NO781404L - Fremgangsmaate ved fremstilling av thymosin alfa-1 og en analog forbindelse - Google Patents
Fremgangsmaate ved fremstilling av thymosin alfa-1 og en analog forbindelseInfo
- Publication number
- NO781404L NO781404L NO781404A NO781404A NO781404L NO 781404 L NO781404 L NO 781404L NO 781404 A NO781404 A NO 781404A NO 781404 A NO781404 A NO 781404A NO 781404 L NO781404 L NO 781404L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- glu
- obzl
- bzl
- ala
- lys
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 title claims description 18
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 title claims description 18
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 title claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 39
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 24
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical class OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 claims description 10
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 9
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 9
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003354 benzotriazolyl group Chemical group N1N=NC2=C1C=CC=C2* 0.000 claims 1
- SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 2154-56-5 Chemical compound [CH2]C1=CC=CC=C1 SLRMQYXOBQWXCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 176
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 160
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 108
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 94
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 65
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 239000000047 product Substances 0.000 description 43
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 36
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 36
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- -1 tert.-butyl Chemical group 0.000 description 29
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 24
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 24
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 229910004373 HOAc Inorganic materials 0.000 description 22
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 18
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical class C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 12
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 11
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 11
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 8
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 7
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 7
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 7
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 7
- BGGHCRNCRWQABU-JTQLQIEISA-N (2s)-2-amino-5-oxo-5-phenylmethoxypentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 BGGHCRNCRWQABU-JTQLQIEISA-N 0.000 description 6
- FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N (2s)-3-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FHOAKXBXYSJBGX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- SNEHQGZSMYSVFT-DYVFJYSZSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s,3r)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxybutanoate Chemical compound O([C@H](C)[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)ON1C(CCC1=O)=O)CC1=CC=CC=C1 SNEHQGZSMYSVFT-DYVFJYSZSA-N 0.000 description 5
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 5
- KEULITJLZYZYPU-AWEZNQCLSA-N 4-o-benzyl 1-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanedioate Chemical compound C([C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)ON1C(CCC1=O)=O)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 KEULITJLZYZYPU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 5
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical class BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 5
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- NTFYOALQRQBBDG-AWEZNQCLSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxypropanoate Chemical compound C([C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)ON1C(CCC1=O)=O)OCC1=CC=CC=C1 NTFYOALQRQBBDG-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 4
- BZNDDHWTEVCBAD-BQBZGAKWSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)OC(C)(C)C BZNDDHWTEVCBAD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229960003116 amyl nitrite Drugs 0.000 description 4
- NDKBVBUGCNGSJJ-UHFFFAOYSA-M benzyltrimethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 NDKBVBUGCNGSJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 4
- PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N cyclohexylamine Chemical compound NC1CCCCC1 PAFZNILMFXTMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- POBDBYGSGKMZPH-NSHDSACASA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O POBDBYGSGKMZPH-NSHDSACASA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKGCFBNYQJDIGS-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-azaniumyl-6-(phenylmethoxycarbonylamino)hexanoate Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 CKGCFBNYQJDIGS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N ethyl (2s,5s)-5-methylpyrrolidine-2-carboxylate;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.CCOC(=O)[C@@H]1CC[C@H](C)N1 VFRSADQPWYCXDG-LEUCUCNGSA-N 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- YWLICOCXPNQJPC-KRWDZBQOSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-6-(phenylmethoxycarbonylamino)hexanoate Chemical compound C([C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)ON1C(CCC1=O)=O)CCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 YWLICOCXPNQJPC-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 2
- COMUWNFVTWKSDT-ZETCQYMHSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O COMUWNFVTWKSDT-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- WXRGJQZMGGGTSS-JTQLQIEISA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s)-4-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O WXRGJQZMGGGTSS-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- FATJLEZSGFVHQA-CABZTGNLSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) (2s,3s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O FATJLEZSGFVHQA-CABZTGNLSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006281 4-bromobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1Br)C([H])([H])* 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical class [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000003946 cyclohexylamines Chemical class 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 2
- 125000004646 sulfenyl group Chemical group S(*)* 0.000 description 2
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 2
- BDHUTRNYBGWPBL-HNNXBMFYSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-6-(phenylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 BDHUTRNYBGWPBL-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- IBABAURSJXMCQJ-QWRGUYRKSA-N (2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoyl]amino]butanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)OC(C)(C)C IBABAURSJXMCQJ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQHSSYROJYPFDV-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-1,3-dichloro-5-(trifluoromethyl)benzene Chemical group FC(F)(F)C1=CC(Cl)=C(Br)C(Cl)=C1 IQHSSYROJYPFDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VGALFAWDSNRXJK-VIFPVBQESA-N L-aspartic acid beta-benzyl ester Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 VGALFAWDSNRXJK-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- IDGQXGPQOGUGIX-VIFPVBQESA-N O-BENZYL-l-SERINE Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COCC1=CC=CC=C1 IDGQXGPQOGUGIX-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KRNYOVHEKOBTEF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 125000000746 allylic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical group C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- QRMKTNANRJCRCY-UHFFFAOYSA-N ethylammonium acetate Chemical compound CC[NH3+].CC([O-])=O QRMKTNANRJCRCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012213 gelatinous substance Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000000612 phthaloyl group Chemical group C(C=1C(C(=O)*)=CC=CC1)(=O)* 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700016958 thymosin fraction 5 Proteins 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57581—Thymosin; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
- C07K5/06043—Leu-amino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Fremgangsmåte ved fremstilling av thymosin a-^og en
analog forbindelse.
