NL8007128A - Detectie van menselijke kankercellen met antilichamen voor antigenen uit de nucleoli van menselijke kankercellen. - Google Patents

Description

S 5773-1 Β.·^- -* Ρ··& c

Detectie van menselijke kankercellen met antilichamen voor antigenen uit de nucleoli^ van menselijke kankercellen.'

De uitvinding heeft betrekking op nucleolaire antigenen (antigenen uit kemlichamen), die aangetroffen worden in een ruim trajekt van menselijke kankersoorten en niet voorkomen in overeenkomstige niet-tumor-weefsels, benevens op antilichamen en antisera die specifiek zijn voor dit 5 (deze) nucleolaire antigen(en) voor diagnostische doeleinden.

Eerdere vondsten bij proefdieren hebben gewezen op de aanwezigheid van nucleaire en nucleolaire antigenen in tumoren, die niet voorkomen in niet-tumorweefsels (R.K. Busch c.s., Cancer Res. 34, 2362, 1974; Yeoman c.s., Proc.Natl.Acad Sci. USA 73, 3258, 1976; 3258, 1976; Busch en Busch, 10 Tumori 63, 347, 1977; Davis c.s. Cancer Res. '38, 1906, 1978; Marashi c.s., Cancer Res. 39,-59, 1979). Bij deze eerdere onderzoekingen van de onderhavige uitvinders werden antilichamen bereid voor nucleoli van normale en nëoplastische cellen van ratten door immunisatie van konijnen (R.K.

Busch c.s. ,.1-.6.; Busch en Busch, l.c.; Davis c.s., l.c.). Er werd een 15 heldere nucleolaire fluorescentie in de met aceton gefixeerde cellen aangetoond met behulp van de indirekte immunofluorescentiemethode. Ook werd gevonden, dat de immunoprecipitine-banden in Ouchterlony gelen, die gevormd waren met antisera voor nucleolaire antigenen van Novikoff hepatoom,. die geëxtraheerd waren uit nucleoli van Novikoff hepatoom bij de rat, verschil-20 de van de overeenkomstige immunoprecipitinebanden, die verkregen werden met nucleolaire antigenen uit de lever en nucleolaire anti-leverantisera (Busch en Busch, l.c.).

Een verdere specifiteit werd aangetoond doordat antitumor * nucleolair antiserum, dat geabsorbeerd was met extracten van leverkernen, 25 een positièvè nucleolaire fluorescentie gaf in ascites cellen van Novikoff hepatoom, maar niet in levercellen. Omgekeerd gaf antièlever nucleolair antiserum, dat geabsorbeerd was met nucleolaire tumorextracten geen detecteerbare nucleolaire fluorescentie met tumor, maar wel een positieve fluorescentie in levernucleoli (Davis c.s., l.c.).

30 Aangezien immunofluorescentie-analyse erop wees, dat er ver schillen waargenomen konden worden in met aceton gefixeerde tumoruitstrijk-sels en uitstrijksels van normale rattencellen (in het bijzonder na absorptie van de antisera met normale leverkernen en nucleoli), werd getracht deze antisera op nucleolaire antigenen bij rattentumoren toe te 35 passen voor het onderzoeken van overeenkomstige weefselmonsers verkregen - uit menselijke tumoren. Bij onderzoek met antilichamen op nucleoli van tumoren van knaagdieren bleek, dat een positieve immunofluorescentie niet 8007128 I > - 2 - t 1 gevonden werd bij menselijke tumornucleoli. ïn verband daarmee begonnen de onderhavige uitvinders met een nieuwe reeks proeven om menselijke nucleolaire antigenen te vinden. Hierbij werd positieve immunofluorescentie gevonden bij menselijke tumorweefsels met antisera en antilichamen voor deze nieuwe 5 preparaten van nucleolie van menselijke tumoren. Bij dit onderzoek werden de antilichamen geabsorbeerd met nucleaire sonicaten van placenta, benevens met foetaal kalverserum (Busch c.s., Cancer Res. 39, 3024, 1979; Davis c.s., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 892, 1979; Smetana c.s. Life Sci. 25, 227, 1979).

10 De uitvinding is het resultaat van onderzoek bestemd om deze nieuwe menselijke nucleoaire antigenen toe te passen voor het detecteren van een ruim trajekt van menselijke nieuwvormingen (neoplasmen)..

Hieronder geeft Tabel A een samenvatting van de menselijke tumoren, waarbij een heldere nucleolaire immunoflorescentie gevonden werd 15 met de antilichamen op menselijke tumornucleoli. De resultaten van deze onderzoekingen gaven een bevestiging van de verrassende vondst, dat vele menselijke tumoren een gemeenschappelijk nucleolair antigeen bevatten, dat een positieve immunoflüorescentie vertoont met antisera of immunóglobuline- frakties van dergelijke antisera (Busch c.s., l.c.).

20 Tabel a

Heldere nucleolaire immunoflorescentie bij menselijke tumoren (Uit; Busch c.s., 1979) X Carcinomen 25 1. Blaas, overgangscel 2. Hersens astrocytoom gliobastoom 3. Wervelkolom, adenocarcinoom (4) 3Q metastase: lever transplanteerbaar carcinoom (GW-39) 4. Exocrineklier, carcinoom 5. Slokdarm, carcinoom van plaatjesachtige cellen 6. Lever, primair carcinoom 22 7. Long; adenocarcinoom (2) "oat" cel (2) plaatjesachtige cellen (5) 8. Melanoom, kwaadaardig, cerebrale metastasen 8007128 « * * l - 3 - 9. Prostaat, adenocarcinoom (4) «Μ 10. Huid: carcinoom van basaalcellen (2) carcinoom van plaatjescellen (7) metastase: lymfknoop 11. Maag, adenocarcinoom metastase: lever metastase: lymfknoop 12. Schildklier, carcinoom (2) II Sarcomen 1. Myoblastoom, kwaadaardig, van lip metastase 'naar cervicaie lymfknoop 2. Osteogeen sarcoom (3), biopsie, weefselcultuur 3. Synoviaal sarcoom 4. Lymfoom (4), geen Hodgkins III Hematologische Neoplasmen 1. Ziekte van Hodgkins (Reed Sternberg, 5) 2. Leukemie: CLL (5), harige cellen (milt) 3. Lymfoon, lymfocytisch, milt 4. Multipel myelöom (5) 5. Mycosis fungoides 6. Acute myelocytische leukemie (5) 7. Chronische myelocytische leukemie (5) 8. Acute monocytische leukemie (2) IV Cultures 1. Borst carcinoom 2. Adenocarcinoom van wervelkolom 3. HeLa 4. HEp-2 5. Prostaat, carcinoom (3) 6. Carcinoom van plaatjescëllen (3)'

Opmerking: de tussen haken geplaatste getallen geven het aantal gevallen aan.

i Bij de niet-tumorweefsels, goedaardige tumoren en onstekings-toestanden werden in het algemeen negatieve resultaten verkregen, zoals blijkt uit de onderstaande B (Busch c.s., l.c.).

