BG64680B1 - Химерен протеин на интерлевкин-6 разтворим рецептор/ лиганд, негови аналози и тяхното използване - Google Patents
Химерен протеин на интерлевкин-6 разтворим рецептор/ лиганд, негови аналози и тяхното използване Download PDFInfo
- Publication number
- BG64680B1 BG64680B1 BG104070A BG10407000A BG64680B1 BG 64680 B1 BG64680 B1 BG 64680B1 BG 104070 A BG104070 A BG 104070A BG 10407000 A BG10407000 A BG 10407000A BG 64680 B1 BG64680 B1 BG 64680B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- sil
- protein
- chimeric
- cells
- analogs
- Prior art date
Links
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 title claims abstract description 271
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 title claims abstract description 271
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 112
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 title description 225
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 101
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 72
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 34
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 11
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 2
- 101800001839 Soluble interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims 1
- 102400001298 Soluble interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 10
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- -1 signaling peptide Chemical class 0.000 description 5
- 102100028029 SCL-interrupting locus protein Human genes 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- FSPQCTGGIANIJZ-UHFFFAOYSA-N 2-[[(3,4-dimethoxyphenyl)-oxomethyl]amino]-4,5,6,7-tetrahydro-1-benzothiophene-3-carboxamide Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)NC1=C(C(N)=O)C(CCCC2)=C2S1 FSPQCTGGIANIJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HOIPREWORBVRLD-XIRDDKMYSA-N Glu-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O HOIPREWORBVRLD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- CHDWDBPJOZVZSE-KKUMJFAQSA-N Glu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CHDWDBPJOZVZSE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000938351 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101150101999 IL6 gene Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101710151245 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 2
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 102000057382 human EPHA3 Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000002629 repopulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035921 thrombopoiesis Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-2,2-bis(chloromethyl)propane Chemical compound ClCC(CCl)(CCl)CCl KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N Arg-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- GMRGSBAMMMVDGG-GUBZILKMSA-N Asn-Arg-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N GMRGSBAMMMVDGG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124295 CD38 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N Cys-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N Glu-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- UYDDNEYNGGSTDW-OYDLWJJNSA-N Met-Trp-Trp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)O)N UYDDNEYNGGSTDW-OYDLWJJNSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- CVAUVSOFHJKCHN-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Cys Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CVAUVSOFHJKCHN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- IPVPGAADZXRZSH-RNXOBYDBSA-N Phe-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O IPVPGAADZXRZSH-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- KIDXAAQVMNLJFQ-KZVJFYERSA-N Pro-Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KIDXAAQVMNLJFQ-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N Tyr-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BVOCLAPFOBSJHR-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O BVOCLAPFOBSJHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000020094 liqueur Nutrition 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 231100000149 liver necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007801 sublethal irradiation Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical class [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до химерни протеини, конструирани чрез сливане на естествено срещани в природата форми на разтворимия IL-6 рецептор, и до IL-6. Те се прилагат за лечение на рак и заболявания на черния дроб, за улесняване на трансплантирането на костен мозък и за лечение на други състояния, свързани с IL-6.
Description
Област на техниката
Изобретението най-общо се отнася до областта на интерлевкин-6 (IL-6) биологичните активности, които зависят от агонистичното действие на разтворимия IL-6 рецептор (sIL6R). Настоящото изобретение се отнася поспециално до нови химерни SIL-6R/IL-6 протеини, конструирани при сливането главно на естествено срещани в природата форми на sIL6R и IL-6, и техните биологично активни аналози, които са изключително полезни при третирането на рак, чрез инхибиране на растежа на раковите клетки, за засилване на трансплантирането на костния мозък, за третиране на нарушения на черния дроб и други, свързани с IL-6 състояния.
Предшестващо състояние на техниката
Интерлевкин-6 (IL-6) е добре известен цитокин, чиито биологични активности се медиират чрез мембранна рецепторна система, включваща два различни протеина, единият наречен IL-6 Рецептор (IL-6R или gp8O), а другият - gp 130 (разглеждан от Hirano et al., 1994). Разтворимите форми на IL-6 (sIL-6R), съответстващи на извънклетъчния домен gp80, са естествени продукти на човешкото тяло, открити като гликопротеини в кръв и урина (Novick et al., 1990, 1992). Едно изключително качество на sIL-6R молекулите е това, че те действат като силни агонисти на IL-6 върху много типове клетки, включително човешки клетки (Taga et al., 1989; Novick et al., 1992). Това се дължи на факта, че даже и без вътрецитоплазмения домен на gp80, sIL-6R е все пак способен да отпуши димеризирането на gp 130 като отговор на IL-6, който на свой ред медиира последващата трансдукция на IL-6-специфичния сигнал и биологичните ефекти (Murakami et al., 1993). Активният IL-6 рецепторен комплекс е в действителност хексамерна структура, образувана от две gp 130 вериги, два IL-6 лиганда (Ward et al., 1994; Paonesa et al., 1995), в който sIL-6R има два вида взаимодействия с gpl30, като и двата са основни за IL-6-специфичните биологични активности (Halimi et al., 1995).
Третирането с sIL-6R води до засилване на биологичните действия на IL-6 в много типове клетки. Пример за туморни клетки, чийто растеж се инхибира до голяма степен от IL6 , когато се прибави sIL-6R, така както миши миелолевкимични Ml клетки (Taga et al.,
1989), T47D клетки от човешка карцинома на гърдата (Novick et al., 1992) или клетки от човешка He-малка карцинома на белите дробове (Ganapathi et al., 1996). IL-6 има противометастазно действие in vivo (Katz et al., 1995), sIL-6R и може също да засили in vivo такива противометастазни действия на IL-6 (Mackiewicz et al., 1995), Друго действие на IL-6, което се засилва от прибавянето на sIL6R е стимулирането на хематопоетичните стволови клетки да продуцират мултилинейни колонии (Sui et al., 1995). Изобретателите на настоящето изобретение са наблюдавали, също така, че преживяемоста на първични култури на мозъчни олигодендроцити се поддържа от комбинацията на sIL-6R и IL-6 (Oh, 1997), докато IL-6 самостоятелно е слабо активен в такива култури (Kahan and De Vellis, 1994). Това откритие показва, че IL-6, когато се комбинира с sIL-6R може да маскира активността на други невротропични цитокини, като Ресничестия Невротропичен фактор (Ciliary Neutropic Facter CNTF) или Инхибиращ Левкемията фактор (Leukemia Inhibitory Factor - LIF), който също действа чрез gpl30, както е също случая за IL-11 и за Онкостатин М (Oncostatin М) (Hirano et al., 1994).
В опит да се предостави молекула, която да може да комбинира споменатите функции на IL-6 и sIL-6R, наскоро бе докладвано за получаването на рекомбинантни дрождеви клетки от слят протеин между скъсени сегменти от последователност на човешки IL-6, свързани чрез богат на глицин линкер (Fisher et al., 1997). Този слят протеин включва по същество единствено N-домен на рецептора на IL6R цитокин и С-домена на рецептора на цитокин, като по този начин му липсват по същество всички IL-6 имуноглобулин (Ig)-noflo6eH домен, и рецепторната пре-мембранна област (област между С-домена и трансмембранния домен). Като такъв, той представлява скъсена форма на sIL-6R, като тази скъсена форма на sIL-6R в слетия протеин е свързана чрез спо менатия богат на глицин линкер към по същество цялата зряла форма на IL-6. Освен липсващи части на естествения sIL-6R, този слят протеин, като е продуциран в дрождеви клетки, няма гликокозилираща матрица, като такъв протеин би имал, ако се продуцира в клетки на бозайник, по-специално например в човешки клетки. Всъщност, този продуциран в дрожди слят протеин е с молекулно тегло от приблизително 57 kDa, в контраст със слетия протеин, съдържащ по същество всички от естествените аминокиселинни остатъци на sIL6R и IL-6, и който напълно се гликозилира в клетки от бозайници (например, човешки), който е с очакваното молекулно тегло от приблизително 85 kDa (пример 2).
Общата практика в развитието на рекомбинантните протеини, които могат да се използват за лечение на хора е показала, че е важно да се остане колкото се може по-близо до естествените форми на протеините, така както се намират в човешкото тяло, с цел да се избегне създаването на антитела и други странични ефекти, наблюдавани при прилагане на неестествени рекомбинантни продукти. Поради тази причина, предимство е да се използват системи на рекомбинантни клетки от бозайници за продуциране на гликозилирани протеини като интерферон- или фактор стимулиращ гранулоцитни колонии (Chemajovsky et al., 1984, Holloway, 1994) в химична форма, доколкото е възможно по-подобна на естествения човешки продукт. Бактерии и микроорганизми, например дрожди, които не гликозилират правилно, също причиняват погрешно нагъване на протеиновите вериги, което води до имуногенни реакции. Това е изключително важно с оглед на IL-6, който силно се модифицира посттранслационно чрез N- и О-гликозилиране, така както и чрез фосфорилиране (Revel, 1989 за преглед), и с оглед на естествения sIL-6R от човешка кръв и урина, който е гликопротеин, чиито N-терминални и С-терминални аминокиселини са постоянни и са определени (Novick et al., 1990 и в съсобственост на патенти на настоящите изобретатели US5216128 и съответния ЕР 413 908 В1).
В съответствие, изглежда, че посоченият предходен продукт на сливане между sIL6R и IL-6 притежава известен брой откази, поспециално по отношение на използването му за лечение на хора и това, поради факта, че му липсват части от sIL-6R, така както и неговото продуциране в дрожди, което може да допринесе за некоректното гликозилиране на протеина.
До този момент не са описани слятата молекула, притежаваща естествения sIL-6R открит в човешка кръв и естествения IL-6, който се продуцира в човешки клетки и клетки на други бозайници.
Това следователно е цел за настоящото изобретение - да предостави една слята молекула, съдържаща естествен sIL-6R и естествен IL-6 (в какъвто и да е ред), която се продуцира в клетки на бозайници.
Друга цел на настоящото изобретение е да се използва един такъв слят протеин (sIL6R/IL-6 химера) за инхибиране растежа на силно метастатични меланомни клетки при много ниска концентрация, като тези клетки са резистентни на sIL-6R или IL-6 самостоятелно.
Друга цел на изобретението е да се използва такъв слят протеин (sIL-6R/IL-6 химера) за in vivo присаждане на човешки хематопо етични стволови клетки в протоколите за трансплантиране на костен мозък.
Друга цел на изобретението е да се използва такъв слят протеин при други свързани с IL-6 разстройства, например състояния на черния дроб или неврологични състояния.
Друга цел на изобретението е да се предоставят фармацевтични състави, които съдържат споменатия естествен sIL-6R-ecrecTBeH IL6 слят протеин (sIL-6R/IL-6 химера) за третиране на рак, за използване при процедури на транспланиране на костен мозък и при други IL-6-свързани нарушения, например неврологични състояния и състояния на черния дроб.
Други цели и аспекти на изобретението ще се поставят или ще възникнат от следващото описание.
Техническа същност на изобретението
Съгласно изобретението се продуцират известен брой слети протеини (химери), като всеки съдържа по същество всички от естествено съществуващите sIL-6R от човешки телесни течности и по същество всички от зрелите форми на естествено съществуващия в природата човешки IL-6, като всеки е придружен от къси линкерни пептиди, които могат да са толкова къси чак до 3 амнокиселинни остатъка дължина или по-дълги, например 13 аминокиселинни остатъка дължина (виж примери 1 и 2). Все пак трябва да се отбележи, че в тези слети протеини линкерните пептиди могат да са пропуснати и sIL-6R частта може директно да е свързана към IL-6 частта. Тъй като линкерите, представляващи неестествени аминокиселинни последователности, могат да са имуногенни епитопи, предизвикващи изработването на антитела, то за предпочитане е да се разполага с директно слята SIL-6R/IL-6 химера, която притежава желаната биологична активност, докато в това време това намалява до минимум риска от индуциране на такова потенциално вредно образуване на антитяло, когато се прилага такава химера.
Запазването на цялата sIL-6R последователност, включваща Ig-подобен домен, както се открива в естествено срещаните в природата молекули, така както и правилно гликозилиране и други посттранслационни модификации, въведени чрез човешки клети или клетки на бозайници, когато горната химера се продуцира в такива клетки, са също толкова важни да се намали потенциалната имуногенност на химерния протеинов продукт.
Все пак е възможно да се използва съвсем къс линкер от приблизително три аминокиселини при точката на свързване между sIL6R и IL-6 частите на химерния протеин. Такъв къс линкер няма да е имуногенен епитоп. Възможно е също така да се използват линкери от до 30 аминокиселини, за да допринесат за разделянето между двете части, но тук трябва да се внимава и трябва да се проведат експерименти за биологична ефикасност и сигурност, за да се подсигури, че химерните молекули с такива линкери не са имуногенни.
