MXPA97003440A

MXPA97003440A - Vector y metodos para introducir por lo menos dosgenes en una planta

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Publication number: MXPA97003440A
Application number: MXPA/A/1997/003440A
Authority: MX
Inventors: Ebinuma Hiroyasu; Sugita Koichi; Matsunaga Etsuko; Yamakado Mikiko
Original assignee: Nippon Paper Ind Co Ltd
Priority date: 1994-11-09
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 1998-11-09

Abstract

Un vector para introducir un gen deseado en una planta, la cual comprende el gen deseado y, por lo menos, un gen de inducción de anormalidad morfológica (IAM) como un gen marcador, o que comprende el gen deseado, por lo menos un gen de IAM y un elemento removible. Un método para producir una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador. Un método para introducir multitudinariamente genes deseados en una planta.

Description

VECTOR Y MÉTODOS PARA INTRODUCIR POR LO MENOS DOS GENES EN UNA PLANTA Campo Técnico La presente invención se refiere a un vector novedoso para introducir un gen deseado en una planta usando métodos de ingeniería genética para obtener una planta transgénica; un método para producir una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador seleccionable usando este vector; y un método para introducir, por lo menos, dos genes deseados en una planta usando este vector. Técnica Antecedente La transformación de microorganismos y células cultivadas usando ingeniería genética, se aplica actualmente a la producción de substancias fisiológicamente activas útiles como medicinas y, por lo tanto, contribuye en gran parte a la industria. En el campo de reproducción de plantas, la aplicación industrial de ingeniería se rezaga debido a que los ciclos de vida de plantas es mucho más largo que aquellos de microorganismos. Sin embargo, dado que esta tecnología permite que un gen deseado se introduzca directamente en plantas para ser reproducida, tiene las siguientes ventajas comparado con la reproducción clásica la cual requiere múltiples cruces. (a) Es posible introducir únicamente una característica para ser mejorada. (b) Es posible introducir características de especies diferentes a plantas (tales como microorganismos y similares). (c) Es posible acortar en gran parte el período de reproducción. Por lo tanto, han sido vigorosamente investigados los métodos de ingeniería genética para cultivo de plantas. La producción de plantas transgénicas requiere los siguientes tres pasos. (1) Introducir el gen deseado en la célula de la planta (incluyendo introducción de la misma en los cromosomas, núcleo y similares). (2) Seleccionar el tejido de plantas formado únicamente de células en las cuales se ha introducido el gen. (3) Regenerar una planta del tejido deseado de las plantas. Con el fin de seleccionar tejidos transgénicos en los cuales se ha introducido un gen deseado, ha sido conveniente la identificación visual del tejido en el cual se expresa el gen desead sin regenerar la planta nueva. Para lograr esto, el gen deseado normalmente se introduce en la célula de la planta junto con un gen marcador seleccionable del cual se puede detectar fácilmente la expresión en la etapa de cultivo de la célula. Es decir, la expresión del gen marcador seleccionable se usa como un índice de introducción del gen deseado. Ejemplos de genes marcadores seleccionables convencionales incluyen genes resistentes a antibióticos, tales como gen resistente a la canamicina (es decir, NPTII; gen de fosfotransferasa de neomicina), un gen resistente a la higromicina (es decir, HPT; gen de fosfotransferasa de higromicina), genes de sintetasa de aminoácidos, tales como un gen de sintetasa de nopalina (NOS), un gen de sintetasa de octopina (OCS), y un gen resistente a sulfonilurea (es decir, ALS; gen de sintetasa acetolactato) que imparte resistencia química agrícola. Sin embargo, la expresión de un gen marcador seleccionable puede ocasionar serios problemas cuando dicha planta transgénica se use para alimento. Es decir, es muy difícil asegurar que un producto de gen producido expresando un gen marcador seleccionable sea seguro para el cuerpo humano. Consecuentemente, si una planta transgénica que contiene un gen marcador seleccionable se va a vender como un alimento, se debe llevar a cabo una investigación detallada para determinar la influencia del gen marcador seleccionable en el cuerpo humano. Por ejemplo, el gen NPTII ha sido usado como un gen marcador seleccionable a nivel de laboratorio desde principios de los años 80. En 1994, el producto de ese gen se aceptó finalmente como un aditivo alimenticio por la U.S. Food and Drug Administration (FDA). Desde entonces, las plantas transgénicas que contienen el gen NPTII como un gen marcador seleccionable, se han usado para alimentos.

Sin embargo, algunos consumidores de productos que contienen el gen NPTII aún están ansiosos acerca del efecto de este gen. Además, los genes marcadores seleccionables que prácticamente se usan, son solo genes, tales como el gen NPTII, el cual contribuye a la destoxificación de una substancia inhibidora de crecimiento en células de plantas. Por lo tanto, para seleccionar tejido transgénico de plantas en el cual se ha introducido el gen deseado, el tejido se cultiva en un medio de cultivo que contiene la substancia inhibidora de crecimiento, y la expresión del gen del marcador seleccionable, a saber, la resistencia en el tejido a la substancia inhibidora de crecimiento se evalúa y se usa como un índice. Sin embargo, aún cuando un tejido tiene tal resistencia, el cultivo en presencia de una substancia inhibidora puede dar como resultado efectos laterales indeseables en las células de plantas, tales como una disminución en proliferación y rediferenciación del tejido transgénico. Además, la expresión de un gen marcador seleccionable en una célula de plantas después de la selección de tejido transgénico obstruye seriamente la reproducción de plantas por la introducción subsecuente de genes. Es decir, cuando se introduce otro gen en una planta transgénica que contiene un gen marcador seleccionable, la introducción del gen deberá monitorearse usando un gen marcador seleccionable diferente. Sin embargo, la efectividad de un gen marcador seleccionable varía con las especies de plantas. Por lo tanto, se requiere una prueba preliminar para establecer las condiciones para cada gen marcador seleccionable (por ejemplo, se reporta que el gen de HPT es más efectivo en plantas de arroz que el gen NPTII (K. Shimamoto y otros, Nature (Londres), vol. 338, p. 274, 1989)). Además, dado que las variedades del gen marcador seleccionable están limitadas, la introducción múltiple de un gen no puede repetirse indefinidamente solo cambiando el gen marcador seleccionable. Es decir, el número de introducciones de genes en cierta planta se limita por sí mismo por la variedad de genes marcadores seleccionables que se pueden usar en esa planta. Además, la clase de gen marcador seleccionable que se puede usar realmente está limitada como se mencionó antes. Consecuentemente, es conveniente hallar un método para remover el gen marcador seleccionable del cromosoma después de la selección del tejido de planta transgénica para excluir la influencia del gen marcador seleccionable de la célula, tejido y planta. Para eliminar la influencia de un gen marcador seleccionable, se han reportado dos métodos. En un método, ungen marcador seleccionable y un transposon de la planta se introduce en un cromosoma de planta y subsecuentemente se remueve la misma siguiendo el transposon (Solicitud Internacional Abierta al Público No. WO 92/01370). En un segundo método, el sistema de recombinación específica para un sitio del fago P1 se usa en lugar del transposon (Solicitud Internacional Abierta al Público No. WO/01283). Usando estos métodos, es posible obtener una célula en la cual el gen marcador seleccionable haya sido removido del cromosoma de la planta en una relación dada después de la introducción del gen. Desafortunadamente, la probabilidad de que se remueva el gen marcador seleccionable es muy baja. Además, las células de plantas en las cuales los genes del marcador seleccionable se hayan removido de los cromosomas usando estos métodos, se difunden entre las células en las cuales los genes marcadores seleccionables aún están presentes y expresados. Estas dos clases de células no se pueden distinguir visualmente. Las células de plantas que contienen genes marcadores seleccionables y un gen deseado se pueden seleccionar basado en su resistencia química, requisitos nutricionales y similares. Sin embargo, en el momento de la selección, las células que carecen de genes marcadores seleccionables exhiben seria inhibición de crecimiento y se destruyen en muchos casos. Consecuentemente, estas selecciones no se pueden aplicar para obtener células que carecen de genes marcadores seleccionables. Con el fin de obtener plantas que carecen de un gen marcador seleccionable y que contiene el gen deseado usando los métodos mencionados antes, el tejido de planta, en el cual las células que carecen del gen marcador seleccionables y las células que contienen los genes marcadores seleccionables se mezclan, se proliferan. se regeneran y después se analizan para la selección, usando métodos tales como hibridación de Southern o reacción en cadena de polimerasa. Este método está basado en la premisa de que un individuo regenerado se deriva de una sola célula y por lo tanto todas las células de la planta deben tener las mismas características. Por lo tanto, un individuo derivado de una célula que carece del gen marcador seleccionable está hecho solo de dichas células. Desafortunadamente, las células que constituyen dicho individuo regenerado no son necesariamente uniformes. Las células que carecen del cromosoma del gen del marcador seleccionable y células que contienen el gen marcador seleccíonable son coexistentes y distribuidos muy irregularmente aunen la misma planta regenerada individual y en el mismo tejido de la misma. Por lo tanto, es extremadamente difícil obtener un individuo hecho solo de células que carecen del gen marcador seleccionable en la etapa en la cual el tejido cultivado se rediferencía para regenerar al individuo. Además, los métodos analíticos conocidos de selección, usan un tejido, tal como una hoja, como una muestra de prueba (no un individuo completo o una sola célula). Consecuentemente, solo la tendencia global se analiza con respecto al estado del gen marcador seleccionable presente en una hoja. Además, en este caso, es común que la célula libre del gen marcador seleccionable y la célula que contiene el gen marcador seleccionable, estén presentes ambas en el mismo individuo o tejido. Por lo tanto, aunque solamente se forme un individuo hecho solo de células que carecen del gen marcador seleccionable, es difícil de seleccionarlo. Aún si la presencia del gen marcador seleccionable no se detecta en este tejido, los tejidos en otros sitios del mismo individuo pueden contener el gen marcador seleccionable o simplemente muestra que la cantidad de gen marcador seleccionable está por debajo del límite detectado. Por lo tanto, es imposible determinar si la muestra de prueba está completamente libre de las células que contienen el gen marcador. Usando los métodos mencionados antes, un individuo que carece del gen marcador seleccionable se obtienen solo de una célula embrionaria, tal como un polen, una célula de huevo y similares. Cuando la autopolinación se lleva a cabo usando la célula huevo que carece del gen marcador seleccionable, se obtiene un huevo fertilizado que carece del gen marcador seleccionable en una relación fija de acuerdo con una ley hereditaria clásica y de este huevo fertilizado, se produce un individuo formado solo de células que tienen las mismas características que el huevo fertilizado. Pueden llevarse a cabo métodos analíticos convencionales tales como hibridación de Southern usando este individuo. A saber, aún si la célula que carece del gen marcador seleccionable se produce por el método descrito en el reporte al que se hace referencia en el presente, el individuo hecho solo de dicha célula se obtiene para el primer momento de rediferenciación de la planta del tejido cultivado que contiene dicha célula, llevando a cabo cruces de la planta regenerada y obteniendo progenie de F o generaciones posteriores. El individuo así obtenido se puede seleccionar como un individuo que carece del gen marcador seleccionable. Con el fin de remover el gen marcador seleccionable de la planta transgénica, JP-A-6-276872 reporte una técnica para introducción de genes en la cual se inserta un gen marcador seleccionable en un vector de plásmido separado diferente del vector que contiene el gen deseado. El plásmido que contiene el gen marcador seleccionable se remueve de la célula después de terminar la introducción del gen (el término "JP-A" como se usa en la presente significa una solicitud de patente japonesa publicada). Sin embargo, esta técnica requiere un paso de cruzamiento para la remoción del gen marcador seleccionable. A este respecto, la técnica es la misma que aquella de los dos reportes mencionados antes. Los métodos anteriores son difíciles de aplicar a plantas leñosas que tienen un largo período de crecimiento, a individuos estériles y individuos híbridos en los cuales se piensa que tiene valor F?. Además, cuando se usan los elementos de ADN removibles, tales como un transposon y similares, la relación en la cual se remueven estos elementos del ADN cromosomal, ADN de vector de virus y similares, en donde estos elementos están presentes y funcionan, normalmente es extremadamente baja.

Consecuentemente, es necesario que la remoción de estos elementos (a saber, la remoción del gen marcador seleccionable) se puede detectar fácilmente de manera real, por lo menos, en la etapa del tejido cultivado. Cuando este no puede detectarse antes de la rediferenciación del tejido cultivado y la formación de una generación tardía vía el cruce del individuo regenerado, el método no es práctico. Descripción de la Invención Consecuentemente, un objetivo de la presente invención es proporcionar un vector que contiene un gen que se desea introducir en una planta y un gen marcador seleccionable, en donde una planta que contiene el mismo no tiene efecto adverso sobre el cuerpo humano cuando se ingiere, aún si se expresa el gen marcador seleccionable. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector para introducir un gen deseado en una planta, en donde el vector contiene un gen marcador seleccionable que permite la selección de un tejido transgénico sin el uso de una substancia inhibidora de crecimiento celular de plantas que disminuye la actividad de la célula de la planta. Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar un vector para introducir un gen deseado en una planta, en donde el vector contiene un gen marcador seleccionable y funciones para excluir la influencia del gen marcador seleccionable removiendo el gen marcador seleccionable del ADN, en donde el gen marcador seleccionable está presente y funciona. Usando este vector, se puede introducir repetida y eficientemente un gen deseado. Un objetivo adicional de la presente invención, es proporcionar un método para producir una planta transgénica usando dicho vector, el cual puede excluir la influencia del gen marcador seleccionable sin sufrir el paso de producción de Fi o generaciones tardías por cruzamiento y un método para introducir multitudinariamente genes en una planta aplicando el método descrito antes.

