BG61081B1

BG61081B1 - МУТАНТНИ МИКРОБИАЛНИ α-АМИЛАЗИ С ПОВИШЕНА ТЕРМИЧНА, КИСЕЛИННА И/ИЛИ АЛКАЛНА УСТОЙЧИВОСТ

Info

Publication number: BG61081B1
Application number: BG93814A
Authority: BG
Inventors: Wilhelmus J Quax; Yves Laroche; Adrianus W Vollebregt; Patrick Stanssens; Marc Lauwereys
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1991-02-11
Publication date: 1996-10-31
Also published as: DD301620A9; FI103285B1; FI910907A0; EP0410498A3; KR0165550B1; US5364782A; IE902369L; WO1991000353A2; FI103285B; CN1050220A; KR920701449A; BG93814A; EP0410498B1; PT94560A; DE69032360T2; ES2117625T3; PT94560B; DE69032360D1; JPH04500756A; CA2030554A1

Abstract

Мутантните α-амилази намират приложение за разграждане на нишесте в текстилния дизайн. Термостабилните и киселиноустойчивите α-амилази се получават като експресионни продукти на α-амилазни гени по генно-инженерен път. Изолирани са от микроорганизми, принадлежащи към род Bacillus. За получаването на хетеродуплексна ДНК се използват както химични, така и мута- генни методи.

Description

Настоящото изобретение се отнася до 5 ДНК молекули, включващи ДНК последователности, кодиращи ензими с α-амилазна активност. Характерно за α-амилазите е, че са подходящи за използване при декориране на текстил и други индустриални процеси, осно- 10 вани на разграждане на нишестето. Те имат повишена термична, киселинна и/или алкална стабилност, което ги прави подходящи за приложение при условия на процеса, при които преди това е било невъзможно. 15

Нишестето представлява смес от амилоза /15 - 30% об./об./ и амилопектин /7085% об./об./. Амилозата се състои от линейни вериги ота-1,4-свързани глюкозни единици, притежаващи молекулно тегло от около 60 000 20 до около 800 000. Амилопектинът е разклонен полимер, съдържащ а-1,6 точки на разклонение през 24-30 глюкозни единици, с молекулно тегло около 100 милиона.

Захарите от нишесте, под формата на 25 концентрирани декстрозни сиропи, понастоящем се продуцират чрез ензимно катализиран процес, включващ: 1/ втечняване на нишесте с α-амилаза до декстрини, притежаващи степен на полимеризация от около 7 до 10, 30 и 2/озахаряване на полученото втечнено нишесте (т.е. нишестен хидролизат) с амилоглюкозидаза (наричана също глюкоамилаза или AG). Полученият глюкозен сироп е с високо глюкозно съдържание. Повечето от глюкозни- 35 те сиропи, които се получават по промишлен път, са предимно изомеризирани по ензимен начин до декстрозо/фруктозна смес, известна като изосироп.

α-амилазата /ЕС 3.2.1.1../ хидролизира нишестето, глюкогена и сходните полизахариди чрез разглеждане на вътрешните а- 1,4-глюкозидни връзки случайно. Този ензим е приложим в захарната, алкохолната, пивоварната и текстилната промишленост, α-амилазите се изолират от голям брой бактериални, плесенни, растителни и животински източници. Най-значимите в индустриално отношение α-амилази са, изолираните от Bacilli.

В първия етап от процеса за разграждане на нишестето, последното внимателно се желатинира чрез нагряване при относително висока температура /до 110°С/. Желатинираното нишесте се втечнява и декстринира чрез термостабилна α-амилаза чрез двустадиен процес. Главните променливи величини в процеса са концентрацията на нишестето, дозата на α-амилазата, температурата и pH. По време на процеса на втечняване и декстриниране, променливите следва да се поддържат в рамките на тесни интервали, за да се постигне добра степен на конверсия, иначе могат да възникват редица сериозни проблеми при филтрацията. Вж. напр. L.E.Coker and Venkata Subramanian in: Biotechnology, p.165-171, Ed.Cheremisinoff P.N., P.B.Quellette, Technicom Publ, Corp.Lancaster Renn 1985.

Един от проблемите, които възникват най-често, е регулирането на температурата в началния етап на процеса на разграждане: пренагряването често причинява денатурация на α-амилазата, така че крайното втечняване е недостатъчно. Един от начините да се избегне това е употребата на термостабилни а-амилази.

Към настоящето да се добавят калциеви йони или амфотерни вещества ЕР 0189838, но този разтвор е незадоволителен.

Следователно от съществен интерес е производството на α-амилази с повишена термостабилност.

Известно е, че в ЕР 057976 се описва изолиране на ген, кодиращ термостабилна аамилаза, от B.Stearothermophilus. Генът е клониран в плазмид, съдържащ начало на репликация от Bacillus или от E.coli. Така полученият химерен плазмид се използва за получаване на а-амилаза. α-амилазният ген се изолира и използва без следващи модификации.

Известно е, че в ЕР 0134048 се описва метод за повишено промишлено производство интерална, на α-амилаза, чрез клониране и експресия на един или повече α-амилазни гени в промишлени щамове Bacillus.

Описани са в ЕР 252666 химерни а-амилази с обща формула Q-R-L в която Q е Nкраен полипептид с 55 до 60 аминокиселинни остатъка, - е 75% хомоложен на 37-те N-крайни остатъка на α-амилаза от B.Amyloliquefacien, R е даден полипептид и L е С-краен полипептид с 390 до 400 аминокиселинни остатъци,- е най-малко 75% хомоложен на 395-те С крайни остатъка на α-амилаза от B.Licheniformis.

Cray et al. /J.Bacteriol., 1986,166, 635/ описват химерни α-амилази, формирани от

NH₂ - крайни части от α-амилаза на Вас.

Stearothermophilus и α-амилаза от СООН - крайни части наа-амилаза от B.licheniformis. Повечето от хибридните ензимни молекули са по-малко стабилни от аналогичните родителски от ензими тип. Нещо повече- нито една от хибридните молекули не показва повишаване на стабилността.

Нито един от посочените по-горе източници не описва заместване на една аминокиселина за получаване на нови а-амилази.

В ЕР-А-0285123 е описан метод за цялостен мутагенезис на последователност от аминокиселини. Като пример, се описва мутагенезис на Stearothermophilus. Освен това, се предполага, че този метод може да бъде използван за получаване на мутант на В. Stearothermophilus с повишена стабилност, но не са приведени примери.

Настоящото изобретение обхваща мутантни α-амилази и метод за получаването им. Тези мутантни α-амилази се отличават по наймалко една аминокиселина от природния тип ензим. Нещо повече, ДНК-те, кодиращи тези мутанти, векторите, кодиращи тези ДНК в експресионните форми и клетките-гостоприемници, съдържащи тези вектори, също влизат в обхвата на изобретението.

В един от аспектите на изобретението е разкрита случайна мутагенеза на клониран аамилазен ген. Мутантните гени са експресирани в подходящи гостоприемници, използвайки подходяща векторна система.

Според друг аспект на изобретението е разкрития скрининг метод за получаване на α-амилазите, както и приложението им. Тези методи обезпечават по-термостабилни и покиселиноустойчиви α-амилази. По-нататък методът се използва с незначителни изменена за получаване на алкалноустойчиви -амилази. Експресионните продукти от тези клонове са изолирани и пречистени.

При друг аспект на изобретението се предвижда α-амилазите да са с повишена термостабилност, като освен това се редуцират проблемите с филтрацията при условията на разграждане на нишестето.

α-амилазите с повишена стабилност редуцират формирането на нежелани странични продукти, такива като малтулоза, като същевременно те увеличават количеството на киселините, необходими за внасяне преди ре акцията с амилоглюкозидаза. Новият а-амилазен процес подобрява свойствата термостабилност и киселиноустойчивост по отделно или едновременно и двете- термостабилност и киселиноустойчивост.

В друг аспект на изобретението мутантните протеини имащи подобрени прояви в условията на приложение на нишестен разтвор. Стабилността в алкална среда е особено важна за прилагане при дизайна на текстил.

Тези аспекти ще бъдат детайлно описани по-нататък в описанието и в примерните изпълнения.

ПОДОБНО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 представлява нуклеотидна последователност на рМа5-8

Stanssens et al., 1987, EMBO Laboratory Course, Martinsried, July 1987. За описанието на различните елементи виж текста;

Фигура 2 - нуклеотидна последователност на плазмиди pPROM SP02 инсерция.