Tabel B

Negatieve immunofluorescentie bij menselijke weefsels .(Uit: Busch c.s., 1979)_~ ~ I Normaal weefsel 8007128 1 1

* V

- 4 - 1. Blaas 2. Beendermerg (hemoblastische lijnen, (5)a^ 3. Borst 4. Roodachtig grijze laag in gecentrifugeerd bloed (3) 5 5. Galblaas 6. Dunne darm, holten van Liéberkuhn 7. Dikke-darm 8. Nier 9. Lever (2) 10 10. Long (aangrenzend aan tumor) 11. Lymfknoop 12. Lymfocyten, normaal (2) 13. Alvleesklier 14. Pijnappelklier 15 15. Hypofyse 16. Placenta 17. Prostaatkliër 18. Huid 19. Maag 20 20. Schildklier II Goedaardig groeiende weefsels 1. Borst, adenoom 2. Parathyroide adenomen (2) 3. Prostaatkliër, hyperlasia (3) 25 4. Schildklier, adenomen (3) nodulaire struma's (2) III Onstekingsziëkten 1. Chronische ulceratieve colitis 2. Glomerulonefitis 30 3. Granulom en fibrose van de long 4. Lever - cirrose, hepatitis 5. Lupus profundus (borstklier en huid) 6. Buleuse pemfigus 7. Maagzweer 35 8. Ontstekings hyperplasie-lymfknopen (4) 9. Infectueuze mononucleose (5) IV Cultures 1. Borst fibroblasten 2. Lymfocyten, met PHA gestimuleerd a) Aantallen tussen haken geven aantal gevallen aan.

8007128 1' -+ - 5 -

Deze resultaten, die oorspronkelijk met iamunofluorescentie verkregen werden, zijn geverifieerd en uitgebreid met immunoperoxidase-methoden.

De uitvinding berust op de verrassende vondst, dat gemeen-5 schappelijke nucleolaire antigenen aangetroffen worden in een grote verscheidenheid van menselijke kankercellen, maar niet voorkomen in normale menselijke cellen. De antigenen zijn eiwitten, die een regelende funktie op de genen of andere funkties kunnen hebben en tijdens de gehele celdeling op een perichromosomale plaats blijven bestaan. Belangrijke aspekten van 10 de uitvinding zijn de vondst van de gemeenschappelijke nucleolaire antigenen, die in.-.menselijke kankercellen worden aangetroffen, het isoleren en zuiveren van de nucleolaire antigenen, de vorming van antisera en anti-lichamen, die specifiek zijn voor deze antigenen, diagnostische onderzoekmethoden onder toepassing van antisera en antilichamen, die specifiek zijn 15 voor deze antigenen, teneinde menselijke kankercellen te detecteren, en een diagnostische uitrusting, die antilichamen of antisera óf beide bevat, welke specifiek zijn voor deze nucleolaire antigenen.

De antigenen zijn aangetroffen in een grote verscheidenheid menselijke kankersoorten, waaronder kankers van het centrale zenuwstelsel, 20 het maagdarmkanaal, het genitourinale stelsel, de long, de huid, bloedvor-mende weefsels en endocrine en exocrine klieren. Als voorbeelden van kwaadaardige cellen bij mensen zijn te noemen: HeLa-cellen, prostaatcarcinom, andere carcinomen, carcomen en hematologische neoplasmen. De antigenen kunnen geëxtraheerd worden uit kernen of nucleoli van kwaadaardige cellen 25 bij mensen. De antigenen zijn niet aangetroffen in overeenkomstige niet- tumorweefsels. Bij toepassing van de diagnostische methoden van de uitvinding voor het detecteren van kwaadaardige cellen werden circa 1 % valse negatieven en 3 % valse positieven gedetecteerd. De .valse negatieven stellen necrotische tumorweefsëls of om onbèkënde oorzaken niet-reaktieve tumoren voor. De valse 30 positieven zijn 2 gevallen van "preneoplastische weefsels" en zwak positieven bij enkele haardgebieden in "hyperplastisch weefsel". Twee focale positieve gebieden werd geïdentificeerd als "preneoplastische gebieden"' of focale neoplastische transformatie bij ontstekingsweefsels in het maagdarmkanaal.

De antigenen bezitten een hoofdsoort en ten minste een en mo-35 gelijk meer kleinere antigeensoorten. De hoofd-antigeensoort uit menselijke kankercellen (a) bezit een duidelijk isoelektrisch punt van 6,0-6,7 en omstreeks 6,3, zoals bepaald door iso-elektrisch focusseren, met pH 3-10 ' en polyacrylamidegel; (b) bezit een molecuulgewicht van circa 50.000-60.000 dalton bepaald door twee dimensionele gel-elektroforese met een tweede 8007128 * ^ · - 6 - demensie van SDS (natriumdodecylsulfaat); (c) is gedeeltelijk sterk gebonden asm nucleair en nucleolair RNP en gedeeltelijk oplosbaar in 0,01 M Tris-HCl, pH 8; (d) en is zowel nucleolair als extranucleolair, maar blijft tijdens de celdeling "intranucleair" of met de chromosomen verbonden.

5 De tweede antigeensdort, die gedetecteerd werd, geeft een pl van circa 6,0 (bepaald volgens dezelfde methode als bij de hoofd-antigeen-soort) en zijn molecuulgewicht bedraagt eveneens 50.000-60.000 dalton. Het is mogelijk, dat dit een gemodificeerd produkt is van het hoofd-antigeen, maar er is niet bepaald of het structureel verwant is. Deze antigeensoort 10 is in een relatief kleinere concentratie aanwezig dan de hoofd-antigeensoort.

Antigenen zijn eveneens aanwezig in nucleolaire ribonucleo-proteine (RNP) deeltjes, die verkregen worden door ultracentrifugeren van de hieronder te beschrijven Tris-extracten. Het in deze deeltjes aanwezige antigeen is sterker aan eiwitten en ribonucleinezuur (RNA) gebonden dan het 15 antigeen in de in Tris oplosbare fraktie. Het is nog niet duidelijk of de antigenen in het RNF-deeltje identiek zijn aan die in de bovendrijvende fraktie, maar hun isoelektrische punten zijn dezelfde en zij absorberen de antilichamen voor de antigenen. Nucleolaire antigenen die aanwezig zijn in fibrielen, waarschijnlijk van het netwerk van het nucleaire ribonucleo-20 proteine, worden eveneens in kankercellen waargenomen met behulp van immune-lichtmicroscopie. Dit zijn extra nucleolaire structuren, die elementen kunnen voorstellen, waarvan de RNP-deeltjes zijn afgeleid.

Er dient nog te worden uitgemaakt of de antigenen een stof voorstellen, die in., hoge concentraties in kankercellen en in zeer lage 25 concentraties in niet-kankercellen aanveZig-is of dat zij foetale antigenen zijn, zoals eerder gevonden werd bij vergelijkende onderzoeken aan nucleaire antigenen van Novikoff hepatoom bij de rat en normale levercellen vein de rat (Yeoman c.s., 1976).

