BG62892B1 - Вектор и методи за въвеждане поне на два гена врастение - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до вектор за въвеждане нажелан ген в растение, който включва желания ген ипоне един индуциращ морфологична аномалност (МАl)ген като маркерен ген, или който включва желания ген, поне един МАl ген и подвижен елемент. Изобретението се отнася и до метод за получаване на трансгенно растение, свободно от влиянието на маркерен ген, и до метод за многократно въвеждане на желанигени в растение.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до нов вектор за въвеждане на желан ген в растение, като се използват методите на генното инженерство за получаване на трансгенно растение; до метод за получаване на трансгенно растение, лишено от влиянието на селекционен маркерен ген, като се използва този вектор; и до метод за въвеждане поне на два желани гена в растение, като се използва векторът.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е приложението на трансформация на микроорганизми и култивирани клетки чрез генно инженерство за получаване на физиологично активни вещества, използвани като лекарства, като по този начин се подпомага значително индустрията. В областта на растителната селекция индустриалното приложение на генното инженерство изостава, тъй като жизнените цикли на растенията са много по-дълги от тези на микроорганизмите. Тъй като тази технология позволява желаният ген да бъде директно въведен в растенията, за да бъдат те селекционирани, тя има следните предимства в сравнение с класическото размножаване, което изисква множество кръстосвания:

а) възможно е да се въведе само една характеристика, която да бъде подобрена;

б) възможно е да се въведат характеристики на други видове, освен растителните (като тези на микроорганизми и други);

в) възможно е значително да се скъси периодът на селекция.

Така, генно инженерните методи за растителна селекция са изследвани значително.

Получаването на трансгенни растения изисква следните три етапа.

1. Въвеждане на желания ген в растителната клетка (включващо въвеждане на същия в хромозомите, ядрата или други).

2. Селекциониране на растителна тъкан, съставена само от клетки, в които желаният ген е въведен.

3. Регенериране на растение от селекционираната растителна тъкан.

За да се селекционират трансгенни тъкани, в които е въведен желан ген, необходима е визуална идентификация на тъканта, в която желаният ген се експресира, без регенерация на ново растение. За да се постигне това, обикновено желаният ген се въвежда в растителната клетка заедно с маркерен ген, на който експресията може да бъде лесно открита на етап клетъчно култивиране. Това означава, че експресията на маркерния ген се използва като индекс за въвеждането на желания ген. Примери за конвенционални маркерни гени включват гени, устойчиви на антибиотици, като канамицинустойчив ген (т.е., NPTII; неомицин фосфотрансферазен ген), хигромицинустойчив ген (т.е., НРТ; хигромицин фосфотрансферазен ген), синтетазните гени за аминокиселини, като нопалинсинтетазен ген (NOS), октопин синтетазен ген (OCS) и сулфонилуреаустойчив ген (т.е., ALS; ацетолактат синтетазен ген), който придава устойчивост към химическите вещества, използвани в земеделието.

Експресията на един селекционен маркерен ген може да причини сериозни проблеми, когато такова трансгенно растение се използва за храна. Ето защо, много трудно е да се осигури генният продукт, получен чрез експресия на селекционен маркерен ген, да е безопасен за човешкото тяло. Следователно, ако едно трансгенно растение, съдържащо селекционен маркерен ген, трябва да се продава като храна, е необходимо да се извърши детайлно изследване, за да се определи въздействието на маркерния ген върху човешкото тяло. Например NPTII генът е използван като маркерен ген на лабораторно ниво още в началото на 80-те години. През 1944 г. продуктът на този ген окончателно беше приет като хранителна добавка от Американската хранителна и лекарствена администрация (FDA). Оттогава трансгенни растения, съдържащи NPTII гена като селекционен маркерен ген, се използват за храна. Някои потребители на продукти, съдържащи NPTII гена обаче, все още не са спокойни за ефекта на този ген.

Освен това селекционни маркерни гени, които практически се използват, са само гени, като NPTII гена, които спомагат за детоксикацията на растежно инхибиторно вещество в растителните клетки. Следователно, за да се селекционира трансгенна растителна тъкан, в която е въведен желан ген, тъканта се култивира в културална среда, съдържаща растежно инхибиторно вещество, и експресията на селекци2 онния маркерен ген, а именно устойчивостта на тъканта към растежно инхибиторното вещество, се оценява и се използва като индекс. Обаче, дори когато една тъкан има такава устойчивост, култивирането в присъствие на инхибиторно вещество може да доведе до нежелани странични ефекти върху растителните клетки, като намаляване на пролиферацията и редиференцирането на трансгенната тъкан.

Освен това, експресията на един селекционен маркерен ген в растителна клетка след селекцията на трансгенна тъкан пречи сериозно на растителната селекция при следващо генно въвеждане. Така че, когато друг ген се въведе в трансгенно растение, съдържащо селекционен маркерен ген, въвеждането на гена трябва да бъде контролирано, като се използва различен селекционен маркерен ген. Ефективността на селекционния маркерен ген варира в зависимост от растителните видове. Следователно, необходим е предварителен тест за установяване на условията за всеки селекционен маркерен ген (например, съобщено е, че НРТ генът е поефективен в оризовите растения, отколкото NPTII гена (К. Shimamoto et al., Nature (London), voL 338, p. 274,1989)). Освен това, тъй като разновидностите на селекционния маркерен ген са ограничени, многократното въвеждане на ген не може да се повтаря безкрайно, просто като се променя селекционният маркерен ген. Това означава, че броят на гениите въвеждания в дадено растение сам по себе си е ограничен от разновидността на селекционните маркерни гени, които могат да бъдат използвани в това растение. Освен това, видът на селекционния маркерен ген, който може да бъде действително използван, е ограничен, както е посочено по-горе. Съответно, желателно е да се намери метод за отстраняване на селекционния маркерен ген от хромозомата след селекция на трансгенната растителна тъкан, за да се изключи влиянието на селекционния маркерен ген върху клетката, тъканта и растението.

Известни са два метода за елиминиране влиянието на селекционния маркерен ген. В единия метод селекционния маркерен ген и транспозон от растението се въвеждат в растителна хромозома и впоследствие се отстранява от там, следвайки транспозона. (International Laid-Open No. WO 92/01370). Във втория метод се използва сайтспецифичната рекомбинантна система на Р1 фага вместо транспозон (International Laid

Open No. WO 93/01283). Като се използват тези методи, е възможно да се получи клетка, в която селекционният маркерен ген се отстранява от растителната хромозома до известна степен след въвеждането на гена. За съжаление възможността селекционният маркерен ген да се отстрани е много малка.

Освен това, растителните клетки, в които селекционните маркерни гени са отстранени от хромозомите чрез тези методи, са разпръснати сред клетките, в които селекционните маркерни гени все още присъстват и се експресират. Тези два вида клетки не могат да се разграничат визуално.

Растителни клетки, съдържащи селекционни маркерни гени и един желан ген, могат да се селекционират въз основа на тяхната химична устойчивост, хранителни потребности и др. Обаче, по време на селекцията клетките, в които липсват селекционни маркерни гени, имат потиснат растеж и в много случаи се разрушават. Съответно, тези селекции не могат да се използват за получаване на клетки, в които липсват селекционни маркерни гени.

За да се получат растения, в които липсва селекционен маркерен ген и които съдържат желания ген, чрез използване на посочените методи, растителна тъкан, в която клетките, несъдържащи селекционния маркерен ген, и клетките, съдържащи селекционните маркерни гени, се смесват, пролиферират, регенерират и тогава се анализират за селекция, като се използват методи като Southern хибридизация или полимеразна верижна реакция. Този метод се базира на предпоставката, че регенериралият индивид е произлязъл от единична клетка и следователно всички растителни клетки трябва да имат същите характеристики. Така, един индивид, получен от клетка, в която липсва маркерният ген, е съставен само от такива клетки. За съжаление клетки, изграждащи такъв регенериран индивид, не са задължително еднакви. Клетки, в чиито хромозоми отсъства селекционният маркерен ген, и клетки, съдържащи селекционния маркерен ген, съществуват едновременно и се разпределят доста неравномерно дори в същия регенериран растителен индивид, а оттук и в същата тъкан. Така че изключително трудно е да се получи индивид, съставен само от клетки, в които липсва селекционният маркерен ген, на етап, в който култивираната тъкан се редиференциира, за да регенерира индивидът.

В допълнение, познатите аналитични методи за селекция използват тъкан, например от лист, като пробен образец (не цял индивид или единична клетка). Ето защо се анализира само общата тенденция по отношение състоянието на селекционния маркерен ген, присъстващ в един лист. Освен това, в този случай обикновено лишената от селекционен маркерен ген клетка и съдържащата селекционен маркерен ген клетка присъстват в същия индивид или тъкан. Така дори ако се формира индивид, съставен само от клетки, в които липсва селекционният маркерен ген, то трудно е той да бъде селекциониран. Дори ако присъствието на селекционния маркерен ген в тази тъкан не се открие, тъканите в други места на същия индивид могат да съдържат селекционния маркерен ген или това просто показва, че количеството на селекционния маркерен ген е под откриваемата граница. Следователно, невъзможно е да се определи дали изследваната проба е напълно лишена от клетки, съдържащи селекционния маркерен ген.

Като се използват посочените методи, е получен индивид, несъдържащ селекционния маркерен ген от зародишна клетка, като полен, яйцеклетка и др. Когато протича самоопрашване, като се използва яйцеклетка, несъдържаща селекционния маркерен ген, при определено съотношение според класическия закон за онаследяване се получава оплодено яйце, несъдържащо селекционния маркерен ген и от това оплодено яйце се получава индивид, съставен само от клетки, имащи същите характеристики както оплоденото яйце. Като се използва този индивид, могат да се прилагат конвенционални аналитични методи като Southern хибридизация. А именно, дори ако е получена клетка, в която липсва селекционният маркерен ген, чрез метода, описан в посочената литература, индивид, образуван само от такава клетка, е получен първоначално чрез редиференциране на растение от култивирана тъкан, съдържаща такава клетка, прилагайки кръстосване на регенерираното растение и получавайки поколение от F1 или следващи. Така полученият индивид може да бъде селекциониран като индивид, в който липсва селекционният маркерен ген.

За да се премахне селекционният маркерен ген от трансгенното растение, в патент JP-A-6276872 се съобщава техника за въвеждане на ген, чрез която селекционният маркерен ген е инсертиран в отделен плазмиден вектор, различен от вектора, съдържащ желания ген. Плазмидът, съдържащ селекционния маркерен ген, се отстранява от клетката, след като завърши въвеждането на гена (терминът “JP-А”, който се използва тук, означава публикувана патентна заявка на JP). Тази техника обаче изисква етап на кръстосване, за да се отстрани селекционният маркерен ген. В това отношение техниката е същата, като посочените по-горе в литературата.

Трудно е да се приложат описаните методи при дървесни растения, които имат дълъг период на растеж, стерилни индивиди или хибридни индивиди, в които само по себе си F1 има стойност. Освен това, когато се използват подвижни ДНК елементи, такива като транспозон и други подобни, съотношението, при което тези елементи се отстраняват от хромозомната ДНК, вирусна векторна ДНК и други, където тези елементи присъстват и функционират, е изключително ниско. Съответно, необходимо е отстраняването на тези елементи да се открива лесно (а именно, отстраняването на селекционния маркерен ген), поне на етапа култивирана тъкан. Когато това не може да се открие преди редиференциране на култивираната тъкан и образуване на по-късна генерация чрез кръстосване на регенерирания индивид, методът практически е неизползваем.

Техническа същност на изобретението

Предмет на настоящото изобретение е осигуряването на вектор, съдържащ желан ген, който да бъде въведен в растение, и селекционен маркерен ген, като растението, което го съдържа, няма вреден ефект върху човешкото тяло, когато се приема дори ако селекционният маркерен ген се експресира.

Друг предмет на настоящото изобретение е осигуряването на вектор за въвеждане на желан ген в растение, където векторът съдържа селекционен маркерен ген, който дава възможност да се селекционира трансгенна тъкан, без да се използва клетъчно растежно инхибиторно вещество, което намалява активността на растителната клетка.

Още един предмет на настоящото изобретение е осигуряването на вектор за въвеждане на желан ген в растение, който вектор съдържа селекционен маркерен ген и функционира, за да отстрани влиянието на селекционния марке рен ген чрез отстраняване на селекционния маркерен ген от ДНК, в която селекционният маркерен ген присъства и функционира. Като се използва този вектор, желаният ген може да се въвежда многократно и ефективно.

Следващ предмет на настоящото изобретение е да осигури метод за получаване на трансгенно растение, като се използва такъв вектор, който може да премахне влиянието на селекционния маркерен ген, без да е необходимо чрез кръстосване да се получи F1 или следващи поколения и метод за многократно въвеждане на гени в растение чрез прилагане на описания по-горе метод.

Съгласно изобретението се използва вектор, който съдържа желан ген и поне един ген, индуциращ морфологична аномалия (оттук-нататък означаван като “MAI”) като селекционен маркерен ген.

Съгласно изобретението се използва такъв вектор, в който селекционният маркерен ген се отстранява от ДНК след неговата експресия. Експресията на селекционния маркерен ген и изчезването на неговата функция се откриват чрез морфологични промени в тъканта, в която е бил въведен селекционният маркерен ген.

Съгласно изобретението се използва вектор, който съдържа желан ген, поне един MAI ген като селекционен маркерен ген, и подвижен ДНК елемент. MAI генът е разположен така, че той се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент. Желаният ген е разположен така, че той не се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент.

