[go: up one dir, main page]

BG61791B1 - Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза - Google Patents

Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза Download PDF

Info

Publication number
BG61791B1
BG61791B1 BG98695A BG9869594A BG61791B1 BG 61791 B1 BG61791 B1 BG 61791B1 BG 98695 A BG98695 A BG 98695A BG 9869594 A BG9869594 A BG 9869594A BG 61791 B1 BG61791 B1 BG 61791B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
nucleic acid
desaturase
gla
isolated nucleic
plant
Prior art date
Application number
BG98695A
Other languages
English (en)
Other versions
BG98695A (bg
Inventor
Terry L. Thomas
Avutu S. Reddy
Michael Nuccio
Georges L. Freyssinet
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone-Poulenc Agrochimie
Publication of BG98695A publication Critical patent/BG98695A/bg
Publication of BG61791B1 publication Critical patent/BG61791B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Description

Област на техниката
Линолова киселина (18:2) (LA) се трансформира в γ-линоленова киселина (18:3) (GLA) чрез ензима А6-дезатураза. Когато този ензим или нуклеиновата киселина, която го кодира, се прехвърли в LA-произвеждащи клетки, се получава GLA. Изобретението осигурява нуклеинова киселина, съдържаща А6-дезатуразния ген. По-специално нуклеиновата киселина се състои от промотор, кодираща област и ограничаващи области на Аб-дезатуразния ген. Изобретението е насочено и към рекомбинантни конструкции на А6-дезатуразна кодираща област във функционална комбинация с хетероложни регулиращи последователности. Нуклеиновите киселини и рекомбинантните конструкции от изобретението се използват за получаване на GLA в трансгенни организми.
Предшестващо състояние на техниката
Ненаситени мастни киселини, такива като линолова (С]8А9·12) и α-линоленова (С18 А9·12·18) киселини, са важни диетични съставни части, които не могат да се синтезират от гръбначни животни, тъй като гръбначните клетки могат да вкарват двойни връзки в А9 позицията на мастни киселини, но не могат да вкарват допълнителни двойни връзки между Δ9 двойната връзка и метиловия край на мастната киселинна верига. Тъй като те са предшественици на други продукти, линоловата и а-линоленовата киселини са важни мастни киселини и обикновено се получават от растителни източници. Линоловата киселина може да се превърне в γ-линоленова (GLA, Clg А6·9·12) киселина от бозайници, която от своя страна може да се превърне в арахидонова киселина (20:4), крайно важна мастна киселина, тъй като тя е важна основа за повечето простагландини.
Диетичното осигуряване на линолова киселина, благодарение на нейното превръщане в GLA и арахидонова киселина, задоволява диетичната нужда от GLA и арахидонова киселина. Установено е, че има връзка между консумацията на наситени мазнини и болестни състоя ния, такива като хиперхолестеролемия, атеросклероза и други химични нарушения, свързани с податливост към коронарни заболявания, докато консумацията на ненаситени мазнини се свързва с намаляване на концентрацията на холестерол в кръвта и намаляване риска от атеросклероза. Терапевтичната полза от диетичната GLA е, че тя е предшественик на арахидоновата киселина и така спомага за простагландиновия синтез. Съответно консумацията на по-ненаситената GLA, вместо линоловата киселина, има потенциални здравни предимства. Обаче GLA не присъства в буквално нито едно от търговско отглежданите културни растения.
Линоловата киселина се превръща в GLA чрез ензима А6-дезатураза.А6-дезатураза, ензим от около 359 аминокиселини, има мембранносвързана част и активно място за дезатуриране на мастни киселини. Когато този ензим премине в клетки, ендогенно произвеждащи липолова киселина, но не GLA, се получава GLA. Чрез осигуряване на генкодираща А6-дезатураза изобретението позволява получаването на трансгенни организми, които съдържат функционална А6-дезатураза и които произвеждат GLA. Освен че позволява получаването на големи количества GLA, изобретението осигурява нови диетични източници на GLA.
Същност на изобретението
Изобретението се отнася до изолиран А6-дезатуразен ген. По-специално изолираният ген се състои от А6-дезатуразен промотор, кодираща област и ограничаваща област.
Изобретението описва още насочващи вектори, състоящи се от А6-дезатуразен промотор, кодираща област и ограничаваща област.
Изобретението описва също насочващи вектори, състоящи се от А6-дезатуразна кодираща област във функционална комбинация с хетероложни регулиращи области, т.е. елементи непроизтичащи от А6-дезатуразния ген.
Изобретението осигурява също клетки и организми, съдържащи векторите от настоящото изобретение и потомци на такива организми.
Изобретението осигурява също изолирана бактериална А6-дезатураза и освен това е насочено към изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална А6-дезатураза.
По-нататък изобретението осигурява ме съдържание на γ-линоленова киселина (GLA), който се състои в трансформиране на растителна клетка с изолирана нуклеинова киселина от настоящото изобретение и регенериране на растение с увеличено съдържание на GLA от споменатата растителна клетка.
Изобретението осигурява също метод за получаване на студоустойчиви растения.
Пояснение на приложените фигури
Фигура 1 описва хидропатийните профили на извлечените аминокиселинни последователности на Synechocystis А6-дезатураза (част А) иА12-дезатураза (част В). Предполагаемите мембранно-въртящи се области са обозначени чрез плътни линии. Хидрофобният индекс е изчислен за отрязък от 19 аминокиселинни остатъка [Kyte, и др. (1982) J. Molec. Biol. 157);
Фигура 2 - газ-течни хроматографски профили на дива (част А) и трансгенна (част В) Anabaena;
Фигура 3 - диаграма от карти на козмидите cSy75, cSyl3 и cSy7 със застъпващи се области и клонинги. Произходите на клонингите на cSy75, cSy75-3,5 и cSy7 са обозначени чрез наклонени диагонални линии. Дезактивираните ограничителни места са в скоби;
фигура 4 - описва газ-течни хроматографски профили на див (част А) и трансгенен (част В) тютюн.
Подробно описание на изобретението
Изобретението осигурява изолирана нуклеинова киселина, кодираща Д6-дезатураза. За да се идентифицира нуклеиновата киселина, кодираща А6-дезатураза, се изолира DNA от организъм, който произвежда GLA. Споменатият организъм може да бъде например животинска клетка, някои гъби (например Mortierella), някои бактерии (като Synechocystis) или определени растения (пореч, Oenothera, френско грозде). Изолирането на геномната DNA може да се осъществи чрез множество методи, добре известни за средния специалист в областта, онагледени с примери от Sambrook и др. (1989) в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Изолираната DNA се разделя на части чрез физични методи или ензимно разлагане и се клонира до подходящ вектор, като бактериафага или козмиден вектор, чрез който и да е от множество добре известни от литературата методи, например от Sambrook и др. (1989). По-специално тук се разглеждат насочващи вектори, съдържащи DNA от изобретението DNA кодиращата Δό-дезатураза може да се идентифицира чрез функционален анализ. Векторът, съдържащ разделената на части DNA, се прехвърля например чрез инфекция, трансконюгация и трансфекция в гостоприемен организъм, който произвежда линолова киселина, но не GLA. Използваният тук термин “трансформация” означава най-общо вграждане на чужда DNA в гостоприемна клетка. Методи за вкарване на рекомбинантна DNA в гостоприемен организъм са известни на средния специалист в областта и са изложени например в Sambrook и др. (1989). Произвеждането на GLA от тези организми (т.е.придобиване на функция) се изследва например чрез газова хроматография или други методи, известни на средния специалист в областта. Организмите, накарани да произвеждат GLA, т.е. придобили функция, чрез вкарването на вектора, се идентифицират, като се извлича DNA кодиращата Д6-дезатураза, а споменатата DN А се възстановява от организмите. Възстановената DNA може отново да се раздели на части, да се клонира с насочващи вектори и да се оцени функционално по-горните процедури, за да се определи с по-голяма точност DNA кодиращата А6-дезатураза.
Като пример от изобретението се изолира произволна DNA от цианобактерията Synechocystis Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, American Type Culture Collection (ATCC) 27184, клонира се в козмиден вектор и се вкарва чрез трансконюгация в цианобактерийния щам Anabaena РСС 7120, АТСС 27893, който е с недостиг на GLA. Получаването на GLA от съдържаща Anabaena линолова киселина се следи чрез газова хроматография и се изолира съответният DNA фрагмент.
Изолираната DNA се структурира чрез методи, добре известни на средния специалист в областта, като например в Sambrook и др. (1989).
В съответствие с настоящото изобретение се изолира DNA, съдържаща А6-дезатуразен ген. По-специално от цианобактерията Synechocystis се изолират 3,588 килобаза (kb) DNA, съдържаща А6-дезатуразен ген. Определя се нуклеотидната последователност на 3,588 ля се нуклеотидната последователност на 3,588 kb DNA, която е показана в SEQ ID N0:1. Отворени отчитащи контури, определящи потенциални кодиращи области, присъстват в нуклеотиди от 317 до 1507 и в нуклеотиди στ 2002 до 3081. За 5 да се определят нуклеотидите, кодиращи Δ6дезатураза, 3,588 kb фрагмента, който причинява А6-дезатуразна активност, се разцепва на два подфрагмента, всеки от които съдържа само един отворен отчитащ контур. Фрагментът 10 ORF1 съдържа нуклеотиди от 1 до 1704, докато фрагментът ORF2 съдържа нуклеотиди от 1705 до 3588. Всеки фрагмент се субклонира в двете - права и обратна, ориентации до конюгиращ насочващ вектор (АМ542, Wolk и др. 15 [1984] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561), който съдържа цианобактериен карбоксилазен промотор. Получените структури [m.e. ORF1 (F), ORF1(R), ORF2(F) и ORF2(R)] се конюгират до див тип Anabaena РСС 7120 посредс- 20 твом стандартни методи (виж. например, Wolk и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561).
