% e a fase móvel B foi TFA a 0,1%/CH3CN a 80%. Formou-se gradiente de B a 10-80% em vinte minutos. A velocidade de fluxo foi de 1 ml/min.
Dissolva 1 mg de GLP-1 (7-36) em pó liofilizado (pureza de mais de 99%) em 1 ml de TFA a 0,1%. Carregue 10 μΙ da amostra à coluna. O resultado foi exibido na Figura 6. 2. Análise da composição de aminoácidos: Dissolva 100 pg de GLP-1 (7-36) em 0,5 ml de 5,7N HCI destilado duplamente. A solução resultante foi vedada firmemente em recipiente e incubada a 110 °C por vinte horas. Remova HCI através de evaporação a vácuo. Repita o processo de evaporação por duas vezes com água destilada duplamente. O volume foi medido e uma amostra foi depositada em seguida para conduzir análise de composição de aminoácidos com Analisador de Aminoácidos Hitachi L-8800 (Hitachi Scientific Instrument). Os valores observados foram consistentes com os teóricos, conforme exibido na Figura 7. 3. Análise de espectro de massa: Pequena amostra de peptídeo GLP-1 (7-36) foi utilizada para conduzir análise de HPLC-MS com Sistema API 2000 LC/MS/MS (Applied Biosystems). O resultado foi exibido na Figura 8. O peptídeo GLP-1 (7-36) resultante da metodologia conforme a presente invenção possui peso molecular de 3297,12. A diferença entre o MW calculado de 3298,68 e o valor medido foi aceitável. 4. Análise de sequência de peptídeos: A amostra foi preparada com o método descrito na análise de composição acima. Sequência de peptídeos N-terminais de GLP-1 (7-36) produzido foi determinada por analisador de seqüências de proteína automatizado Precise® cLC (Applied Biosystems). Os resultados indicam a seqüência dos primeiros quinze aminoácidos de GLP-1 (7-36) produzidos foi correta (esta análise foi realizada pela Faculdade de Ciências da Vida, Universidade de Pequim).
Exemplo 14 Efeito de GLP-1 (7-36) Sobre o Aumento da Secreção de Insulina Camundongos C57/BL/6J saudáveis foram adquiridos do Laboratório Central de Animais de Xangai da Academia Chinesa de Ciências. Os camundongos foram divididos em três grupos com seis camundongos em cada grupo. O grupo placebo de camundongos recebeu 200 μΙ de solução salina injetada na sua cavidade abdominal, enquanto o grupo de teste recebeu 10 pg de GLP-1 (7-36) e o grupo controle positivo recebeu 10 pg de GLP-1 (7-36) NH2 (Sigma). O momento em que os animais receberam a injeção foi ajustado como momento zero. 50 pl de sangue foram retirados das veias em ângulo fechado com capilar graduado que havia sido enxaguado com heparina e seco em seguida. As amostras de sangue foram depositadas em seguida no quinto, 15°, 30° e 60° minutos. As amostras de sangue foram misturadas imediatamente com 50 pl de solução salina em tubo microcentrifugador. A mistura foi centrifugada a 3000 rpm para remover eritrócitos. O soro foi utilizado para medir a concentração de insulina. O kit de radioimunoensaio (Instituto de Produtos Biológicos de Xangai, Ministério Chinês da Saúde) para insulina foi utilizado para medir o efeito de GLP-1 (7-36) sobre a secreção de insulina. Conforme exibido na Figura 9, não houve mudança significativa na concentração de insulina no grupo placebo e os dois grupos que recebem GLP-1 (7-36) e GLP-1 (7-36) NH2 exibem respectivamente aumento significativo da concentração de insulina no soro. Esta observação indica que a administração de GLP-1 (7-36) ou GLP-1 (7-36) NH2 aumenta a secreção de insulina em camundongos. Este resultado confirma, portanto, que GLP-1 (7-36) exibe perfil similar a GLP-1 (7-36) NH2 em termos de aumento da secreção de insulina em camundongos.
Exemplo 15 Efeito de GLP-1 (7-36) Sobre o Aumento da Secreção de Peptídeo C
Conforme descrito no Exemplo 14, camundongos C57/BL/6J foram divididos em dois grupos, com o grupo de placebo recebendo 200 μΙ de solução salina injetados em cavidade abdominal e o grupo de teste recebendo 10 mg de GLP-1 (7-36). Foi utilizado kit de radioimunoensaio (Instituto de Produtos Biológicos de Xangai, Ministério Chinês da Saúde) para peptídeo C, para medir o efeito de GLP-1 (7-36) sobre a secreção de peptídeo C.
Conforme exibido na Figura 10, não houve mudança significativa na concentração de peptídeo C no grupo de placebo e os grupos que recebem GLP-1 (7-36) exibiram aumento significativo da concentração de peptídeo C no soro. Esta observação indica que a administração de GLP-1 (7-36) aumenta a secreção de peptídeo C em camundongos.