Всъщност бе показано съгласно изобретението, че такива дълги линкери не са основни за активността на химерния протеин, като това означава, че правилното нагъване на химерата не се нуждае от дълъг линкер, а по-специално когато всички по същество от естествено срещаните в природата последователности на sIL-6R и IL-6 частите са инкорпорирани (включени) в химерната молекула (пример 3 и фиг. 5), които се отнасят до сравнение между SIL-6R/IL-6 химера, притежаваща много къс (3 аминокиселини) линкер и подобна химера, притежаваща по-дълъг лиикер от 30 аминокиселини.
Тези слети протеини или SIL-6R/IL-6 химери се продуцират ефикасно съгласно изобретението в експресионни системи на клетки от бозайници за добив на гликолизирани продукти, притежаващи силна активност върху туморни клетки, които обикновено не отговарят на IL-6 или sIL-6R самостоятелно, и които са високо ефективни за осигуряване на успеха на присаждането на трансплантирани клетки от човешки костен мозък (примери 1-4). Всъщност, в такива трансплантанти от костен мозък, SIL-6R/IL-6 химерите са основни за преживяването и пролиферацията на трансплантираните неангажирани плурипотеитии хемопоетични стволови клетки. Освен това, от експерименталните резултати, представени в описанието, така както и от други анализи, става ясно, че могат да се приготвят различни аналози на SIL-6R/IL-6 химерния протеин от изобретението, които имат по същество същата биологична активност на SIL-6R/IL-6 химера, като тези аналози са SIL-6R/IL-6 химери, в които един или повече аминокиселинни остатъци са били делетирани, прибавени или заместени от други, като единственото ограничение за такива аналози е те да запазват повечето от естествено срещаните в природата sIL-6R и IL-6 последователности. Например, прибавянето на аминокиселини към срещаните в природата sIL-6R и IL-6 последователности за предпочитане се ограничава до между 20 аминокиселини и за предпочитане тези прибавяния са в сайта на свързване между sIL-6R и IL-6, т.е. линкерната молекула. Също така, делециите от sIL-6R и IL-6 последователностите за предпочитане се ограничават до между 20-30 аминокиселини; а заместванията на аминокиселинни остатъци в sIL-6R и IL-6 последователностите от други аминокиселинни остатъци също за предпочитане се ограничават до между 20-30 аминокиселини. Всички споменати делеции, прибавяния и замествания са приемливи съгласно изобретението, когато така модифицираните аналози, които са получени, запазват основно биологичната активност на т sIL-6R и IL-6 химерата, съставена от основно естествено съществуващи в природата последователности, и запазват основно същия модел на гликозилиране на химерата, съставена от основно естествено съществуващи в природата последователности, ко4 гато се експресират в клетки на бозайници.
В съгласие с това изобретението предоставя химерен гликозилиран разтворим интерлевкин-6 рецептор (81Ь-6Я)-интерлевкин-6 (IL-
6) протеин (sIL-6R/IL-6) и техни биологично активни аналози, включващи продукт на слят протеин между по същество всички естествено съществуващи в природата форми на sIL6R и по същество всички естествено съществуващи в природата форми на IL-6, като посоченият SIL-6R/IL-6 и техните аналози са гликозилирани по подобен начин на гликозилирането на естествено съществуващи в природата форми на sIL-6R и IL-6R.
Варианти за изпълнение на изобретението на горния химерен протеин от изобретението включват:
(i) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, като посоченият SIL-6R е слят с IL-6 чрез пептидна линкерна молекула, (ii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, както е посочено в (i), като посоченият линкер е много къс, неимуногенен линкер от приблизително
3-4 аминокиселинни остатъка.
(iii) Химерен sIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, както в (ii) по-горе, като посоченият линкер е трипептид на последователността E-F-M (Glu-Phe-Met).
(iv) Химерен sIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, както погоре в (i), като посоченият линкер е пептид от 13 аминокиселинни остатъка на последователност E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met) (SEQ ID: No 1).
(v) Химерен sIL-6R/IL-6 протеин, който е горепосочения sil-6R6Val/IL-6 трипептиден линкер на последователноста E-F-M между Стерминалния Val-356 на sil-6R и N-крайния Рго29 на IL-6, като посоченият химерен протеин притежава последователността, посочена погоре на фиг. 3.
(vi) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, който е горепосочения sIL-6R5Val/IL-6 притежаващ 13 аминокиселинен пептиден линкер на последователността E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-QF-M между С-терминалния Val-356 на sIL-6R и N-крайния Рго-29 на IL-6, като посоченият химерен протеин притежава последователността, посочена по-горе на фиг. 3, където три пептидът на последователност E-F-M между позиции 357-359 на фиг. 3 са заместени от посочената 13 аминокиселинна пептидна последователност.
(vii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, при който посоченият протеин се продуцира в клетки на бозайници в напълно завършена форма.
(viii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, при който посоченият протеин се продуцира в клетки на човек.
(ix) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин, при който посоченият протеин се продуцира в СНО клетки.
(x) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да инхибират растежа на силно злокачествени ракови клетки.
(xi) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да инхибират растежа на силно злокачествени меланомни клетки.
(хй) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да инхибират растежа на силно злокачествени ракови клетки.
(xiii) Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както погоре, като посоченият химерен протеин и аналози се характеризират с това, че са способни да предпазват черния дроб от хепатотоксични средства.
Изобретението предоставя, също така, ДНК последователност, кодираща химерен sIL6R/IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози, както е отбелязано по-горе.
Освен това, изобретението предоставя, също така, ДНК-ов вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща химерен sIL-6R/ IL-6 протеин и неговите биологично активни аналози от изобретението, както е отбелязано по-горе, подходящи за експресиране на посочения химерен протеин в клетки от бозайници.
Варианти за изпълнение на ДНК-ов вектор на изобретението, които включват:
(i) ДНК-ов вектор, като посоченият вектор е подходящ за експресиране на посочения химерен протеин в човешки клетки.
(ii) ДНК-ов вектор, като когато посоченият вектор се експресира в човешки клетки, експресираният химерен протеин притежава последователност, която позволява пълно завършване на химерния протеин чрез бозайниковите или човешки клетки и секретиране на напълно завършения химерен протеин от клетките в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.
(iii) ДНК-ов вектор, както по-горе, като посоченият вектор е посоченият тук плазмид рсДНК SIL-6R/IL-6, включващ рсДНКЗ вектор, съдържащ ДНК последователността, кодираща химерния SIL-6R/IL-6 протеин под контрола на промотора на цитомегаловирус (CMV).
(iv) ДНК-ов вектор, както по—горе, като посоченият вектор е посоченият тук плазмид рсДНК SIL-6R/IL-6, включващ рсДНКЗ вектор, съдържащ ДНК последователността, кодираща химерния SIL-6R/IL-6 протеин под контрола на промотора на цитомегаловирус (CMV), и при който посочената ДНК последователност, кодираща посочения химерен sIL6R/IL-6 протеин, инсерира там линкерна последователност, кодираща линкерен пептид при EcoRI сайта, разположен между последователността, кодираща SIL-6R частта и последователността, кодираща IL-6 частта на протеина.
Също така, изобретението предоставя трансформирани клетки от бозайници, съдържащи ДНК-ов вектор, както по-горе, който е способен да експресира sIL-6R/IL-6 последователността на химерния протеин, пренасяна от посочения вектор и напълно завършващ експресирания протеин и секретиращ в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.
Един вариант за изпълнение на тези трансформирани клетки са описаните клетки 293 от ембрионален човешки бъбрек (НЕК293), трансфектирани чрез рсДНК SIL-6R/IL-6 вектор, като посочените клетки са способни да експресират SIL-6R/IL-6 химерен протеин, напълно завършване на посочения протеин и секретиране на посочения протеин в културалната среда, в която се култивират посочените клетки под формата на около 85 kDa гликопротеин.
Друг вариант за изпълнение на трансформирани клетки са описаните СНО (Chinese Hamster Ovary) клетки, трансфектирани чрез рсДНК SIL-6R/IL-6 вектор, като посочените клетки са способни да експресират SIL-6R/IL6 химерния протеин, напълно да завършат посочения протеин в културалната среда, в която се култивират посочените клетки, под формата на около 85 kDa гликопротеин.
Изобретението предоставя, също така, метод за получаване на химерен протеин или негови биологични аналози, както по-горе, включващ култивиране на посочените трансформирани клетки при условия, подходящи за експресиране, процесинг и секретиране на посочения протеин или негови аналози в културалната среда, в която се култивират посочените клетки, и пречистване на посочения протеин или негови аналози от посочената културална среда чрез имуноафинитетна хроматография, при използване на моноклонални антитела, специфични за SIL-6R.
Химерният протеин от изобретението притежава голям брой приложения, включващи:
(i) използване на SIL-6R/IL-6 химерен протеин или негови аналози, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като инхибитори на ракови клетки;
(ii) използване, както в (i), като инхибитор на силно злокачествени меланомни клетки;
(iii) използване на химерен sIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активна съставка за предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при присаждане на костен мозък;
(iv) използване на химерен sIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активни съставки за увеличаване на хематопоезата, за третиране на хепатични и неврологични състояния, или за други приложения, в които се използват SIL-6R/IL-6.
Подобно, химерният протеин от изобретението може да се използва за приготвяне на лекарствени средства за голям брой медицински предписания, а по-точно химерен sIL-6R/ IL-6 протеин или аналози, соли на който и да е от тях и техни смеси, за използване при приготвянето на лекарствено средство за третиране на рак чрез инхибиране на раковите клетки, или при приготвянето на лекарствено средство за засилване на трансплантацията на костен мозък чрез предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантация на костен мозък, или при приготвяне на лекарствено средство за повишаване на хематопоезата, или при приготвяне на лекарствено средство за третиране на неврологични нарушения, или при приготвяне на лекарствено средство за други приложения, в които се използват SIL-6R/IL-6.
Освен това, изобретението предоставя, също така, фармацевтичен състав, съдържащ като активна съставка химерен sIL-6R/IL-6 протеин или негов аналог, както по-горе, и фармацевтично приемлив носител, разредител или пълнител.
Един вариант за изпълнение на този фармацевтичен състав съгласно изобретението включва:
(i) фармацевтичен състав за лечение на рак при бозайници.
(ii) фармацевтичен състав за засилване на трансплантацията на костен мозък.
(iii) фармацевтичен състав за третиране на черен дроб и неврологични нарушения или за засилване на хематопоезата или за други приложения, в които се използват IL-6 или SIL-6R.
Изобретението предоставя, също така, метод за третиране на рак при бозайници или за засилване трансплантацията на костен мозък, или за третиране на хепатични или неврологични нарушения, или за засилване на хематопоезата, или за други приложения, при които се използват IL1-6 или SIL-6R, който метод включва прилагане върху пациент на фармацевтичен състав, както посочения, в подходящи форми на дозите и чрез подходящ път на прилагане.
С цел да се избегне всякакво съмнение, изобретението се отнася до химера между IL-6 и sIL-6R в какъвто и да е ред, т.е. N-терминални и С-терминални участъци, могат да се обърнат и химерата след това е IL-6-sIL-6R протеин, въпреки че се отнася до SIL-6R/IL-6 протеин.
Други аспекти на вариантите за изпълнение на изобретението са представени по-долу или възникват директно от подробното описание на изобретението.
Описание на приложените фигури
Фигура 1 (А, В) представлява схематично изображение на различните вектори, реагенти и етапи на процеси, използвани при кон струирането на химерната. ДНК молекула, кодираща химерния протеин, в която се запазва структурата на естествената форма на sIL-6R, която завършва, при Val 356 остатъка, следван от последователността на естествената, зряла, завършена форма на IL-6, както подробно е обяснено в пример 1.