Конюгираните клетки от Anabaena се идентифицират, като NeoR зелени колонии върху кафява основа от умиращи неконюгирани клетки, след двуседмичен растеж върху селективна среда (стандартна минерална среда BG11N + съдържаща 30pg7ml немоцин, съгласно Rippka и др., (1979) J. Gen Microbiol 111, 1). Подбират се зелените колонии и израстват в селективна течна среда (BG11N +с 15 pg/ml неомицин). Чрез стандартни методи се екстрахират липиди (например, Dahmer и др. (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) от получените трансконюгати, съдържащи право и обратно ориентираните ORF1 и ORF2 конструкции. За сравнение липидите също се екстрахират от диви типове култури Anabaena и Synechocystis. Метиловите естери на мастни киселини се анализират чрез газ-течна хроматография (GLC), например с Тгасог-560 газтечен хроматограф, снабден с йонизиращ детектор с водороден пламък и капилярна колона. Резултатите от GLC анализа са показани в
Таблица 1:
Разпространение на С18 мастни киселини в див тип цианобактерия и трансгенна цианобактерия
SOURCE 18:0 18:1 18:2 γ18:3 ul8:3 18:4
Anabaena (wild type) + + + - + -
Anabaena + ORF1(F) 4 4 - 4 -
Anabaena + ORFl(R) + + 4 - 4 -
Anabaena » ORF21F) + + + 4 4
Anabaena + ORF2IR) 4- 4 4 - 4 -
Synechocystis (wild type) + 4 + 4 - -
таблица 1.
Както показва GLC анализът, Anabaena с недостиг на GLA придобива свойството (функцията) да произвежда GLA, когато се вкарва чрез трансконюгация, конструкцията съдържаща ORF2 в права ориентация. Трансконюгати, съдържащи конструкции с ORF2 в обратна ориентация спрямо карбоксилазния промотор или ORF1 в която и да е ориентация, не произвеждат GLA. Този анализ показва, че единичният отворен отчитащ контур (ORF2) в 1884-ия Ьр фрагмент кодира А6-дезатураза. 1884-ият Ьр фрагмент е SEQ ID N0:3. Това се потвърждава от цялата прилика на хидропатийните профили между А6-дезатураза и А12-дезатураза
[Waga и др. (1990) Nature 347], както е показано на фиг. 1, като (А) и (В) съответно.
Изолираните нуклеинови киселини, кодиращи А6-дезатураза, могат да бъдат различени от другите организми, които произвеждат GLA, чрез описания по-горе анализ за придобито свойство или чрез хибридизационни методи с нуклеинова киселина, използващи изолираната нуклеинова киселина, която кодира Anabaena А6-дезатураза, като хибридизационна проба. И двата - геномен и cDNA клониращ, метода са известни на специалистите и са изложени в изобретението. Хибридизационната проба може да съдържа цялата DNA последователност, описана като SEQ ID N0:1 или ограничаващ фрагмент или друг съответен DNA фрагмент, включващ олигонуклеотидна проба. Методите за клониране на хомоложни гени чрез кръстосана хибридизация са известни на средния специалист в областта и са описани например в Sambrook (1989) u Beltz и др. (1983) Methods in Enzymology 100, 266.
Трансгенните организми, които са придобили функцията да произвеждат GLA, чрез вкарване на DNA кодираща Δ-дезатураза, също така придобиват свойството да произвеждат октадекатетраеноена киселина (18:4 д6·’·12·15). Октадекатетраеноена киселина присъства обикновено в рибни масла и в някои растителни видове от рода Boraginaceae (Craid и др. [1964] J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 209-211; Gross и др. [1976] Can. J. Plant Sci. 56, 659-664). В трансгенните организми от настоящото изобретение октадекатетраеноената киселина се получава от по-нататъшно дезатуриране на а-линоленова киселина чрез А6-дезатураза или дезатуриране на GLA посредством А15-дезатураза.
359-те аминокиселини, кодирани от ORF2, т.е. отворения отчитащ контур, кодиращ Δ6дезатураза, са показани като SEQ ID N0:2. В изобретението също са описани други нуклеотидни последователности, които кодират аминокиселините от SEQ ID N0:2. В компетенцията на средния специалист е да идентифицира такива последователности, които се получават, например от дегенерирането на генетичния код. Освен това, средният специалист в областта може да определи чрез описания по-горе анализ за придобито свойство по-малки подфрагменти на 1884-ия Ьр фрагмент, съдържащ ORF2, който кодира Δό-дезатураза.
В друг аспект на изобретението вектор, съдържащ 1884-ия Ьр фрагмент или по-малък фрагмент, съдържащ промотор, кодираща последователност и ограничаваща област на Δ6дезатуразен ген се прехвърля в организъм, например цианобактерия, в която Δό-дезатуразният промотор и ограничаващите области са функционални. Съответно това изобретение осигурява организми произвеждащи рекомбинантна Δό-дезатураза. Още един аспект на настоящото изобретение е осигуряването на изолирана Δδ-дезатураза, която може да бъде пречистена от рекомбинантните организми чрез стандартни методи за протеиново пречистване. (Виж, например, Ausubel и др. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing
Associates, New York).
Изобретението също осигурява вектори, съдържащи DNA кодираща Дб-дезатураза. За средния специалист в областта е очевидно, че могат да се конструират подходящи вектори, които да насочват преминаването на Л6-дезатуразната кодираща последователност в множество организми. По-специално се предпочитат възпроизвеждащи се насочващи вектори. Описаните тук възпроизвеждащи се насочващи вектори са DNA или RNA молекули, конструирани за контролирано Еасочване на желания ген, т.е. Л6-дезатуразния ген. За предпочитане векторите са плазмиди, бактериофаги, козмиди или вируси. Совалкови вектори като описаните от Wolk и др. 11984) Proc. Narl. Acad. Sci. USA, 1561-1565 и Bcstos и др. (1991) J.Bacteriol. 174, 7525-7533. се изследват в настоящото изобретение. Samborook и др. (1989), Goeddel, ed. (1990) Methods ir. Enzymology 185 Academic Press и Perbal (19881 A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., дават подробен преглед на вектори, в които може да бъде вкарана и насочена нуклеинова киселина, кодираща наличната Аб-дезатураза. Такива вектори също съдържат нуклеинови киселинни последователности, които могат да влияят на насочването на нуклеиновите киселини, кодиращи А6-дезат>раза. Последователности, способни да влияят на насочването на генен продукт, са промотори. усилващи елементи, възходящо активираща последователности, транскрипционни ограничаващи сигнали и полиаденилиращи места. Разглеждат се и двата-съставен и тъканно-спестфичен промотори. По-специално интересни за трансформиране на растителни клетки са 35S промотора на цветнозелевия мозаечен вирус (CaMV) и промотори, които се регулират по време на узряването на растителните семена. Всички тези промотори и транскрипцонни регулаторни елементи, самостоятелно или в комбинация, се разглеждат за използване в настоящите възпроизвеждащи се насочващи вектори и са известни на средния специалист в областта. CaMV 355 промотора е описан например от Restrepo и др. (1990) Plant Cell 2, 987. Също се изследват генетично конструирани и мутирали регулаторни последователности. Средният специалист в областта може да определи подходящите вектори и регулаторни елементи за носител в конкретна гостоприемна клетка. Нап кодиращ карбоксилазата на Anabaena, оперативно свързан с кодиращата област на А6-дезатураза и също оперативно свързан с ограничаващ сигнал от Synechocystis, е подходящ за носител на Л6-дезатураза в цианобактерия. “Оперативно свързан” в този контекст, означава, че промоторът и ограничаващите последователности действат ефективно за регулиране на транскрипцията. Примерно вектор, подходящ за носител на А6-дезатураза в трансгенни растения, може да включва семенно-специфична промоторна последователност, получена от хелиантинин, напин или глицин, оперативно свързана с А6-дезатуразната кодираща област и също оперативно свързана със семенен огарничаващ сигнал или с нопалиновия синтезен ограничаващ сигнал.
По-специално хелиантиновите регулаторни елементи, описани в нерешена US заявка 682 354, заявена на осми април 1991 и цитирана тук за справка, са описани като промоторни елементи, насочващи пренасянето на 6дезатуразата от настоящото изобретение.
Модификациите на описаните тук нуклеотидни последователности или регулаторни елементи, които притежават дадените тук функции, са в обхвата на това изобретение. Такива модификации са прибавки, заместители и заличители и специфични заместители, които отразяват разрушаването на генетичния код.
Стандартните методи за конструиране на такива хибридни вектори са добре известни на средните специалисти в областта и са описани в публикации, такива като Sambrook и др. (1989) или в който и да е от многобройните, широко разпространени лабораторни наръчници за рекомбинантна DNA технология. Познати са множество подходи за лигазиарне на фрагментите на DNA, изборът на които зависи от естеството на края на DNA фрагментите. По-нататък се описва включването в хибридните вектори на други елементи с нуклеотидни последователности, които улесняват клонирането, насочването или обработката, например последователности, кодиращи сигнални пептиди, последователност, кодираща KDEL, който е необходима за задържане на протеините в ендоплазмения ретикулум или последователности, кодиращи транзитни пептиди, които насочват Δ6дезатуразата към хлоропласта. Такива последователности са известни на средния специалист в областта. Оптимизирани транзитен пеп тид е описан например в Van den Вгоеск и др. (1985) Nature 313, 358. Прокариотни и еукариотни сигнали последователности са описани например от Michaelis и др. (1982) Ann.Rev. Micrrobiol. 36,425.
Друг аспект от изобретението осигурява организми от цианобактерията, които съдържат DNA, кодираща А6-дезатуразата от това изобретение. Трансгенните организми, съответно описани в настоящето изобретение, са бактерии, цианобактерии, гъби и растения и животни. Изолираната DNA от настоящото изобретение може да бъде вкарана в гостоприемника по методи, известни от нивото на техниката, например инфекция, трансфекция, трансформиране или трансконюгация. Методите за трансфер на DNA от настоящото изобретение в такива организми са добре известни и са описани в публикации, такива като Sambrook и др. (1989).
