BG62852B1 - Метод за изолиране на ловастатин - Google Patents

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за изолиране на хиполипазно активно вещество ловастатин от ферментационна хранителна среда и ще намери приложение в областта на биотехнологията.

Ловастатинът се произвежда като вторичен метаболит на фунги (плесени, гъби) Aspergillus terreus (US 4 231 938), депозирани в Американската колекция за типови култури под No АТСС 20541, АТСС 20542 и Monascus ruber, депозиран във Ферментационната изследователска институтска агенция на индустриалната наука и технология към Министерството на търговията и индустрията, Япония (DE 30 06 216 А1) под No Ferm 4822. Добре познати са и други видове микроорганизми, продуциращи ловастатин, например мутант на микроорганизъм Aspergillus terreus и Aspergillus oryzae, маркиран АТСС 74135.

Ловастатинът представлява химически Г, 2’, 6’, 7’, 8а’ -хексахидро-3,5-дихидрокси2’ ,6’ ,-диметил-8’-2”-метил-1 ’’-оксобутокси-1 нафталин енантова киселина-5-лактон (описан от Stubbs et al., 1986) и се изразява с формулата посочена в ЕР 0 033 537 А1.

Съединение I

Една активна форма на ловастатина е също киселина, която представлява химически 1,2,6,8,8а-хексахидро-Р, -дихидрокси-1 -нафталин енантова киселина (описана от Alberts et al., 1980) и се изразява с формулата (посочена в ЕР 0 022 478 А1)

Съединение И

Лактонната форма на ловастатина се използва като агент за понижаване нивото на холестерола в кръвта (Scott М. G. and Vega G. L., 1985). Той инхибира биосинтезите на 3.5-диокси-3-метилвалерианова киселина чрез инхибиране на З-хидрокси-З-метилглутарил А редуктазния коензим (HMG-CoA reductase, Е. С. 1.1.1.34) (Zubay et al., 1984).

Предшестващо състояние на техниката

След завършената ферментация, ловастатин се подава в хранителната среда в лактонна форма (съединение I) и в кисела форма (съединение II). В изолационния процес, както е описан в ЕР 0 033 536 А2, ловастатинът се екстрахира от хранителната среда с етилацетат. Екстрактът се концентрира чрез вакуумна дестилация. Тъй като ловастатина се представя в лактонна форма, както и в кисела форма и само лактонът представлява търговски интерес, киселата форма трябва да се превърне в лактон.

Лактонизацията се осъществява чрез дефлегмация на концентрата в толуол при 106°С за 2 h. След като лактонизацията завърши, разтворът се концентрира до малък обем. Чиста субстанция се получава чрез пречистване на концентрата през колона, запълнена със силикагел, в присъствие на разтворители, като етилацетат или п-хексан. Сборните фракции отново се концентрират под вакуум и тогава чистият ловастатин кристализира в лактонна форма.

Поради множество сложни стъпки на процедурата и тежки условия, използвани при изолирането, добивите на ловастатин са обикновено ниски. Различните разтворители, които се използват, като бензен, толуен, ацетонитрил или етилацетат, проявяват отчасти токсичност. След работа с тези разтворители здравето на участващите лица е изложено на опасност, а има проблеми и с опазване на околната среда.

Техническа същност на изобретението

Предмет на настоящото изобретение е преодоляване посочените недостатъци на състоянието на техниката и създаване на метод за изолиране на ловастатин по ефикасен и икономичен начин. В допълнение би следвало да се обърне внимание на здравните аспекти за включените в изолирането работници и за опазване на околната среда.

Като резултат от обширното проучване, довело до настоящото изобретение, настоящите изобретатели откриха, че ловастатинът може да бъде изолиран лесно чрез екстрахиране на ловастатин от проба с бутилацетат, концентриране на разтвора и извличането му чрез кристализация.

В предпочитано изпълнение бе осъществена концентрация на разтвора при понижено налягане. В следващо изпълнение концентрация се осъществи при температура около 40°С със или без понижено налягане.

В друго предпочитано изпълнение пробата от ловастатин се извлича от микроорганизми, за предпочитане фунги, позволяващи продуциране на ловастатин. В този случай пробата може да бъде ферментационната среда, в която микроорганизма или съответно фунгите са израсли, мицела на фунгите или филтрата.

Фунгите, които могат да бъдат използвани не са ограничени и които и да са фунги, способни да продуцират ловастатин могат да бъдат използвани, като се предпочитат тези, принадлежащи към рода Aspergillus, по-точно Aspergillus oryzae или Aspergillus terreus.

В още едно предпочитано изпълнение фунгите са Aspergillus terreus (ATCC 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

Съгласно метода на настоящото изобретение ловастатин може да бъде получен единствено в лактонна форма.

