NO821196L - Molekyl-separeringssoeyle og dennes anvendelse - Google Patents

Description

Molekyl-separeringssøyle og dennes anvendelse.

Beslektede søknader:

Dette er en "continuation-in-part" av søknad Serial Nr.

184 822 inngitt 8. september 1980, idet hele dennes fremstilling innlemmes heri som referanse.

'Denne søknad er også beslektet med følgende søknader under behandling:

U.S. Serial Nr. innlevert 24. juni 1981

under tittelen: "Process for'Preparing a Zero Standard Serum",

til Hou, og

U.S. -Serial Nr. 238 686, inngitt 27. februar 1981 med

tittel: "Tissue Culture Medium", til Cohe et al.

Alle disse ovennevnte, løpende søknader og deres innhold utgjør ikke kjent teknikk med hensyn til den oppfinnelse som beskrives og patentsøkes i den foreliggende søknad.

Oppfinnelsens bakgrunn:

Der eksisterer en flerhet av teknikker for molekylseparering av komponentene i en gitt prøve enten for analyseformål eller fer produktprepareringsformål. En type av molekylseparering omfatter en flerhet av prosesser til å utføre differensiell distribusjon av prøvekomponentene mellom to faser, og slike fremgangsmåter er generelt betegnet som kromatografi. Den differensielle distribusjon oppnår man ved en innbyrdes veksling mellom en bevegelig fase som kan være en væske eller gass, og en stasjonær fase.

1. Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye molekyl-separe-ringssøyler, f.eks. kromatografisøyler og mer spesielt en ny stasjonær fase til bruk i forbindelse med slike søyler.

Kromatografi er et generelt uttrykk som anvendes i forbindelse med en stor variasjon av separeringsteknikker basert på den innbyrdes veksling av prøven mellom en bevegelig fase som kan være gass eller væske, og en stasjonær fase. Når gass utgjør den bevegelige fase (eller "mobile fase" som den betegnes innen kromatografi-terminologien) kalles teknikken gasskromatografi og når væsken utgjør den bevegelige fase, kalles teknikken væskekromatografi.

Den såkalte "kromatografiske adsorpsjonsmetode" med hensyn til analyse, ble utviklet av den russiske botaniker M. Tswett, Ber. Deut. Botan. Ges., 24, 316, 1906 som benyttet den for separering av komponenter fra plantepigmenter. Dette arbeid ble of-ret liten oppmerksomhet inntil 1931 og opptil 1940 ble hovedvek-ten lagt på frontal- og forskyvningsanalyser. Teorien vedrørende kromatografi ble utviklet av Wilson, J.N, J. Amer. Chem. Soc, 62, 1383 i 1940. Selv om den viktige historiske rolle for dette verk i stor grad er blitt neglisjert fordi den kvantitative teori ikke hadde rom for diffusjon eller ikke-likevekt mellom de mobile og stasjonære faser, gav Wilson en solid kvalitativ beskrivelse av ikke-likevekt og dennes betydelige plass innen kromatografi. Han forklarte også betydningen av longitudinell diffusjon. Selv om de store spredevirkningene. som skriver seg fra lave adsorpsjon-og desorpsjonshastigheter, kan reduseres ved minskning av strømningshastighetene, så gir det på sin side opp-hav til spredevirkninger pga. store longitudinelle diffusjons-virkninger.

Etter Wilsons arbeid fulgte Nobelprisvinner-avhandlingen av A.J.D. Martin og R.L.M. Synge, Biochem. J., 35, 1358, hvilket introduserte plateteorien for kromatografi og revolusjonerte væskekromatografien. De nevnte personer foreslo også bruken av gass som den mobile fase. Gasskromatografi ble først utprøvet av A.T. James og A.J.P. Martin, Biochem, J. , 50, 6979, i 1952. Siden den gang er der imidlertid utgitt megen litteratur som ved-rører gass-væske og gass-faststoffkromatografi, og gasskromato-graf i har utviklet seg til en raffinert analytisk teknikk.

Til å. begynne med ble væskekromatografi utført i glass-søy-ler med store diametere og under normalt trykk. Disse betingelser førte til lange analysetider og en hovedsakelig møysomme-lig fremgangsmåte. Imidlertid^ i de siste årene med innføringen av høytrykkspumper, så foregikk utviklingen både når det gjaldt instrumentering og søylepakkinger så raskt at det er blitt vanskelig å holde tritt med den mengde litteratur som er blitt publisert, og væskekromatografi vinner raskt inn på gasskromato-graf i med hensyn til å bli denne likeverdig.

Separeringer kan klassifiseres enten som analytisk eller tilberedende avhengig av. formålet. Ved analytiske separeringer går formålet ut på høyoppløsningsseparering og identifisering og kvantifisering av de forskjellige komponenter i en prøveblanding. Ved tilberedende kromatografi på den annen side, er hensikten isolasjon av rene mengder av de ønskede bestanddeler i prøven. Væskekromatografi er fordelaktig overfor gasskromatografi i og med den førstnevnte kan utgjøre både en utmerket analytisk såvel som en forberedende teknikk. Gasskromatografi er meget begrenset når det gjelder anvendelsen som et forberedende verktøy pga. de meget små prøvestørrelser. I forbindelse med væskekromatograf i på den annen side, er tilberedte separeringer av milligram til gramstørrelser ikke uvanlig avhengig av den kromatografiske søylediameter og mengden av stasjonær fase.

Samlingen av kromatografiske teknikker kan klassifiseres på forskjellige måter og den mest grunnleggende baserer seg på angivelsen av de typer av faser som blir benyttet. Væskeadsorp-sjons-kromatografi blir i stor utstrekning benyttet for organiske og biokjemiske analyser, men er begrenset fordi der finnes bare noen få passende adsorberende stoffer. Distribusjonskoeffisien-ten for adsorpsjon er ofte avhengig av den totale konsentrasjon og denne oppførsel resulterer ofte i ufullstendige separeringer. Gass-faststoffkromatografi er hovedsakelig beheftet med de samme ulemper som væskeadsorpsjons-kromatografi..Ioneutvekslingskro-matografi er et spesialfelt innen væske-faststoffkromatografi og er spesielt anvendelig ved ioniske prøver. Affinitetkromatografi baserer seg på attraksjon (affinitet) hos et molekyl ("ligand"), bundet til den faste stasjonære fase for en gitt komponent av prøven.. Væske-væske eller avdelingskromatografi innbefatter bruken av et tynnere skikt av væske som holdes på plass på overflaten av et solid inert faststoff som den stasjonære fase. Papirkromatografi er et spesialfelt innen væske-væskekromatografi hvor den stasjonære væske utgjør en vannfilm adsorbert på en pa-pirmatte, og tynnskiktkromatografi ligner på papirkromatografi med unntak av at papiret erstattes av en glass- eller plastplate trukket med et tynt skikt av aluminium, siliciumoksydgel eller annet pulvermateriale.

Søylevirkningsgrad måles vanligvis ved hjelp av størrelsen H, noen ganger angitt som HETP (høydeekvivalent til en teoretisk plate - "height equivalent to a theretical plate")., som utgjør søylelengden dividert med det totale antall av teoretiske plater (n) som inneholdes i den lengde. H blir vanligvis betraktet å' være summen av tre bidrag, dvs. bidraget fra ikke-make baner (virveldiffusjon - "eddy diffusion"), bidraget fra diffusjon langs søylen (longitudinell diffusjon) og bidraget fra ikke-likevekt (masseoverføring). Virveldiffusjonen er direkte proporsjo-nal med diameteren av patriklene som utgjør den stasjonære fase. Jo mindre homogen strukturen er, jo større blir bidraget fra de ikke-make baner. Konvensjonell kromatografisk teori forutsier således at finere pakkegeometrier innebærer reduserte diffusjons-bindeskikt, dvs. kortere baner for materialtransport til fast-stof flaten, som vil resultere i økt virkningsgrad. Nåværende kromatograf isk teori og derfor nåværende praksis, fører til bruken av meget fin homogen, sfærisk pakking. En kompliserende faktor er imidlertid motstanden av søylen overfor fluidumstrømning,

dvs. trykkfallet over søylen er omvendt proporsjonalt med kvadratet av partiklenes diameter. Halvering av partikkeldiameteren vil derfor øke trykkfallet med en faktor på 4.

Dessuten, som kjent fra den foreliggende teknikk, er gel-.., substrater ikke i stand til å motstå betydelige trykkfall og/eller lave strømningshastigheter.

2. Kjent teknikk

Bruken av adsorbérende eller partikkelformede stoffer båret av fibre eller papir, har vært brukt i filterteknikken for. en stund, se f.eks. følgende US patentskrifter:

2 143 044 til Wicks et al,

2 746 608 til Briggs,

3 238 056 til Pall et al,

3 253 978 til Bodendorf et al,

3 591 010 til Pall et al,

4 007 113 til Ostreicher,

4 160 059 til Samejima, og

4 238 334 til Halbfoster

Karbon er blitt påført et ark med partikler homogent fordelt og fast tilbakeholdt i arket, slik det er beskrevet i US patentskrift 3 149 023 til Bodendorf et al. Arkene ifølge Bodendorf .et al blir brukt som sigarettfiltre, luftfiltre, gassfiltre, ompakiiinger for frukt og stoffer sojb har en tendens til å farge av eller bli ødelagt av gassene i atmosfæreluktfjærnelagene i laminerte ark fremskaffet for sanitære bleier og for kirurgibind for sår og lignende.

Til en viss grad make ark som beskrevet i de ovennevnte patentskrifter, er blitt benyttet i papir- og tynnskiktkromatografi.

I US patentskrift 3 642 684 til Malcolm, blir der beskrevet et tynnskikt-kromatografimedium som tar form av en selvbæ- . rende, bøyelig arkstruktur med en hovedproporsjon av kromatografisk adsorpsjonsstoff, f.eks. kiselsyre som er jevnt og homogent fordelt med en mindre mengde av strukturstabiliserende uor-ganiske fibre, f.eks. glassfibre anordnet i et slumporientert nettverk av kationisk materiale, f.eks. kationisk stivelse.

Fra US patentskrift 3 455 818 til Leifield, er der kjent sorbente ark som kan brukes til kromatografi utført på samme generelle måte som vanlig tynnskikt- eller papirkromatografi. Arkene blir fremstilt ved dispersering av fine fibre av ikke-cel-lulosematerialej-f-eks..fibrøst glass sammen med en høy andel av det ønskede pulverformede sorbent, i et passende væskemedium som får strømme inn i et porøst bæreorgan, fulgt av fjerning av væsken. Arkene kan brukes i en søyle ved sammenrulling av et eller flere av arkene til en kompakt rulle og innsetting av denne i et glass-rør eller sylinder, slik at grenseskiktet mellom arkoverflåtene er parallelle med og på linje med den mobile fasestrømning.

Fiber- eller filamentpakkingerfor molekyl-separeringssøy-ler er tidligere blitt brukt, se f.eks. Miller et al., The Use of Textile Yarns In Separation Processes, Textile Research Jour-nal, januar 1980, side 10 og følgende, Brown et al, Macroreti-cular Resin Columns. I. Model of Bend and Filament Packings, Separation Science and Technology, 15 (a), side 1533 - 1553 (1980) og Partridge, Nature, 1123 - 1125 (18. mars 1967) . Andre referanser som foreslår bruken av fibre for molekylsepareringspakker er:

US patentskrift nr. 3 570 673 til Dutzetal,

US patentskrift nr. 3 307 333 til Norem et. al,

US patentskrift nr. 4 169 790 til Pretorius et al, og

US patentskrift nr, 4 070 287 til Wiegand.