Известни са множество методи за трансформиране на растения. Д6-дезатуразният ген може да се вкара в растенията през листото, чрез трансформационно-регулационна процедура, описана от Horsh и др. (1985) Science 227, 1229. Други методи за трансформация, такива като протопластно културиране (Horch и др. (1984) Science 223, 496; DeBlock и др. (1984) ЕМВО J.2, 2143; Barton и др. (1983) Cell 32, 1033), могат също да бъдат използвани и са в обхвата на това изобретение. За предпочитане е растенията да се трансформират с Agrobacterium-получени вектори. Все пак известни са и други методи за вкарване на Δό-дезатуразния ген от настоящото изобретение в растителни клетки. Такива алтернативни методи са биолистни подходи (Klein и др. (1987) Nature 327, 70), химически индуцирано DNA поемане или използване на вируси или цветен прашец като вектори.
Когато е необходимо за метода за трансформация, Δό-дезатуразният ген от настоящото изобретение може да бъде вкаран в растителен трансформационен вектор, като двойния вектор, описан от Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Растителни трансформацонни вектори могат да бъдат получени чрез модифициране на естествената генна система за трансфер на Agrobacterium tumefaciens. Естествената система включва големи Ti (туморпредизвикващи)-плазмиди, съдържащи голям сегмент, известен като Т-DNA, който е прех върлен на трансформираните растения. Друг сегмент от Ti плазмида, vir областта, е необходим за Т-DNA трансфер. Т-DNA областта граничи с крайни повтарящи се елементи. В модифицираните двойно вектори тумор-предизвикващите гени са премахнати и функциите на vir областта се използват да прехвърлят чуждата DNA, граничеща с Т-DNA граничните последователности. Т-областта съдържа също селективен маркер за антибиотична устойчивост и многократно клониращо място за вкарване на последователности за трансфер. Такива конструирани щамове са известни като “обезвредени” A. tumefaciens щамове и позволяват ефикасна трансформация на последователности, граничещи с Т-областта в ядрените геноми на растенията.
Повърхностно стерилизирани листа се заразяват с “обезвредения” A.tumefaciens, съдържащ чужда DNA, култивират се за два дни и след това се прехвърлят в среда, съдържаща антибиотик. След внедряването в среда, съдържаща подходящ антибиотик, се избират трансформирани части от тъкан, прехвърлят се в пръст и регенерират.
Като друг аспект от изобретението се осигуряват трансгенни растения или прогени на тези растения, съдържащи изолирана DNA от изобретението. Изследват се както едносемеделен, така и двусемеделни растения. Растителни клетки се трансформират с изолираната DNA кодираща А6-дезатураза по който и да е от методите за трансформиране на растения, описани по-горе. Трансформираната растителна клетка, обикновено намираща се в новообразувание на кората или в листото, регенерира до завършено трансгенно растение по методи, добре известни на средния специалист от областта (напр. Horsch и др. (1985) Science 227, 1129). За предпочитане трансгенното растение е слънчоглед, маслодайна рапица, царевица, тютюн, фъстък или соя. Тъй като прогените на трансформираните растения наследяват DNA кодираща А6-дазатураза, семена или отрязъци от трансформираните растения се използват, за да поддържат трансгенната растителна линия.
Изобретението също осигурява метод за получаване на трансгенни растения с увеличено съдържание на GLA. Този метод включва вкарване на DNA кодираща А6-дезатрузата в растителни клетки, които нямат GLA или са с ниски нива на GLA,ho съдържат LA, и регенериране на растения с увеличено съдържание на GLA от трансгенните клетки. Поспециално като трансгенен организъм се използват търговско отглеждани културни растения, като слънчоглед, соя, маслодайна рапица, царевица, фъстък и тютюн, без те да се считат за ограничаващи.
Изобретението осигурява също метод за получаване на трансгенни организми, които съдържат GLA. Този метод включва вкарване на DNA кодираща А6-дезатураза в организъм, който няма GLA или е с ниски нива на GLA, но съдържа LA. В друг случай включва вкарване на един или повече насочващи вектори, които съдържат DNA кодираща А12-дезатураза и А6-дезатураза в организми, които са с недостатъчно GLA и LA. Съответно организми с недостатъчно GLA и LA се предизвикват да произвеждат LA чрез вкарването на Δ12дезатураза, а след това генерират GLA вследствие на вкарването Д6-дезатураза. Насочващи вектори, съдържащи DNA кодираща Д12-дезатуразата или Д12-дезатураза и Д6-дезатураза, могат да бъдат конструирани по методите на рекомбинантната технология, известни на средния специалист от областта (Sambrook и др., 1989) и публикуваната последователност 12дезатураза (Wada и др. [1990] Nature (London) 347, 200-203). Също така е намерено в съответствие с настоящото изобретение, че нуклеотиди 2002-3081 от SEQ ID N0:1 кодират цианобактерийната Д12-дезатураза. Съответно тази последователност може да се използва за конструиране на споменатите насочващи вектори. По-специално като трансгенен организъм се използват отглеждани културни растения, за търговия, като слънчоглед, соя, маслодайна рапица, царевица, фъстък и тютюн, без те да се считат за ограничаващи.
Изобретението се отнася също до метод за предизвикване на студоустойчивост в растения. Чувствителността към студ може да се дължи на фазово преминаване на липиди в клетъчни мембрани. Температурата на фазово преминаване зависи от степента на ненаситеност на мастни киселини в липидните мембрани и по-този начин, увеличавайки степента на ненаситеност, например чрез вкарване на Δ6дезатураза, в която да преобразува LA в GLA, може да се предизвика или подобри студоустойчивостта. Съответно настоящият метод включва вкарването на DNA кодираща А6-дезатураза в растителна клетка и регенериране на растение с подобрена студоустойчивост от споменатата трансформирана растителна клетка, за предпочитане растението е слънчоглед, соя, маслодайна рапица, царевица, фъстък или тютюн.
Следващите примери илюстрират изобретението.
Пример 1. Щамове и условия за култивиране
Synechocystis (РСС 6803, АТСС 27184), Anabaena (РСС 7120, АТСС 27893) и Synechococcus (РСС 7942, АТСС 33912) се отглеждат фотоавтотропно при 30° С в BG11N + среда (Rippka и др. [1979] J.Gen. Microbiol. Ill, 1-61) при осветяване от лампи с нажежаема жичка (60 μ E.m2.S’). Избират се козмиди и плазмиди и се размножават в Escherichia coli щам DH5a върху LB среда с прибавени антибиотици при стандартни концентрации, както е описано от Maniatis и др. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryq Cold Spring, New York.
Пример 2. Конструиране на Synechocystis козмидна геномна съвкупност
Общата геномна DNA от Synechocystis (РСС 6803) се разрежда частично с Sau3A и се фракционира при захарозен градиент (Ausubel и др. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Избират се фракциите, съдържащи 30 до 40 kb DNA фрагменти, и се лигазират в дефосфорилираното BamHI мястото на козмидния вектор, pDUCA7 (Buikema идр. [19991] J. Bacteriol. 173, 1879-1885). Лигазираната DNA се опакова in vitro, както е описано от Ausubel и др. (1987) и опакованата фага се размножава в E.coli DN5a. съдържаща Aval и Есо4711 метилазен помощен плазмид, pRL528, както е описан от Buikema и др., 1991.Общо 1152 колонии се изолират в произволен ред и се отглеждат индивидуално в дванадест 96гнездни микротитърни плочи.
Пример 3. Придобиване на функция след вкарване на GLA в Anabeana
Anabaena (РСС 7120). но съдържа значителни количества линолова киселина, която е предшественик на GLA /фигура 2, таблица 2). Svnechocystis козмидната съвкупност, описана в пример 2, се конюгира в Anabeana (РСС 7120), за да се идентифицират трансконюгатите, които произвеждат GLA. Клетките Ana beana се отглеждат до средна фаза в BG11N + течна среда и се ресуспендират в същата среда до получаване на крайна концентрация от приблизително 2 х 108 клетки на ml. Културата от средната фаза, E.coli RP4 (Burkartdt и др. [1979] J.Gen Microbiol. 114, 341-348), отгледана в LB, съдържаща ампицилин, се промива и ресуспендира в свежа LB среда. След това Anabaena и RP4 се смесват и се разполагат равномерно върху BG11N+ плочи, съдържащи 5% LB. Козмидната геномна съвкупност отново се разполага върху LB плочи, съдържащи 50 g/ml канамицин и 17.5 pg/ml хлорамфеникол и последователно се поставя на BG11N + плочи, съдържащи Anabeana и RP4. След 24-часов престой в инкубатор при 30°С се подсладява 30 pg/ml неомицин и престоят в инкубатор при 30°С продължава, докато се появят трансконюгати.
След конюгация се изолират индивидуални трансконюгати и се отглеждат в 2 ml BG11N + течна среда с 15 pg/ml неомицин. Получават се метилови естери на мастна киселина от див тип култури и култури, съдържащи множества от по десет трансконюгати, както следва. След центофугиране се получават див тип и трансгенни цианобактерийни култури, които се промиват двукратно с дестилирана вода. От тези култури се екстрахират метилови естери на мастна киселина, както е описано от Dahmer и др. (1989) J.Amer.Oil. Chem.Soc. 66, 543-548, и се анализират чрез газ-течна хроматограхфия (GLA), като се използва Jracor-560, снабден с водородно-пламъчен йонизационен детектор и капилярна колона (30 m η 0.25 mm, свързана с FSOT Superox 11, Alltech Associates Ins., IL). За идентифициране на мастни киселини се използват времената на задържане и кохроматография на стандартни проби (получени от Sigma Chemical Co.). Средната мастно-кисела композиция се определя като съотношение на пиковата стойност (област) на всяка С18 мастна киселина към нейната стандартна стойност.
Представителни GLC профили са показани на фиг.2. Показани са метилови естери на С18 мастна киселина. Пиковете се идентифицират чрез сравняване на времената за елюиране с известните стандартни стойности за метилови естери на мастна киселина и след това се потвърждават чрез газхроматографска масспектрометрия. Част А представлява GLC ана лиз на мастни киселини от див тип Anabaena. Стрелката показва миграционното време на GLA. Част В представлява GLC профил на мастни киселини на трансконюгати от Anabaena с pAM542+1.8F. За две GLA произвеждащи множества (от 25 множества с общо 250 трансконюгати) се доказва, че произвеждат GLA. Индивидуални трансконюгати от всяко от тези множества се анализира за това дали произвежда GLA; два независими трансконюгата, AS13 и AS75, по един от всяко множество, се идентифицират, че имат значителни нива GLA и че съдържат козмиди, съответно cSyl3 и cSy75 (фигура 3). Козмидите се застъпват в област с дължина приблизително 7,5 kb 3.5 kb Nhel фрагмент от cSy75 се реклонира във вектор pDUCA7 и се прехвърля в Anabaena, която придобива функция да отделя GLA (таблица 2).