Фигура 2 (А,В) показва резултатите, получени от анализа, проведен за идентифициране на Val-6R6Val/Il-6 р86 химера чрез полиакриламидна гел-електрофореза (А) и биоактивен профил (В), както на фиг. 2А е показана репродукция на гел, оцветен с Comassie, върху който се елюират електрофорезните имунопрофилирани фракции от колоните за афинитетна хроматография, заредени с проба от секретиран протеин, получена от клетъчни култури, трансфектирани с вектор кодиращ химерния протеин; и фиг. 2В, където се показва графично представяне на биологичната активност (инхибиране на растежа на F 10,9 меланомни клетки) на всеки от посочените фракции, елюирани от колоните за афинитетна хроматография, всички са както подробно е обяснено в примери 2 и 3;
фигура 3 изобразява аминокиселинна последователност (еднобуквен код) на sIL-6R 5Val/Il-6 р86 химера, на която са показани различните домени на молекулите, включително N-терминалния сигнален протеин (реда най-отгоре на последователността), имуноглобулинподобния (Ig-подобен) домен, N-домена на рецептора на цитокин (подчертан), С-домена на цитокина (реда на върха на последователността) и рецепторната пре-мембранна област (областта между С-домена и трансмембранния домен), всички SIL-6R части на химерата; така както и зрялата IL-6 част на химерата; така както и зрялата IL-6 част (подчертана по-долу) на химерата, както е описано в примери 1 и 2;
фигура 4 (А, В) показва фотографии на F10,9 меланомни клетки в култура без (А) и (В) третиране с SIL-6R/IL-6 химерен протеин в продължение на 4 дни, като на фигура 4В са явни морфологичните промени индуцирани в такива метастатични меланомни клетки (F10.9 клетки) чрез третиране с SIL-6R/IL-6 химера, както е описано в пример 3;
фигура 5 е графично представяне на резултатите, изобразяващи инхибирането на нарастването на F10.9 меланомни клетки чрез
SIL-6R/IL-6 химерен протеин в различни концентрации на химерата, вариращи в границите от приблизително 0,12 ng/ml до приблизително 150 ng/ml, където химерата, единствено с 3 аминокиселинен линкер SIL-6R/IL-6, както е описан в пример 3, се сравнява с химера с дълъг 13 аминокиселини линкер (sIL-6R/IL-6)];
фигура 6 е графично представяне на резултатите, изобразяващи липсата на инхибиращи растежа ефекти върху F10,9 меланомни клетки или на изолиран IL-6 самостоятелно (пунктираната горна линия с отворени квадратчета) при концентрации вариращи в граници от 0-40 ng/ml IL-6 самостоятелно и sIL-6R самостоятелно (точка на пресичане на всички криви върху вертикалната ос, където IL-6 концентрацията е нула); така, както и наблюдаваните инхибиращи растежа ефекти, когато IL-6 и sIL6R се добавят заедно при различни концентрации на всеки, при което концентрацията на IL-6 е в границите от 10 ng/ml до 40 ng/ml, a sIL-6R прибавен при три концентрации от 100 ng/ml, 200 ng/ml и 400 ng/ml за всяка IL-6 концентрация, както се илюстрира от трите по-долни криви (две пунктирни криви с отворени триъгълници и кръгове и плътна крива със затворени квадрати), както е описано в пример 3;
фигура 7 е репродукция на автодиаграма от Southern блот, показваща необходимостта от SIL-6R/IL-6 химерен протеин за успешно присаждане на човешки хематопоетични стволови клетки по време на трансплантация на костен мозък в SCID-NOD мишки (две десни ивици представляващи мишката, която получава SIL-6R/IL-6 химерния протеин в добавка към други необходими фактори, SCF, FLT3 и това в контраст на трите леви ивици, които представляват мишка, която е получила единствено SCF и FLT-3 и SCF, FLT-3 както и изолиран, т.е. неслят IL-6 и sIL-6R), както е описано в пример 4;
фигура 8 е диаграма на разсейване на афинитетните характеристики на SIL-6R/IL-6 химера при сравнение със смес от IL-6 и sIL6R, като стойностите на химерата са показани чрез запълнени квадратчета, а на сместа чрез запълнени многоъгълници, като съотношението на наклона е 4 към 1;
фигура 9 показва най-високата активност на SIL-6R/IL-6 химера върху F 10,9 меланомни клетки при сравнение със сместа от SIL-6R+IL6, или към sIL-6R (без IL-6);
фигура 10 показва sIL-6R/IL-6 химерното предпазване срещу чернодробната токсичност, стойностите представляващи средно от 4 експеримента, запълнените квадратчета представляват IL-6R-/-MHniKH, запълнените многоъгълници представляват IL-6-/-mhuikh, получаващи IL-6, а запълнените звездички представляват Ш-6-/-мишки, получаващи химера;
фигура 11 представлява аминокиселинна последователност (еднобуквен код) на sIL-6R6Val химера Зе, като линкерът е подчертан;
фигура 12 показва биологичната активност върху фигура 10.9 меланомни клетки на химера Зе (тъмни запълнени звездички) в сравнение с SIL-6R/IL-6 химера (запълнени квадратчета) и два мутанта (Mutt 39 (HD)-3aпълнени многоъгълници) и Mutt NHD-светли запълнени звездички), както е описано в пример 9.
Подробно описание на изобретението
Изобретението се отнася до химерен sIL6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, които притежават по същество всички от естествено съществуващите в природата форми на sIL-6R и по същество всички естествено съществуващи в природата форми на IL-6, слети заедно, чийто сайт на сливане може да е като линкерен пептид, толкова къс, колкото 3 аминокиселини, и който химерен SIL-6R/IL-6 протеин или негови аналози притежават подобно количество и модел на гликозилиране като тези на естествено срещаните в природата SIL-6R и IL-6. За такъв химерен sIL-6R/IL-6 протеин, продуциран съгласно изобретението в клетки от бозайници, в човешки клетки (примери 1-4) или СНО клетки (пример 6) е открито, че се експресира ефикасно в такива клетки, че е силно гликозилиран и че притежава силна активност върху туморни клетки, които въобще не показват отговор на IL-6 или sIL-6K самостоятелно.
По-специално, съгласно изобретението, наблюдавано бе (примери 1-3), че горепосоченият SIL-6R/IL-6 протеин от изобретението причинява задържане на растежа на силно злокачествени клетки на бозайници, като F10,9 меланомни клетки при концентрации по-ниски от необходимите, когато се използва смес от sIL-6R и IL-6. Това е изключително значим резултат с оглед на факта, че такива Р10.9 меланомни клетки продължават да се развиват нормално при третиране единствено с IL-6 или с sIL-6R, поотделно, и преодоляват задържането на растежа единствено когато се подложат на сравнително високи дози от комбинация от неслети IL-6 и sIL-6R. В съответствие, химерният sIL-6R/IL-6 протеин на настоящето изобретение е по-силен инхибитор на тези силно злокачествени меланомни клетки, отколкото смес от техните отделни части, т.е., смес от неслети IL-6 и sIL-6R. Химерният протеин от изобретението е следователно изключително полезен като активна съставка за третиране на различни видове рак.
По-високата активност на химерния SIL-6R/IL-6 протеин се смята чрез неговия висок афинитет към gpl3O, отколкото от сместа от неслети IL-6 и SIL-6R (пример 7).
Освен това е открито също, съгласно изобретението (пример 4), че химерна sIL-6R/ IL-6 молекула от изобретението е изключително полезна за засилване на трансплантирането на костен мозък. Всъщност, при използване на известен протокол за присаждане на човешки клетки от костен мозък в строго комбинирана имунодефицитна (SCID) мишка, в която факторът на стволовите клетки (SCF) и Flt3-nHганда се използват да направят възможно преживяването и пролиферацията на най-примитивните плурипотенти хематопоетични стволови клетки, способни на дългосрочна трансплантация в костен мозък реципиент, бе открито, че тези два фактора, SCF и РкЗ-лиганда са недостатъчни да спомогнат в действието на трансплантирането на човешки клетки в реципиент миши костен мозък, и че единствено когато се прибави химерният SIL-6R/IL-6 протеин, може да е сполучливо присаждането. Това откритие означава, че химерният протеин SIL-6R/IL-6 е основен при такива протоколи за трансплантиране. В същите експерименти, неслети IL-6 и sIL-6R, когато се прибавят поотделно, когато е недостатъчно да се спомогне успешно трансплантиране на костен мозък и когато се добавят заедно, когато са много по-малко активни отколкото химерния sIL6R/IL-6 протеин, т.е., при една активна концентрация от 100 ng/ml sIL-6R/IL-6 химерен протеин, спомага на успешно трансплантиране на костен мозък, докато двете разделени IL-6 и sIL-6R, когато се добавят заедно при даже по-високи концентрации (sIL-6R от ng/ml, IL-6 от 50-200 ng/ml), е много по-малко активен при спомагането на такава трансплантация.
Горният SIL-6R/IL-6 химерен протеин от изобретението за предпочитане е рекомбинантен гликозилиран SIL-6R/IL-6 химера, продуциран в човешки клетки или в която и да е подходяща експресионна система от бозайник като СНО клетки от хамстер, които са способни на гликозилирани протеини, както правят човешките клетки и които въвеждат същите посттранслационни модификации, както правят и човешките. Една важна характеристика е, че химерният гликопротеин, получен по този начин, се завършва и модифицира както и естествените IL-6 и sIL-6R молекули открити в човешкото тяло, без скъсяване и без прибавяния на екзогенни неестествени полипептидни последователности, с изключение на много късия трипептид или когато се инкорпорира по-дълъг линкерен пептид между sIL-6R и IL-6 частите на химерния протеин.
За получаването на горния предпочитан химерен протеин на изобретението се разглеждат следните характеристики на естествено срещания в природата SIL-6R и IL-6: Известно е, че IL-6, присъстващ в човешки клетъчни мембрани, се продуцира чрез сДНК кодираща 468 аминокиселини, включващи сигнален пептид, един имуноглобулин (Ig) подобен домен, цитокин-свързващ домен, трансмембранна област и цитоплазматичен домен (Yamasaki et al., 1983). Разтворима форма на sIL-6R е открита в телесните течности, които имат, както в зрелия IL-6 от мембрани, един N-край, отговарящ на Leu-20 (Novick et al.,
1990) и С-край, отговарящ на Val-356 точно преди трансмембранната област на IL-6 (US в сьпритежание 5,216,128 и ЕР 413 908 Bl). С цел да се слее тази sIL-6R последователност към IL-6, се въвежда EcoRI рестрикционен сайт след Val-356. Последователността на зрелия IL-6 започващ при Рго-29 на IL-6 сДНК и завършващ при Met-212 (Ziberstein et al., 1986; Hirano et al., 1986) се въвежда след този EcoRI сайт. При този EcoRI сайт би могло също така, но не е задължително, да се въведе линкерен пептид с желана дължина за раздалечаване на sIL-6R и IL-6 частите една от друга в химерния протеин. Както е посочено в примерите по-долу, продуцират се два различни химерни протеина като примери за такива въз можни химерни протеини, като единият притежава трипептиден линкер, а другият притежава линкер от 13 аминокиселинни остатъци при този EcoRI сайт, като и двата са по същество еднакво биологично активни.
Изобретението се отнася, също така, до аналози на горния химерен протеин SIL-6R/IL6 от изобретението, които аналози задържат по същество същата биологична активност на химерния протеин, притежавана по същество само от естествено срещаните в природата последователности на sIL-6R и IL-6. Такива анализи могат да бъдат тези, в които могат да се делегират до 30 аминокиселинни остатъка, да се добавят или да се заместят от други в sIL6R и/или IL-6 частите на химерния протеин, така че модификации от този вид не променят по същество биологичната активност на аналога на химерния протеин, като се има предвид самия химерен протеин и в който sIL-6R частта на такъв аналог по същество задържа структурата на естествено срещания в природата сигнален пептид (преди процесинг - фиг. 3), Igподобния домен, цитокин рецепторния С-домен и рецепторния пре-мембранен домен. Също така, аналози на такъв химерен протеин би трябвало да задържат по същество естествено съществуващата в природата зряла форма на IL6 частта. Различните аналози могат да се различават най-вече един от друг и от базовата химерна молекула на протеина (която е единствено с естествено срещани в природата sIL6R и IL-6 последователности) при сайта на линкерния протеин, който свързва sIL-6R и IL-6 частите в химерния протеин. Такъв линкер може да е с дължина до 30 аминокиселини и служи за разделяне на sIL-6R и IL-6 частите една от друга в химерния протеин. Доколкото се отнася до такъв линкер, трябва да се внимава да се избере неговата последователност (и следователно да се тества биологично в подходящо стандартно изследване всеки такъв аналог), така че той да не води, например, до неправилно нагъване на химерния протеин, което може да го направи неактивен, или да не направи от аналога на химерния протеин имуногенен протеин, който ще предизвика антитела срещу него в пациент, който трябва да се третира с него, с резултат, че такъв аналог би бил неефективен поне като средно или дългосрочно лекарствено средство.
По отношение на горните аналози на хи мерния протеин от изобретението, тези аналози са тези, в които са заместени, един или повече и до 30 аминокиселинни остатъци от базовия химерен протеин от изобретението, от различни аминокиселинни остатъци, или са делетирани или са прибавени повече аминокиселинни остатъци към първоначалната последователност на химерния протеин на изобретението (това е единствено, по същество, естествено съществуващите в природата sIL-6R и IL-6 последователности) без значително да се променя активността на получените продукти, при сравняване с основния химерен протеин от изобретението. Аналозите се получават по известни техники на синтез и/или на сайт - насочен мутагенез, или които и да са други известни техники, подходящи за това.