Alle stappen voor het verkrijgen en analyseren van monsters 30 van menselijk weefsel, bloed en serum van menselijke tumoren en andere weefsels van patiënten die van kanker verdacht werden, waren goedgekeurd door het Human Research Committee in Baylor College of Medicine, Houston, Texas en daarmee samenwerkende ziekenhuizen. COupes.van: menselijke, tumoren werden verkregen uit bevroren coupes..van operatiemonsters, biopsie of ge-35 conserveerde cryostaatmonster, in hoofdzaak van het Department of Pathology van Houston Veterans Administration Medical Centre en ook van the Michigan Kanker Foundation, Detroit, Michigan en van de Afdeling voor Interne Geneeskunde van de Keizer Karei Universiteit in Praag, Tsjechoslowakije. Deze coupes werden op de aanwezigheid van necleolaire antigenen geanalyseerd 8007128

J

- 7 - V * volgens methoden van indirekte immunofluorescentie en immunoperoxidase.

De zuivering van de antigenen werd Uitgevoerd door kernen of nuclëoli 6 maal te extraheren met 10 mM Tris HC1/0,1 mH PMSF/pH 8 in een hoeveelheid van 20 volumina op 1 volume kernen of nucleoli. Het extract 5 werd eerst gedurende 10 minuten met 27.000 x. g.en daarna 16 uren met 100,000 x g gecentrifugeerd. Men 'gebruikte ammoniumsulfaat van 40 % ver-zadigingsconcentratie om verontreinigingen te verwijderen. De 40 - 100 % ammoniumsulfaatfraktie werd door centrifugeren verzameld en tegen 20 mM Tris HCl/pH 7,6 gedialyseerd. De antigenen werden gechromatografeerd over 10 DE-52 cellulosekolommen (lx 10 cm). De antigenen werden geëlueerd in de fraktie van 0,15 M NaCl/0,1 mM PMSF met pH 7,6. Gelen voor het isoelektrisch focusseren werden toegepast om de antigenen te identificeren en te zuiveren. Deze gelen bevatten 4 % acrylamide/8M ureum/2 % amfolinen (pH 3,5-10). De antigenen met respectievelijk pi 6,3 en 6,0 werden uit de gelen gesneden.

15 Op. SDS (natriumdodecylsulfaat) gelen werd één hoofdvlek gevonden voor elk van deze antigenen.

Kernen of nucleoli van HeLa cellen werden bereid door HeLa cellen te verzamelen uit Spinner kweekflessen (7-8 liter). De cellen dienen 5 in de logfase te zijn (7-8 x 10 cellen/ml) en ware dit ook. De cellen wer-20 den gedurende 8 minuten bij 800 x g gecentrifugeerd onder vorming van cel-tabletten. Deze celtabletten werden gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (0,15 M NaCl, 0,01 M fosfaat, pH 7,2) door zacht homogeniseren met een losse stamper van polytetrafluoretheen en gedurende 8 minuten met 800 x g gecentrifugeérd. De cellen werden een tweede maal met 25 PBS gewassen en de celtabletten werden gewogen. De celtabletten werden door zacht homogeniseren in 20 volumina reticulocyt standaardbuffer (RSB) met pH 7,4 gehomogeniseerd, waarna men ze 30 minuten op ijs liet zwellen. Daarna werden de cellen gedurende 8 minuten bij 1000 x g gecentrifugeerd en opnieuw door zacht homogeniseren gesuspendeerd in RSB buffer plus 1/20 volume van 30 het reinigingsmiddel Nonidet P40 (10% in RSB). De uiteindelijke hoeveelheid Nonidet bedroeg 0,5 volume %. De cellen werden met een Dounce homogeniseer-inrichting met 20-60 slagen gehomogeniseerd tot de cellen gebroken waren en de kernen vrijgekomen waren en van cytoplasma bevrijd waren. De cellen werden daarna 8 minuten bij 1000 x g gecentrifugeerd, door zacht homogeni-35 seren weer gesuspendeerd in 0,88 M sucrose met 0,5 mM Mg-acetaat (20 x gewicht-volume) en 20 minuten bij 1500 x g gecentrifugeerd. Het verkregen materiaal bevatte de HeLa kernen en deze werden gebruikt om de hieronder beschreven antigeenextracten te bereiden. Kernen van andere menselijke kwaadaardige cellen kunnen op overeenkomstige wijze verkregen worden.

8007128 « t - 8 -

Voor het isoleren van nucleoli werd het op de bovenbeschreven wijze verkregen kerntablet vervolgens door zacht homogeniseren gesuspendeerd in 0,34 M saccharose met 0,5 mM Mg-acetaat waarbij men 2 ml saccharose per gram van de oorspronkelijke cellen gebruikte. De kernen werden met ultra-5 sonore trillingen behandeld (met een Branson inrichting) met salvo!s van 10 sekonden (en 10 sekonden rust). De totale tijd lag tussen 60 en 110 sekonden. De vrijgekomen nucleoli werden bewaakt door microscopisch onderzoek. Om de nucleoli zichtbaar te maken werden zij gekleurd met azuur C ( een oplossing van 1 % azuur C in 0,25 M saccharose). Het preparaat dient 10 aan het einde van de behandeling met ultrasonore trillingen vrij te zijn van kernen. Op de met ultrasonore trillingen behandelde fraktie bracht men drie maal het volume 0,88 M saccharose-oplossing' (zonder Mg-acetaat) aan en men centrifugeerde 20 maal bij 1500 x g. Het verkregen materiaal bevatte de HeLa nucleoli, die als immunogeen toegepast kunnen worden.

15 Gewoonlijk werd met de bovenstaande werkwijze'een bevredigende reiniging verkregen (Busch en Smetana, 1970) en bij licht microscopie bleek, dat de kwaliteit van deze preparaten in hoofdzaak bevredigend was. Bij analyse met elektronenmicroscopie bleek echter de aanwezigheid van chromatine en verontreinigingen uit de kern. Het hoofdprobleem voor een doelmatige 20 zuivering van deze preparaten is de beperkte hoeveelheid oorspronkelijke HeLa cellen in de cultures, waardoor het aantal hernieuwde zuiveringsstap-pen beperkt wordt. Nucleoli, die bereid werden uit preparaten van 5-10 g HeLa cellen i.p.v. de hoeveelheden van 0,5-1 g, die bij eerder onderzoek gebruikt werden, gaven voldoende materiaal voor een adequate zuivering.

25 De omstandigheden voor het kweken van de HeLa cellen en het isoleren van de placenta-kemen waren praktisch dezelfde als, die we'lke al eerder beschreven waren (Davis c.s., 1979).

Een Tris extract van HeLa werd bereid door de HeLa kernen in NaCl-EDTA buffer te suspenderen, 10 x gewicht/volume, dus 1 gram kernen/ 30 10 ml buffer (buffer: 0,075 M.lïaCl, 0,025 M Na-EDTA? pH 8j ImM PMSF).