Два Nhel/Hind III подфрагмента (1.8 и 1.7 kb) на 3.5 kb Nhe I фрагмента на cSy75-3.5 се субклонират в “pBLUESCRIPT” (Stratagene) (фигура 3) за получаване на последователност. Прилагат се стандартни молекулярни биологични методи, както е описано от Maniatis идр. (1982) и Ausubelnap. (1987). Осъществява се получаване на дидеоксипоследователност (Sanger и др. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463, 5467) на pBS1.8 c “SEQUENASE” (United States Biochemical) на двете вериги чрез използване на специфични олигонуклеотидни първични слоеве, синтезирани от Advanced DNA Technology Laboratory (Biology Department, Texas
A & M University). Осъществява се анализ на DNA последователността с GCG (Madison, WI) софтуер, както е описано от Devereux и др. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Двата подфрагмента Nhel/Hindlll се прехвърлят в конюгиращ насочващ вектор АМ542, както в права, така и в обратна ориентация спрямо цианобактерийния карбоксилазен промотор и се вкарват в Anabaena чрез 10 конюгация. Трансконюгатите, съдържащи 1,8 kb фрагмента в права ориентация (АМ5421.8F), произвеждат значителни количества GLA и октадекатетраеноена киселина (фигура 2; таблица 2). Трансконюгати, съдържащи 15 други конструкции, обратно ориентиран 1.8 kb фрагмент или право и обратно ориентиран 1.7 kb фрагмент, не произвеждат видими нива GLA (таблица 2).
Във фигура 2 се сравняват С18 мастно20 киселинен профил на екстракт от див тип Anabaena (фигура 2А) с този на трансгенна Anabaena, съдържаща 1.8 kb фрагмента на cSy75-3.5 в правата си ориентация (фигура 2В). GLC анализът на метилови естери на мастна 25 киселина от AM542-1.8F показва пик с време на задържане, идентично с това на автентичната стандартна GLA. Анализът на този пик чрез газ-хроматографска масспектрометрия (GC-MS) показва, че той има същото масфраг30 ментиране, като GLA проба. Трансгенни Anabaena с променени нива на полиненаситени мастни киселини са подобни на дивия тип по темп на растеж и морфология.
Таблица 2
Състав на С18 мастни киселини в див тип и в трансгенна цианобактерия
Щам Мастна киселина (%)
18:0 18:1 18:2 18:3 (α) 18:3 (γ) 18:4
Див тип
Synechocystis (sp.PCC6803) 13.6 4.5 54.5 - 27.3 -
Anabaena 2.9 24.8 37.1 35.2 - -
(sp.PCC7120) Synechococcus (Sp.PCC7942) 20.6 79.4 - - - -
Anabaena трансконюгати
cSy75 3.8 24.4 22.3 9.1 27.9 12.5
cSy75-3.5 4.3 27.6 18.1 3.2 40.4 6.4
PAM542-1.8F 4.2 13.9 12.1 19.1 25.4 25.4
PAM542-1.8R 7.7 23.1 38.4 30.8 - -
pAM542-1.7F 2.8 27.8 36.1 33.3 - -
pAM542-1.7R 2.8 25.4 42.3 29.6 - -
Synechococcus трансформанти
pAM854 27.8 72.2 - - - -
ρΑΜ854-Δ12 4.0 43.2 46.0 - - -
ρΑΜ854-Δό 18.2 81.8 - - - -
ρΑΜ854-Δ6 & Δ12 42.7 25.3 19.5 - 16.5 -
18:0, стеаринова киселина; 18:1, олеинова киселина; 18:2, линолова киселина; 18:3 (а), а-линоленова киселина; 18:3 (γ), γ-линоленова киселина; 18:4, октадекатетраеноена киселина Пример 4. Трансформиране на Synechococcus с Δ6 и Δ12 дезатуразни гени.
Трети козмид, cSy7, който съдържа Δ12дезатуразен ген, се изолира чрез отделяне от Synechocystis геномната съвкупност на олигонуклеотид, синтезиран от публикуваната Synechocystis дезатуразна генна последователност (Wada и др. [1990] Nature (London) 347, 200203). 1.7 kb Aval фрагмент от този козмид, съдържащ Л12-дезатуразния ген, се идентифицира и служи като пример, за да демонстрира, че cSyl3 съдържа не само А6-дезатуразен ген, но също и А12-дезатуразен ген (фигура 3). Геномният Southern Blot анализ показва, че и двата Δ6 и А12-дезатуразни гена са уникални за Synechocystis геном, така че двата функционални гена, включени в С18 мастнокиселинното дезатуриране, са тясно свързани в Synechocystis генома.
Едноклетъчната цианобактерия Synechocystis (РСС 7942) е с недостатъчно съдържание, както на линолова киселина, така и на GLA(3). Δ12 и Δ6 дезатуразните гени се клонират индивидуално и заедно в рАМ854 (Bustos и др. дд [1991] J. Bacteriol. 174, 7525-7533), совалков вектор, който съдържа последователности, необходими за интегриране на чуждата DNA в генома Synechococcus (Golden и др. [1987] Methods in Enzymol. 153, 215-231). Synechoco- 45 ecus се трансформира c тези генни конструкции и се избират колонии. Метиловите естери на мастна киселина се екстрахират от трансгенна Synechococcus и се анализират чрез GLC.
Таблица 2 показва, че основните мастни 50 киселини на дивия тип Synechococcus са стеаринова киселина (18:0) и олеинова киселина (18:1). Synechococcus трансформиран с рАМ
854- 12 отделя линолова киселина (18:2), освен основните мастни киселини. Трансформантите с рАМ854- Δ6 и Δ12 произвеждат както линолеат, така и GLA (таблица 1). Тези резултати показват, че Synechococcus, съдържащ и двата Δ12- и Δό-дезатуразни гена, придобива способността да вкара втора двойна връзка в Δ12 позиция и трета двойна връзка в Δ6 позиция на С18 мастни киселини. Все пак не се забелязват промени в мастно-киселинния състав на трансформанта, съдържащ рАМ854- Δ6, което показва, че при отсъствието на субстрат, синтезиран от А12-дезатураза, 6-дезатуразата не е активна. Освен това този експеримент показва, че 1.8 kb Nhel/ Hindlll фрагмента (фигура 3) съдържа, както кодираща, така и промоторна област на Synechocystis А6-дезатуразния ген. Трансгенните Synechococcus с променени нива на полиненаситени мастни киселини са подобни на дивия тип по темп на растеж и морфология.
Пример 5. Нуклеотидна последователност на 6-дезатураза
Определя се нуклеотидната последователност на 1.8 kb фрагмента на cSy75-3.5, включващ функционалния Л6-дезатуразен ген. Идентифицира се отворен отчитащ контур, кодиращ полипептид от 359 аминокиселини (фигура 4). Kyte-Doolittle хидропатиен анализ (Kyte идр. [1982] J. Mol. Biol. 157, 105-132) показва две области на хидрофобни аминокиселини, които могат да представляват трансмембранни домени (фигура 1А); освен това, хидропатийният профил на Аб-дезатуразата е подобен на този на А12-дезатуразния ген (фигура IB; Wada и др.) и на 9-дезатуразите (Thiede идр. [1986] J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Подобието на последователностите между Synechocystis Δ6- и Л12-дезатурази е по-малко от 40% при нуклеотидното ниво и е приблизително 18% при аминокиселинното ниво.
Пример 6. Трансфер на цианобактериална А6-дезатураза в тютюн
Цианобактериалният А6-дезатуразен ген се вкарва в растителен насочващ вектор и се прехвърля в тютюн, като се използват генни методи за трансфер посредством Agrobacterium среда. За да е сигурно, че прехвърлената дезатураза е подходящо внедрена в листа и развиващи се семена и че дезатуразният генен продукт е насочен към ендоплазмения ретикулум или към хлоропласта, се конструират разнообразни насочващи касети с Synechocystis Δ-дезатуразен отворен отчитащ контур (ORF). Компонентите на тези касети са: (i) 35S промотор или семенно-специфичен промотор, извлечен от слънчогледовия хелиантининов ген, за насочване на Аб-дезатуразното генно отделяне във всички растителни тъкани или съответно само в развиващите се семена, (ii) предполагаем сигнален пептид от морковен екстенсинов ген или от слънчогледов хелиантининов ген, който да насочи новосинтезираната А6-дезатураза в ER, (iii) ER лумен ограничаваща сигнална последователност (KDEL) в СООН-края на А6-дезатуразния ORF и (iv) оптимизиран транзитен пептид за насочване на А6-дезатуразата в хлоропласта. 35S промоторът е производно на pRTL2, описано от Restrepo и др. (1990). Оптимизираната транзитна пептидна последователност е описана от Van de Вгоеск и др. (1985). Морковният екстенсинов сигнален пептид е описан от Chen и др. (1985) ЕМВО J. 9, 2145.
Получават се трансгенни тютюневи растения, съдържащи химеричен цианобактериен дезатуразен ген, състоящ се от Synechocystis А6-дезатуразния ген, свързан с ендоплазмена ретикулумна ограничаваща последователност (KDEL) и екстенсинов сигнален пептид, движен от CaMV 35S промотор. PCR увеличения на трансгенната тютюнева геномна DNA показват, че А6-дезатуразният ген е вграден в тютюневия геном. Метилови естери на мастна киселина от листата на тези трансгенни тютюневи растения се екстрахират и анализират чрез газ-течна хроматография (GLC). Този трансгенен тютюн акумулира значителни количества GLA (фигура 4). Фигура 4 показва метилови естери на мастна киселина, както са определени чрез GLC. Пиковете се определят чрез сравняване на времето за елюиране с известните стандарти за метилов естер на мастна киселина. Съответно цианобакте риални гени, включени в мастно-киселинния метаболизъм, могат да бъдат използвани, за да генерират трансгенни растения с променен мастно-кисел състав.