Det er generelt akseptert innen teknikken at oppskalering fra laboratorieresultater er vanskelig, spesielt i kromatografiske prosesser hvor teoretiske modeller er utilfredsstillende. Konstruksjonen av kommersielle installasjoner basert på kunnskap som oppnås fra laboratorieeksperimenter innen dette område, har vist seg å være et hovedproblem. I henhold til fagfolk på området, er bruken av store søyler av harpiks, f.eks. søyler av organisk gel, ikke ønskelig pga. kompakthet, dårlige separeringsresultater og pga. for stor uspeding av de utvaskede komponenter, idet begge disse faktorer gjør fremgangsmåten uøkonomisk. Dersom en væske innføres jevnt fordelt over toppen av søylen, vil en del av fronten bevege seg nedover med en hastighet som er forskjellig fra bevegelseshastigheten hos resten av væsken, som renner på skrå og bevirker at der i underlaget opptrer ujevnheter ("tailing") og fingerdannelse ("finger formation"). For å unngå disse problemer er det ønskelig at fronten av den ledende kant av hver væske eller, utvaskningsmiddel som tilføres ved toppen av søylen, beveger seg nedover med en jevn hastighet samtidig som"fronten forblir hovedsakelig i et smalt bånd som ligger i et horisontalt plan.

Disse problemer, i henhold til kjent teknikk er omtalt f.eks. av Baddour i US patentskrift nr. 3 250 058. Gode separeringer oppnår man ved bruk av.tynne laboratoriesøyler, men når der gjø-res forsøk på å gjenta separeringen i en teknisk eller kommersiell skala under bruk av søyler.som har en diameter på 5 cm eller mer, så er det funnet at der i søylen opptrer ujevnheter ("tailing") og "f ingerdannelse",. forhold som begge bidrar til uttyn-ning og dårlige separeringsresultater. Baddour forsøker å løse disse problemer ved innføringen av et arrangement med tversgående ledeplater i søylen, som skal bevirke sideveis strømning av den væske som føres gjennom søylen. Dessuten finner Baddour det nød-vendig å bruke disse ledeplater i kombinasjon med laterale ledeplater .

Ideen med en tvunget vertikal strømning i stor-skala-søyler ble ytterligere utviklet av Lauer et ål, som beskrevet i US patentskrift 3 539 505, hvor der introduseres enheter for radial blanding i søylen eller oppdeling av søylen i flere korte seksjo-ner som beskrevet i tysk"patentsøknad, DE-OS 2 036 525. Enda en annen løsning på dette problem er beskrevet i tysk patentsøknad, DE-OS 2 224 794 og i japansk patentskrift 73-68752 i henhold til hvilket søylen blir mettet med den oppløsning som skal separeres. Ved hjelp av de mettede søyler og motstrømsstrømning, blir de forstyrrelser som forårsakes av densitetsgradienter i søylen, unn-gått .

De meget kompliserte fremgangsmåter som er beskrevet oven-for, gjør det mulig å utføre stor-skala-kromatografisepareringspro-sedyrer på kommersiell basis. Imidlertid fører disse fremgangsmåter til kompliserte søylestrukturer og til fremgangsmåter som er vanskelige å utføre i kommersiell målestokk. I de tilfeller hvor der foreligger innebygde konstruksjoner i søylen, opptrer der store problemer, f.eks. når harpiksen blir ettervasket. Et-tervasking er nødvendig ved disse fremgangsmåter etter et visst antall av sykler fordi mekaniske urenheter fra det tilførte stoff eller det utvaskede stoff akumulerer seg på harpiksunderlaget, slik at ytelsen av søylen gradvis blir redusert. Det er åpenbart at innbygde konstruksjoner i søylen er besværlig ved slike situ-asjoner. Ideene med mettede harpiksunderlag og motstrømsstrøm-' ning fører også til kompliserte konstruksjoner som beskrevet i tysk patentsøknad DE-OS 2 224 794, eller til kompliserte fremgangsmåter for drift av systemet.

Huber beskriver en annen løsning i sitt US patentskrift

3 856 681, hvor langstrakte stavlignende elementer ble anordnet parallelt med søyleaksen, men disse elementer fremskaffet usym-metriske søyletverrsnitt som bevirket forskjellig søylepakking og ujevn fluidumstrømning og begrenset også det samlede produk-sjonsresultat fra søylen.

I sitt US patentskrift 3 856 681 forsøker Huber å oppnå jevn-strømning over en forberedende eller produksjonskromatografi-søyle ved bruken av en flerhet av lag av kromatografisk media anordnet inntil hverandre med den tykkeste dimensjon av lagene for-løpende hovedsakelig vinkelrett på primærvæskestrømaksen og fortrinnsvis anordnet sideveis på avstand fra hverandre ved hjelp av et forholdsvis inert skilleorgan innskutt mellom lagene. Even-tuelt kan forholdsvis store partikler av kromatografisk media eller relativt inert materiale, være jevnt fordelt gjennom det kromatografiske medialag for å redusere det totale trykkfall gjennom den endelige søyle. Overflaten av det kromatografiske medium er parallelt med, og ligger i samme retning som den mobile faseflui-dumstrøm.

McDonald et al. beskriver i US patentskrift 4 211 656 en hylse som triaksialt komprimerer det partikkelformede pakkemate-riale med henblikk på å sikre en jevn strøm gjennom søylen.

Det er nå avdekket at en søyle hvor den mobile fase strøm-mer gjennom en fast stasjonær fase kan konstrueres i direkte motsetning til konvensjonell kromatografisk pakketeori, dersom det stasjonære fase-"system" stort sett er en hoveddel av partikkelstof f som er immobilisert i en porøs matrise av fibre. Denne nye, stasjonære fase har fordelen av både lavt trykkfall og lav diffusjonsmotstand, noe som gjør den spesielt egnet for separeringer i kommersiell skala, spesielt væskesepareringer. Lede-platearrangementer er unødvendige. Som et resultat er det mulig å konstruere stabile høystrømnings-separeringssøyler med stor kapasitet og kortere gjennomløpningstider, hvilke søyler har gode trykkresponser, er.fri for kanalisering eller fluidumforbi-passering, Jkan lett regenereres for reproduserbar gjennyttelse og har evnen til å bli forsendt under omgivende betingelser eller lagret på det ubestemte. I tillegg samvirker kantene av den nye, stasjonære fase med innerveggen av separeringssøylen for med denne å danne en hovedsakelig fluidumtett avtetning og således forhindre kanaldannelse nær. veggene.

Sammendrag av oppfinnelsen

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er. der frem-bragt en molekylsepareringssøyle til å utføre differensiell fordeling mellom to faser, av komponentene av en prøve som strømmer derigjennom, idet søylen inneholder en stasjonær faststoffase som omfatter en porøs matrise av.fibre som i seg bærer immobilisert partikkelstoff samtidig som i det minste en av fibrene eller partikkelstof f et er effektivt for molekylseparering, fortrinnsvis partikkelstoffet, og samtidig som matrisen er hovedsakelig homogen med hensyn til hver komponent. Brukt i forbindelse med væske-faststoff gjennomstrømnings-molekylsepareringer vil der foreligge et redusert trykkfall og diffusjonsmotstand^ slik at søylen kan brukes for væskesepareringer i kommersiell skala i tillegg til analytiske separeringer.

Der er også foreslått en fremgangsmåte til å bevirke molekylsepareringer under bruken av slike søyler såvel som å skaffe en faststoffase til bruk ved slike søyler.

Sammenlignet med vanlige søyler som inneholder lignende partikkelstof f, oppviser sjøylene ifølge den foreliggende oppfinnelse lavere trykkfall, de er mindre følsomme overfor høye trykk (f.eks. vil trykk på 154 kg/cm 2 i en søyle med diameter 10 mm ikke påvirke søyleydelsen),oppviser mer aksial dispersjon (vanlige søyler oppviser større dispersjon av de separerte komponenter pga. masseoverføringsmotstand) , oppviser bedre separering ved høye prøvebelastninger, er mindre sensitive overfor strømnings-hastigheter og oppviser jevnere toppformer.

Den stasjonære faststoffase ifølge den foreliggende oppfinnelse oppviser fordeler ved kromatografiske separeringer i kommersiell skala, spesielt for høyvolum-høymolekylvekt-separeringer. Ekseperimenter har vist at den porøse matrise skaffer større virveldiffusjon enn partikkelstoff alene og ved 70% partikkelstof f oppviser en lavere diffusjonsmotstand sannsynligvis pga. forbedret strømningsfordeling i den mer åpne matrise. Den forholdsvis høye virveldiffusjon og lave diffusjonsmotstand, fore-speiler at den porøse matrise omfatter to enestående trekk hva angår kromatografiske separeringer - økede separeringer for komponenter med lave diffusjonskoeffisienter og jevnere toppformer.

Vanlig kromatografteori er vellykket med hensyn til formingen av separeringer med lineære adsorpsjonsisotermer. Mange separeringer er tilsynelatende lineære ved lave prøvekonsentra-sjoner, men separeringer som har kommersiell interesse, har forholdsvis høye konsentrasjoner og er ikke-lineære. Effektivite-ten for den stasjonære fase i henhold til den foreliggende oppfinnelse oppnådd ved høye prøvekonsentrasjoner, viser at den er effektiv for kommersielle separeringer.

Oppfinnelsens formål

En hensikt med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe nye molekylseparerings-faststoffmedier og søyler som inneholder slike medier.

En annen hensikt er å skaffe nye medier som har egenskaper som lavt trykkfall og lav. diffusjonsmotstand, noe som gjør dem spesielt egnet for separeringer i kommersiell skala, spesielt

ved væskesepareringer.

En ytterligere hensikt er å skaffe stabile høystrømnings-separeringssøyler med god kapasitet og kortere gjennomløpnings-tider som har gode trykkresponser, er frie for kanaldannelse eller fluidumforbistrømning, som lett kan regenereres til et repro-duserbart resultat og har evne til å bli transportert under omgivende betingelser eller lagret på det uvisse.

Enda en annen hensikt er å skaffe nye, stasjonære faststoff-fasemedier som samvirker med innerveggen av en separeringssøyle for dannelse av en hovedsakelig fluidumtett forsegling og derved forhindre kanaldannelse nær veggene.

Disse og andre hensikter ifølge den foreliggende oppfin- .. neise vil fremstå for fagfolk på området ved lesning av den føl-gende beskrivelse.

Kort beskrivelse av tegningen

Fig. 1 er et snitt gjennom en utførelsesform for en pakket molekylsepareringssøyle i henhold til den foreliggende oppfinnelse . Fig. 2 er et blokkdiagram som anskueliggjør bruken av mole-kylsepareringssøylen på fig. 1 i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 er et blokkdiagram over en annen utførelsesform som anskueliggjør bruken av en molekylsepareringssøyle i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Figurene 4A og 4B viser enkle fiber/fiber-pakninger. Figurene 5 og 6 er kromatogrammer oppnådd ved separeringene

i henhold til eksempler 1 og 2.

Fig. 7 viser nedtegning av søylevirkningsgrad som funksjon

av lineær hastighet utledet fra eksempel 1.

Fig. 8 er en nedtegning som viser hvordan faktoren (k<1>)

er avhengig av lineær hastighet utledet fra eksempel 1.