Het fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) wordt in een concentratie van 100 mM in isopropanol toegepast. Het wordt aan iedere oplossing toegevoegd vóór het extraheren. De suspensie werd met een Dounce homogeniseerinrichting onder toepassing van 20 slagen gehomogeniseerd en 5 minuten gecentrifugeerd 35 met 3000 x g. De bovenstaande vloeistof werd verzameld. De bovengenoemde extracties werden nog 2 maal met het kernmateriaal herhaald. Het NaCl-EDTA extract werd niet bij het onderhavige antigeenonderzoek gebruikt en derhalve verwijderd. Het kernmateriaal werd gesuspendeerd in 10 maal gewicht/ volume 0,01 M Tris-HCl; pH 8; 1 mM PMSF en met een Dounce homogeniseerin- 8007128 - 9 - " ff ( richting met 20 slagen gehomogeniseerd, hoewel opgemerkt wordt, dat 0,01 M Tris-HCl met pH 7-9 bevredigend is. De bovenstaande vloeistof werd verzameld en op ijs bewaard. Tijdens de extracties met Tris braken de kernen en werd chromatine afgegeven. Het breken van de kernen werd bewaakt met micros-5 copisch onderzoek. Het materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in de Tris buffer en men liet de kernen gedurende 15 minuten op ijs "zwellen" Daarna werd met een "Dounce" apparaat met 20 slagen gehomogeniseerd en werd gedurende 10 minuten met 12000 x g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd bewaard. Het materiaal werd ophieuw gesuspendeerd en had een 10 witachtig donzig uiterlijk. Het werd opnieuw met een "Dounce” apparaat gehomogeniseerd met 20 slagen en 30 minuten met 27000 x g gecentrifugeerd.

De bovenstaande vloeistof werd verzameld en met de eerdere' bovenstaande vloeistoffen verkregen van de Tris-extracten gekombineerd.

De Tris-extracten werden daarna geconcentreerd met een 15 Amicon UM-10 of PM-10 Diaflo membraan. In het algemeen bedroeg het volume bij het begin omstreeks 50 ml en werd het geconcentreerd tot 4-5 ml. De uiteindelijke eiwitconcentratie bedraagt omstreeks 4-5 milligram/ml. Met dit Tris-extract kan het konijn geimmuniseerd worden.

Onder toepassing van de bovenstaande werkwijze kan men ook 20 extracten bereiden uit HeLa nucleoli en van kernen of nucleoli van andere kwaadaardige cellen bij mensen.

Voor het Tris-immunogeen verdunt men 250 ƒ11 Tris-extract (4—5 mg/ml, dat op de bovenstaande wijze bereid is, met 250yil PBS. Men . kombineert dit met Freund's hulpvloeistof, zoals voor het nucleolaire 25 immunogeen hieronder beschreven wordt.

Antilichamen werden bereid door konijnen met preparaten van HeLa celnucleoli als volgt te immuniseren: de HeLa nucleoli werden gewogen .(20-30 mg, vochtig gewicht) en gelijkmatig gesuspendeerd in 0,5 ml 0,01 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,2. Daarna werden ze als volgt 30 gemengd met 0,6 ml volledig hulpmiddel van Freund (GIBCO): de gesupendeerde nucleoli werden in een injectiespuit van 5 ml gebracht en het hulpmiddel van Freund in een tweede spuit. Aan iedere spuit bevestigde men een naald met een doorsnede van 1,2 mm, waarvan de punt verwijderd was. De naalden werden daarna verbonden met een stuk polyetheenbuis met een inwendige 35 doorsnede van 1,2 mm (Clay-Adams). De inhoud van de spuiten werd gemengd tot het preparaat dik werd en moeilijk door de buis te persen was.

Het konijn werd op de rug geschoren en op 6 plaatsen werd intradermaal een injektie toegediend van 0,1 ml per plaats. De resterende 8007128 s - 10 - 0,4-0,5 ml werd voor de helft subcutaan (onder de losse huid op het bovenste deel van de rug) en voor de helft intramusculair (in de dijspier) gelnjek-teerd. De injekties werden gedurende 3 weken 1 maal per week gegeven, waarbij elke keer dezelfde hoeveelheden nucleoli werden toegediend. De eerste 5 bloedafname werd 7-10 dagen na de derde week van de immunisatie uitgevoerd. Hen gebruikte een konijne-oorkam (Bellco) en een vacuumpomp om het bloed te verzamelen. Men liet het bloed (circa 45-50 ml) 3-4 uren bij kamertemperatuur klonteren. Het serumgedeelte werd uit de buis verwijderd en 30 minuten met 1000 g gecentrifugeerd (hierdoor worden evenutele vrije rode 10 bloedlichaampjes gesëdimenteerd). Het heldere serum werd verzameld en daarna geabsorbeerd (of in bevroren toestand gehouden tot men gereed was voor de absorptie). De bloedklonter kan gedurende:.een nacht gekoeld wordën. Hierdoor komen nog enkele ml serum vrij. Het serum van iedere bloedafname werd met de indirekte immunoflorescentiemethode onderzocht op de aanwezigheid 15 van antilichamen voor de nucleoli.

Andere niet-menselijke gastheren (bijv. geiten, schapen, paarden, kippen enz.) kunnen met preparaten van nucleoli uit menselijke kwaadaardige cellen geïmmuniseerd worden om de antisera of antilichamen tegen de nucleolaire antigenen volgens de uitvinding op te 'wekken. Antisera 20 kunnen ook bereid worden door immunisatie van niet-menselijke gastheer dieren met extracten (bijv. Tris-extract) van kernen of nucleoli van voor mensen kwaadaardige cellen.

De absorptie van antinucleolair antiserum werd uitgevoerd door het konijne-antiserum eerst te absorberèn met 20 % normaal menselijk 25 serum en 2Q % foetaal kalfsserum (GIBCO). Men voegde 20 % normaal menselijk sefum toe aan het konijne-antiserum (4 ml op 20 ml) en incubeerde 1 uur onder schudden in een op 37° C gehouden waterbad. Men verwijderde de kolf uit het bad, voegde 20 % foetaal kalfsserum (4,8 ml op 24 ml) toe en incubeerde 1 uur onder schudden in een op 37° C gehouden waterbad. De kolf 30 werd verwijderd en nog een uur bij kamertemperatuur geIncubeerd, waarbij gemengd werd door iedere 15 minuten zacht om te zwenken. Daarna werd het mengsel 30 minuten bij 15000 x g gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof (geabsorbeerd serum) werd verwijderd en bewaard. Het geabsorbeerde serum werd in de immunoglobulinevoxm (Ig) omgezet onder toepassing van de 35 werkwijze, die hieronder beschreven is voor de (NH^)^SO^-precipitatie van serum.

Het Ig-preparaat uit het nucleolaire antiserum, dat geabsorbeerd was met normaal menselijk serum en-foetaal kalfsserum, werd nu geabsorbeerd met een normaal menselijk weefsel (placenta of lever). Een ge- 8007128 » * I ** - 11 - lijk volume sonicaat (door behandeling met ultrasohore trillingen verkregen materiaal) van placentakernen in PBs 7,2 (10-15 mg eiweit/ml) werd toegevoegd aan het geabsorbeerde nucleolaire immunoglobuline (10 ml Ig plus 10 ml kemsonicaat) en het mengsel werd 1 uur onder schudden in een op 5 37° C gehouden waterbad gelncubeerd. Daarna werd nog een uur bij kamertem-‘peratuur gelncubeerd, waarbij gemengd werd door de kolf iedere 15 minuten .· - zacht om te zwenken; hierna Werd 30 minuten gecentrifugeerd bij 15000 x g.