Съгласно изобретението е създаден метод за получаване на трансгенно растение, свободно от влиянието на селекционен маркерен ген, който метод включва следните етапи:

А) въвеждане на вектор в растителна клетка, който съдържа желан ген, поне един MAI ген като селекционен маркерен ген и подвижен ДНК елемент, в който MAI генът е разположен така, че се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент или е разположен така, че не се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент.

Б) култивиране на растителната клетка, получена в подточка А), откриване на морфологично анормална растителна тъкан, която се появява по време на култивирането и селекционираме на споменатата морфологично анормална тъкан,и

В) култивиране на морфологично анормалната тъкан, селекционирана в подточка Б), откриване на морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането и селекционираме на морфологично нормалната тъкан.

Съгласно изобретението е създаден и метод за въвеждане поне на два желани гена в растение, който метод включва провеждане на следните етапи поне два пъти:

A) въвеждане на вектор в растителна клетка, който вектор съдържа желан ген, поне един MAI ген като селекционен маркерен ген и подвижен ДНК елемент, като MAI генът е разположен така, че се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент или е разположен така. че той не се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент.

Б) култивиране на растителната клетка, получена в подточка А), откриване на морфологично анормална растителна тъкан, която се появява по време на култивирането, и селекциониране на споменатата морфологично анормална тъкан,и

B) култивиране на споменатата морфологично анормална тъкан, селекционирана в подточка Б), откриване на морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането, и селекциониране на морфологично нормалната тъкан.

В допълнение, тези и други предмети на настоящото изобретение са постигнати чрез растение, регенерирано чрез култивиране на описаната по-горе морфологично нормална тъкан.

Кратко описание на фигурите

На фигура 1 е показана диаграма на Ti плазмида и рестрикционна ендонуклеазна карта на Pst I фрагмент от Т-ДНК областта на А. tumefaciens щам РО22;

На фигура 2 - диаграма на конструкцията р1РТ2;

На фигура 3 - диаграма на конструкцията на р1РТЗ от р1РТ2;

На фигура 4 - диаграма на конструкцията на р1РТ4 от р1РТЗ;

На фигура 5 - рестрикционна ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта в структурата на р1РТ4;

На фигура 6 - резултати от PCR анализа на краен филизен фенотип на тютюн, в който е въведен ген, като се използва р!РТ4;

На фигура Ί - диаграма на конструкцията на ρΝΡΙ102;

На фигура 8 - диаграма на конструкцията на ρΝΡΙ103 от р1РТ4 и ρΝΡΙ 102;

На фигура 9 - диаграма на конструкцията на ρΝΡΙ 106 от ρΝΡΙ 103;

На фигура 10 - рестрикционна ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта в структурата на ρΝΡΙ106;

На фигура 11 - снимка на филиз No.. 2, един месец след култивиране в пример 2;

На фигура 12 - снимка на филиз No.. 8, един месец след култивиране в пример 2;

На фигура 13 са показани резултати от PCR анализа на филиз No. 8 в пример 2;

На фигура 14 - резултати от PCR анализа на нормални индивиди, получени от филизи No.. 13-1 и 14-1 в пример 3;

На фигура 15 - снимка на нормални филизи, диференцирани от краен филизен фенотип на тютюн в пример 3;

На фигура 16 - резултати от PCR анализа на нормален индивид, който е получен от лист, формиран от филиз No.. 7 в пример 2;

На фигура 17 - диаграма на конструкцията на ρΝΡΙ 128;

На фигура 18 - диаграма на конструкцията на pNPI129 от ρΝΡΙ 128;

На фигура 19 - диаграма на конструкцията на pNPI132 от ρΝΡΙΙΟΙ и ρΝΡΙ 129;

На фигура 20 - рестрикционна ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта в структурата на pNPI132;

На фигура 21 - резултати от PCR анализа на нормални индивиди, получени от филизи No. 15 до 21 в пример 5, като се използват праймери, в които е намерено наличието на ipt гена;

На фигура 22 - резултати от PCR анализа на нормални индивиди, получени от филизи No. 15 до 21 в пример 5, като се използват праймери, в които е открито елиминирането на област, придържана от двойка Rs’s, включваща ipt гена;

На фигура 23 - резултати от PCR анализа на нормални индивиди, получени от филизи No. 15 до 21 в пример 5, като се използват праймери, в които е открито наличието на GUS гена;

На фигура 24 - резултати от PCR анализа на нормални индивиди, получени от линия, която не може да формира краен филизен фенотип в пример 5;

На фигура 25 - диаграма на конструкцията на pNPI702;

На фигура 26 - рестрикционна ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта в структурата на pNPI702;

На фигура 27 - снимка на нормални филизи, диференцирани от краен филизен фенотип на хибрид от трепетлика в пример 7;

На фигура 28 - рестрикционна ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта в структурата на pNPI140.

На фигура 29 - резултати от PCR анализа на нормален филиз, диференциран от краен филизен фенотип след многократно въвеждане на гени в пример 8.

Предпочитан вариант на изобретението

Използваният тук MAI ген е ген, който индуцира в растителната тъкан морфологично анормална диференциация като нискораслост, нарушаване на апикална доминантност, промяна в пигментите, формиране на гали, образуване на покрити с власинки корени, нагъване на листата и други подобни. По отношение на предпочитан MAI ген в различните растения могат да се използват тези гени, изолирани от бактериите от рода Agrobacterium или други подобни, които индуцират тумор или тератома (т.е., формиране на допълнителни филизи и допълнителни корени). Примери за такива различни MAI гени включват цитокинин синтетазния ген (т.е., ipt (изопентенилтрансферазния) ген (A. С. Smigocki L. D. Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, p. 5131, 1988)), iaaM (триптофан монооксигеназен) ген (Н. J. Klee et al., Genes & Development, vol. 1, p. 86, 1987), ген 5 (H. Korber et aL, EMBO Journal, vol. 10, p. 3983, 1991), ген 6b (P. J. J. Hooykaas et al., Plant Mol. Biol., vol. 11, p. 791, 1988), и rol гените като rolA, rolB, rolC и rolD (F.F. White et al., J. Bacteriol., vol. 164, p. 33, 1985). Освен това, примери за това включват iaaL (индолоцетния-лизин синтетазен) ген като Pseudomonas syringae subsp. savastanoi (A. Spena et al., Mol. Gen. Genet., vol. 227, p. 205, 1991), хомео бокс гените и фитохром гените в различни растения. Предимно се използват цитокинин синтетазните гени, като ipt гена или поне един ген, селекциониран от rol гените (най-предпочитани са, rol гените, съдържащи гените rolA, rolB и rolC). Ipt генът присъства в Т-ДНК на Agrobacterium tumefaciens и индуцира разрушаване на апикална доминантност. Rol гените, съдържащи гените rolA, rolB и rolC, присъстват в Т-ДНК на Agrobacterium rhizogenes и поне един от тях индуцира образуването на корени с власинки, нискораслост, нагъване на листата и други подобни на растение, регенерирано от корен с власинки.

Като се използват техниките от настоящото изобретение, може да се състави комбинация от тези селекционни маркерни гени така, че се редиференцира специфична структура като допълнителен филиз, допълнителен корен или подобни на тях в определено растение, в което са въведени тези селекционни маркерни гени. В настоящото изобретение може да бъде използвана такава комбинация от MAI гени в зависимост от условията на получаване на трансгенното растение, например видът на растението, в което трябва да бъдат въведени гените.

Морфологично анормалната тъкан, получена чрез въвеждане на MAI гена в клетката, е съставена само от клетки, съдържащи този ген. Следователно, като се използва този ген като селекционен маркерен ген, се конструира вектор заедно с желания ген. Когато този вектор се въведе в растителната клетка и трансгенната клетка се култивира, тъканта, възстановена само от тази клетка, в която са въведени селекционният маркерен ген и желаният ген, може да се селекционира чрез визуално селекциониране на морфологично аномалната тъкан, формирана от тази клетка.

Подходящи вектори, полезни според настоящото изобретение, имат ДНК последователност, която въвежда чужд ген в клетката гостоприемник и която експресира чуждия ген в клетката на гостоприемника.

Когато генът е въведен, като се използва векторът от настоящото изобретение, растителната тъкан, възстановена само от трансформираната клетка, може визуално да се селекционира просто чрез култивиране на клетката след операцията за въвеждане на гена в обичайна културална среда като MS (Murashigue-Skooq) културална среда, при нормални условия на култивиране. Тъй като не е необходимо да се използва специфично вещество за селекциониране на трансформираната тъкан, като клетъчно растежно инхибиторно вещество или други подобни, процедурата е не само опростена, но също така и активността на растителната клетка не намалява от такова вещество. В допълнение растението има свойствения MAI ген, или МА1 генът е спонтанно въведен в растението чрез заразяване с бактерии или други подобни. Съответно растение, получено чрез използване на вектора съгласно настоящото изобретение, не се различава от естествено срещащите се растения. които имат тази морфологична анормалност.

Подходящ вектор съгласно изобретението е векторът, в който MAI генът е разположен така, че той се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент, а желаният ген е разположен така, че той не се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент.

Използваният тук подвижен ДНК елемент е елемент от ДНК последователност, като самият е отстраним от ДНК, в която ДНК елементът съществува и функционира. В растенията транспозонът, присъстващ в хромозомата, е известен като такъв елемент. Структурата, активността и поведението на транспозоните вече са почти напълно идентифицирани. За да функционира транспозонът, са необходими по принцип два компонента: 1) ензим, който се експресира от гена, който присъства там, и който катализира изрязването и преместването на самия транспозон (транспозаза); и 2) ДНК свързващи последователности, които присъстват в крайната област на транспозона и върху които действа транспозазата. Чрез тези елементи транспозонът се изрязва от хромозомата, в която той присъства. и след това обикновено се премества на ново място в ДНК. Обаче, при дадено съотношение транспозонът също така изчезва, без да бъде преместен. Съгласно настоящото изобретение се извлича полза от такава транспозиционна грешка на транспозона.

Транспозонът може да бъде един от двата типа: или автономен транспозон, или неавтономен транспозон. Автономният транспозон поддържа двата елемента, транспозазата и ДНК свързващата последователност. В автономния транспозон транспозазата се експресира и се свързва с ДНК свързващата последователност за действие, чрез което транспозонът автономно се изрязва от хромозомата. Неавтономният транспозон запазва терминалната ДНК свързваща последователност, за която транспозазата се свързва за действие. В неавтономния транспозон транспозазният ген се подлага на мутация, така че транспозазата не се експресира, а така транспозонът не може да се изреже от хромозомата автономно. Обаче, когато неавтономният транспозон е снабден с транспозаза от автономен транспозон или от независим транспозазен ген, неавтономният транспозон се държи подобно на автономния транспозон.

Примери за автономни транспозони включват Ас и Spm, изолирани от царевица (A. Gierl and Н. Saedler, Plant Mol. Biol., vol. 19, p. 39, 1992). Ac може да се получи чрез разграждане на wx-m7 генния локус в хромозомата на царевица с рестрикционната ендонуклеаза Sau3A (U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet., vol. 194, p. 346, 1984). Този автономен транспозон е най-анализираният сред растителните транспозони. В действителност ДНК последователността вече е определена (М. Muller-Neumann et al., Mol. Gen. Genet., vol. 198, p. 19, 1984).

Примери за неавтономни транспозони включват Ds и dSpm, получени чрез делеция на вътрешните области на Ас и Spm, съответно (Н.Р. Doring and Р. Starlinger, Ann. Rev. Genet., vol. 20, p. 175, 1986) и тези, изолирани от много растения, други освен царевицата, като кученце, грамофонче и други подобни (например, Y. Inagaki et al., Plant Cell, vol. 6, p. 375, 1994). Когато тези транспозони се въведат в хромозомите на екзогенни растения, тези транспозони също се изрязват от хромозомата и се преместват като разкриват активност (например, В. Baket et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, p. 4844, 1986).

В настоящото изобретение и автономният, и неавтономният транспозон могат да бъдат използвани. Неавтономният транспозон може да се използва, след като в него се вмъкне функциониращ транспозазен ген.

Друг подвижен ДНК елемент, който не присъства в растенията, но който може да се използва според настоящото изобретение, е елемент, получен от сайт-специфична рекомбинантна система. Сайт-специфичната рекомбинантна система се състои от два елемента: 1) рекомбинантен сайт (съответстващ на подвижния ДНК елемент от настоящото изобретение), имащ характерна ДНК последователност; и 2) ензим, който се свързва специфично с ДНК последователността, и катализира рекомбинацията между ДНК последователностите, ако съществуват две или повече последователности (рекомбиназа). Когато двете ДНК последователности са ориентирани в една и съща посока с даден интервал върху същата ДНК молекула, областта, обхващаща тези ДНК последователности, се изрязва от ДНК молекулата, подобно на плазмид, хромозома и други. Когато двете ДНК последователности са ориентирани в противоположна посока върху същата ДНК молекула, областта, която обхваща тези ДНК последователности, е инвертирана.

Настоящото изобретение използва предимно първото изрязване. Двете - изрязването и инверсията в рекомбинантния сайт се срещат като резултат от хомоложна рекомбинация чрез сайтспецифичната рекомбинантна система, която е различна от механизма, използващ транспозона. Известно е, че рекомбинантният ген не е необходимо да присъства в същата ДНК молекула, в която съществува рекомбинантният сайт. Рекомбинантният ген е необходим да присъства само в същата клетка и трябва да се експресира, за да изреже или инвертира областта, обхващаща двете ДНК последователности (N.L. Craig, Annu. Rev. Genet., vol. 22, p. 77, 1988).