Estos y otros objetivos de la presente invención se han logrado usando un vector, el cual comprende un gen deseado y, por lo menos, un gen de inducción de anormalidad morfológica (de aquí en adelante denominado como "IAM") como un gen marcador seleccionable. Además, estos y otros objetivos de la presente invención se han logrado usando dicho vector, en donde el gen marcador seleccionable se remueve del ADN después de su expresión. La expresión del gen marcador seleccionable y la desaparición de la función del mismo, son detectables por cambios morfológicos en el tejido en el cual el gen marcador seleccionable se ha introducido. Además, estos y otros objetivos de la presente invención se han logrado usando un vector el cual comprende un gen deseado, por lo menos un gen de IAM es un gen marcador seleccionable y un elemento de ADN removible. El gen de IAM se coloca de manera que se comporta integralmente con el elemento de ADN removible. El gen deseado se coloca de manera que no se comporta integralmente con el elemento de ADN removible. Además, estos y otros objetivos de la presente invención se han logrado mediante un método para producir una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador seleccionable, el cual comprende los siguientes pasos: (A) introducir un vector en una célula de planta, en donde dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen de IAM como un gen marcador seleccionable, y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de IAM se coloca de manera que se comporta integralmente con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se comporta integralmente con el elemento de ADN removible, (B) cultivar la célula de planta obtenida en (A), detectando un tejido de planta morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo, y seleccionar dicho tejido morfológicamente anormal, y (C) cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectando un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente normal. Además, estos y otros objetivos de la presente invención se han logrado por un método para introducir, por lo menos, dos genes deseados en una planta, el cual comprende llevar a cabo los siguientes pasos, por lo menos dos veces: (A) introducir un vector en una célula de plantas, en donde dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen de IAM como un gen marcador seleccionable y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de IAM se coloca de manera que se comporta integralmente con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se comporta integralmente con el elemento de ADN removible, (B) cultivar la célula de planta obtenida en (A), detectando un tejido de planta morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo, y seleccionando dicho tejido morfológicamente anormal, y (C) cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectando un tejido morfológicamente anormal que aparecen durante el cultivo, y seleccionando dicho tejido morfológicamente normal. Adicionalmente, estos y otros objetivos de la presente invención se han logrado por una planta regenerada cultivando el tejido morfológicamente normal descrito antes. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1, es un diagrama del plásmido Ti y un mapa de endonucleasa de restricción de fragmento de Pst I en una región de ADN-T de cepa de A. tumefaciens P022. La Figura 2, es un diagrama de la construcción de plPT2. La Figura 3, es un diagrama de la construcción de plPT3 de plPT2. La Figura 4, es un diagrama de la construcción de plPT4 de plPT3. La Figura 5, es un mapa de endonucleasa de restricción de una región de ADN-T de la estructura de plPT4. La Figura 6, es el resultado del análisis de PCR de un fenotipo de brotes extremos de un tabaco en el cual se ha introducido un gen usando plPT4. La Figura 7, es un diagrama de la construcción de pNPI102. La Figura 8, es un diagrama de la construcción de pNPI103 de plPT4 y pNPI102.

La Figura 9, es un diagrama de la construcción de pNPI106 de pNPI103. La Figura 10, es el mapa de endonucleasa de restricción de una región de T-ADN en la estructura de pNPMOT. La Figura 11, es una fotografía del brote No. 2 después de un mes de cultivo en el Ejemplo 2. La Figura 12, es una fotografía del brote No. 8 después de un mes de cultivo en el Ejemplo 2. La Figura 13, es el resultado del análisis de PCR del brote No. 8 en el Ejemplo 2. La Figura 14, es el resultado del análisis de PCR de individuos normales obtenidos de brotes Nos. 13-1 y 14-1 en el Ejemplo 3. La Figura 15, es una fotografía de brotes normales diferenciados de un fenotipo de brotes extremos de un tabaco en el Ejemplo 3. La Figura 16, es el resultado del análisis de PCR de un individuo normal que se obtiene de una hoja formada del brote No. 7 en el Ejemplo 2. La Figura 17, es un diagrama de la construcción de pNPI128. La Figura 18, es un diagrama de la construcción de pNPI129 de pNPI128. La Figura 19, es un diagrama de la construcción de pNPM32 de pNPI101 y pNPI129. La Figura 20, es el mapa de endonucleasa de restricción de la región de T-ADN en la estructura de pNPI132.

La Figura 21, es el resultado del análisis de PCR de individuos normales obtenidos de los brotes Nos. 15 a 21 en el Ejemplo 5 usando iniciadores en los cuales se detectó la existencia de un gen de ipt. La Figura 22, es el resultado del análisis de PCR de individuos normales obtenidos de los brotes Nos. 15 a 21 en el Ejemplo 5 usando iniciadores en los cuales se detectó la eliminación de una región mantenida por un par de Rs incluyendo un gen de ipt. La Figura 23, es el resultado del análisis de PCR de individuos normales obtenidos de brotes Nos. 15 a 21 en el Ejemplo 5 usando iniciadores en los cuales se detectó la existencia de un gen de GUS.

La Figura 24, es el resultado del análisis de PCR de individuos normales obtenidos de la línea que no podría formar un fenotipo de brotes extremos en el Ejemplo 5. La Figura 25, es un diagrama de la construcción de pNPI702. La Figura 26, es el mapa de endonucleasa de restricción de la región de T-ADN en la estructura de pNP1702. La Figura 27, es una fotografía de brotes normales diferenciada de un fenotipo de brotes extremos del álamo híbrido en el Ejemplo 7. La Figura 28, es el mapa de endonucleasa de restricción de la región T-ADN en la estructura de pNPI140. La Figura 29, es el resultado del análisis de PCR de un brote normal diferenciado de un fenotipo de brotes extremos después de la introducción multitudinaria de genes en el Ejemplo 8. Mejor Modo de Practicar la invención Como se usa en la presente, el gen de IAM es un gen que se induce en un tejido de una diferenciación morfológicamente anormal de la planta tal como un enano, destrucción de dominancia apical, cambio en pigmentos, formación de una aspereza en la corona, formación de raíces pilosas, ondulación de las hojas o similares. Con respecto al gen de IAM preferido, se pueden genes aislados de bacterias del género Agrobacterium o similares que inducen tumor o teratoma (v.gr., formación de brotes adventicios y raíces adventicias) en varias plantas. Ejemplos de estos diferentes genes de IAM incluyen genes de síntesis de citoquinina (v.gr., gen de ipt (isopenteniltransferasa) (A. C. Smigocki, L. D. Owens, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., vol. 85, p. 5131, 1988)), gen de iaaM (mono-oxigenasa de triptofano) (H. J. Klee y otros, GENES & DEVELOPMENT, vol. 1, p. 86, 1987), gen 5 (H. Kórber y otros, EMBO Journal, vol. 10, p. 3983, 1991), gen 6b (P. J. J. Hooykaas y otros, Plant Mol. Biol., vol. 11, p. 791, 1988) y genes de rol tales como ro1A, ro1B, ro1C, y ro1D (F. F. White y otros, J. Baceriol., vol. 164, p. 33, 1985). Además, ejemplos de los mismos incluyen un gen de iaaL (sintetasa de ácido indolacético-lisina) como Pseudomonas syringae subespecie savastanoi (A. Spena y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 227, pág. 205, 1991), genes de compartimientos homogéneos y genes de fitocromos en varias plantas. Preferiblemente, se usan los genes de síntesis de citoquinina tales como el gen de ipt o por lo menos un gen seleccionando de los genes de rol (más preferiblemente, genes de rol que contienen genes ro1A, ro1B y ro1C). El gen de ipt está presente en el T-ADN de Agrobacterium tumefaciens e induce la destrucción de dominancia apical. Los genes de rol que contienen los genes ro1A, ro1B y ro1C están presentes en el T-ADN de Agrobacterium rhizogenes y, por lo menos, uno de estos induce la formación de raíces pilosas, enanos, ondulación de las hojas similares de una planta regenerada de la raíz pilosa. Usando las técnicas de la presente invención, se puede diseñar una combinación de estos genes marcadores seleccionables de manera que una estructura específica, tal como un brote adventicio, una raíz adventicia o similares, se rediferencía en una planta específica en la cual se introducen estos genes marcadores seleccionables. En la presente invención, se puede usar dicha combinación de genes de IAM, de acuerdo con las condiciones para producir la planta transgénica, tal como la clase de una planta en la cual se van a introducir los genes. El tejido morfológicamente anormal producido por la introducción del gen de IAM en la célula se forma solo de las células que contienen este gen. Por lo tanto, usando este gen como el gen marcador seleccionable, se construye un vector junto con el gen deseado. Cuando este vector se introduce en la célula de la planta y se cultiva la célula transgénica, el tejido formado únicamente de esta célula en el cual se introducen el gen marcador seleccionable y el gen deseado se puede seleccionar escogiendo visualmente el tejido morfológicamente anormal formado de esta célula. Los vectores adecuados útiles de acuerdo con la presente invención tienen una secuencia de ADN que introduce un gen extraño en una célula huésped y que expresa el gen extraño dentro de una célula de un huésped. Cuando el gen se introduce usando el vector de la presente invención, el tejido de planta formado únicamente de la célula transformada puede seleccionarse visualmente cultivando únicamente la célula después de la operación para la introducción del gen en un medio de cultivo camún tal como medio de cultivo MS (Murashige-Skoog) bajo condiciones de cultivo normales. Dado que no hay necesidad de usar una substancia especial para seleccionar el tejido transformado, tal como una substancia inhibidora de crecimiento celular de plantas o similares, no solamente se simplifica el procedimiento, sino que también la actividad de la célula de la planta no se disminuye a través de dicha substancia. Además, la planta tiene inherentemente el gen de lAM, o el gen de lAM es introducido espontáneamente en la planta mediante infección con bacteria o similares. Consecuentemente, una planta obtenida usando el vector de la presente invención, no es diferente de las plantas que están presentes en la naturaleza que tienen esta anormalidad morfológica. Los vectores adecuados de acuerdo con la presente invención, incluyen un vector en donde el gen de lAM se coloca de manera que se comporta integralmente con un elemento de ADN removible y el gen deseado se coloca de manera que no se comporta integralmente con el elemento de ADN removible. Como se usa en la presente, un elemento de ADN removible es un elemento de una secuencia de ADN que por si misma es removible del ADN en donde existe y funciona el elemento de ADN. En las plantas, el transposon presente en un cromosoma se conoce como est elemento. La estructura, actividad y comportamiento de transposones casi se ha identificado completamente. Para que funcione el transposon, en principio se requieren dos componentes, (1) una enzima que se expresa del gen presente en la misma y que cataliza la extirpación de transposición del propio transposon (transposasa) (2) secuencias de unión de ADN que están presentes en la región terminal del transposon sobre las cuales actúa la transposasa. Mediante estos elementos, el transposon se extirpa del cromosoma en el cual existe, y después se transpone usualmente a una nueva posición en el ADN. Sin embargo, en cierta proporción, el transposon también desaparece sin ser traspuesto. La presente invención hace uso de dicho error de transposición del transposon. El transposon puede ser de uno de dos tipos, ya sea un transposon autónomo o un transposon no autónomo. El transposon autónomo mantiene los dos elementos, la transposasa y la secuencia de unión de ADN. En el transposon autónomo, la transposasa se expresa y se une a la secuencia de unión de ADN para acción, por lo que el transposon se extirpa autónomamente del cromosoma. El transposon no autónomo retiene la secuencia de unión de ADN terminal al cual se une la transposasa para actuar. En el transposon no autónomo, el gen de transposasa sufre mutación de manera que no se expresa la transposasa; por lo tanto, el transposon no puede extirparse autónomamente del cromosoma. Sin embargo, cuando se suministra la transposasa al transposon no autónomo del transposon autónomo o de un gen de transposasa independiente, el transposon no autónomo se comporta similar al transposon autónomo. Ejemplos de los transposones autónomos incluyen Ac y Spm aislados de maíz (A. Gierl y H. Saedler, Plant Mol. Biol., vol. 19, p. 39, 1992). Ac puede obtenerse digiriendo sitios en el gen wx-m7 en el cromosoma del maíz con endonucleasa de restricción Sau3A (U. Behrens y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 194, p. 346, 1984). Este transposon autónomo es el más analizado entre transposones de planta. De hecho, la secuencia de ADN ya ha sido determinada (M. M?ller-Newman y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 198, p. 19, 1984). Ejemplos de transposones no autónomos incluyen Ds y sSpm obtenidos borrando las regiones internas de Ac y Spm respectivamente (H. -P. Dóring y P. Starlinger, Ann. Rev. Genet.. vot. 20, p. 175, 1986) y aquellos aislados de muchas plantas, diferentes al maíz, tales como boca de dragón, enredadera de campanilla, y similares, (por ejemplo, Y. Inagaki y otros, Plant Cell, vol. 6, p. 375, 1994). Cuando estos transposones se introducen en cromosomas de plantas exógenas, estos transposones también se extirpan de un cromosoma y se transponen al exhibir la actividad (por ejemplo, B. Baker y otros , Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , vol . 83, p. 4844 , 1986) . En la presente invención, se pueden usar tanto transposones autónomos como no autónomos. Los transposones no autónomos se pueden usar al insertar en el mismo u n gen que funciona como transposasa. Otro elemento removible de ADN , que no está presente en plantas , pero que se puede usar de acuerdo con la presente invención , es un elemento derivado de un sistema de recombinación específico de sitio. U n sistema de recombinación específica para u n sitio , consiste de dos elementos, ( 1 ) un sitio de recombinación (que corresponde al elemento removible de ADN de la presente invención) que tiene una secuencia de ADN característica , y (2) una enzima que se une específicamente a la secuencia de ADN y cataliza la recombinación entre las secuencias de ADN si existen dos o más de las secuencias (recombinasa). Cuando se orientan las dos secuencias de ADN en la misma dirección en un intervalo dado en la mismo molécula de ADN , la región mantenida por estas secuencias de ADN se extirpan de la molécula de ADN , tal como un plásmido, cromosoma o similares. Cuando las dos secuencias de ADN se orientan en direcciones opuestas en la misma molécula de ADN , se invierte la región mantenida por estas secuencias de ADN . La presente invención utiliza preferiblemente la prime ra extirpación . Tanto la extirpación como la inversión dentro del sitio de recombinación ocurren como resultado de la recombinación homologa a través del sistema de recombinación específica para sitio, que es diferente del mecanismo que usa et transposon. Se sabe que el gen recombinasa no está necesariamente presente en la misma molécula de ADN , en la cual existe el sitio de recombinación. El gen de recombinasa solo necesita estar presente en la misma célula y se expresa para extirpar o invertir la región mantenida por las dos secuencias de ADN (N . L. Craig , Annu. Rev. Genet. , vol. 22, p. 77 , 1988) . En la actualidad, los sistemas de recombinación específicas para sitio se han identificado en microorganismos tales como fagos, bacterias (v. gr. , E. coli), levadura y similares. Ejemplos de los mismos incluyen un sistema de Cre/lox, un sistema de pSR 1 , un sistema de FLP, un sistema de cer, y un sistema de fim (por ejemplo, N . L. Craig, Annu. Rev. Genet. , vol . 22, p. 77, 1988) . cuando el sistema de recombinación específico de sitio separado de estos microorganismos con el uso de un sistema de Cre/lox derivado del fago P1 (WO 93/01283) se introduce en organismos (incluyendo plantas) diferentes del organismo del cual se ha derivado este sistema, se comporta en la misma forma que en el organismo original. El sistema de recombinaci?n especifico para un sitio de levadura (Zygosaccharomyces rouxii) (sistema pSR 1 (H . Matsuzaki y otros , J. Bacteriology, vol . 172, p. 610, 1990)) puede usarse también de acuerdo con la presente invención. Este sistema de pSR 1 también mantiene su función inherente en plantas superiores (H. Onouchi y otros, Nucleic Acid Res., vol. 19, p. 6373, 1991). En la presente invención, el gen de inducción de anormalidad morfológica (lAM) se puede insertar en una posición en donde se extirpa este gen junto con el elemento de ADN removible. Por ejemplo, cuando se usa el transposon como el elemento de ADN removible, el gen de lAM puede insertarse en una posición que no influencia la extirpación del transposon y que está corriente arriba de la región del promotor del gen de transposasa pero corriente abajo de la región terminal a la cual se una la transposasa. Cuando se usa el sistema pSR1, el gen de lAM puede insertarse en cualquier posición dentro de la región mantenida por las secuencias de ADN características que no inhibe la expresión de la recombinasa. En la invención presente, el gen de lAM preferiblemente está presente dentro del elemento removible de ADN. Por otro lado, la posición del gen deseado no está particularmente limitada; sin embargo, preferiblemente, el gen deseado está presente agüera del elemento removible de ADN. Usando el vector de dicha estructura después de la introducción del gen deseado, el gen de lAM puede removerse a cierta frecuencia, junto con el elemento de ADN removible, a partir del ADN en el cual está introducido y funciona. El gen deseado que no se comporta integralmente con el gen marcador seleccionable permanece en el mismo ADN. El vector se puede usar para introducir multiplicadamente un gen deseado en cierta planta. Además, dado que la pérdida de la función de este gen de lAM puede detectarse visualmente como un cambio morfológico del tejido transgénico durante el cultivo, el tejido formado solo de la célula con el gen deseado pero sin el gen marcador seleccionable, se puede seleccionar con facilidad y sin necesitar un procedimiento especial, consecuentemente, aún cuando se forma realmente dicha célula a una relación baja, la célula puede seleccionarse suficientemente para hacer prácticamente útil el procedimiento . Además , no solo la introducción múltiple del gen que usa este vector puede repetirse muchas veces , sino que se puede repetir antes de que se genere una planta madura. Por lo tanto, se puede llevar a cabo introducción múltiple de manera eficiente . Con el fin de obtener la planta transgénica individual formada solo de dichas células, la planta puede regenerarse del tejido as í selccionado, sin tener que soportar el paso de cruzamiento. La planta transgénica individual así obtenida está completamente libre de ningún efecto adverso en el cuerpo humano causado por el gen marcador seleccionable como se mencionó antes. Además, el uso de este vector no requiere una substancia inhibidora de crecimiento celular que pueda disminuir la actividad de la célula en el paso de seleccionar el tejido transgénico .