Конструкцията на този вектор е описана в ER-A-0224294. α-амилазната аминокиселинна последователност и изобразена под триплетите. Нормерирането започва от първата аминокиселина на зрелия протеин /Kuhn et al., 1982, I.Bacteriol, 149, 372/. Промоторът S P02 е инсертиран между позиции 61 до 344;

фигура 3 - нуклеотидна последователност на рМа.ТПаб.

Този вектор е конструиран от рМа5-8 инсерта на pPROM S РО2 и синтетичен ДНК фрагмент, кодиращ ТАС промотор. ДНК фрагментът, съдържащ ТАС промотора, действа между позиции 3757 и 3859. а-амилазната аминокиселинна последователност е изобразена под триплетите;

фигура 4 - рестрикционна карта pMaTLia6.

Следващите уникални сайтове на рестрикционния ензим са подходящи да попълнят конструкцията на α-амилазния ген: BamHI, Spel, SacII, Kpnl, Clal, Narl, Sall, Thtlll, Xmalll и BstEII. Секвенирани праймери за всички възможни случаи са синтезирани с оглед детерминацията на мутациите. Плазмидът pMcTLia6 е идентичен на pMaTLia6 с изключение на присъствието на amber кодон в ампицилиновия ген /отстраняващ Seal сайта/ и отсъствието същия amber кодон в хлорамфениколния ген « «ι i.MiiMiii ι /вкарва PvuII сайта/;

фигура 5 - очертание на рВМа/с Bacillus /E.coli совалковия вектор.

Секторът отляво рМа/ с дава възможност за подходяща мутагенеза в E.coli. Блокът 5 отляво от Вас.subtilis съдържа α-амилазния ген (или който и да е друг ген на Bacilllus) заедно с минимум репликони за размножаване на В. Subtilis. След успешна мутагеназа в E.coli, блокът на В.Subtilis може да бъде циркуляри- 10 зирана, освобождавайки SP02 промотора да се предвижи пред α-амилазния ген при трансформация в Bacillus;

фигура 6 - рестрикционна карта на pBMa/cl Този вектор е специфичен пример за му- 15 тагенен експресионен вектор, очертан на фигура 5 /1/ и /2/: мултиплетни сайтове на клониране. Желаният ген е инсертиран в /2/. Чрез вариране на сайтовете /1/ и /2/ могат да бъ- 20 дат създадени рестрикционни сайтове за отворен /празен/ дуплекс.

FDT: транскрипционен терминатор

F1.ORI: начало на репликация, получен от фиг F 1 25

E.coli ORI: начало на репликация, получено от pBR322

BLA: ген за устойчивост на ампицилин CAT: ген за устойчивост на хлорамфеникол 30

ВАС OR1: начало на репликация от pUBl 10 Kanamycin: ген от pUBllO за устойчивост на Kanamycin /neomycin/

SP02: промотор на фага SP02;

Фигура 7 - рестрикционна карта на 35 pBMa/cGLia6

-амилазният ген на Bac.Licheniformis се включва в рВМа/С 1 като мултиплетен клониращ сайт /2/ от фигура 6. На тази фигура SP02 промоторът е означен като /2/ OR1 от 40 E.coli е означен с /4/ фигура 8 - phoA-фрагмент в рМа/c TPLia6. Изобразена е последователност от EcoRI сайта в посока 3' от ТАС-промотора до първата аминокиселина на зрялата α-амилаза. phoA 45 аминокиселинната последователност е показана под ДНК последователността;

фигура 9 - диаграма на Михаелис-Ментен за WOT и 2D5 а-амилаза.

Тази диаграма показва началната степен 50 на ензимна активност спрямо субстратната концентрация на WT и 2D5 α-амилаза. Условията за изпитване са показани в пример 8;

фигура 10 - термична инактивация на WT и D7 α-амилаза. Тази диаграма показва времето на полуживот за WT и D7 - амилази като функция от концентрацията на Са²⁺ при рН 5,5 и 90,5°С;

фигура 11 - термоинактивация на WT и D7 а-амилаза

Както на фигура 10 с изключение на това, че рН че 7,0;

фигура 12 - термоинактивация на WT и 2D5 а-амилаза

Диаграмата показва времето на полуживот на WT и 2D5 α-амилазата като функция от концентрацията на Са²⁺ при рН 7,0 и 95°С;

Фигура 13 - термоинактивация на WT и D7 α-амилаза като функция от рН;

фигура 14 - термоинактивация на WT и 2D5 α-амилаза като функция от рН;

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

С термина “повишени качества”, използва във връзка с “мутантната α-амилаза” в настоящото описание се означават амилази с по-висока ензимна активност или по-дълъг живот в условията на приложение на втечняване на нишестето, текстилния дизайн и други индустриални процеси.

С “повишена термостабилност” се означава факта, че мутантният ензим съхранява своята активност при по-високите температури на процеса, или че съществува по-дълго при същата температура, при която съществува природния ензим.

Под “повишена киселинна /или алкална/ стабилност” се разбира, че мутантните ензими са по-стабилни при по-ниски степени на рН от природните типове ензими, от които са получени. Природните ензими са получени от щамове от род Bacillus.

Следва да се разбира, че подобрените качества на ензимите се определят от заместването на една или повече аминокиселини.

Хромозомна ДНК се изолира от микроорганизъм, синтезиращ α-амилаза. За предпочитане е микроорганизмът да е от род Bacillus, а още по-добре - от групата, съдържаща B.stearothermophilus, B.licheninformis, B.amyloliquefaciens, а най-добре е да бъде използван B.licheninformis Т5, /ЕР-А-134048/. Хромозомната ДНК се смила с помощта на под4

I .111:11 I. II ходящ рестрикционен ензим и се клонира във вектор. Могат да бъдат използвани много вероятни пътища на селекция, като например хибридизация, имунологично определяне и определяне на ензимната активност. Изборът на 5 вектор за клониране на подложена на смилане ДНК /хромозомна/ зависи от подходящите методи на селекция. Ако се използва хибридизация, няма нужда от специални мерки за предпазване. Ако определянето е имунологично 10 или основано на ензимната активност, векторът следва да съдържа експресионни сигнали. Определяне на клонове, съдържащи а-амилаза са представени на агарни пластинки, съдържащи агар. След прорастване и инкубация 15 с 1₂, се определят области на изпарение около позитивните клонове. Като следваща стъпка е определянето на аминокиселинната последователност, която се използва са сравнение с познати α-амилазни последователности за дава- 20 не на първото впечатление за важни аминокиселини/т.е. активни сайтове, Са²⁺ връзки, възможни S-SMOCTOBe/. По-добри индикации са получени чрез определяне на 3D-структурите.

Това е лабораторен начин и често се използва 25 друг подход. При липсата на ЗО-структури, програмите за определяне на вторични структурни елементи /т.е. а-спирала, β-структури са успешно използвани за определяне и евентуални терциерни структурни елементи, като β-цилиндър. За литературно потвърждение (виж Janin, J. and Wodack, S.J., Progr. Biophys. molec. Biol. 1983,42, 21-78). Може да се предприеме значително аминокиселинно заместване. Стабилността на протеиновата структура се определя чрез чистата разлика в свободната енергия между нагънатата и свободна конформация на протеина. Тъй като протеиновият остатък се ограничава до по-малки конформации от другите аминокиселини, конфигуралната ентропия на ненагънатия /свободен/ протеин се намалява и по този начин стабилността се увеличава, когато една аминокиселина се замества с пролин. Друго полезно заместване е това на глицин с аланин. Остатъци като треонин, валин и изолевцин с разклонени β-въглеродни вериги, ограничават конформацията на гръбнака повече от неразклонените остатъци.

До колкото част от термостабилността на някои протеини се дължи на солевите мостове, полезно е да се въведат лизинови и аргининови остатъци /Tomozie SJ.and Klibanov А.М., J.Biol.Chem, 1988, 263,3092-3096). Нещо повече, заместването на лизинови с аргининови остатъци може да повиши стабилността на солевите мостове тъй като аргининът е в състояние да образува допълнителни Н-връзки. /вж. Wigby, D.b. et.al., Biochem. Biophys. Ries.Comm. 1987, 149,927-929/. Отбелязва ce, че деамидизацията на аспарагина и глутамина причиняват сериозни нарушения на ензимната структура, като чрез заместване са неамидни остатъци може да се избегне такова нарушение. Заместването на аминокиселини се осъществява за предпочитане чрез мутагенеза на ниво ДНК.