Понастоящем са идентифицирани сайтспецифични рекомбинантни системи в микроорганизми като: фаг, бактерия (например Е. coli), дрожди и други подобни. Примери за това включват Сге/lox система, pSRl система, FLP система, сег система, и firn система (например, N.L. Craig, Annu. Rev. Genet, vol. 22, p. 77, 1988). Когато сайтспецифичната рекомбинантна система, отделена от тези микроорганизми с използването на Сге/lox система, получена от Р1 фага (WO 93/01283), се вмъкне в организми (включващи растения), различни от организма, от който тази система е получена, тя се държи по същия начин, както в първоначалния организъм. Сайтспецифичната рекомбинантна система на дрождите (Zigosaccharomyces rouxii) (pSRl система (Н. Matsuzaki et al., J. Bacteriology, vol. 172, p. 610, 1990)) може също така да бъде използвана според настоящото изобретение. Тази pSRl система също поддържа своята присъща функция във висшите растения (Н. Onouchi et al., Nucleic Acid Res., vol. 19, p. 6373, 1991).

В настоящото изобретение генът, индуциращ морфологична аномалия, (MAI) гена, може да бъде инсериран в сайт, където този ген се изрязва заедно с подвижния ДНК елемент. Например, когато транспозонът се използва като подвижен ДНК елемент, MAI генът може да бъде инсериран в сайт, който не влияе на изрязването на транспозона и който е вляво от промоторната област на транспозазния ген, но вдясно от терминалната област, с която транспозазата се свързва. Когато се използва pSRl системата, MAI генът може да бъде вмъкнат в който и да е сайт в областта, обхващаща характерните

ДНК последователности, която не потиска експресията на рекомбиназата.

В настоящото изобретение MAI генът присъства предимно в подвижния ДНК елемент. От друга страна, мястото на желания ген не е точно ограничено, но е за предпочитане желаният ген да присъства извън подвижния ДНК елемент.

Като се използва вектор с такава структура след въвеждане на желания ген, MAI генът може да бъде отстранен при определена честота заедно с подвижния ДНК елемент от ДНК, в която той е въведен и функционира. Желаният ген, който не се държи като едно цяло със селекционния маркерен ген, остава в същата ДНК. Векторът може да се използва за многократно въвеждане на желан ген в определено растение. В допълнение, тъй като загубата на функция на този MAI ген може визуално да се открие като морфологична промяна на трансгенната тъкан по време на култивиране, тъканта, възобновена от клетка с желания ген, но без селекционния маркерен ген, може да се селекционира лесно и без да е необходима специална процедура. Следователно, дори когато такава клетка се образува с ниска честота, клетката може да бъде успешно селекционирана, за да направи процедурата практически полезна. Освен това, не само може много пъти да се повтаря въвеждането на гена, като се използва този вектор, но това може да се повтаря, преди да е регенерирано зряло растение. По такъв начин многократното въвеждане може да се провежда ефективно. За да се получи отделно трансгенно растение, изградено само от такива клетки, растението може да се възстанови от така селекционираната тъкан, без да е необходим етап на кръстосване. Така полученото отделно трансгенно растение е напълно лишено от каквито и да са вредни ефекти върху човешкото тяло, причинени от селекционния маркерен ген, както бе споменато по-горе. Освен това, използването на този вектор не изисква вещество, инхибиращо клетъчния растеж, което може да намали клетъчната активност в етапа на селекциониране на трансгенната тъкан.

Векторът от настоящото изобретение може да се използва във всякакви растения, в които генът може да бъде въведен чрез генноинженерни методи. Желаният ген според настоящото изобретение може да бъде всеки един ген, чрез който могат да се предават ценни селскостопански характеристики и всеки един ген, който позво лява изследвания на гениите експресионни механизми и други подобни, макар че не е задължително да се предават ценните селскостопански характеристики.

За да се получи белтък като например ензим от ген, най-общо са необходими структурна генна последователност, кодираща информацията на полипептида, и регулаторни последователности на структурния ген, като промоторна последователност, инициираща експресията последователност) и терминаторна последователност (последователност за крайна експресия) и други подобни. Примери за подходяща промоторна последователност, която функционира в растението, включва 35S промотора на вируса на мозайката по цветно зеле (J.T. Odell et al., Nature (London), vol. 312, p. 810, 1985), промотора на нопалин синтетазата (W.H.R. Langridge et al., Plant Cell Rep., vol. 4, p. 355, 1985) и промотора на рибулозо дифосфат карбоксилазата/малката субединица на оксигеназата (R. Fluhr et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, p. 2358, 1986). Примери за подходяща терминаторна последователност включват сигнал за полиаденилиране на нопалин синтетазата (А. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., vol. 1, p. 561, 1982) и сигнал за полиаденилиране на октопин синтетазата (J. Gielen et al., EMBO J., vol. 3, p. 835, 1984). Съответно, когато е необходимо, генът от вектора на настоящото изобретение включва структурен ген и неговите експресионни регулаторни последователности. Генът, или генът и регулаторните последователности, могат да бъдат получени чрез химически синтез или чрез клониране на кДНК или геномна ДНК.

Векторът от настоящото изобретение може да бъде непряко въведен в растителната клетка чрез вируси или бактерии, с които растенията се заразяват (I. Potrykus, Алпи. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 42, p. 205, 1991). Примери за подходящи вируси включват вирус на мозайката по цветното зеле, джеминивирус, вирусът на мозайката по тютюна, и вирусът на бромусовата мозайка. Примери за подходящи бактерии включват Agrobacterium tumefaciens, (по-нататък означавана като A. tumefaciens) и Agrobacterium rhizogenes (по-нататък означавана като A. rhizogenes). Известно е, че обикновено двусемеделните растения се заразяват с бактерии от рода Agrobacterium. Неотдавна беше съобщено за въвеждането на гени в едносемеделни растения чрез заразяване на тези растения с тях (например, в

International Laid-Open No. WO 94/00977).

Векторът от настоящото изобретение може да бъде директно въведен в растителна клетка чрез физични и химични методи, например като микроинжектиране, електропорация, полиетиленгликолов метод, метод на сливане и метод на проникване с висока скорост (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 42, p. 205, 1991). Тъй като обикновеният индиректен метод за въвеждане, като се използва род Agrobacterium, не може да бъде приложен за много от едносемеделните растения и двусемеделните растения, които са устойчиви към заразяване с Agrobacterium, за тези растения са ефективни посочените методи за директно въвеждане.

Използваният вектор в настоящото изобретение не е специфично ограничен до степен, до която той задоволява практическите нужди. Например, ако векторът е индиректно въведен в растителната клетка, векторът може да е Ti вектор или вирусен вектор. Примери за Ti вектор, използвани в настоящото изобретение, включват Bind 19 (М. Bevan et al., Nucleic Acids Res., vol. 12, p. 8711, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 85, 1985), pGA492 и pGA482 (G. An. Plant Physiol., vol. 81, p. 86,

1986) , pC22 (C. Simoens et al., Nucleic Acids Res., vol. 14, p. 8073, 1986), pAGSlll (P. van den Elzen et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 149, 1985), pEND4K (H. J. Klee et al., Bio/Technology, vol. 3, p. 637, 1985), pGV831 (R. Delaere et al., Nucleic Acids Res., vol. 13, p. 4777, 1985), и pMON200 (R.T. Fraley et al., Bio/Technology, vol. 3, p. 629, 1985). Примери за вирусен вектор, използвани в настоящото изобретение, включват вирусен вектор на мозайката по цветното зеле (N. Brisson et al., Nature (London), vol. 310, p. 511, 1984), джеминивирусен вектор (R.J. Hayes et al., Nature (London), vol. 334, p. 179, 1988), бромусовия вирусен вектор на мозайката (R. French et al., Science, vol. 231, p. 1294, 1986), векторът на вируса на мозайката по тютюна (N. Takamatsu et al., EMBO J., vol. 6, p. 307,

1987) , агроинфектиращия вектор (N, Grimsley et al., Nature (London), vol. 325, p. 177, 1987). Обаче векторите, използвани в настоящото изобретение, не се ограничават само с това.

Освен това желаният ген, използван в настоящото изобретение, не е специално ограничен. Самата природа на желания ген не е критична за настоящото изобретение. Примери за използване на желан ген в настоящото изобретение включват гени за устойчивост към болест (например, ген за ендотоксина на Bacillus thuringiensis, WO 92/20802), устойчивост към хербицид (например, мутантен ацетолактат синтетазен ген, WO 92/08794), белтък, запазващ семената (например глутелинов ген, WO 93/18643), синтез на мастна киселина (например, ацил-АСР тиоестеразен ген, WO 92/20236), хидролиза на клетъчна стена (например, полигалактуроназен ген (D. Grierson et al., Nucleic Acids Res., vol. 14, p. 8595, 1986)), биосинтеза на антоцианина (например, халкон синтетазен ген (H.J. Reif et al., Mol. Gen. Genet., vol. 199, p. 208, 1985)), биосинтеза на етилена (например, ACC оксидазен ген (A. Slater et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 137, 1985)), пречистваща система c активен кислород (например, глутатион редуктазен ген (S. Greer & R.N. Perham, Biochemistry, vol. 25, ρ. 2736, 1986) и биосинтеза на лигнина (например, фенилаланин амоняк-лиазен ген, цинамилалкохол дехидрогеназен ген, о-метилтрансферазен ген, цинамат 4-хидроксилазен ген, 4кумарат-КоА лигазен ген, цинамоил КоА-редуктазен ген (А.М. Boudet et al., New Phytol., vol. 129, p. 203, 1995)). Обаче, желаният ген, използван в настоящото изобретение, не е ограничен с това.

Освен това клетката гостоприемник, използвана в настоящото изобретение, не е специално ограничена. Примери за тревисто растение, използвано като растение гостоприемник, включва тютюн (Tabacum), домат (Lycopersicom |, сладък картоф (Impoea), картоф (Solanum}, морков (Dacus), салата (Lactuca) цветно зеле (Brassica), зеле (Brassica), рапица (Brassica), слънчоглед (Helianthus), захарно цвекво (Bela), аспарагус (Asparagus), банан (Musa), памук (Gossypium), арабидопсис (Arabidopsis), люцерната (Medicago), грах (Pisum), соя (Glycine), ориза (Oryza), царевица (Zea) и ръж (Secale). Примери за дървесно растение, използвано като растение гостоприемник, включват топола (Populus), евкалипт (Eucalyptus), акация (Acacia), круша (Pyrus), ябълка (Malus), лоза (Vitis), орех (Juglans), слива (Prunus), роза (Rosa) и смърч (Picea). Обаче растенията гостоприемник, използвани в настоящото изобретение, не се ограничени с това.

В настоящото изобретение MAI генът се експресира, за да предизвика вътре в клетката физиологична аномалия. Физиологичните аномалии включват получаване на растителен рас тежен хормон в растителна клетка, като резултатът е, че пролиферацията и диференцията на клетката, съдържаща MAI гена, се причина за индукация на различни физиологични аномалии. Например агрегация на разбъркани филизи с разрушена апикална доминантност (краен филизен фенотип; ESP), корени с власинки или други подобни, могат да се получат от клетка, в която такъв MAI ген е въведен. Този фенотип се получава чрез аномална пролиферация и диференциация на посочената клетка. По такъв начин тази морфологично аномална тъкан е възстановена само от клетката, съдържаща този ген. Съответно, ако се конструира вектор, като се използва този ген като селекционен маркерен ген заедно с желания ген и се въведе в растителната клетка, и клетката се култивира, тъканата, създадена от клетката, в която селекционен маркерен ген и желаният ген са въведени може да бъде селекционира просто чрез визуално диференциране на морфологично анормалната тъкан, образувана от растителна клетка. По такъв начин е възможно визуално да се селекционира трансгенната тъкан, без да се провеждат каквито и да са специални процедури, като добавяне на вещество, инхибиращо растежа на растителните клетки, и други подобни към културалната среда.

Докато конвенционалните селекционни маркерни гени, такива като NPTII гена, не се въвеждат в растенията без генно инженерство; MAI генът от настоящото изобретение е ген, който растенията вродено запазват, или който естествено се въвежда в растенията чрез заразяване с бактерии или други подобни. Поради тази причина безопасността на този генен продукт за човешкото тяло се счита за доста висока.

Освен това в настоящото изобретение MAI генът се вмъква в такова място, че той се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент. След като векторът, имащ такава структура, се въведе в растението, MAI генът, използван като селекционен маркерен ген, се отстранява от ДНК заедно с подвижния ДНК елемент с постоянна честота, водеща до загуба на неговата функция. Междувременно желаният ген, който не се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент, се запазва в същата ДНК и поддържа своята функция. Така експресията на същия селекционен маркерен ген може да се използва като индекс за въвеждането на желан ген отново и отново. Съответно този вектор причинява многократно въвеждане на гена в определено растение просто като променя структурата, свързана с въвеждането на желания ген, без да причинява каквато и да е промяна върху структурите на селекционния маркерен ген и на другата. Поради тази причина векторът може да се използва многократно за неограничен период от време.

Тъй като загубата на функция на селекционния маркерен ген, т.е. загубата на функция на MAI гена, може да бъде открита визуално, тъканта, съставена от клетки, в които липсва селекционният маркерен ген и съдържаща желания ген, може да бъде получена сигурно и лесно. Това означава, че култивирането, визуалната селекция и отделянето могат да бъдат повтаряни, без да е необходимо някаква специална процедура, за да се получи такава тъкан. Освен това растението, създадено само от посочената клетка, може да се получи само чрез регенериране на растението от получената тъкан, без да е необходим етап на кръстосване. Освен това, въпреки че е трудно транспозонът да бъде изцяло отстранен от ДНК, защото този елемент има висока подвижност, изобретението може да се прилага с успех в практиката, поради високата ефективност на селекцията.

Примери за изпълнение на изобретението

Настоящото изобретение ще бъде илюстрирано чрез следните примери, които не го ограничават.