El vector de la presente invención se puede usar en cualqu ier planta en la cual el gen pueda introducirse por métodos de ingeniería genética . El gen deseado de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier gen mediante el cual se puedan impartir características agrícolamente excelentes y cualquier gen que permita estudios de mecanismos de expresión del gen y similares, aunque no se imparten necesariamente características agrícolamente excelentes. Para producir una proteína tal como enzima de un gen, generalmente se requiere secuencia de gen estructural que codifica información del polipéptido y secuencias reguladoras del gen estructural, tal como una secuencia del promotor (secuencia de iniciación de expresión), una secuencia de término (secuencia de terminación de expresión) y similares. Ejemplos de secuencia adecuada de promotor que funciona en la planta incluye el promotor 35S de un virus de mosaico de coliflor (J. T. Odell y otros, Nature (Londres), vol. 313, p. 810, 1985), el promotor de una sintetasa de nopalina (W. H. R. Langridge y otros, Plant Cell Rep., vol. 4, p. 355, 1985) y el promotor de la pequeña subunidad de carboxilasa/oxigenasa de difosfato de ribulosa (R. Fluhr y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p. 2358, 1986). Ejemplos de la secuencia de terminador adecuada incluyen la señal de poliadenilación de una sintetasa de nopalina (A. Depicker y otros, J. Mol. Appl. Gen., vol. 1, p. 561, 1982) y la señal de poliadenilación de una sintetasa octopina (J. Gielen y otros, EMBO J., vol. 3, p. 835, 1984). Consecuentemente, cuando es necesario, un gen en el vector de la presente invención comprende un gen estructural y las secuencias reguladoras de expresión del gen del mismo. El gen, o gen y secuencias reguladoras, se pueden obtener por síntesis química o clonando cADN o ADN genómico . El vector de la presente invención puede introducirse indirectamente en la célula de planta a través de virus o bacterias con las cuales se infectan las plantas (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. , vol. 42, p. 205, 1991 ). Ejemplos de virus adecuados incluyen virus de mosaico de coliflor, geminivirus , virus de mosaico de tabaco y virus de mosaico bromado . Ejemplos de bacterias adecuadas incluyen Agrobacterium tumefaciens (de aqu í en adelante denominado como A . tumefaciens) , y Agrobacterium rhizogenes (de aqu í en adelante denominado como A. rhizogenes) . Plantas dicotiledóneas generalmente se conocen por infectarse con la bacteria del género Agrobacterium. Recientemente, también se ha reportado la introducción de genes en las plantas monocotiledóneas por la infección de estas plantas con ellas (por ejemplo, en Internacional Abierta al Público No. WO 94/00977) . El vector de la presente invención puede introducirse directamente en la célula de la planta mediante métodos f ísicos y qu ímicos tales como una microinyección , una electroporación , un método de glicol polietilénico, un método de fusión y una penetración de bal ística de alta velocidad (I . Potrykus , Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. , vol. 42 , p . 205, 1991 ) . dado que el método de introducción indirecta general que usa el género Agrobacterium no puede aplicarse a muchas de las plantas monocotiledóneas y las platas dicotiledóneas que son resistentes a la infección con Agrobacterium, los métodos de introducción directa mencionados antes son efectivos para estas plantas. El vector par usarse en la presente invención no se limita particularmente mientras se cumplan los requisitos de la presente invención. Por ejemplo, si el vector es introducido indirectamente en la célula de la planta, el vector puede ser un vector Ti o un vector de virus. Ejemplos del vector Ti para usarse en la presente invención incluye Bin19 (M. Bevan y otros, Nucleic Acids Res., vol. 12. p. 8711, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema y otros, Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 85, 1985), pGA492 y p.GA482 (G. An, Plant Physiol., vol. 81, p. 86, 1986), pC22 (C. Simoens y otros, Nucleic Acids Res., vol. 14, p. 8073, 1986), pAGS111 (P. van den Elzen y otros, Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 149, 1985), pEND4K (H. J. Klee y otros, Bio/Technology, vol. 3, p. 637, 1985), pGV831 (R. Delaere y otros, Nucleic Acids Res., vol. 13, p. 4777, 1985), y pMON200 (R. T. Fraley y otros, Bio/Technology, vol. 3, p. 629, 1985). Ejemplos del vector del virus para usarse en la presente invención incluye vector del virus de mosaico de coliflor (N. Brisson y otros, Nature (Londres), vol. 310, p. 511, 1984), vector de geminivirus (R. J. Hayes y otros, Nature (Londres), vot. 334, p. 179, 1988), vector del virus de mosaico bromado (R. French y otros, Science vol. 231, p. 1294, 1986), vector del virus de mosaico de tabaco (N. Takamatsu y otros, EMBO J.. vol. 6, p. 307, 1987), y vector de agroinfección (N. Grimsley y otros, Nature (Londres), vol. 325, p.177, 1987). Sin embargo, los vectores para usarse en la presente invención no están limitados a lo mismo.

Además, el gen deseado para usarse en la presente invención no está limitado particularmente. La naturaleza del gen deseado por sí misma no es crítica para la presente invención. Ejemplos del gen deseado para usarse en la presente invención incluyen genes para resistencia a enfermedades (v.gr., gen para endotoxina de Bacillus thuringiensis, WO 92/20802), resistencia a herbicidas (v.gr., gen de sintasa de acetolactato mutante, WO 92/08794), proteína de almacenamiento de semillas (v.gr., gen de glutelina, WO 93/18643), síntesis de ácidos grasos (v.gr., gen de tioesterasa de acilo-ACP, WO 92/20236), hidrólisis de pared celular (v.gr., gen de poligalacturonasa (D. Grierson y otros, Nucleic Acids Res., vol. 14, P. 8595, 1986)), biosíntesis de antocianina (v.gr., gen de sintasa de calcona (H. J. Reif y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 199, p. 208, 1985)), biosíntesis de etileno (v.gr., gen de oxidasa de ACC (A. Slater y otros, Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 137, 1985)), sistema de barrido de oxígeno activo (v.gr., gen de reductasa de glutationa (S. Greer & R. N. Perham, Biochemistry, vol. 25, p. 2736, 1986)), y biosíntesis de lignina (v.gr., gen de amonio de fenilalanina-liasa, gen de deshidrogenasa de alcohol cinamílico, gen de o-metiltransferasa, gen de 4-hidroxilasa de cinamato, gen de ligasa de 4-cumarato-CoA, gen de reductasa de CoA cinamoilo (A. M. Boudet y otros, New Phytol., vol. 129, p. 203, 1995)). Sin embargo, los genes deseados para usarse en la presente invención no están limitados a la misma. Además, la planta huésped para usarse en la presente invención no está limitada particularmente. Ejemplos de planta herbácea usada como la planta huésped incluye tabaco (Tabacum), tomate (Lycopersícom), papa dulce (Impoea), papa (So/ar?í/m), zanahoria (Dacus), lechuga (Lactuca), coliflor (Brassica), col (Brassica), colza de semilla oleosa (Brassica), girasol (Helianthus), remolacha (Bela), espárrago (Asparagus), plátano (Musa), algodón (Gossypium), arabidopsis (Arabidopsis), alfalfa (Medicago), chícharos (Pisum), soya (Glycine), arroz (Oryza), maiz (Zea), y centeno (Sécale). Ejemplos de planta arbórea usados como la planta huésped incluyen álamo blanco (Populus), eucalipto (Eucalyptus), acacia (Acacia), pera (Pyrus), manzana (Malus), uva (Vitis), nuez de nogal (Juglans), ciruelo (Prunus), rosa (Rosa), y abeto (Picea). Sin embargo, las plantas huésped para usarse en la presente invención no están limitadas a la misma. En la presente invención, el gen de lAM se expresa para hacer anormal la parte interna fisiológica de la célula. Las anormalidades fisiológicas incluyen la producción de hormona de crecimiento de planta en una célula de plantas, con el resultado de que la proliferación y diferenciación de la célula que contiene el gen de lAM se confunden para inducir varias anormalidades morfológicas. Por ejemplo, un agregado de brotes desordenados con dominancia apical destruida (fenotipo de brotes extremos: FBE), raíces pilosas o similares, se pueden derivar de una célula en la cual se introduce un gen de lAM. Este fenotipo se forma por proliferación y diferenciación anormal de la célula mencionada antes. Por lo tanto, este tejido morfológicamente anormal está formado únicamente de la célula que contiene este gen. Consecuentemente, si el vector se construye usando este gen como el gen marcador seleccionable junto con el gen deseado y se introduce en la célula de la planta y la célula se cultiva, el tejido formado solo de la célula en la cual el gen marcador seleccionable y el gen deseado se han introducido, se pueden elegir seleccionando visualmente solo el tejido morfológicamente anormal formado de la célula de la planta. Por lo tanto, es posible seleccionar visualmente el tejido transgénico sin llevar a cabo ningún procedimiento especial de manera que la adición de la substancia inhibidora del crecimiento de la célula de la planta y similares a un medio de cultivo. Mientras que los genes marcadores seleccionables convencionales tales como gen NPTII, no se introducen en plantas sin ingeniería genética; el gen de lAM de la presente invención es un gen cuyas plantas retienen inherentemente o que se introducen naturalmente en plantas por infección con bacteria o similares. Por esta razón, se considera que es muy alta la seguridad del producto del gen para el cuerpo humano. Además, en la presente invención, el gen de lAM se inserta en una posición de manera que se comporte integralmente con el elemento removible de ADN. Después de que se introduce en la planta el vector que tiene dicha estructura, el gen de lAM usado como el gen marcador seleccionable se remueve de ADN junto con el elemento removible de ADN a una frecuencia fija dando como resultado la pérdida de esta función. Mientras tanto, el gen deseado que no se comporta integralmente con el elemento de ADN removible permanece en el mismo ADN y mantiene su función. Por lo tanto, la expresión del mismo gen marcador seleccionable se puede usar como un índice para la introducción de un gen deseado una y otra vez. Consecuentemente, este vector ocasiona que la introducción múltiple del gen en cierta planta meramente cambiando la estructura relacionada con el gen deseado que será introducido sin imponer ningún cambio en las estructuras del gen marcador seleccionable y los demás. Por esta razón, el vector puede usarse repetitivamente para una cantidad no limitada de veces. Dado que la pérdida de la función del gen marcador seleccionable, es decir, la pérdida de la función del gen de lAM, puede detectarse visualmente, el tejido formado de células que carecen del gen marcador seleccionable y que contienen el gen deseado se pueden obtener de manera segura y fácil. Es decir, el cultivo, la selección visual y la separación pueden repetirse sin la necesidad de algún procedimiento especial para obtener dicho tejido. Además, la planta formada solo de la célula mencionada antes se puede obtener únicamente por la regeneración de la planta del tejido obtenido, sin tener que sufrir el paso de cruzamiento. Aún además, aunque un transposon sea duro de remover completamente del ADN dado que este elemento tiene una alta capacidad de transposon, la invención puede colocarse suficientemente en uso práctico dado que la selección es altamente eficiente. Ejemplo La presente invención será ilustrada haciendo referencia a los siguientes Ejemplos, pero la presente invención no deberá interpretarse por limitarse a la misma. En los siguientes Ejemplos, los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones de Molecular Cloning, 2a edición (Sambrook y otros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989) o mediante un fabricante a menos que se instruya de otra manera., EJEMPLO 1 I. Construcción de un vector Un gen de ipt presente en ADN-R de la cepa P022 de A. tumefaciens patogénica (H. Wabiko, Chemical Regulation of Plants, vol. 24, p. 35, 1989 (véase Fig. 1)) se separó con la endonucleasa de restricción Pst\, y el plásmido plPT1 se obtuvo ligando el gen de ipt en el sitio de endonucleasa de restricción de Psti del plásmido pUC7 (Molecular Cloning, 2a edición, col. 1, 4.10). A partir de este plásmido, un gen de ipt que contiene un promotor nativo y una señal de poliadenilación nativa se separó de las endonucleasas de restricción BamHl y Pstl, y el plásmido pIPT2 se obtuvo ligando el gen de ipt en los sitios de endonucleasa de restricción SamHI-Psfl del plásmido pUC119 (obtenido de Takara Shuzo Co., Ltd.). A partir de este plásmido, el gen estructural y la señal de poliadenilación nativa del gen de ipt se separaron con la endonucleasa de restricción Rsal y el plásmido pIPT3 se obtuvo ligando el gen de ipt en el sitio de endonucleasa de restricción Smal del plásmido pUC119. Además, el gen de ipt insertado en plPT3 se separó con las endonucleasas de restricción BamHl y Sacl, y el plásmido plPT4 se obtuvo ligando el fragmento en los sitios de endonucleasa de restricción ßamHI-Sací del plásmido pBM21 del vector (obtenido de Clontech Co.) que es útil para la introducción del gen en una planta. Cuando se infecta una planta con A. tumefaciens que tiene el plásmido plPT4, una región de ADN-T que existe entre un sitio de LB y un sitio de RB, una región de aproximadamente 5 kb que tiene el gen de NPTII y el gen de ipt, entra para integrarse en el cromosoma de la planta. Este plásmido pIPT4 se introdujo en la cepa JM109 de E. coli (Escherichia coli), y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (plPT4) bajo el No. de Depósito FERM BP-5063. La estrategia para construir el plásmido pIPT4 se muestra esquemáticamente en las Figuras 2 a 4. El mapa de endonucleasa de restricción de la región de ADN-T del mismo se muestra en la Figura 5. En las Figuras 2 a 4 y 5, las "P" y "T" encerradas en un círculo indican un promotor nativo y una señal de poliadenilación nativa del propio gen de ipt, respectivamente. 35S-P indica un promotor 35S de un virus de mosaico de coliflor y Nos-P indica un promotor de un gen de sintetasa de nopalina. T (Fig. 4) o Nos-T (Fig. 5) indica una señal de poliadenilación del gen de sintetasa de nopalina. En este Ejemplo, como se muestra en la Figura 5, para el gen de lAM como el gen marcador seleccionable, se usó el gen de ipt que contribuye a la formación de un ESP induciendo la destrucción de dominancia apical, y se usó el gen NPTII como un modelo del gen deseado. El gen de ipt es un miembro de oncógenos que retiene A. tumefaciens patogénico. Una célula de planta en la cual se introduce este gen de ipt, ocasiona diferenciación que conduce a la formación de un ESP mediante la sobeproducción de citoquinina, la cual es una hormona de planta. En este Ejemplo, el promotor 35S de un virus de mosaico de coliflor se usó para una secuencia de promotor del gen de ipt, y la señal de poliadenilación nativa del propio gen de ipt, se usó para una secuencia de terminador. II. Introducción de pIPT4 en Agrobacterium La cepa LBA4404 de A. tumefaciens (obtenida de Clontech Co.) se inoculó en 10 ml de medio de cultivo líquido YEB (conteniendo 5 g/litro de extracto de carne, 1 g/litro de extracto de levadura, 1 g/litro de peptona, 5 g/litro de sacarosa, y 2 mM de MgSO4, pH de 7.2 a 22°C (el pH a 22°C se aplica a lo siguiente a menos que se indique de otra manera)), y se cultivó a 28°C hasta que OD63o estuvo dentro de la escala de 04 a 0.6. Después, el cultivo se centrifugó a 6,900 x g durante 10 minutos a 4°C para recoger las células. Las células se suspendieron en 20 ml TrisHCI 10-mM (pH 8.0) y la suspensión se recentrifugó a 6,900 x g durante 10 minutos a 4°C. Subsecuentemente, las células recopiladas se resuspendieron en 200 µl de medio de cultivo líquido YEB, y esta suspensión se usó como una solución de células para introducir un plásmido. En un tubo de 15 mililitros (hecho por Falcon), 200 µl de la solución de células para introducir el plásmido se mezclaron con 6 µg de plásmido pIPT4 obtenido en el paso 1 descrito antes la mezcla se enfrió sumergiéndola durante 5 minutos en etanol que se había enfriado en nitrógeno líquido durante de 30 a 40 minutos. La solución así enfriada, junto con el tubo, se dejaron en reposo en un baño de agua de 29°C durante 25 minutos. Después, 750 µl de medio de cultivo líquido YEB se añadieron a la misma y la solución mezclada se cultivó a 29°C durante 1 horas mientras se agitaba. Esta solución de células se dispersó en medio de cultivo de agar YEB (conteniendo 1.2 %p/p de agar y los mismos ingredientes que aquellos del medio de cultivo mencionado antes) al cual se le añadieron 50 mg/litro de canamicina, y se cultivaron a 28°C durante 2 días. Las colonias de células así obtenidas, se inocularon en medio de cultivo líquido YEB y se cultivaron adicionalmente. Después, el plásmido se extrajo de las células por un método alcalino y se dividieron con endonucleasas de restricción Psfl, SamHl y EcoRl. Los fragmentos así obtenidos del plásmido se analizaron por electroforesis de gel de agarosa y se confirmó que el plásmido pIPT4 se introdujo en una cepa de A. tumefaciens LBA4404. lll. Introducción de pIPT4 de Aqrobacterium en un tabaco Las hojas maduras de un tabaco (Nicotina tabacun cv. xanthi, de aquí en adelante un tabaco significa esta variedad a menos que se indique de otra manera) desarrollado en un invernadero, se sumergieron en una solución acuosa de hipoclorito de sodio al 7 %v/v para esterilización y se lavaron tres veces con agua estéril Después, la nervadura central de la hoja se removió para formar discos de hoja de aproximadamente 8 mm cuadrados. Los discos de hoja así obtenidos, se sumergieron durante aproximadamente 1 minuto en una suspensión de células de pIPT4 introducido en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens en el paso II descrito antes, y se infecto con la misma (cuya suspensión se diluyó con un agua esterilizada a OD63o=0.25 después del cultivo durante la noche en medio de cultivo líquido YEB). El disco de hoja infectado se colocó en un papel filtro esterilizado para remover cualquier suspensión extra de células. Después, se colocó sobre un medio de cultivo de agar MS sin hormonas (T. Murashige y F. Skoog, Physiol. Plant., vol. 15, p. 473, 1962 (con la condición de que 0.8p/v% de agar se haya añadido al mismo)) conteniendo 50 mg/litro de acetosiringona con la parte posterior de la hoja mirando hacia arriba y se cultivó durante 3 dias, a 25°C en luz completa (el cultivo en un explante, un tejido de planta y una planta se llevó a cabo bajo estas condiciones de temperatura e iluminación a menos que se indique de otra manera). El disco de hoja así cultivado, después se transplantó en medio de cultivo de agar de MS sin hormona conteniendo solo 500 mg/litro de carbenicilina, y se continuo el cultivo. Como resultado, se rediferenciaron 22 brotes adventicios. Estos brotes adventicios se separaron y cultivaron además en un medio de cultivo que tiene la composición mencionada antes para obtener 6 líneas de ESP. Estas líneas de ESP, se subcultivaron en el mismo medio de cultivo cada mes, y se subcultivaron en medio de cultivo de agar MS sin hormonas que varias veces no contuvo carbenicilina 3 meses después de una infección. Después de que no se observó la proliferación de Agrobacterium, se llevó a cabo una prueba para resistencia a la canamicina y análisis de PCR. IV. Análisis de un tabaco en el cual se ha introducido el gen A. Prueba para resistencia a la canamicina. Las 6 líneas de ESP obtenidas en el paso Ul descrito antes, se cultivaron como tal sin subcultivos. Las hojas desarrolladas de estas líneas de ESP se cortaron para formar disco de hojas de aproximadamente 3 mm cuadrados. Los discos de hoja así obtenidos, se colocaron sobre el medio de cultivo de agar MS (1 mg/litro de adenina de bencilo y se añadieron al mismo 0.2 mg/litro de ácido a-naftalenacético) conteniendo 200 mg/litro de canamicina. Después del cultivo en este medio de cultivo que contienen canamicina durante 1 mes , también se observó la formación de l íneas de ESP de los discos de hojas obtenidos de estas líneas de ESP. B. Análisis de PCR Se extrajeron A DNs cromosomales para todas las 6 l íneas de ESP obtenidas en el paso III descrito antes, y los genes introducidos a los mismos , se analizaron mediante el método de PCR. El ADN cromosomal se extrajo usando el siguiente método de CTAB modificado. Primero, aproximadamente 1 g de las hojas desarrolladas del ESP se molieron en nitrógeno l íquido usando un mortero y tritu rador templados y se suspendieron en 5 ml de una solución reguladora de pH (contendiendo 2 % p/v de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio), NaCI 1 .4 M, 0.2 % v/v de ß-mercaptoetanol, EDTA 20 mM y Tris-HCl 100 M (pH 8.0)) que se ha calentado a 60°C . Esta suspensión se calentó a 60°C durante de 30 a 60 minutos mientras se agitó suavemente, y después se enfrió a temperatura ambiente. A esta suspensión se le añadió una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24: 1 ) a un volumen igual y estos se mezclaron suavemente. Después, la mezcla se centrifugó a 1 ,600 x g durante 5 minutos para recuperar un sobrenadante . Subsecuentemente , se añadieron 2/3 de volu men de alcohol isoprop ilico al sobrenadante y se mezcla de nuevo suavemente . La mezcla se dejó reposar en hielo durante 10 minutos para precipitar el A DN cromosomal . Este ADN cromosomal se recogió por centrifugación a 1 ,6000 x g durante 10 minutos. El ADN cromosomal así recogido se lavó con 70% v/v de etanol, después se secó a vacío y se disolvió en 300 µl de TE (comprendiendo Tris-HCl 10 mM y EDTA 1mM). Mientras, con el fin de detectar el gen de ipt por el método de PCR, se sintetizaron un par de iniciadores (oligonucléotidos) por un sintetizador de ADN (manufacturado por Applied Biosystems Co.). Cuando se unieron al gen de ipt, la distancia entre los dos iniciadores fue de aproximadamente 800 pb. Para amplificar el gen de ipt, se disolvió 1 µg del ADN cromosomal extraído en 50 µl de una solución mezclada conteniendo 0.2 µM de estos iniciadores, Tris-HCl 10 mM (pH de 8.8 a 25°C), KCl 50 mM, MgCI2 1.5 mM, 1% p/v de Tritón X-100, dNTP 0.1 mM y 1.25 unidades de polimerasa de Taq (obtenida de CETUS CO.). Después de que se calentó la mezcla a 94°C durante 1.5 minutos, se repitió un ciclo de calentamiento en tres partes, a saber, a 94°C durante 1 minuto, a 55°C durante 2 minutos y a 72°C durante 3 minutos durante un total de 30 veces para completar la reacción. La mezcla de reacción obtenida se analizó por electroforesis de gel de agarosa para detectar la presencia del gen de ipt en el ADN cromosomal por la amplificación del gen de aproximadamente 800 pb. Los resultados se muestran en la Figura 6. Como es claro a partir de la Figura 6, la amplificación del gen de aproximadamente 800 pb se observó en todos los 6 ESPs. En la Figura 6, los valores mostrados en el lado izquierdo indican la longitud de bases, la cual fue de los ingredientes de banda detectados (de aquí en adelante denominado como la "banda") en la electroforesis en el marcador de tamaño del ADN. EJEMPLO COMPARATIVO 1 El análisis se llevó a cabo con respecto a 16 brotes que no tuvieron la capacidad de formar un ESP y se obtuvieron de los brotes adventicios rediferenciados de la hoja infectada con A. tumefaciens en el paso III del Ejemplo 1. Es decir, en el momento en que se cultivaron 22 brotes adventicios y se seleccionaron las líneas de ESP en el paso 111 del Ejemplo 1, los que muestran brotes morfológicamente normales (de aquí en adelante denominados como "sin-ESP") también se liberaron de A. tumefaciens y se sometieron a la prueba de resistencia a la canamicina en la misma forma que el los pasos III y IV del Ejemplo 1. Además, las 9 líneas sin ESP se sometieron a análisis de PCR. Sin embargo, con respecto a estas líneas sin-ESP, los discos de hoja colocados sobre el medio de cultivo que contiene canamicina se volvieron de color café y se volvieron blancos después de 3 meses. Además, en el análisis de PCR, en ninguna de las nueve líneas analizadas, no se detectó amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb, lo cual prueba la presencia del gen de ipt. Los resultados de PCR se muestran en la Figura 6. EJEMPLO 2 I. Construcción de un vector El plásmido pHSG398 (obtenido de Takara Shuzo Co., Ltd.) se digirió con la endonucleasa de restricción SamHI. Las terminaciones cohesivas producidas por la digestión se cambiaron en las terminaciones de extremo despuntado con polimerasa I de ADN T4 (subunidad grande), y el plásmido pNPHOO se obtuvo ligando estas terminaciones. Es decir, el pNPHOO fue el pHSG398 que pierde el sitio de endonucleasa de restricción de SamHl. Mientras, el plásmido pCKR97 (T. Izawa y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 227, p. 391, 1991) se digirió con endonucleasa de restricción Pst\. El transposon Ac de un maiz se cortó y se insertó en el sitio de ia endonucleasa de restricción Psfl del pNPHOO para obtener el plásmido pNPH02. Subsecuentemente, del plásmido pIPT4 construido en el Ejemplo 1, un promotor del virus de mosaico de coliflor 35S y un gen de ipt unido al mismo, se cortaron con las endonucleasas de restricción HindU y Sacl. Las terminaciones cohesivas del fragmento así obtenidas se cambiaron a las terminaciones de extremo despuntado con la polimerasa I de ADN T4 y el fragmento se insertó en el sitio de endonucleasa de restricción Hincll del plásmido pUC119 para obtener el plásmido pNPHOI. A partir de este plásmido pNP16101, el virus del promotor del mosaico de coliflor 35S y el gen de ipt se cortaron de nuevo con endonucleasas de restricción Psfl y EcoRI y las terminaciones cohesivas del fragmento se cambiaron en terminaciones de extremos despuntados con polimerasa 16 de ADN T4. Además, el plásmido pNP16103 se obtuvo ligando el fragmento en el sitio de endonucleasa BamHl de extremo despuntado de pNPI102. Es decir, en el plásmido pNPI103, el promotor 35S y el gen de ipt ligado al mismo existieron en el sitio de endonucleasa de restricción antiguo de Sa HI dentro del transposon Ac. El vector deseado se obtuvo cortando el transposon Ac que contiene el promotor del virus de mosaico de coliflor 35S y el gen de ipt del plásmido pNPI103 con la endonucleasa de restricción Psfl e insertando este transposon Ac en el sitio de endonucleasa de restricción Ssel del plásmido de vector pBI121. Este se designó como plásmido pNPI106. Este plásmido pNP106 también se introdujo en la cepa de E. coli JM109 y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (pNPI106) bajo el No., de Depósito FERM BP-5064. La estrategia para construir el plásmido pNPHOd se mostró esquemáticamente en las Figuras 7 a 9. Un mapa de endonucleasa de restricción de la región de ADN-T del mismo se muestra en la Figura 10. En las Figuras 7 a 9 y 10, la región terminal del transposon Ac se muestra por los triángulos opuestos negros, respectivamente. En la Figura 10, Ac-P es un promotor nativo presente dentro de Ac. Otros símbolos son iguales que aquellos mostrados en las Figuras 2 a 5. Como es claro a partir de la Figura 10, este plásmido tiene el gen de ipt como el gen marcador seleccíonables y el gen NPTIl y el gen de GUS (ß-galactosidasa) como un modelo del gen deseado en la región de ADN-T, a saber en la región que será integrada en el cromosoma de la planta. Además, el gen de ipt está presente a medida que se inserta dentro del transposon Ac. Dado que la célula que tiene el gen de GUS metaboliza un substrato especial para producir un pigmento azul, la expresión del gen puede identificarse detectando este pigmento. Por lo tanto, el gen de GUS con frecuencia se usa para el análisis de la expresión del gen en la planta. II. Introducción de pNPH06 en un tabaco y análisis de un tabaco en el cual se ha introducido el gen A. Introducción de pNPH06 en un tabaco y prueba para expresión del gen introducido. En la misma manera que en los pasos II y Ul del Ejemplo 1, pNPI106 se introdujo en la cepa LBA4404 de A. tumefaciens y los discos de hojas del tabaco se infectaron con este A. tumefaciens. La hoja de tabaco así infectada, se cultivó en medio de cultivo de agar MS sin hormona que contiene 50 mg/litro de acetosiringona. y después en el medio de cultivo de agar de MS sin hormona al cual se le añadieron 500 mg/litro de carbenicilina. Después de dos meses de dicho cultivo, se separaron 63 lineas de ESP. Las líneas de ESP se transplantaron en el medio de cultivo de la misma composición (medio de cultivo de agar de MS sin hormona conteniendo 500 mg/litro de carbenicilina). Un mes después, de entre los brotes de ESPs que crecieron ligeramente, 9 brotes (aquellos que se generaron de los ESPs se llaman de aquí en adelante, simplemente "brotes") se seleccionaron visualmente los cuales tuvieron un crecimiento de aproximadamente dos o más veces en comparación con los otros brotes, en los cuales el crecimiento de los brotes laterales no se observó y que la influencia del gen de ipt parecieron disminuir. Las hojas de los brotes se sometieron a la misma prueba para resistencia a la canamicina que se llevó a cabo en el paso IV-A del Ejemplo 1 y la prueba para la expresión del gen de GUS (prueba para actividad de GUS) basado en el método de Jefferson y otros. Los brotes obtenidos después de que las hojas se cortaron, se transplantaron en medio de cultivo de agar MS sin hormonas y se cultivaron. Un mes después, se observaron las configuraciones para detectar la capacidad de formar los ESPs de los brotes, exhibieron por lo tanto la expresión del gen de ipt. Los resultados se muestran en la Tabla 1. TABLA 1 Resultados para la expresión del gen introducido en un tabaco por el vector pNPH06 Brote No. Resistencia Actividad de Morfología a la GUS después de canamicina 1 mes de cultivo Ejemplo 2 1 ESP 2 ESP 3 ESP 4 ESP 5 ESP 6 ESP 7 ESP 8 normal 9 ESP Ejemplo 10 normal Comparativo 11 normal 2 12 normal Notas: 1. En la resistencia a la canamicina, + es "resistente", y - es "no resistente". 2. En la actividad de GUS, + es "activo", y - es "inactivo". 3. "normal" significa un individuo que ocasiona el crecimiento dominante de un brote apical y la formación de raíces.

Como es evidente a partir de la Tabla 1, aunque la hoja de la raíz No. 8 tenga resistencia a la canamicina y actividad de GUS, un ESP no se forma aunque la raíz se cultive durante 1 mes. Esto es presumiblemente debido a que el gen de ipt que ocasiona la formación del ESP, está presente en la forma insertada dentro del transposon Ac en el plásmido pNPI106. Es decir, el gen de ipt, que se introduce en el cromosoma del tabaco por la infección con el A. tumefaciens que contiene este plásmido para el tejido y expresado en la etapa inicial del cultivo de tejido justo después de la infección, se remueve junto con AC mediante la acción de Ac durante el cultivo subsecuente. Mientras, en el mismo vector, el gen NPTII y el gen de GUS se insertan en una posición en donde no se comportan integralmente con Ac, de manera que estos genes aún permanecen en el cromosoma de la planta y se expresan. En la Tabla 1, aunque la resistencia a la canamicina y a capacidad de formación de ESP se observa en los brotes Nos. 3, 5, y 6, solo es negativa la actividad de GUS. Esto significa que en estos brotes solo el gen de GUS de los genes introducidos usando el pNPI106 no se expresa. Se considera que esto se debe a la integración errónea que se presenta cuando estos genes fueron integrados en los cromosomas de plantas. Es decir, cuando el gen se introdujo vía A. tumefaciens que contiene el plásmido que tiene la estructura de pNPHOd o similares, la región de ADN-T, a saber, la región integral global entre el sitio de RB y el sitio de LB, deben integrarse normalmente en el cromosoma de ia planta. Sin embargo, esta región algunas veces no se integra completamente, sino que se rompe y se inserta la pieza deficiente que carece de alguna porción de las terminales de LB. En la región de ADN-T del pNPI106, el gen de GUS está presente en la posición más cercana al sitio de LB. Consecuentemente, se considera que debido a la integración errónea en la introducción de genes, el gen de GUS se integra en el cromosoma en una condición en la cual el gen de GUS se rompe en piezas y se pierde su propia función, o el gen de GUS no se inserta totalmente en el mismo, de manera que el gen de GUS no se expresa en estos brotes y la actividad del mismo no se observa. La fotografía del brote No. 2 y No. 8 después de un mes de cultivo, se muestra en las Figuras 11 y 12. Con respecto al crecimiento de la hoja dei brote No. 8 y sometido a la prueba para resistencia a la canamicina presente, el cultivo se continuó adicionalmente después de la prueba. Cinco brotes adventicios se obtuvieron de esta hoja y todos fueron sin ESPs. B. Análisis de PCR. En los brotes Nos. 1 a 9 en la Tabla 1, después de que se observó la capacidad de formación de ESP, se llevó a cabo el análisis de PCR en la misma forma que en el paso IV-B del Ejemplo 1 para examinar además la presencia del gen de ipt en el cromosoma, siempre y cuando el par de iniciadores que se diseñaron estén unidos al gen NPTII y el gen de GUS se usaron respectivamente además de los iniciadores usados en el paso IV-B del Ejemplo 1. En el caso en que se usaran estos iniciadores, cuando el Ac y el gen de ipt insertados en el mismo (complejo de ?c-gen de ipt) se extirparon de la región de ADN-T del pNPI106, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb en el PCR. Consecuentemente, la extirpación del complejo de /Ac-gen de ipt del ADN se pueden detectar usando eta amplificación como un índice. Los resultados del análisis de PCR en el brote No. 8, se muestran en la Fig. 13, en la cual los valores indicados en el lado izquierdo son iguales que aquellos mostrados en la Figura 6. Como es evidente a partir de los resultados, en el ADN cromosomal extraído del brote No. 8, se observó la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb que prueba la extirpación del complejo de Ac-gen de ipt, mientras que no se observa la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb que prueba la presencia del gen de ipt. Esto significa que el gen de ipt se extirpa del ADN cromosomal de este brote junto con el Ac y desaparece. Por otro lado, con respeto a los brotes Nos. 1 a 7 y 9, la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb no se detectó en ninguna muestra de ADN cromosomal del mismo, mientras que se detectó la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb en todas las muestras de ADN cromosomal de los mismos. Consecuentemente, se considera que en estos brotes, el gen de ipt está aún presente en el ADN cromosomal junto con el Ac. EJEMPLO COMPARATIVO 2 En el cultivo de hoja infectada con A. tumefaciens en el paso II-A del Ejemplo 2, se separaron los 3 sin ESPs rediferenciadas junto con el ESPs, y se sometieron a la prueba para resistencia de canamicina, la prueba para actividad de GUS, observación visual después de 1 mes de cultivo y análisis de PCR en la misma forma que en II del Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los brotes obtenidos a partir de esto sin-ESPs no tienen ni resistencia a la canamicina, la actividad de GUS y capacidad de formar ESP. Además, la amplificación de los fragmentos de ADN de aproximadamente 800 pb y aproximadamente 3 kb no se detectaron en el análisis de PCR. EJEMPLO 3 Además, el cultivo de las 63 líneas de ESP separadas en el Ejemplo 2, fueron continuas en medio de cultivo de agar MS sin hormona. Aproximadamente dos meses después de la separación, un total de siete brotes Nos. 13-1 a 13-3 y 14-1 a 14-4 que fueron brotes normales capaces de identificarse visualmente, es decir, que exhibió el dominio apical se obtuvieron de las 2 líneas de ESP. Estos botes se separaron para transplantarse en el medio de cultivo que tiene la composición mencionada antes, entonces se extendieron y formaron raíces normalmente. De estos, los individuos obtenidos de los brotes Nos. 13-1 y 14-1 se sometieron al análisis de PCR en la misma forma que en el paso 1I-B del Ejemplo 2. Como resultado, no se observó la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb en ninguno de los brotes Nos. 13-1 ni 14-1. Mientras, la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb se observó en ambos de estos brotes. Por lo tanto se determinó que el gen de ipt se extirpó del ADN cromosomal de estos individuos junto con el Ac y desaparición. Los resultados se muestran en la Figura 14, en la cual ios valores indicados en el lado izquierdo son iguales a aquellos mostrados en la Figura 6. Además, la expresión del gen de GUS se detectó en todos los individuos obtenidos de los siete brotes. La Figura 15, muestra el estado de un brote normal diferenciado de un ESP. EJEMPLO 4 La hoja obtenida de un brote que se muestra como brote No. 7 en la Tabla 1 entre las 9 raíces seleccionadas en el Ejemplo 2, se cultivó en medio de cultivo de agar MS sin hormonas durante aproximadamente 1 mes. Un brote normal se seleccionó visualmente y se separó de 6 brotes adventicios que se rediferenciaron de la hoja cultivada. Este brote normal se transplantó en un medio de cultivo de la composición mencionada antes, entonces se obtuvo un individuo normal extendido y con raíces formadas. Además, este individuo se sometió a análisis de PCR en la misma forma que en el paso II-B del Ejemplo 2, y sobre la base de la desaparición del fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb y la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb, se determinó que el gen de ipt se ha extirpado del ADN cromosomal junto con el Ac y desapareció. Los resultados de muestran en la Figura 16, en los cuales los valores indicados en el lado izquierdo son iguales que aquellos mostrados en la Figura 6. Además, en los mismos individuos, también se detectó la expresión del gen de GUS. EJ EM PLO 5 1. Separación de un sistema de recombinación especifico para sitio (sistema pSR D de levadura . La levadura (Zygosaccharomyces rouxii (obtenido del I n stitute for Fermentation)) se inoculó en 5 ml de medio de cultivo líquido YPAD (conteniendo 10 g/litro de extracto de levadura, 20 g/litro de polipeptona, 0.4 g/litro de adenina y 20 g/litro de glucosa), y se cultivó a 30°C durante 24 horas. La solución del cultivo se centrifugó a 6,900 x g durante 3 minutos a 20°C para recoger las células (de aquí en adelante, las células se recogieron bajo las mismas condiciones) . Las células obtenidas se suspendieron en 2 ml de una solución que comprende Tris- HCl 0.2M (pH 8.0) y 5 % v/v de mercaptoetanol. La suspensión de células se dejó reposar a 25°C durante 30 minutos mientras que se agitó suavemente algunas veces y se recogieron las células. Además, las células recogidas se suspendieron en 1 ml de una solución (pH 6.8) conteniendo 2.5 mg/ml de Zaimolyeis-20T (obtenido de SEIKAGAKU CORPORATION), 10 % p/v de sorbitol y 5% p/v de KPO4. La suspensión se dejó reposar a 30°C durante 90 minutos y se recentrifugó para recoger de nuevo las células. Las células recogidas se resuspendieron en 1 ml de una solución que contiene NaCI 0.2 M, se añadieron EDTA 0.1 M, 5% p/v de SDS, Tris-HCl 50 mM (pH 8.5) y Proteinasa K para llegar a 20 mg/ml de la misma. La solución mezclada se dejó reposar a 60°C durante 1 hora y se regresó a temperatura ambiente y se extrajo con una mezcla de fenol y cloroformo y después con cloroformo para purificarla. El sobrenadante así obtenido, se añadió en un volumen igual de isopropanol para precipitar ADN cromosomal y plásmido pSR1. La mezcla se centrifugó a 6,900 x g durante 10 minutos a 4°C para recoger el ADN y el ADN recogido se lavó con 70% v/v de etanol, después se secó a vacío y se disolvió en 100 µl de TE. Usando el ADN así extraído (la mezcla del ADN cromosomal y el plásmido pSR1) como un molde, solo un sistema de recombinación específico para un sitio que estuvo presente en el plásmido pSR1 (de aquí en adelante denominado como "sistema de pSR1") se amplificó por el método de PCR. El sistema de pSR1 consiste de un gen R que es un gen de recombinasa y una secuencia de recombinación Rs y sus secuencias de ADN ya se han determinado (H. Araki y otros. J. Mol. Biol., vol. 182, p. 191, 1985). En la presente invención, con el fin de amplificar el gen R, se usaron para usarse, un iniciador en el cual se añadió un sitio de endonucleasa de restricción de Xbal a una posición 5' de 22 bases, a saber, 5,596a - 5,617a bases en la secuencia del plásmido pSR1 (5'- CCTCTAGAATGCAATTGACCAAGGATACTG-3') y un iniciador en el cual se añadió el sitio de endonucleasa de restricción Sacl a la posición 5' de 22 bases, a saber, 4,126a - 4,147a bases en las secuencias del plásmido pSR1 (5'- CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3'). Por otro lado, con el fin de amplificar Rs, se sintetizaron para usarse dos pares de iniciadores, comprendiendo cada uno 30 bases (un total de cuatro tipos). Es decir, un par estuvo compuesto de un iniciador en el cual las tres bases 287a-316a de la secuencia del plásmido pSR1. se reemplazaron y se introdujo un sitio de endonucleasa de restricción Ssel (5'-AGGATTGAGCTATGGACGGGAATCCTGCA-3') y un iniciador en el cual las cuatro bases 690a-719a de la secuencia del plásmido pSR1 se reemplazaron y se introdujeron el sitio de endonucleasa de restricción Hindlll y el sitio de endonucieasa de restricción Xhol (5'-CAACTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3'). El Rs que será amplificado con este iniciador establecido se llamó "Rs1". Otro par se constituyó de un iniciador en el cual las tres bases 287a-316a de la secuencia del plásmido pSR1 se reemplazaron y se introdujeron un sitio de endonucleasa de restricción Xhol y un sitio de endonucleasa de restricción EcoRI (5'-AGGATTGAGCTACTCGAGGGGAATTCTGGA-3') y un iniciador en el cual las cinco bases de 688a a 717a de la secuencia del plásmido pSR1 se reemplazaron y se introdujeron en el sitio de endonucleasa de resctricción Ssel (5'- ACTGGACCAATCCCTGCAGGTCGTAGTCAA-3'). El Rs para amplificarse con este iniciador establecido se llamó "RS2". Con el fin de amplificar el gen R y los Rs's, se añadió 1 µl de la solución de ADN extraída a cada 50 µl de la solución mezclada usada en el paso IV-B del Ejemplo 1 conteniendo 0.2 µM de cada iniciador establecido respectivamente. Un ciclo de calentamiento en tres partes, a saber a 95°C durante 30 segundos, a 55°C durante 30 segundos y a 72°C durante 1.5 minutos se repitió en la mezcla durante un total de 30 veces. La mezcla de reacción así obtenida se analizó mediante electrólisis de gel de agarosa para confirmar la amplificación del gen R y los Rs's. II. Construcción de un vector El Rs1 amplificado por el método de PCR, se digirió con endonucleasas de restricción Psfl y Xhol, y se obtuvo un plásmido pNPI126 insertando este Rs1 en los sitios de endonucleasa de restricción Psfl-Xftol de pSL1180 (obtenido de Pharmacia Biotech Co.). Subsecuentemente, con el fin de eliminar el sitio de endonucleasa de restricción EcoRI y el sitio de endonucleasa de restricción Hindlll de pHSG398, la digestión de estas endonucleasas de restricción, cambiando las terminaciones digeridas en terminaciones de extremos despuntados con polimerasa I T4 (subunidad grande) y las ligaduras de las terminaciones de extremos despuntados se repitieron en secuencia. En esta forma, se obtuvo el plásmido pNPI121 con estos sitios de endonucleasa de restricción eliminados. Se produjo el plásmido pnPI127 digiriendo el Rs2 amplificado por el método PCR con las endonucleasas de restricción X?oI u Psfl e insertando este Rs2 en los sitios de endonucleasa de restricción Sall-Pstl del plásmido pNPI121. El plásmido pNPH28 se obtuvo separando Rs1 de pnPI126 con las endonucleasas de restricción Smal y Spel e insertando este fragmento en los sitios de endonucleasas de restricción Smal-X£>al del ?NPI127. El gen R amplificado por el método PCR se digirió con las endonucleasas de restricción Xbal y Sacl y se insertó en los sitios de endonucleasas de restricción Xbal-Sacl de pHSG398. El plásmido así obtenido se designó pNPI124. Después pBI221 (obtenido de Clontech Co.) se digirió con la endonucleasa de restricción Psfl. Las terminaciones digeridas se cambiaron a terminaciones de extremos despuntados y después se ligaron en la manera descrita antes. Por lo tanto, se obtuvo el plásmido pNPI111 con los sitios de endonucleasas de restricción Ssel y Psfl eliminados. Después, el gen R separado del pNPI124 con las endonucleasas de restricción Xbal y Sacl se insertaron en los sitios de endonucleasas de restricción Xbal-Sacl del pNP1111 reemplazando el gen de GUS para producir el plásmido pNPM25. Además, un promotor 35S del virus de mosaico de coliflor, el gen R ligado al promotor y una señal de poliadenilación de sintetasa de nopalina, se separaron con las endonucleasas de restricción Hindlll y EcoR] y se insertaron en los sitios de endonucleasas de restricción Hindlll-EcoRl del pNPI128 para obtener el plásmido pNPI129. pNPI101 se digirió con la endonucleasa de restricción Smal y un ligador de Hind 5'-fosforilado (obtenido de Takara Shuzo Co., Ltd.) se insertó en el sitio de digestión para obtener el plásmido pNPI122. Es decir, pNPI122 es uno en el cual el sitio de endonucleasa de restricción Smal del pNPI101 se reemplazó con el sitio de endonucleasa de restricción Hindlll. Además, el pNPI122 se digirió con la endonucleasa de restricción Psfl y las terminaciones digeridas se cambiaron a terminaciones de extremos despuntados y se ligaron para producir el plásmido pNPH23 con los sitios de endonucleasas de restricción Ssel y Psfl eliminados. De este plásmido pNPI123, un promotor 35S del virus de mosaico de coliflor y gen de ipt se ligaron al promotor en donde se cortaron con la endonucleasa de restricción Hindlll y se insertaron en el sitio de la endonucleasa de restricción Hindlll del pNPI129 para obtener el plásmido pNPI130. El vector deseado se obtuvo separando el fragmento conteniendo el gen de ipt y el gen R, los promotores 35S del virus de mosaico de coliflor ligado a ellos respectivamente y los Rs's presentes en ambas terminales de estos genes con la endonucleasa de restricción Psfl e insertando este fragmento en el sitio de endonucleasa de restricción Ssel del pBI121. El plásmido así obtenido se designó pNPI132. Este plásmido pNPI132 también se introdujo en la cepa de E. coli JM109, y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (pNPH32) bajo el No. de Depósito FERM BP-5065. La estrategia para construir el plásmido pNPM32 se muestra esquemáticamente en las Figuras 17-19. El mapa de endonucleasa de restricción de la región de ADN-T del mismo se muestra en la Figura 20. En las Figuras 17 a 19 y 20, un triángulo punteado indica la secuencia Rs de recombinación derivada del piásmido pSR1 de levadura y la dirección de esta secuencia. Otros símbolos son los mismos que aquellos mostrados en las Figuras 2 a 5. Como es evidente a partir de la Figura 20, el plásmido pNPI132, al igual que el plásmido pNPI106, tiene el gen de ipt como el gen marcador seleccionable y el gen NPTII y el gen de GUS como modelos del gen deseado en la región de ADN-T. Sin embargo, en este caso, la región entre las dos secuencias de recombinación Rs's del sistema pSR1, se comporta como el elemento de ADN removible. Por lo tanto, el gen de ipt se inserta de manera que se mantiene por las dos mismas secuencias de recombinación dirigidas. III. Introducción de pNPH32 en un tabaco y análisis del tabaco en el cual se ha introducido el gen En la misma manera que en los pasos II y III del Ejemplo 1, el plásmido pNPI132 se introduce en la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y los discos de hoja de un tabaco (Nicotina tabacum cv. SR1) se infectaron con este A. tumefaciens. Después, las hojas infectadas se cultivaron en medio de cultivo de agar MS sin hormona conteniendo 50 mg/litro de acetosiringona y después en medio de cultivo de agar MS sin hormona conteniendo 500 mg/litro de carbenicilina. Un mes después, las hojas cultivadas se transplantaron en el medio de cultivo de la misma composición y el cultivo se continuo además durante 1 mes. Después, se separaron 48 líneas de ESP. Las líneas de ESP se transplantaron de nuevo en el medio de cultivo en la misma composición y el cultivo se continuo adicionalmente. Aproximadamente un mes después (a saber, aproximadamente 3 meses después de la infección con A. tumefaciens), los brotes que fueron visualmente detectables por tener una morfología normal se generaron de siete de las 40 líneas de ESP. Estos brotes se separaron y se transplantaron en el medio de cultivo de la misma composición y después se pudieron obtener diez individuos normales. Estos individuos se sometieron al análisis de PCT en la misma forma que en el paso II-B del Ejemplo 2, siempre y cuando se usan un par de iniciadores para detección del gen de GUS además de los iniciadores usados en el paso II-B del Ejemplo 2. Conduciendo PCR usando estos iniciadores, un fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb se amplificó cuando el gen de ipt estuvo presente; un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb se amplificó cuando el gen de ipt se extirpó de la región de ADN-T del plásmido pNPH32 mediante la extirpación de la porción mantenida por Rs's (estos resultados son los mismos que en el análisis del paso TT- B en el Ejemplo 2); y se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb cuando estuvo presente el gen de GUS. Los resultados se muestran en las Figuras 21-23 y la Tabla 2. En las Figuras 21-23, los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que aquellos mostrados en la Figura 6. TABLA 2 Resultados del análisis de un gen transgénico en un tabaco en el cual el gen se introdujo con el vector pNPI132 Línea ESP Planta re ipt re GUS No. individual 800 pb 3 kb 1.7 kb No. 15 1 2 16 1 17 1 18 1 19 1 2 20 1 2 21 1 Notas: + indica que el fragmento de ADN correspondiente está amplificado y - indica que no está amplificado. Como es evidente de la Tabla 2, la presencia del gen de ¡pt que fue el gen marcador seleccionable, no se detectó en ninguno de los cromosomas de los individuos que se seleccionaron simplemente por la observación visual de su morfología y en su lugar, se detectó la amplificación del fragmento de ADN que indicó la extirpación del gen de ipt en todos los individuos. Por otro lado, se examinó la resistencia a la canamicina usando los botones terminales de individuos que se obtuvieron de sin-ESPs diferenciando casi simultáneamente con las 48 líneas ESP y mostraron elongación y formación de raíces normales con el uso de un medio de agar MS sin hormona conteniendo 200 mg/l de canamicina. Como resultado, se encontró que dos de 16 individuos tienen resistencia a la canamicina. Subsecuentemente, estos individuos resistentes a la canamicina se examinaron adicionalmente sometiéndolos a análisis de PCR junto con tres individuos seleccionados entre 14 individuos sensibles a la canamicina en la misma manera que se empleó para individuos obtenidos de ESPs. La Figura 24 muestra los resultados en donde los valores indicados en el lado izquierdo son iguales que aquellos mostrados en la Figura 6. Como muestra claramente la Figura 24, cada uno de los dos individuos resistentes a la canamicina exhibieron la amplificación de un fragmento de ADN, lo cual indica la extirpación de una región que contiene el gen de ipt y se mantuvo por Rs's y la presencia del gen de GUS. Por lo tanto, se probó que los genes originados en pNP±132 se ha integrado en estos cromosomas. En contraste, no se observó ninguna amplificación en los tres individuos sensibles a la canamicina. Además, ninguno de estos individuos (a saber, ni los individuos resistentes a la canamicina y los individuos sensibles a la canamicina) mostró la amplificación de un fragmento de ADN indicando la presencia del gen de ipt. Se supuso que estos individuos resistentes a la canamicina obtenidos de una cepa que carece de una capacidad de formar ESPs al igual que los individuos sensibles a la canamicina, dirigidos en células en los cromosomas de los cuales pNPI132 no ha sido introducido en la infección con A. tumefaciens. Basado en esta suposición, es posible que los genes que se originan en este vector estén contenidos en los cromosomas. Además, no es razonable que los individuos que carecieron del gen de ipt pero que estuvieron contenidos en el gen NPTII (como se indicó por el hecho de que estos individuos fueron resistentes a la canamicina) y el gen de GUS cada uno en la forma completa en ios cromosomas, aparecieron en dicha frecuencia considerando todos estos genes originados en el mismo vector. A saber, es razonable concluir que, en estos individuos resistentes a la canamicina, se introdujo una vez pNPI132 en los cromosomas. Es decir, se calcula que la región de ADN-T de pNPI132 se introdujo una vez en el cromosoma debido a la infección con A. tumefaciens, pero la función excesivamente eficiente del sistema pSR1 usado para este vector indujo la extirpación del gen de ipt antes de la formación de ESPs siguiendo la infección con A. tumefaciens. Como resultado, el gen NPT1I y el gen de GUS permanecieron exclusivamente en el cromosoma. El hecho de que los individuos resistentes a la canamicina mostrados en el análisis de PCR, la extirpación de la región que contiene el gen de ipt y mantenido por Rs's, también apoyan este cálculo. EJEMPLO 6 I. Construcción de un vector Los genes de rol (S. Kiyokawa, Plant Physiol. vol. 104, p. 801, 1994) conteniendo ro1A, ro1B y ro1C y teniendo un tamaño total de 7.6 kb, cuyos genes se han insertado en el sitio de endonucleasa de restricción EcoRI de pBluescriptII SK+ (hecho por Toyobo Co., Ltd.), se separó un una endonucleasa de restricción EcoRl. Este fragmento se insertó en el sitio de endonucleasa de restricción EcoRI del pNPI129 para producir el plásmido pNPI700. De este plásmido pNPI700, los genes de rol, el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor, el gen R ligado al promotor y los Rs's presentes en ambas terminales de estos genes, se separaron con la endonucleasa de restricción Ssel y se insertaron en el sitio de la endonucleasa de restricción Ssel del pB1121 para obtener el plásmido deseado pNPI702. El plásmido pNP!702 se introdujo después en la cepa de E. coli JM109 y se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest como E. coli JM109 (NP1702) bajo el No. de Depósito. FERM BP-5066. La estrategia para construir el plásmido pNPI702 se muestra esquemáticamente ene la Figura 25. El mapa de endonucleasa de restricción de a región de ADN-T del mismo, se muestra en la figura 26. Los símbolos en las Figuras 25 y 26 son ¡guales que aquellas en las Figuras 2 a 5. Como es evidente de la Figura 26, el plásmido pNPl702 es similar al pNPH32, pero solo el gen marcador seleccionable se cambio de gen de ipt a los genes de rol . Los genes de rol usados para este vector están presentes en el ADN-T de A. rhizogenes en la naturaleza. Se sabe que cuando los genes de rol se introducen en células de plantas, se general raíces pilosas en el tejido de la planta y que la planta regenerada de estas raíces pilosas muestra anormalidad morfológica tal como enanismo o similares. II. Introducción de pNPI702 en un tabaco y análisis del tabaco en el cual se ha introducido el gen En la misma forma que en los pasos II y III del Ejemplo 1, el plásmido pNPI702 se introdujo en la cepa de A. tumefaciens LBA4404, y discos de hoja de tabaco se infectaron con este A. tumefaciens. El disco de hoja de tabaco así infectado se cultivó en medio de cultivo de agar MS sin hormona contiendo 50 mg/litro de acetosiringona en un lugar oscuro durante 3 días y después en medio de cultivo de agar MS sin hormona al cual se añadieron 400 mg/litro de ticarcilina. Aproximadamente 15 días después de empezar el cultivo, se observó diferenciación de las raíces pilosas. Las raíces pilosas se separaron una después de la otra, se colocaron sobre un medio de cultivo de inducción (medio de cultivo de agar MS conteniendo 0.1 mg/litro de un ácido a-naftalenacético, 2.0 mg/litro de benciladenina y 400 mg/litro de ticarcilina). Después, entre los brotes rediferenciados, se seleccionaron 18 brotes que se consideró que tenían morfología normal, y se sometieron al análisis de PCR en la misma forma que en el paso II-B del Ejemplo 2, usando los iniciadores para la detección con el fin de extirpar la región que contiene los genes de rol y mantenidos por Rs's mediante la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb (igual que los iniciadores usados en los Ejemplos 2 a 5 y Ejemplo Comparativo 2) y los iniciadores para detección de la presencia de los genes de rol mediante la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 1.1 kb. Como resultado, se confirmó que la región que contiene los genes de rol y mantenidos por Rs's se extirpó de los cromosomas de los 9 brotes. EJEMPLO 7 Usando el vector pNPI106 construido en el Ejemplo 2 anterior, un álamo híbrido (Populus sieboldii x Populus grandidentata; una planta leñosa) se sometió a introducción de genes. El tallo de la cepa Y63 del álamo híbrido (cultivado en el bosque experimental de Akita Jujo Chemicals Co., Ltd.) desarrollado en un matraz esterilizado, se cortó en una sección sin nodos de 5 mm de longitud. Después se cortó verticalmente en dos piezas para usarse como una muestra y la muestra se infectó con la cepa LBA4404 de A. tumefaciens introducida en pNPI106 en la misma manera que en el paso del Ejemplo 1. Después de la infección, la sección del tallo se colocó en un medio de cultivo de agar de MS modificado sin hormona (conteniendo 2 % p/v de sacarosa y ?.8% p/v de agar) al cual se añadieron 40 mg/litro de acetosiringona y en el mismo se cultivó durante 3 días. Subsecuentemente, se transplantó en el mismo medio pero conteniendo 500 mg de carbenicilina en lugar de acetosiringona y se cultivó adicionalmente en el mismo. El medio de cultivo de MS modificado empleado en la presente, es uno preparado combinado las concentraciones de amonio-nitrógeno y nitrato-nitrógeno del medio de cultivo de MS usual respectivamente a 10 mM y 30 mM respectivamente. Después de aproximadamente dos meses, los brotes adventicios desarrollándose en esta sección se separaron y cultivaron adicionalmente durante 2 meses. De esta forma se obtuvieron 6 líneas de ESP. Estas líneas se subcultivaron adicionalmente y aproximadamente 4 meses después, (es decir, aproximadamente 8 meses después de la infección con A. tumefaciens), se observaron brotes morfológicamente normales creciendo de los ESPs desde el primer momento. Estos brotes después se transplantaron en un medio de goma de gelana (conteniendo 2 % p/v de sacarosa y 0.3 % p/v de goma de gelana) a la cual se le añadieron 0.05 mg/litro de IBA (ácido indolbutírico) y se cultivaron en el mismo. Por lo tanto, se obtuvieron varias raíces en desarrollo de individuos normales en total de 2 líneas de EPS dentro de diez meses después de la invención con A. tumefaciens. Estos individuos se sometieron entonces al análisis de PCR en la misma forma que en el paso III del Ejemplo 5. Como resultado, el gen de ipt no se detectó de ninguno de ellos. Por otro lado, la presencia del gen de GUS se detectó en dos individuos entre ellos. Por lo tanto, se confirmó que el vector de la presente invención también trabajaría eficientemente en una planta leñosa. Incidentalmente, en los 5 individuos normales restantes, únicamente se detectó una parte del gen de GUS. Parece que, en dicho individuo, cuando el transposon Ac introducido por el vector pNPI106 se extirpó del cromosoma junto con el gen de ipt, el gen de GUS localizado en la vecindad del mismo se implicó en la extirpación y por lo tanto se rompió. La Figura 27, muestra el estado de un brote normal diferenciado de un ESP. EJEMPLO 8 El individuo normal (obtenido vía ESP) que tiene los genes introducidos en el mismo por pNPI132 en el Ejemplo 5, se sometió además a la introducción del gen con el uso del vector de la presente invención. El gen de GUS de pNPI132 se reemplazó por un gen de HPT (gen de resistencia a la higromicina). Usando el vector así obtenido (pNPI140, Figura 28), los individuos normales mencionados antes se sometieron a la introducción del gen en la misma forma que en los pasos II y III del Ejemplo 1. Por lo tanto, se obtuvieron 10 líneas de ESP 40 días después de la infección con >A. tumefaciens teniendo este vector introducido en el mismo. Estas líneas de ESP se separaron, se transplantaron en un medio de cultivo de la misma composición (medio de cultivo de agar MS sin hormona conteniendo 500 mg/litro de carbenicilina) y se cultivaron además en el mismo. Como resultado, se observó la diferenciación de brotes, con morfología visualmente normal, en una de estas líneas 20 días después (a saber, aproximadamente 2 meses después de la infección con A. tumefaciens). Uno de estos brotes normales así diferenciado, se sometió a análisis de PCR en la misma manera que en los pasos de IV-B del Ejemplo 1. La Figura 29, muestra el resultado. Se debe observar que un par de iniciadores diseñados para unirse en el gen NPTII y el gen HPT respectivamente, para detectar la extirpación de la región que contiene el gen de ipt y mantenido por Rs's del ADN cromosomal y otro par de iniciadores para detectar la presencia del gen HPT (detectado a través de la amplificación de fragmentos de ADN de aproximadamente 4 kb y aproximadamente 1 kb, respectivamente) se emplearon en la presente además de los iniciadores usados en el paso IV-B del Ejemplo 1. En la Figura 29, los valores indicados en el lado izquierdo son los mismos que aquellos mostrados en la Figura 6. Como muestra claramente la Figura 29, en el análisis de PCR, el ADN cromosomal extraído del brote mostró la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 4 kb, que indicó que el gen de ipt ha sido extirpado mediante la extirpación de la región mantenida por Rs's y la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb, lo cual indicó la presencia del gen HPT. Por otro lado, la amplificación del fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb, la cual indicó la presencia del gen de ipt, no se detectó en el mismo ADN. Estos resultados sugieren que el gen de ipt, el cual ha sido introducido una vez en el ADN cromosomal de este brote, se extirpó del mismo mediante la extirpación de la región mantenida por Rs's y por lo tanto desaparición, mientras que el gen HPT aún permaneció en el ADN. Es decir, un individuo introducido con los genes deseados (es decir, el gen NPTII y el gen de GUS) por pNPI132 además se introdujo con un gen novedoso deseado (es decir, el gen HPT) usando un vector, en donde la construcción que se refiere al gen deseado se alteró exclusivamente (es decir, el mismo gen de ipt usado como el gen marcador seleccionable) repitiendo el cultivo, la selección visual y usualmente la separación. Además, los resultados mostraron que es muy posible que el tercero, cuarto o más genes deseados podrían introducirse con el uso del mismo gen marcador seleccionable. Como es evidente a partir de los Ejemplos descritos antes, las líneas de ESP obtenidas siempre de ESP tuvieron el gen de ipt dentro de sus cromosomas como se muestra en la Figura 6. Además, los ESPs, que mostraron anormalidad morfológica notable que podrían ser identificados visualmente, exhibe resistencia a la canamicina, sin excepción por la expresión del gen NPTII que fue gen deseado como un modelo y se introdujo junto con el gen de ipt. Esto provee que dicho gen de lAM está completamente disponible como un gen marcador seleccionable para introducir un gen en una planta y que el vector de la presente invención que contiene este gen de lAM como el gen marcador seleccionable también esta disponible como un vector para introducir un gen en una planta. Cuando se introdujo un gen en un planta que usa el vector pNPII06 en el cual el gen de ipt se integró dentro del transposon Ac, un brote o similares que pierden su capacidad de formación de ESP como resultado de la desaparición del gen de ipt del cromosoma, mientras que retiene características provistas por el gen deseado (gen NPTII y/o gen de GUS), se obtuvo del tejido que formó una vez el ESP en la etapa inicial del cultivo justo después de la operación de introducción del gen, como se muestra en la Tabla 1 y Figuras 13, 14 y 16. Además, la morfología de este tejido obtenido (es decir, el brote o similares que pierden su capacidad de formación de esp) podrían identificarse visualmente como se muestra en las Figuras 15 y 27. Además, cuando éste se seleccionó, se separó y se cultivó, se obtuvo un individuo extendido y con raíces teniendo una morfología normal. Además, los tejidos que se rediferenciaron del tejido obtenido del brote que pierde su capacidad de formación de ESP también mostró morfologías normales sin tener capacidad de formación de ESP. Esto prueba que dicho brote o similares, consistió de células uniformes. También se observaron los mismos resultados cuando uno derivado del sistema de recombinación específica para sitio se usó como el elemento de ADN removible y cuando los genes de rol se usaron como el elemento lAM. Es decir, cuando se introdujo un gen en una planta usando un vector, en la cual la construcción que se refiere al transposon o el transposon y el gen de ipt de los vectores usados en los Ejemplo 1 a 4 y 7, se reemplazaron con el que se refiere al sistema de recombinación mencionada antes y/o genes de rol como se describió en los Ejemplo 5 y 6, el tejido morfológicamente normal y planta en la cual desaparición el gen de lAM de este cromosoma, mientras mantuvo el gen deseado, se obtuvo del tejido que mostró la morfología anormal inmediatamente después de la introducción del gen (Figuras 21-23, Tabla 2). Además, también es posible introducir multitudinariamente los genes deseados en el mismo individuo repitiendo los paso de introducción de genes, cultivo y selección visual usando el vector en donde la construcción que se refiere al gen deseado se altera exclusivamente mientras que se emplea el mismo gen que induce la anormalidad morfológica como el gen marcador seleccionable (Ejemplo 8, Figura 29). Consecuentemente, cuando se usa dicho vector, en el cual se usa el gen de lAM como el gen marcador seleccionable y se inserta en la posición tal que se comporta integralmente con el elemento de ADN removible, un tejido hecho solo de células en las cuales el gen deseado solo permanece en el cromosoma o similares y mantiene su función, se obtiene únicamente llevando a cabo los siguientes pasos: (1) cultivando las células justo después de la operación de introducción del gen y seleccionando visualmente un tejido morfológicamente anormal que aparece durante el cultivo, (2) cultivando adicionalmente el tejido morfológicamente anormal y seleccionando visualmente un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo. Además, una planta formada solo de dichas células, también puede obtenerse de dicho tejido morfológicamente normal. Además, cuando uno derivado del sistema de recombinación específico para sitio se usó como el elemento de ADN removible, dado que la extirpación del mismo ocurrió rápidamente y a una frecuencia muy alta, el tejido morfológicamente normal que aparece del tejido morfológicamente normal también podría detectarse rápidamente y se obtuvieron muchos individuos normales del mismo con buena eficiencia. La Tabla 3 muestra la eficiencia en la cual el individuo normal se obtuvo del tejido morfológicamente anormal cuando el transposon o un derivado del sistema de recombinación específico para sitio se usó como el elemento de ADN removible en el vector de la presente invención. TABLA 3 Diferencia en eficiencia para obtener individuos normales dependiendo de un tipo de un elemento de ADN removible.

Vector Elemento de Número de Número de ADN removible líneas de ESP líneas en las que se regeneran individuos normales Ejemplo 3 pNPH06 Ac 63 2 (7 (transposon) individuos) Ejemplo 5 pNPI132 la región 48 7 (10 mantenida por Rs's del sistema individuos) pSR1 (sis. de recombinación específica de sitio) Notas: 1. El ESP se separó después de dos meses del cultivo. 2. El brote normal puede detectarse después de cuatro meses de cultivo en el Ejemplo 3 y después de tres meses de cultivo en el Ejemplo 5. 3. Cada uno de los individuos normales mencionados antes contuvieron un gen de GUS como un modelo del gen deseado. En los Ejemplos 1 a 5, bajo las condiciones sin hormona, el tejido conteniendo las células transgénicas proliferó, diferenció el brote adventicio y regeneró la planta. Esto se atribuye presumiblemente a la acción del gen de ipt que se introdujo en el cromosoma en la célula transgénica como el gen marcador seleccionable. Es decir, por la expresión de este gen, la hormona de la planta se sobreprodujo dentro de la célula. Consecuentemente, la hormona de la planta producida en la célula que contiene el gen de ipt no solo influenció a la propia célula para diferenciar el tejido tal como el ESP o similares, sino también el tejido adyacente a la célula a algún grado, por lo que se creó el mismo estado como el dado por la adición artificial de la hormona de la planta al medio de cultivo. En el vector de la presente invención, el gen de lAM se uso como el gen marcador seleccionabie. Por lo tanto, cuando la introducción del gen se llevó a cabo en la planta usando este vector, el tejido en el cual se introdujo el gen deseado, se puede seleccionar cultivando la célula sometida al tratamiento para la introducción del gen, en un medio de cultivo común bajo condiciones comunes de cultivo sin adicionar ninguna substancia química para selección e identificando visualmente el tejido resultante morfológicamente anormal. Consecuentemente, el procedimiento se simplificó y la actividad de la célula de la planta no disminuyó durante la selección. Además, dicho gen de lAM es inherente en la planta o se introdujo en la planta por infección con bacteria o similares en la naturaleza. Por esta razón, aún si el gen de lAM se expresó dentro de la célula de la planta en la cual se introdujo el gen, su seguridad es considerablemente alta cuando se ingirió en el cuerpo humano. Además, cuando el gen de ipt se usó como el gen de lAM, el tejido que contiene la célula transgénica proliferó y diferenció el brote adventicio por la por la acción de este gen, haciendo posible eliminar la necesidad para la adición de hormonas de plantas para el medio de cultivo que generalmente se consideró indispensable para la proliferación y diferenciación en el cultivo de la célula de la planta. Además, en este vector, se usó el gen de lAM a medida que el gen marcador seleccionable se insertó en la posición de manera que se comporta integralmente con el elemento de ADN removible, por lo que el gen marcador seleccionable se removió del ADN en donde existe este gen y funciona a través de la excisión del elemento de ADN en una proporción dada después de que se introdujo el gen en la célula de la planta, y este pierde su propia función. Por lo tanto, solo el gen deseado presente en una posición del vector de manera que no se comporta integralmente con el elemento de ADN removible, permanece en el mismo ADN y mantiene la capacidad de expresar su función. Consecuentemente, en esta estructura, el vector ocasiona la introducción múltiple que se refiere al gen en cierta planta meramente cambiando la porción del gen deseado para ser introducido sin ningún cambio de estructuras del gen marcador seleccionable y los demás. Por lo tanto, la introducción múltiple se puede llevar a cabo un número o limitado de veces. Además, en este caso, la pérdida de la función del gen de lAM como el gen marcador seleccionable puede detectarse visualmente a través del cambio morfológico del tejido transgénico como en la introducción de este gen. Por lo tanto, el tejido formado solo de células en las cuales el gen deseado solo permanece en el cromosoma o similares y mantiene su función, se puede seleccionar de manera segura y fácil Como resultado, la introducción múltiple del gen se puede llevar a cabo con alta eficiencia, y la planta transgénica formada solamente de dichas células, a saber, el individuo libre de la influencia del gen marcador seleccionable y completamente libre de cualquier riesgo de salud presentado por el producto del gen marcador seleccionable se puede obtener sin tener que sufrir el paso de cruzamiento. ***Notas*** Con respecto a INDICACIONES QUE SE REFIEREN A UN MICROORGANISMO DEPOSITADO enumerado en la especificación como sigue: 1) FERM BP-5063 en la página 31, líneas 22 2) FERM BP-5064 en la página 40, línea 4 3) FERM BP-5065 en la página 53, línea 16-17 4) FERM BP-5066 en la página 59, línea 25-26 Los cuatro identificados antes con los Números de Acceso se depositaron simultáneamente en la siguiente institución depositante.