Принципно, експерименталната мутагеназа може да се проведе директно върху изолираните клонове. Обаче, инсерцията за предпочитане се клонира върху мутагенно/експресионен вектор. Възможна е, случайна мутагенеза също и сайт-насочена мутагенеза. В смисъл, че се образува огромно количество мутантни клонове по този метод, и доколкото 3Dструктурата от α-амилазата е известна като способна да осъщесатвява доказани предположения за сайт-насочена мутагенеза, ние решихме да реализираме случайна мутагенеза в специфични области.

Следното е възможният подход за осъщесатвяване на настоящото изобретение:

Най-напред генът се модифицира чрез въвеждане на “тихи” рестрикционни сайтове. Въвеждането на силни рестрикционни сайтове също е възможно. Така става възможна деленията на специфични области от гена. След това като втори момент, генът се клонира в плазмид. Тази комбинация от фаг и плазмид улеснява продукцията на едноверижна ДНК. Други начини за получаване на едноверижна ДНК също са възможни. Чрез хибридизация на смес на ДНК от двойноверижен вектор (положителен инсерт), с векторно-инсерционна комбинация, съдържаща празнина в инсерцията, се получава хетеродуплексна ДНК с нужната празнина /вж. Morinaga, Y.et al. 1984 /Biotechnology, 2,636/.

Тази празнота се използва за химична и ензимна мутагенеза. Ние използвахме бисулфитния метод /Folk and Hofstetter, Cell, 1983, 33,585/ и един ензимен метод /модифицирана версия на Lehtovaara et.al., Prot. End., 1988,2,63/. Тези методи могат да бъдат при5

I ложени по същия начин, като всеки единичен нуклеотид в празнината се замества с три други нуклеотида /наситена мутагенеза/. Последният метод може да бъде приложен по различни начини. По един от тях, един синтетичен 5 праймер се хибридизира с празнината. След това се провежда реакция, на удължаване, при която дезоксинуклеотидът, комплементарен на първия дезоксинуклеотид 3' от праймера, липсва. По принцип всичките три дезоксинукле- 10 отида могат да бъдат включени по този начин. Това може да бъде постигнато както чрез използване на смес от три дезоксинуклеотида, така и чрез използване на три различни реакции, всяка от които съдържа само един дезок- 15 синуклеотид. Друг начин е използването на метода за получаване на случайни клонове. Тук четири отделни реакции се провеждат, всяка от които съдържа един лимитиращ дезоксинуклеотид. Това дава вторични вериги, които спи- 20 рат преди всеки единичен нуклеотид. Следващите стъпки могат да се осъществяват, както е описано по-горе. И двата метода -бисулфитният и ензимно-мутагенетичният се използват за получаване на мутанти. 25

За изпитване на ензимните свойства, удобно е клонираните гени да бъдат експресирани в същия гостоприемник, който е бил използван по време на мутагенетичните експерименти. По принцип това може да бъде всеки 30 гостоприемник, който е подходящ за включване на мутагенетичен експресионен вектор. Особено удобни за работа са E.coli, например E.coli WK6. След прорастване на колониите, те се прехвърлят в петрита с агар, към който 35 се прибавят нишесте и буфери с различни стойности на pH. Позитивните клонове могат да бъдат открити чрез образуваните ореоли. Скриниране в микротитърни панички е подходящо за селекция по термостабилност, киселинно- и, алкалоустойчивост, стабилност спрямо соли и др.

Подходящите щамове-гостоприемници за продукция на мутантнаа-амилаза включват способни на трансформация микроорганизми, в които може да се осъществи ескспресия на аамилаза. Специфичните щамове-гостоприемници от същите видове или родове, от които са получени α-амилазите са адаптирани като щамовете на Bacillus. Един амилазен негативен щам Bacillus се използва за предпочитане пред аамилазен и протеазен негативен щам Bacillus.

Например, използва се в B.licheniformis T9 за получаване на голямо количество мутантни а-амилази.

Методът за получаване на -амилазата включва етапите:

а/ култивиране на клетките при условията, при които се получава мутантната аамилаза и б/ изолиране на мутантната а-амилаза от културата.

За предпочитане е α-амилазите, които се продуцират, да се секретират в културалната среда /по време на ферментацията/, което улеснява извличането й. За целта може да се използва всяка подходяща сигнална последователност да постигане на секрецията.

Експресионните α-амилази се секретират от клетките и могат да бъдат пречистени след това по който и да е подходящ метод. Гелфилтрация и моно Q хроматография са примери за такива методи. Изолираната аамилаза се тестува за термоинактивация при различни концентрации на Са²⁺ /0,5-15 мМ/и извън pH-интервала от 5,5-8,0. Тестуването се осъществява при условията на приложение. Специфичните мутантни α-амилази се изпитват при специфичните условия на нишестени разтвори при pH 5,5 и 5,25. По-нататък се тестуват приложенията за текстилен дизайн. Свойствата на някои мутанти, които бяха скринирани, се адаптират за желаните условия за провеждане на метода.

Настоящото изобретение разкрива получаване на α-амилази с повишени термостабилност, стабилност при pH под 6,5 и над 7,5. Броят на аминокиселинните замествания не е от значение дотолкова, доколкото активността на мутантния протеин е същата или подобра от тази на природния ензим. Мутантните α-амилази се отличават от природния ензим най-малко по една аминокиселина, за предпочитане от 1 до 10 аминокиселини. Специфичните мутанти с подобрени свойства включват мутантни α-амилази, съдържащи едно или повече аминокиселинни замествания при последователните позиции 111, 133, 149 /номерирането е съответно на от α-амилаза Вас. licheniformis. Между предпочитаните аминокиселини и заместените са Ala-III-Thr, His133-Tyr, Thr-149-Ile.

Такива мутантни ензими имат повишени способности при pH под 6,5 и/или над 7,5.

Проявяват се и с повишена жизнеустойчивост при високи температури, например до 110°С.

Повечето от α-амилазните продукти са получени от бактериални източници, в частност Bacillus, например B.subtilis, B.licheniformis, B.stearothermophilus, B.coagulans, B.amyloliquefaciens.

Тези ензими имат висока степен на хомоложност и идентичност (Juuki et al., J.Biochem., 1985,98, 1147; Nakajima et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1986, 23, 355). Поради това, познанията за подходящите мутации, получени от една от тези α-амилази, могат да бъдат използвани за подобряване на други амилази.

По-долу са описани експерименталните методи, използвани в изобретението. Примерите илюстрират изобретението без да го ограничават.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. Основни техники на клониране

Техниките на клониране са използвани, както са описани в книгата на T.Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab.,; E.M.Ausubel et.al., 1987, Current Profocols in Molecutar Biology, John Wiley & Sons Jnc., New Jork; B.Perbal, 1988, A Practical Gnide to Molecular Cloning, 2 nd edition, John Wileu & Sous Jnc., N. Тези книги описват детайлно начина на конструиране и нарастване на ДНК молекулите и процедурите са създаване на генни библиотеки, за секвениране и мутация на ДНК и за ензимно моделиране на ДНК молекулите.

2. Химична мутагенеза

Клонираната ДНК може да бъде третирана in vitro с химикали с цел предизвикване на мутации в ДНК. Ако мутациите са насочени към аминокиселини, кодиращи триплетни кодони, мутанният протеин може да бъде продуциран чрез мутантната клонирана ДНК. Метод за химична мутагенеза с добавяне на натриев бисулфит е описан от Shortle and Botstein (Methods Bnzymd., 1983,100457).

Предпочитан метод е описан от Folk и Hofstetter (Cell, 1983,33,585). Други методи за мутагенеза са описани от Smith, Ann, Rev. Genrt., 1985,19 423. Изключително полезен е за изобретението метода, описан от Ausubel at al., ibid.