В следващите примери експериментите са проведени според инструкциите на Molecular Cloning, 2nd edition (Samrook et al. ads., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 11989) или съгласно инструкиците на произовидтеля, освен ако не са указани други.

Пример 1.

1. Конструиране на вектор

Ipt генът, присъстващ в Т-ДНК на патогенната A.tumefaciens, щам PO22(K.Wabiko, Chemical Reglation of Plants, vol 24,p.35, 1989 (виж фиг.1) беше срязан с рестрикционната ендонуклеаза Pstl и беше получен плазмидът PIPT1, чрез лигиране на ipt гена в Pstl рестриктазно ендонуклеазен сайт на плазмида pUC7 (Molecular Cloning, 2 nd edition,, vol. 1,4. 10). От този плазмид, c рестрикционните ендонуклеази BamHI и Pstl беше срязан ipt генът, съдържащ нативен промотор и нативен сигнал за полиаденилация и беше получен плазмитьт р1РТ2, чрез лигиарне на ipt гена в BamHI-PstI рест риктазните ендонуклеазни сайтове на плазмида pUC119 (получен от Takara Shuso Co., Ltd.). От този плазмид с рестрикционната ендонуклеаза Rsal бяха срязани структурният ген и нативният полиаденилиран сигнал на oipt гена и беше получен плазмидът р1РТЗ чрез лигиране на ipt генва в Smal рестриктазно ендонуклеазен сайт на плазмида pUCl 19. Освен това с рестрикционните евдонуклеази BamHI и Sacl беше срязан ipt генът, вмъкнат в р1РТЗ и беше получен плазмидът р1РТ4 чрез лигиране на фрагмента в ВашШSacl рестриктазните ендонуклеазни сайтове на векторния плазмид рВ1121, получен от Clontech Co.), който е полезен за въвеждане на гена в растение. Когато едно растение е заразено с A.tumefaciens, съдържаща плазмида, IPT4, Т-ДНК областта, която се намира между LB място и RB място, тук това е областта с приблизителна дължина 5 kb, съдържаща NPTII гена, и ipt гена, се интегрира в хромозомата на растението.

Този плазмид р!РТ4 беше въведен в E.coli (Escherichia coli) щам JM109 и той беше депозиран съгласно Будапещенския договор като E.coli JM109 (р1РТ4) под депозит No FERM ВР-5063.

Стратегията за конструиране на плазмида pIPt4 схематично е показана на фиг.2 до 4. Рестрикционната ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта от плазмида е показана на фиг.5. На фиг.2 до 4 и 5, оградените Р и Т означават нативен промотор и нативен сигнал за полиаденилиране на самия ipt ген респективно. 35S-P означава 35S промотора на вируса на мозайката по цветното зеле, a Nos-P означава промотора на нопалин синтетазния ген. Т. (фиг.4) или NosТ (фиг.5) означава полиаденилиран сигнал на нопалин синтетазния ген.

В този пример, както е показано на фиг.5 за MAI гена, като селекционен маркерен ген беше използван ipt генът, който допринася за формирането на ESP чрез индуциране разрушаването на апикалната доминанта, a NPTII генът беше използван като модел за желан ген. Ipt генът е член на онкогените, които патогенната

A. tumefaciens запазва. Растителна клетка, в която е въведен този ipt ген, причинява диференциация, която води до формиране на ESP, поради свръхпродукция на цитокинин, който е растителен хормон.

В този пример 35S промоторът на вируса на мозайката на цветното зеле беше използван за промоторна последователност на ipt гена, а нативният сигнал за полиаденилация на самия ipt ген беше използван за терминаторна последователност.

II. Въвеждане на PIPT4 в Agrobacterium.

A. tumefaciens, щам LBA4404, получен от Clontech Co.), се инокулира в 10 ml YEB течна културална среда, съдържаща в g/1 5 говежди екстракт, 1 дрождев екстракт, 1 пептон, 5 g захароза и 2 mM MgSO₄, при pH 7.2 и 22°С (pH при 22°С, се прилага, ако няма друга инструкция) и беше култивиран при 28°С, докато OD_63O е в диапазона от 0.4 до 0.6. След това културата се центрофугира при 6,900 х g за 10 min при 4°С, за да се съберат клетките. Клетките се суспендират в 20 ml 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) и суспензията се центрофутгира отново при 6,900 х g за 10 min при 4°С. Впоследствие събраните клетки се ресуспендират в 200 μΐ. YEB течна културална среда и тази суспензия се използва като клетъчен разтвор за въвеждане на плазмида.

B. В 15-милиметрова епруветка, произведена от Falcon, 200 μΐ от клетъчния разтвор за въвеждане на плазмида се смесват с 6 pg от плазмида р1РТ4, получен в по-горе описания етап I, и сместа се изстудява чрез потапянето й за 5 min в етанол, който се изстудява в течен азот от 30 до 40 min. Така изстуденият разтвор заедно с епруветката се поставя във водна баня при 29°С за 25 min. След това 750 μΐ от ΥΕΒ течната културална среда се добавя към него и смесеният разтвор се култивира при 29°С за един час при непрекъснато клатене. Този клетъчен разтвор беше поставен върху ΥΕΒ агарова културална среда, съдържаща 1,2 т./об. агар, и същите съставки като тези от посочената културална среда), към която беше добавен 50 mg/ канамицин, и култивиран при 28°С за два дена. Така получените клетъчни колонии се инокулират в YEB течна кулутрална среда и понататък култивирани. След това плазмидът се екстрахира от клетките чрез алкален метод и се срязва с рестрикционните евдонуклеази PstI, BamhI и EcoRI. Така получените фрагменти от плазмида се анализират чрез агарозна гелелектрофореза и се потвърди, че плазмидът р1РТ4 е въведен в A.tumefaciens щам LBA 4404.

III. Въвеждане на р1РТ4 от Agrobacterium в тютюн.

Зрели листа от тютюн (Nicotiana tabacum cv. xanthi, по-нататък тютюнът означава тази разновидност, ако не е посочена по-специално друга, отгледани в парник, се потапят в 1 об./ об. воден разтвор на натриев хипохлорид, за стерилизиране и се измиват три пъти със стерилна вода. След това средната жилка от листа се премахва, за да се образуват листни дискове с квадрат, приблизително 8 mm. Така получените листни дискове след това се потапят за около една минута в клетъчна суспензия от A. tumefaciens щам LBA4404, съдържат р1РТ4 в погоре описания етап II и се заразяват с нея, която суспензия е разредена със стерилна вода при OD₆₃₀=0.25 след една нощ култивиране в YEB течна среда). Инфектираният листен диск се поставя върху стерилна филтърна хартия, за да се отстрани каквато и да е допълнителна клетъчна суспензия. След това той се поставя върху MS културална агарова среда без хормон (Т. Murashige and F.Skoog, Physiol. Plant, vol. 15, p. 473, 1962), при условие, че 0.8 т./об. arap е добавен към нея, съдържаща 50 mg/l ацетосирингон, като гърбът на листа е насочен нагоре и се култивира за три дена при 25°С при пълна светлина (култивирането на експланта, растителната тъкан и растението се провеждат при тази температура и светлинни условия, ако не е посочена друга инструкция. Така култивираният листен диск се трансплантира в MS агарова културална среда без хормон, съдържаща само 500 mg/l карбеницилин и култивирането продължава. Като резултат 22 допълнителни филиза се редиференцират. Тези допълнителни филизи се отделят и по-нататък се култивират в културална среда, с посочения състав, за да се получат 6 ESP линии. Тези ESP линии се субкултивират в същата културална среда всеки месец, и се субкултивират няколко пъти 3 месеца след заразяването в MS агарова културална среда без хормон, която не съдържа карбеницилин. След като не се наблюдава пролиферация на Agrobacterium, се провеждат тестове за устойчивост към канамицин и PCR анализ.

IV. Анализ на тютюн, в който генът е въведен.

А. Тестът за устойчивост към канамицин. Шестте ESP линии, получени в по-горе описания етап III, се култивират като такива без субкултура. Листата, развиващи се от тези ESP линии, се срязват, за да се образуват листни дискове с квадрат около 3 mm. Така получените листни дискове се поставят върху MS агарова кулутрална среда (1 mg/l бензил аденин и 0,2 mg/l α-нафтален оцетна киселина се добавят към нея), съдържаща 200 mg/l канамицин. След култивиране в тази канамицинсъдържаща културална среда за един месец се наблюдава формиране на ESP линии върху листните дискове, получени от тези ESP линии.

E.PCR анализ

Хромозомни ДНК се екстрахират от всички 6 ESP линии, получени в по-горе описания етап III, и гените, въведени в тях, се анализират чрез PCR метод.

Хромозомалната ДНК се екстрахира чрез използване на следния модифициран СТАВ метод.

Отначало около 1 g от листата, развити от ESP бяха поставени в течен азот, чрез използване на студен хаван и чукче, и суспендирани в 5 ml буфер, съдържащ 2 т./об. СТАВ (хексадецилтриметиламониев бромид), 1.4 М NaCL, 0.2 об./об. β- меркаптоетанол, 20 mM ЕАТА, и 100 mM Tris-HCI (pH 8.0), който беше нагрят до 60°С. Тази суспензия е нагрята до 60°С от 30 до 60 min при внимателно разбъркване и след това беше охладена до стайна температура. Към тази суспензия беше добавен еднакъв обем смес от хлороформ и изоамилов алкохол (24:1) и те бяха смесени внимателно. След това беше центрофугирана при 1600 х g за 5 min, за да се получи супернатанта. Впоследствие 2/3 обем от изопропилов алкохол се добавяше към супернатантата и се смесваха отново внимателно. Сместа се оставяше да престои върху лед за 10 min, за да преципитира хромозомалната ДНК. Тази хромозомална ДНК се събира чрез центрофугиране при 1600 х g за 10 min. Така събраната хромозомална ДНК се измиваше със 70 об./об. етанол, след това се изсушава под вакуум и се разтваря в 300 μΐ. ТЕ, съдържащ 10 mM TRis-HCI и ImM EDT.

Междувременно, за да се открие ipt генът чрез PCR метода, двойката праймери (оглигонуклеотиди), които трябва да бъдат използвани, се синтезира чрез OKU синтезатор, произведен от Applied Biosystems Co. Когато те бяха свързани с ipt гена, разстоянието между 2 праймера беше приблизително около 800 Ьр. За да се амплифицира ipt генът, 1 pg от екстрахираната хромозомално ДНК беше разтворена в 50 μΐ от смесения разтвор, съдържащ 0.2 μΜ от тези парймери, 10-mM Tris-HCI (ph 8.8 при 25°С/, 50 тМ KCI, 1.5 mM MgClj, 1 τ/об. Triton Х-100, 0.1 тМ dNTP и 1.25 единици от полимераза Tag, получена от CETUS CO.). След като сместа беше загрята при 94°С за 1.5 min, тристепенен цикъл на загряване, а именно при 94°С за една min, при 55°С за две min, при 72°С за три min се повтаряха общо 30 пъти, за да завърши реакцията. Получената реакционна смес се анализира чрез агарозна гел електрофореза, за да се открие присъствието на ipt гена в хромозомалната ДНК чрез амплификация на гена с приблизителна дължина 800 Ьр.

Резултатите са показани на фиг.6. Както е ясно от тази фигура, амплификация на гена с приблизителна дължина 800 Ьр се наблюдаваше във всичките шест ESPs. На фиг.6 стойностите, означени от лявата страна, показват дължината на базите, които се отнасят до отделните фракции (по-нататък означавани като “ивица”) при електрофорезата на размера на селекционната маркерна ДНК.

Сравнителен пример 1.

Проведен е анализ с 16 филиза, които нямат способността да образуват ESP и които бяха получени от допълнителните филризи, редиференцирани от заразените с A.tumefaciens листа в етап III от пример 1. Така че, когато 22 допълнителни филизи се култивират и бяха селекционирани шест ESP линии в етап III от пример 1, тези показващи морфологично нормални филизи (означавани като “HeESP”) бяха също така освободени от A. tumefaciens и подложени на тест за устойчивост към канамицин, по същия начин, както в етапите III и IV от пргмер 1. Понататък, 9-те HeESP линии бяха подложени на PCR анализ. Обаче по отношение на тези HeESP линии листните дискове, поставени върху културална среда, съдържаща канамицин, станаха кафява и изсъхнаха след приблизително три месеца. Освен това при PCR анализа, амплификация на ДНК фрагмент с приблизителна дължина 800 Ьр, който доказва присъствието на ipt гена, на беше открит в която и да е от анализираните 9 линии.

Резултатите от PCR анализа са показани на фиг.6.

Пример 2. I. Конструиране на вектор.

Плазмидът pHSG398, получени от Такага Shuzo Co., Ltd.,беше разграден с рестрикционната ендонуклеаза BamHI. Лепливите краища, получени при разграждането, бяха променени в тъпи краища с Т4ДНК полимераза I (голяма субединица) и беше получен плазмидът ρΡΝΡΙΙΟΟ чрез свързване на тези краища. Така че, ρΝΡΙΙΟΟ беше pHSG398, загубил BamHI рестриктазния ендонуклеазен сайт. Междувременно плазмитьт, pCKR97 (T.Izawa et al., Mol. Gen. Genet., vol 227, p.391, 1991)беше разграден c рестрикционната ендонуклеаза Pstl. Транспозонът Ac от царевица беше срязан и вмъкнат в Pstl рестриктазен ендонуклеазен сайт на ρΝΙΙΟΟ, за да се получи плазмидът pNPI102.