De bovenstaande vloeistof werd verzameld en de'geabsorbeerde Ig werd op de beschreven wijze weer neergeslagen met (NH^SO^. Deze Ig kan als het 10 uiteindelijke antilichaamprodukt worden toegepast of door. chromatografie over diethylaminoethyl (DEAE) cellulose als volgt verder gezuiverd worden;

De Ig, die in de met 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing met pH 7,2 aanwezig is, wordt gedialyseerd tegen 0,0175 M fosfaatbuffer met pH 6,3 (zonder zout). Na dialyse wordt gedurende 20 minuten bij 2500 x g 15 gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof wordt op de DEAE kolom gebracht (20 mg eiwit per gram cellulose, Whatman DE 52). De IgG wordt uit de kolom geëulueerd met de 0,0175 M fosfaatbuffer. Na elutie wordt de IgG-fraktie gedialyseerd tegen de met 0,01 M fosfaat, gebufferde zoutoplossing met pH 7,2.

20 Dezelfde werkwijze werd gevolgd voor het controleserum, dat uit het pre-immuneserum bestond, dat verkregen was door bloedafname van het konijn (of een ander niet-menselijk gastheerdierl voordat de immunisatie begonnen was.

Konijne-immunoglobuline Ig werd als volgt bereid: er werd 25 een verzadigde (NH^SOj oplossing (760 g/liter) bereid en een gelijk volume koude verzadigde (NH^^SO^ werd druppelsgewijs onder roeren aan het antiserum tóegevoegd. Er vormde zich eén wit neerslag en men liet dit neerslag zich gedurende 1*2-2 uren in de koude aggregeren met een magnetische - ' roerder. Het neergeslagen antiserum werd gedurende 20 minuten met 3000 x g 30 gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en het materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in PBS met pH 7,2 (ongeveer de helft van het volume van het oorspronkelijke serum). Het oplosbaar gemaakte materiaal werd in een dialysezak gebracht en gedurende een nacht in de koude gedialyseerd tegen 100 volumina PBS (met magnetisch, roeren). De dialysezak werd 35 de volgende morgen in vers PBS (100 maal het volume) geplaatst en de dialyse werd gedurende 6 uren voortgezet. De immunoglobuline werd zorgvuldig uit de dialysezak verwijderd en gedurende 20 minuten met 2500 x g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd verzameld.

De in de literatuur beschreven werkwijze voor immunofluorescentie 8007128 - 12 - (RK Busch c.s., 1974; Hilgers c.s., 1972) werd als volgt bij dit onderzoek toegepast: men bracht 150 ul antinucleolair antiserum in een verdunning van 1:50 op met acetón gefixeerde HeLa cellen of op gefixeerde weefselmon-sters (volgens Hilgers c.s. 1972; RK Busch c.s., 1974). Het kan nodig zijn 5 meer dan 150 ul te gebruiken, als het weefselmonster een groot gedeelte van het glaasje bedekt. De verdunning van het antiserum (As) hangt af van de titer van het antilichaam (Ab). Men kan ook andere verdunningen toepassen tot aan het punt, waarbij de As- of Ab-preparaten te verdund worden om het positieve responsi te geven op bekende positieve cellen (bijv. HeLa. 10 De glaasjes werden gedurende 45-50 minuten bij 37° C in een vochtige ruimte geincubeerd (de vochtigde kamer kan bestaan uit een grote petrischaal, waarin een vochtige papieren handdoek is gebracht). Na het incuberen werd het antiserum van het glaasje gewassen door voorzichtige toevoeging van PBS en de glaasjes werden in een houder geplaatst en 1 uur in BBS gewassen. 15 Het PBS werd 3 maal ververst, na 15 minuten, na 30 minuten en na 45 minuten. De glaasjes werden uit PBS verwijderd en 10 maal in gedestilleerd of ge-deoniseerd water gedompeld met snelle op en neer bewegingen. De glaasjes werden met koude lucht van een ventilator of föhn gedroogd (2-3 minuten), waarbij men voorzichtig was niet te ver te drogen. Men bracht 150 ^il met 20 fluoresceien gemerkt geite- .antikonijne-antiserum (Hyland of Cappel) in de verdunning 1:10 óp de glaasjes en incubeerde 30-35 bij kamertemperatuur in de vochtige kamer. Het tweede antilichaam werd door voorzichtig wassen met PBS van het glaasje verwijderd. Daarna werden de glaasjes 1 uur in PBS gewassen, waarbij 3 maal ververst werd, na 15 minuten, 30 minuten en 25 45 minuten; in plaats daarvan kan men ze na de eerste 15 minuten wassen ook in vers PBS plaatsen en ze gedurende de nacht in een koelkast laten staan. Na het uiteindelijke wassen met PBS werden de glaasjes 10 maal in gedeoniseerd of gedestilleerd water gedompeld met snelle op en neer bewegingen en met koude lucht van een ventilator of föhn (2-3 minuten) ge-30 droogd. Een oplossing van glycerol en PBS in de verhouding 1:1 werd aan de cellen of het weefselmonster toegevoegd en het geheel werd met een dek-glaasje bedekt. Het monster kan verscheidene maanden bewaard worden, wanneer men het dekglaasje afdichtend bevestigt met een .afdichtmiddel, bijv. ongekleurde nagellak, en koud bewaart. Het glaasje werd daarna met een fluores-35 centiemicroscoop onderzocht. Nucleolaire fluorescentie werd niet waargenomen met pre-immune immunoglobuline of pre-immune IgG-frakties. De andere toegepaste immunologische methoden waren dezelfde als die bij vroeger onderzoek (Kendall, 1938; Lowry c.s, 1951; Dale en Latner, 1969; Laurell, 1972; Wallace c.s., 1974; Marashi c.s. 1979) toegepast waren. Voor analyse 8007128 ’ # · ·· I. - --13- van de nucleolaire localisatie van de immunofluorescentie werden.monsters ** tijdens het' waarnemen van de fluorescentie in en buiten fase-contrast-be-.lichting geplaatst.

I.p.v. met fluoresceren gemerkt geite-antikonijneserum kan 5 men ook de methode met immunoperoxidase toepassen. Zo werd bijv. 150 jil van met peroxidase gemerkte geite- antikonijneserum in de verdunning 1:10 of 1:20 toegevöëgd. Plaatselijke peroxidase-aktiviteit kan aangetoond worden met een 'aantal redoxikleurstofsystemen, geschikt voor llichtmicroscopie . - of elektrorienmicroscopie. Andere enzymen kunnen dienen als merkmaterialên 10 voor de indirekte methode en men kan peroxidase en andere enzymen direkt gebruiken door het primaire antilichaam te merken.