Списък на последователности (1) Обща информация:
(i) Заявител: Thomas, Terry L.
Reddy, Avutu S.
Nuccio, Michael Freyssinet, Georges L.
(ii) Заглавие на изобретението: Получаване на γ-линоленова киселина чрез А6-дезатураза (iii) Брой последователности: 3 (iv) Адрес за кореспонденция:
(A) Адресант: Scully, Scott, Murphy & Presser (B) Улица: 400 Garden City Plaza (C) Град: Garden City (D) Щат: New York (E) Държава: САЩ (F) ZIP код: 11530 (v) Компютърно оборудване (A) Носител: Флопи диск (B) Компютър: IBM PC съвместим (C) Операционна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Софтуер: Patentin Release # 1.0, Version #1.25 (vi) Налични данни за описанието (A) Номер на описанието:
(B) Дата на подаване: 8 януари 1992 (C) Класификация:
(vii) Информация за пълномощника:
(A) Име: McNulty, William Е.
(B) Регистрационен номер: 22606 (C) Списъчен номер: 8383Z (ix) Телекомуникационна информация (A) Телефон: (516) 742-4343 (B) Телефакс: (516) 742-4366 (C) Телекс: 230 901 SANS UR (2) Информация за SEQ (последователност) ID NO: 1:
(i) Характеристика на последователността (A) Дължина: 3588 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Вид на веригата: и двата вида (D) Топология: линейна (ii) Тип молекула: DNA (геномна) (ix) Особености:
(A) Име/код: CDS (B) Местонахождение: 2002...3081 (xi) Описание на последователността: SEQ 1D N0:1:
GCTAGCCACC AGTGACGATG CCTTGAATTT GGCCATTCTG ACCCAGGCCC GTATTCTGAA60
TCCCCGCATT CGCATTGTTA ATCGTTTGTT CAACCATGCC CTGGGTAAAC GTTTAGACAC120
CACCTTGCCA GACCACGTTA GTTTGAGTGT TTCCGCCCTG GCGGCCCCGA TTTTTTCCTT180
TGCGGCTTTG GGCAATCAGG CGATCGGGCA ATTGCGTTTG TTTGACCAGA CTTGGCCCAT240
TCAGGAAATT GTCATTCACC AAGACCATCC CTGGCTCAAT TTACCCCTGG CGGATTTATG300
GGATGATCCG AGCCGAATGT TGATCTATTA CCTACCGGCC CACAGTGAAA CGGATTTAGT160
AGGCGCAGTG GTGAATAATT TAACGTTGCA ATCTGGGGAC CATTTAATAG TGGGACAAAA420
ACCCCAACCC AAGACCAAAC GGCGATCGCC TTGGCGCAAA TTTTCCAAAC TGATTACCAA480
CCTGCGGGAG TATCAGCGGT ATGTCCAACA GGTGATATGG GTGGTGTTGT TTTTATTGTT540
GATGATTTTT CTGGCCACCT TCATCTACGT TTCCATTGAT CAACATATTG CCCCAGTGGA600
CGCGTTGTAT TTTTCCGTGG GCATGATTAC CGGGGCCGGT GGCAAGGAAG AGGTGGCCGA660
AAAGTCCCCC GATATCATCA AAGTATTCAC AGTGGTGATG ATGATCGCCG GGGCGGGGGT720
GATTGGTATT TGTTATGCCC TACTGAATGA TTTCATCCTT GGCAGTCGCT TTAGTCAGTT780
TTTGGATGCG GCCAAGTTAC CCGATCGCCA TCACATCATC ATTTGTGGGC TGGGGGGAGT8 40
GAGCATGGCC ATTATTGAAG AGTTAATTCA CCAGGGCCAT GAAATTGTGG TAATCGAAAA900
GGATACAGAT AATCGTTTCT TGCATACGGC CCGCTCCCTG GGGGTGCCCG TAATTGTGGA960
GGATGCCCGC CT AG A A AG AA CGTTGGCCTG CGCCAATATC AACCGAGCCG AAGCCATTGT1020
GGTGGCCACC AGCGACGACA CCGTTAACTT GGAAATTGGC CTAACTGCCA AGGCGATCGC1080
CCCTAGCCTG CCAGTGGTGT TGCGTTGCCA GGATGCCCAG TTTAGCCTGT CCCTGCAGGA1140
AGTATTTGAA TTTGAAACGG TGCTTTGTCC GGCGGAATTG GCCACCTATT CCTTTGCGGC1200
GGCGGCCCTG GGGGGCAAAA TTTTGGGCAA CGGCATGACC GATGATTTGC TGTGGGTAGC1260
CCTAGCCACC ТГААТСАСТС CTAACCATCC CTTTGCCGAC CAATTGGTTA AAATTGCAGC1320
CCAAAAGTCT GATTTCGTTC CCCTCTATCT AGAACGGGGT GGCAAAACCA TCCATAGCTG1380
GGAATTATTG GGTACCCATC TCGACTCTGG AGACGTGTTG TATTTAACCA TGCCCGCCAC1440
TGCCCTAGAG CAACTTTGGC GATCGCCCCG TGCCACTGCT GATCCTCTGG АСТСТТГГТТ1500
GGTTTAGCAT GGGGGGATGG AACTCTTGAC TCGGCCCAAT GGTGATCAAG AAAGAACGCT1560
TTGTCTATGT TTAGTATTTT TAAGTTAACC AACAGCAGAG GATAACTTCC AAAAGAAATT1620
AAGCTCAAAA AGTAGCAAAA TAAGTTTAAT TCATAACTGA GTTTTACTGC TAAACAGCGG1680
TGCAAAAAAG TCAGATAAAA TAAAAGCTTC ACTTCGGTTT TATATTGTGA CCATGGTTCC1740
CAGGCATCTG CTCTAGGGAG TrrrrCCGCT GCCTTTAGAG AGTATTTTCT CCAAGTCGGC1800
TAACTCCCCC ATTTTTAGGC ААЛАТСАТАТ ACAGACTATC CCAATATTGC CAGAGCTTTG1860
ATGACTCACT GTAGAAGGCA GACTAAAATT CTAGCAATGG ACTCCCAGTT GGAATAAATT1920
TTTAGTCTCC CCCGGCGCTG GAGTTTTTTT GTAGTTAATG GCGGTATAAT GTGAAAGTTT1980
TTTATCTATT T AAA TTT AT A A ATG CTA ACA GCG GAA AGA ATT AAA TTT ACC2031
Het Leu Thr Ala Glu Arg lie Lys Phe Thr
510
CAG AAA CGG GGG TTT CGT CGG GTA CTA АЛС CAA CGG GTG GAT C.CC TAC207 9
Gin Lys Arg Gly Phe Arg Arg v*l Leu Asn Gin Arg Vai Asp AlaTyr
2025
TTT GCC GAG CAT GGC CTG ACC CAA AGG GAT AAT CCC TCC ATG TAT CTG2127
Phe Ala Glu His Gly Leu Thr Gin Atg Asp Asn Pro Ser Met Tyr Leu
AAA ACC Lye Thr CTG ATT Leu lie 45 ATT GTG CTC TGG TTG TTT TCC GCT TGG GCC TTT GTG 2175
He Val Leu Trp Leu 50 Phe Ser Ala Trp 55 Ala Phe val
CTT TTT GCT CCA GTT ATT TTT CCG GTG cr,c CTA CTG GGT TGT ATG GTT 2223
Leu Phe Ala Pro Val He Phe Pro Val Arg Leu Leu Gly Cys Met Val
60 65 70
TTG GCG ATC GCC TTG GCG GCC TTT TCC TTC AAT GTC GGC CAC GAT GCC 2271
Leu Ala He Ala Leu Ala Ala Phe Ser Fhe Asn Val Gly His Asp Ala
75 BO 85 90
AAC CAC AAT GCC TAT TCC TCC AAT CCC CAC ATC AAC CGG GTT CTG GGC 2319
Asn His А8П Ala Tyr Ser Ser Asn Pro Ills He Asn Arg Val Leu Gly
95 100 105
ATG ACC TAC GAT TTT GTC GGG TTA TCT AGT TTT CTT TGG CGC TAT CGC 2367
Met Thr Tyr Asp Phe Val Gly Leu Ser Ser Phe Leu Trp Arg Tyr Arg
HO US 120
CAC AAC TAT TTG CAC CAC ACC TAC ACC AAT ATT CTT GGC CAT GAC GTG 2415
Hie Aan Tyr Leu His His Thr Tyr Thr Asn He Leu Gly His Asp val
125 130 135
GAA ATC CAT GGA GAT GGC GCA GTA CGT ATG AGT CCT GAA CAA GAA CAT 7461
Glu lie His Gly Asp Gly Ala Val Arg Met Ser Pro Glu Gin G1U His
140 145 150
GTT GGT ATT TAT CGT TTC CAG CAA TTT TAT ATT TGG GGT TTA TAT CTT 2511
val Gly lie Tyr Arg Phe Gin Gin Phe Tyr He Trp Gly Leu Tyr Leu
155 160 165 170
TTC ATT CCC TTT TAT TGG TTT CTC TAC GAT GTC TAC CTA GTG CTT AAT 255?