Впоследствие, от плазмида р1РТ4 конструиран, в пример 1, 35S промоторът вируса на мозайката по цветното зеле и ipt генът, свързан с него, бяха срязани с рестрикционните етдонуклеази Hindlll и Sacl. Лепливите краища на така получения фрагмент бяха променени в тъпи краища с Т4ДНК полимераза I и фрагментът беше вмъкнат в Hindi рестрикционния ендонуклеазен сайт от плзмида pUCl 19, за да се получи плазмидът ρΝΙΙΟΙ. От плазмида pNPlOl, 35S промоторът на вируса на мозайката по цветното зеле и ipt генът бяха срязани отново с рестрикционните ендонуклеази Pstl и EcoRI и лепливите краища на фрагмента бяха променени в тъпи краища с Т4ДНК полимераза I. По-нататък беше получен плазмидът pNPI103 чрез легиране на фрагмента в тъпо BamHI ендонуклеазния сайт на pNPI102. По този начин в плазмида pNPI103, 35S промотора и ipt гена, свързана с него, съществуват в стария BamHI рестриктазен ендонуклеазен сайт в Ас транспозона.

Желаният вектор беше получен чрез изрязване на транспозон Ас, съдържащ 35S промотора на вируса на мозайката по цветното зеле и ipt гена от плазмиза pNPI103 с рестрикционната ендонуклеаза Pstl, и вмъкване на този транспозон Ас във Ssel рестрикционния ендонуклеазен сайт на векторния плазмид рВ1121. Това беше означено като плазмид ρΝΡΙΙΟό.

Този палзмид ρΝΙ106 беше също така въведен във E.coli щам JM109 и той беше депозиран в съответствие със Будапещенския договор като E.coli JM109 (ρΝΡΙΙΟό) под депозит номер FERM ВР-5064.

Стратегията за конструиране на плазмида NPI106 схематично е показана на фигурите от 7 до 9. Рестриктазната ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта от него е показана на фиг. 10. На фигури 7 до 9 и 10 крайната област на Ас транспозона е показана чрез насрещни черни триъгълници, респ. На фиг. 10, Ас-Р е нативен промотор, присъстващ в Ас. Другите символи са същите като тези, показани на фиг.2 до 5.

Както се вижда от фиг. 10, този плазмид има ipt гена като секционен маркерен ген и NPTII гена и GUS (β-галактозидаза) гена като модел за желан ген в Т-ДНК областта, а именно в областта, която трябва да бъде интегрирана в хромозомата на растението. По-нататък ipt генът е представен като вмъкнат в транспозона Ас. Тъй като клетката, имаща GUS гена, метаболи- 5 зира специален субстрат, за да произвежда син пигмент, експресията на гена може да бъде идентифицирана чрез откриване на този пигмент. Така GUS генът често се използва за анализ на експресията на гена в растението.

II. Въвеждане на pNP106 във тютюн и анализ на тютюна, в който генът е въведен.

А. Въвеждане на ρΝΡΙΙΟό във тютюн и тест за експресия на въведения ген

По същия начин като в етапи II и III от пример I, ρΝΡΙΙΟό беше въведен в A.tumefaciens щат LBA4404 и листни дискове от тютюна бяха заразени с този A.tumefaciens. Така заразеният тютюнев лист беше култивиран в MS агарова културална среда без хормон, свдържаща 50 mg/1 ацетосирингон и след това в MS агарова среда без хормон, към която беше добавен 500 mg/1 карбеницилин. След 2 месеца от кулитвирането бяха отделени 63 ESP линии.

Резултатите от теста за експресия на

Тези ESP линии бяха трансплантирани в кулутарлна среда със същия състав (МС агарова среда без хормон, съдържаща 500 mg/Ι карбеницилин). Един месец по-късно сред филизите, които бяха израснали от ESPs, бяха селекционирани визуално 9 филиза (онези, които бяха произлезли от ESP, по-нататък се наричат просто “филизи”), които бяха пораснали около два или повече пъти в сравнение с другите филизи, в които не се наблюдаваше растеж на странични филизи и в които влиянието на ipt гена изглеждаше, че е намалено. Листата от тези филизи са продължени на същия тест за устойчивост към канамицин, който е провеждан в етап IV-А от пример 1 и на тест за експресия на GUS гена (тест за GUS активност), базиращ се на метода на Jefferson et al. Филизите са получени, след като листата бяха отрязани и трансплантирани в MS агарова културална среда без хормон и култивирани. Един месец по-късно се наблюдаваха формите, за да се открие способността за формиране на филизи от ESPs, като по този начин се показваше експресията на ipt гена.

Резултатите са показани в таблица 1.

Таблица 1. въведен в тютюн чрез вектор NPI106 ген,

	Филиз. No	Канамицин устойчиви	GUS активност	Морфология 1 месец след култивиране
Пример 2	1	+	+	ESP
	2	+	+	ESP
	3	+	-	ESP
	4	+	+	ESP
	5	+	-	ESP
	6	+	-	ESP
	7	+	+	ESP
	8	+	+	нормална
	9	+	+	ESP
Сравнителен	10	-	-	нормална
пример 2	11	-	-	нормална
	12	-	-	нормална

Забележки: 1. В колонката канамицинустойчиви + означава “устойчив”, а - означава “неустойчив”.

1. В колонката GUS активност + означава “активен, а - означава “неактивен”.

2. “Нормална” се отнася до индивид, който причинява доминантен растеж на апикален филиз и формиране на корени.

Както се вижда от таблица 1, въпреки че листът от филиз No.8 има устойчивост към канамицин и GUS активност, ESP не се формира, дори ако филизът се култивира за един месец. Това най-вероятно е така, защото ipt генът, който причинява образуването на ESP, присъства във вмъкната форма в Ас транспозона от плазмид ρΝΡΙΙΟό. Така че ipt генът, който е въведен в хромозомата на тютюна чрез заразяване със A. tumefaciens, съдържащ този плазмид в тъканта и експресиран във началния етап на тьканното култивиране веднага след заразяването се премахва заедно с Ас чрез действието на Ас по време на следващото култивиране. Междувременно, в същия вектор, NPTII генът и GUS генът са вмъкнати в сайт, където те не се държат като едно цяло с Ас, така че тези гени все още остават в растителната хромозома и се експресират.

Въпреки че в таблица 1 във филизи No 3, 5 и 6 се наблюдава устойчивост към канамицин и способност за формиране на ESP, само GUS активността е отрицателна. Това означава, че в тези филризи само GUS генът от гените, въведени чрез използване на pNI106 не се експресира. Счита че, че това се дължи на неправилна интеграция, която се среща, когато тези гени с интегрирани в растителната хромозома. Така че, когато генът е въведен чрез A.tumefaciens, съдържащ плазмид, който има структурата на ρΝΡΙ1Ο6 или други подобни, Т-ДНК областта, а именно цялата вътрешна област между RB сайта и LB сайта трябва да бъде нормално интегриран в растителна хромозома. Обаче тази област понякога не е напълно интегрирана, а се къса и дефектният участък, в който липсва част от LB краищата, се вмъква. В Т-ДНК област на pNPI106, GUS генът присъства в най-близка позиция до LB сайта. Съответно, счита се, че поради неправилна интеграция при въвеждането на гена, GUS генът е интегриран в хромозомата в условие, при което GUS генът е скъсан на парченца и неговата собствена функция е загубена, или че GUS генът въобще не е вмъкнат там, така че, GUS генът не е експресиран в тези филизи и в тях не се наблюдава активност.

Снимките на филизи No. 2 и No 8 1 месец след култивирането са показани на фиг. 11 и 12.

По отношение на листа, израснал от филиз No 8 и подложен на тест за устойчивост към канамицин тук, култивирането беше по-нататък продължено след теста. Пет допълнителни филизи бяха получени от този лист и всички те не бяха ESP.

Б. PSR анализ

С филизи No 1 до 9 в таблица 1, след като беше наблюдавана способност за образуване на ESP, беше проведен PCR анализ по същия начин, както в етап W-Б от пример 1, за по-нататъшно изследване присъствието на ipt гена в хромозомата, при който анализ двойката праймери, които бяха подбрани да се свързват с NPTII гена и GUS гена, съответно, бяха използвани като допълнение към праймерите, използвани в етап IV-Б на пример 1. В случай, че тези праймери бяха използвани, когато Ас и ipt гена вмъкнати в тях (Ac-ipt генен комплекс) се изрязват от Т-ДНК областта на pNPI106, ДНК фрагмент с приблизително 3 kb дължина се амплифицира чрез PCR. Съответно изрязването на Ac-ipt генния комплекс от ДНК може да бъде открито чрез използването на тази амплификация като индекс.

Резултатите от PCR анализа на филиз No.8 са показани на фиг.13, в която стойностите, означени от лявата страна, са същите както тези, означени на фиг.6.

Както е очевидно от резултатите, в хромозомната ДНК, екстрахирана от филиз № 8, се наблюдава амплификация на ДНК, фрагмент с дължина, приблизително 3 kb, което доказва изрязването на Ac-ipt генния комплекс, докато амплификация на ДНК фрагмента с приблизителна дължина от 800 Ьр, което доказва, че присъствието на ipt гена не се наблюдава. Това означава, че ipt генът е изрязан от хромозомната ДНК на този филиз заедно с Ас и изчезва.

От друга страна, по отношение на филизи No. 1 до 7 и 9, амплификация на ДНК фрагмент с приблизителна дължина 3 kb не се откриваше в нито един от примерите на хромозомната ДНК, докато амплификация на ДНК фрагмент с дължина около 800 Ьр се откриваше във всички примери на хромозомната ДНК. Съответно, счита се че в тези филизи ipt генът все още присъства в хромозомната ДНК заедно с Ас.

Сравнителен пример 2.

При култивирането на лист, заразен с A.tumefaciens в етап П-А на примера 2, бяха отделени три редиференцирани HeESPs заедно с ESPs, и подложени на тест за устойчивост към канамицин, тест за GUS активност, визуално наблюдение 1 месец след култивирането и PCR анализ по същия начин, както в II от пример 2.

Резултатите са показани в таблица 1. Филизите, получени от тези HeESP, не притежаваха каквато и да е устойчивост към канамицин, GUS активност и способност да формират ESP. Освен това, не се откриваше амплификация на ДНК фрагменти с приблизителна дължина 800 Ьр и 3 kb чрез PCR анализа.

Пример 3. Освен това, беше продължено култивирането на 63 ESP линии, отделени в пример 2 върху MS върху агарова кулутрална среда без хормон. Около два месеца по-късно след отделянето, общо 7 филиза No 13-1 до 13-3 и 14-1 до 14-4, които бяха нормални филизи, способни да бъдат визуално идентифицирани т.е. показваха апикална доминантност, бяха получени от 2 ESP линии. Тези филизи бяха отделени за трансплантиране в клтурална среда, имаща по-горе споменатия състав, след това те нормално прорастваха и даваха корени. От тях индивидите, получени от филизи No. 13-1 и 14-1, бяха подложени на PCR анализ по същия начин, както в етап И-Б от пример 2. Като резултат, не беше наблюдавана амплификация на ДНК фрагмент с приблизителна дължина около 800 Ьр нито във филиз No. 13-1, нито в 14-1. Междувременно беше наблюдавана амплификация на ДНК фрагмент с приблизителна дължина 3 kb и в двата филиза. Така беше определено, че ipt генът е бил изрязан от хромозомната ДНК на тези индивиди заедно с Ас и е изчезнал. Резултатите са показани на фиг. 14, в която стойностите, означени от лявата страна, са същите, като тези, означени на фиг.6. Освен това, експресията на GUS гена беше открита във всички индивиди, получени от седемте филиза.

Фиг. 15 показва състоянието на нормален филиз, диферензиран от ESP.

Пример 4. Листът, получен от филиз, който е показан като филиз No. 7 в таблица 1 сред деветте филиза, селекционирани в пример 2, беше култивиран върху MS агарова културална среда без хормон за около един месец. Един нормален филиз беше визуално селекциониран и отделен от шестте допълнителни филиза, които бяха редиференцирани от култивирания лист. Този нормален филиз беше трансплантиран в кулутрална среда с посочения състав, след което беше получен нормален индивид с корени. Понататък, този индивид беше подложен на PSR анализ по същия начин, както в етап П-Б от пример 2 и въз основа на изчезването на ДНК фрагмент с приблизителна дължина 800 Ьр и амплификацията на ДНК фрагмент с приблизителна дължина kb беше определено, че ipt генът е бил изрязан от хромозомната ДНК заедно с Ас и е изчезнал. Резултатите са показани на фиг. 16, в която стойностите, означени от лявата страна, са същите, като тези показани на фиг.6. Освен това, същите индивиди беше открита също така експресия на GUS гена.

Пример 5.

1. Изолиране на сайтспецифична рекомбинантна система (pSRl система) от дрожди.

Дрождите (Zygosaccharomyces rouxii, получени от Института за ферментация) бяха посяти в 5 ml YPAD течна кулутрална среда (съдържаща в g/1: 10 дрождев екстракт, 20 полипептон, 0.4 аденин 20 гликоза) и бяха култивирани при 30°С за 24 h. Клетъчният разтвор беше центрофугиран при 6,900 х g за 3 min с 20°С, за да се съберат клетките (по-нататък клетките бяха събирани при същите тези условия). Получените клетки бяха суспендирани в 2ml разтвор, съдържащ 0.2 М Tris-HCI (pH 8.0) и 5 об./об меркаптоетанол. Клетъчната суспензия се оставяше да стои при 25°С за 30 min, като от време на време се разбъркваше внимателно и след това клетките се събираха. По-нататък събраните клетки буха суспендирани в 1 ml разтвор (pH 6.8), съдържащ 2.5 mg/ml зимолиаза-20 Т, получен от Seikagaku corporation, 10 т./об.сорбитол и 5 т./об.% КРО₄. Суспензията се оставяше да стои при 30°С за 90 min и се рецентрофугираше, за да се съберат отново клетките. Събраните клетки бяха ресуспендирани в 1 ml разтвор, съдържащ 0.2 М NaCl, 0.1 М EDTA, 5 т./об.% SDS, 50 mM Tris-HCI (pH 8.5) и към него беше добавена протеиназа К 20 mg/ml. Смесеният разтвор се оставяше за един час при 60°С, след това се темперираше до стайна температура и се екстрахираше със смес от фенол и хлороформ, а след това с хлороформ, за да се пречисти. Към така получената супернатанта се добавяше равен обем от изопропанол, за да преципитира хромозомолната ДНК и плазмидът pSRl. Сместа се центрофугираше при 6,900 х g за 10 min при 4°С, за да се събере ДНК, която се измиваше с 70 об/об.% етанол, изсушаваше се под вакуум и се разтваряше в 100 1 ТЕ.