3. Мутагенеза на дар-дуплексната ДНК

Методът, основан на дар-дуплексния подход /Kramer et al., 1984, Nucl. Acids Res.12, 9441 / и плазмид (плазмид/фагов хибрид) се прилага, като същността му касае междинна дуплексна ДНК, състояща се от верига, с липсваща аминокиселинна част /-верига/, включваща природен маркер за резистентност към антибиотик и верига /+ верига/носеща amberмутация, в гена, придаващ резистентност към антибиотици. След ренатурация на ДНК, мутантният олигонуклеотид се включва in vitro в съдържащата празнина верига по време на попълването й и на реакцията на завършване. Получените молекули се използват за трансформация на несъвършения /MutS/ гостоприемник, в който връзката между очакваната мутация и маркера за резистентност към антибиотика е запазена. Смесената плазмидна популация, изолирана от този щам, след това се подлага на сегрегация в супресор-негативен щам-гостоприемник. Трансформантите се поставят в среда, съдържаща антибиотик, което дава възможност за селекция на поколение, получено от носещата празнина верига.

Двойната векторна система рМа/с5-8, която бе описана от P.Stanssens et al. (Nucl.Acids.Res., 1989,17,4441/, е съставена от следните елементи:

позиция 11-105: бактериофаг fd, терминатор

-”- 121-215: бактериофаг fd, терминатор

-”- 221-307: плазмид рВР322 позиция 2069-2153/

-”- 313-768: начало на репликация от бактериофаг fl (позиция 5482-5943)

772-2571: начало на репликация и β-лактамазен ген от плазмид pBR 322

-”- 2572-2685:транспозон Тп903

2519-2772:триптофанов терминатор /двоен/

-”- 2773-3729: транспозон Тп9, хлорамфеникол-ацетил трансферазен ген

3730-3803: сайт на мултиплен клониране

Последователността е изобразена на фигура 1.

Във вектора от рМа тип, нуклеотид 3409 е изменен от G на А, докато във вектора от

II IIIΛ,ΙΙΙΙΙΙΙΙΙ.ΙΙΙΙΙ тип рМс, нуклеотид 2238 е изменен от G на С, създавайки amber-стоп кодони в ацетил-трансферазния и β-лактамазния ген, като посочените гени се инактивират.

Всички последователности се получават 5 от Genbank /National Nucleic Acid Seqnence Data Bsnk NIN USA/. Плазмидът pMc5-8 е депозиран под номер DSM 4566. За да осъществи мутагенезата, ДНК-фрагментът мишена се клонира в мултиплетен сайт на клониране от рМа.5-8. 10 След това се конструира дар-дуплексът между рМа 5-8, съдържащ мишената ДНК и рМс5-8.

Единичната верига, с празнина съдържаща мишенната ДНК, може да бъде подложена на мутагенезис с мутагенетичен олигонуклеотид, с дълги синтетични олигонуклеотиди, с ниско ниво неинкорпорирани нуклеотиди, с химически или ензимно неинкорпорирани нуклеотиди, а също и със случайни мутагенични PCR. За детайлно описание, вж. Ausubel et al., 20 ibid, or Perbal ibid. Като алтернатива на in vitro мутагенезата може да се използва in vivo мутагенеза, а също и въздействие с W-лъчи или химикали или с прилагане на мутация-предизвикващи щам E.coli. /Fowler et al., J.Bacteriol, 25 1986, 167, 130/.

Мутагенетичните нуклеотиди могат да се синтезират с използването на апарати, производство на Applied Bio Systems.

4. Случайна мутагенеза чрез ензимно не- 30 инкорпориране на нуклеотиди дар-дуплексът рМа/рМс може да се подложи на удължаване с праймери и ниенкорпорационна мутагенеза, както е описано в Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1982, 79, 1588/ от B.C.Cun- 35 nigham and J.A.Wells /Prot.Eng,1987,1,319/, или чрез модификация на тази процедура е описана от LehtoVaara et al.,/ Prot.Eng., 1988,2,63/.

Този метод е основан на контролирано използване на полимерази. Четири популации 40 от ДНК молекули най-напред са генерирани от праймер елонгация на дар-дуплекса рМа/ рМс в празнината на веригата, така че да завършват случайно, в празнината, но точно преди известния тип бази/преди A,C,G, или Т респективно/. Всяка от тези четири популации след това се подлага на мутации в отделни реакции на неинкорпорация, където правилната база може да бъде пропусната. По този начин всички типове мутации на заместване на бази 50 могат да бъдат генерирани при всяка позиция на празнината. Използването на секвенза /ТМ/ /U.S. Brochemical Corporation/ се предпочита пред използването на Klenow-полимеразата. Нещо повече, MoMuLV обратна транскриптаза се използва вместо A.M.V.обратна транскриптаза, приложена от LehtoVaara et.al./ibid/.

За да се обезпечи заместването при единичен сайт, се представя следната модификация на протокола, описан от Lehto Vaara et.al, ibid. В буфера с обратна транскриптазата не присъстват три, а само един неинкорпориран нуклеотид. Например, А-база-специфичната смес за ограничаване на елонгацията се инкубира в три различни реакции с 250 М dCTP, 250 μΜ dGTP и 250 μΜ dTTP, респективно.

За получаване пълния комплект от четирите бази-специфични смеси за ограничаване елонгацията се провежда комплекс от 12 отделни реакции на неинкорпориране. След инкубация за 1,5 h при 42°С, се добавя следа от всички четири дезоксинуклеотида в концентрация от 0,5 mM, след което реакцията се провежда при температура 37°С за най-малко 20 min. Пробите след това се подлагат на реакция по Lehto Vaara et. al., c модификация, състояща се в това, че се прилага броима селекция, основана на рМа/c вектор, а не се осъществява такава за урацил-съдържащата ДНК верига.

5. Продукция на мутантни а-амилази Трансформантите на E.coli, щам WK6 / Zell,R. и Fritz,H.J. EMBO-J., 1987,6,1809/, съдържащи експресионен вектор и продуциращи всяка една от α-амилазните конструкти, се инокулират в ТВ среда /10 ml/ при 30°С. ТВ средата се състои от 0,017 М КН₂РО₄0,072МК₂НР0₄ 12g/l Bactotripton 24 g/1 Bacto дрождев екстракт, 0,4% глицерин и антибиотик /ампицилин с рМа или хлорамфеникол с рМс конструкти/. Пробите от културата се използват за инокулация на 250 ml ТВ в двулитрови колби. Към OD*600 от 10-12, се добавя 0,1 мМ IPTG /изопропил^-б-тиогалактопиранозид/ и инкубацията продължава още 12-16 h.

* OD = оптична плътност

6. Пречистване на мутантните а-амилази

Клетките се отделят чрез центрофугиране и след тава се ресуспендират в буфер, съдържащ 20% захароза при 0°С. След повторно центрофугиране, клетките се ресуспендират в студена вода. Клетъчните останки се отстраняват чрез трето центрофугиране и сус8 пернатантата се довежда до стойност на pH 8,0 с 20 мМ TRIS буфер. СаС1₂ се добавя до крайна концентрация от 50 мМ. Материалът се третира при висока температура за 15 min при 70°С и неразтворимият материал се отстранява чрез центрофугиране. Супернатантната се филтрира през 0,22 μ филтър Millipore и се концентрира до 1/10-та от началния обем.

По-нататък пречистването протича чрез гелфилтрация /върху TSK HW-55-Мегск/ и Mono Q хроматография. Преди хроматография върху mono S, pH на ензимно активните фракции се довежда до 4,8 чрез натриев ацетат. аамилазата се елуира с 250 мМ NaCl. За да бъде избегната инактивацията, pH веднага се довежда до 8.

Примери

Пример 1.Молекулярно клониране нааамилазен ген от Bac.licheniformis.