Всеки такъв аналог, за предпочитане, притежава последователност от аминокиселини в достатъчно повтори на тази на основната SIL-6R/IL-6 химера, така че да притежават по същество подобна активност. Следователно, може да се определи дали един даден аналог притежава по същество същата активност като основния химерен протеин на изобретението чрез средства на рутинно експериментиране, включващо подлагане на един такъв аналог на тестове за биологична активност, посочени в примери 2-4.
Аналози на химерния протеин, които могат да се използват съгласно изобретението, или нуклеинови киселини, които ги кодират, включват ограничен набор, съответстващи по същество последователности като заместени пептиди или полинуклеотиди, които могат рутинно да се получат от специалиста в областта, без излишно експериментиране, основаващо се на знанията и напътствията, представени тук. За пълно описание на химията на протеина и на структурата му, виж Schulz, G. Е. et al., Principles of Protein Stucture, SpingerVerlag, New York, 1978; и Creighton, T. E. Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, които са включени тук за справка. За представяне на заместванията на нуклеотидните последователности, предпочитания за един такъв кодон, виж Ausubel et al., по-горе, при && А. 1.1 А. 1.24, Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience Ν. Y. && 6.3 и
6.4 (1987, 1992), в притурки C и D.
Предпочитани замени на аналозите съг10 ласно изобретението са тези, известни като „консервативни” замествания. Консервативни аминокиселинни замествания на тези в химерния протеин, притежаващи по същество естествено съществуващи в природата IL-6 и sIL- 5 6R последователности, могат да включват синонимни аминокиселини от група, която притежава достатъчно подобни физикохимични свойства, като заместванията от членове на групата ще запазят биологичната функция на молекулата, Graham, Science, Vol. 185, рр. 862864 (1974). Ясно е, че инсерции и делеции на аминокиселини могат да се направят, също така, без да се променя тяхната функция, по-специално ако инсерциите или делециите включват единствено няколко аминокиселини, нап ример, под тридесет и за предпочитане под 10, и не отстраняват или не изместват аминокиселини, които са критични за функционалната конформация, например цистеиннови остатъци, Anfisen. “Principles That Govern The Folding of Protein Chains”, Science, Vol. 181, pp. 223230 (1973). Аналози, получени чрез такива делеции и/или инсерции, се включват в обхвата на изобретението.
За предпочитане синонимните аминокиселинни групи са тези, които са дефинирани в таблица I. По-предпочитано, синонимните аминокиселинни групи са тези, които са дефинирани в таблица II, и още по за предпочитане, синонимните аминокиселинни групи са тези, които са дефинирани в таблица III.
Таблица I. Предпочитани групи на синонимните аминокиселини
| Аминокиселина | Синонимна група |
| Ser | Ser, Thr, Gly, Asn |
| Arg | Arg, Gin, Lys, Glu, His |
| leu | lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu |
| Pro | Gly, Ala, Thr, Pro |
| Thr | Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr |
| Ala | Gly, Thr, Pro, Ala |
| Val | Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val |
| Gly | Ala, Thr, Pro, Ser, Gly |
| He | Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie |
| Phe | Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe |
| Tyr | Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr |
| Cys | Ser, Thr, Cys |
| His | Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His |
| Gin | Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin |
| Asn | Gin, Asp, Ser, Asn |
| Lys | Glu, Gin, His, Arg, Lys |
| Asp | Glu, Asn, Asp |
| Glu | Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu |
| Met | Phe, lie, Val, Leu, Met |
| Trp | Trp |
ТАБЛИЦА II
По-предпочитани групи на синонимните аминокиселини^
Аминокиселина
Ser
Arg leu Pro Thr Ala Val Gly lie
Phe
Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp
Синонимна група
Ser
His, Lys, Arg,
Leu, lie, Phe, Met,
Ala, Pro
Thr
Pro, Ala
Val, Met, lie,
Gly lie, Met, Phe, Val, Leu, Met, Tyr, lie, Leu, Phe Phe, Tyr
Cys, Ser
His, Gin, Arg,
Glu, Gin, His
Asp, Asn
Lys, Arg,
Asp, Asn,
Glu, Gin,
Met, Phe, lie, Val, Leu,
Trp
Таблица III
Най-предпочитани групи на синонимните аминокиселини
Аминокиселина
Ser
Arg leu. Pro Thr Ala Val Gly lie Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp
Примери за получаване на аминокиселинни замествания в протеини, които могат да се използват за получаване на аналози на химерния протеин за използване в изобретението, включват който и да е известен етап на метод, като този, представен в US RE 33,653, 4,959,314, 4,737,462 на Mark et al.; 5,116,943 на Koths et al.; 4,965,195 на Namen et al.; 4,879,111 на Chong et al.; и 5,017,691 на Lee et al.; и лизин-заместен протеин, представен в US 4,904,584 (Shaw et al.).
В друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, който и да е аналог на
Синонимна група
Ser
Arg,
Leu, lie, Met,
Pro
Thr
Ala
Val
Gly lie, Met, Leu,
Phe
Tyr
Cys, Ser
His
Gin
Asn
Lys
Asp
Glu
Met, lie, Leu,
Tro химерния протеин за използване в настоящото изобретение притежава аминокиселинна последователност, съответстваща по същество на тази на посочения основен химерен протеин на изобретението. Терминът „съответстващ по същество на” се разбира, че включва аналози с минимални промени на последователността на основния химерен протеин, които не засягат неговите основни характеристики, по-специално неговите способности да инхибира пролиферацията на ракови клетки или да спомагат трансплантацията на костен мозък, например. Видът промени, които обикновено се при ема, че попадат в „съответстваща по същество” терминологията, са тези, които биха били резултат на конвенционални техники на мутагенез на ДНК кодираща химерния протеин на изобретението, водещи до няколко малки модификации, и скриниращи за желаната активност, по описания начин.
Аналозите, съответстващи на настоящото изобретение, включват тези, кодирани от нуклеинова киселина като ДНК или РНК, която хибридизира към ДНК или РНК под строги условия, и която кодира химерен протеин, съгласно настоящото изобретение, включваща основно всички естествено съществуващи в природата последователности, кодиращи sIL-6R и IL-6. Например, такава хибридизационна ДНК може да е една такава кодираща същия протеин от изобретението, притежаваща например, последователността, посочена на фигура 3, но която се различава по своята нуклеотидна последователност от естествено срещаната в природата нуклеотидна последователност поради разпада на генетичния код, т.е. до известна степен различна нуклеотидна последователност може все още да кодира за същата аминокиселинна последователност, което се дължи на този разпад на кода. Освен това, както също бе споменато по-горе, количеството аминокиселинни промени (делеции, прибавяния, замествания) е ограничено до приблизително 30 аминокиселини, така че даже и с максималното количество промени, аналозите съгласно настоящото изобретение, ще бъдат тези, които съществено задържат лидерната последователност (преди процесинга), Ig-подобен домен, цитокинов рецептор N- и С-домени и рецепторна пре-мембранна област (областта между С-домена и трансмембранния домен) в SIL-6R частта и по същество всяка IL-6 област. Една такава нуклеинова киселина би била първия кандидат за определяне дали кодира полипептид, който запазва функционалната активност на химерния протеин от настоящото изобретение. Терминът „строги условия” се отнася до условията на хибридизиране и последващото промиване, които специалистите в областта конвенционално изразяват като „строги”. Виж Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, no-rope, Interscience, Ν. Y., ara. 6.3 и
6.4 (1989, 1992) и Sambrook et al., по-горе. Без ограничения, примери за строги условия включват условия на промиване 12-20°С пре ди изчисляването на Тт на хибрида, който се изучава в, например, 2 х SSC и 0,5% SDS в продължение на 5 min, 2 х SSC и 0,1% SDS в продължение на 15 min; 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 37°С за 30-60 min и след това 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 68°С за 30-60 min. Специалистите в областта разбират, че строгостта на условията зависи от дължината на ДНК последователностите, олигонуклеотидните проби (като 10-40 бази) или смесени олигонуклеотидни проби. Ако се използват смесени проби, се предпочита да се използва тетраметил амониев хлорид (ТМАС) вместо SSC, Виж Ausubel по-горе.
Терминът „соли” се отнася в настоящото и до двете соли на карбоксилни групи и до соли на присъединителни киселини на аминогрупи на химерния протеин от настоящото изобретение или негови аналози. Соли на карбоксилни групи могат да се образуват по начини, известни от състоянето на техниката и включващи неорганични соли, например, натриеви, калциеви, амониеви, фери или цинкови соли и други подобни, и соли с органични основи като тези, образувани например с амини, като триетаноламин, аргииин или лизин, пиперидин, прокаин и подобни. Солите на присъединяване на киселини включват, например, соли с минерални киселини като, например, солна киселина (хлороводородна киселина) или сярна киселина, и соли с органични киселини като, например, оцетна киселина или оксалова киселина.
Естествено всяка една такава киселина трябва да има по същество подобна активност към химерния протеин на настоящото изобретение или към неговите аналози.
Изобретението се отнася, също така, до ДНК последователности, кодиращи посочения химерен протеин от изобретението и неговите аналози, така както и до ДНК-ови вектори, пренасящи такива ДНК последователности за експресиране в подходящи клетки от бозайници, за предпочитане клетки от човек. Един вариант за изпълнение на вектор от изобретението е плазмид рсДНК sIL-6R/ IL-6 включващ рсДНКЗ вектор (Invitrogen), включващ sIL-6R/ IL-6 сляти последователности под контрола на промотора на цитомегаловирус (CMV).
Изобретението се отнася, също така, до трансформирани клетки от бозайници, за пред14 почитане човешки клетки, клетки, способни да експресират горните протеини от изобретението. Един вариант за изпълнение на такива трансформирани клетки са човешки ембрионални бъбречни 293 (НЕК 293, ATCC CRL 1573) трансфектирани с рсДНК sIL-6R/ IL-6, който секретира слятия 6IL-6R/IL-6 химерен гликопротеии като 85 kDa.
Друг вариант за изпълнение на настоящото изобретение е плазмид рсДНК sIL-6R/ IL-6, който се различава от горния рсДНК sIL6R/ IL-6 чрез инсериране в EcoRI сайт на къси линкери, кодиращи 10 допълнителни аминокиселини. Могат да се въведат за оптимизиране на разстоянието между IL-6 и sIL-6R известен брой различни последователности с различни дължини.
Изобретението включва, също така, химерен протеин, в който IL-6 частта предхожда sIL-6B (както е на фигура 11).
Настоящото изобретение се отнася, също така, до метод за получаване и пречистване на химерния протеин на изобретението или неговите аналози, който включва култивиране на посочените трансформирани клетки при условия, подходящи за експресиране и секретиране на продукта химерен протеин в културалната среда и пречистване на секретирания протеин чрез имуноафинитетна хроматография при използване на aHTH-sIL-6R моноклоналио антитяло 34.4, както е посочено в пример 2 и пример 5.
Настоящото изобретение се отнася, също така, до фармацевтичен състав, включващ като активно средство една SIL-6R/IL-6 химера или нейни аналози или техни смеси или техни соли и фармацевтично приемлив носител, разредител или пълнител. Един вариант за изпълнение на фармацевтичния състав на изобретението включва фармацевтичен състав за засилване на IL-6 типа действие, за третиране на рак, за трансплантиране на костен мозък, за увеличаване на хематопоезата, в някои специфични тромбопоези, за третиране на неврологични състояния, за третиране на нарушения в черния дроб, и други приложения на IL-6 или свързани цитокини.
Фармацевтичните състави на изобретението са приготвени за прилагане чрез смесване на химерния протеин или на неговите аналози с физиологично приемливи носители, и/ или стабилизатори и/или пълнители, и се при готвят в дозирани форми, т.е. чрез лиофилизиране в ампула за дозиране. Методът на прилагане може да е по който и да е от приемливите методи за прилагане на подобни средства и ще зависи от състоянието, което трябва да се третира, т.е. интравенозно, интрамускулно, подкожно, чрез локално инжектиране или локално прилагане, или непрекъснато чрез вливане и др. Количеството активно съединение, което трябва да се приложи, ще зависи от пътя на прилагане, от заболяването, което трябва да се третира, и от състоянието на пациента. Локалното инжектиране, например, ще се нуждае от по-ниско количество от протеина на основа на телесното тегло, отколкото интревенозното вливане.