Figurene 9 og 10 fremstiller van Deemter avtegninger (sorp-tiv virkningsgrad) og kapasitetsdata for en stasjonær fase ifølge den foreliggende oppfinnelse utledet fra eksempel 4.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Slik det vil bli brukt gjennom hele denne beskrivelse, innbefatter uttrykket "molekyl-separering" separering av komponenter av en gitt prøve, idet man høster fordel av forskjellig stør- reise, fysiske egenskaper eller kjemiske egenskaper hos de forskjellige molekyler som rommes i den aktuelle prøve. Uttrykket "søyle" er ment å omfatte en hvilken som helst beholder, vanligvis, men ikke nødvendigvis med sylindrisk form og med en total dybde på minst 1 cm og fortrinnsvis mer enn 2 cm. Uttryk-kene "homogen" eller "hovedsakelig homogen" som blir brukt i den foreliggende beskrivelse som referanse til den faste stasjonære fase, innebærer at den stasjonære fase har en jevn eller hovedsakelig jevn struktur og/eller sammensetning i et plan på tvers av prøvens strømningsretning gjennom en søyle.

Fig. 1 viser en foretrukken molekylsepareringssøyle 10 til å utføre differensialfordeling av prøvebestanddeler mellom to faser i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Søylen 10 er en hul sylinder 11 med sirkulært tverrsnitt som kan fremstilles fra et .hvilket som helst materiale, f.eks. glass, stål, pleksi-glass og lignende, omfattende en flerhet av skiver av faste, stasjonære faseelementer 12. Kantene 13 av elementene 12 danner en fluidumtett forsegling med den innvendige vegg av sylinderen 11. Den fluidumtette forsegling kan.oppnås på mange måter.. Ved en utførelsesform er dimensjonene på elementene 12 og det indre av sylinderen 11 slik at elementene 12 holdes fast på plass ved hjelp av en friksjonstilpasning, slik at en forhåndsbelastning trykker sammen elementene. Dette krever meget nøyaktige dimensjonstole-ranser for både den innvendige vegg av sylinderen 11 og elementene 12. De enkelte elementer 12 blir satt inn i sylinderen 11, vanligvis ved hjelp av et eller annet mekanisk hjelpemiddel, f. eks. en skyvestav eller stempel. Ved en foretrukken utførelses-form som egner seg dersom en vandig mobil fase blir ført gjennom søylen, er elementene hydrofil.e og sveller noe ved berøring med den mobile fase under dannelse av den nødvendige fluidumtette forsegling med innerveggen av sylinderen 11. I dette tilfelle be-høver dimensjonstoleransene for innerflaten av sylinderen og elementene 12 ikke være så nøyaktige som i tilfellet med en frik-sjons tilpasning.

Søylen 10 innbefatter en innløpshette 15 som holdes på plass ved hjelp av bolter 16 og en utløpshette 17 som holdes på plass ved hjelp av bolter 18. Innløpshetten 15 holdes i et av-standsrelatert forhold med sylinderen 11 ved hjelp av avstands- elementer. Pakningsringer 19 og 20 danner en lufttett forsegling av hettene 15 og 17 med sylinderen 11. Innløpshetten 15 er forsynt med en innløpsåpning 21 til å motta væske som føres inn i søylen, og en innløpsdiffusør 22 til å fordele den innkommende væske over sylinderboringen. Utløpshetten 17 er anordnet med en støtteskjerm 23 som tjener til å holde elementene 12 inne i søylen,og en utløpsåpning 24 som den separerte væske blir tømt ut gjennom til en prøvedetektor for analyse. Fig. 2 anskueliggjør på en skjematisk måte bruken av søylen på fig. 1. Passende oppløsningsmidler, f.eks. "Fisher Scienti-fic" og "MCB High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) grade solvent", kan sirkuleres fra et oppløsningsreservoir 100 ved hjelp av en konstantvolumpumpe 101 som skaffer en strøm på 1 - 12 ml/min, f.eks. som tilgjengelig fra AMF Cuno Division. En puls-demper 102 som kan være et 2 m langt rustfritt stålrør med ytter-diameter 0,16 cm og innerdiameter 0,08 cm, fulgt av en T-kobling med en trykkmåler, forbinder pumpen 101 med en "Valco" seksåpnings-innsprøytningsventil- 103 ved toppen av søylen 104. Passende detektorer 106 for det utstrømmende fluidum innbefatter en Pharma-cia 254 UV detektor for virkningsgradstudier og"fenolseparerin-ger og en Varian (Palo Alto, California) Vari-chrom UV Visible Spectral Photometer for kapasitetsstudier og separeringer som krever bølgelengder forskjellige fra 254 nm. En'strimmelarkopp-tegner 106 med varierbar hastighet kan muliggjøre bruken av hvilket som helst detekteringssystem. Fig. 3 anskueliggjør i diagramform en annen utførelses-form for bruken av en søyle i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Et oppløsningsmiddel fra et passende reservoir 200 blir sirkulert ved hjelp av en eller flere høytrykkspumper 201 som kan være forbundet i serie eller parallell med en høytrykks-pulsdemper 202, en trykkmåler 203 av typen Bourdon og en ventil-sløyfeinnsprøyter 204, og føres inn i en søyle 205 som er utstyrt med en forbikoblingskrets 20 6. Den utstrømmende væske fra søy-len blir tilført et fotometer 207 med et 254 nm fast bølgelengde-filter som er forbundet med en passende opptegner 208, og den ut-strømmende væske eller fluidum blir. deretter ført til et avfalls-reservoir 209.

Den stasjonære fase omfatter en porøs matrise med fibre

som inneholder immobiliserte partikler, idet i det minste en av fibrene eller partiklene er effektive for molekylsepareringer. Den fibrøse matrise er hovedsakelig homogen med hensyn til den enkelte komponent. Fortrinnsvis er partikkelstoffet effektivt for molekylseparering. Molekylsepareringspartikkelstoffet bør holdes i den stasjonære fase med en virksom mengde for å oppnå den ønskede molekylseparering. Fortrinnsvis er den porøse matrise hovedsakelig inert og dimensjonsstabil. Fig. 1 viser bruken av en flerhet av skiveformede elementer, men der kan eventu-elt brukes bare ett eneste søyleelement av tilsvarende lengde.

De foretrukne partikkelstoffer.som kan brukes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, innbefatter alle de stoffer som kan fremskaffes i findelt form og oppviser kromatografisk funk-sjonalitet, dvs. muliggjør effektive molekylsepareringer. Blandinger av slike sammensetninger kan også benyttes. Eksempel på slike partikkelstoffer er siliciumoksyd, aluminiumoksyd, diatomé-jord, perlitt, leirarter, f.eks. vermikulitt, karboner, f.eks. aktivert karbon, modifiserte polymerpartikkelstoffer, f.eks. ioneutbyttingsharpikser., krystallinsk cellulose, molekylsikter --og lignende, hvis overflater kan modifiseres på vanlig måte.

Slike materialer blir markedsført under en flerhet av vare-merker, f.eks. Biosila, Hi-Flosil, LiChroprep.Si, Micropak Si, Nucleosil, Partisil, Porasil, Spherosil, Zorbax Sil, Corasil, Pallosil, Zipax, Bondapak, LiChrosorb, Hypersil, Zorbax, Perisorb, Fractosil, Corning Porous Glass, Dowex og Amberlite harpikser og lignende.

Eksempler på publikasjoner som omtaler partikkelstoffer

som er effektive for molekylseparering er følgende:

US patentskrift 3 669 841 (Miller),

US patentskrift 3 722 181 (Kirkland et al),

US patentskrift 3 795 313. (Kirkland et al) ,

US patentskrift 3 983 299 (Regnier),

US patentskrift 4 029 583 (Chang),

US patentskrift 3 664 967. (Stehl) ,

US patentskrift 4 053 565 (Krekeler), og

US patentskrift 4 105 426 (Iher)

Den fulle tekst av alle disse publikasjoner er her innbefattet som referanser.

Partikkelstørrelsen hos partikkelstoffet er ikke kritisk, men influerer noe på strømningshastigheten med hvilken den prøve som skal behandles, føres gjennom den foreliggende søyle. Vanligvis foretrekkes der partikkelstørrelser som er større enn ca. 5 mykroner, idet 10 - 100 mykroner utgjør et praktisk operasjons-område. Mengden av partikkelstoff kan variere meget fra ca. 10 vektprosent opptil 80 vektprosent eller mer av den faste, stasjonære fase. Den optimale partikkelstoffkonsentrasjon vil variere avhengig av den ønskede molekylseparering, men for nåværende synes de større konsentrasjoner av partikkelstoff å være mer ønskelig .

Den porøse matrise av fiber kan være en hvilken som helst matrise som er i stand til å immobilisere partikkelstoffet som inneholdes deri, dvs. være i stand til å forhindre betydelige partikkelstofftap fra den stasjonære fase og oppvise en porøsi-tet som gjør det mulig for fluidumet å passere gjennom søylen. Fortrinnsvis er den porøse matrise sammensatt av en selvbindende matrise av fibre. Passende fibre som kan benyttes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, innbefatter.polyacrylonitril-fibre, nylonfibre, rayonfibre og polyvinylkloridfibre, cellulosefibre, f.eks. tremasse og bomull og celluloseacetat. Den foretrukne stasjonære fase ifølge den foreliggende oppfinnelse har en porøs matrise sammensatt av en selvbindende matrise av cellulosefibre.

For å skaffe en matrise som er koherent, og en håndterbar struktur for handel og industri, er det ønskelig at i det minste en av komponentene som benyttes ved formingen av den porøse matrise er en lang selvbindende strukturell fiber. Slike fibre gir den stasjonære fase tilstrekkelig strukturell integritet i både den våte "som formet" tilstand og den endelige, tørkede tilstand. En slik struktur tillater håndtering av fasen og i spesielle ark under fremstilling og ved tidspunktet for den påtenkte bruk. Slike fibre er typisk tilgjengelige i diametre i området 6-60 mikrometer. Tremasse, f.eks. har fiberdiametre i området 15 - 25 mikrometer og fiberlengder på ca. 0,85 - 6,5 mm.

De foretrukne lange, selvbindende, strukturelle fibre blir fortrinnsvis skaffet fra normalt dimensjonert cellulosemasse, f.eks. manilahamp,, jute, .caroa, sisal, bleket eller ubleket kraft masse, kozu og lignende som typisk har Canadian Standard Freeness på ca. +400 til +800 ml. Disse lange, selvbindende fibre vil utgjøre mer enn 50% av den porøse matrise, regnet etter vekt, fortrinnsvis ca. 66 - 90% av den porøse matrise og mest foretrukket 75 - 83%.

Når mengden av partikkelstoff som er immobilisert i den porøse matrise, er lav, dvs. mindre enn ca. 50 vektprosent av me-diet, er det foretrukket at den porøse matrise blir tildannet av en selvbindende matrise av normal cellulosemasse med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml.

Ved den foretrukne utførelsesform for den foreliggende oppfinnelse er det ønskelig å ha en stor mengde av partikkelstoff, dvs. mer enn ca. 50 vektprosent av den stasjonære fase immobilisert i den porøse matrise. Det er således meget ønskelig å bruke den oppfinnelse som er beskrevet i en løpende amerikansk søknad, US Serial No. 123 467 til Hou et al, for å bibeholde et slikt

høyt innhold av partikkelstoff i den stasjonære fase. Hele teks-ten i nevnte søknad er innbefattet."i den foreliggende beskrivelse som referanse. I brede vendinger blir en mindre del av cellulosemasse raffinert-til en Canadian Standard Freeness på ca. +100 og -600 ml, og blir innlemmet med en hoveddel av den normalt dimen-sjonerte cellulosemasse (+400 til +800 ml). Spesielt blir ca.

1% til ca. 10% av den raffinerte masse og ca. 10% til ca. 30%

av den normale cellulosemasse i forhold til vekten av den stasjonære fase inneholdt i den stasjonære fase, idet resten består

av partikkelstoffet. Generelt vil vektforholdet mellom uraffinert og høyraffinert masse ligge i området fra ca. 2 : 1 til ca. 10 : 1 fortrinnsvis 3 : 1 til ca. 5 : 1. En slik blanding av masser tillater en tilbakeholdelse av fine partikkelstoffer på opptil ca. 80% eller mer, relatert til vekten av den stasjonære fase.

Mengden av partikkelstoff i den stasjonære fase kan være

så lav som 10% av den faste fase,, opptil ca. 80 .-vektprosent. Fortrinnsvis kan der benyttes nivåer på ca. 50 - 80 vektprosent.

Fortrinnsvis blir de ark som danner den stasjonære fase, tildannet ved vakuumfilting av en vannholdig velling av slike normale cellulosefibre, høyraffinert tremasse og partikkelstoff. Dette danner et ark med partikkelstoffet immobilisert i en porøs matrise. Arket viser en jevn høy porøsitet, fin porestørrelsestruktur med utmerkede strømningskarakteristikker og er hovedsakelig homogen med hensyn til fiber og partikkelstoff.

Sekvensen med å tilsette de ønskede komponenter til vann for dannelse av en vannholdig velling, synes å være forholdsvis uviktig forutsatt at vellingen blir underkastet styrte hydrody-namiske skjærkrefter under blandeprosessen. Fortrinnsvis blir den raffinerte masse ført sammen med en velling av den uraffi-nerte masse hvoretter partikkelstoffet blir innlemmet deri. Vellingen blir vanligvis preparert ved en ca. 4% konsistens og deretter utspedd med ytterligere vann til den riktige konsistens som kreves for vakuumfilting-arkdannelse. Denne siste konsistens . vil variere avhengig av den type utstyr som blir benyttet for dannelsen av arket. Typisk blir vellingen støpt til en hullete flate, vakuumfiltet og tørket på vanlig måte. Det flate dimensjonsstabile ark kan ha en hvilken som helst ønsket tykkelse og blir deretter skåret til de ønskede dimensjoner for hver søyle-type. Alternativt kan elementene vanligvis i form av skiver.som passer til en kromatografisk søyle, fremstilles ved tørrblanding og pressing. En søyle av den stasjonære fase kan også formes in situ, f.eks. ved hjelp av en velling-pakketeknikk.

Kjemiske bindemidler og tilsetningsstoffer kan benyttes ved formingen av den faste, stasjonære fase i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Imidlertid bør der ikke forekomme noen kjemisk behandling som er ødeleggende for molekylseparering.

En foretrukken molekylsepareringssøyle i henhold til oppfinnelsen omfatter en flerhet av elementer, dvs. tilkappede skiver eller puter pakket i søylehuset som vanligvis har form av en sylinder med en meget nøyaktig innerdiameter. Skivene blir tilskåret til den samme diameter som sylinderen og stablet i sylinderen til en passende høyde. Skiven og sylinderen bør fortrinnsvis ha en innbyrdes tilpasning slik at skiven kan skyves inn i sylinderen uten vanskeligheter til en hvilken som helst nødvendig dybde, men bør ikke falle under påvirkning av tyngdekraften. Etter at søylen er pakket i tørr tilstand, kan der benyttes en høytrykkspumpe til pumping av oppløsningsmiddel gjennom elementene som er ..stablet i søylen. Fortrinnsvis sveller elementene for å danne en hovedsakelig forbistrømningsfri kant-tetning mot sylinderveggen. Oppløsningsfronten er meget jevn med liten eller ingen skrå stilling. Fordi de enkelte elementer er dimensjonsstabile, er søylen ikke følsom overfor orien-tering eller håndtering, noe som er et felles og presserende problem ved andre kromatografiske medier, spesielt organisk gelme-dium.

Generelt er de strømningshastigheter som kan oppnås med molekylsepareringssøylene ifølge den foreliggende oppfinnelse vesentlig høyere enn dem man oppnår med vanlige gel- eller pakkede partikkelsøyler. De foreliggende søyler oppviser også en fremragende kapasitet fordi diameteren av søylen er så å si uten grenser, sammenlignet med vanlige gel- eller partikkelsøyler.

Molekylsepareringssøylene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan benyttes i forbindelse med de velkjente molekylsepareringer som vanligvis utføres med kjente søyler.

Dessuten kan søylene ifølge den foreliggende oppfinnelse finne anvendelse på områder hvor vanlige søyler er upraktiske,

se f.eks. den ovennevnte verserende og beslektede amerikanske søknad, US Serial.No. "Process for Preparing a Zero Standard Serum" til Hour og US Serial No. 238 686 "Tissue Culture Medium" til Cone ét al.

Typiske kromatografiske separeringer utført før den foreliggende oppfinnelse har ført til utviklingen av meget fine, sfæriske, i mange tilfeller homogene faste, stasjonære fasematerialer. Vanlige teoretiske analyser av kromatografiske separeringer, førte til den konklusjon at for høye oppløsninger,prak-tiske trykkfallnivåer og brukbare strømningshastigheter trengte søyler av analytisk type, meget små sfæriske og jevne partikler med meget spesielle overflateegenskaper. Bruken av sammenlign-bare ikke-homogene partikler, dvs. fibre og partikkelstoff med stor størrelsesfordeling, fordelt i en bimodal.(to størrelser) fibermatrise som den stasjonære fase i henhold til den foreliggende oppfinnelse er i direkte motsetning til alt som er kjent vedrørende kromatografiske separeringer.

De variable som bør tas i betraktning med hensyn til den stasjonære fase ifølge den foreliggende oppfinnelse er bl.a.:

1) type av fiber eller fibre som blir benyttet,

2) aspektforhold (L/D) for hver fibertype (opprinnelig og etter raffinering),

3) volumprosent av hver komponent i blanding,

4) type partikkelstoff eller benyttet partikkelstoffblanding, 5) diameter av partiklene (i fall sfæriske) eller annet

mål for partikkelgeometri (aspektforhold etc.),

6) faststoffnivå (S/L brukt ved skivedannelse),

7) forhold (R) mellom partikkelstørrelse (diameter) og

fiberdiameter,

8) type av harpiks eller bindemiddel som blir benyttet

(dersom slikt blir benyttet),

9) overflatemodifikasjon for partikkelstoff (eller fi-.

bre) som blir benyttet,

10) oppløsningstype som brukes for velling (vann, alko-hol, oppløsningsmiddel) for dannelse av ark, 11) velling-tilsetningsstoffer (fuktemidler, urenheter

osv.), og

12) ' filtebetingelser

Dersom man antar at den stasjonære fase i henhold til den foreliggende oppfinnelse vil bli fremskaffet under bruk av en fibermatrise (f.eks. raffinert pulp og høyraffinert pulp) og verflateaktivt partikkelstoff eller partikkelstoffblanding, kjemisk behandlet eller derivatisert før bruken for spesielle overflateegenskaper innbefattende eller ikke innbefattende fiberen etter ønske, og bindemiddelsystemer så vil den følgende forenk-lede diskusjon være til hjelp for en fagmann på området hva.angår konstruksjonen av den stasjonære fase.

En stasjonær fase med en høy bulkfaktor er ønskelig. En åpen eller porøs matrise med høy kompresjonsstyrke er nødvendig for høy strømningshastighet ved lave trykkfall. Disse egenskaper er fortrinnsvis bestemt av fibermatrisen og må være i overens-stemmelse med det å holde partikkelstoffet i konstruksjonen. Derfor vil den optimale blanding variere fra partikkelstoff til partikkelstof f .

Dersom man for distribusjonens skyld antar at fibrene er solide staver med forskjellige L/D-forhold og at de partikkelformede tilsetningsstoffer av natur er sfæriske, så blir problemet med stasjonær fasekonstruksjon fra et strukturelt synspunkt et som gjelder forståelsen .av pakkingen av fibre med fibre bg fibre med sfærer. Enkel fiber/fiber-pakking er vist på figurene 4A og 4B. Densiteten av et enkelt fibersystem er en funksjon av fiber L/D-forholdet, idet lave L/D-forhold fører til høyere densiteter og lavere innleiringsvolumer. Bulkvolumene som en funksjon av L/D-forholdet for forskjellige stive fibre er kjent. Bulkvolumet er hovedsakelig uavhengig av fibermaterialet (fibre med lav modulfleksibilitet vil ha en forskjellig virkning). Dersom fi-berblandinger tas i betraktning er problemet noe mer komplisert og den resulterende pakkevirkning blir bestemt ved forholdet mellom fiber L/D-forholdene. For fibre med samme diameter vil fibre som er korte nok til å kunne passes inn i innleiringsvolumet for de lengre fibre, skaffe et materiale med lavere bulkdensitet. Visse andre fiberstørrelses-forhold kan øke eller redusere det resulterende bulkvolum.

Jevne kuler, dersom de tillates å bli pakket ved hjelp av tyngdekraften, vil danne heksagonale pakkede lag. Tabell 1 viser virkningen av kulediameter på opptatt volum, innleiringsvolumet, overflatearealet og forholdet mellom overflate og innleiringsvolum.

Som ventet vil forholdet mellom overflate og innleiringsvolum øke dramatisk for mindre diametre, mens det totale innleiringsvolum øker bare svakt. Det som ikke er vist i denne tabell, er imidlertid at selv om innleiringsvolumet øker bare lite, blir banen gjennom innleiringsvolumet mye mer snodd fordi hver komponent i banen blir meget mindre (noe som fører til høyere trykkfall for partikler med mindre diameter). Forholdet mellom innleiringsvolum og overflateareal er viktig fordi dette er den faktor som primært bestemmer likevektsfordelingen av materialet fra væskefasen til den faste fase i en typisk kromatografisk søyle. Dette enkle bilde på en kulepakking viser hvorfor jevne kuler med liten diameter gir nyttigere søyler så lenge som trykkfallet ikke blir for stort. Typisk er partikkeldiametre fra 5 til 10 mikrometer vanlig i forbindelse med væskekromatografi. Dersom små kuler blir blandet med store kuler er bulkvolumet en funksjon av de aktuelle diametre og volumbrøkdeler.

Dersom enkle, jevne fibre blir pakket sammen med jevne kuler, blir den effektive kulepakking brått avbrutt og bulkfakto-ren blir en funksjon av fiber L/D-forholdet og forholdet R mellom kulediameter og fiberdiameter, og volumbrøkdelen av hver komponent. Dette er vist i tabell 2 som indikerer de store densi-tetsforskjeller som er mulige med sammensatte blandinger avhengig av størrelse og mengde av hver komponent.

<*>Milewski, John V., "Identification of Maximuiti Packing Conditions in the Bimodal Packing of Fibers and Spheres", 29. årlige Rein-forced Plastics Composites Conference, februar 1974.

Dersom blandingen består av fiberstørrelseblandinger (forskjellig L/D) og kulestørrelseblandinger (bimodal, trimodal, osv.) blir pakkedensiteten et komplisert funksjonelt forhold for å finne mer optimale materialer. Større bulkvolum fører til større strømningshastighet, men dette virker inn på kompresjonsstyrken. ' Andre partikkelformer og andre fibermodi (f.eks. ikke-stive fibre) vil tilføye sin egen kompleksitet.

Dersom man tar utgangspunkt i en søyle med pakkede, jevne kuler og tilsetter en liten mengde fiber, så kreves det meget lite fiber for å skaffe en stor endring i innleiringsvolumet i den resulterende blanding. Forholdet mellom innleiringsvolum og overflateareal vil øke likeså vel som størrelsen på de individuelle volum som bidrar til det totale innleiringsvolum. Dette vil føre til høyere strømningshastigheter, men på bekostning av fordelingslikevekten som er ansvarlig for komponentsepareringen. Litteraturen oppviser ikke klarhet med hensyn til den relative størrelse av disse virkninger. Der kan finnes et system med høyt innleiringsvolum overensstemmende med god, jevn fordeling av de aktive partikler, men ved et forhold mellom innleiringsvolumele-ment og partikkeloverflateareal, som fremdeles stemmer overens med gode mediaseparasjonsegenskaper. Disse strukturendringer vil påvirke den strekning langs hvilken diffusjonen finner sted, graden av blanding og strømningsturbulens, buktningen av væskestien og andre egenskaper. Derfor er optimale strukturer for hvert spesielt system til en hviss grad empirisk. Til tross for teoretiske forklaringer av operasjonsmåten er den foreliggende søyle kjennetegnet ved et vesentlig redusert trykkfall, og mer jevne kromatografiske topper. Den foreliggende søyle passer utmerket for preparativ kromatografi, såvel som for analytisk kromatografi.

I den hensikt å anskueliggjøre oppfinnelsen ytterligere blir der beskrevet forskjellige eksempler i det følgende. Det skal forstås at i disse eksempler som i hele beskrivelsen og kra-vene, er alle deler og prosenter referert til vekt og alle tempe-raturer gitt i °C, hvor intet annet er anmerket.

EKSEMPEL 1

Weyerhauser Coho bleket kraftmasse med gjennomsnittlig diameter på ca. 20 mikroner, gjennomsnittlig lengde på ca. 0,16 cm og Canadian Standard Freeness på +600 ml, ble raffinert i en dobbeltskiveraffinør av typen Black Claussen til en Canadian Standard Freeness på -250 ml. Den raffinerte masse, uraffinert masse og en umodifisert siliciumoksydgel med ca. 15 mikroner i diameter ble tilsatt vann under sterk omrøring for å danne en vannholdig velling med konsistens på ca. 4%. Vellingen ble utspedd til en konsistens på 2% og deretter vakuumfiltet i et ca. 16 cm diameter håndarkapparat ved bruk av en 100 mesh sil. Arket ble fjernet fra apparatet og tørket i en statisk ovn ved ca. 175°C inntil der ble oppnådd en konstant vekt. Arket inneholdt 70% med siliciumoksydpartikler og 30% tremassfiber (24% uraffinert masse og 6% høyraffinert cellulosemasse). Partikkelstoffet var Syloid (W.R. Grace) 620 med en nominell gjennomsnittlig partikkel-størrelse på 15 mikroner, et overflateareal på 320 m 2/g og et porevolum på 1,1 ml/g.

Skiver ble tilberedt og pakket i et 50 cm presisjonsboret rør av rustfritt stål med en innvendig diameter på 10 mm, idet der ble benyttet en tapp med 9,5 mm diameter. Skivene ble pakket hver for seg til en søyle med silsiden ned, og der ble gjort an-strengelser for å trykke sammen hver skive i samme grad.

Undersøkelse av siliciumoksydet ved hjelp av et elektronisk avsøkningsmikroskop åpenbarte forekomsten av siliciumoksydpartikler med størrelser i området 1-40 mikroner, et trekk som er hovedsakelig uegnet for kromatografisk bruk pga. høyt trykkfall og ikke-toppsymmetri fremskaffet av den pakkede sammenstilling av partikler med heterogen størrelse. Hele partikkelstørrelses-området forble tilbakeholdt i cellulosematrisen. Noe siliciumoksyd gikk tapt under filteprosessen slik at den endelige sammensetning inneholdt 64% partikkelstoff. Det ble observert at siliciumoksydpartiklene synes å være sammenbundet ved hjelp av den lille høyraffinerte masse og slike fibre kan i virkeligheten være kjemisk bundet til siliciumoksydoverflaten ved berørings-punktene. Den fullstendig pakkede søyle inneholdt 15,7 gram av sammensetningsmaterialet og et tomt volum på 32,5 ml, dvs. 83% av hele søylevolumet.

En testblanding inneholdende tre komponenter ble tilberedt. Komponentene ble valgt for å skaffe informasjon om topp-dispersjon for ikke tilbakeholdt (k' = 0, toluen), noe tilbakeholdt (k' = 2 - 3, dibutylftalat "DPB"). og godt tilbakeholdt

(k<1>=5-6, dimetylftalat "DMP"). oppløsninger. Den mobile fase-sammensetning (0,2% isopropanol i heptan) ble justert for å gi den passende tilbakeholdelse for disse komponenter i den stasjonære fase. Søylen ble testet ved strømningshastigheter på 0,2 - 19,9 ml/min og de kromatografiske karakteristikker (trykkfall, kapasitetsfaktor og H) ble beregnet, og resultatene er angitt i nedenstående tabell 3. Den høye grad av toppsymmetri som ble utvist av den sammensatte søyle gjennom evalueringen er illu-strert ved hjelp av et representativt kromatogram som angitt på fig. 5.

Økningen i trykkfall over søylen ble funnet å være en lineær funksjon av strømningshastigheten (lineær hastighet) ved trykk opptil 70 kg/cm 2. Mens dette ikke er overraskende for partikkelinneholdende pakkede sammenstil-linger, så viser det at der så å si ikke fant sted noen kompresjon av matrisen ved disse trykk. Søylen ble også utsatt for et trykkfall på 154 kg/cm<2>som svarte til den maksimale strømningshastighetskapasitet for systemet (19,8 ml/min). Etterfølgende reevaluering av de kromatografiske parametre ved en strømningshastighet på 6 ml/min gav

verdier (H^„„ = 1,53, H^.,„ = 1,17) som bare var noe svakere enn

DBP DMP

dem som tidligere ble oppnådd (tabell 3). Et tomrom på 2,5 mm ble imidlertid notert ved innløpsenden av søylen når tetningen ble fjernet.

Innvirkningen av s.trømningshastighet på kromatograf isk virkningsgrad for den stasjonære fase er vist på fig. 7. Den generelle form av kurvene er make til den som ble oppnådd med pakkede søyler av porøs siliciumoksyd. Selv om begynnelsesøkningen H for vanlige søyler er større enn for den porøse matrise i henhold til den foreliggende oppfinnelse, så blir dette noe utbalansert ved en senere utflatning av kurven ved høye strømnings-hastigheter. Virkningsgraden for søylen ifølge den foreliggende oppfinnelse i området for relativ konstant H, svarer i grove trekk til den som ble oppnådd med 30 - 35 mikron porøse siliciumoksydpartikler og der ble i det vesentlige ikke observert noen variasjoner i kapasitetfaktoren ved de strømningshastigheter som ble undersøkt som vist på fig. 8.

EKSEMPEL 2

Til sammenligning ble der pakket en søyle med dimensjoner 25 cm . 10 mm innerdiameter som inneholdt 10,3 g av de samme siliciumoksydpartikler ved hjelp av en modifisert balansert densi-tetvellingteknikk. Dette var tilnærmet ekvivalent med de 10 g av siliciumoksyd beregnet til å være inneholdt i 50 cm søylen beskrevet i eksempel 1. Den toppsymmetri som ble oppnådd med denne søyle var generelt dårlig, og viste en forholdsvis heterogent pakket ansamling. De pakkede partikler undergikk tilsynelatende en viss forskyvning under senere bruk og trykkene nærmet seg det opprinnelige pakketrykk (ca. 350 kg/cm 2) og toppsymmetrien forbedret seg til den som er vist på fig. 6. De kromatografiske parametre som ble beregnet for siliciumoksydsøylen, er vist i følgende tabell 4.

For ytterligere sammenligning ble der i 50 cm søylen evaluert en sammensetning inneholdende 94% uraffinert cellulose og 60% av cellulose med Canadian Standard Freeness på -250 ml. De beregnede parametre er gitt i tabell 5 nedenfor.

Trykkfallet var nesten make til det for sammensetning inneholdende partikkelstoff ved alle strømningshastigheter som ble undersøkt, men toppfordelingen (H) for det ikke tilbakeholdte, oppløste produkt (toluen) var mye større. Ftalatene ble ikke holdt tilbake på den porøse cellulosematrise.

EKSEMPEL 3

Kromatografiske karakteristikker hos ytterligere faste, stasjonære fasematerialer i henhold til den foreliggende oppfinnelse ble bestemt og resultatene fremgår i de følgende tabel-

ler 6-9.

EKSEMPEL 4 -

Under bruk av søylen ifølge eksempel 1 og arrangementet vist på fig. 3, ble der utført separeringer av fenoler og ftalater. Virkningsgrads- og kapasitetsdata som ble oppnådd fremgår av henholdsvis fig. 9 og 10.

Fenolene ble separert ved bruk av 1% isopropylalkohol i kloroform som en mobil fase, noe som gav en oppløsningsstyrke større enn den påkrevde 0,3 for å vaske ut fenoler fra siliciumoksyd. Strømningshastigheten var 3,2 ml/min og komponentene vari-erte mellom 10 og 2 5 mg. Komponentene ble vasket ut i orden benzen, o-klorofenol, p-fenylfenol, fenol og p-nitrofenol. Oppløs-ningen av de første to komponenter var ca. 90% og de tredje og fjerde komponenter ca. 80% og den endelige sammensetning større enn 98%. Selv om fenol og p-fenylfenol viste seg som en eneste topp i blandingskromatogrammet, så viste kromatogrammet for de rene komponenter en tilbakeholdelsesforskjell på 30 mm ved en karthastighet på 4 8,6 cm/time. Når de rene komponentkromatogram-mer ble overlagret, ble der observert en oppløsning på 88%. Den mest fremtredende side av van Deemter nedtegningen vist på fig._9 er formen av kurven. Normalt for væskekromatografi er det ventet at H-verdiene avtar ved små strømningshastigheter. Det er nå også blitt rapportert i litteraturen at ved meget små strømnings-hastigheter kan H-verdiene begynne å avta og deretter øke kraftig. Slik det kan ses av fig. 9 vil H-verdiene avta når strøm-ningshastigheten avtar, deretter øke kraftig, og til slutt avta på nytt, en slags oppførsel som ikke tidligere er blitt rapportert .' Det annet sett av kromatogrammer ble oppnådd ved separeringen av dimetyl, dietyl, dibutyl og dioktylftalater. Oppløs-ningssystemet som ble benyttet var 7% kloroform i heksan, idet strømningshastigheten var 3,8 ml/min og karthastigheten var 40,6 cm/time. Bestanddelene ble vasket ut etter orden av avtagende molekylvekt. Oppløsningen for oktyl og butylftalat var 95% eller bedre, idet oppløsningen for de sistnevnte to komponenter var 92 - 94%. Toppene i blandingskromatogrammet representerte 18 - 22 mg av hver bestanddel. Fig. 10 viser at den stasjonære fase av den foreliggende oppfinnelse hadde i det minste en kapasitet på 100 mg.

EKSEMPEL 5

Idet der ble fulgt fremgangsmåtene og bruken av søylene omtalt i eksempel 4, ble der bestemt søyleparametre for en 99% separering av ftalater med en 3,15 cm/min strømningshastighet. Med den stasjonære fase inneholdende nominelt 70% partikkelstoff ble separasjonstiden 2,38 min, idet trykkfallet var ca. 9,4 kg/ cm 2, avstanden den mobile fase forflyttet seg var 5,71 cm og den totale mengde av partikkelstoff var 1,14 g. For siliciumoksyd-partikkelstoffsøylen var separasjonstiden 1,08 min, idet trykkfallet var ca. 20,6 kg/cm 2, avstanden den mobile fase hadde forflyttet seg var 1,54 cm og den totale mengde av partikkelstoff 0,705 g. Vesentlig lenger søyler er påkrevet med den stasjonære fase ifølge den foreliggende oppfinnelse for den samme grad av separering fremskaffet av en 100% partikkelstoffsøyle. Den ytterligere søylelengde er imidlertid mer enn utbalansert ved lave trykkfall for separeringen. Ved kommersielle separeringer er trykkfallkarakteristikkene for separeringsmediet meget viktig, fordi for høye trykkfall kan begrense kapasiteten hos søylen, noe som krever dyre pumper og materialer eller legger, en begrensning på søylelengden og således antallet av teoretiske plater som er tilgjengelige for en gitt separering. Fordi den stasjonære fase ifølge den foreliggende oppfinnelse har et vesentlig lavere trykkfall enn 100% partikkelstoffsøylen, kan der benyttes adskil-lig større søylelengder.

EKSEMPEL 6

• Dette eksempel viser at sammensetningen av de materialer som blir benyttet ved fremstillingen av den faste, stasjonære fase, har virkning på den kromatografiske effektivitet hos den resulterende stasjonære fase.

Der ble tilberedt åtte vannholdige blandinger åv siliciumoksydgel, lange cellulosefibre og høyraffinert masse og blandingen ble omrørt for jevnt sluttresultat. De vannholdige suspen-sjoner ble deretter helt over i en filterstøpeform for fjerning av vann og dannelse av en sammensatt materialfilt. Åtte filter ble fremskaffet i henhold til den eksperimentelle form som er presentert i tabell 10 med spesielle sammensetninger av materialene tilsatt den vannholdige suspensjon som fremgår av tabell 11. De åtte filter ble deretter fjernet fra filteret og tørket. Fra

den tørkede, sammensatte filt ble der deretter avskåret plugger (10 mm i diameter) som ble pakket 250 mm søyler av rustfritt stål med vanlige forberedende høyydelsevæskekromatografendeavslutnin-ger. De kromatografiske evalueringer av de således dannede stasjonære faser ble utført under bruk av en mobil fase av 0,2% 2-propanol/heptan. Trykkfallet og dispersjonskarakteristikkene for søylene med 10 mm innerdiameter ble evaluert ved strømnings-hastigheter på 0,2, 6 og 19,8 ml/min. Dispersjonskarakteristikkene for de stasjonære faser ble bestemt ved bruken av et ikke tilbakeholdt produkt (toluen), et noe tilbakeholdt oppløst produkt (dibutylftalat,. "DBP") og et godt tilbakeholdt oppløst produkt (dimetylftalat, "DMP"). De eksperimentelle resultater av tilberedelsen av fiberpartikkelstoffmaterialene såvel som den kromatografiske effektivitet for disse materialer fremgår i tabellene 12 - 15. Virkningene for hver av de sammensatte variab-ler på hvert sett av de eksperimentelle resultater ble deretter oppnådd med en vanlig statistisk analyse av silkonstruksjonen. Virkningen av en variabel utgjorde forskjellen mellom det gjennomsnittlige ekseperimentelle resultat når den uavhengige variable var positiv og den gjennomsnittlige verdi av de éksperimen-

telle resultater når den uavhengige variable var negativ. De variable nivåer valgt for løp 8, ble definert vilkårlig som de negative nivåer for disse variable i denne konstruksjon. Betydningen av virkningene ble estimert ved sammenligning av virkningene av de uavhengig variable, og virkningene oppnådd med de dummy-variable. Virkningen av de dummy-variable skyldes eksperimentelle feil såvel som variable innbyrdes påvirkninger. På grunn av den sterke innbyrdes påvirkning som potensielt forekom-mer i denne silkonstruksjon, ble virkningene av partikkelstør-relse, spredningen av partikkelstørrelsesfordeling og nærværet av blandinger i partikkelstoffet også innbefattet ved vurderingen av virkningene som skyldes eksperimentelle feil og variable innbyrdes påvirkninger. Dette resulterer i en konservativ vurdering av sannsynligheten for betydning, og betydningen av virkningene kunne være vesentlig større enn det som fremgår av tabellene. Analyser av virkningene av de variable er presentert i tabellene 17 - 38.

Hver av de variable som ble undersøkt, hadde betydning for påvirkningen av den kromatografiske ydelse hos den stasjonære fase. Noen av de sammensatte variable forbedret noen av de eksperimentelle resultater, men resulterte i redusert ydelse på andre områder. Et sammendrag av virkningene av sammensetningen av den stasjonære fase på noen av de mer betydningsfulle eksperimentelle resultater er angitt i tabell 38.

Da partikkelstørrelsen av et porøst siliciumoksyd av merket Partisil ble redusert fra 10 mikroner til 5 mikroner, oppsto der et stort vekttap av det sammensatte materiale under dannelsen, av-tapningstiden ble redusert, trykkfallet gjennom arket ble større og høyden svarende til en teoretisk plate (H. i mm) ble lavere. Produktet av trykkfallet og høydeekvivalenten for den teoretiske plate ble øket. Den totale oppløsning av søylen ble ikke vesentlig øket ved en endring i partikkelstørrelsen av Partisil. Når eksperimentrekkene basert på Partisil ble sammenlignet med ekspe-rimentrekker basert på siliciumoksyd av typen Syloid 620, reduserte Partisil filtdreneringstiden og søyleoppløsningen. Høyde-ekvivalenten av teoretisk plate såvel som produktet av trykkfallet og høydeekvivalenten for den teoretiske plate var større for søyler basert på Partisil enn søyler basert på Syloid 620. Når Partisil forekom som en blanding med Syloid 620 hadde blandingen både lavere trykkfall og lavere høydeekvivalent av teoretiske plater i det sammensatte materiale, hva enn enten ren Syloid 620 eller ren Partisil ble brukt som partikkelstoff. Oppløsningen av søylene når der forelå blandinger av Partisil og Syloid 620, ble forbedret mens produktet av trykkfall og høydeekvivalent for den teoretiske plate ble redusert, vekttapet forbundet med den sammensattet materialforming økte, filtdreneringen avtok og høyde-ekvivalenten av den teoretiske plate ble redusert. Der var liten virkning på trykkfallet, oppløsningen og produktet av trykkfall og høydeekvivalenten for den teoretiske plate. Der var en mode-rat virkning på mengden av den raffinerte masse og kapasitetsfaktoren for dimetylftalat. Vanngjennomslipningsevnen hos massen var en betydelig variabel fordi forsøksrekkene med høyere vann-gjennomslipsningsverdier, dvs. mer positiv CSF hadde lavere vekttap, lavere dreneringstid i feltdannelsen, lavere trykkfall og dårligere oppløsning med økt høydeekvivalent for en teoretisk plate. Generelt ble imidlertid produktet av trykkfallet og høy-deekvivalenten for. teoretiske plater redusert når massevanngjen-nomslipningsevnen øket. Mengden av partikkelstoff i det sammensatte materiale var en betydelig variabel fordi reduksjon av mengden av partikkelstoff i det sammensatte materiale reduserte vekttapet, trykkfallet og produktet av trykkfallet og høydeekvivalent for den teoretiske plate. Reduksjonen av mengden av partikkelstoff skaffet sammensatte materialer med vesentlig lavere kapasi-tetsf aktorer , lavere oppløsning og en større høydeekvivalent av teoretiske plater.

En viktig variabel ved vurderingen av ydelsen hos de sammensatte materialer for kromatografiske separeringer, er produktet av trykkfall og høydeekvivalenten for en teoretisk plate. Dette produkt kan sammenlignes med trykkfall pr. teoretisk plate, og en lavere verdi svarer til en mer effektiv separering fordi der ved en gitt strømningshastighet kreves mindre trykkfall for å oppnå separeringen av en teoretisk plate. Kombinasjonen av variable som foreligger i forsøksrekke 2, resulterte i en betydelig forbedring i verdien av produktet av trykkfall og høydeekvivalent for en teoretisk plate når produktet ble sammenlignet med produk-ter fra forsøksrekker 4,5, 7 og 8, hvor. enten ren Partisil eller ren Syloid 620 ble brukt som partikkelstoff. Produktet av høyde-ekvivalent av en teoretisk plate og trykkfallet var lavere i hver forsøksrekke hvor Partisil ble blandet med Syloid 620, sammenlignet med forsøksrekker utført med ren Partisil eller ren Syloid 620 som partikkelstoffet i de sammensatte materialer.

EKSEMPEL 7

En søyleparameter som i betydelig grad virker inn på effek-tiviteten for en søyle med henblikk på separering av komponenter, er graden av aksial dispersjon. Det passer å sammenligne den dispersjon som oppnås ved forskjellige søyler, ved hjelp av en dispersjonsvarians. Når topputvaskingen er gaussisk trengs der to parametre for å etablere denne kurve, gjennomsnittet og standardavviket. Variansen av dispersjonskurven utgjør kvadratet av standardavviket. Den dimensjonsløse varians som oppnås ved divi-sjon av standardavviket ved hjelp av dispersjonskurven og deretter kvadrering av resultatet, kan brukes til å sammenligne virkningsgraden for de-forskjellige søyler.

Idet man følger fremgangsmåten ifølge eksempel 4, oppnådde man de dimensjonsløse varianser for kromatografisk separering av DMP (dimetylftalat) og DBP (dibutylftalat), hvilket er angitt i tabell 39. Det skal gjøres oppmerksom på at dispersjonen for de tilbakeholdte komponenter ikke var vesentlig større enn dispersjonen for den ikke tilbakeholdte komponent ..toluen. Fordi dispersjonen for den tilbakeholdte komponent er avhengig av dispersjonen, pga. baksideblanding ("back mixing") i selve søylen,

så kan enhver dispersjon pga. diffusjonsmotstand, variansen som

skyldes diffusjon eller motstand, oppnås ved subtraksjon av toluen variansen fra variansen hos den tilbakeholdte komponent. En slik beregning er presentert i tabell 40. Det skal bemerkes at meste-parten av søylevariansen skyldes langsgående diffusjon eller baksideblanding. Bidraget fra diffusjonsmotstanden ble tilsynelatende den samme for både DMP og DBP og disse resultater er i motsetning til dispersjonen som ble oppnådd med en partikkelstof f-søyle av Syloid 620 som også foreligger i tabell 40. Der ble oppnådd forholdsvis skarpe topper med den ukjente tilbakeholdte komponent toluen og vesentlig større dispersjon ble oppnådd med de tilbakeholdte komponenter. Dette viser at der fore-kommer forholdsvis lite baksideblanding eller aksial diffusjon i

siliciumoksydsøylen. Der var store forskjeller i DBP som ikke blir tilbakeholdt i den grad som DMP. Ved de mindre og større strømningshastigheter som ble undersøkt,var diffusjonsmotstanden større i partikkelstoffsøylen enn i den sammensatte søyle. Bidraget pga. baksideblanding vil variere avhengig av den spesielle blanding av den sammensatte søyle.

EKSEMPEL 8

Idet man fulgte fremgangsmåten ifølge eksempel 7, ble trykkfall H, tilbakeholdelsesfaktor k' og teoretisk minimal søy-leavstand nødvendig for 99% separering av DMP og DBP bestemt og oppført i tabell 40. Trykkfallet er tilnærmet lineært i forhold til strømningshastighet, noe som indikerer laminære strømnings-betingelser. Dispersjonskoeffisienten eller graden av baksideblanding som ble oppnådd,er også tilsynelatende lineær relatert til strømningshastigheten. H for det sammensatte materiale vari-erte ikke generelt så mye med strømningshastigheten som forholdet var for en søyle'som inneholder 100% partikkelstoff. Uføl-somheten hos det sammensatte materiale med hensyn til strømnings-hastigheter er en fordel.