Хромозомална ДНК, изолирана от Вас. licheniformis Т5 /ЕР-А-134048; CBS 470,83/ се смила с рестрикционен ензим EcoRi и се присъединява към EcoRi сайта на pLIBllO /Grycsan.T.J. et.al., I.Bacteriol, 1978,134, p.318/. Сместа се трансформира в Bac.subtilis 1А40 / Bacillus Centtic Stoce Center/. Резистентните на неомицин колонии се тестуват за а-амилазна продукция на Н1 агарни плочки /DIFCO/ с добавка на 0,4 g/Ι нишесте /Zulkowsky sAarch, Атегк/. След култивирането и инкубация с газообразен 1₂, позитивната колония с голям чист ореал се селекционира за по-нататъшно характеризиране. Плазмидът, изолиран от тази позитивна колония, съдържа 3,4 kb EcoRl-EcoRI фрагмент, произхождащ от Bacillus licheniformis Т5. Този плазмид е наречен pGB33 /ЕР-А134048; CBS 466.83/. Инсъртът кодираща-амилаза се присъединява към синтетична към ShineDalgarno последователност и бактериофагният протомор SPO₂, резултирайки в плазмида pProm SPO₂ /вж.ЕР-А-0224294; CBS 696.85/. Нуклеотидната последователност на инсерцията от PProm SPO₂, така както е определена по метода на Sanger /Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1977,74,6463/, е показана на фигура 2. Последователността показва едно голяма отворена рамка на разтичате, кодираща една α-амилаза, която е идентична на α-амилазната последователност на Bac.lichemiformis така, както е определена от Yuuki. Първите 29 аминокиселини са сигнална последователност, която се изразява по време на секрецията на α-амилазата. Номерацията на аминокиселините съгласно описанието на настоящото изобретение е така както при зрелия протеин.

Последователността на Yuuki се различава през следните позиции: при позиция 134 един Arg присъства вместо Leu; при позиции 310 един Ser присъства вместо Gly; при позиция 320 присъства Ala вместо Ser.

Пример 2. Конструиране на мутагенетично/експресионни вектори рМаТПаб.

Плазмидът pPROM SPO₂ се смила EcoRi и Bell и 1,8 kb EcoRI-BclI инсъртът се пречиства и клонира рМа5-8 смлян с EcoRI-BamHI. Този вектор рМа5-8 е осигурен преди това с модифициран мултиплен на сайт клониране. Фрагментът BamHI-HIndlll, започващ от позиция 3767 към позиция 3786 на фигура 1, се заменя със синтетична ДНК последователност, така както се чете от позиция 5647 до 5660 на фиг.З. Това се провежда, за да се превърне от някои рестрикционни сайтове вътре в а-амилазния ген в уникални. Получената а-амилаза, съдържаща рМа5-8 производен, се смила с EcoRi и BamHI и се присъединява към синтетичен ДНК фрагмент, носещ копие от ТАС промотор /De Boer at al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1983,80,21. Последователността на този синтетичен ДНК фрагмент е изобразена заедно с крайния α-амилазен мутагенетичен /експресионен вектор pMaTLia6 на фигура 3, от позиция 3757 към позиция 3859. Този вектор се окомплектовка чрез въвеждане на няколко слаби рестрикционни сайта, които се очаква да предизвикват празнини в α-амилазния ген по време на мутагенетичния експеримент /фигура 4/. За тази цел се правят следните мутации, използвайки сайт -насочен олигонуклеотиден мутагенезис:

- Spel сайта се вкарва чрез “тиха” мутация

Т49Т и S50S

ACG -7 ACT AGC -> AGT

- Narl сайта се вкарва чрез тиха мутация:

А269А

GCG -> GCC

- BstE II сайта се вкарва непосредствено до TAG стоп кодона в посока 5'

TAGAAGAGC TAGGTGACC

Този α-амилазен мутагенетичен вектор рМаТПаб се адаптира за мутагенезис и дардуплексния метод. Двойноверижната плазмидна рМаТПаб ДНК, изготвена чрез смилане с

II IIII,II»ШИ I подходящи рестрикционни ензими, се циркуляризира до едноверижни pMcTLia6 ДНК.

Резултатните едноверижни празнини се подлагат на сайт-насочен мутагенезис, на химичен мутагенезис и на случайна ензимна 5 мутагенеза, както е описано в експерименталната част.

Присъствието на TAG промотора пред α-амилазния ген дава възможност за индуцирана експресия на α-амилаза в Е.coli чрез до- 10 бавяне на IPTG.

Плазмидът рМаТ1аб в E.coli WK6 е депозиран като CBS 255.89 на 2 юни 1989 г.

Пример 3. Конструиране на Bacillus /Е. coli/ совалков вектор за мутагенеза и експресия. 15 Този вектор дава възможност за мутагенезис на един инсериран ген в E.coli и незабавна експресия в Bacillus. Избраният начин за конструиране на вектора предвижда комбиниране на плазмида рМВПО /Grycsan, lbld/./c рМа/с 20 двойна векторна система, така че:

1. Блокът на Вас. subtilis може да се отстрани чрез единичен рестрикционно /свързващ експеримент.

2. Различни α-амилазни гени и промо- 25 тори могат лесно да бъдат клонирани в този вектор.

3. След рециркулация, клонираният ген следва да бъде под контрола на подходящ промотор от Bacillus. 30

4. По време мутагенезата в E.coli, промоторът от Bacillus и структурният а-амилазен ген са физически разединени, предпазвайки от летална акумулация наа-амилаза в E.coli.

Схематичното описание на совалковия 35 вектор е показан на фиг.5. Структурата на финалната версия на вектора рВМа /с1 е представено на фигура 6. Векторът pBMal е депозиран под N CBS 252.89 на 2 юни 1989. Векторът е конструиран както следва: 40

- EcoRI - SnaBI фрагментът от pLIBllO, носещ REP -гена и NeoR гена, се пречиства и клонира в смлян с EcoRI - Smal рМС8

- EcoRI -Hindlll фрагментът от този рМС8 се клонира в смлян с EcoRI-Hindlll рМа5- 45 8, резултирайки в плазмида рМа5-80.

- BamHI -Xbal полилинкерен фрагмент се замества със синтетичен фрагмент на ДНК, кодиращ SPO₂ промотор на бактериофаг SPO₂/Williams at al., J.Bacterid 1981, 146, 1162/ плюс 50 рестрикционни сайтове за разпознаване на SacII, Apal, Xhol, SacI, Bgll, Mlul и Xbal.

- Уникалният EcoRI сайт на pMa5-80 се използва за инсертиране на полилинкерния фрагмент, конституиращ следните сайтове за разпознаване EcoRI, Smal, SacI, EcoRV, SphI, KpnlXbal и Hind III.

За специфични нужди дериватите на рВМа/с2 и рВМа/сб са развити извън рВМа/ cl.

В рВМа/с2 полилинкерът EcoRI -Hindlll от рВМа/cl се замества от съответния полилинкер на pNC19.

- В рВМа/сб в допълнение SacII сайт в полилинкера на р ВМа/cl се отстранява чрез Klenow-реакция.

Сайт-насочената мутагенеза върху аамилазният ген на Bac.licheniformis се осъществява след конструиране на РВМа/сб Lia6. Този вектор се конструира чрез свързване на BamHIHindlll фрегмент изолиран от pMaTLia6 в погоре отбелязания рВМа/сб, който се разцепва от BamHI и Hindlll. Резултатният плазмид може да бъде използван за конструиране на дардуплекси за мутагенезис в E.coli.

Резултантните мутанти се експресират в Вас.subtilis 1А40 /BGSC 1А40/ след рестрикция с SacL, свързване отново и трансформация съгл.Chand и Cohen /Mol.Gen.Genrt., 1979,168,111/.

Пример 4. Експресия в E.coli на правилна зряла α-амилаза от Вас.

licheniformis

Характеризирането на -амилазата, продуцирана от pMaTLia /Пример 2/ показва, че част от нея е с неправилен процесинг по време на секрецията. Ип₂-крайната последователност изявява един допълнителен аланинов остатък за α-амилазата, продуцирана от E.coli WK 6.

Независимо, че няма данни, че това се придаде различни свойства на амилазите, се замества α-амилазната сигнална последователност със сигнална последователност за алкална фосфатаза PhoA. Към този край мутагенетичният експеримент се провежда така, че да се вкара EspI рестрикционен сайт в рМаТПаб при мястото на съединяване на сигналния пептид със зрялата α-амилаза. След смилане с FspI и BamHI, синтетичен фрагмент, кодиращ phoA сигнална последователност /Michaelis et.al., J.Bacteriol, 1983, 154, 366/, се инсертира. Последователността на тази конструкция е показана на фиг.8. а-амилазата, продуцирана от pMa/cTPLia6 притежава пра10 η

вилната NH^-крайна последователност.

Пример 5. Скриниране за стабилна аамилаза. екраниране за киселинноустойчиви α-амилазни мутанти α-амилазните мутанти, които представ- 5 ляват по-добра или по-лоша активност при ниско pH спрямо дивия тип α-амилаза, могат да бъдат селекционирани по ореолите при култивиране в петрита с нишестени среди, буферирани при различни стойности на pH след като 10 нишестето се оцветява с йоден разтвор.