Incubatièmêdium volgens Kamofsky wordt als vólgt bereid: men weegt voldoende diaminóbenzidine (Sigma) af en suspendeert dit in 0,05 M Tris=HCl met pH 7,6, zodat de..concentratie 0,5 mg/ml bedraagt. Men 15 bereidt een waterstofperoxide-oplossing van 0,02 % (in de 0,05 M Tris-HCl-buffer). Men mengt de oplossingen van 0,5 mg/ml DAB en 0,02 % in een gewichtsverhouding 1:1 (deze gemengde oplossing werd iedere keer dat hij gebruikt werd vers bereid en tijdens de bereiding koud gehouden). Men brengt 200-300 ul van het mengsel van DAB en HjC^ op het glaasje en incubeert 30 20 minuten in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.

Na deze incubatie verwijdert men het DAB en mengsel door het glaasje te wassen met de 0,05 M Tris-HCl-buffer van pH 7,6, waaraan 0,1 M NaCl is toegevoegd. De glaasjes worden daarna 2 maal telkens 10 minuten gewassen in 0,05 M Tris-HCl met 7,6, dat 0,1 M is aan NaCl. Men beëindigt 25 de bewerking van de microscoopglaasjes als aangegeven in stappen 11-14 (behalve dat de PBS gewijzigd is iii Tris-HCl). Na voltooiing wordt het glaasje onderzocht met lichtmicroscopie.

Microscoopglaasjes met HeLa cellen voor immunofluorescentie .werden als volgt bereid: er werd een voorraad van gefixeerde HeLa cellen 30 bereid door aktief groeiende cellen uit de HeLa cultuurfles met PBS met een pH van 7,2 te verwijderen en daarmee te wassen. De cellen werden zo 6 'gesuspendeerd, dat er ten minste 1,5 x 10 cellen/ml aanwezig waren. Men bracht 1 druppel van de HeLa-cel suspensie op ieder gewassen glaasje (gereinigd met reinigingsmiddel, gespoeld met gedestilleerd of gedeoniseerd ‘ 35 water en gereinigd met alcohol en vervolgens gespoeld en warme lucht uit een föhn gedroogd) en spreidde dit enigszins uit en liet het bij kamer-- temperatuur (of een nacht in de koude)' drogen. De gedroogde cellen werden -----gefixeerd door de glaasjes 12 minuten bij 4° C in aceton te plaatsen. De glaasjes werden genummerd met een markeerpsttood voor glas met diamanten.

8007128 - 14 -

De glaasjes werden als positieve controle op inmuriofluorescentie gebruikt.

Het onderhavige onderzoek bevestigt, dat nucleolaire anti-genen aanwezig zijn in tumorcellen, maar niet wórden aangetroffen in niet-tumorweefseis. Een aanvankelijk onderzoek toonde aan, dat zowel in cellen 5 cultures van menselijke tumoren als in monsters verkregen bij autopsie of biopsie, een heldere nucleolaire fluorescentie verkregen werd met de dubbele antilichaamtechniek (indirekte immunofluorescentie) en dat geen overeenkomstig resultaat bereikt werd met een reeks non-tumorweefsels (Davis c.s., 1979). Bij later onderzoek'werden meer dan 60 kwaadaardige gezwellen 10 onderzocht en werd ook een reeks controleweefsèls onderzocht. Het is van groot belang, dat deze ruime sortering van kwaadaardige gezwellen van ectodermale, endodermale en mesodermale oorsprong de aanwezigheid van een of meer gemeenschappelijke nucleolaire'antigënen vertoond (Tabel A).

voorbeeld I

15 Normale weefseis: Bij 17 niet-tumorweefsels trad geen nucleolaire fluorescentie op na incubering van de antisera of antilichamen met de verschillende gefixeerde celpreparaten. Van bijzonder belang was, dat noch de Malpighiaanse laag van de huid, noch de cellen van het beendermerg, noch de holten van Lieberkuhn bij deze methode positieve .immunofluorescentie vertoonden.

20 Bovendien waren de verschillende niet-tumorweefsels grenzend aan de neoplas-men eveneens negatief; hieronder zijn vele weefsels van verschillende types. Een aantal goedaardige gezwellen, die onderzocht werdén, waaronder verschillende soorten adenomen van de schildklier, waren eveneens negatief (Tabel B).

Voorbeeld II

25. Onstekingsbeschadiglngen: Om vast te stellen of een ontstekingsresponsie verband hield met het verschijnen van deze antigenen werd een onderzoek uitgevoerd met 8 soorten ontstekingsweefseis. Bij de meeste daarvan trad geen waarneembare fluorescentie op in de nucleoli van de onderzochte cellen. Er werden echter secties in monsters van ulceratieve colitis en maagzweer 30 gevonden’, die een positieve nucleolaire fluorescentie vertoonden. In het bijzonder waren twee of drie secties van de ulceratieve colitis negatief, terwijl een een duidelijke positieve nucleolaire fluorescentie vertoonde.

Bij het riaagzweerweefsel vertoonde een van de twee geanalyseerde secties een positieve nucleolaire fluorescentie. Deze resultaten zijn bijzonder 35 interessant i.v.m. de bekende neiging van deze lesies een verandering te ondergaan tot kwaadaardige gezwellen. Van bijzonder beIcing was om zowel de focaal positieve als negatieve gebieden van deze plaatjes opnieuw te bekijken in de hematoxyline, met eosine gekleurde secties; deze toonden aan, dat errinderdaad gebieden in deze lesies bestonden, die niet 'alleen 8007128 - 15 - a § mitotische figuren vertoonden, maar ook een ophoping van de epitheellaag.

Dit wees er mogelijk op, dat deze cellen in situ preneoplastische lesies of carcinoom zouden kunnen gaan vormen. Het is mogelijk, dat de vondst van deze fluorescerende gebieden behulpzaam kunnen zijn bij beslissingen om 5 chirurgisch op te treden met locale of meer algemene resecties"van de aangetaste lesies.

. voorbeeld lil

Artifacten: In het epithëel van de maag was er een gebied van fluorescentie in iedere cel, dat niet nucleolair was en dat een niet-specifieke locali-10 satie van het fluorescerende antilichaam leek voor te stellen. In een holte van de dunne darm bleek een niet-specifieke localisatie van het antilichaam voor te komen in de vorm van aggregaten; in de meeste gevallen werden deze aggregaten verwijderd door filtratie vooraf van de'antilichamen door een Millipore filter met poriën van 0,45 ^am..In een monster borst-15 weefsel, dat negatief was op nucïeolaire fluorescentie waren in het algemeen kleine, niet-specifieke immunofluorescentievlekken 'verdeeld zonder speciale localiserende kenmerken voor wat betreft de celmorfologie. De diametèrs van deze zeer kleine, niet-specifieke precipitaten bedroegen 0,5-0,1 jm, waar tegenover de nucïeolaire diameters in de kernen en nucleoli 4-6 urn 20 bedroegen.

v Voorbeeld IV

Fluorescentie-tijdens fasen van de celcyclus: De nucïeolaire fluorescentie werd gemakkelijk zichtbaar gemaakt bij de nucleoli in-interfase. In de metafase werd de nucïeolaire fluorescentie niet waargenomen als duidelijke 25 eenheid, maar 'was deze zichtbaar tussen de chromosomen en in de verbindingsgebieden tussen de "kernen" en het cytoplasma. Aangezien de nucleolus tijdens de metafase grotendeels verdwijnt en de synthese van rRNA in de late profase ophoudt, was het verrassend, dat de nucïeolaire fluorescentie niet als een duidelijke eenheid in dergelijke cellen zichtbaar was (Tan en Lerner, 1972).