Настоящото изобретение се отнася, също така, до използване на химерния протеин от изобретението или на неговите аналози или на техни смеси за третиране на рак, за трансплантиране на костен мозък, за засилване на хематопоезата, за специално тромбопоезата, за третиране на неврологични състояния, за предпазване на тъканите на черния дроб на пациенти с некротични заболявания, дължащи се на химикали (например въглерод, тетрахлорид, алкохол, парацетамол) или други причини (например вирус, операция) и използване на други приложение на IL-6 или свързаните цитокини. Подобно, настоящото изобретение се отнася, също така, до химерен протеин или негови аналози или техни смеси за използване при приготвяне на лекарствени средства за третиране на посочените заболявания или за използване в посочените предписания.
Освен за горепосочените методи за лечение, се имат предвид и ex-vivo процедури и генна терапия с химера и/или кодираща я ДНК.
Настоящото изобретение ще бъде описано в повече детайли в следните неограничителни примери и приложените фигури.
Пример 1: Конструиране на sIL-6R5gal/ IL-6 химерен експресионен вектор
На фигура 1 е показана схематична поточна диаграма на етапите, необходими за конструиране на експресионен вектор, пренасящ последователносттац кодираща за sIL-6R&;Val/ IL-6 химерен протеин, включваща всички начални и междинни вектори, различни реагенти и реакционни етапи. Тази процедура на конструиране по същество използва техники, добре известни от състоянието на техниката за кон15 струиране на желани вектори (виж, например, Sambrook et al.,). Процедурата е следната.
сДНК библиотека от T47D клетки от човешка карцинома на гърдата се клоиират в ламбда (λ) gtl 1 бактериофаг и се скринира с олигонуклеотидни проби, произлизащи от IL-6 последователности Yamasaki et al.m, (1988). Изолира се един Xgtl 1 сДНК клон, който притежава пълната човешка IL-6 кодираща последователност. Инсертът се изрязва от Xgtl 1 чрез EcoRI и се клонира в Множествен Сайт на Клониране (MCS) на Е. coli фагемид Blue Script pBS/SK (Stratagene System, LaJollia, California). Този плазмид pBS/SK-IL-6R (фигура 1) се срязва от EcoRI, който след това се затъпява и отново се срязва с EcoRV за изолиране на 5' фрагмент на IL-6R от 959 базови двойки (Ьр), завършващ при EcoRV сайта на IL-6R (координата 1203). Този фрагмент, изолиран от един агарозен електрофоретичен гел, се клонира в нов pBS/SK вектор, отворен при EcoRV на MCS (pBS/pBS/SK-sIl-6R-RV на фигура 1).
Посочената, предварително получена ДНК на pBS/SK-sIL-6R, се подлага на полимеразна верижна реакция (PCR) за амплифициране на 368 Ьр фрагмент между предния праймер 1137-1156 и обратния праймер 1505-1488. Обратният праймер се синтезира с EcoRI сайт непосредствено след кодона за Валин-356 на IL-6R (виж фигура 1), щом този Валинов остатък преди това е бил определен като карбокси-терминалната аминокиселина на естествената, форма на разтворим sIL-6R екскретиран в човешката урина (Novick et al., 1990; Oh et al., 1996; US в съпритежание 5,216,128 и EP 413908 Bl). PCR продуктът се изрязва чрез EcoRV и EcoRI и се лигира в pBS/SK-sIL-6R-RV между EcoRI на сайта на IL-6R и EcoRI на MCS (фигура 1). Полученият плазмид pBS-sIL-6R- ValRI след това се скъсява за отстраняване на 5' нетранслирани последователности чрез лигиране на Hiddlll сайта на MCS с Ncol сайта при базова двойка 410 на IL-6R (като и двата сайта първо се привеждат с тъпи краища), за получаване на pBS-siL-6R-0Val-RI-Ncol (фигура 1).
IL6R последователността произлиза от плазмид рКК 2-7, който е както е описано погоре (Chen et al., 1988) се конструира чрез инсериране на BsNI-cut IFN-32/IL-6 сДНК (Zilberstein et al., 1986) в EcoRI сайта на E.coli експресионен вектор рКК 233-3 (Pharmacia, Uppsala. Sweden) при използване на синтети чен олигонуклеотид с Ecoli сайт следван от Метионинов кодон и кодона Пролин-29 на IL-6 и завършващ при Sali и Notl (ЕсоВН) сайта. IL-6 сДНК инсертът на ρΚΚβ2-7 завършва 7 базови двойки след терминалния кодон в NalalV сайта и е следван 11 Ьр след това от Hindu сайта на ρΚΚβ223.3 вектора (фигура 1). ρΚΚβ2-7 ДНК се срязва с Hindlll, прави се с тъпи краища и отново се срязва с EcoRI, след което IL-6 сДНК се инсерира в pBS-sIL-6R6Val-RI-Ncol, така че да се слее последователността на зрелия IL-6 (започваща от Пролин -29) непосредствено след Валин-356 на IL-6R и разделена от само 3 кодона (Glu-PheMet). Полученият плазмид pBS/SK-sIL/SK-sIL6R/IR-6 (фигура 1) след това отново се срязва при Sall и Notl сайтовете на неговия MCS и инсертът се клонира в EcoRV сайта на рсДНКЗ (Invitrgen Corporetion, San Diego California). Полученият плазмид рсДНКЗ- sIL6R/IL-6 (фигура 1) съдържа инсерта в посока downstream от силния промотор на цитомегаловирус (CMV) и следван от сайт за полиаденилиране осигуряващ ефикасна транскрипция на sIL-6R0Val/IL-6 химерата. Запазването на 5' края на sIL-6R в химерния пептид осигурява под експресията на клетки на бозайници сигналния пептид да функционира и процесията на N-края на химерния протеин да е както в естествения sIL-6R.
Както е посочено по-долу, една характеристика, представляваща предимство за sIL6R8Val/IL-6 структурата, е, че предимно се сливат естествената форма на SIL-6R и естествената форма на sL-б, както съществуват в човешкото тяло, без външни полипептидни последователности. Въпреки това, запазването на EcoRI сайта в sIL-6R Val/IL-6 структурата (фигура 1) позволява лесно да се въведат линкерни полипептидни сегменти между sIL-6R и IL-6 частите. Също се конструира, една такава структура с 13-аминокиселинна, линкерна последователност Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, въведена между Val-346 на SIL-6R и Рго-29 на IL-6, (sIL-6R5Val/L/IL-6).
Пример 2 : Експресиране на sIL-6R5Val/
IL-6 химера в човешки клетки
При използване по същество на стандартни техники на култивиране на клетки от бозайници, клетъчно трансфектиране и анализ на трансфектираните клетки за експресия на новоиндуцираната ДНК последователност (за процедури, виж например, Sambrook et al., 1989), грната празмидна структура (пример 1) се използва за трансфектиране на човешки клетки и се определя тяхната експресия. Използва се следната процедура.
Човешки НЕК 293 клетки (АТСС СИВ 1573, първично трансформирани човешки ембрионални клетки от бъбрек) се трансфектират с плазматична структура рСОДНКЗ-яШ6R/IL-6 ДНК (посочена в пример 1). Култури в Log фаза на НЕК 293 се обработват с трипсин и се посяват в 9-cm Nunc блюда (2,5 х 106 клетки/блюдо). Един ден по-късно се провежда трансфектиране с 10 pg рСДНКЗ- sIL-6R/ IL-6 ДНК чрез СаРО4 процедура на утаяване (Samborook et al., 1989) и един час по-късно средата се сменя с DMEM-10% FCS и култивирането продължава още допълнителни 16 h. След смяна на средата с DMEM-2% FCS, секретираните протеини се събират за два последователни периода от 48 h. Клетъчните отломки се отстраняват чрез центрофугиране при 1000 rpm в продължение на 10 min и супернатантата се тества на ELISA за sIL-6R, при използуване на поликлонално заешко анти- sIL6R и мише МсАВ 17.6 антитяло (Novick et al.,
1991). Открита бе концентрация от 1,2 pg/ml яШ-бВ-еквиваленти, която е показателна за много ефикасна експресия на химерния sIL6R/IL-6 протеин в трансфектираните човешки клетки.
Осъществява се имунопречистване на секретирания химерен протеин (sIL-6R/IL-6) с Моноклонално Антитяло 34,4 специфично за един епитоп на извънклетъчния домен на човешки sIL-6R(Novick et al., 1991; Halimi et al., 1995). 34.4 хибридомните клетки се култивират в миша перитонеална кухина и имуноглобулиновата (Ig) фракция се получава от асцитиата течност чрез утаяване с амониев сулфат. Използва се Affigel-10 (Bio-Rad Labs, Richmondq-Califomia) за имобилизиране на МсАВ 34,4 (15 mg Ig прикрепени към 1ml Affigel-10). Супернатантите, съдържащи секретираните протеини от НЕК 293 клетки, трансфектирани с рсДНКЗ- SIL-6R/IL-6 се адсорбират върху колони от МсАВ 34.4 (0,3 ml колона за 15 ml супернатанта). След промиване с PBS, свързващите протеини се елЬират чрез 25 тМ лимонена киселина pH 2,5, след което веднага се неутрализират с 1 М буфер на He pes pH 8,5 и се диализират през цялата нощ (приблизително 8-12 h) срещу PBS.
Анализът на имунепречистения протеин чрез полиакрилиа гел-електрофореза в SDS показва една единствена протеинова ивица при оцветяване с Comassie blue (фигура 2). Молекулярното тегло на протеина е 85 килодалтона, както се очаква от сливането на гликозилираните форми на sIL-6R6Val (60 kDa, както е показано в Oh еу al., 1996) и гликозилирания IL6 (23-26 kDa, както е показано от Zilberstone etal., 1986). Аминокиселинната последователност на. SIL-6R/IL-6 е от 543 аминокиселини, която след процесинг на сигналния протеин ще пред казва протеин от 524 аминокиселини или от приблизително 58 kDa (фигура 3). Много по-големият размер на SIL-6R/IL-6 химерата, продуцирана от рекомбинантна ДНК в човешки клетки, показва, че гликозилирането се изчислява от участък, който може да се изреже от молекулата.
Пример 3. SIL-6R/IL-6 химерата задържа растежа и индуцира диференциране на метастатични меланомни клетки
Клон F10.9, произлизащ от В16 меланомни клетки, образува силно метастатични тумори в С57В1аск/6 мишки, което убива животните от бeлogpoбни метастази до 2-3 месеца (Karz et al.., 1995). Прибавянето на sIL-6R/IL6 химерен протеин към F10.9 клетъчна култура води до дълбоки морфологични промени в клетките и задържане на техния растеж (фигура 4). F10.9 клетки, третирани с химера, ставата удължени, с изпъкнали дендритни удължения, като обединяват спиндлоидната диференциация на ембрионалните меланоцити или клетките на глията.
Растежът на клетките се определя количествено 4 дни след посяването на 3 х 103 клетки в ямки на 96-ямкови микроблюда в 0,2 ml RPMI1640 среда с 10% PCS. Клетките се фиксират в 12,5% глутаралдехид за 30 min, промиват се с вода и се оцветяват с 0,1% кристал виолет за 30 min. След промиване и изсушаване, багрилото се екстрахира с 10% оцетна киселина и се определя оптичната плътност при 540 nm. Химерата продуцира зависещо от дозата инхибиране на растежа с пълно инхибиране на растежа при толкова ниски концентрации до 10 mg/ml от химерния (р85) протеин (фигура 5). И двата химерни протеина SIL 6R 5Val/IL-6 и sIl-6R5Val/ L/IL-6 (химера с по-дъл гия линкер между siL-6R и IL-6 частите, виж пример 1) са с подобна активност. Този резултат служи, също така, да покаже, че линкерният пептид между S1L-6R и IL-6 частите в химерата, не е основен за активността на химерата, щом горната sIL-6R8Val/IL-6 химера притежава само един много къс линкер от 3 аминокиселини, докато горният sIl-6R0Val/L/IL-6 притежава по-дълъг линкерен пептид от 13 аминокиселини, но и двата притежават по същество същата активност при инхибиране на рестежа на метастазните клетки в контраст, нито IL-6 самостоятелно, нито sIL-6R6Val самостоятелно инхибират растежа на тези меланомни клетки (фигура 6), като демонстрират единствената активност на sIL-6R/IL-6(p85) химерния протеин. За да се получи подобен ефект, е необходима смес от 200 - 400 mg/ml IL-6 и 123 ng/ml sIL-6R0Val (фигура 6). Когато се пресмята в молна концентрация, максималното инхибиране на F10-9 клетки изисква 7,5 nM IL-6 и 2 nM siL-6R6Val срещу само 0,12 пМ от sIL6R/IL-6 химерата.
Инхибиращата растежа активност на р85 sIL-6R/IL-6 химерен протеин се следи по време на имунопречистването върху МсАВ 34,4 колони (пример 2). Моделът на активност съответства на интензитета на р85 ивицата, която се вижда в различните фракции от SDS полиакрилната гел-електрофореза на фигура 2.