Метод:

1. Прорастване

Възможните мутанти се отглеждат върху микротитърни панички. Средата, която се 15 използва е 250 μ мозъчно-сърдечно бульон DIFCO. Направени са и следните добавки:

хлорамфеникол 50 pg/ml

1. P.T.C. /SICMA/ 0,2 шМ _2Q

СаС1₂ 2 тМ

Колониите са взети от агарните пластинки със стерилни микропипети и инокулирани в различни ямки (96) от микротитърната паничка. Във всяка паничка се включват 4 ко- 25 лонии от див тип като контроли. Микротитърните панички се поставят на 37°С за 40 h, без да се разклащат.

2. Тестуване на пластинките

След посочения период от време, в кой- 30 то α-амилазата се получава, се вземат 5 μΐ проби от всяка ямка и се поставят 2 различни вида агарни пластинки /144 х 140 mm/. Първият тип е богата на сърдечна инфузия (DIFCO) агарна пластинка + 0,4% нишесте /Zulkowsky 35 stareh - Merck/ + хлорамфеникол 50 pg/ml. След инкубация при 37°С за 16 h тази пластинка е източник на мутанти.

Вторият тип пластинки са действителните скрининг пластинки, които включват: 40

Bacto agar /DIFCO/ - 1,5%

Lulkowsky starch - 0,2%

Агарът и нишестето са разтворени в сис-

тетична водопроводна вода /STW/. Това е де-	45
минерализирана +
СаС1₂	2 mM
MgCl₂	1 mM
NaHCO₃	2,5 mM	50
BSA	10 pg/ml

Скрининговите пластинки са буферирани със 100-кратно разреден 5 М калиево ацетатен буфер, разтворен в тази среда. Стойността на pH в този разтвор е 4,80; 5,0 5,2 при стайна температура. Крайната стойност на pH в агарните пластинки, която бе измерена, е малко по-ниска от онази на разтвора. От всяка ямка 5 ml култура се накапва в скрининговите пластинки с различна степен на pH.

Областта на pH се избира по начина, според който остава ниска или липсва активност /или нейната липса/ на α-амилазата от див тип в пластинките с най-ниска стойност на pH.

3. Оцветяване

Скрининговите пластинки се инкубират за 2 h при 55°С. След този период те се заливат с йоден разтвор. 10 х 1₂-ов разтвор съдържа 30· g 1₂ и 70 до KI за литър.

Количеството на просветляване на петната корелира с остатъчната α-амилазна активност при даденото pH. Мутантните, които се представят по-добре от дивия тип контроли, се селекционират за втория етап от скринирането. Дивият тип ореоли са много репродуктивни в този експеримент.

4. Второ скриниране

Позитивните мутанти се взимат от обогатените пластини се пречистват на пресни HI панички + хлорамфеникол. Взимат се четири единични колонии от всеки мутант и те отново се тестуват по аналогичен начин, както при първото скриниране. В допълнение се провежда серия разреждания от тези култури с STW и тези разреждания се накапват върху скринираните панички с неутрално pH /рН = 7,0/. Сравнението с дивия тип култури дава възможност да се реши дали по-доброто представяне при ниско pH е достатъчно за много подобра α-амилазна продуктивност или до съществено по-стабилна а-амилаза.

Мутантите, които преживяват второто скриниране се характеризират чрез определяне на нуклеотидната последователност на онази част от гена, която е подложена на мутагенеза.

В. Скриниране за устойчивост на основи на а-амилазата.

Скринирането за устойчивост на алкална среда се представя по начин, аналогичен на този за устойчивост на α-амилазите на киселини. След отглеждане върху микротитърни пластинки, 5 μΐ проби се вземат от всяка ямка и се накапват върху резервна пластинка

I

и върху действителна скрининг пластинка. Последната е съставена от:

Bacto agar /DIFCO/ 1,5%

ZulcoVsicy starch 0,2% и се допълва с деминерализирана вода плюс:

СаС1₂MgCl₂NaHCO BSA

Скрининг пластинките се буферират с 50 тМ карбонат/бикарбонатен буфер, pH 9,0; 9,5 и 10,0. Областта на pH е избрана по такъв 15 начин, че да е налице малка или да липсва и да е активност на дивия тип α-амилаза при по-висока степен на pH. След 2 h инкубация при 55°С разтвор на 1₂ се излива върху пластинките. Онези мутанти, които дават по-добър 20 ореол от дивият тип ензими, са селекционирани с оглед второ скриниране. Това второ скриниране се провежда по аналогичен начин, както за киселиноустойчивост.

С. Скриниране за термостабилни а-ами- 25 лазни мутанти α-амилазните мутанти, които се представят по-добре или по-зле при висока температура от дивият тип α-амилаза, могат също така да бъдат подбрани чрез сравнение на ореолите върху петрита с нишесте причинени от остатъчната амилазна активност в културалния бульон след нагряване.

Метод:

1. мутантите се отглеждат по същия начин, както за pH скрининг

2. Мутантите се репликират върху HI агарни пластинки, както при рН-скрининга

3. Отделните ямки от микротитърните пластинки се затварят с подвижни капачета /Flow laboratories/ за предпазване на бульонната култура от изпарение по време на температурното третиране.

4. Микротитърните пластинки се загряват на водна баня за 1 h при 95°С. След това се поставят в центрофуга за събиране на тотална проба на дъното на микротитърната пластинка.

5. Скринирането за термостабилни мутанти се извършва както следва:

От всяка ямка по 5 ц1 от културата се накапва върху неутрални скрининг пластинки /вж.рН скрининг/. Тези пластинки се инкубират за 1 h при 55°С.

След оцветяване на нишестето с йоден разтвор, мутантите и контролите могат да се кринират за остатъчна α-амилазна активност чрез сравняване на ореолите.

В случаите, че остатъчната активност е твърде висока, трябва да бъдат направени серия разреждания и да се накапват върху скрининг пластинките, за да се отделят мутантите, които са по-термостабилни от дивия тип ензими.

6. Възможно интересуващите ни мутанти се тестуват по-нататък така, както бе направено при pH скриниг метода.

Комбинация от скрининг тип А или В с тип С може да бъде приложена, ако е желана комбинация от свойства. Например след първото скриниране за стабилност към алкални вещества, второто скриниране за термостабилност също може да бъде проведено. Онези мутанти, които бележат позитивност и в двата теста, могат да бъдат подбрани като кандидати, проявяващи желаните свойства.

Пример 6. Бисулитен мутагенезис на рМаТНаб.

Едноверижни ДНК се присъединяват към pMcTLia6, смлян с Sacll-Clal с оглед получаване на хетеродуплекс с празнина, започваща от позиция 4315 до 4569 /фигура 3/. Този хетеродуплекс се подлага на бисулфитен мутагенеза /вж.експериментално/.

След трансформация в E.coli WK6 mut S/Zell,R.and Fritz Η.I. ibid./ и селекциониране върху хлорамфеникол, съдържащи агарни пластинки /50 pg/ml/, плазмидните области се изолират и трасформират в E.coli WK6. E.coli WK6 Mut S се депозира като CBS 472.88,E.coli WK6 се депозира като CBS 473.88. Получените трансформанта се отглеждат в BHI среда /DIFCO/, съдържаща 2,0 тМ СаС1₂, 50 μg/ml хлорамфеникол и 0,20 тМ IPTG / SIGMA/ в продължение на 40 h при 37°С в микротитърни ямки без клатене. Скринингът за pH устойчиви мутанти се провежда, както е описано в пример 5.

Около 300 Cm^R трансформанти се скринират. Честотата на мутациите, както са определени чрез ДНК секвениране е около 0,4 мутантни/молекули на ямка. Един киселиноустойчив мутант, D7, се идентифицира след pH скрининг. Секвенирането на този мутант разкрива H133Y мутация, получена от мутация на кодиращия типлет от САС в ТАС.