Като се използва така екстрахираната ДНК, сместа от хромозомална ДНК и плазмида pSRl, като матрица, само сайт специфичната рекомбинантна система, която присъстваше в плазмида pSRl, по-нататък означена като “pSRl” система, беше амплифицирана чрез PCR метода. pSRl системата се състои от R ген, който е ген за рекомбиназа и рекомбинантна последователност Rs, като техните ДНК последователности са вече определени (H.Araki et al., J. Mol Biol., vol 182, p. 191, 1985). В настоящото изобретение, за да се амплифицира R генът, праймер, в който Xbal сайт за рестрикционна ендонуклеаза беше добавен към 5’-мястото от 22 бази, а именно, 5,596-та - 5,617-та бази в последователността на плазмида pSRl (5’-CCTCTAGAATGCAATTGACCAAGGATACTG-3’) и праймер, в който Sacl сайт за рестрикционна ендонуклеаза беше добавен към 5’ сайт от 33 бази, а именно, 4,126-та - 4,147-та бази в последователността на плазмида pSRl (5’-CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3’) бяха синтезирани за използване. От друга страна, за да се амплифицира Rs, бяха синтезирани две двойки праймери, всеки съдържащ 30 бази (общо 4 типа). Така, една двойка беше съставена от праймер, в който три от 287та - 316-та бази от последователността на плазмида pSRl бяха заменени и беше въведено Ssel сайт за рестрикционна ендонуклеаза (5’-AGGATTGAGCTACTGGACGGGAATCCTGCA-3’) и праймер, в който четири от 690-та - 719-та бази от последователността на плазмиза pSRl бяха заменени и бяха въведени Hindlll сайт за рестрикционна ендонуклеаза и Hhol сайт за рестрикционна ендонуклеаза (5’-CAACTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3’). Rs, който трябваше да бъде амплифициран с този набор от праймери, беше наречен “Rsl”. Другата двойка беше съставена от праймер, в който три от 287-та -316-та бази на последователността от плазмид pSRl бяха заменени и бяха въведени Xhol сайт за рестрикционна ендонуклеаза и EcoRI сайт за рестрикционна ендонуклеаза (5’AGGATTGAGCTACTCGAGGGGAATTCTGGA3’) и парймер, в който пет от 688-та - 717-та бази от последователността на плазмида pSRl бяха заменени и беше въведено SSel сайт за рестрикционна ендонуклеаза (5’ ACTGGACCAATCCCTGCAGGTCGTAGTCAA-3’). RS, който трябваше да бъде амплифициран с този набор от праймери, беше наречен “Rs2”.

За да се амплифицира R генът и Rs’s, 1 μΐ от екстрахирания ДНК разтвор се добавяше на всеки 50 μΐ от смесения разтвор, използван в етап IV-Б на пример 1, съдържащ 0.2 μΜ съответно от всеки праймер. Тристепенен цикъл на загряване, а именно при 95°С за 30 s, при 55°С за 30 s и при 72°С за 1.5 min беше повторен със сместа общо 30 пъти. Така получената реакционна смес беше анализирана чрез агарозна гел електрофореза, за да се потвърди амплификциране на R гена и на Rs’s.

II. Конструиране на вектор

Rsl, амплифициран чрез PCR метода, беше разградена с рестрикционните ендонуклеази PstI и Xhol и беше получен празмидът pNPI126 чрез вмъкване на Rsl в PstI-Xhol сайт за рестрикционна ендонуклеаза на pSLl 180, получен от Pharmacia Biotech Co).

Впоследствие, за да се елиминира EcoRI сайт за рестрикционна ендонуклеаза и Hindlll сайт за рестрикционна ендонуклеаза на pHSG398, беше повторено последователно разграждане с тези рестрикционни ендонуклеази, променящи разградените краища в тъпи с Т4 полимераза I (голяма субединица) и лигиране на тъпите краища. По този начин беше получен плазмидът NPI121, в който бяха отстранени тези сайтове за рестрикционна ендонуклеаза. Беше получен плазмидът pNPI127 чрез разграждане на амплифицирания чрез PCR метода Rs2 с рестрикционните ендонуклеази Xhol и PstI и вмъкване на Rs2 в SaLL-PstI сайтове за рестрикционна ендонуклеаза на плазмида pNPI121.

Плазмидът pNPI128 беше получен чрез изрязване на Rsl от pNPI126 с рестрикционните ендонуклеази Smal и Spel и вмъкване на този фрагмент в Smal-Xbal сайт за рестрикционна ендонуклеаза на pNPI127.

R генът, амплифициран чрез PCR метода, беше разграден с рестрикционните ендонуклеази Xbal и Sacl и вмъкнат в Xbal-Sacl сайтове за рестрикционна ендонукелаза на pHSG398. Така полученият плазмид беше означен като PNPI124.

След това, рВ1221, получен от Clontech Co., беше разграден с рестрикционната ендонуклеаза PstI. Разградените краища бяха променени в тъпи краища и след това лигирани по описания по-горе начин. Така беше получен плазмидът pNPIl 11, в който са отстранени Ssel и PstI сайтове за рестрикционна ендонуклеаза. След това, R генът, изрязан от pNI124 с рестрикционните ендонуклеази Xbal и Sacl беше вмъкнат в Xbal-Sacl сайтове за рестрикционна ендонуклеаза на pNPIlll, измествайки GUS гена, за да се получи плазмидът pNPIl 25. По-нататък, 35S промоторът на вируса на мозайката по цветното зеле, R генът, свързан с промотора, и сигналът за полиаденилиране на нопалин синтетазата бяха изрязани с рестрикционните ендонуклеази Hindlll и EcoRI и вмъкнати в HindlEcoRI сайтове за рестрикционна ендонуклеаза на pNPI128, за да се получи плазмидът pNPI129.

ρΝΡΙΙΟΙ беше разграден с рестрикционната ендонуклеаза Smal и 5’-фосфорилирания Hindlll линкер (получен от Takara Shuso

Co., Ltd.) беше вмъкнат в сайт за разграждане, за да се получи плазмидът pNPI122. Така, този pNPI122 е плазмид, в който Smal сайт за рестрикционна ендонуклеаза на ρΝΡΙΙΟΙ беше заменен с Hindlll сайт за рестрикционна ендонуклеаза. По-нататък pNPI122 беше разграден с рестрикционната ендонуклеаза PstI и разградените краища бяха променени в тъпи краища и лигирани, за да се получи плазмидът pNI123 с отстранени Ssel и PstI сайтове за рестрикционна ендонуклеаза. От този плазмид pNPI 123, 35S промоторът на виурса на мозайката на цветното зеле и ipt генът, свързан с промотора, бяха изрязани с рестрикционната ендонуклеаза Hindlll и вмъкнати в Hindlll сайта за рестрикционна ендонуклеаза на pNPI 129, за да се получи плазмидът pNOI130.

Желаният вектор беше получен чрез изрязване на фрагмент, съдържащ ipt гена и R гена, 35S промоторите на вируса на мозайката по цветното зеле, свързани с тях, респ. и Rs’s, присъстващи в двата край на тези гени с рестрикционната ендонуклеаза PstI, и вмъкване на този фрагмент в Ssel сайта за рестрикционна ендонуклеаза на pBI 121. Така полученият плазмид беше означен като pNPI 132.

Този плазмид ρΝΡΠ32 -беше също така въведен в E.coli щам JM109 и беше депозиран в съответствие с Будапещенския договор като E.coli JM109 (pNPI132) под депозит. No.FERM ВР-5065.

Стратегията за конструиране на плазмида pNPI 132 схематично е показана на фиг. 17-19. Рестрикционната ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта от него е показана на фиг.20. Във фиг. 17 до 19 и 20 защрихованите триъгълници показват рекомбинантната последователност Rs, произлязла от плазмида pSRl от дрожди, и посоката на нейната последователност. Другите символи са същите като тези, показани на фиг.2 до 5.

Както е показано на фиг.20, плазмидът pNPI 132, както и плазмидът pNPI 106, има ipt ген като маркерен ген и NPTII ген и GUS ген като модели за желан ген в Т-ДНК областта. Обаче, в този случай областта между двете рекомбинантни последователности Rs’s на pSRI системата се държат като подвижен ДНК елемент. Следователно ipt генът е вмъкнат така, че той се придържа от двете еднакво насочени рекомбинантни последователности.

III. ВМЪКВАНЕ НА PNPI132 В ТЮТЮН И АНАЛИЗ НА ТЮТЮНА, В КОЙТО Е ВЪВЕДЕН ГЕНЪТ

По същия начин, както в етапи II и III от пример 1, плазмидът pNPI 132 беше въведен в A. tumefaciens щам LBA 4404 и листните дискове от тютюна (Nicotiana tabacum cv. SRI) бяха заразени с тази A. tumefaciens. След това заразените листа бяха култивирани в MS агарова културална среда без хормон, съдържаща 50 mg/l ацетосирингон и след това в MS агарова културална среда без хормон, съдържаща 500 mg/l карбеницилин.

Един месец по-късно култивираните листа бяха трансплантирани в културална среда със същия състав и култивирането беше продължено по-нататък за един месец. След това бяха изолирани 48 ESP линии.

Тези ESP линии бяха трансплантирани отново в културална среда със същия състав и култивирането беше продължено по-нататък. Около един месец по-късно, а именно, около три месеца след заразяването с A. tumefaciens, филизите, които визуално имаха нормална морфология, бяха поколения на 7 от 48 ESP линии. Тези филизи бяха изолирани и трансплантирани в културална среда със същия състав и от тях след това можеха да се получат 10 нормални индивида.

Тези индивиди бяха подложени на PCR анализ по същия начин, както в етап П-Б от пример 2, при условие, че бяха използвани двойка праймери за откриване на GUS гена като допълнение към праймерите, използвани в етап П-Б от пример 2. При провеждане на PCR, използвайки тези праймери беше амплифициран ДНК фрагмент със приблизителна дължина 800 Ьр, когато присъстваше ipt генът; ДНК фрагмент с приблизителна дължина 3 kb беше амплифициран, когато ipt генът беше изрязан от Т-ДНК областта на плазмида pNPI 132 чрез изрязване на частта, придържана от Rs’s (тези резултати са същите, както при анализа на етап П-Б в пример 2); и ДНК фрагмент около 1,7 kb беше амплифициран, когато присъстваше GUS генът. Резултатите са показани на фиг. 21 - 23 и таблица 2. На фиг. 21-23 стойностите, означени от лявата страна, са същите, като показаните на фиг. 6.

Таблица 2.

Резултати от анализа на трансгенен ген в

тютюн	, в който генът е въведен с PNPI132	вектор
ESP	No. на	ге ζρί		reGUS
	растение	800 Ьр	ЗкЬ	1.7 kb
15	1		+	+
	2		+	+
16	1			4-
17	1		+	+
18	1		+	+
19	1			+
	2		+	+
20	1		+	+
	2		+	+
21	1		+	+

Забележки: “+” означава, че съответният ДНК фрагмент е амплифициран, означава, че той не е амплифициран.

Както се вижда от таблица 2, присъствието на ipt гена, който беше маркерен ген, не се откриваше в нито една от хромозомите на инди | видите, които бяха селекционирани просто чрез визуално наблюдение на тяхната морфология, но в замяна на това беше открита амплификация на ДНК фрагмент, което означава, че ipt генът е изрязан. Междувременно беше открито присъствието на GUS гена, използван като желан ген във всички индивиди.

От друга страна, резистентността към канамицин беше изследвана чрез използване на връхни пъпки от индивиди, които бяха получени от HeESPs, диференцирани почти едновременно с 48 ESP линии и показали нормална елонгация и вкореняване, като се използва MS агарова среда без хормон, съдържаща 200 mg/l канамицин. Като резултат беше намерено, че два от 16-те индивида са резистентни към канамицина.

Впоследствие тези устойчиви към канамицина индивиди бяха изследвани по-нататък чрез PCR анализ заедно с 3 индивида, селекционирани от 14 канамицин чувствителни индивида, по същия начин, като този използван за индивидите, получени от ESPs. Фиг. 24 показва резултатите, като стойностите, означени от лявата страна, са същите, като, показаните на фиг. 6.

Както ясно личи от фиг. 24, всеки от двата канамицинустойчиви индивида показва амплифициране на ДНК фрагмент, което е индикация за изрязване на областта, съдържаща ipt гена и придържана от Rs’s, и за присъствието на GUS гена. Така беше доказано, че гените, произхождащи от pNPI132, са били интегрирани в тези хромозоми. Обратно, такова амплифициране не се наблюдаваше в трите чувствителни към канамацин индивида. По-нататък, който и да е от тези индивиди (а именно, нито устойчивите към канамицин индивиди, нито чувствителните към канамицин индивиди) не показваха амплификация на ДНК фрагмент, означаващо присъствието на ipt гена.