Phe lie Pro Phe Tyr Trp Phe Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Val Leu Asn
175 180 185
AAA GGC AAA TAT CAC GAC CAT AAA ATT CCT CCT TTC CAG CCC CTA GAA 2601
Lye Gly Lys Tyr His Asp His Lys He Fro Fro Phe Gin Pro Leu Glu
190 195 200
TTA GCT AGT TTG CTA GGG ATT AAG CTA TTA TGG CTC GGC TAC GTT TTC 2655
Leu Ala Ser Leu Leu Gly He Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyt Val Fhe
205 210 215
GGC TTA CCT CTG GCT CTG GGC TTT TCC ATT CCT GAA GTA TTA ATT GGT 2703
Gly Leu Pro Leu Ala Leu Gly Phe Ser lie Pro Glu Val Leu He Gly
220 225 230
GCT TCG GTA ACC TAT ATG ACC TAT GGC ATC GTG GTT TGC ACC ATC TTT 2751
Ala Ser Val Thr Tyr Met Thr Tyr Gly lie Val Val Cys Thr He Fhe
235 240 245 250
ATG CTG GCC CAT GTG TTG GAA TCA ACT GAA TTT CTC ACC CCC GAT GGT 2799
Met Leu Ala His Val Leu Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly
255 260 265
GAA TCC GGT GCC ATT GAT GAC GAG TGG GCT ATT TGC CAA ATT CGT ACC 2847
Glu Ser Gly Ala He Asp Asp Glu Trp Ma He Cys Gin He Arg Thr
270 27S 280
ACG GCC АЛТ TTT GCC ACC AAT AAT CCC TTT TGG AAC TGG TTT TGT G’G - 2895
Thr Ala Asn Fhe Ala Thr Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe cys Gly
285 290 295
GGT TTA АЛТ CAC CAA GTT ACC CAC CAT CTT TTC CCC AAT ATT TGT CAT 2943
Gly Leu Asn His Gin val Thr His His Leu Phe Pro АЗП lie cys Ris
300 305 310
ATT CAC TAT CCC CAA TTG GAA AAT ATT ATT AAG GAT GTT TGC CAA CAG 299!
lie Hlr Tyr Fro Gin l.eu Glu Asn lie I le Lys Asp val Cys Gin Glu
315 320 325 310
TTT GGT GTG GAA TAT AAA GTT TAT CCC ACC TTC AAA GCG GCG ATC GCC 3039
Phe Gly Val Glu Tyr Lys val Tyr Fre Thr Phe Lys Ala Ala He Ala
335 340 345
TCT AAC TAT CGC TGG CTA GAG GCC ATG . GGC AAA . GCA , TCG i TGACATTGCC 3088
Ser Asn Tyr Arg Trp Leu Glu Ala Met Gly Lys Ala Ser
350 355 360
TTGGGATTGA AGCAAAATGG САААЛТСССТ CGTAAATCTA TGATCGAAGC CTTTCTGTTG 3148
CCCGCCGACC AAATCCCCGA TGCTGACCAA AGGTTGATGT TGGCATTGCT CCAAACCCAC 3208
TTTGAGGGGG TTCATTGGCC GCAGTTTCAA GCTGACCTAG GAGGCAAAGA TTGGGTGATT 3268
TTGCTCAAAT CCGCTGGGAT ATTGAAAGGC TTCACCACCT TTGGTTTCTA CCCTGCTCAA 3328
TGGGAAGGAC AAACCGTCAG AATTGTTTAT TCTGGTGACA CCATCACCGA CCCATCCATG 3388
TGGTCTAACC CAGCCCTGGC CAAGGCTTGG AtJCAAGGCCA TGCAAATTCT CCACGAGGCT 3448
AGGCCAGAAA AATTATATTG GCTCCTGATT TCTTCCGGCT ATCCCАССТА CCCA1TH1G 3508
AGCATTTTTG CCAAGGAATT СТЛТССССАС TATCTCCATC ССАСТССССС GCCTGTACAA 3568
ААТГТТЛТСС ATCAGCTAGC 3588
та (2) Информация за SEQ ID N0:2: (D) Топология: линейна (i) Характеристики на последователност- (п) Тип молекула: протеин (xi) Описание на последователността:
(A) Дължина: 359 аминокиселини SEQ ID N0:2:
(B) Тип: аминокиселина
Met Leu Thr Ala Glu Arg lie Lys Fhe Thr Gin Lys Arg Gly Fhe Arg
1 5 10 15
Arg Val Leu Asn Gin Arg Val Asp Ala Tyr Fhe Ala Glu His Gly Leu
20 25 30
Thr Gin Aro Asp Asn Pro Ser Met Тут Leu Lys Thr Leu He lie Val
35 40 45
Leu Trp Leu The Set Ala Trp Ala Phe val Leu Fhe Ala Fro Val lie
50 55 60
Phe Pre Val Ara Leu Leu Gly Cys Met Val Leu Ala lie Ma Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Ser Phe Asn val Gly His Asp Ala Asn His Asn Ala Tyr Ser
85 90 95
Ser Asn Fro His lie Asn Arg val Leu Gly Met Thr Tyr Asp Phe val
100 105 110
Gly Leu Ser Sei Phe Leu Trp Arg Tyr Arg His Asn Tyr Leu His His
115 120 125
Thr Tyr Thr Asn lie Leu Gly Ills Asp Val Glu He His Gly Asp Gly
130 135 140
Ala Val Arg Met Ser Pro Glu Gin Glu His Val Gly He Tyr Arg Fhe
145 150 155 160
Gin Gin Phe Tyr He Trp Gly Leu Tyr Leu Phe He Pro Phe Tyr Trp
165 170 175
Phe Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Val Leu Asn Lys Gly Lys Tyr His Asp
180 185 190
His Lys lie Pro Pro Fhe Gin Pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly
195 200 205
tie Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu
210 215 220
Gly Phe Ser lie Pro Glu Val Leu He Gly Ala Ser Val Thr Tyr Met
225 230 235 240
Thr Tyr Gly He Val Val cys Thr He Phe Met Leu Ala His Val Leu
245 250 255
Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro ι Asp Gly Glu Ser Gly Ala lie Asp
260 265 270
Asp Glu Trp 275 Ala He Cys Gin He 280 Arg Thr Thr Ala Asn 2BS Phe Ala Thr
А»п Asn 290 Pro Phe Trp Asn Trp 295 Phe Cys Gly Gly Leu 300 Asn His Gin Val
Thr 305 His Ills Leu Phe Pro 310 Asn He Cys His He 315 His Tyr Pro Gin Leu 320
Glu Asn lie He Lys 325 Asp Val cys Gin Glu 330 Phe Gly Val Glu Tyr 335 Lys
Val Tyr Pro Thr 340 Phe Lys Ala Ala He 345 Ala Ser Asn Tyr Arg 350 Trp Leu
Glu Ma Het 355 Gly Lys Ala Ser
та (2) Информация за SEQ ID N0:3:
(i) Характеристики на последователност- (A) Дължина: 1884 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Вид на веригата: и двата вида (D) Топология: линейна (й) Тип молекула: DNA (геномна) (xi) Описание на последователността:
SEQ ID N0:3:
AGCTTCACTT CGGTTTTATA TTGTGACCAT GGTTCCCAGG CATCTGCTCT AGGGAGTTTT 60
TCCGCTGCCT TTAGAGAGTA ТТТТСТССАЛ GTCGGCTAAC TCCCCCATTT TTAGGCAAAA 120
TCATATACAG ЛСТАТСССЛА TATTGCCAGA GCTTTGATGA CTCACTGTAG AAGGCAGACT 180
AAAATTCTAG CAATGGACTC CCAGTTGGAA ΤΑΑΑΠΤΓΤΑ GTCTCCCCCG GCGCTGGAGT 240
TTTTTTGTAG TTAATGGCGG TATAATGTGA ΑΑΘΙΤΙΤΠΛ ТСТЛТТТААА TTTATAAATG 300
CTAACAGCGG AAAGAATTAA ATTTACCCAG AAACGGGGGT TTCGTCGGGT ЛСТЛААССАА 360
CGGGTGGATG CCTACTTTGC CGAGCATGGC CTGACCCAAA GGGATAATCC CTCCATGTAT 420
CTGAAAACCC TGATTATTGT GCTCTGGTTG THTCCGCTT GGGCCTTTGT GCTTTTTGCT 480
CCAGTTATTT TTCCGGTGCG CCTACTGGGT TGTATGGTTT TGGCGATCGC CTTGGCGGCC 540
'1'1'1 TCCTTCA ATGTCGGCCA CGATGCCAAC CACAATGCCT ATTCCTCCAA ТССССЛСЛТС 600
AACCGGGTTC TGGGCATGAC CTACGATTTT GTCGGGTTAT CTAGTTTTCT TTGGCGCTAT 660
CGCCACAACT ATTTGCACCA САССТАСЛСС AATATTCTTG GCCATGACGT GGAAATCCAT 720
GGAGATGGCG CAGTACGTAT GAGTCCTGAA CAAGAACATG TTGGTATTTA TCGTTTCCAG 7B0
CAATTTTATA TTTGGGGTTT ATATCTTTTC ATTCCCTTTT ATTGGTTTCT CTACGATGTC 840
TACCTAGTGC TTAATAAAGG СЛААТАТСАС GACCATAAAA TTCCTCCTTT CCAGCCCCTA 900
GAATTAGCTA GTTTGCTAGG GATTAAGCTA TTATGGCTCG GCTACGTTTT CGGCTTACCT 960
CTGGCTCTGG GCTTTTCCAT TCCTGAAGTA TTAATTGGTG CTTCGGTAAC CTATATGACC 1020
TATGGCATCG TGGTTTGCAC CATCTTTATG CTGGCCCATG TGTTGGAATC AACTGAATTT 1080
CTCACCCCCG ATGGTGAATC CGGTGCCATT GATGACGAGT GGGCTATTTG CCAAATTCGT 1140
ACCACGGCCA ATTTTGCCAC САЛТЛАТССС TTTTGGAACT GGTTTTGTGG CGGTTTAAAT 1200
CACCAAGTTA CCCACCATCT ТТТССССАЛТ ATTTGTCATA TTCACTATCC CCAATTGGAA 1260
ΑΑΤΑΤΤΛΤΤΑ AGGATGTTTG CCAAGAGTTT GGTGTGGAAT ATAAAGTTTA TCCCACCTTC 1320
AAAGCGGCGA TCGCCTCTAA CTATCGCTGG CTAGAGGCCA TGGGCAAAGC ATCGTGACAT 1380
TGCCTTGGGA TTGAAGCAAA ATGGCAAAAT CCCTCGTAAA TCTATGATCG AAGCCTTTCT 1440
GTTGCCCGCC GACCAAATCC CCGATGCTGA CCAAAGGTTG ATGTTGGCAT TGCTCCAAAC 1500
CCACTTTGAG GGGGTTCATT GGCCGCAGTT TCAABCTGAC CTAGGAGGCA AAGATTGGGT 1560
GATTTTGCTC AAATCCGCTG GGATATTGAA AGGCTTCACC ACCTTTGGTT TCTACCCTGC 1620
TCAATGGGAA GGACAAACCG TCAGAATTGT TTATTCTGGT GACACCATCA CCGACCCATC 1680
CATGTGGTCT AACCCAGCCC TGGCCAAGGC TTGGACCAAG GCCATGCAAA TTCTCCACGA 1140
GGCTAGGCCA GAAAAATTAT ATTGGCTCCT GArrrCTTCC GGCTATCGCA CCTACCGATT 1800
TTTGAGCATT TTTGCCAAGG ААГГСТАТСС CCACTATCTC CATCCCACTC CCCCGCCTGT 1860
ACAAAATTTT ATCCATCAGC TAGC 1884
Патентни претенции

Claims (23)

  1. Патентни претенции
    1. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална А6-дезатураза.