Пример 4. SIL-6R/IL-6 химерата е основна при Присаждане на трансплантирани клетки от човешки костен мозък присаждането на хематопоетични стволови клетки от човешки костен мозък може да се изучава след трансплантиране при строго комбинирани имунодефицитни (SCID) мишки (Vormoor et al., 1994). SCIDNOD мишки се подлагат на сублетанло облъчване и се инжектират в опашната вена с Зх105 клетки от костен мозък. Преди инжектирането, пречистените С034+ клетки се поддържат в продължение на 3 дни в течни култури с различни комбинации на цитокини. След един месец мишките се убиват и се взимат костите за събиране на клетките от костния мозък. Присаждането на човешки клетки в SCID-NOD мишки реципиенти се определя чрез Southern блот хибридизация към човешка повтаряема ДНК.
За фактора на стволовите клетки (SCF, steel фактор или ckit-лиганд) и РП13-лиганд (flt3/flt22 тирозин киназа рецепторен лиганд) бе открито, че е важен за преживяването и пролиферацията на повечето примитивни плурипотентни хематопоетични стволови клетки способни на дълготрайно присаждане в костен мозък на реципиент (McKenna et al., 1995). Както се вижда на фигура 7, тези два фактора са недостатъчни за спомагането на присаждането на човешки клетки в костен мозък на SCID-NOD мишки реципиенти. Прибавянето на sIL-6R/IL-6 химерен протеин е необходимо, за да може присаждането да бъде открито при значими нива. При 100 mg/ml ng/ml sIL6R/IL-6 е много по-активен, отколкото изолирания IL-6 (50-200 ng/ml) и SIL-6R (1251250 ng/ml) (фигура 7). Необходимостта от ILGR/IL химера означава, че този протеин е основен за преживяването и пролифепацията на неангажирани плурипотентни хематопоетични стволови клетки, които могат да се върнат вътре и отново да населят заобикалящата среда на костния мозък, което означава, че този протеин може да е полезен при клиничните протоколи за трансплантиране на костен мозък.
Това е първото демонстриране, че sIL6R/IL-6 химерата притежава най-малко две нови активности:
(i) Когато се добавят заедно с двата фактора FCF и Fit3-лиганд към човешки хематопоетични примитивни прогенитални (прародителски) клетки, предизвиква тяхното преживяване и пролиферация; и (й) Активна е (и явно основна) в in vivo модел на трансплантиране на човешки костен мозък в имунодефицитии мишки.
Пример 5. SIL-6R/IL-6 химерата е активна при силно пречистени примитивни хематопоетични стволови клетки
Мононуклеарни (моноядрени) клетки от кръв на човешка хорда се подлагат на фракциониране при ниска плътност на моноядрените клетки (NNC) върху Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), следвано от мини MACS комплект (Milttney Biotec, ergisch Gladbach, Germany) за приготвяне на 80% чиста популация от CD34+ клетки. Тези клетки след това се пасират над имобилизирано анTH-CD38 моноклонално антитяло или се сортират по флуоресцентно активираните клетки и по CD34+CD38 популация, което съответства, че приблизително 0,1% от първоначалните клетки са възстановени. Тези пречистени стволови клетки (20 000 клетки) се поставят в сус18 пензионна култура в 0,5 ml RPMI среда, 10% фетален телешки серум (FCS), 1% говежди серумен албумин, съдържащ 50 ng/ml фактор на стволови клетки (SCF) и 100 ng/ml (ИЗ-лиганд (FL) (и двата от R&D Systems, Mineapolis MN). 5 Половината от културите се допълват с 100 ng/ml sIL-6R/IL-6 химера, а другите се култивират без такава добавка. Инкубирането е при 37°С в 5% СО2, в продължение на 6 дни. Броят на клетките отново популиращи костен мозък се определя чрез инжектиране (i.v.) на всички клетки от тези in vitro култури в сублетално облъчени NOD-SCID мишки. Мишките се поддържат при безбацилни условия. След 6 седмици мишките се убиват и костният мозък от техните дълги кости се отделя. Клетките от костен мозък (ВМ) се посяват върху полутвърди 0,9% метилцелулозни блюда с 30% FCS, 50 μΜ β-меркаптоетанол, 50 ng/ml IL-3,5 ng/ml (GMCSF, 6 u/ml еритропоетин (всички от (R&D Systems, Mineapolis, MN). Културите съдържат, също така, и човешки серум, условия, които предпазват от растеж на миши колонии. Резултатите (таблица IV) показват, че прибавяне на SIL-6R/IL-6 химера към суспензионни култури продуцира 30-50 пъти нарастване на броя на човешки колония образуващи клетки (CFU), получени от трансплантирани мишки, при сравнение с SCF и FL, самостоятелно. Това представлява голямо нарастване на броя на SCIDрепопулиращите столови клетки присъстващи в суспензионните култури на 6-ия ден, при сравнение с деня 0. При отсъствие на sIL-6R/ IL-6 химера, SCF и FL не водят до повишаване на броя на стволовите клетки, по време на
6-те дни на суспенсионно култивиране. ДНК на ВМ клетки, получени от трансплантирани MOD/SCID мишки се анализира чрез Southern болт, както е в пример 4. Количеството получена човешка ДНК е 10 пъти по-високо, когато мишките са получавали клетки култивирани с химера, при сравняване с мишки, получавали клетки, некултивирани с химера.
CFU родителски клетки от костен мозък на NOD/SCID мишки, както е в таблица IV, се приготвят срещу хематопоетични клетки от различни миелоидни линии (макрофаги и гранулоцити), така както еритроидна и лимфоидна линия (например, CD19+, CD56+), единствено когато човешките кръвни клетки са култивирани с SIL-6R/IL-6 химера преди трансплантирането.
Таблица IV.
Човешки стволови клетки, способни да репопулират (отново да населят) костен мозък от NOD/SCID мишки.
Прибавяне по време на суспензионното култивиране на CD34+CD384 човешки клетки от кръв от хорда
Дни на култивиране
SCF + FL
SCF+FL+SCF+sILБрой на човешки хематопоетични колонии, образуван от ВМ от тренсплантирани NOD/SCID мишки 4
2-3
50-100
6R/IL-6
Допълнителни експерименти сравняват ефекта от SIL-6R/IL-6 върху CD34+CD38+ популация от кръв от хорда с тези върху силно пречистени CD34+CD38+ стволови клетки. In vitro експанзията на силно пречистени клетки е много по-силно засилена от sIL-6R/ IL-6, отколкото тази на пречистени клетки (таблица V). Това означава, че най-примитивните стволови клетки са предпочитани мишени за SIL/6R/IL6 ефекта върху клетъчната експанзия.
Таблица V. In vitro експанзията на хематопоетични стволови клетки
Посята клетъчна Брой кл<
популация (20 000 клетки) ия ден с експеримент 1
CD344 CD38+ 780 000
CD34+CD38+ 42000 експеримент 2
CD34+ CD38+ 330 000
CD34+CD38+ 63000
In vitro поддържането на активността на репопулирането на костен мозък се измерва чрез нарастване продължителността на суспензионното култивиране на силно пречистени CD34+ CD38+ стволови клетки преди инжектиране на NOD/SCID мишки. Присаждането се 20 преценява чрез пропорцията на човешка ДНК в костен мозък на мишки реципиенти 6 седмици по-късно, т.е. инжектиране на култивираните клетки. Когато се добавя SIL-6R/IL-6 към SCF и FL по време на култивирането, се наб- 25 людава силно присаждане (> 1% човешка ДНК) след две седмици от култивирането, и присаждането е по-силно, отколкото при некултивираните клетки. В контраст, експерименти с култури, съдържащи SCF, FL, GM-SCF, IL-3, 30 показват, че 1 седмица след култивирането не остават SCID-репопулиращи клетки (Bhata, М. Et al., Exp. :ed. 186, 619-624, 1997).
Тези резултати показват, че SIL-6R/IL-6 позволява разсейването (експанзията) и под- 35 държането човешки примитивни стволови клетки, способни на присаждане в костен мозък реципиент. Стволовите клетки остават активни в недиференцирано състояние, докато се размножават. SIL-6R/IL-6 химерата предоста- 40 вя нов начин за култивиране на хематопоетични клетки за присаждане. Това може да позволи също да се използват ретровирусни вектори за въвеждане на гени в стволови клетки за присаждане, при протоколите за генна терапия. 45 До сега това не бе възможно с човешки стволови клетки, тъй като тези примитивни клетки на биха могли да се поддържат in vitro циклично състояние, както се изисква за интегриране на ретровирусна ДНК. SIL-6R/IL-6 химерата 50 разрешава този проблем.
Пример 6. Продуциране на SIL-6R/IL-6 :тки в 6- Брой клетки на 6-и
SC + FL ден с SC +FL + sIL,
6R/IL-6
675 000 (х 0,86)
153 000 (х 3,6)
507 000 (х 1,5)
000 (х 6,0) химера в СНО клетки
ДНК от плазмид SIL-6R/IL-6 рсДНКЗ, както на фигура 1, се ко-трансфектира в клетки от Shinese Hanster Ovary (СНО), заедно с ДНК на плазмид pDHFR, както е описано в Могу et al., (DNA 5, 181-193, 1986). Между трансфектантите, растящи в 50 пМ метотрексат, се изолира клон L12-[sIL-6R/IL-6].3a този клон е открито, че е стабилен при многобройни пасажи и полуслятите култури обикновено секретират в културалната среда количества от
1,2 gg/ml от SIL-6R/IL-6 химерата.
За пречистване на sIL-6R/IL-6xHMepaTa
3,25 1 среда от клон L12, култивиран в 2% говежди серумен албумин, се концентират до 200 ml. Количеството се адсорбира върху колона с обем 18 ml с античовешки sIL-6R Моноклонално Антитяло 34,4, прикрепено към Affigel 10 перли и се елюира, както е описано (Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991). 25 mM елюат на лимонена киселина веднага се неутрализират с 1 Нерез буфер с pH 8,6. Протеините се концентрират върху 10 KDa cutoff мембрана от Amicon до крайна концентрация от 1 mg/ml. При провеждане на SDS-PAGE, се наблюдава единична ивица от 85 kDa, съответстваща на SIL-6R/IL-6 химерата. Гликозилирането се демонстрира чрез редуциране на размера след третиране с гликозидаза (Boehringer, Mannheim). Установено е, че биологичната активност на СНО продуциращи SIL-6R/IL-6 химера е стабилна поне за пет месеца при 4°С. Обикновено съхранението е при -70°С.
Пример 7 : Афинитет на SIL-6R/IL-6 химерата към gpl30 sIL-6R/IL-6 химера, продуцирана от
СНО и смес от IL-6 и sIL-6R се сравняват по тяхното свързване към разтворимата форма на gpl3O (sgpl3O), която е втората верига на рецепторната система за IL-6 (виж състояние на техниката). 96-ямково микротитърно блюдо (Nunc) се покрива с античовешко gpl3O моноклонално антитяло и се прибавят 50 ng/ml sgp 130 (и двете от R & D Systems, Mineapolis). След промиване с физиологичен разтвор с фосфатен буфер, се прибавя sIL-6R/IL-6 химера в различни ямки при различни концентрации, вариращи от 0,1 до 50 ng/ml. В отделни ямки се добавя ruhlL-6 (Ares-Serono, Geneva) при 500 ng/ml заедно с човешки sIL6R8Val при концентрация от 2 до 500 ng/ml. След инкубиране през цялата нощ при 4°С се прибавя заешко поликлонално aHTH-IL-6R (Oh et al., Cytokine, 401-409, 1996), следвано от кози антизаешки lg, конюгиран с пероксидаза от ряпа, която се установява чрез цветна реакция (Sigma, St. Louis). Фигура 8 показва диаграма на разсейване на резултатите. Открива се, че афинитетът на SIL-6R/IL-6 химера към gpl30 е над 4 пъти по-висок, отколкото този на двете части на прибавените поотделно молекули, съответно (6,3 х 10 М спрямо 2,6 10|0М). Резултатът е линеен и обяснява високата активност на химерата при сравняване с IL-6+ sIL-6R комбинация върху меланома и върху хематопоетични клетки (фигура 9 и пример 4).