30 De vondst dat resten van de immunofluorescentieprodukten tijdens de mitosis blijven bestaan wijst er echter op, dat de nucïeolaire sub-structuren (i.p.v. de nucïeolaire produkten) de antigenen bevatten, die epigenetisch blijven bestaan.

Voorbeeld V

35 Kwaadaardige gezwellen, negatieven: In de reeks kwaadaardige gezwellen werden over alle glaasjes in wisselende mate negatieve gebieden gevonden.

In het algemeen correleerden deze met necrotische of door abcessen aangetaste delen van de neoplasmen. In een monster van een hersentumor was de massa, die geen positieve fluorescentie vertoonde,necrotisch; vele leukocyten 8007128 « - 16 - t waren aanwezig, maar er was geen bepaalde structuur. Een adenocarcinoom, dat metastasen in de hersens gaf, vertoonde geen positieve fluorescentie; de redenen daarvoor waren niet duidelijk. Aangezien 61 van de onderzochte 63 tumoren een positieve nucleolaire fluorescentie vertoonden, was 97 % 5 van de onderzochte reeks positief. Deze onderzoeken zijn nu verder verruimd tot meer dan 300 menselijke kankermonsters, waaronder een reeks kankergezwellen van de borst, de prostaat, de long en hematologische tumoren, alles met sterk overeenkomstige resultaten.

Voorbeeld VI

10 Merken; Direkte immunochemische methoden voor het aantonen van de antilichamen zijn bijv. het merken van het primaire antilichaam met een of meer van de volgende merkstoffen: een radio-isotoop voor autoradiografie, bijv.

125 131 14 3 - X, .1, C, of H; een fluorescerende kleurstof, bijv.fluoresceien of tetramethylrodamine voor fluorescentiemicroscopie; een enzym, dat een 15 fluorescerend of gekleurd produkt geeft voor detectering door fluorescentie of lichtmicroscopie of dat een produkt met grote elektronendichtheid geeft, zodat het aangetoond kan worden door elektronenmicroscopie; of een molecuul met grote elektronendichtheid, bijv. ferritine, voor direkt zichtbaar maken met elketronenmicroscopie.

20 Als indirekte immunochemische methoden zijn te noemen het merken van het tweede antilichaam of een ander bindingseiwit, dat specifiek is voor het eerste antilichaam, met een fluorescerende kleurstof, met een verbinding met grote elektronendichtheid, met een enzym, dat een produkt geeft, dat detecteerbaar is door licht, fluorescentie of elektrönenmicros-25 copisch onderzoek of een radio-isotoop, dat detecteerbaar is door autoradiografie.

Als indirekte immunochemische methoden voor het zichtbaar maken van de antilichamen zijn te noemen toepassing van hybride primaire of secundaire antilichamen of antilichaamfragmenten (F (eb') 2)/ waarin een deel van 30 het hybride antilichaampreparaat specifiek is voor de nucleolaire antigenen (hybride primair antilichaam) of voor het primaire antilichaam (hybride secundair antilichaam) en een deel specifiek is voor een merkstof, bijv. die welke in de bovenstaande alineas genoemd zijn.

Gemerkte al dan niet geconjugeerde antilichamen kunnen af-35 zonderlijk verpakt worden in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of andere gebufferde suspendeermiddelen voor distributie als diagnostische uitrustingen. Als geschikte suspendeermiddelen zijn te noemen glycerol, heparine en saccharose. Als geschikte buffers zijn te noemen barbitalbuffers, 8007128 . - · * · = ' · - 17 - morfolinefauffers, MOPS[3-(N-morfolino)propaansulfonzuur], hepes[N-2-hydroxy-ethylpiperazine N-2-ethaansulfonzuur], Tris-carbonaat e.d.

* Λ \ r% 8007128

Claims (29)

1. Werkwijze voor het langs immunologische weg detecteren van kanker in menselijke weefselcoupes, uitstrijkjes en exfoliatieve cytolo-gische preparaten van mensen onder toepassing van antilichamen, die zijn opgewekt tegen nucleoli van kwaadaardige cellen voor mensen of extracten 5 van kernen of nucleoli van dergelijke cellen, met het kenmerk, dat men monsters in kontakt brengt met deze antilichamèn en de localisatie van deze antilichamèn in de nucleoli van kwaadaardige cellen maar niet van normale cellen aantoont.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de 10 antilichamèn opwekt tegen nucleoli, die geïsoleerd zijn uit een van de soorten kwaadaardige menselijke cellen: HeLa-cellen, carcinomen, sarcomen en hematologische neoplasmen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de antilichamèn worden opgewekt tegen nucleoli, geïsoleerd uit HeLa-cellen 15 of cellen van menselijk prostaatcarcinoom.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de anti-lichamen worden opgewekt-tegen extracten van kernen of nucleoli van kwaadaardige menselijke cellen van de soort: HeLa-cellen, carcinomen, sarcomen en hematologische neoplasmen.

5. Werkwijze volgens conclusie 4., met het kenmerk, dat de anti- lichamen worden opgewekt tegen extracten.van kernen of nucleoli van HeLa-cellen of cellen van menselijk prostaatcarcinöam.

6. Werkwijze volgens conclusies 1 en 4, met het kenmerk, dat de antilichamèn wórden opgewekt tegen extracten van kernen of nucleoli 25 van kwaadaardige menselijke cellen tegen door extractie met 0,01 H Tris HC1 met pH 7-9.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de anti-lichamen worden opgewekt tegen extracten van kernen of nucleoli van HeLa-cellen of menselijk prostaatcarcinoom.

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7,.met het kenmerk, dat de localisatie van het antilichaam wordt aangetoond door een direkte of indi-rekte immunochemische methode.

9. Werkwijze volgens conclusies t-8, met het kenmerk, dat men de immunologische detectering van kanker uitvoert met antilichamèn volgens 35 conclusie 1, door de primaire antilichamèn te merken met een of meer van de volgende merkstoffen: een radio-isotoop, dat detecteerbaar is door autoradiografie, een fluorescerende kleurstof, detecteerbaar door fluorescentiemicroscopie, 8007128 • · 1 . - 19 - een enzym, dat een fluorescerend of gekleurd produkt geeft, dat detecteerbaar is door fluorescentie of lichtmicroscopie, een enzym, dat een produkt met grote elektronendichtheid geeft, dat detecteerbaar is door elektronenmicroscopie en 5 een molecuul met grote elektronendichtheid, dat detecteerbaar is door direkt zichtbaar maken met elektronenmicroscopie.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men radio- . . . ...... 125 131 14 3 isotoop kiest uit I, I, ,C en H.

11. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men 'de 10 fluorescerende kleurstof kiest uit fluoresceien en tetramethylrodamine.

12. Werkwijzè volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men als enzym, dat een fluorescerend of gekleurd produkt geeft, dat detecteerbaar is door fluorescentie of lichtmicroscopie, peroxidase, beta-galactosidase, alkalische fofatase of cytochroom C kiest,

13. Werkwijze volgens conclusie 9,. met het kenmerk, dat het door enzym geproduceerde dichte molecuul, dat detecteerbaar is door direkt zichtbaar maken met elektronenmicroscopie, ferritine, hemocyanine, virusdeeltjes of latexbolletjes is.

14. Werkwijze volgens conclusies 1-8, met het kenmerk, dat men 20 de immunologische detectie van kanker uitvoert door indirekt immunochemisch aantonen van de antilichamen, waarbij men ten minste één gemerkt tweede antilichaam of ander bindend eiwit, dat specifiek voor de primaire antilichamen of modificaties daarvan is, toepast,

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men de 25 merkstof kiest uit fluorescerende kleurstof, een verbinding met grote elektronendichtheid en een enzym, dat een produkt geeft, dat detecteerbaar is door onderzoek met lichtmicroscopie, fluorescentiemicfoscopie of elektronenmicroscopie, en een radio-isotoop, dat detecteerbaar is door autoradiografie.

16. Indirekte immunochemische werkwijze voor het zichtbaar maken 30 van de antilichamen van conclusie 1, met het kenmerk, dat men hybride . primaire of secundaire antilichamen en/of antilichaamfragmenten ((F(ab') toepast, waarbij een deel van het hybride antilichaampreparaat specifiek is voor de hucleolaire antigenen (hybride primair antilichaam) of voor het primaire antilichaam (hybride tweede antilichaam) en een deel specifiek 35 is'voor een merkstof, waaronder een ..verbinding met grote elektronendichtheid voor aantonen met elektronenmicroscopie, een enzym dat produkten geeft die detecteerbaar zijn door licht-, fluorescentie- of elektronenmicroscopie, of een met een radio-isotoop gemerkte verbinding voor autoradiografie. 8007128 - 20 - . K I ff

17. Werkwijze voor het langs immunologische weg detecteren van kanker in menselijke weefselcoupes, uitstrijksels en exfoliatieve cyto-logische preparaten onder toepassing van gemodificeerde of gefragmenteerde antilichamen, die zijn opgewekt tegen nucleoli van kwaadaardige menselijke 5 cellen of extracten van kernen of nucleoli van dergelijke cellen, met het kenmerk, dat men monsters met deze gemodificeerde of gefragmenteerde antilichamen in kontakt brengt en de localisatie van de gemodificeerde antilichamen of antilichaamfragmenten aantoont met een van de volgende methoden: lichtmicroscópie, fluorescentiemicroscopie, elektronenmicroscópie en auto-10 radiografie met behulp van direkt en/of indirekte immunochemische middelen, waarbij de localisatie plaatsheeft in de nucleoli van de kwaadaardige menselijke cellen, maar niet in de nucleoli van normale cellen.

18. Met menselijke kankercellen verband houdende antigenen, die een hoofd- en bijspecies bevatten, waarbij het hoofdspecies de volgende . 15 eigenschappen bezit: een pi bij iso-elektrisch focusseren van circa 6,0-6,7 en een molecuulge-wicht van circa 50.000-60.000 dalton, oplosbaar in 0,01 M Tris HC1 met pH 8 en primair voorkomend in de nucleoli.

19. De hoofdantigeensoort volgens conclusie 18 in praktisch ge-20 zuiverde vorm.

20. Werkwijze ter bereiding van antilichamen met specifiteit tegen antigenen, die voorkomen in nucleoli en kernen van menselijke kankercellen, met het kenmerk, dat men niet-menselijke gastheerdieren immuniseert met de antigenen van claim 18 en de antilichamen uit het geïmmuniseerde 25 dier oogst.

21. Werkwijze volgens conclusie .20, met het kenmerk, dat men antilichamen bereidt met specifiteit tegen antigenen, die voorkomen in nucléoli van menselijke kankercellen.

22. Werkwijze voor het bereiden en isoleren van nucleolaire anti-30 genen, met het kenmerk, dat men de antigenen uit kernen of nucleoli van menselijke kankercellen'extraheert met 0,01 en Tris HCl met pH 7-9.

23. Celkernpreparaat, bevattende Tris-HCl extracten van kernen of nucleoli van menselijke kankercellen.

24. Werkwijze voor het zuiveren van nucleolaire antigenen, met 35 het kenmerk, dat men ze achtereenvolgens zuivert door neerslaan met ammonium-sulfaat, chromatografie over een DEAE-kolom, gelexlusie mét Sephadex, kationenuitwisseling en gelchromatografie met calciumfosfaat en prepara-tief iso-elektrisch focusseren.

25. Werkwijze voor het zuiveren van antilichamen, met het kenmerk, 8007128 Λ ' * S— —* • · .......... ................. - 21 - dat men antilichamen gebruikt, die verkregen zijn uit een niet-menselijk gastheerdier, waarin zij geïnduceerd zijn door immuniatie met een nucleo-*» lair antigéen.

26. Diagnostische uitrusting gekenmerkt door antilichamen, die 5 specifiek zijn tegen nucleolaire antigenen, wélke voorkomen in menselijke kankercellen en die zodanig gemerkt zijn, dat zij detecteerbaar zijn door licht-, fluorescentie- of elektronenmicroscopie, indirekte bepalingsmethoden of autoradiografie, in een gebufferd suspendeermiddel of gebufferde oplossing.

27. Diagnostische uitrusting, met het kenmerk, dat deze niet-ge- merkte primaire antilichamen bevat, die specifiteit bezitten tegen nucleolaire antigenen, welke voorkomen in menselijke kwaadaardige kankercellen, in een gebufferd suspendeermiddel of gebufferde oplossing, benevens geschikte, al dan niet gemerkte reagentia voor het detecteren van de primaire 15 antilichamen in gefixeerde menselijke kwaadaardige cellen volgens een methode gekozen uit: lichtmicrocopie, fluorescentiemicroscopie,.elektronenmicroscopie en autoradiografie.

28. Het menselijke kankercellen verband houdende antigenen, die 20 een hoofd- en nevensoort bevatten, waarbij het hoofdspecies de volgende eigenschappen bezit: een pi bij iso-elektrisch focusseren van circa 6,0-6,7 en een molecuul-gewicht van circa 50.000-60.000 dalton, dat oplosbaar is in 0,01 M Tris HCl met pH 8 en primair gelocaliseerd is in de-nucleoli, bereid volgens 25 de werkwijze van conclusie 22 of een equivalent daarvan.

29. Hoofd-antigeenspecies volgens conclusie 18 in praktisch gezuiverde vorm, bereid volgens de werkwijze van conclusie 24 of een equivalent daarvan. * i ' y • · ·*·.«· 8 0 0 7 1 2 8