Мутантът D7 също се определя като позитивен в термостобилна скрининг проба /Пример 5/. 5

Секвенирането ДНК се осъщестява върху едноверижна ДНК със специфичен олигонуклеотид, оформен като начало точно преди фрагмента SacII-Clal. В отделен мутагенетичен експеримент се скринират 1000 Cm^R 10 трансформанта. Друг киселиноустойчив мутант, 2D5, се идентифицира след pH скриниране. Този мутант има следните мутации:

Н133У САС -> ТАС

T149I АСА -> АТА

Бисулфитният мутагенезис се прилага така, както бе описано току що върху ClalSall празнината, която започва от позиция 4569 към позиция 4976 на фигура 3. Скринират се около 300 Cm^R трасформанти /честота на мутациите 0,6 мутации/молекула/. Не са намерени киселиноустойчиви трансформанти. Открити са много киселинолабилни мутанти. Измежду тези лабилни мутанти някои могат да притежават изменение в pH спектъра, което е резултат от по-висока стабилност на фенотипа при алкални въздействия.

Пример 7. Ензимен мутагенезис на рМа

TLia6 30

Едноверижен pMaTLia6 (фигура 4) е свързан с MpcTLia6 смлян с Clal-Sall, за да се получи хетеродуплексна последователност от позиция 4569 до 4976 (фигура 3). Дуплексът с празнината се подлага на ензимна мутагенеза за неинкорпориране, както е описано в експерименталната част.

Пробита, получена след dATP-лимитирана праймер на елонгация се разцепва на три части и се инкубира в присъствие на обратна 40 транскриптаза с dCTP. GTP и dTTP, респективно. След инкубация при 37°С за 10 min, следа от всички четири dNTP и полимераза на Кленов, както и Т4-ДНК лигаза се добавя, за да се завърши елонгацията до напълно дву- 45 верижни молекули.

Тези молекули се трансформират в E.coli WK6 MutS и плазмидите се отделят. Тези плазмиди се трансформират последователно в E.coli WK6 и колониите се селекционират върху съ- 50 държащи хлорамфеникол (50 pg/ml) агарни пластинки. Получените мутанти се скринират за стабилност на α-амилазата, както е описано в пример 5.

В друг експеримент празнината SpelSacII се подлага на лимитирана праймерна елонгация с dATP, dCTP,DGTP и dTTP респективно. Тези праймери се подлагат на мутация чрез неинкорпориране /вж. експерименталната част/. 100 Cm^R трансформанти се тестуват върху pH пластинки /пример 5/ и мутант М29 се идентифицира като по-стабилен при ниско pH. Последователността на мутацията се определя като: А111Т GCG —> TCG

Пример 8. Свойства на стабилните мутанти

Два от мутантите, получени по бисулфитните мутагенични експерименти, се характеризират по-нататък. Както е описано преди, ДНК секвенирането подсказа със следните аминокиселинни замествания:

- D7 съдържа тирозин при позиция 133 вместо хистидин /D7 = H133Y/

- 2D5 съдържа D7 мутация и освен това треонин 149 е заместена от изолевцин /2D5 = H133Y, Т1491/.

а. Измерване на ензимната активност

Ензимната активност на α-амилаза WT В.licheniformis и мутантите се измерва с използване на 4-нитрофенил-малтопентаозид /4NPDP5/ като субстрат, при което се получават нитрофенол и малтопентаозата и тази реакция може да бъде последвана от измерване на изменението в OD405. Изпитването е проведено при 35°С в 50 mM MOPS, 50 тМ NaCl, 2тМ СаС1₂/ pH 7,15/ и 0-1 тМ 4NP-DP5.

Наличните стойности са измерени и Енитрофенолът е взет като 10 000 1/М/ст. Фигура 9 показва резултатите за WT и 2D5 аамилази V_max и К_т се измерват и са дадени в Таблица 1:

Vmax /цт	ю1/min/mg/	Кт/тМ/
WT	66,7 ± 0,9	0,112 ± 0,005
2D5	66,3 ± 0,7	0,119 ± 0,004

От данните в таблица 1 се вижда, че мутацията на α-амилаза 2D5 не влияе съществено върху ензимната активност.

в/ Влияние на Са²⁺ върху термоинактивацията

Експериментите за термична инактивация се провеждат върху WTD7 и 2D5 при различни концентрации на Са. Процедурата е както следва:

I

1/ Деметализация

Ензим /2-3 mg/ml/, диализиран за 24 h срещу χ 1 L 20 mM <MOPS mM EDTA mM EGTA ,рН 7,0 χ 1 L 20 тМ MOPS pH 7,0

2/ Реметализация

- 500 μΐ буфер 100 тМ /например MeS, MOPS, EPPS/*

- 145 μΐ деметаизиран ензим /например 2,15 mg/ml/

- 100 μΐ СаС1₂ /100, 50,30,20,10,5 или

2,5 тМ/

- χ μΐ K₂S₄0 /ЮОтМ/

- /255 - х/ Н₂0
крайна [СаС1₂] тМ	крайна [K₂SOJ тМ
0,25	14,75
0,5	14,5
1	14
2	13
3	12
5	10
10	0

* - pH MES e.g. 6,77 при стайна температура ще даде 6,0 при 90° / /рКа 6,15 рКа/ °C = - 0,011/

- рКа е от таблица на Merck амфотерен буфер

3. Топлинна инактивация ml ензимен разтвор, предварително инкубиран при стайна температура, се подлага на загряване при 90,5°С или 95°С в затворени тефлонови съдове при концентрация от около 0,2 mg/ml. Проби от по 50 μΐ се взимат през равни интервали от 0 до 6-тия час със спринцовка и се охлаждат върху лед. Остатъчната активност се определя с 4NP-DP5 /0,5 шМ/.

Времето на полуживот се определя чрез GRAPHPAD

Фигури 10 и 11 показват времето на полуживот /LD₅₀/ за WT и D7 α-амилазите при рН 5,5 и 7,0 респективно, като функция от конструкцията на Са²⁺ при 90,5°С. Са²⁺ зависимостта на 2D5 се определя само при рН 7,0 при 95°С /фигура 12/. Може да се види, че зависимостта на мутантите от Са²⁺ не е различна от тази за WT.

с. Термостабилност на мутантните а-амилази при различни стойности на рН

Зависимостта на термоинактивацията от рН за D7 и 2D5 се определя при 90,5 и при

95°С респективно, използвайки буфера, както бе описано по-горе при 1 тМ Са²⁺ концентрация. Може да се заключи, че термостабилността и за D7 и за 2D5 е много увеличена 5 над (два пъти за 2D5) над пълния рН интервал (фигури 13 и 14).

Пример 9. Продукция на мутантни ензими в Bacillus

Мутации в α-амилаза от Вас lichenifor10 mis, които са идентифицирани чрез експресия в E.coli WK6, се трансформират в експресионен вектор от Bacillus по два различни начина:

а/ С помощта на уникални рестрикционни сайтове вътре в α-амилазния ген (фиг.4), 15 фрагментите, носещи мутацията, се изолират от pMaTLia6 мутанти и се субклонират в хомоложни позиции на рВМаб. Последният плазмид, който може да бъде реплициран както в E.coli и така и в Bacillus, впоследствие се 20 смила със SacI и се рециркулизира с Т4 ДНК лигаза. След трансформация в Вас. Subtilis 1А40, се получава високо ниво на а-амилаза под контрола на SPO₂ промотора. Рециркуларизираният pBMa6Lia6, е наречен рВ6.1ла6,за 25 да се отбележи отстраняването на E.coli участък от вектора.

в/ рВМаб.Lia6 едноверижна ДНК се събира отново от E.coli и циркуляризира с двуверижна ДНК рВПсб, смила се до получаване 30 на дар-дуплекс с очакваната празнина върху α-амилазния ген. Тази празнина след това се подлага на сайт насочена мутегенеза с един олигонуклеотид /както бе описано в експерименталната част/, който кодира желаната 35 мутация. рВМсб Lia6 векторът след това се трансформира в pBMc.Lia6 тип вектор, както бе описано по-горе. Комбинация от различни едноверижни мутации могат да се осъществят чрез метод а/ако мутациите са в различни 40 празнини, като за предпочитане, обаче се използва метод в/.

мутациите на мутантите D7 и 2D5 се прехвърлят в рВМаб.Lia6 по метода а/ чрез замяна на SacII-Sall фрагментите α-амилаза45 та се извлича от културалната среда на трансформирания Вас.subtilis 1А40. Супернатантите от двата мутанта се подлагат на скрининг процедурите от примерите и е потвърдено, че и двата мутанта, продуцират а-ами50 лаза, която е по-киселиноустойчива и по-термостабилна от α-амилазата, продуцирана от природния тип pB6.Lia6.