Пример 8. sIL-6R/IL-6 химерният протеин предпазва, от хепатотоксичност
Инжекция от въглероден тетрахлорид (СС14) върху мишка продуцира сериозна некроза на черния дроб, водеща до смърт на животното (Stater T.F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1985). Когато на мишки, които са генетично дефицитни на IL-6 (CLб'), се дават сравнително ниски дози СС14 (2-3 ml/kg телесно тегло) чрез интерперитонеално инжектиране, степента на леталност за 24 h е около 70% (фигура 10). Инжектиране на продуцирана в СНО SIL-6R/IL-6 химера един час преди CCL4, предпазва животните и не се установяват смъртни случаи за 24 h. В контраст, свободен rhulL-б, инжектиран по същия начин няма ефект (фигура 10). SIL-6R/IL-6 химера е ефективна при дози от 2-3 g за инжекция, което в моларно отношение е 10 пъти пониско от дозата на IL-6, която не е ефективна. При по-високи дози, CCL4 (например, 3,5 ml/kg на фигура 10), химерата също предпазва, като смъртността е по-ниска с IL-6 или без цитокини. Разликата в смъртността между мишки, третирани с химера, и нетретирани мишки, и двата вида получаващи същото количество СС14 атака, е значителна при р<0,01. Хистологичните наблюдения на срезове от черен дроб оцветени с хематоксилинеозин потвърждават, че СС14 продуцира некроза на тъканта на черния дроб, и че 1L-6R/IL-6 химерата предпазва хепатоцитите от този токсичен ефект (непоказано).
Едно приложение на sIL-6R/IL-6 химера може да бъде за предпазване на тъканите на черния дроб при пациенти с некротично заболяване, дължащо се на химикали (например, алкохол, парацетамол) или други причини (например, вирусен хепатит).
Пример 9 : Конструиране и активност на IL-6/sIL-6R8Val химера
Конструира се химерна молекула, в която IL-6 частта е при N-края, докато SIL-6R частта е при С-края. Плазмид pBS-IL-б/ sIL6R5Val се срязва при Sau3a (bp 1086) и при Hindlll следващ стоп кодона след Val-356 (виж пример 1). Линкер, съдържащ три рестрикционни сайта : Spel, Smal и BamHl, се синтезира както следва:
Spel Smal BamHl
5' СТ AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG
A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEQ ID N0:2)
Този Sau3a сайт на sIL-6R се легира към BamHl на линкера и се клонира в множествения сайт на клониране на Bluescript pBS SK плазмида. IL-6 последователността се амплифицира чрез PCR от рКК 2-7 ДНК при използване на праймери (кодон на иницииране подчертан) :
Spel направо 5' GA СТА GTA GCT ATG ААС ТСС TTC ТС (SEQ ID:3)
НаеШ обратно 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C (SEQ ID NO : 4)
PCR продуктът, срязан със Spel и Hindlll се въвежда между Spel и Smal сайта на горния линкер. Друг линкер BamHl -Ncol с вътрешен Smal се синтезира както следва :
Smal
5’ GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C [Ncol] [BamHIJGC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC
5'(SEQ ID NO : 5)
Той се клонира между BamHl на предходния линкер и Ncol 1464 на sIL-6R последователността. Фрагмент от sIL-6R от SAmI 867 до Ncol 1464 се въвежда, след това между Smal на втория линкер и Ncol на SIL-6R. Получената химерна ДНК се секвенира и повторно се клонира в рсДНКЗ за експресиране в човешки НЕК 293 клетки. Аминокиселинната последователност на тази IL-6-IL-6R химера Зее показана на фигура 11 (линкерът е подчертан). Химера Зе се пречиства чрез афинитетна хроматография върху антиЛЬ-б моноклонално антитяло ( като при Novick et al., Hybridoma 8, 561-567, 1989). Върху SDS-PAGE се наблюдава ивица от 75 kDa.
Биологичната активност на IL-6-IL-6R химерата Зе за инхибиране на растежа на F10,9 меланомни клетки е показана на фигура 12. Тя е явно активна, при сравняване с SIL-6R/IL-6 химера (препарат 1-3) в същия експеримент, въпреки че е необходимо повече за 50% инхибиране на растежа.
Правят се два мутанта на SIL-6R/IL-6, в които аминокиселините His-280 и Asp-281 от IL-6 частта от SIL-6R/IL-6 (фигура 3) се променят на Ser и Val, съответно, чрез PCR мутагенеза (Мутант 39 или HD), или при които Asn230 допълнително се променя на Asp (Мутант NHD). Както може да се види от фигура 12, тези два мутанта почти не притежават активност, при сравняване с IL-6RIL-6 и IL-6-IL-6R химери. Щом като в IL-6R, тези аминокиселини реагират с gpl30, както е показано чрез молекулярно моделиране (Halimi rt al., 1995), това демнонстрира, че SIL-6R/IL-6 химерата запазва този основен сайт на взаимодействие.
В IL-6-IL-6R химера Зе липсва имуноглобулин-подобния домен на IL-6R, който присъства в SIL-6R/IL-6. Въпреки това, отстраняването само на този Ig-подобен домен от sIL6R/IL-6 не намалява биологичната активност върху F10,9 клетки. Свързването на IL-6-IL6R химера Зе към gpl30 е приблизително 30% от това на друга IL-6R/IL-6 химера (не е показано). Това ниско ниво на свързване е в съответствие с ниската активност върху растежа на меланомни клетки.
Тези резултати демонстрират, че блоки рането на IL-6 карбокситерминуса чрез сливане посредством линкер към sIL-6R, запазва добра биологична активност в такава нова химера.
Claims (34)
- Патентни претенции1. Химерен гликозилиран разтворим интерлевкин-6 рецептор (sIL-6R)-HHTepneBKHH6 (IL-6) протеин (sIL-6R/IL-6) и негови биологично активни аналози, включващ продукт на слят протеин между по същество всички от естествено съществуващите в природата форми на sIL-6R и естествено съществуващите в природата форми на IL-6, наречен SIL-6R/ IL-6 и негови аналози, които са гликозилирани по подобен начин на гликозилирането на естествено срещаните в природата sIL-6R и IL-6.
- 2. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият SIL-6R се слива към IL-6 посредством пептидна линкерна молекула.
- 3. Химерен sIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че посоченият линкер е много къс, неимуногенен линкер от приблизително 3 аминокиселинни остатъка.
- 4. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че посоченият линкер е трипептид с последователност E-F-M (Clu-Phe-Met).
- 5. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че посоченият линкер е пептид от 13 аминокиселинни остатъка с последователност E-F-G-AG-L-V-L-G-G-Q-F-M (G1 u-Phe-Gly- Ala-Gly-Leu- Val-Leu-GlyGly-Gly-Phe-Met).
- 6. Химерен sIL-6R/IL-6 протеин съгласно която и да е претенция от 1 до 4, който е проектирания в настоящото sIL-6R6Val/IL-6, притежаващ трипептиден линкер с последователност E-F-M между С-терминалния Val356 от sIL-6R и N-терминалния Рго-29 от IL6, характеризиращ се с това, че посоченият протеин притежава последователността, посочена на фигура 3.
- 7. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съглас но която и да е претенция от 1, 2 и 5, който е проектирания в настоящето sIL-6R5Val/IL-6, притежаващ 13 аминокиселинен пептиден линкер с последователност E-F-G-A-G-L-V-L-GG-Q-F-M, между С-терминалния Val-356 от sIL6R и N-терминалния Рго-29 от IL-6, характеризиращ се с това, че посоченият протеин притежава последователността, посочена на фигура 3, където трипептидът от последователността E-F-M, между позиции 357-359 от фигура 3 се замества от посочената 13 аминокиселинна пептидна, последователност.
- 8. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно претенция 1, който е проектирания в настоящето IL-6/sIL-6R, притежаващ пълната последователност на IL-6, предхождаща sIL-6R последователността с 14 аминокиселинен пептиден линкер с последователност G-G- G-GD-P-G-G-G-G-G-G-P-G (SEQ ID NO: 6) между С- терминалния Met-212 на IL-6 и Val-112 на sIL-6Rp характеризиращ се с това, че посоченият химерен протеин притежава последователност, посочена на фигура 11.
- 9. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно която и да е претенция от 1 до 8, характеризиращ се с това, че посоченият протеин се продуцира в клетки на бозайници в напълно завършена форма.
- 10. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че посоченият протеин се продуцира в човешки клетки.
- 11. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че посоченият протеин се продуцира в СНО клетки.
- 12. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 10, характеризиращи се с това, че посоченият химерен протеин и аналози са способни да инхибират растежа на силно злокачествени ракови клетки.
- 13. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно претенция 12, характеризиращи се с това, че посоченият химерен протеин и аналози са способни да инхибират растежа на силно злокачествени меланомни клетки.
- 14. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращи се с това, че посоченият химерен проте ин и аналози са способни да предизвикат in vitro присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантиране на костен мозък.
- 15. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращи се с това, че посоченият химерен протеин и аналози са способни да предпазват черния дроб от хепатотоксични средства.
- 16. ДНК последователност, кодираща химерен SIL-6R/IL-6 протеин и негови биологично активни аналози, съгласно която и да е претенция от 1 до 11.
- 17. ДНК-ов вектор, включващ ДНК последователност, кодираща химерен SIL-6R/IL6 протеин и негови биологично активни аналози, съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращ се с това, че посоченият вектор е подходящ за експресия на посочения химерен протеин в клетки на бозайници.
- 18. ДНК-ов вектор съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че посоченият вектор е подходящ за експресия на посочения химерен протеин в човешки клетки.
- 19. ДНК-ов вектор съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че посоченият вектор е подходящ за експресия на посочения химерен протеин в СНО клетки.
- 20. ДНК-ов вектор съгласно претенции 17-19, характеризиращ се с това, че посоченият вектор се експресира в клетки на бозайници или човешки клетки, като експресираният химерен протеин притежава последователност, която позволява пълния процесинг на химерния протеин от клетките на бозайници или човешките клетки и секретирането на напълно завършения химерен протеин от клетките в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.
- 21. Трансформирани клетки на бозайници съдържащи ДНК-ов вектор, съгласно която и да е претенция от 17 до 20, които са способни да експресират последователността на sIL-6R/ IL-6 химерния протеин, пренасяна от посочения вектор и напълно да завършва експресирания протеин и да секретира в културалната среда, в която се култивират посочените клетки.
- 22. Трансформирани клетки съгласно претенция 21, характеризиращи се с това, че посочените клетки са описаните в настоящото човешки ембрионални бъбречни клетки 293 (НЕК293), трансфектирани с рсДНК SIL-6R/IL6 вектор, като посочените клетки са способни да експресират sIL-6R/ IL-6 химерния протеин, напълно да завършват посочения протеин и да секретират посочения протеин в културалната среда, в която се култивират посочените клетки под формата на приблизително 85 kDa гликопротеин.
- 23. Метод за продуциране на химерен протеин или на негови биологично активни аналози, съгласно която и да е претенция от 1 до 14, характеризиращ се с това, че се култивират трансформираните клетки, съгласно претенции 21 или 22, при условия, подходящи за експресиране, процесинг и секретиране на посочения протеин или аналози в културална среда, в която се култивират посочените клетки, и се пречиства посоченият протеин или неговите аналози от културалната среда.
- 24. Метод съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че пречистването се провежда чрез имуноафинитетна хроматография, при използване на моноклонални антитела, специфични за SIL-6R/IL-6.
- 25. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като инхибитори на ракови клетки.
- 26. Използване на химерен протеин или на негов аналог съгласно претенция 25, като инхибитор на силно злокачествени меланомни клетки.
- 27. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активнасъставка за предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантация на костен мозък .
- 28. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активна съставка за предпазване на черния дроб срещу хепато тиксични средства.
- 29. Използване на химерен SIL-6R/IL-6 протеин или на негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси, като активна съставка за увеличаване на хематопоезата, за третиране на черния дроб или неврологични състояния, или за други, приложения, в които се използват IL-6 или sIL-6R.
- 30. Химерен SIL-6R/IL-6 протеин или негови аналози съгласно която и да е претенция от 1 до 11, соли на който и да е от тях, и техни смеси за използване при приготвянето на лекарствено средство за третиране на рак при бозайници за инхибиране на ракови клетки при бозайници или за приготвяне на лекарствено средство за засилване трансплантацията на костен мозък за предизвикване на присаждане на човешки хематопоетични клетки при трансплантиране на костен мозък, или за приготвяне на лекарствено средство за засилване на хематопоезата, или за приготвяне на лекарствено средство за третиране на чернодробни или неврологични нарушения, или за приготвяне на лекарствено средство за други приложения, при които се използват IL-6 или SIL-6R.
- 31. Фармацевтичен състав съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращ се това, че включва като активна съставка химерен SIL-6R/IL-6 протеин или негов аналог, и фармацевтично приемлив носител, разредител или пълнител.
- 32. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се това, че се прилага за третиране на рак.
- 33. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се това, че се прилага за засилване на трансплантацията на костен мозък.