  2. 2. Нуклеиновата киселина от претенция 1, съдържаща нуклеотидите от SEQ. ID N0:3.
  3. 3. Изолирана нуклеинова киселина, която кодира аминокиселинната последователност, кодирана от нуклеиновата киселина от претенция 1.
  4. 4. Изолираната нуклеинова киселина съгласно която и да е претенция 1-3, където споменатата нуклеинова киселина се съдържа във вектор.
  5. 5. Изолираната нуклеинова киселина от претенция 4, функционално свързана с промотор и/или ограничаващ сигнал, способен да осъществи насочването на генния продукт на споменатата изолирана нуклеинова киселина.
  6. 6. Изолираната нуклеинова киселина от претенция 5, където споменатият промотор е А6-дезатуразен промотор, Anabaena карбоксилазен промотор, хелиантининов промотор, глицинов промотор, напинов промотор или хелиантининов тъканно-специфичен промотор.
  7. 7. Изолираната нуклеинова киселина от претенция 5, където споменатият ограничаващ сигнал е Synechocystis ограничаващ сигнал, нопалинов синтезен ограничаващ сигнал или семенен ограничаващ сигнал.
  8. 8. Изолираната нуклеинова киселина съгласно която и да е от претенции 1-7, където споменатата изолирана нуклеинова киселина се съдържа в трансгенен организъм.
  9. 9. Изолираната нуклеинова киселина съгласно претенция 8, където споменатият трансгенен организъм е бактерия, гъба, растителна клетка или животно.
  10. 10. Растение или потомство на това растение, което е регенерирано от трансгенната растителна клетка от претенция 9.
  11. 11. Растението съгласно претенция 10, което е слънчоглед, соя, царевица, тютюн, фъстък или маслодайна рапица.
  12. 12. Метод за получаване на растение с увеличено съдържание на гама линоленова киселина (GLA), характеризиращ се с това, че включва:
    (а) трансформиране на растителна клет20 ка с изолираната нуклеинова киселина съгласно която и да е от претенции 1-7; и (б) регенериране на растение с увеличено съдържание на GLA от споменатата растителна клетка.
  13. 13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че споменатото растение е слънчоглед, соя, царевица, тютюн, фъстък или маслодайна рапица.
  14. 14. Метод за предизвикване получава1Λ нето на гама линоленова киселина (GLA) в организъм с недостатъчна или липсваща GLA, характеризиращ се с това, че включва трансформиране на споменатия организъм с изолираната нуклеинова киселина съгласно която и ас да е от претенции 1-7.
  15. 15. Метод за предизвикване получаването на гама линоленова киселина (GLA) в организъм с недостатъчна или липсваща GLA и линолова киселина (LA), характеризиращ се с ^® това, че включва трансформиране на споменатия организъм с изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална А6-дезатураза и изолирана нуклеинова киселина, кодираща А12дезатураза.
    “15
  16. 16. Метод за предизвикване получаването на гама линоленова киселина (GLA) в организъм с недостатъчна или липсваща GLA и линолова киселина (LA), характеризиращ се с това, че включва трансформиране на спо5® менатия организъм с най-малко един насочващ вектор, включващ изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална .А6-дезату16 раза и изолирана нуклеинова киселина, кодираща Д12-дезатураза.
  17. 17. Метод съгласно която и да е от претенции 15 или 16, характеризиращ се с това, че споменатата изолирана нуклеинова киселина, кодираща Д6-дезатураза, включва нуклеотиди 317 до 1507 от SEQ. ID N0:1.
  18. 18. Метод за предизвикване получаването на октадекатетраеноена киселина в организъм с недостатъчна или липсваща гама линоленова киселина, характеризиращ се с това, че се състои в трансформиране на споменатия организъм с изолирана нуклеинова киселина съгласно която и да е от претенции 1 до 7.
  19. 19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че споменатият организъм е бактерия, гъба, растение или животно.
  20. 20. Метод за използване на изолираната нуклеинова киселина съгласно която и да е от претенции 1 до 7 за получаване на растение с подобрена студоустойчивост, който включва:
    а) трансформиране на растителна клетка с изолираната нуклеинова киселина съгласно която и да е от претенции 1 до 7, и
    5 б) регенериране на споменатото растение с подобрена студоустойчивост от споменатата трансформирана растителна клетка.
  21. 21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че споменатото рас-
    10 тение е слънчоглед, соя. царевица, тютюн, фъстък или маслодайна рапица.
  22. 22. Изолирана бактериална Д6-дезатураза.
  23. 23. Изолирана бактериална Д6-дезату15 раза съгласно претенция 22, притежаваща ами- нокиселинна последователност от SEQ ID N0:2.
    Приложение: 4 фигури
BG98695A 1991-10-10 1994-04-05 Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза BG61791B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77447591A 1991-10-10 1991-10-10
US81791992A 1992-01-08 1992-01-08
PCT/US1992/008746 WO1993006712A1 (en) 1991-10-10 1992-10-13 Production of gamma linolenic acid by a δ6-desaturase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98695A BG98695A (bg) 1995-05-31
BG61791B1 true BG61791B1 (bg) 1998-06-30

Family

ID=27118889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98695A BG61791B1 (bg) 1991-10-10 1994-04-05 Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5552306A (bg)
EP (1) EP0666918B1 (bg)
JP (1) JP3537434B2 (bg)
KR (1) KR100316068B1 (bg)
CN (2) CN1053469C (bg)
AT (1) ATE284961T1 (bg)
AU (1) AU667848B2 (bg)
BG (1) BG61791B1 (bg)
BR (1) BR9206613A (bg)
CA (1) CA2120629C (bg)
CZ (1) CZ285471B6 (bg)
DE (1) DE69233459T2 (bg)
DK (1) DK0666918T3 (bg)
ES (1) ES2231767T3 (bg)
HU (1) HU217328B (bg)
IL (1) IL103407A (bg)
MX (1) MX9205820A (bg)
NZ (1) NZ244685A (bg)
PH (1) PH31293A (bg)
RO (1) RO113256B1 (bg)
RU (1) RU2152996C2 (bg)
UA (1) UA43314C2 (bg)
WO (1) WO1993006712A1 (bg)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070130654A1 (en) * 1991-10-10 2007-06-07 Thomas Terry L Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US5614393A (en) * 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
EP0684998A1 (en) 1993-02-05 1995-12-06 Monsanto Company Altered linolenic and linoleic acid content in plants
US5639645A (en) * 1993-09-22 1997-06-17 Mitsubishi Corporation Recombinant Δ9 desaturase and a gene encoding the same
US6310194B1 (en) * 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5965793A (en) 1995-09-20 1999-10-12 Monsanto Company, Inc. Strong early seed-specific gene regulatory region
US5977436A (en) * 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5959175A (en) * 1997-04-09 1999-09-28 Thomas; Terry L. Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
CN1253588A (zh) * 1997-04-11 2000-05-17 艾博特公司 在植物中合成长链多不饱和脂肪酸的方法和组合物
US5968809A (en) * 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6051754A (en) * 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US6075183A (en) * 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
ATE342361T1 (de) * 1997-04-15 2006-11-15 Commw Scient Ind Res Org Pflanzengene, die für fettsäurenepoxygenase kodieren und ihre verwendungen
US6080911A (en) * 1997-04-15 2000-06-27 Ohio University Mice models of growth hormone insensitivity
US6100450A (en) * 1997-10-22 2000-08-08 Rhone-Poulenc Agrochimie Seed specific promoters based on arabidopsis genes
GB9724783D0 (en) * 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
JP2002516093A (ja) * 1998-05-29 2002-06-04 オハイオ ユニバーシティー 脂肪酸、その誘導体および下流産物を合成するための組成物および方法
PT1086236E (pt) 1998-06-12 2007-12-12 Calgene Llc Ácidos gordos poliinsaturados em plantas
US20030163845A1 (en) * 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
RU2268939C2 (ru) * 1999-06-07 2006-01-27 Басф Плант Сайенс Гмбх ДЕЛЬТА 6-АЦЕТИЛЕНАЗА/ДЕЛЬТА-6-ДЕСАТУРАЗА И ДЕЛЬТА-6-ДЕСАТУРАЗА ИЗ Ceratodon purpureus
IL146782A0 (en) 1999-06-07 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh 6-acetylenase and 6-desaturase from ceratodon purpureus
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
GB9929897D0 (en) * 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
FR2803592A1 (fr) 2000-01-06 2001-07-13 Aventis Cropscience Sa Nouveaux derives de l'acide 3-hydroxypicolinique, leur procede de preparation et compositions fongicides les contenant.