Exemplo 16 Efeito de GLP-1 (7-36) Sobre a Redução do Nível de Glicose no Sangue Camundongos C57/BL/6J saudáveis foram adquiridos do Laboratório Central de Animais de Xangai da Academia Chinesa de Ciências. Os camundongos foram divididos em quatro grupos com seis camundongos em cada grupo. Camundongos que se alimentaram por uma noite foram injetados através de cavidade abdominal. No grupo de placebo, foram injetados 200 μΙ de solução de glicose a 40%, no grupo de teste, foram injetados 200 μΙ de solução de glicose a 40% mais 10 μg de GLP-1 (7-36), no grupo de controle positivo (I), foram injetados 200 μΙ de solução de glicose a 40% mais 10 μg de GLP-1 (7-36) NH2 (Sigma) e no grupo de controle positivo (II) foram injetados 200 μΙ de solução de glicose a 40% mais 10 μg de GLP-1 (7-37) (Sigma). O momento em que os animais receberam a injeção foi definido como tempo zero. Após a injeção, 20 μΙ de amostra de sangue foram retirados imediatamente do seno ótico de cada camundongo com capilar tratado com heparina. As amostras de sangue foram imediatamente misturadas com 300 μΙ de solução salina em tubo de microcentrifugação, a mistura foi centrifugada a 3000 rpm para remover eritrócitos. O soro foi utilizado para medir a concentração de glicose no soro. Este procedimento foi repetido nos 30°, 60° e 120° minutos. A concentração de glicose no sangue e soro foi medida por kit comercial (Instituto de Produtos Biológicos de Xangai, Ministério Chinês de Saúde). Conforme exibido na Figura 11, aumento significativo na concentração de glicose no sangue do grupo de placebo (injetado apenas com glicose) e foi observada queda gradual até o nível normal. Para os outros três grupos de camundongos, a concentração de glicose no sangue e soro não apresenta elevação óbvia do nível normal durante o processo de medição. Esta observação indica que a administração de GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36) NH2 ou GLP-1 (7-37) pode aumentar a secreção de insulina em camundongos para evitar a flutuação dramática da concentração de glicose no sangue. Os resultados confirmam, portanto, que GLP-1 (7-36) exibe perfil similar a GLP-1 (7-36) NH2 ou GLP-1 (7-37) em termos de redução da glicose de sangue.
Embora as realizações preferidas e as figuras da presente invenção tenham sido descritas nos parágrafos anteriores, deverá ser evidente para os técnicos no assunto que modificações e edições alternativas da presente invenção são possíveis e métodos e substâncias substancialmente idênticas encontram-se ainda dentro do escopo da presente invenção, que é descrita nas reivindicações a seguir. Declaração separada do material biológico depositado 1. Nome e endereço da instituição depositária: Nome: Comitê Chinês de Coleção de Cultivos de Microorganismos, Centro Geral de Cultivo Microbiológico.
Endereço: Zhong-guan-cun, Beijing, China. 2. Data do depósito do material biológico junto à instituição: 11 de julho de 2001 3. Número de Acesso emitido pela Instituição Depositária: CGMCC N° 0599 4. Nome e endereço do depositante: Nome: Shanghai Hua-Yi Bio-Tech Lab.
Endereço: N° 36 Gaobao Road, Shanghai, China.
SEQUENCE LISTING <110> SHANGHAI HUA-YI BIO-TECH LAB SUN, Yukun WU, Dengxi WU, Aizhen ZHU, Zhiyong YU, Gang ZHOU, Jiaxiang ZHAO, Shaoling <120> A METHOD OF PRODUCING INSULINOTROPIC GLP-1 (7-36) POLYPEPTIDE AND/OR GLP-1 ANALOGS
Claims (16)
1. Método de produção de polipeptídeo GLP-1 (7-36) (SEQ ID NO:1) insulinotrópico e/ou análogos de GLP-1 que compreende: (a) introdução de dois sítios de divagem de endonuclease de restrição individuais capazes de formar um local híbrido para os dois terminais do gene que pode codificar o polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1; (b) ligação das extremidades coesivas para formar um local híbrido após a digestão com endonucleases de restrição e clonagem em um vetor de N cópias do gene GLP-1 (7-36) ligado em série, gene análogo de GLP-1 ou genes ligados interativamente que codificam o polipeptídeo GLP-1 (7-36) ou análogos de GLP-1, em que N é um número inteiro de 2 a 32; (c) transformação do vetor que contém o gene ligado em série em uma célula hospedeira; (d) expressão na célula hospedeira de uma proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é um número inteiro de 2 a 32, em que a mencionada proteína de fusão contém o polipeptídeo GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 ou sua combinação, mas sem nenhuma proteína veículo; (e) divagem da proteína de fusão; (f) separação e purificação dos polipeptídeos GLP-1 (7-36) e/ou análogos de GLP-1.
2. Método conforme a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as duas endonucleases de restrição capazes de formar um local híbrido são Bgl II e BamH I.
3. Método conforme a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as duas endonucleases de restrição capazes de formar um local híbrido são Sal I e Xhol I.
4. Método conforme a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor contém N cópias do gene ligado em série, em que N é um número inteiro de 2 a 32.
5. Método conforme a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor contém N cópias do gene ligado em série, em que N é um número inteiro de 8 a 32.
6. Método conforme a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor contém N cópias do gene ligado em série, em que N é 16.
7. Método conforme a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor contém N cópias do gene ligado em série, em que N é 32.
8. Método conforme a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o mencionado vetor é aquele contido no depósito de CGMCC Acesso n° 0599.
9. Método conforme a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira pode expressar uma proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é um número inteiro de 2 a 32.
10. Método conforme a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira pode expressar uma proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é um número inteiro de 8 a 32.
11. Método conforme a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira pode expressar uma proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é 16.
12. Método conforme a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira pode expressar uma proteína de fusão que contém N cópias de um polipeptídeo, em que N é 32.
13. Método conforme qualquer das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira é uma célula procariótica.
14. Método conforme a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira é Escherichia coli JM103, JM109, HB101 ou DH5 a.
15. Método conforme a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a mencionada célula hospedeira é aquela contida em CGMCC Depósito n° 0599.
16. Método conforme a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mencionada protease utilizada para dividir a proteína de fusão é Clostrispan ou Tripsina.
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