Беше открито, че използваният разтво рител, т.е. бутилацетатът, осигурява признаци, позволяващи да се постигне тази цел, а именно - при лактонизационния метод се отделя вода и тя трябва да бъде отстранена от реакционната среда, тъй като бутилацетатът има повисока температура на кипене и не образува ацеотропни смеси с вода при дадените условия. Това именно позволява всичката вода, образувана през лактонизационния процес да бъде отстранена.

Чрез метода съгласно настоящото изобретение става възможно да бъде съкратено времето за изолиране на ловастатина. Тъй като бутилацетата може да бъде използван, за да екстрахира ловастатина от проба и в същото време може да бъде оползотворен за извършване на лактонизацията, токсичните ефекти от другите разтворители могат да бъдат избегнати.

Метода може да бъде индустриално възпроизведен с крайни добиви около 60 %, независимо дали ловастатина е бил продуциран чрез микроорганизми междуклетъчно или външноклетъчно, в лактонна форма или в кисела форма.

Изолираната субстанция е същата, както субстанцията, изолирана съгласно методите, известни от състоянието на техниката. Структурата беше потвърдена от IR спектроскопия (фиг. 1), масспектроскопия (фиг, 2), NMR (ядрено-магнитен резонанс) (фиг. 3) и UV (ултравиолетова) спектроскопия (фиг. 4).

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Ферментационна хрнителна среда (1000 ml), получена чрез ферментация на Aspergillus terreus (ATCC 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135) и имаща pH стойност от 4,8, възраст от 120 h и съдържание на ловастатин 300 mg/ml (лактон + киселина) бе подкислена със НС1 (36 %) до pH от 3 - 5. След това ферментационната среда бе охладена под 20°С, бе добавен бутилацетат (500 ml) и тя бе екстрахирана за 4 h при тази температура. След завършване на екстракцията, ферментационната среда бе центрофугирана и водната и органичната фази бяха разделени.

Мицела и водната фаза бяха бракувани (отстранени) и органичната фаза бе обработвана по-нататък. Тя бе концентрирана чрез вакуумдестилация при температура около

40°С до обем от 50 ml. Едновременно с концентрирането бе извършен така добре и процеса на лактонизация. След това концентратът бе охладен до температура под 20°С и оставен да стои няколко часа, така че ловастатина да 5 кристализира.

Полученият суров продукт бе рекристализиран. Бе получен ловастатин (170 mg) в лактонна форма, имащ чистота около 90 %.

Пример 2. Ферментационна хранителна 10 среда (1000 ml), получена чрез ферментацията на Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135) и имаща pH стойност от 4,73, възраст от 120 h и съдържание на ловастатин от 190 mg/ml (лактон + 15 киселина) във филтрата и 15 mg/ml в мицела, бе подкислена с НС1 (36 %) до pH 3 - 5. Хранителната среда бе филтрирана върху Oliver филтър. Мицела бе бракуван, филтрата бе охладен до температура под 20°С и беше 20 добавен бутилацетат в количество равно на половината от обема на филтрата. Той бе екстрахиран за 1 h. След това бяха извършени процедурите, както в пример 1.

Бе получен ловастатин (79 mg) в лак- 25 тонна форма с чистота около 90 %.

Пример 3. Ферментационна хранителна среда (1000 ml), получена чрез ферментация на Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135) и имаща pH 30 стойност 4,78, възраст от 120 h, и съдържание на ловастатин от 5 mg/ml (лактон + киселина) във филтрата и 300 mg/ml в мицела бе подкислена с НС1 (36 %) до pH от 3 - 5 и центрофугирана. Филтратът бе бракуван, а чети- 35 рикратно намален (спрямо мицела) обем от бутилацетат бе добавен към мицела и той бе охладен под 20°С, след което бе екстрахиран за 4 h. Екстракцията бе последвана от центрофугиране. Мицела бе бракуван и филтрата от него обработен, както в пример 1.

Получен бе ловастатин (90 mg) в лактонна форма с чистота около 90 %.

Claims (5)

1. Патентни претенции

   1. Метод за изолиране на ловастатин чрез екстрахиране с бутилацетат от ферметационна хранителна среда, мицел или филтрат от микроорганизъм, концентриране под вакуум и кристализиране, характеризиращ се с това, че се осъществява директно от ферментационната хранителна среда, мицела или филтрата от микроорганизъм и, че филтратът първо се подкислява и след това екстрахирането с бутилацетат се извършва директно.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че микроорганизмите, позволяващи продуциране на ловастатин са фунги.
3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че фунгите принадлежат към рода Aspergillus.
4. 4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че фунгите принадлежат към рода Aspergillus terreus или Aspergillus oryzae.
5. 5. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че фунгите са Aspergillus terreus (АТСС 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС 74135).