1.1 ;ill!l! I II II

Фенотипът на α-амилазните мутации в Bacillus по този начин не се различава от фенотипа на E.coli.

Мутантите pB6.Lia6 се трансформират в Вас. licheniformis T9, който е протеазно негативен, α-амилазно негативен дериват от Bac.licheniformis Т5 (EP-0253455,CBS 470.83). Гостоприемникът T9 се използва за получаване на високо ниво на α-амилазни мутанти в хомоложна система. Отстраняването на хромозомния α-амилазен ген, превръща този щам в особено подходящ за продукция на мунатна α-амилаза, без контаминация от природния тип α-амилаза повече. Ензимът, получен от този щам, се използва за изпитване за промишлено приложение. Демонстрирано е индустриланото приложение на мутантите pB6.Lia6.2D5 и pB6.Lia6.D7.

Пример 10. Тест за прилагане на мутантна α-амилаза при условията на разграждане на нишесте.

Методът за разграждане на нишесте включва: поставяне на нишестето в контакт с мутантната α-амилаза за достатъчно време и при условия, при които α-амилазата разгражда нишестето.

За тестуване на мутантната а-амилаза 2D5 в по-реални обстоятелства, ферментационната култура се пречиства /от пример 9/ чрез ултрафилтрация и се формира ензимът с 50% пропиленгликол.

Тестуват се три проби:

893701: WT В.licheniformis Т5 α-амилаза

1530 TAU/g 893703: 2D5 Мутант, изготвен като WT 2820 TAU/g Maxamyl 0819 Търговски проби 7090 TAU/o

Една TAU единица за /термостабилност на α-амилаза се определя като количествто ензим, което превръща при стандартни условия 1 mg нишесте за 1 min в продукт, имащ еднаква абсорбция както оцветяването на йодна реакция - 620 nm. Стандартните условия са рН 6,6 ; 30°С; реакционно време - 20 min. Съответното оцветяване е 25 g СоС1₂.6Н₂0,3,84 g К₂Сг₂0₇ и 1 ml HCI /1М/ в 100 ml дестилирана вода.

1. Тест на набъбване при ниско рН /5,5 и 5,25/

Температурата на изливаното нишесте се увеличава до 110 ± 5°С толкова бързо, кол кото е възможно и се запазва за 6 min.

Набъбването се провежда в непрекъснат поток /5,4 Ι/h/. Три проби от 135 ml /1,5 min на разреждане/ са взети след 45,60 и 75 min от разреждането и се оставят при 95°С за 2 h. След този период, 50 ml от пробите се подкиселяват с 0,4 ml H₂SO₄1N до получаване на рН 3,5 и се поставят на водна баня за 10 min, за да бъде спряна ензимната активност преди Д.Е. определянето.

Оставащата част от пробата се охлажда за определяне остатъчната ензимна активност.

Изливаната смес е:

3,3 kg пшенично нишесте Д. 88% /2,904 kg сухо нишесте/ 5,45 1 вода /40 Т.Н./

Суха субстанция на изливаното нишесте е 33% рН се коригира до 5,5 с 1N сярна киселина или IN NaOH. Ензимна концентрация: 4,4 TAU/g сухо нишесте.

Скоростта на потока се проверява два или три пъти по време на третирането.

2. Определяне на Д.Е.

Суха субстанция от набъбналото нишесте се проверява с рефрактомер /около 34%/. Д.Е. се определя чрез известния lane Eynon метод. Резултатите са показани на фигура 15.

3. Остатъчна ензимна активност

Остатъчната ензимна активност в набъбването нишесте е определена чрез амилографа на Варбендер.

g картофено нишесте

390 ml дестилирана вода при 50°С ml Трисбуфер 0,05 М, рН 6,50 ml 1аС1₂.2Н₂0 за 30 g/l

Температурата се повишава до 80°С /1,5°С/ min/, докато вискозитетът се стабилизира /10 min/, 5 ml разредено набъбнало нишесте /7о до 50 ml с дестилирана вода/ се добавя, измерва се увеличението на вискозитета след 20 min, който вискозитет е функция на ензимната активност. Стандартна крива с позната ензимна концентрация позволява да се определи остатъчната активност в TAU.

Мутантът 2D5 се представя забележително по-добре при рН <5,5 и 110°С от WT ензима. С мутант 2D5 е получено увеличение от 2-3 ДЕ единици при рН 5,25.

Пример 11. Тест за приложение на мутантна α-амилаза при условията за текстилния дизайн

Декорацията на текстил включва поставяне на текстилна материя в контакт с мути15 шиш рала α-амилаза за достатъчно време и при условия, при които текстилната материя се декорира.

За тестуване на индустриалната приложимост на алкалните α-амилазни мутанти, тес- 5 тът се провежда за стабилност ри 20°С в следния разтвор:

1,4% Н₂0₂ /35% /

1,0-1,5% Сода каустик/100%/

15-20 ml/Ι натриев силикат /38 Ве/

0,3-0,5%1 Алкилбензен сулфонат /Ланарил N.A.-ICI/

0,5-1,0% Органичен стабилизатор /Тинокларит G/ j₄

След инкубация за 2,5 h, -амилазните мутанти, се подбират по техните желани свойства, следва да имат някаква остатъчна ензимна активност.

Claims

Патентни претенции

1. Мутантна α-амилаза, представляваща експресионен продукт на мутантна ДНК последователност, кодираща α-амилаза, харак- 25 теризираща се с това, че има най-малко една заместена аминокиселина в сравнение с природната α-амилаза и че мутантната а-амилаза проявява едно или повече подобрени биологични свойства в сравнение с природната а- 30 амилаза, като подобрена термостабилност, повишена стабилност при pH под 6,5 и/или повишена стабилност при pH над 7,5.

2. Мутантна α-амилаза, съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че природ- 35 ната ДНК последователност, кодираща а-амилаза, е получена от микроорганизми от род Bacillus.

3. Мутантна α-амилаза, съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че микроор- 40 ганизмите са избрани от групата, съдържаща B.stearothermophilus, В. licheniformis, B.amyloliquefaeiens.

4. Мутантна α-амилаза, съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризираща 45 се с това, че мутантната α-амилаза, различна от природната мутантна α-амилаза, се получава от В.licheniformis чрез аминокиселинно заместване при една или повече от позициите 111, 133 и 149 или при съответните позиции 50 във всяка хомоложна мутантна а-амилаза.

5. Мутантна α-амилаза, съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризираща се с това, че съдържа една или повече от следните заместени аминокиселини:

Ala-111-Thr, His-133-Tyr, Thr-149-Ile.

6. Мутантна ДНК последователност, кодираща мутантна α-амилаза, съгласно коя да е претенция от 1 до 5.

7. Експресионен вектор, съдържащ мутантна ДНК последователност, съгласно претенция 6.

8. Клетка-гостоприемник, съдържаща експресионния вектор, съгласно претенция 7.

9. Клетка-гостоприемник, природно неспособна да продуцира екстрацелуларни амилолитични ензими преди трансформация, характеризираща се с това, че се трансформира с експресионния вектор, съгласно претенция 7.

10. Клетка-гостоприемник, съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че е щам В.licheniformis T9.

11. Метод за получаване на мутантна α-амилаза с подобрени биохимични свойства, характеризиращ се с това, че включва:

- мутагенеза на ДНК последователност, кодираща а-амилаза;

- инкорпориране на мутантната ДНК последователност в експресионен вектор;

- трансформиране с експресионния вектор, съдържащ мутантната ДНК последователност на клетка-гостоприемник, подходяща за експресия и продукция на мутантната аамилаза;

- култивиране на трансформираните клетки, както са определени във всяка една от претенции 8-10, при условията на получаване на мутантна α-амилаза и - изолиране на мутантната α-амилаза от културалната среда.

12. Метод за разграждане на нишесте, в който се прилага мутантна α-амилаза, характеризиращ се с това, че нишестето се поставя в контакт с мутантна α-амилаза, както е определено във всяка една претенция от 1 до 5, за време и при условия присъщи за ензимната реакция.

13. Метод за декорация на текстил, в който се прилага мутантна α-амилаза, характеризиращ се с това, че текстилната материя се поставя в контакт с мутантна а-амилаза, както е определено във всяка една претенция от 1 до 5, за време и при условия, присъщи за ензимната реакция.

Приложение: 14 фигури