Nombre de la institución depositante: National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (Osamu Suzuki, Dr., DIRECTOR GENERAL) Dirección de la institución depositante: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 JAPÓN Fecha de depósito: 5 de abril de 1995.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un vector para introducir un gen deseado en una planta, la cual comprende dicho gen deseado, y por lo menos un gen de inducción de anormalidad morfológica como un marcador seleccionable, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es un gen de síntesis de citoquinina.
2. El vector de la reivindicación 1, en donde dicho gen de síntesis de citoquinina es un gen de ipt, isopenteniltransferasa, que está presente en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
3. Un vector para introducir un gen deseado en una célula de planta junto con un gen marcador seleccionable, en donde dicho gen marcador seleccionable expresa una vez su función en la célula de la planta, después se remueve del ADN en donde existe de acuerdo con un comportamiento de un elemento de ADN removible y la función de dicho gen marcador seleccionable desaparece y la expresión de dicho gen marcador seleccionable y la desaparición de la función del mismo se detectan mediante cambio morfológico del tejido derivado de la célula de la planta en la cual se introduce dicho gen marcador seleccionable.
4. Un vector para introducir un gen deseado en una planta, que comprende dicho gen deseado, por lo menos un gen de inducción de anormalidad morfológica como un gen marcador seleccionable y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es colocado de manera que se remueve junto con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se remueve junto con el elemento de ADN removible.
5. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica está presente dentro de dicho elemento de ADN removible.
6. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho elemento de ADN removible es un transposon.
7. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho elemento de ADN removible se deriva de un sistema de recombinación específica para sitio.
8. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se obtiene de un microorganismo de el género Agrobacterium.
9. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es un gen de síntesis de citoquinina.
10. El vector de la reivindicación 9, en donde dicho gen de síntesis de citoquinina es un gen de ipt, isopenteniltransferasa, que está presente en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
11. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es por lo menos un gen seleccionado de genes de rol.
12. El vector de la reivindicación 11, en donde dichos genes de rol son genes de rol que contienen ro1A, ro1B y ro1C, los cuales están presentes en el ADN-T de Agrobacterium rhizogenes.
13. Un método para producir una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador seleccionable, el cual comprende los siguientes pasos: (A) introducir un vector en una célula de planta, en donde dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen de inducción de anormalidad morfológica como un gen marcador seleccionable, y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se coloca de manera que se remueve junto con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se remueve junto con el elemento de ADN removible, (B) cultivar la célula de la planta obtenida en A(), detectando un tejido de planta morfológicamente anormal el cual aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente anormal, y (C) cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectando un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente normal.
14. El método de la reivindicación 13, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica está presente dentro de dicho elemento de ADN removible.
15. El método de la reivindicación 13, en donde dicho elemento de ADN removible es un transposon.
16. El método de la reivindicación 13, en donde dicho elemento de ADN removible se deriva de un sistema de recombinación específica para sitio.
17. El método de la reivindicación 13, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se obtiene de un microorganismo del género Agrobacterium.
18. El método de la reivindicación 13, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es un gen de síntesis de citoquinina.
19. el método de la reivindicación 18, en donde dicho gen de síntesis de citoquinina es un gen de ipt, ¡sopenteniltransferasa. que está presente en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
20. El método de la reivindicación 13, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es por lo menos un gen seleccionado de genes de rol.
21. El método de la reivindicación 20, en donde dichos genes de rol son genes de rol que contienen genes ro1A, ro1B y ro7C. en el cual está presente el ADN-T de Agrobacterium rhizogenes.
22. Un método para introducir por lo menos dos genes deseados es una planta, la cual comprende llevar a cabo los siguientes pasos por lo menos dos veces: (A) introducir un vector en una célula de planta, en donde dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen de inducción de anormalidad morfológica como un gen marcador seleccionable, y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se coloca de manera que se remueve junto con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se remueve junto con el elemento de ADN removible, (B) cultivar la célula de la planta obtenida en A(), detectando un tejido de planta morfológicamente anormal el cual aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente anormal, y (C) cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectando un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente normal.
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica está presente dentro de dicho elemento de ADN removible.
24. El método de la reivindicación 22, en donde dicho elemento de ADN removible es un transposon.
25. El método de la reivindicación 22, en donde dicho elemento de ADN removible se deriva de un sistema de recombinación específica para sitio.
26. El método de la reivindicación 22 , en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se obtiene de un microorganismo del género Agrobacterium.
27. El método de la reivindicación 22 , en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es un gen de síntesis de citoquinina.
28. el método de la reivindicación 27, en donde dicho gen de síntesis de citoquinina es un gen de ipt, isopenteniltransferasa , que está presente en el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
29. El método de la reivindicación 22 , en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica es por lo menos un gen seleccionado de genes de ro l .
30. El método de la reivindicación 29, en donde dichos genes de ro l son genes de ro l que contienen genes ro 1A, ro 1 B y ro 1 C, en el cual está presente el ADN-T de Agrobacterium rhizogenes.
31 . Una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador seleccionable, producido por un método, el cual comprende los siguientes pasos: (A) introducir un vector en una célula de planta, en donde dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen de inducción de anormalidad morfológica como un gen marcador seleccionable, y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se coloca de manera que se remueve junto con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se remueve junto con el elemento de ADN removible, (B) cultivar la célula de la planta obtenida en A(), detectando un tejido de planta morfológicamente anormal el cual aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente anormal , (C) cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B) , detectando un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente normal; y (D) cultivar dicho tejido morfológicamente normal para regenerar una planta.
32. Una planta que contiene dos o más genes deseados producidos por un método el cual comprende los siguientes pasos : (A) introducir un vector en una célula de planta , en donde dicho vector comprende un gen deseado, por lo menos un gen de inducción de anormalidad morfológica como un gen marcador seleccionable, y un elemento de ADN removible, en donde dicho gen de inducción de anormalidad morfológica se coloca de manera que se remueve junto con el elemento de ADN removible y en donde dicho gen deseado se coloca de manera que no se remueve junto con el elemento de ADN removible, (B) cultivar la célula de la planta obtenida en (A) , detectando un tejido de planta morfológicamente anormal el cual aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente anormal, (C) cultivar dicho tejido morfológicamente anormal seleccionado en (B), detectando un tejido morfológicamente normal que aparece durante el cultivo y seleccionando dicho tejido morfológicamente normal; (D) llevar a cabo los pasos (A) a (C ) por lo menos una vez; y (E) cultivar dicho tejido morfológicamente normal para regenerar una planta. RESU MEN Un vector para introducir un gen deseado en una planta , la cual comprende el gen deseado y, por lo menos, un gen de inducción de anormalidad morfológica (lAM) como un gen marcador, o que comprende el gen deseado, por lo menos un gen de lAM y un elemento removible. U n método para producir una planta transgénica libre de la influencia de un gen marcador. U n método para introducir multitudinariamente genes deseados en una planta.