RU2311457C2 (ru) * 2000-02-09 2007-11-27 Басф Акциенгезельшафт Новый ген элонгазы и способ получения полиненасыщенных кислот жирного ряда
FR2810994B1 (fr) * 2000-06-30 2004-03-12 Biogemma Fr Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications
EP1197550A3 (en) * 2000-08-25 2002-11-20 Pfizer Products Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis
AU2002218447C9 (en) * 2000-09-28 2008-04-17 Bioriginal Food & Science Corporation Fad4, Fad5, Fad5-2, and Fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
BR0205508A (pt) * 2001-01-25 2005-05-03 Abbott Lab Genes para dessaturase e usos dos mesmos
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US7045683B2 (en) * 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
EP1392278A4 (en) * 2001-05-14 2005-05-04 Martek Biosciences Corp PRODUCTION AND USE OF A LIPID-RICH POLAR FRACTION CONTAINING STEARIDONIC ACID AND GAMMA-LINOLENIC ACID EXTRACTED FROM SEEDS AND MICROORGANISMS
CA2451116C (en) * 2001-05-14 2013-04-09 Martek Biosciences Corporation Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsaturated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
DE50312241D1 (de) 2002-01-30 2010-01-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter f
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
WO2005024017A1 (en) * 2002-03-15 2005-03-17 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules associated with oil in plants
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
FR2848064B1 (fr) * 2002-12-06 2006-01-13 Bayer Cropscience Sa Plantes legumineuses transplastomiques fertiles
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
CA2510462A1 (en) 2002-12-19 2004-07-08 University Of Bristol Method for producing polyunsaturated fatty acids in a transgenic plant or microorganism comprising an introduced delta-9-elongase and a delta-8-desaturase
BRPI0407138A (pt) 2003-02-27 2006-01-10 Basf Plant Science Gmbh Sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo transgênico não humano, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeo, ou um ácido graxo poliinsaturado ou uma fração dos mesmos, composições de óleo, de lipìdeos, ou de ácido graxo, e, uso do óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou de composições de óleo, de lipìdeos ou de ácido graxo
EP1613730A4 (en) 2003-03-28 2007-12-05 Monsanto Technology Llc NEW PLANT PROMOTORS FOR USE IN THE EARLY SEED DEVELOPMENT PHASE
WO2004087902A2 (de) 2003-03-31 2004-10-14 University Of Bristol Neue pflanzliche acyltransferasen spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte fettsäuren
WO2004090123A2 (de) 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
ES2590077T3 (es) 2003-08-01 2016-11-18 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
MXPA06002028A (es) 2003-08-21 2006-05-17 Monsanto Technology Llc Desaturasas de acido graso de primula.
CA2450000A1 (en) 2003-12-18 2005-06-18 Alberta Research Council Inc. Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil
EP3543324B1 (de) 2004-02-27 2022-11-30 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigten fettsäuren in transgenen pflanzen
PL1720988T3 (pl) 2004-02-27 2012-05-31 Basf Plant Science Gmbh Sposób wytwarzania nienasyconych kwasów tłuszczowych omega-3 w organizmach transgenicznych
US20050220901A1 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 Huttenbauer Samuel Jr Methods of pharmaceutical separation from plants
ES2541537T3 (es) 2004-04-16 2015-07-21 Monsanto Technology, Llc Expresión de desaturasas de ácido graso en maíz
US7807849B2 (en) 2004-04-22 2010-10-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA3023314C (en) 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
US7138391B2 (en) * 2004-08-09 2006-11-21 Silverbrook Research Pty Ltd Hydrophilizable and hydrophilic cyanine dyes
US7456270B2 (en) * 2004-09-01 2008-11-25 Abbott Laboratories Δ6-desaturase genes and uses thereof
AU2006217847B2 (en) 2005-02-26 2011-04-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
CN101198701B (zh) * 2005-04-19 2013-04-24 巴斯福植物科学有限公司 单子叶植物中的淀粉胚乳特异性和/或萌芽胚特异性表达
EP1874937A2 (en) 2005-04-20 2008-01-09 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
BRPI0614070A2 (pt) 2005-05-10 2018-07-31 Basf Plant Science Gmbh cassetes de expressão, sequência de nucleotídeos isolada, seqüência sintética reguladora de transcrição, métodos para proporcionar uma seqüência sintética de nucleotídeos reguladora de transcrição, e um cassete de expressão, vetor, organismo não-humano ou célula hospedeira transgênico(a), e, célula de planta ou planta transgênica
AU2006249983B2 (en) 2005-05-23 2011-03-17 Arcadia Biosciences, Inc. Safflower with elevated gamma-linolenic acid
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
EP1806398A1 (en) * 2006-01-04 2007-07-11 Monsanto S.A.S. Fad-2 mutants and high oleic plants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
MX2009000757A (es) 2006-07-19 2009-03-09 Monsanto Technology Llc Acido graso desaturasas de tetraselmis suecica.
AU2007287585B2 (en) 2006-08-24 2013-08-29 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel Pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
AU2007291937B2 (en) 2006-08-29 2014-05-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
US8710299B2 (en) 2006-10-06 2014-04-29 Basf Plant Science Gmbh Processes for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CN101631868B (zh) 2007-02-16 2016-02-10 巴斯福植物科学有限公司 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列
EP2351845A1 (en) 2007-06-01 2011-08-03 Solazyme, Inc. Renewable chemicals and fuels from oleaginous yeast
AU2008281760B2 (en) 2007-07-31 2014-07-17 Basf Plant Science Gmbh Elongases and methods for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
US20130323801A1 (en) * 2007-11-01 2013-12-05 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, Methods, and Kits for Polyunsaturated Fatty Acids from Microalgae
CA2708087A1 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Bioriginal Food & Science Corp. Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
AU2009242130B2 (en) 2008-04-30 2013-09-19 Rothamsted Research Ltd. Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CA2729496C (en) 2008-07-01 2018-02-13 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
DE112009002048T5 (de) 2008-08-26 2012-01-26 Basf Plant Science Gmbh Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl
NO2358882T3 (bg) 2008-11-18 2017-12-23
ES2742527T3 (es) 2008-11-28 2020-02-14 Corbion Biotech Inc Fabricación de aceites personalizados en microorganismos heterotróficos recombinantes
CA2744930C (en) 2008-12-12 2018-03-20 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
WO2010118477A1 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Molecular Plant Breeding Nominees Ltd Plant promoter operable in endosperm and uses thereof
AU2010240916B2 (en) 2009-04-22 2016-05-12 Basf Plant Science Company Gmbh Whole seed specific promoter
WO2010130725A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
CA2766858A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
AU2010325720A1 (en) 2009-12-03 2012-07-19 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for embryo-specific expression in plants
WO2011095460A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Bayer Cropscience Ag Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents
EP2576800B1 (en) 2010-05-28 2019-01-30 Corbion Biotech, Inc. Method for producing oils from Prototheca
EP2585603B1 (en) 2010-06-25 2017-12-20 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses therof in fatty acid production
SG10201509035WA (en) 2010-11-03 2015-12-30 Solazyme Inc Microbial Oils With Lowered Pour Points, Dielectric Fluids Produced Therefrom, And Related Methods
CN110066836A (zh) 2011-02-02 2019-07-30 柯碧恩生物技术公司 产自重组产油微生物的定制油
CA2869738C (en) 2012-04-12 2022-04-05 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
EP2839018B1 (en) 2012-04-18 2019-06-05 Corbion Biotech, Inc. Tailored oils
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
BR112014031362A8 (pt) 2012-06-15 2022-06-28 Commw Scient Ind Res Org Lipídeo de planta extraído, processo para produzir lipídeo de planta extraído, célula hospedeira, método de produzir semente, farinha de semente, método para produzir um produto alimentício, uso e processo para produzir ésteres etílicos de ácidos graxos poli-insaturados
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
US9249252B2 (en) * 2013-04-26 2016-02-02 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
MX369685B (es) 2013-10-04 2019-11-19 Terravia Holdings Inc Aceites adaptables.
US9725399B2 (en) 2013-12-18 2017-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
SG11201610596PA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
ES2764273T3 (es) 2014-07-10 2020-06-02 Corbion Biotech Inc Nuevos genes de cetoacil ACP sintasa y uso de los mismos
KR102054762B1 (ko) 2018-03-06 2020-01-22 대한민국(관리청: 특허청장, 승계청: 농촌진흥청장) 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 및 이의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4736866B1 (en) * 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
NZ221259A (en) * 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
ZA888155B (en) * 1987-11-04 1989-07-26 Merrell Dow Pharma Fluorinated arachidonic acid derivatives
DE69033816T2 (de) * 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc., St. Louis Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
EP0472722B1 (en) * 1990-03-16 2003-05-21 Calgene LLC Dnas encoding plant desaturases and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
CZ285471B6 (cs) 1999-08-11
DE69233459D1 (de) 2005-01-20
US5663068A (en) 1997-09-02
MX9205820A (es) 1993-04-01
DK0666918T3 (da) 2005-03-14
CZ81794A3 (en) 1995-09-13
DE69233459T2 (de) 2005-12-15
CA2120629C (en) 2009-02-17
KR100316068B1 (ko) 2002-11-13
JPH07503605A (ja) 1995-04-20
WO1993006712A1 (en) 1993-04-15
NZ244685A (en) 1994-06-27
US5689050A (en) 1997-11-18
EP0666918B1 (en) 2004-12-15
CN1053469C (zh) 2000-06-14
JP3537434B2 (ja) 2004-06-14
CN1072722A (zh) 1993-06-02
EP0666918A1 (en) 1995-08-16
BR9206613A (pt) 1995-04-11
CN1121499C (zh) 2003-09-17
AU2881292A (en) 1993-05-03
CN1174236A (zh) 1998-02-25
PH31293A (en) 1998-07-06
IL103407A (en) 1999-09-22
RU2152996C2 (ru) 2000-07-20
UA43314C2 (uk) 2001-12-17
RO113256B1 (ro) 1998-05-29
HUT69781A (en) 1995-09-28
ATE284961T1 (de) 2005-01-15
AU667848B2 (en) 1996-04-18
US5552306A (en) 1996-09-03
HU9401007D0 (en) 1994-08-29
EP0666918A4 (en) 1995-03-17
IL103407A0 (en) 1993-03-15
ES2231767T3 (es) 2005-05-16
BG98695A (bg) 1995-05-31
HU217328B (hu) 1999-12-28
CA2120629A1 (en) 1993-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU667848B2 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
AU707061B2 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US6355861B1 (en) Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
US20170283780A1 (en) Fatty acid desaturases from primula
US6683232B1 (en) Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
US20070130654A1 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US20090077692A1 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase