NO803910L - Fremgangsmaate for immunologisk paavisning av kreft i vev hos mennesker. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nucleoære antigener som finnes i en rekke typer av kreft hos mennesker, men som ikke finnes i de tilsvarende friske vev, samt antistoffer og antisera som er spesifikke overfor disse nucleoære antigener for diagnostiske formål.

Tidligere undersøkelser i eksperimentdyr har vist et nærvær av nucleære og nucleoære antigener i svulster som ikke finnes i friskt vev (R.K. Busch et al, Cancer Res. 34,; 2362, 1974,' Yeoman et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 73,; 3258, 1976; Busch og Busch, Tumori 62. 347, 1977;

Davis et al, Cancer Res. 3_8, 1906, 1978; Marashi et al, Cancer Res. _39, 59, 1979) . I tidligere undersøkelser av foreliggende søkere ble antistoffer fremstilt for nucleoli hos normale og neoplastiske celler hos rotter ved immuni-sering av kaniner (R.K. Busch et al, supra; Busch og Busch, supra; Davis et al, supra). Klar nucleolær fluorescens ble påvist i de aceton-fikserende cellene ved hjelp av en indirekte immunofluorescens. Man fant at de immunopresipitinbånd i Ouchterlony-gel som var dannet med antisera til en Novikoff-hepatoma nucleolære antigener som var ekstrahert fra rotte-Novikoff-hepatoma nucleoli skilte seg fra de:tilsvarende immunopresipitinbånd man fikk med lever-nucleolære antigener og antilever-nucleolære antisera (Busch og Busch, supra).

Ytterligere spesifitet ble påvist når anti-svulst nucleolære antisera absorbert med lever-nucleære ekstrakter ga positiv nucleolær fluorescens i Novikoff-hepatoma-ascitesceller, men ikke i lever-celler. Tilsvarende så ga lever-nucleolære antisera absorbert med svulst-nucleolære ekstrakter ingen påvisbar svulst-nucleolær fluorescens, men ga positiv fluorescens i levende nucleoli (dvis et al, supra).

Ettersom immunofluorescens-analysen indikerte at I de forskjeller man kunne observere i de aceton-fikserte svulst-utstrykningene og i normale rottecelleutstrykninger (spesielt etter absorpsjon av antisera med normale lever-nuclei og nucleoli), så ble det gjort forsøk på å bruke disse antisera for rotte-svulst-nucleolære antigener ved prøving av tilsvarende vevsprøver.som var avledet fra svulster hos mennesker. Undersøkelser med antistoffer tii smågnagersvulst-nucleoli viste at den positive immunofluorescens man der hadde ikke kunne finnes i svulst-nucleoli fra mennesker. På grunn av dette begynte man så med en ny serie eksperimenter for å finne humane nucleolære antigener. Positiv immunofluorescens ble så funnet i humane svulstvev med antisera og antistoffer til disse nye humane svulst-nucleolære preparatene. I disse undersøkelsene ble antistoffene absorbert med placentale nucleære soni-kater så vel' som med kalvefosterserum (Busch et al, 39, 3024, 1979; Davis et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 16, 892, 1979; Smetana et al, Life Sei. 25, 227, 1979).

Foreliggende oppfinnelse er et resultat av undersøkelser som var utformet slik at man kunne bruke disse nye humane nucleolære antigener for påvisning av en rekke humane neoplasmaer.

Den følgende tabell I gir en oversikt over de svulster hos mennesker hos man fant en klar nucleolær immunofluorescens med antistoffene til humane svulst-nucleoli. Disse undersøkelser viste overraskende og uventet at mange humane svulster inneholder felles nucleolære antigener som viser en positiv immunofluorescens med antisera eller immnoglobulinfraksjoner av slike antisera-(Busch et,al, supra).

I friskt vev og i godartede svulster og i inflammatoriske tilstander fikk man generelt negative resultater slik dette er angitt i den følgende tabell II (Busch et al, supra).

Disse resultater som opprinnelig ble oppnådd

ved immunofluorescens, er siden blitt bekreftet og utvidet ved hjelp av immunoperoksydase metoder.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende og uventede oppdagelse at vanlige nucleolære antigener finnes i en rekke typer av kreftceller hos mennesker, men finnes ikke i normale celler. Disse antigener er proteiner som kan ha en genekontroll eller andre funksjoner og som alltid er vedvarende under mitosen i en perikromoso-mal posisjon. Viktige aspekter av oppfinnelsen er oppdagel-sen av vanlige nucleolære antigener som finnes i humane cancerceller, isolasjon og rensing av disse antigener, samt fremstilling av antisera og antistoffer som er spesifikke for disse antigener samt diagnostiske metoder hvor man bruker antisera og antistoffer som er spesifikke til disse antigener for å påvise humane cancerceller, samt et diagnostisk utstyr som enten inneholder antistoffer eller antisera eller begge og hvor disse er spesifikke for disse nucleolære antigener.

Disse antigener har vært påvist i en rekke for skjellige typer av kreft hos mennesker, såsom kreft i det sentrale nervesystem, i tarmkanalen, i urinveien, i lunger,

i huden, i bloddannende vev og i endokrine og eksokrine kjertler. Således innbefatter ondartede humane celler HeLa-celler, prostata-carcinom, andre typer carcinom,

sarcom og hematologisk neoplasma. Disse antigener kan ekstraheres fra nuclei eller nucleoli i humane ondartede celler. Nevnte antigener er ikke påvist i tilsvarende friskt vev. I diagnostiske fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse for å påvise ondartede celler, har man funnet ca. 1% falske negative og 3% falske positive utslag. De falske negative utslag representerer nekrotisk svulstvev eller ikke-reaktive svulster av ukjent opprinnelse. De falske positive utslag representerer to tilfeller av "preneoplastisk vev" og svake positive utslag opptrådte

av og til i de fokale områder i såkalt "hyperplastisk vev". To fokale, positive områder ble identifisert som "preneo-plastiske områder" eller fokal neoplastisk transformasjon i inflammatorisk vev i tarmkanalen.

Antigenene består av et hovedantigen og minst et og muligens flere mindre antigener. Selve hovedantigenet fra humane cancerceller har (a) et diskret isoelektrisk punkt fra 6,0 til 6,7 og ca. 6,3 slik dette kunne bestemmes ved isoelektrisk fokusering, pH 3-10, polyakrylamid-gel; (b) har en omtrentlig molekylvekt på fra 50.000-6 0.000 dalton slik dette kunne bestemmes ved todimensjonal gel-elektro-forese med en SDS (natriumdodecylsulfat) annen dimensjon;

(c) er delvis sterkt bundet til nucleær og nucleolær RNP

og er delvis oppløselig i 0,01 molar tris-HCl, pH 8; (d) er både nucleolær og ekstranucleolær, men forblir "intranucleær" eller kromosomforbundet under celledeling.

Den annen type antigen som har vært påvist har en:pl på ca. 6,0 (påvist ved samme fremgangsmåte som for-klart ovenfor) og dets molekylvekt er også fra 50.000-60.000 dalton. Det er mulig at denne andre typen representerer et modifisert produkt av den førstnevnte type, men det er ikke bestemt hvorvidt de er strukturelt nærstående. Den sist- nevnte type av antigen forekommer i relativt mindre konsentrasjoner enn det førstnevnte.

Antigenene ér også tilstede i nucleolært ribo-nucleoprotein (RNP) partikler som er fremstilt ved ultra-sentrifugering av Tris-ekstraktene, slik dette er beskrevet i det etterfølgende. Det antigen som er tilstede i disse partikler er sterkere bundet til proteiner og ribonuclein-syre (RNA) enn antigenet i den Tris-oppløselige fraksjonen. Det er ikke helt klart hvorvidt antigenene i RNP-partiklene er:identiske med de som forefinnes i væsken, men deres iso-elektriske punkt er det samme og de absorberer antistoffer til antigenene. Ved hjelp av immun-lys mikroskopi kunne man også i kreftceller påvise nucleolære antigener som var tilstede i fibriller, antagelig fra det nucleolære ribonucleo-protein-nettverket. Dette nettverk er ekstranucleolære strukturer som kan representere elementer hvorfra nevnte RNP-partikler oppstår.

Det gjenstår å bestemme hvorvidt antigener representerer et stoff som er tilstede i høyere konsentrasjoner i kreftceller og i lavere konsentrasjoner i friskt vev eller er fosterantigener slik det tidligere ble funnet i sammenlignende studier over nucleære antigener i rotte-Novikoff-hepatoma og i normale rotte-leverceller (Yeoman

et al, 1976).

Alle de trinn som ble utført for å oppnå og analysere prøver av vev fra mennesker, blod og serum fra svulster og annet vev i pasienter hvor man hadde mistanke om kreft, var anbefalt av the Human Research Committee ved Baylor College of Medicine, Houston, Texas og tilknyttede hospitaler. Snitt av humane svulster ble oppnådd fra frosne snitt tatt ut ved kirurgi, biopsi eller konservert i sterk kulde, og man fikk dem i alt vesentlig fra the Department of Pathology fra Houston Veterans Administration Medical Center, men også fra The Michigan Cancer Foundation

i Detroit, Michigan samt the Department of Interhal Medicine, Charles University i Praha, Tsjekkoslovakia. Disse snitt

ble analysert for et nærvær av nucleolære antigener ved indirekte immunofluorescens og immunoperoksydaseteknikk.

Rensning av antigener ble utført ved en ekstraksjon av nuclei eller nucleoli med 10 mmol Tris HCl/0,1 mmol PMSF/pH 8 seks ganger i et forhold på 20 volumer til 1 volum nuclei eller nucleoli. Ekstraktene ble først sentrifugert ved 27.000 x g i 10 minutter og så ved 100.000 x g i 16 timer. Ammoniumsulfat ved 4 0% metning ble brukt for å fjerne for-urensningen. 40-100% ammoniumsulfatfraksjonen ble oppsamlet ved sentrifugering og dialysert mot 20 mmol Tris HCl/pH 7,6. Antigenet ble kromatografert på DE-52 cellulosekolonner

(lx 10 cm). Antigenene ble eluert med 0,15 molar NaCl/0,1 mmol PMSF/pH 7,6-fraksjonen. Isoelektrisk fokuserings-geler ble brukt for å identifisere og rense antigenene. Disse inneholdt 4% akrylamid/8M urea/2% amfoliner (pH 3,5-10). Antigenene med pl 6,3 og 6,0 henholdsvis ble så skåret ut

av gelene. På SDS (natriumdodecylsulfat)-gelene, fant man et hovedpunkt for hver av disse antigenene.

HeLa-cellenuclei eller -nucleoli ble fremstilt ved å oppsamle HeLa-celler fra Spinner-kulturkolber (7-8 liter). Cellene bør være i en logfase 7-8 x 10 5 celler/ml. Cellene ble sentrifugert ved 800 x g i 8 minutter til celle-pellets. Disse ble så suspendert i (PBS) fosfatbufferet saltoppløsning (0,15 molar NaCl, 0,01 molar fosfat, pH 7,2) ved forsiktig homogenisering med en myk Teflon-stav og sentrifugert ved 800 x g i 8 minutter. Cellene ble så

vasket en gang til med PBS og celle-pellets ble veiet. De ble så suspendert ved forsiktig homogenisering i 20 volumer av ,en reticulocytt-standardbuffer (RSB) ved pH 7,4 og ble så hensatt for svelling i 30 minutter på is. Cellene ble så sentrifugert ved 1000 x g i 8 minutter og resuspendert ved forsiktig homogenisering i nevnte RSB-buffer pluss 1/20 volum av vaskemidlet Nonidet P40 (10% i RSB). Det endelige volum av Nonidet var 0,5%. Cellene ble homogenisert med en Dounce-homogenisator med fra 20-60 strøk inntil alle cellene var brutt opp og nuclei var frigjort og fritt for cytoplasma. Cellene ble så sentrifugert 1000 x g i 8 minutter, resuspendert med forsiktig homogenisering i 0,88 molar! sucrose, 0,5 mmol Mg-acetat (20 x vekt-volum) og sentrifugert ved 1500 x g i 20 minutter. Den resulterende pellets

som inneholdt nevnte HeLa-nuclei ble så brukt for å frem-stille antigenekstraktene slik dette er beskrevet nedenfor. Nuclei fra andre humane ondartede celler ble fremstilt på samme måte.

For isolasjon av nucleoli ble nevnte nucleære pellets fremstilt som beskrevet ovenfor, suspendert ved forsiktig homogenisering i 0,34 molar sucrose, 0,5 mmol Mg-acetat, idet man brukte 2 ml sucrose for hvert gram opprinnelig celler. Nevnte nuclei ble lydbehandlet (med et■Branson-ultralydapparat) ved 10 sekunders perioder (og 10 sekunders hvile). Total tid var mellom 60 og 110 sekun-der. De frigjorte nucleoli ble fulgt ved mikroskopiske undersøkelser. For å gjøre nevnte nucleoli synlige, ble de farget med Azur C (denne oppløsningen inneholder 1% Azure C i 0,25 molar sucrose). Etter lydbehandlingsperioden skulle preparatet være fritt for nuclei. Den ultralyd-behandlede fraksjonen ble underlagt tre ganger med et volum av 0,88 molar sucrose (uten magnesiumacetat) og sentrifugert 1500 x g i 20 minutter. Den resulterende pellet inneholdt HeLa-nucleoli som kan brukes som immunogenet.

Man oppnådde tilfredsstillende rensning ved å bruke den ovennevnte fremgangsmåte (Busch og Smetana, 1970)., og lysmikroskopi viste at disse preparaters kvalitet i alt vesentlig var tilfredsstillende. En elektronmikroskopisk analyse indikerte imidlertid at det var et nærvær av kromatin og nucleære forurensninger. Hovedproblemet i en rensning av disse preparater er den begrensede mengde man har av opprinnelige HeLa-celler i kulturen, og dette begrenser det antall rensningstrinn man kan anvende. Nucleoli fremstilt fra HeLa-cellepreparater hvis vekt varierte mellom 5 og 10 g mer enn de h til 1 g mengder man brukte i tidligere forsøk, ga tilstrekkelig materiale for en tilfredsstillende rensning. Dyrkningsbetingelsene for HeLa-cellene og;isolasjon av de placentale nuclei var i alt vesentlig de samme som har vært angitt tidligere (Davis et al, 1979).

HeLa Tris-ekstrakt ble fremstilt ved å suspen-dere nevnte HeLa-nuclei i NaCl-EDTA-buffer 10 x vekt/volum, 1 g nuclei/10 ml buffer. (Buffer: 0,075 molar NaCl, 0,025 molar Na EDTA/pH 8, 1 mmol PMSF). Nevnte fenylmetylsulfo-nylfluorid (PMSF) ble fremstilt i en 100 mmol konsentrasjon i isopropylalkohol. Denne ble så tilsatt hver oppløsning før ekstraksjonen. Suspensjonen ble homogenisert med en Dounce-homogenisator med 20 støt og så sentrifugert ved 3000 x g i 5 minutter. Væsken over bunnfallet ble oppsamlet. De ^ovennevnte ekstraksjoner ble gjentatt på den nucleære pellet to ganger til. NaCl-EDTA-ekstraktet ble ikke brukt i det foreliggende antigen-arbeid, og ble følgelig kastet. Den nucleære pellet ble suspendert i 10 x vekt/volum ved 0,01 molar Tris-HCl, pH 8, 1 mmol PMSF og homogenisert igjen i nevnte Dounce-homogenisator med 20 støt, skjønt 0,01 molar Tris-HCl, pH 7-9 er tilfredsstillende. Væsken ble oppsamlet og hensatt på is. Under Tris-ekstraksjonen ble kjernene brutt ned og kromatin ble frigjort. Kjerne-nedbrytningen ble fulgt ved hjelp av mikroskopisk under-søkelse. Nevnte pellet ble resuspendert i Tris-bufferen og nuclei ble hensatt for svelling i 15 minutter på is.

De ble så igjen homogenisert med 20 støt og sentrifugert ved 12.000 x g i 10 minutter. Væsken over bunnfallet ble oppsamlet. Nevnte pellet ble resuspendert og hadde et hvitt voluminøst utseende. Den ble igjen homogenisert med 20 støt og sentrifugert ved 27.000 x g i 30 minutter. Væsken over cellene ble oppsamlet og slått sammen med tidligere væsker fra Tris-ekstraktene.

Tris-ekstraktene ble så konsentrert med en Amicon UM-10 eller PM-10 Diaflo-membran. Vanligvis var volumet ved begynnelsen ca. 5 0 ml og dette ble konsentrert til 4-5 ml. Den endelige konsentrasjonen av protein var rundt 4-5 mg/ml. Kaninen kan immuniseres med dette Tris-ekstrakt.

Ved å bruke ovennevnte fremgangsmåte fremstilte man også ekstrakter fra HeLa-nucleoli eller fra nuclei eller nucleoli fra andre ondartede humane celler.

For Tris-immunogenet ble 250 yl Tris-ekstrakt (4-5 mg/ml) fremstilt som ovenfor fortynnet med 250 yl PBS. Dette ble så blandet med Freunds fortynningsmiddel slik dette er beskrevet nedenfor for det nucleolære immunogen.

Antistoffer ble fremstilt ved å immunisere kaniner med HeLa-celle-nucleolære preparater på følgende måte: nevnte HeLa nucleoli ble veiet (20-30 mg, våtvekt) og;suspendert jevnt i 0,5 ml 0,01 molar fosfatbufferet saltoppløsning, pH 7,2. De ble så blandet med 0,6 ml av Freunds fortynningsmiddel (GIBCO) på følgende måte: De suspenderte nucleoli ble plassert i en 5 ml sprøyte og Freunds fortynningsmiddel i en annen. Til hver sprøyte festet man en nål på 18 gauge hvis spiss var fjernet. Nålene ble så forbundet ved hjelp av et stykke av et poly-etylenrør, I.D. 0,047 (Clay-Adams). Innholdet av sprøytene ble så blandet inntil preparatet ble fortykket og var van-skelig å presse gjennom røret.

Kaninene ble barbert på ryggen og injisert intradermalt på 6 steder med 0,1 ml/sted. Den gjenværende 0,4-0,5 ml ble injisert, halvt subkutinøst (under den løse huden på øvre del av ryggen) og halv intramuskulært (i lårmuskelen). Injeksjonene ble gitt en gang i uken i tre uker med lignende mengder nucleoli hver gang. Den første blodtapping ble utført 7-10 døgn etter tredje uke av immuniseringen. En kaninørekopp (Bellco) og en vakuumpumpe ble brukt for å oppsamle blodet. Blodet (ca. 45-50 ml) ble hensatt for koagulering i 3-4 timer ved romtemperatur. Serum-delen ble så tatt ut og sentrifugert ved 1000 g i 30 minutter (disse sedimentene er frie for røde blodceller). Det klare serum ble oppsamlet og ble så absorbert (eller holdt frosset inntil det skulle absorberes). Selve det koagulerte blodet kan avkjøles over natten, og man vil da få frigjort et par ytterligere ml serum. Serumet fra hver blodtapping ble undersøkt for nærvær av nucleolære antistoffer ved en indirekte immunofluorescensmetode.

Andre ikke-humane verter (f.eks. geit, sau, hest, kylling etc.) kan immuniseres med ondartede humane celle-nucleoli-preparater for å fremkalle antisera eller antistoffer til de nucleolære antigener ifølge foreliggende oppfinnelse. Antisera kan også fremstilles ved å immunisere ikke-humane vertsdyr med ekstrakter (f.eks. tris-ekstrakt) av ondartede humane celle-nuclei eller -nucleoli.

Absorpsjon av antinucleolært antiserum ble ut-ført ved først å absorbere kanin antiserumet med 20% normalt, humant serum og 20% kalvefosterserum (GIBCO). 20% normalt, humant serum ble tilsatt kanin-antiserumet (4 ml/ 20 !ml) og inkubert i en time i et rietevannbad ved 37°C. Kolben ble tatt ut og 20% kalvefosterserum (4,8 ml/24 ml) ble tilsatt, og inkubering ble igjen utført en time i et ristebad ved 37°C. Kolben ble tatt og inkubert en time ved romtemperatur ved forsiktig røring hvert 15. minutt. Den ble så sentrifugert ved 15.000 x g i 30 minutter, og den overliggende væsken (absorbert serum) ble fjernet og spart. Det absorberte serum ble omdannet til immunoglo-bulinet (lg) ved å bruke den fremgangsmåte som er gitt for (NH^)ellingen av serum som er beskrevet i detietter-følgende.

Ig-preparatet fra det nucleolære antiserum og som var absorbert med normalt humant serum og kalvefosterserum ble nå absorbert med et normalt humant vev (placenta eller lever). Med et tilsvarende volum placentalt nucleært sonikat i PBS 7,2 (10-15 mg protein/ml) ble tilsatt det absorberte nucleolære immunoglobulin (10 ml lg pluss 10 ml nucleært sonikat) og inkubert en time ved 37°C i et riste-vannbad. Det ble så inkubert ytterligere en time ved romtemperatur ved forsiktig blanding av flaskens innhold hvert kvarter og så sentrifugert ved 15.000 x g i 30 minutter. Den overliggende væske ble oppsamlet og det absorberte lg ble gjenutfelt med (NH^^SO^ som beskrevet. Dette lg kan brukes som det endelige antistoffprodukt eller kan ytterligere renses ved dietylaminoetyl (DEAE) cellulose-kromatografi på følgende måte: Nevnte lg som befant seg i 0,01 molar fosfatbufferet saltoppløsning pH 7,2, ble dialysert mot 0,0175 molar fosfatbuffer pH 6,3 (uten saltoppløsning). Etter dialyse ble det sentrifugert ved 2500 x g i 20 minutter. Den overliggende væske ble tilsatt DEAE-kolonnen (20 mg protein pr. gram cellulose, Whatman DE52). IgG ble eluert fra kolonnen med 0,0175 molar fosfatbuffer. Etter eluering ble IgG-fraksjonen dialysert mot 0,01 molar fosfatbufferet saltoppløsning med pH 7,2.

Man brukte den samme fremgangsmåten for kon-trollserumet som besto av preimmunt serum som var oppnådd ved å tappe blod fra kaninen (eller et annet ikke-humant vertsdyr) før immuniseringen startet.

Kaninimmunoglobulin lg ble fremstilt på følgende måte: en mettet (NH^)2SO^-oppløsning (760 g/liter) ble fremstilt og et tilsvarende volum av en kald (NH^^SO^ble tilsatt dråpe for dråpe til antiserumet med røring.

Det dannet seg et hvitt bunnfall, og dette ble hensatt for sammenløping i 1% til 2 timer på en magnetisk rører i kulen. Det utfelte antiserum ble så sentrifugert ved 3000 x g i 20 minutter. Den overliggende væske ble fjernet og nevnte pellet ble resuspendert i PBS, pH 7,2 (ca. halvparten av volumet av det opprinnelige serum). Den oppløste pellet ble plassert i en dialysepose og dialysert mot 100 volumer PBS over natten i kulden med magnetisk røring. Dialyseposen ble så plassert i frisk PBS (100 x volumet) den etterfølg-ende morgen og dialysen ble fortsatt i 6 timer. Immuno-globulinet ble forsiktig tatt ut av dialyseposen og sentrifugert ved 2500 x gi 20 minutter. Den overliggende væske ble oppsamlet.

Den fremgangsmåte som er beskrevet tidligere

(RK Busch et al, 1974; Hilgers et al, 1972) for immunofluorescens ble brukt i denne undersøkelse på følgende måte: 150 yl antinucleolært antiserum fortynnet 1:50 ble plassert på aceton-fikserte HeLa-celler eller på fikserte vevsprøver (fra Hilgers et al, 1972, RK Busch et al, 1974). Det kan være nødvendig å bruke mer enn 150 1, hvis vevsprøven dek-ker en større del av objektglasset. Fortynningen av antiserum (As) er avhengig av styrken på antistoffet (Ab). Andre fortynninger kan brukes opptil det punkt hvor As og Ab-fortynningen blir for tynne til at man får positiv reaksjon

overfor kjente positive celler (f.eks. HeLa). Preparatglassene ble inkubert i et fuktig kammer i 45-50 minutter

ved 37°C (Det fuktige kammer kan bestå av en større petri-skål som er tilsatt fuktet papir.) Etter inkuberingen. ble antiserumet vasket av ved forsiktig tilsetning av PBS, og objektglassene ble plassert i en holder og vasket i PBS i en:time. PBS ble skiftet tre ganger, dvs. etter 15 minutter, 30 minutter og 45 minutter. Objektglassene ble tatt ut ;av PBS og dyppet i destillert eller deionisert vann ti ganger ved rask oppadgående og nedadgående bevegelser. De ble så tørket med kald luft fra en hårtørker i fra 2-3 minutter, idet man var forsiktig slik at de ikke tørket for sterkt. 15 0 yl fluorescein-merket geit antikanin antiserum (Hyland eller Cappel) fortynnet 1:10 ble så plassert på objektglassene og inkubert i et fuktig kammer i 30-35 minutter ved romtemperatur. Det annet antistoff ble fjernet fra objektglassene ved forsiktig vasking med PBS. Objektglassene ble så vasket i PBS i en time idet man byttet væske tre ganger, dvs. ved 15 minutter, 30 minutter og 45

minutter etter at forsøket begynte, eller etter den første vaskingen etter 15 minutter, kan de plasseres i frisk PBS og hensettes i kjøleskap over natten. Etter den siste vaskingen med PBS ble objektglassene dyppet i deionisert eller destillert vann ti ganger ved raske bevegelser og tørket i kald luft ved hjelp av en hårtørker i fra 2-3 minutter. En oppløsning av glycerol og PBS i et forhold på

1:1 ble tilsatt cellene eller vevsprøven og denne ble så dekket med et dekkglass. Prøven kan oppbevares i flere måneder hvis dekkglasset lukkes med et tetningsmiddel, såsom klar neglelakk, og deretter holdes i et kjøleskap eller kaldere. Objektglasset ble undersøkt ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Nucleolær fluorescens kunne ikke observeres med preimmun immunoglobulin eller preimmuno IgG-fraksjoner. De andre typer immunologisk teknikk som ble brukt, er de samme som ble anvendt under tidligere under-søkelser (Kendall, 1938; Lowry et al, 1951; Dale and Latner, 1969; Laurell, 1972; Wallace et al, 1974; og Marashi et al,

1979). For analyse av nucleolær plassering av den immunofluorescens man kunne observere, ble prøvene tatt ut og inn av!fasekontrastbelysning under fluorescensobserveringen.

Istedenfor å bruke fluorescein-merket geit-antikaninsérum, så kan man bruke en immunoperoksydase-metode. F.eks. kan 150 pl av peroksydase-merket geit-antikanin l:10-eller 1:20-fortynning tilsettes. Lokalisert peroksydase-aktivitet kan påvises ved en rekke redoks-fargesystemer for lys eller elektronmikroskopundersøkelse. Andre enzymer kan også brukes som markør for denne indirekte metode, og peroksydase og andre enzymer kan brukes direkte ved merking med primært antistoff.

Man fremstilte deretter Karnofsky's inkuberings-medium på følgende måte: man veiet ut tilstrekkelig diamino-benzidin (Sigma) og suspenderte dette i 0,05 molar tris-HCl, pH 7,6, slik at konsentrasjonen ble 0,5 mg/ml. Man fremstilte så en hydrogenperoksydoppløsning på 0,02% (i nevnte 0,05 molar Tris-HCl-buffer). Man blandet 0,5 mg/ml DAB og nevnte 0,02% H202^ ^-^ e ^eler'dvs. i et forhold på 1:1 (denne oppløsningen ble friskt fremstilt hver gang den ble brukt og lagret i kulden under bruk). Man tilsatte så fra 200-300 yl DAB og H202~blandingen til objektglasset og inku-berte dette i 30 minutter i et fuktig kammer ved romtemperatur.

Etter inkuberingen ble DAB og H202-blandingen vasket av objektglasset med 0,05 molar Tris-HCl, pH 7,6-buffer som var tilsatt 0,1 molar NaCl. Objektglassene ble så gitt to 10 minutters vasking i 0,05 molar Tris-HCl pH 7,6 0,1 molar NaCl. Endelig opparbeiding av objektglassene er angitt i trinn 11-14 (bortsett fra PBS er blitt byttet ut med Tris.HCl). Det endelig objektglass ble undersøkt ved hjelp av lysmikroskopi.

HeLa-cellepreparater for immunofluorescens ble fremstilt på følgende måte: et lager av fikserte HeLa-celler ble fremstilt ved å fjerne og vaske med PBS, pH 7,2, aktivt voksende celler fra nevnte HeLa-kulturkolbe. Cellene ble suspendert slik at det var minst 1,5 x 10 6 celler/ml. En dråpe av denne HeLa-cellesuspensjonen ble plassert på hver vasket preparatglass (vasket med vaskemiddel, renset med destillert eller deionisert vann og så renset med alkohol, og 'deretter tørket ved hjelp av oppvarmet luft fra en hår-tørker) og spredd svakt utover og hensatt for tørking ved romtemperatur (eller i kulden over natten). De tørre cellene ble fiksert ved å plassere objektglassene ved 4°C

i aceton i 12 minutter. Preparatglassene ble nummerert ved hjelp av en blyant med diamant. Preparatene ble brukt som positive kontroller på immunofluorescens.

Foreliggende undersøkelse bekrefter at nucleolære antigener er tilstede i svulstceller, men ikke er tilstede i friskt vev. De første undersøkelser viste at både i cellekulturer i humane svulster og i prøver som var tatt ut enten ved autopsi eller ved biopsi, så fikk man klar nucleolær fluorescens ved den doble antistoffteknikken (indirekte immunofluorescens), og et tilsvarende resultat lot seg ikke oppnå i en serie tatt fra friskt vev (Davis et al, 1979). I senere undersøkelser ble mer enn 60 ondartede svulster undersøkt, og en rekke typer av vev ble også bedømt. Det er av interesse at dette store utvalg av ondartede svulster av ectodermal, endodermal og mesodermal opprinnelse alle har et nærvær av ett eller flere vanlige nucleolære antigener (tabell I).

Eksempel 1

Normalt vev - I 17 friske vevsprøver fant man ingen nucleolær fluorescens etter inkubering av nevnte antisera og antistoffer med forskjellige fikserte cellepreparater. Det var av spesiell interesse at hverken det Malpighi-anske lag i huden eller cellene i benmargen og heller ikke Lieberkiihns huler ga positiv immunof luorescens med denne fremgangsmåten. Videre var en rekke forskjellige friske vevsprøver som var tatt i nærheten av neoplasmaene, også negative. Videre undersøkte man en gruppe godartede svulster blant annet flere typer av skjoldbruskkjertel-adenom, og disse var også negative.(tabell II).

Eksempel 2

Inflammatoriske lesjoner - For å undersøke hvorvidt en inflammatorisk reaksjon var forbundet med disse antigener, ble det gjort undersøkelser over åtte typer inflammatorisk vev. I de fleste av disse var det ingen påvisbar fluorescens i de celle-nucleoli som ble under-søkt. Imidlertid viste det seg at snitt som ble funnet i ulcerøs colitis og prøver tatt fra magesår hadde en positiv nucleolær fluorescens. Bemerkelsesverdig var det at 2 av 3 snitt av den ulcerøse colitis var negativ, mens en viste en definitiv positiv nucleolær fluorescens. Fra de magesår som ble undersøkt, viste det seg at ett av to snitt hadde positiv nucleolær fluorescens. Disse resultater er spesielt interessante på bakgrunn av at disse typer lesjoner ofte utvikler seg i ondartet retning. Det var av spesiell interesse å undersøke både de fokale positive og negative områder av disse snittene når disse var farget med hema-toksylin og eosin. Det viste seg da at visse områder av disse sårene ikke bare hadde mitotiske dannelse, men også en opphopning av det epiteliske vev. Disse resultatene antyder at disse cellene muligens kunne utgjøre preneopla-stiske lesjoner eller carcinom in situ. Det er mulig at funnet av disse fluorescerende områder kan lette avgjørelser hvorvidt man skal gjøre et kirurgisk inngrep enten dette er lokalt eller gjelder større områder av sårflaten.

Eksempel 3

Artifact - I magesekkens epitel var det et område med fluorescens i hver celle som var ikke-nucleolært av opprinnelse, og dette synes å representere en ikke-spesi-fikk lokalisering av fluorescerende antistoff. I et hulrom i tynntarmen synes det også å opptre et ikke-spesifikt område med antistoff i form av aggregater, og i de fleste tilfeller så fikk man en eliminasjon av disse aggregater når antistoffene ble filtrert gjennom et milliporefilter på 0,45 ym. I en prøve av et brystvev som var negativt for nucleolær fluorescens, så fikk man små ikke-spesifikke immunofluorescerende flekker som var fordelt uten spesiell lokalisering med hensyn til cellemorfologi.Diameterne på disse meget små ikke-spesifikke utfellingene var fra 0,5

til 0,1 ym sammenlignet med de nucleolære diametere i nuclei og nucleoli som varierer fra 4 til 6 ym.

Eksempel 4

Fluorescens under faser av cellesyklusen - Den nucleolære fluorescens var meget lett synlig i interfase-nucleoliene. I metafasen kunne man ikke se noen nucleolær fluorescens i form av distinkte områder, men denne var synlig mellom kromosomene og i forbindelsesområder mellom "kjerne" og cytoplasmaet. Ettersom nucleolen i alt vesentlig forsvinner under metafasen og rRNA-syntesen stopper opp i den sene profasen, så er det ikke overraskende at den nucleolære fluorescensen ikke var synlig som et distinkt område i slike celler (Tan og Lerner, 1972). Dette at man imidlertid fant spor av de immunofluorescerende produkter under hele mitosen synes å antyde at de nucleolære sub-strukturer (mer enn selve de nucleolære produkter) inneholder antigenene som er vedvarende epigenetisk.

Eksempel 5

Negative ondartede svulster - I en serie ondartede svulster fant man negative områder i varierende grad utover hele snittene. Vanligvis var disse korrolert med enten nekrotiske eller bylleaktige deler av neoplasmaer.

I en prøve av en svulst fra hjernen, så var den masse som ikke viste noen positiv fluorescens, rent nekrotisk, og mange leukocytter var tilstede, men det var ingen definert struk-tur. I en adenocarcinom som var utviklet i form av en meta-stase i hjernen, så fikk man ingen positiv fluorescens, og årsaken er ikke klar. Ettersom 61 av 63 undersøkte svulster hadde en positiv nucleolær fluorescens, var 97% av de under-søkte serier positive. Disse undersøkelser er nå blitt utvidet til over 300 cancerprøver fra mennesker såsom kreft i brystet, prostata, lungen og hematologiske svulster med tilsvarende resultater.

Eksempel 6

Merking - Direkte immunokjemiske metoder for påvisning av antistoffene innbefatter merking av det primære antistoff med en eller flere av de følgende grunnstoffer: en:radioisotop for autoradiografi såsom I, I, C eller<3>H, et fluorescerende fargestoff såsom fluorescein eller tetrametylrhodamin for fluorescensmikroskop, et enzym som gir et fluorescerende eller farget produkt for påvisning ved fluorescens eller lysmikroskopi, eller som gir et elektrontett produkt for påvisning ved elektronmikroskopi,

eller et elektrontett molekyl såsom ferritin for direkte synliggjøring i elektronmikroskopet.

Indirekte immunokjemiske metoder innbefatter merking av det annet antistoff eller et annet bindende protein som er spesifikt for det første antistoff med et fluorescerende fargestoff, en elektrontett forbindelse,

et enzym som gir et produkt som lar seg påvise ved lysmikroskopi, eller fluorescens eller elektronmikroskopi eller en radioisotop som lar seg påvise ved autoradiografi.

De indirekte immunokjemiske fremgangsmåter for synliggjøring av antistoffene innbefatter påføring av hybrid-primære eller sekundære antistoffer eller antistoff-fragmenter (F(ab')2) hvor en del av hybridantistoffpreparatet er spesifikt for de nucleolære antigener (hybridprimært antistoff) eller for det primære antistoff (hybrid annet antistoff), og delvis er spesifikt for slik merking, f.eks. av den type som er nevnt i det ovennevnte avsnitt.

Merkede konjugerte og ikke-konjugerte antistoffer kan pakkes separat i fosfatbufferet saltoppløsning (PBS) eller andre bufferede suspenderingsmidler for fordeling som diagnostiske prøver. Egnede suspenderingsmidler innbefatter glycerin, heparin eller sucrose.. Egnede buffere innbefatter barbitalbuffere, morfolinbuffere, M0PS-3-(N-morfolino)propan-sulfonsyre, hepes-N-2-hydroksyetylpiperazin-N-2-etan-sulfon-syre, Tris-karbonat og lignende.

Claims (29)

1. Fremgangsmåte for immunologisk påvisning av kreft i humane vevssnitt, utstrykninger eller exfoliative cytologiske preparater hvor man anvender antistoffer som reagerer med nucleoli i ondartede humane celler eller ekstrakter av nuclei eller nucleoli i slike celler,

   karakterisert ved at man

   kontakter prøvene med nevnte antistoffer, og påviser lokaliseringen av nevnte antistoffer i nevnte nucleoli i ondartede celler, men ikke i friske normale celler.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene reagerer med nucleoli isolert fra en gruppe av ondartede humane celler bestående av HeLa-celler, carcinomer, sacomer og hematologiske neoplasmaer.
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene reagerer med nucleoli isolert fra en gruppe bestående av HeLa-celler eller humane prostata-carcinomceller.
4. 4. ; Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene reagerer med ekstrakter av nuclei eller nucleoli av ondartede humane celler fra gruppen bestående av HeLa-celler, carcinomer, sarcomer og hematologiske neoplasmaer.
5. 5.i Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene reagerer med ekstrakter av nuclei eller nucleoli fra gruppen bestående av HeLa-celler eller humane prostata-carcinomceller.
6. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene reagerer med ekstrakter av'nuclei eller nucleoli av ondartede humane celler oppnådd ved en ekstraksjon med 0,01 molar Tris-HCl ved pH mellom 7 og 9.
7. 7. ; Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene reagerer med ekstrakter av nuclei eller nucleoli fra gruppen bestående av HeLa-celler eller humane prostatacarcinomer oppnådd ved ekstraksjon med 0,01 molar Tris-HCl ved pH 7-9.
8. 8. i Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at lokaliseringen av antistoffet påvises ved en av de direkte eller indirekte immunokjemiske.

   metoder.
9. 9. i Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den immunologiske påvisningen av-kreft ved hjelp av antistoffer ifølge krav 1 innbefatter

   merking av de primære antistoffer med en eller flere av de følgende markører,

   en radioisotop som lar seg påvise ved autoradiografi,

   et fluorescerende fargestoff som lar seg påvise ved hjelp av fluorescensmikroskopi,

   et enzym som produserer et fluorescerende eller farget produkt som lar seg påvise ved fluorescens eller lysmikroskopi,

   et enzym som produserer et elektrontett produkt som lar seg påvise ved elektronmikroskopi og

   et elektrontett molekyl som lar seg påvise ved synliggjøring i direkte elektronmikroskopi.
10. 10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at radioisotopen velges fra gruppen bestående av <125> I, <13> 1I, 14C og 3H.
11. 11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det fluorescerende fargestoffet velges fra gruppen bestående av fluorscein og tetrametylrhodamin.
12. 12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at enzymet som gir et fluorescerende eller farget produkt som lar seg påvise ved fluorescens eller lysmikroskopi, er peroksydase, 8-galactosidase, alkalisk fosfatase eller cytokrom.C.
13. 13^ Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det enzymtette molekylet som lar seg påvise ved direkte elektronmikroskopi-synliggjøring, er ferritin, hemocyanin, viruspartikler eller latex-perler.
14. 14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den immunologiske påvisningen av kreft ved indirekte immunokjemisk påvisning av antistoffene innbefatter at man påfører minst ett merket annet antistoff og et annet bindende protein som er spesifikt for de primære antistoffer og deres modifikasjoner.
15. 15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at markøren velges fra gruppen bestående av fluorescerende fargestoffer, en elektrontett forbindelse,

    samt et enzym som gir et produkt som lar seg påvise ved lys,

    fluorescens eller elektronmikroskopi eller en radioisotop som lar seg påvise ved autoradiografi.
16. 16. Indirekte immunokjemisk fremgangsmåte for synlig-gjøring av antistoffer ifølge krav 1, karakterisert ved at man påfører minst et hybridprimært eller sekundært antistoff eller antistoff-fragmenter (Ffab <1> ^)» hvor en del av hybridantistoffpreparatet er spesifikt for de nucleolære antigener (hybridprimært antistoff) eller for det primære antistoff (hybrid annet antistoff) og delvis er spesifikt for den markør som innbefatter en elektrontett forbindelse for elektronmikroskopisk påvisning, et enzym som gir produkter som lar seg påvise ved lys, fluorescens eller elektronmikroskopi, eller en radioisotop-merket forbindelse som kan påvises ved autoradiografi.
17. 17. Fremgangsmåte for immunologisk påvisning av kreft i humane vevsnitt, utstrykninger og exfoliative cytologiske preparater hvor man anvender modifiserte eller fragmenterte antistoffer som reagerer med nucleoli i ondartede humane celler eller ekstrakter av nuclei eller nucleoli av slike celler, karakterisert ved at man

    kontakter prøvene med nevnte modifiserte eller fragmenterte antistoffer og

    påviser lokaliseringen av de modifiserte antistoffer eller antistoff-fragmenter ved enten lysmikroskopi, fluorescensmikroskopi, elektronmikroskopi og autoradiografi ved minst en direkte eller indirekte immunokjemisk fremgangsmåte, og hvor nevnte lokalisering opptrer i nucleoli fra ond-

    artede humane celler, men ikke i nucleoli fra friske og normale celler.
18. 18; Humane kreftceller som er forbundet med antigener av en hovedtype og mindre undertyper, karakterisert ved at hovedtypen har følgende egenskaper

    en pl ved isoelektrisk fokusering på ca. 6,0 til 6,7 og

    en molekylvekt på mellom 50.000 og 60.000 dal-tons,

    er oppløselig i 0,01 molar Tris-HCl ved pH 8 og er primært lokalisert i nucleoli.
19. 19. Hovedantigengruppen ifølge krav 18, karakterisert ved å .være i alt vesentlig i renset form.
20. 20. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer med spesifitet mot antigener som finnes i nucleoli og nuclei i humane kreftceller, karakterisert ved at man

    immuniserer ikke-humane vertsdyr med antigener ifølge krav 18 og

    innhøster antistoffene fra de immuniserte dyrene.
21. 21. Fremgangsmåte for fremstilling av antistoffer med spesifitet mot antigener som finnes i nucleoli i humane kreftceller, karakterisert ved at man

    immuniserer ikke-humane vertsdyr med antigenene ifølge krav 26 og

    innhøster antistoffene fra de immuniserte dyr.
22. 22. Fremgangsmåte for fremstilling og isolering av nuclelære antigener, karakterisert ved at man ekstraherer antigenene fra nevnte nuclei eller nucleoli fra humane cancerceller med 0,01 molar Tris-HCl pH 7-9.
23. 23. Nucleært preparat, karakterisert ved å innbefatte Tris-HCl-ekstrakter av nuclei eller nucleoli fra humane kreftceller.
24. 24. Fremgangsmåte for rensing av nucleolære antigener, karakterisert ved at man utfører en sekvensmessig rensing ved hjelp av ammoniumsulfatutfelling, DEAE-kolonnekromatografi, Sephadex-gelutslutning, kation-utbytning og kalsiumfosfatgel-kromatografi og preparativ isoelektrisk fokusering.
25. 25 i Fremgangsmåte for rensing av antistoffer som er innhøstet fra en ikke-human dyrevert, karakterisert ved at rensingen er indusert ved immuni-sering med et nucleolært antigen.
26. 26. Diagnostisk utstyr, karakterisert ved å innbefatte antistoffer som er karakterisert ved spesifitet mot nucleolære antigener som finnes i humane kreftceller og som har en markør som lar seg påvise enten ved lys, fluorescens eller elektronmikroskopi, eller ved indirekte målingsmetoder og/eller autoradiografi.

    i et bufferet suspenderingsmiddel eller en opp-løsning.
27. 27. Diagnostisk utstyr, karakterisert ved å inneholde umerkede primære antistoffer karakterisert ved en spesifitet mot nucleolære antigener som finnes i humane ondartede kreftceller, og hvor nevnte antistoffer befinner seg i et bufferet suspenderingsmiddel eller oppløs-ning, og

    passende merkede og umerkede reagenser for påvisning av nevnte primære antistoffer i fikserte humane ondartede celler ved hjelp av fremgangsmåter som er valgt fra gruppen bestående av lysmikroskopi, fluorescensmikroskopi, elektronmikroskopi og autoradiografi.
28. 28. Humane kreftceller forbundet med antigener, karakterisert ved at nevnte antigener består av en hovedgruppe og en undergruppe, og hvor hovedgruppen har følgende egenskaper

    en pl ved isoelektrisk fokusering på 6,0 og 6,7 og. en molekylvekt på mellom 50.000 og 60.000 dalton,

    er oppløselig i 0,01 molar Tris-HCl pH 8 og er primært lokalisert i nucleoli, og hvor nevnte antigener er fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge krav 22 eller en tilsvarende kjemisk ekvivalentfremgangsmåte.
29. 29. Hovedgruppen av antigener ifølge krav 18, karakterisert ved å være i alt vesent lig i renset form og fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge krav 24 eller en tilsvarende kjemisk ekvivalentfremgangsmåte.