- 34. Фармацевтичен състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че се прилага за третиране на неврологични нарушения и нарушения на черния дроб, или за увеличаване на хематопоезата или за групи приложения, при които се използват IL-6 или SIL-6R.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL12128497A IL121284A0 (en) | 1997-07-10 | 1997-07-10 | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
| IL12281897A IL122818A0 (en) | 1997-07-10 | 1997-12-30 | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG104070A BG104070A (bg) | 2000-11-30 |
| BG64680B1 true BG64680B1 (bg) | 2005-11-30 |
Family
ID=26323470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG104070A BG64680B1 (bg) | 1997-07-10 | 2000-01-10 | Химерен протеин на интерлевкин-6 разтворим рецептор/ лиганд, негови аналози и тяхното използване |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7198781B1 (bg) |
| EP (1) | EP0991661B1 (bg) |
| JP (1) | JP4402288B2 (bg) |
| KR (1) | KR100505172B1 (bg) |
| CN (1) | CN1185348C (bg) |
| AR (1) | AR013201A1 (bg) |
| AT (1) | ATE342915T1 (bg) |
| AU (1) | AU758161B2 (bg) |
| BG (1) | BG64680B1 (bg) |
| BR (1) | BR9812096B1 (bg) |
| CA (1) | CA2295936C (bg) |
| CY (1) | CY1105895T1 (bg) |
| CZ (1) | CZ302488B6 (bg) |
| DE (1) | DE69836217T2 (bg) |
| DK (1) | DK0991661T3 (bg) |
| EA (1) | EA004793B1 (bg) |
| EE (1) | EE05519B1 (bg) |
| ES (1) | ES2271999T3 (bg) |
| HU (1) | HU225855B1 (bg) |
| IL (2) | IL122818A0 (bg) |
| NO (1) | NO327397B1 (bg) |
| NZ (1) | NZ502139A (bg) |
| PL (1) | PL199212B1 (bg) |
| PT (1) | PT991661E (bg) |
| SK (1) | SK287039B6 (bg) |
| WO (1) | WO1999002552A2 (bg) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL122818A0 (en) * | 1997-07-10 | 1998-08-16 | Yeda Res & Dev | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
| US5919763A (en) * | 1998-06-01 | 1999-07-06 | Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. | IL-6/SIL-6R complex for promotion of liver functions |
| US20040170604A1 (en) | 1998-07-06 | 2004-09-02 | Tosoh Corporation | IL-6 receptor IL-6 direct fusion protein |
| EP1094081B1 (en) * | 1998-07-06 | 2005-09-21 | Tosoh Corporation | Fused protein with direct bond of il-6-receptor to il-6 |
| MXPA01009074A (es) * | 1999-03-09 | 2002-03-27 | Zymogenetics Inc | Nuevo ligando zalfa11 de citocina. |
| IL130586A0 (en) * | 1999-06-21 | 2000-06-01 | Yeda Res & Dev | IL6RIL6 chimera for the treatment of demyelinating diseases |
| WO2001096565A2 (en) * | 2000-06-16 | 2001-12-20 | Asterion Limited | Binding agents: chimeric ligand/receptor proteins |
| AU9184901A (en) * | 2000-09-14 | 2002-03-26 | Ares Trading Sa | Use of il-6r/il-6 chimera in huntington's disease |
| DE10106827A1 (de) * | 2001-02-14 | 2002-09-05 | Stefan Rose-John | Verwendung eines Konjugats aus Interleukin-6(IL-6) und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression des Stammzellfaktors (SCF) und von Flat-3-Ligand (Flt-3L) |
| DE10107737A1 (de) * | 2001-02-16 | 2002-09-05 | S Rose John Christian Albrecht | Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor zur Tumortherapie |
| KR100453877B1 (ko) | 2001-07-26 | 2004-10-20 | 메덱스젠 주식회사 | 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 |
| GB0119015D0 (en) * | 2001-08-03 | 2001-09-26 | Univ Cardiff | A fusion protein |
| GB2384001B (en) * | 2001-12-14 | 2004-02-04 | Asterion Ltd | Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins |
| IL147412A0 (en) * | 2001-12-31 | 2002-08-14 | Yeda Res & Dev | The use of il6r/il6 chimera in nerve cell regeneration |
| AU2003223089A1 (en) * | 2002-04-29 | 2003-11-17 | Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. | Compositions and methods for treating cancer with an oncolytic viral agent |
| WO2004069173A2 (en) | 2003-01-31 | 2004-08-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods for modulating an inflammatory response |
| FR2850621B1 (fr) * | 2003-02-04 | 2006-12-08 | Journee Paul | Connecteur reliant un bras d'essuie-glace a un balai d'essuyage, qui comporte deux languettes pour le verrouillage transversal de bras d'essuie-glace |
| DE10321317A1 (de) * | 2003-05-13 | 2004-12-23 | Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel | Verfahren zum Nachweis des funktionellen IL-6/ sIL-6-Rezeptor-Komplexes und Test-Kit zur Durchführung dieses Verfahrens |
| IL157309A0 (en) * | 2003-08-07 | 2004-02-19 | Applied Research Systems | Method for the purification of a non-immunoglobulin protein |
| IL159558A0 (en) | 2003-12-24 | 2004-06-01 | Applied Research Systems | Use of il-6 in liver injury |
| IL161673A0 (en) | 2004-04-29 | 2004-09-27 | Applied Research Systems | Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy |
| IL161672A0 (en) | 2004-04-29 | 2004-09-27 | Yeda Res & Dev | Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy |
| SG177946A1 (en) | 2005-08-29 | 2012-02-28 | Technion Res & Dev Foundation | Media for culturing stem cells |
| AU2012261726B2 (en) * | 2005-08-29 | 2015-03-12 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Media for Culturing Stem Cells |
| EP1777294A1 (en) | 2005-10-20 | 2007-04-25 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins |
| JP2009543579A (ja) * | 2006-07-19 | 2009-12-10 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | 抗炎症反応のための標的としてのＷＳＸ−１／ｐ２８ |
| DK3441459T3 (da) * | 2006-08-02 | 2021-06-07 | Technion Res & Dev Foundation | Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur |
| US8052968B2 (en) | 2006-10-16 | 2011-11-08 | Genelux Corporation | Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods |
| CA2690627C (en) * | 2007-06-15 | 2014-12-02 | Genelux Corporation | Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors |
| CN101827857A (zh) * | 2007-08-03 | 2010-09-08 | 埃斯特瑞恩有限公司 | 粒细胞集落刺激因子 |
| GB0715216D0 (en) * | 2007-08-03 | 2007-09-12 | Asterion Ltd | Leptin |
| EP2310508A1 (en) * | 2008-07-02 | 2011-04-20 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Tgf-b antagonist multi-target binding proteins |
| WO2010003101A2 (en) * | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Il6 immunotherapeutics |
| WO2010081738A1 (en) | 2009-01-16 | 2010-07-22 | Agirx Limited | Vaccine compositions |
| ES2932664T3 (es) | 2009-11-12 | 2023-01-23 | Technion Res & Dev Foundation | Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado |
| EP2516467A2 (en) | 2009-12-23 | 2012-10-31 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof |
| DK2614141T3 (da) | 2010-09-07 | 2019-09-09 | Technion Res & Dev Foundation | Hidtil ukendte fremgangsmåder og dyrkningsmedier til dyrkning af pluripotente stamceller |
| EP2832856A4 (en) | 2012-03-29 | 2016-01-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF |
| CA2909576C (en) | 2013-04-19 | 2023-07-18 | Cytune Pharma | Cytokine derived treatment with reduced vascular leak syndrome |
| US20160194369A1 (en) * | 2013-08-12 | 2016-07-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods and compositions for co-expression of polypeptides of inerest and il6 |
| EP2915569A1 (en) | 2014-03-03 | 2015-09-09 | Cytune Pharma | IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method |
| CN104826093A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-12 | 刘永庆 | 用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂及卵黄抗体 |
| CN104922659B (zh) * | 2015-07-03 | 2018-04-20 | 刘永庆 | 防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用 |
| US20240269236A1 (en) | 2021-06-04 | 2024-08-15 | Sonnet BioTherapeutics, Inc. | Methods of treating age-related frailty with interleukin-6 |
| CN116064563B (zh) * | 2022-11-04 | 2025-11-11 | 广州达安基因股份有限公司 | 白细胞介素-6截短体的制备方法和应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5216128A (en) | 1989-06-01 | 1993-06-01 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| IL99803A (en) * | 1991-10-20 | 1997-02-18 | Yeda Res & Dev | Pharmaceutical compositions comprising interleukin-6 for the treatment of chronic lymphocytic leukemia and B-cell lymphomas |
| PL190445B1 (pl) * | 1995-05-15 | 2005-12-30 | Akademia Medyczna Im K Marcink | Genetyczna szczepionka przeciwrakowa |
| DE19608813C2 (de) | 1996-03-07 | 1998-07-02 | Angewandte Gentechnologie Syst | Konjugat zur Beeinflussung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen |
| IL122818A0 (en) * | 1997-07-10 | 1998-08-16 | Yeda Res & Dev | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof |
| AR020315A1 (es) * | 1997-12-19 | 2002-05-08 | Serono Lab | Un complejo de interferon tipo i(ifn) y una subunidad del receptor del interferon humano-(ifnar) que es capaz de unirse al inf tipo i del complejo, una molecula de adn, un vector, una celula huesped incapaz de conducir a la regeneracion de un animal o una planta transformada con un vector, una compo |
-
1997
- 1997-12-30 IL IL12281897A patent/IL122818A0/xx unknown
-
1998
- 1998-07-09 HU HU0002426A patent/HU225855B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 BR BRPI9812096-4A patent/BR9812096B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 US US09/462,416 patent/US7198781B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-09 EP EP98931006A patent/EP0991661B1/en not_active Revoked
- 1998-07-09 NZ NZ502139A patent/NZ502139A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 CZ CZ20000075A patent/CZ302488B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 PL PL338002A patent/PL199212B1/pl unknown
- 1998-07-09 DK DK98931006T patent/DK0991661T3/da active
- 1998-07-09 KR KR10-2000-7000080A patent/KR100505172B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-09 DE DE69836217T patent/DE69836217T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 PT PT98931006T patent/PT991661E/pt unknown
- 1998-07-09 WO PCT/IL1998/000321 patent/WO1999002552A2/en not_active Ceased
- 1998-07-09 EE EEP200000012A patent/EE05519B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 AU AU81271/98A patent/AU758161B2/en not_active Ceased
- 1998-07-09 EA EA200000109A patent/EA004793B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 CN CNB988089416A patent/CN1185348C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-09 CA CA002295936A patent/CA2295936C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-09 JP JP2000502071A patent/JP4402288B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-09 ES ES98931006T patent/ES2271999T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-09 SK SK6-2000A patent/SK287039B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-07-09 AT AT98931006T patent/ATE342915T1/de active
- 1998-07-10 AR ARP980103377A patent/AR013201A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-01-07 NO NO20000086A patent/NO327397B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-01-10 IL IL133972A patent/IL133972A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-01-10 BG BG104070A patent/BG64680B1/bg unknown
-
2006
- 2006-12-29 CY CY20061101873T patent/CY1105895T1/el unknown
-
2007
- 2007-03-20 US US11/688,640 patent/US7374912B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG64680B1 (bg) | Химерен протеин на интерлевкин-6 разтворим рецептор/ лиганд, негови аналози и тяхното използване | |
| ES2240981T3 (es) | Citocina denominada lerk-7. | |
| ES2253753T3 (es) | Citocina que induce apoptosis. | |
| KR100320106B1 (ko) | 트롬보포이에틴폴리펩티드분비방법 | |
| US8163520B2 (en) | Nucleic acids encoding a chimeric polypeptide comprising IL-7 and HGF-beta chain and methods of use | |
| ES2287773T3 (es) | Composiciones y metodos relacionados con fragmentos solubles multimericos y oligomericos del receptor tweak. | |
| AU4027799A (en) | Osteoporosis treatment | |
| EP1148065B1 (en) | Fusion proteins comprising two soluble gp130 molecules | |
| NZ238659A (en) | Mast cell growth factor, recombinant production and isolated sequences | |
| NZ501831A (en) | Trail binding protein (TRAIL-BP) showing significant homology to the extracellular domains of members of the tumour necrosis factor receptor (TNF-R) and is anchored to cell surface via glycosylphosphatidylinositol (GPI) linkage | |
| KR20000029998A (ko) | 발현벡터,세포,그리고혈소판조혈인자를제조하는방법 | |
| MXPA00000364A (en) | Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof | |
| CA2224625A1 (en) | P-selectin ligands and related molecules and methods | |
| MXPA97004173A (en) | Designated citoquina lce | |
| MXPA97010399A (es) | Citocina que induce apoptosis |