EKSEMPEL 9

Den søylelengde som er nødvendig for oppnåelse av en gitt separering er avhengig av separeringstiden mellom toppene og toppbreddene. Tiden mellom toppene er en funksjon av kapasitets-f aktoren kog bredden mellom toppene kan uttrykkes som tallet for standardavvikene (X). Følgende ligning kan brukes til å forhåndsbestemme den søylelengde som er nødvendig for å oppnå

en bestemt separering.

lengde = (eksperimentell søylelengde)

(dimensjonsløs varians) (X) 2(summen av

kapasitetsfaktorer pluss to/differanse mellom

2

kapasitetsfaktorer)

For 70% Syloid 620-søylen beskrevet tidligere, ble 99% av prøven gjenvunnet og tallet for standardavvikene var 2,33. Følgelig er den søylelengde som er nødvendig for separering av DMP fra DBPj bare 7 cm. Denne ligning tar ikke hensyn til søyleuregel-messigheter som kan bevirke kanaldannelse og på sin side bevirke bredere topper. Utvaskriingskurver blir heller ikke representert ved en normal fordeling, spesielt ved høye søyleutnyttelser, noe som har en tendens til å introdusere ytterligere feil. Imidlertid er ligningen av verdi, fordi den tillater forenkling av pre-liminær konstruksjon og identifisering av betydelige variable for konstruksjonen.

Søylekapasiteten er relatert til den tid det tar for en komponent til å bli vasket ut. Å oppnå en høy kapasitet er ikke nødvendigvis ønskelig fordi lengre tilbakeholdstider i virkeligheten reduserer produksjonskapasiteten dersom man ønsker separeringer. Teoretisk er kapasitetsfaktoren lik produktet av avde-lingskoeffisienten og forholdet mellom ytterflatearealet av den stasjonære fase og volumet av den mobile fase. Følgelig kan ka-pasitetsf aktoren for den stasjonære fase ifølge den foreliggende oppfinnelse justeres ved endring av forholdet mellom overflatearealet og tomromsvolumet for det sammensatte materialet. Tomromsvolumet for alle de stasjonære faser som ble testet, slik det er beskrevet i foreliggende eksempler, var tilnærmet konstant og fibrene oppviste ingen separeringskapasitet for de utprøvde komponenter. Dette, peker., på at mengden av partikkelstof f eller partikkelstof f blanding i den sammensatte blanding er den hovedvari-able som kan brukes for å virke inn på kapasitetsfaktoren for det sammensatte materiale. Der eksisterer et lineært forhold mellom kapasitetsfaktoren og forholdet mellom mengde av siliciumoksyd og tomromsvolum.

EKSEMPEL 10

Fraksjonering av gjenvunnet menneskelig plasma ved hjelp av

svake an i onu tvek s l i rig smed i er

En 10 ml alikot av gjenvunnet menneskelig plasma er fortyn-net tifoldig med 0,025 M pH 5,5 natriumacetatbuffer (endelig pH 6,31) ble ført gjennom en søyle svarende til den foreliggende oppfinnelse og med mål 12,5 cm høy og 2,5 cm innerdiameter og pakket med individuelle sorpsjonselementer inneholdende 70% siliciumoksydgel (70 mikrometer gjennomsnittlig partikkelstørrelse modifisert ved behandling med 3-aminopropyltrietoksysilan). Gjennom-strømningshastigheten var 5 ml/min. Søylen ble vasket ut sekven-sielt med

. (1) 0,025 M natriumacetatbuffer pH 6,31,

(2) 0,25 M natriumacetatbuffer pH 5,5,

0,25 M natriumacetatbuffer pH 4,8, og

(3) 0,25 M natriumacetatbuffer pH 4,0

Utvaskningsprofilene for de fire fraksjoner er fremstilt

på fig. 11. Fraksjoner på tilnærmet 20 ml ble oppsamlet og tolv ble utvalgt for albuminanalyse (Sigma nr. 630) og globuliner (Sigma nr. 560). Utvaskningsprofilene av de tolv fraksjoner er gitt i følgende tabell 41, og karakteristikkene for de seks pul-jedannede fraksjoner er gitt i tabell 42.

EKSEMPEL 11

Glucoamylase- rensing ved hjelp av svake anioriutveks1irigsmedier

En markedsført glucoamylaseoppløsning ble dialysert mot 0,025 M natriumacetatbuffer med pH 5,5 og filtrert gjennom et 50 S Zeta Plus kation-modifisert filtermedium (AMF Incorporated, White Plains, New York). En 1 ml prøve av oppløsningen (45,6 mg/ml, protein) ble deretter tilført en kromatografisk søyle (10 cm høy og 0,9 cm innerdiameter) ved 1 ml/min (22 PSI) ved romtemperatur. Søylen ble pakket med sorpsjonselementer av den art som beskrevet i eksempel 10. Et totalt antall på 80 rør av 3,3 ml fraksjoner ble samlet sammen og puljedannet til 6 fraksjoner svarende til forskjellig pH-verdi og ionestyrke-trinnend-ringer ved utvaskingen av proteiner (tabell 43). Analyseresul-tatene av de seks fraksjoner sammenlignet med begynnelses-protein-prøven er gjengitt i tabell 43. Disse data viser at tilnærmet 77% av begynnelsesaktiviteten blir gjenvunnet i fraksjon VI med en 1,8-foldig rensing.

EKSEMPEL 12

Rensing av immunoglobuTin G ( Tg G)

Hver av fire kromatografiske søyler med dimensjoner 10 cm høyde . 10 mm innerdiameter ble pakket med 0,2 g av det sorpsjons-elementmedium som er beskrevet i eksempel 10 og ble operert ved en strømningshastighet på 1,5 ml/min. Ig G-prøvene (ammoniumsul-fatfraksjoner av menneskelig serum tilgjengelig fra Immunore-agents Inc, Sequin, Texas) ble dialysert mot 0,05 M natriumfosfat pH 6,8, før gjennomføring gjennom søylen. Søylene ble vasket ut med 0,05 M natriumfosfat_pH 6,8 og 0,025 M natriumacetat med

De resultater man oppnådde med hver søyle fremgår av den følgende tabell 44.

Fra tabell 4 4 kan det ses at de første tre søyler gav lignende resultater. Dersom det antas at separeringen i den minste prøve var optimal, så skal det ses at distribusjonen av protein (lg G) i de neste to prøver er meget lik med tilnærmet 71% av den gjenvinnbare protein utvasket med 6,8-bufferen. Ved den fjerde prøve økte proteinet i 6,8-fraksjonen til 77,2% av den gjenvinnbare protein, noe som viser en mulig overbelastning av søylen. Fra denne.informasjon er den maksimale kapasitet funnet å være 25 mg/g medium.

I den hensikt å kvalifisere renheten av pH 6,8-oppløsnings-prøven ble like mengder av utvasket lg G fra 49,8 mg-søylen og 65,48 mg-søylen kromatografert på nytt. Like mengder fra disse 6,8-utvaskene (3B og 4B)"ble kromatografert på nytt (3C og 4C).

Resultatene av separeringen fremgår i den følgende tabell 45.

Det kan ses av utvaskningsprofilene for 3B og 4B at 6,8-utvaskningen av 3A var renere enn den fra 4A. I B-seriene gav tilsvarende anvendelser forskjellige forhold av protein i 6,8-vs. 4,O-utvaskningene. Når de rensede lg G-prøver fra B-seriene ble gjenkromatografert var'utvaskningsprofilene nesten helt like.

EKSEMPEL 13

Forberedende skalaimmunoglobuliri G ( Tg G) rensing

En kromatografisk søyle i henhold til den foreliggende oppfinnelse (24 cm høy . 2,5 cm innerdiameter pakket med 33 g av individuelle sorpsjonselementer som beskrevet i eksempel 10) ble balansert som følger:

500 ml vann

200 ml 0,1 M pH 6,8. natriumf osf at

800 ml 0,025 pH 4,0 riatriumacetat med 0,5 M natriumklorid

500 ml 0,1 M pH 6,8 natriumfosfat

1500 ml 0,05 M pH 6,8 natriumfosfat

Ekvilibreringen ble utført ved 10 ml pr. minutt. Tomromsvolumet i søylen var tilnærmet 80 ml.

En lg G prøve som beskrevet i eksempel 12 ble dialysert

mot 0>05 M pH 6,8 natriumfosfat før den ble tilført søylen. Etter dialysen hadde en 1 : 100 oppløsning en 0 D 280 - 0,258

som tilsvarer 19,1 mg/ml (OD lg G," 1 mg/ml = 1,35) 43 ml (821,3 mg) av lg G oppløsningen ble ført gjennom søylen.. Utvask-ning ble utført med 0,05 M pH 6,8 natriumfosfat fulgt av 0,025

M pH 4,0 natriumacetat med 0,5 M natriumklorid. Strømningshastig-heten var 4 ml/min. Resultatene av separeringen fremgår nedenfor og utvaskningskarakteristikkene av 6,8 og 4,0 gjenvinningene er grafisk angitt på fig. 12.

Prøve - 821,3 mg

6,8 gjenvinning - 535,28 mg

4,0 gjenvinning - 179,51 mg

Total gjenvinning - 724,43 mg

% total gjenvinning - 88,48%

% av total i 6,8 - 73,68%

6,8/4,0 - 2,98

EKSEMPEL 14

For å sammenligne en søyle inneholdende den faste, stasjonære fase i henhold til den foreliggende oppfinnelse med visse kjente søyler, spesielt av den art som er omtalt i US patentskrift 3 455. 818 til Leifield og US patentskrift 3 856 681 til Huber, som foreslår bruken av en flerhet av ark av kromatografisk medium arrangert ved siden av hverandre med en tykkelsesdimensjon av lagene som strekker seg hovedsakelig vinkelrett på den primære fluidumstrømningsadgangen, ble der konstruert en "kvadratisk" molekylsepareringssøyle. Denne søyle besto av et trau med bredde 25 mm, dybde 25 mm og lengde 259 mm. Der ble skaffet et deksel som ble fastboltet til trauet med en "0"-ring for avtetting av skjøten. Der ble boret et 0,6 cm hull i midten av endene for innløp og utløp av den mobile fase. En 0,16 cm tykke, 25 mm kvadratisk fritte av rustfritt stål og 2 mikrometer porøsitet fordelte oppløsningsmidlét ved begge ender.

Søylen ble pakket med ark bestående av 24% uraffinert masse, 6% av -250 høyraffinert masse og 70% Syloid 620. Materialet ble filtet i 30.. 50 runde ark. For den vertikale pakking (kjent teknikk) ble der avskåret 6 - 8 25 . 250 mm strimler.

Disse ble deretter plassert i søylen og dekslet boltet fast. Mediumet ble deretter testet for molekylsepareringsevne. For

den horisontale pakking, dvs. den hovedsakelig homogene, faste, stasjonære fase ifølge den foreliggende oppfinnelse ble den samme fremgangsmåte fulgt under bruk av 25 . 25 mm kvadrater stablet horisontalt langs trauet. Både de horisontale strimler (oppfinnelsen) og de vertikale strimler (kjent teknikk) ble testet dob-belt under bruk av en væskekromatograf av typen Varian modell 5000. Ved en tilleggstest ble både den vertikale og horisontale pakking utført som før og deretter ble en ytterligere pute eller strimmel, tilføyet under høyt trykk for å sikre en høy pakkeden-sitet i søylen.

Der ble evaluert prøver som inneholdt: 1) benzen, 2) beta-naftol, 3) paranitrofenol, 4) benzoesyre og 5) dimetylftalat.

Den mobile fase var heksan. De ultrafiolette detektorer som ble benyttet ble innstilt på 2 54 nanometer.

Disse forsøk viste at den horisontale pakking av oppfinnelsen gir ca. en 8-foldig økning av søyleeffektiviteten og meget skarpere toppformer, noe som viser meget bedre kromatografiydelse enn de vertikale strimler (kjent teknikk). Dette til tross for det forhold at søylen var konstruert og strømmen geometrisk opti-malisert spesielt for de vertikale strimler (kjent teknikk). Generelt viste alle kromatogrammene fra innsprøytningen av de oven-for oppramsede prøver meget "brede" toppformer og meget "dårlige" rester ("tailing") for den vertikale pakking (kjent teknikk) sammenlignet med den horisontale pakking (oppfinnelsen).

Forskjellige endringer og modifikasjoner kan utføres i forbindelse med fremgangsmåten og produktene i henhold til den - foreliggende oppfinnelse uten å avvike fra oppfinnelsens ide og ramme. De forskjellige utførelsesformer er blitt beskrevet her bare i

den hensikt å anskueliggjøre oppfinnelsen ytterligere, og er ikke ment som en begrensning av denne.

Claims (51)

1. En fast, stasjonær fase for en molekylsepareringssøyle omfattende en porøs matrise av fibre med partikkelstoff immobilisert deri, idet minst en av fibrene eller partikkelstoffet er effektivt for molekylseparering og den porøse matrise er hovedsakelig homogen med hensyn til hver av sine komponenter.

2. Faststoffase som angitt i krav 1, karakterisert ved at partikkelstoffet er effektivt for molekyl-separering.

3. Faststoffase som angitt i krav 2, karakterisert ved at fibrene er cellulose.

4. Faststoffase som angitt i krav 3, karakterisert ved at matrisen omfatter en hovedmengde av lange, selvbindende, strukturelle fibre og en mindre mengde av raffinerte massefibre hvis Canadian Standard Freeness ligger i området +100 - -600 ml.

5. Faststoffase som angitt i krav 4, karakterisert ved at forholdet mellom strukturell fiber og raffinert massefiber er 2 : 1 - 10.: 1.

6. Faststoffase som angitt i krav 5, karakterisert ved at forholdene er 3:1-5:1.

7. Faststoffase som angitt i krav 1, 2,-3 eller 4, k a-, rakterisert ved at mengden av partikkelstoff i det minste er 10 vektprosent av den stasjonære faststoffase.

8. Faststoffase som angitt i krav 7, karakterisert ved at mengden av partikkelstoff utgjør fra 10 til 80% av den stasjonære faststoffase.

9. Faststoffase som angitt i krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at partikkelstoffet har en gjennomsnittlig partikkelstø rrelse på ca. 5 - 100 mikroner.

10. Faststoffase som angitt i krav 4, karakterisert ved at den strukturelle fiber er cellulose med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml.

11. Faststoffase som angitt i krav 1, 2, 3, 4, 5. eller 6, karakterisert ved at den stasjonære faststoffase omfatter en flerhet av ark.

12. Faststoffase som angitt i krav 11, karakterisert ved at arkene er skiver.

13. Faststoffase som angitt i krav 1, 2, 3 eller 4, omfattende en flerhet av ark av de stasjonære faststoffaseelementer, idet kantene av elementene er i stand til å samvirke med innverveg-gen av separeringssø ylen for med denne å danne en hovedsakelig fluidumtett forsegling, for derved å forhindre eventuell skjev stilling eller forbipassering av fluidum rundt kantene av elementene.

14. Faststoffase som angitt i krav 13, karakterisert ved at den stasjonære faststoffase er hydrofilt svellbart.

15. Faststoffase som angitt i krav 14, karakterisert ved at elementene er i stand til å danne en fluidumtett forsegling med innerveggen av sylinderen ved en med denne vannsvellbar tilpasning.

16. Faststoffase som angitt i krav 15, karakterisert ved at elementene omfatter en flerhet av elementskiver, idet partikkelstoffet har en gjennomsnittlig partikkel-størrelse på fra ca. 5 til 100 mikroner og utgjør ca. 10 - 80 vektprosent av den stasjonære faststoffase,"idet den strukturelle fiber er cellulose med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml, og forholdet mellom strukturell fiber og raffinert massefiber er 3 : 1 - 5 : 1.

17. Faststoffase som angitt i krav 13, karakterisert ved at elementene er i stand til å danne en fluidumtett forsegling med innerveggen av separeringssøylen ved mot denne å danne en kompresjonsfriksjon-tilpasning.

18. En molekylsepareringssøyle for utfø relse av den differensielle distribusjon mellom to faser av de komponenter av en prøve som strømmer derigjennom, idet søylen inneholder en stasjonær faststoffase som er hovedsakelig homogen med hensyn til hver av sine komponenter, og som omfatter en porøs matrise av fiber med et partikkelstoff immobilisert deri, idet minst en av fibrene eller partikkelstof.fet er effektivt for molekylseparering.

19. Molekylsepareringssø yle som angitt i krav 18, karakterisert ved at partikkelstoffet er effektivt for molekylseparering.

20. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 19, karakterisert ved at fibrene er cellulose.

21. , Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 20, karakterisert ved at matrisen omfatter en hovedmengde av lange, selvbindende strukturelle fibre og en mindre mengde av raffinerte massefibre med Canadian Standard Freeness i området ca. +100 til -600 ml.

22. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 21, karakterisert ved at forholdet mellom strukturell fiber og raffinerte massefibre er 2 : 1 til 10 : 1.

23. Molekylsepareringssø yle som angitt i krav 22, karakterisert ved at forholdene er 3 : 1 til 5:1.

24. Molekylsepareringssø yle som angitt i krav 18, 19, 20, 21, 22 og 23, karakterisert ved at mengden av partikkelstoff utgjør minst 10 vektprosent av den stasjonære faststoffase.

25. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 24, karakterisert ved at mengden av partikkelstoff utgjør fra 10 - 80 vektprosent av den stasjonære faststoffase.

26. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 18, 19, 20, 21, 22 og 23, karakterisert ved at partikkelstoffet har en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på ca. 5 - 100 mikroner.

27. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav. 21, karakterisert ved at de strukturelle fibre er cellulose med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml.

28. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 18, 19, 20, 21, 22 og 23, karakterisert ved at den stasjonære faststoffase omfatter en flerhet av ark.

29. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 28, karakterisert ved at søylen er sylindrisk og at arkene er skiver.

30. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 18, 19, 20, eller 21 omfattende en hul sylinder pakket med en flerhet av ark av nevnte stasjonære faststoffaseelementer, idet kantene av elementene samvirker med innerveggen av sylinderen for med denne å danne en hovedsakelig fluidumtett forsegling som hindrer eventuelle merkbare skråstillinger eller forbipassering av fluidum rundt' elementenes kanter.

31. Molekylsepareringssø yle som angitt i krav 30, karakterisert ved at den stasjonære faststoffase er hydrofilt svellbar.

32. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 31, karakterisert ved at elementene danner en fluidumtett forsegling med innerveggen av sylinderen ved hjelp av en svellbar tilpasning til veggen.

33. Molekylsepareringssø yle som angitt i krav 32, karakterisert ved at elementene omfatter en flerhet av elementskiver, idet partikkelstoffet har en gjennomsnittlig par-tikkelstørrelse fra ca. 5 til 100 mikroner og: utgjør ca.. 10 til 80 vektprosent av nevnte, stasjonære faststoffase samtidig som den strukturelle fiber er cellulose med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml og forholdet mellom de strukturelle fibre og raffinerte massefibre er 3:1-5:1.

34. Molekylsepareringssøyle som angitt i krav 30, karakterisert ved at elementene danner en fluidumtett forsegling med innerveggen av sylinderen ved hjelp av en kompre-sjonsfriksjons-tilpasning med veggen.

35. Ved en fremgangsmåte for utførelse av en molekylseparering ved å utføre en differensiell distribusjon av en prøves komponent mellom to faser, idet der føres en mobil fase gjennom en molekyl-separeringssøyle inneholdende en stasjonær faststoffase kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter å bruke som den stasjonære faststoffase en porøs matrise av fiber med deri anordnet immobilisert partikkelstoff, idet minst en av fibrene eller partikkelstoffet er effektiv for molekylseparering, samtidig som den stasjonære faststoffase er hovedsakelig homogen med hensyn til hver av sine enkeltkomponenter.

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, karakterisert ved at partikkelstoffet er effektivt for molekyl-separering .

37. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, karakterisert ved at den mobile fase er væske.

38. Fremgangsmåte som angitt i krav 36, karakterisert ved at fibrene er cellulose.

39. Fremgangsmåte som angitt i krav 38, hvor matrisen omfatter en hoveddel av lange,.selvbindende strukturelle fibre og en mindre mengde av raffinerte massefibre hvis Canadian Standard Freeness ligger i området fra ca. +100 til -600 ml.

40. Fremgangsmåte som angitt i krav 39, karakterisert ved at forholdet mellom strukturelle fibre og raffinerte massefibre er 2 : 1 til 10 : 1.

41. Fremgangsmåte som angitt i krav 40, karakterisert ved at forholdet er 3 : 1 til 5:1.

42. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, 36, 37, 38 eller 39, karakterisert ved at mengden av partikkelstoff er minst 10% av den stasjonære faststoffase.

43. Fremgangsmåte som angitt i krav 42, karakterisert ved at mengden av partikkelstoff utgjør fra 10 til 80 vektprosent av den stasjonære faststoffase.

44. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, 36, 37, 38 eller 39, karakterisert ved at partikkelstoffet har en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på ca. 5 - 100 mikroner.

45. Fremgangsmåte som angitt i krav 39, karakterisert ved at de strukturelle fibre er cellulose med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml.

46. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, 36, 37, 38, 39, 40 eller 41, karakterisert ved at den stasjonære faststoffase omfatter en flerhet av ark.

47. Fremgangsmåte som angitt i krav 46, karakterisert ved at sø ylen er sylindrisk og at arkene er skiver.

48. Fremgangsmåte som angitt i krav 35, 36, 37, 38 eller 39, omfattende en hul sylinder pakket med en flerhet av ark av stasjonære faststoffaseelementér, idet kantene av elementene samvirker med innerveggen av sylinderen for å danne en hovedsakelig fluidumtett forsegling med veggen for å forhindre eventuelle merkbare skjevheter eller forbipassering av fluidum rundt elementenes kanter.

49. Fremgangsmåte som angitt i krav 48, karakterisert ved at den stasjonære faststoffase er hydrofilt svellbar.

50. Fremgangsmåte som angitt i krav 49, karakterisert ved at elementene danner en fluidumtett forsegling med innerveggen av sylinderen ved hjelp av en vannsvellbar tilpasning til veggen.

51. Fremgangsmåte som angitt i krav 50, karakterisert ved at elementene omfatter en flerhet av elementskiver, idet partikkelstoffet har en gjennomsnittlig partikkel-størrelse fra ca. 5 - 100 mikroner, og utgjør ca. 10 - 80 vektprosent av den stasjonære faststoffase, samtidig som de strukturelle fibre er cellulose med en Canadian Standard Freeness på +400 til +800 ml og forholdet mellom de strukturelle fibre og raffinerte massefibre er 3 : 1 - 5 : 1.