Thymosin a, er en varme stabil, sterk sur polypeptid' forbindelse med 28 aminosyre rester med følgende sekvens:
Dette peptidet som er et sterkt immunopotensierende middel blir isolert fra thymosin-fraksjon 5 av Goldstein et al. ved en komb-inasjon av ione-bytte kromatorgrafi og gel-filtrering (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 725-729 (1977)).
Foreliggen2de oppfinnelse vedrører en syntese av thymosin a, eller dets [Asn ]-analog og deres farmaseutisk fordraglige salter ved fjerning av beskyttelses grupper fra et beskyttet oktacosapeptid med sekvensen:
hvor X er Asn eller Asp(OR 2),
R er en vanlig beskyttelses gruppe for hydroksyl-gruppen i serinresten,
2 4 6
R ,R og R er konvensjonelle karboksylgruppe beskyttelsesgrupper,
3
R er en konvensjonell beskyttelsesgruppe for hydroksylgruppen i treonin og
R 5 er en konvensjonell beskyttelsesgruppe for
-aminogruppen i lysinresten,
bg om ønsket, overføre den erholdte forbindelsen i et farmaseutisk fordrage! i.g salt.
Eksempler på Rx er ben syl, acetyl, benzyl,tert.-butyl, trityl,4-brombenzyl,2,6-diklorbenzyl og benzyloksykarbonyl hvor benzyl er foretrukket. Eksempler på R 2 ,R 4 , R 6 er arylgrupper, spesielt fenyl eller fenyl substituert med en lavere alkyl, halogen, nitro, markapto eller substituert merkapto som metyltio,aralkylgrupper som benzylgrupper eller benzyl substituert med metoksy, halogen eller nitro, lavere alkylgrupper som.metyl, etyl,tert.-butyl.og tert.-amyl, substituerte lavere lakylgrupper som 2-halogenetyl, 3, (3-dimetylaminoetyl og cyanometyl, benshydryl og f enacylgrupper
3 hvor benzyl er foretrukket. Eksempler på R er benzyl, acetyl, benzoyl,•tert.-butyl, trityl,2,6-diklorbenzyl,4-brombenzyl og benzyloksykaronyl hvor benzyl er foretrukket. Eksem' pler på R<5>er benzyloksykarbonyl som eventult kan være substituert i den aromatiske ringen, som ved 4-klor, . 2-brom, 4-brom, 2,4-diklor, 4-nitro, 4-metoksy, 3,5-dimetoksy,4-metyl, 2,4,6-trimetyl, 4-fen-ylasy,4-(4-metoksyfenylso), 2-(N,N-dimetylkarbamido) og 2-nitro-4,5-dimetoksy, uretantype beskyttelsesgruppe som 4--toluensulfon yloksykarbonyl,9-fluorenymetyloksykarbonyl og beslektede base-avspaltbare grupper, 5t;benzisoxazolylmetylenoksykarbonyl ,metyltio-og metylsulf onuletuloksykarbonyl, isonikotinyloksykarbonyl, halo-, etyloksykarbonyl,diisopropylmetyloksykarbonyl, benzhydryloksy-karbonyl, isobornyloksykarbony1, dinitrodifenylmetyldksykårbonyl, tert.-butyloksykarbonyl, tert.-amyloskykarbony1, adamantyloksy-karbonyl,cycloheksyloksykarbonyl, metylcyclobutyloksykarbonyl, metylcycloheksyloksykarbonyl,2-arylisoprpyloskykarbonyl grupper som2-(p-bifenylyl)-isopropyloksykarbonyl, 2-(4-pyridyl)-isopropy-•loksykarbonyl og beslektede nitrogenholdige uretan-grupper, acyl-grupper som formyl, triflouracetyl,ftaloyl, benaensulfonyl,klor-acetyl,2-nitrobensoyl>4-toluensulfonyl, sulfenylgrupper som benz ensulfenyl,o-nitrofenylsulfenyl og beslektede sulfenylgrupper, og aryl lavere alkylgrupper som difenylmetyl og trifenylmetyl hvor benzyloksykarbonylgruppen er foretrukket.