Счита се, че тези устойчиви към канамицин индивиди, получени от щам, загубил способността да формира ESPs, така както и чувствителните към канамицин индивиди, са възникнали от клетки, в хромозомите на които pNPI132 не е бил въведен чрез заразяване с A. tumefaciens. Въз основа на това предположение не е възможно гените, произлезли от този вектор, да се съдържат в хромозомите. Още повече, че няма причина индивидите, в които липсва ipt генът, но които съдържат NPTII гена (както е показано от факта, че тези индивиди бяха резистентни към канамицина) и GUS гена, всеки представен в пълна форма в хромозомите, да се появяват с такава честота, че да се счита, че всички тези гени са произлезли от същия вектор.

А именно, уместно е да заключим, че в тези индивиди, устойчиви към канамицин, pNPI132 е бил веднъж въведен в хромозомите. Това означава, че е изчислено, че Т-ДНК областта от pNPI132 е била въведена веднъж в хромозомата при заразяване с A. tumefaciens, но изключително ефективната функция на pSRl системата, използвана за този вектор, индуцира изрязване на ipt гена, преди да се формират ESPs, след заразяване с A. tumefaciens. Като резултат, NPTII генът и GUS генът остават изключително в хромозомата. Фактът, че устойчивите към канамицин индивиди показват при PCR анализа изрязване на областта, съдържаща ipt гена и придържана от Rs’s, също подкрепя тази оценка.

Примери 6. I. Конструиране на вектор. Rol гените, S. Kiyokawa, Plant Physiol., vol. 104, p. 801, 1994, съдържащи rolA, rolB и rolC, и c общ размер 7,6 kb, които са били вмъкнати в EcoRI сайт за рестрикционна ендонуклеаза на pBluescriptll SK + (направен от Toyobo Co., Ltd), бяха изрязани с рестрикционната ендонуклеаза EcoRI. Този фрагмент беше вмъкнат в EcoRI сайт за рестрикционна ендонуклеаза на pNPI 129, за да се получи плазмидът pNPI700.

От този плазмид pNPI700, rol гените, 35S промоторът на вируса на мозайката по цветното зеле, R генът, свързан с промотора, и Rs’s, представени в двата края на тези гени, бяха срязани с рестрикционната ендонуклеаза Ssel и вмъкнати в Ssel сайта за рестрикционна ендонуклеаза на рВ²121, за да се получи желаният плазмид PNPI702.

Този плазмид pNPI702 беше също така въведен в E.coli, щам JM109, и беше депозиран според Будапещенския договор като E.coli JM109 (pNPI702) под депозит, No. FERM ВР-5066.

Стратегията за конструиране на плазмида pNPI702 схематично е показана на фиг. 25. Рестрикционната ендонуклеазна карта на Т-ДНК областта от него е показана на фиг. 26. Символите на фиг. 25 и 26 са същите, като тези на фиг. 2 до 5.

Както се вижда от фиг. 26, плазмидът pNPI702 е сходен с ρΝΡΙ 132, но само маркерният ген беше променен от ipt ген на rol гени. Rol гени, използвани за този вектор, присъстват в Т-ДНК от A. rhizogenes в природата. Известно е, че когато rol гените се въведат в растителни клетки, се образуват корени с власинки в растителната тъкан и че растението, регенерирано от този корен с власинки, показва морфологична анормалност, такава като джуджеизъм или сходни.

II. Въвеждане на pNPI702 в тютюн и анализ на тютюна, в който е въведен генът.

По същия начин, както в етапи II и III от пример 1, плазмидът pNPI702 беше въведен в A. tumefaciens, щам LBA4404 и листни дискове от тютюн бяха заразени с тази A. tumefaciens.

Така заразеният тютюнев листен диск беше култивиран в MS агарова културална среда без хормон, съдържаща 50 mg/ί ацетосирингон на тъмно за три дни, а след това в MS агарова културална среда без хормон, към която беше добавен 400 mg/Ι тикарцилин. Около 15 дни по-късно след началото на култивирането се наблюдаваше диференциране на корени с власинки. Корените с власинки бяха отделени един след друг, положени върху културална среда, която индуцира филиз (MS агарова културална среда, съдържаща 0,1 mg/Ι α-нафталеноцетна киселина, 2,0 mg/Ι бензиладенин и 400 mg/1 тикарцилин). След това, сред редиференцираните филизи бяха визуално селеционирани 18 филиза, които се считаха, че имат нормална морфология и те бяха подложени на PCR анализ по същия начин, както в етап П-Б от пример 2, като се използваха праймери за откриване на изрязването на областта, съдържаща rol гените и придържана от Rs’s чрез амплификация на ДНК фрагмент с приблизителна дължина 3 kb (като същите праймери, използвани в примери 2 до 5 и сравнителен пример 2) и праймери за откриване присъствието на rol гените чрез амплификацията на ДНК фрагмент с дължина, приблизително 1,1 kb. Като резултат, беше потвърдено, че областта, съдържаща rol гените и придържана от Rs’s, беше изрязана от хромозомите на 9 филиза.

Пример 7. Използвайки вектора ρΝΡΙ 106, конструиран в горния пример 2, хибридно растение трепетлика (Populus Sieboldii х Populus grandidentata; дървесно растение) беше подложено на генно въвеждане.

Стеблото на хибридната трепетлика, линия Y 63, събрано в експерименталната гора на Akita Jujo Chemicals Co., Ltd, израснало в стерилна колба, беше нарязано на срезове с дължина 5 mm. След това, то беше вертикално нарязано на 2 парченца, за да се използват като проба, и пробата беше заразена с A. tumefaciens, щам LBA4404, в който е въведен pNPI106, по същия начин, както в етапа от пример 1. След заразяването срезът от стеблото беше поставен върху модифицирана MS агарова среда без хормон, съдържаща 2 т./об. % захароза и 0,8 т./об. % агар, към която беше добавен 40 mg/Ι ацетосирингон и култивиран за 3 дни в нея. Впоследствие той беше трансплантиран в същата среда, но съдържаща 500 mg карбеницилин вместо ацетосирингон и по-нататък култивиран в нея. Използваната тук модифицирана MS културална среда е приготвена чрез промяна на концентрацията на амонячния азот и нитратния азот на обикновената MS културална среда, респ. до 10 тМ и 30 тМ.

След около 2 месеца допълнителните пъпки, израснали от този срез, бяха отделени и понататък култивирани за 2 месеца. Така бяха получени 6 ESP линии. Тези линии бяха понататък субкултивирани и около 4 месеца след това, т.е. около 8 месеца след заразяването с A. tumefaciens, бяха наблюдавани за първи път морфологично нормални филизи, израснали от ESPs. Тогава, тези филизи бяха трансплантирани в 2/3 разредена MS gelam смола среда, съдържаща 2 т./об. % захароза и 0,3 т./об. % gelam смола, към която беше добавен 0,05 mg/Ι ²ВА (индолилмаслена киселина) и култивирани в нея. Така бяха получени 7 нормални индивида с растящи корени, общо от 2 ESP линии за 10 месеца след заразяването с A. tumefaciens.

Тези индивиди бяха подложени на PCR анализ по същия начин, както в етап III от пример 5. Като резултат ipt генът не беше открит в нито един от тях. От друга страна, сред тях в 2 индивида беше открито присъствието на GUS гена. Така беше потвърдено, че векторът от настоящото изобретение би могъл да работи ефективно също и в дървесно растение.

Изненадващо в останалите 5 нормални индивида, беше открит само част от GUS гена. Изглежда, че в такива индивиди, когато транспозонът Ас, въведен чрез вектора ρΝΡΙΙΟό, се изреже от хромозомата заедно с ipt гена, GUS генът, който е локализиран близо до него, се въвлича в изрязването и така се накъсва.

фиг. 27 показва състоянието на нормален филиз, диференциран от ESP.

Пример 8. Нормалният индивид, получен чрез ESP, имащ гени, които са въведени там чрез pNPI132 в пример 5, беше по-нататък подложен за въвеждане на ген с използването на вектора от настоящото изобретение.

GUS генът от pNPIl 32 беше заместен от НРТ гена (хигромицин устойчив ген). Като се използва така полученият вектор (pNPI14O, фиг. 28), погоре споменатите индивиди бяха подложени на въвеждане на ген по същия начин, както в етапи II и III от пример I. Така бяха получени 10 ESP линии 40 дена след заразяването с A. tumefaciens, съдържащи този вектор. Тези ESP линии бяха отделени, трансплантирани в културална среда със същия състав (MS агарова културална среда без хормон, съдържаща 500 mg/l карбеницилин) и по-нататък култивирани в нея. Като резултат беше наблюдавано диференциране на филизи с визуално нормална морфология, в една от тези линии 20 дена по-късно, а именно, около 2 месеид след заразяването с A. tumefaciens.

Един от тези така диференцирани нормални филизи беше подложен на PCR анализ по същия начин, както в етапи IV-Б от пример 1. На фиг. 29 е показан резултатът. Трябва да се отбележи, че като допълнение към праймерите, използвани в етап IV-Б от пример 1, бяха използвани двойка праймери, предназначени да се свързват с NPTII гена и НРТ гена, съответно за откриване на изрязването на областта, съдържаща ipt гена и придържана от Rs’s от хромозомната ДНК, и друга двойка праймери за откриване присъствието на НРТ гена, открит чрез амплификация на ДНК фрагменти с дължина приблизително 4 kb и 1 kb, съответно. На фиг. 29 стойностите, означени от лявата страна, са същите, като показаните на фиг. 6.

Както ясно личи от фиг. 29, PCR анализът на хромозомалната ДНК, екстрахирана от филиза, показваше амплификация на ДНК фраг мент с приблизителна дължина 4 kb, което означава, че ipt генът е бил изрязан чрез изрязване на областта, придържана от RS’s, и амплификация на ДНК фргамнет с приблизителна дължина 1 kb, което означава присъствие на НРТ гена. От друга страна, амплификация на ДНК фрагмент с приблизителна дължина 800 Ьр, което означаваше присъствие на ipt гена, не беше открита в същата ДНК. Тези резултати допускат, че ipt генът, който е бил въведен веднъж в хрмозомната ДНК на този филиз, е бил изрязан от там чрез изрязване на областта, придържана от Rs’s, и по този начин е изчезнал, докато НРТ генът все още е запазен в ДНК. Това означава, че когато в един индивид са въведени желаните гени (т.е. NPTII гена и GUS гена) чрез pNPI 132, по-нататък може да бъде въведен нов желан ген (т.е. НРТ гена) чрез използване на вектор, в който конструкцията, свързана с този желан ген, е изключително променена (т.е. същият ipt ген, използван като маркерен ген) обикновено чрез повтаряне на култивирането, визуалната селекция и сепарирането. Освен това резултатите показваха, че напълно е възможно и могат да бъдат въведени трети, четвърти или повече желани гени, като се използва същият маркерен ген.

Както личи от по-горе описаните примери, получените ESP линии винаги са имали ipt гена в своите хромозоми, както е показано на фиг. 6. Освен това ESPs, които показваха значителна морфологична анормалност, която може да бъде визуално идентифицирана, без изключение показваха устойчивост към канамицина чрез експресията на NPTII гена, който беше използван като модел за желан ген и въведен заедно с ipt гена. Това доказва, че такъв MAI ген е напълно достъпен като маркерен ген за въвеждане на ген в растение и че векторът от настоящото изобретение, съдържащ този MAI ген като маркерен ген, е също така достъпен като вектор за въвеждане на ген в растение.

При въвеждане на ген в растение, като се използва векторът ρΝΡΙΙΟό, в който е бил интегриран ipt генът в транспозона Ас, беше получен филиз или друг подобен, който е загубил способността си да формира ESP, като резултат от изчезването на ipt гена, докато останалите характеристики, обезпечени от желания ген (NPTII гена и/или GUS гена) бяха получени от тъкан, която веднъж е образувала ESP в началния етап на култивирането, веднага след операцията за въвеждане на ген, както е показано в таблица 1 и фиг. 13, 14 и 16. Освен това морфологията на тази получена тъкан, т,е. филиз или друга подобна тъкан, която е загубила способността да формира ESP, може визуално лесно да бъде идентифицирана, както е показано на фиг. 15 и 27. По-нататък, когато тази тъкан беше селекционирана, сепарирана и култивирана, се получаваше развит индивид с корени, имащ нормална морфология. Освен това тъканите, които бяха редиференцирани от тъканта, получена от филиза, който е загубил способността да формира ESP, също показваха нормална морфология, без да имат способността да формират ESP. Това доказва, че такъв филиз или друг подобен е съставен от еднакви клетки.

Същите резултати бяха наблюдавани, когато такъв вектор, произлязъл от сайтспецифична рекомбинантна система, беше използван като подвижен ДНК елемент и когато rol гените бяха използвани като MAI ген. Това значи, че при въвеждане на ген в растение чрез използване на вектор, в който конструкцията, отнасяща се до транспозона, или транспозона и ipt гена от векторите, използвани в примери 1 до 4 и 7, беше заменена с тази, отнасяща се до посочената по-горе рекомбинантна система и/или rol гените, както е описано в примери 5 и 6, морфологично нормална тъкан и растение, в което MAI генът е изчезнал от неговата хромозома, докато се поддържаше желаният ген, бяха получени от тъканта, показваща анормална морфология веднага след въвеждането на гена (фиг. 21 - 23, таблица 2). Освен това, възможно е да се въведат многократно желани гени в същия индивид, като се повтарят етапите на генното въвеждане, култивиране и визуална селекция чрез използване на вектора, в който конструкцията, отнасяща се до желания ген, е изключително променена, докато същият ген, индуциращ морфологична анормалност, е използван като маркерен ген (пример 8, фиг. 29).

Съответно, когато е използван такъв вектор, в който МА² генът е използван като маркерен 5 ген и е инсертиран в такова място, че той се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент, само чрез провеждането на следващите етапи се получава тъкан, образувана от клетки, в които само желаният ген остава в хромозомата IQ или подобни и поддържа своята функция:

(1) култивиране на клетките веднага след операцията за въвеждане на гена и визуално селекциониране на морфологично анормална тъкан, която се появява по време на култивирането;

(2) по-нататъшно култивиране на тази морфологично анормална тъкан и визуално селекциониране на морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането. Освен това растение, образувано само от такива клетки, може също така да бъде получено от такава морфологично нормална тъкан.

Нещо повече, когато такъв вектор, получен от сайтспецифична рекомбинантна система, беше използван като подвижен ДНК елемент, тъй като изрязването от него ставаше бързо и с 25 доста висока честота, морфологично нормалната тъкан, появяваща се от морфологично анормалната тъкан, можеше също така да бъде бързо открита и поради това бяха получени много нормални индивиди от нея с добра ефективност. 30 Таблица 3 показва ефективността, при която беше получен нормален индивид от морфологично анормална тъкан, когато транспозон или такъв, възникнал от сайтспецифична рекомбинантна система, беше използван като подви35 жен ДНК елемент във вектора от настоящото изобретение.

Таблица 3.

Различие в ефективността на получените нормални индивиди в зависимост от типа на подвижния ДНК елемент

	Вектор	Подвижен ДНК елемент	Номер на ESP линиите	Номер на линии, в които нормалните индивиди регенерират
Пример 3	ρΝΡΙΙΟό	Ас	63	2
Пример 5	ΡΝΡ1132	(транспозон) областта, придържана от Rs’s на pSRl система (сайтспецифична рекомбинантна система)	48	(7 индивида) 7 (10 индивида)

Забележки:

1. ESP бяха отделени 2 месеца след култивирането.

2. Нормалният филиз може да бъде открит 4 месеца след култивиране в пример 3 и три месеца след култивиране в пример 5.

3. Всеки от посочените по-горе нормални ицдиввди съдържа GUS гена като модел за желан лен.

В примери 1 до 5, при условия на култивиране без хормон, тъканта, съдържаща трансгенните клетки, пролиферираше, диференцираше допълнителен филиз и регенерираше растението. Това най-вероятно се дължи на действието на ipt гена, който беше въведен в хромозомата на трансгенната клетка като маркерен ген. Така чрез експресията на този ген се получаваше свръхпродукция на растителния хормон в клетката. Ето защо растителният хормон, продуциран в клетката, съдържаща ipt гена, влияе не само върху това дали самата клетка ще диференцира тъканта като ESP или друга подобна, но също така върху тъканта, до известна степен прилежаща до клетката, където беше постигнато също такова състояние, причинено от изкуствено добавяне на растителен хормон към културалната среда.

Във вектора на настоящото изобретение MAI генът е използван като маркерен ген. Следователно, когато се провежда въвеждане на ген в растение, като се използва този вектор, тъканта, в която желаният ген е въведен, може да бъде селекционирана чрез култивиране на клетката, подложена на третиране за въвеждането на гена, в обикновена културална среда при обикновени условия за култивиране, без добавяне на каквото и да е химично вещество за селекциониране, и визуално идентифициране на получената морфологично анормална тъкан. Съответно, процедурата е опростена и активността на растителната клетка не намалява по време на селекцията.

Освен това такъв MAI ген е присъщ за растението или се въвежда в растението чрез заразяване с бактерии или други подобни в природата. Поради тази причина, дори ако MAI генът се експресира в растителната клетка, в която генът е въведен, нейната безопасност е значително висока, когато се поема в човешкото тяло.

Освен това, когато ipt генът се използва като MAI ген, тъканта, съдържаща трансгенната клетка, пролиферираше и диференцираше допълнителен филиз, поради действието на този ген, давайки по този начин възможност да се избегне необходимостта от добавяне на растителни хормони към културалната среда, които най-общо се считат като необходими за пролиферацията и диференциацията при култивирането на растителната клетка.

В допълнение в този вектор MAI генът, използван като маркерен ген, е вмъкнат в такава позиция, че той се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент, в който маркерният ген се премахва от ДНК, където този ген присъства и функционира, чрез изрязване на ДНК елемента при дадено съотношение, след като генът е въведен в растителната клетка и това води до загуба на неговата функция. Така само желаният ген присъства в такова място на вектора, че той не се държи като едно цяло с подвижния ДНК елемент, а остава в същата ДНК и запазва способността да експресира своята функция. Съответно в тази структура векторът причинява многократно въвеждане на ген в определено растение, просто чрез промяна на частта на желания ген, който трябва да бъде въведен, без да се променят структурите на маркерния ген. Така многократното въвеждане може да бъде провеждано за неограничен период от време.

При това в този случай загубата на функция на MAI гена като маркерен ген може визуално да се открие чрез морфологичната промяна на трансгенната тъкан, поради въвеждането на този ген. Следователно тъканта, образувана само от клетките, в хромозомите на които е останал единствено желаният ген и се поддържа неговата функция, може да бъде селекционирана лесно и сигурно. Като резултат многократното въвеждане на гена може да се провежда с висока ефективност и може да се получи трансгенно растение, образувано само от такива клетки, а именно индивид, свободен от влиянието на маркерния ген и напълно свободен от всякакви здравословни рискове вследствие продукта на маркерния ген, без да е необходим етап на кръстосване.

***3абележки***

Относно показанията, отнасящи се до депозирания микроорганизъм, изброени в заявката, както следва:

1) FERM ВР-5063 на страница 27, ред 25

2) FERM ВР-5О64 на страница 34, ред 27

3) FERM ВР-5065 на страница 46, ред 9

4) FERM ВР-5066 на страница 51, ред 6

Посочените четири микроорганизма със съответните номера за достъп бяха едновременно депозирани в следния депозитарен институт.

Име на депозитарния институт:

National Institute of Bioscience and HumanTechnology

Agency of Industrial Science and Technology (Osamu Suzuki, Dr., DIRECTOR GENERAL·) Адрес на депозитарния институт:

1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken 305 JAPAN

Дата на депозиране: 5 април 1995 г.

Claims (32)

1. Патентни претенции

   1. Вектор за въвеждане на желан ген в растение, който включва посочения желан ген и поне един ген, индуциращ морфологична анормалност като селекционен маркерен ген, в който посоченият ген, индуциращ морфологична анормалност, е цитокинин синтетазен ген.
2. 2. Вектор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че посоченият цитокинин синтетазен ген е ipt, изопентенилтрансферазен ген, който присъства в Т-ДНК на Agrobacterium tumefaciens.
3. 3. Вектор за въвеждане на желан ген в растителна клетка заедно със селекционен маркерен ген, в който споменатият селекционен маркерен ген експресира веднъж своята функция в растителната клетка, след това той се отстранява от ДНК, където той съществува според поведението на подвижния ДНК елемент, и функцията на посочения селекционен маркерен ген изчезва, а експресията на посочения селекционен маркерен ген и изчезването на неговата функция се откриват чрез морфологична промяна на тъканта, получена от растителната клетка, в която посоченият селекционен маркерен ген е въведен.
4. 4. Вектор за въвеждане на желан ген в растение, който включва посочения желан ген, поне един ген, индуциращ морфологична анормалност, като селекционен маркерен ген и подвижен ДНК елемент, в който посоченият ген, индуциращ морфологична анормалност, е разположен така, че се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент или посоченият желан ген е разположен така, че не се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент.
5. 5. Вектор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият ген, индуциращ морфологична анормалност, присъства в посо чения подвижен ДНК елемент.
6. 6. Вектор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият подвижен ДНК елемент е транспозон.
7. 7. Вектор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият подвижен ДНК елемент е получен от сайтспецифична рекомбинантна система.
8. 8. Вектор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият ген, индуциращ морфологична анормалност, е получен от микроорганизъм от рода Agrobacterium.
9. 9. Вектор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият ген, индуциращ морфологична анормалност, е цитокинин синтетазен ген.
10. 10. Вектор съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че посоченият цитокинин синтетазен ген е ipt, изопентенилтрансферазен ген, който присъства в Т-ДНК на Agrobacterium tumefaciens.
11. 11. Вектор съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че посоченият ген, индуциращ морфологична анормалност, е поне един ген, селекциониран от rol гените.
12. 12. Вектор съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че посочените rol гени са rol гени, съдържащи rolA, rolB и rolC, които присъстват в Т-ДНК на Agrobacterium rhizogenes.
13. 13. Метод за получаване на трансгенно растение, свободно от влиянието на селекционния маркерен ген, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

    A) въвежда се вектор в растителна клетка, в която векторът включва желан ген, поне един ген, индуциращ морфологична анормалност, като селекционния маркерен ген, и подвижен ДНК елемент, в който генът, индуциращ морфологична анормалност, е разположен така, че се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент, или желаният ген е разположен така, че не се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент.

    Б) култивира се растителната клетка, получена в (А), открива се морфологично анормална растителна тъкан, която се появява по време на култивирането, и се селекционира морфологично анормална тъкан, и

    B) култивира се споменатата морфологично анормална тъкан, селекционирана в етап (Б), открива се морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането, и се селекционира посочената морфологично нор мална тъкан.
14. 14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че генът, индуциращ морфологична анормалност, присъства в посочения подвижен ДНК елемент.
15. 15. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че споменатият подвижен ДНК елемент е транспозон.
16. 16. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че подвижният ДНК елемент е получен от сайтспецифична рекомбинантна система.
17. 17. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че генът, индуциращ морфологична анормалност, е получен от микроорганизъм от рода Agrobacterium.
18. 18. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че генът, индуциращ морфологична анормалност, е цитокинин синтетазен ген.
19. 19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че цитокинин синтетазният ген е ipt, изопентенилтрансферазен ген, който присъства в Т-ДНК на Agrobacterium tumefaciens.
20. 20. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че генът, индуциращ морфологична анормалност, е поне един ген, селекциониран от rol гените.
21. 21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че споменатите rol гени са rol гени, съдържащи гените rolA, rolB и rolC, които присъстват в Т-ДНК на Agrobacterium rhizogenes.
22. 22. Метод за въвеждане поне на два желани гена в растение, характеризиращ се с това, че включва провеждането на следните етапи поне два пъти:

    (A) въвежда се вектор в растителна клетка, в която векторът включва желан ген и поне един ген, индуциращ морфологична анормалност, като селекционен маркерен ген и подвижен ДНК елемент, в който генът, индуциращ морфологична анормалност, е разположен така, че се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент или споменатият желан ген е разположен така, че не се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент.

    (Б) култивира се растителна клетка, получена в етап (А), открива се морфологично анормална растителна тъкан, която се появява по време на култивирането, и се селекционира морфологично анормална тъкан, и (B) култивира се споменатата морфо логично анормална тъкан, селекционирана в етап (Б), открива се морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането, и се селекционира споменатата морфологично нормална тъкан.
23. 23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че споменатият ген, индуциращ морфологична анормалност, присъства в споменатия подвижен ДНК елемент.
24. 24. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че подвижният ДНК елемент е транспозон.
25. 25. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че подвижният ДНК елемент е получен от сайтспецифична рекомбинантна система.
26. 26. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че споменатият ген, индуциращ морфологична анормалност, е получен от микроорганизъм от рода Agrobacterium.
27. 27. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че споменатият ген, индуциращ морфологична анормалност, е цитокинин синтетазен ген.
28. 28. Метод съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че споменатият цитокинин синтетазен ген е ipt, изопентенилтрансферазен ген, който присъства в Т-ДНК на Agrobacterium tumefaciens.
29. 29. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че споменатият ген, индуциращ морфологична анормалност, е поне един ген, селекциониран от rol гените.
30. 30. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че споменатите rol гени са rol гени, съдържащи rolA, rolB и rolC, които присъстват в Т-ДНК на Agrobacterium rhizogenes.
31. 31. Трансгенно растение, лишено от влиянието на селекционния маркерен ген, получено чрез метод, който включва следните етапи:

    А) въвежда се вектор в растителна клетка, в която векторът включва желан ген, поне един ген, индуциращ морфологична анормалност, като селекционен маркерен ген, и подвижен ДНК елемент, в който генът, индуциращ морфологична анормалност, е разположен така, че се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент, или споменатият желан ген е разположен така, че не се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент.

    Б) култивира се растителната клетка, по лучена в етап А), открива се морфологично анормална растителна тъкан, която се появява по време на култивирането, и се селекционира посочената морфологично анормална тъкан.

    В) култивира се морфологично анормалната тъкан, селекционирана в етап (Б), открива се морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането, и се селекционира посочената морфологично нормална тъкан,и

    Г) култивира се споменатата морфологично нормална тъкан за регенериране на растение.
32. 32. Растение, съдържащо два или повече желани гена, получено чрез метод, който включва следните етапи:

    А) въвеждане на вектор в растителна клетка, в която споменатият вектор включва желан ген, поне един ген, индуциращ морфологична анормалност, като селекционен маркерен ген и подвижен ДНК елемент, в който генът, индуциращ морфологична анормалност, е разполо жен така, че се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент, или желаният ген е разположен така, че не се отстранява заедно с подвижния ДНК елемент.

    5 Б) култивиране на растителната клетка, получена в етап (А), откриване на морфологично анормална растителна тъкан, която се появява по време на култивирането, и селекциониране на посочената морфологично анормална тъкан.

    10 В) култивиране на спомената морфологично анормална тъкан, селекционирана в етап (Б), откриване на морфологично нормална тъкан, която се появява по време на култивирането, и селекциониране на морфологично нормална тъ15 кан.

    Г) провеждане на етапи (А) до (В) поне един път и

    Д) култивиране на морфологично нормална тъкан за регенериране на растение.