Fjerning av beskyttelsesgruppen fra det beskyttede aktakosapeptidet med sekvens I utføres lett ved i og for seg kjente metoder som f.eks. ved behandling med vann-fri syre som hydrogenflorid,for-
I
trinnsvis i nærvær av anisol.
Ifølge foreliggende oppfinnelse kan det beskyttede oktakosapeptid i denne sekvens I syntetiseres ved kondensasjon av et beskyttet tetradecapeptid med sekvensen
med et beskyttet tetradecapeptid med sekvensen
hvor X,,,,,og R^ er som ovenforangitt
7
og R er hydrogen eller en aktiverende gruppe.
Den forannevnte koblingsreaksjonen kan.utføres ved å anvende velkjente fremgangsmåter innenfor oppløsningsfase peptidsyntesen. Således kan f.eks. amino terminal tetradekapeptidet omsettes med en hydroksy benzotriazole (HOBT) og dicycloheksylkarbodiimid (DCC) for å gi den aktiverte esteren som så omsettes med karboksyl terminaltetradekapeptidet for å gi det ønskede oktacosapeptidet i beskyttet form.
De beskyttede tetradecapeptidene kan fremstilles ifølge velkjente metoder.
Systemet som ble anvendt i den kjemiske syntese av det beskyttede karboksyl terminalede tetradecapeptide III [X=Asp(OBzl)]
var som følger: ■
H-Glu(OBzl)-0H ble først koblet med Boc-Ala-OSu hvilket gav det beskyttede dipeptid fragmentet Boc-Ala-Glu(OBzl)-0H som så ble kondensert med HCL • H-Asn-OBzl via DCC/HOSu prosedyren til Wiinsch and Drees, Chem. Ber. 9>9,110 (1966).
Hydrokloridsaltet til aspargin benzylester ble fremstilt fra Boc-Åsn-OBzl som igjen ble suntetisert fra handelsvare Boc-Asn-OH i(Dg ' benzylbromider ved bruk av cesiumsaltet av aminosyren. Boc-beskyttelsesgruppen ble fjernet ved en 30's behandling méd 4N HC1 i tørt THF.
Reaksjonen mellom H-Glu(OBzl)-OH og Boc-Glu(OBzl)-OSu gav Boc-Glu (OBzl).-Glu (OBzl)-OH som en fargeløs klar olje. Den ble så
brukt i syntesen av det beskyttede pentapeptid Boc-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Asn-OBzl i en DCC/HOSuindirekte fragment kondensasjon ved bruk av HC1 ' H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl som stammet fra Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBZl etter 4N HC1/THF behandling. - Det forannevnte beskyttede pentapeptid ble oppnådd i gode utbytte som krystalinsk rent materiale.
For fremstillingen av det beskyttede octapeptidet Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, ble det det nødvendige beskyttede tripeptidet Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH først fremstilt. Boc-Val-OSu fikk reagere med fritt valin hvilket gav Boc-Val-Val-
OH som etter avblokering med 4N HG1 i THF fulgt av omsetning med Boc-Glu(OBzl)-OSu gav det ønskede tripeptid som ble krystalisert
som cycloheksylamin salt Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH • CHA. Sykloheksylaminsaltet ble overført i den frisyren og ble så kob-
let med DCC i nærvær av HOSu til HC1 • H-Glu-(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl) -Asn-OBzl som stammet fra Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl) -Asn-OBzl ved behandling med HC1 i THF. Det beskyttede octapeptidet Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl erholdtes i renset form som et amorft faststoff. Beskyttelsesgruppen ble fjernet hydrogenolytisk etterfulg av behandling med • triflouredikksyre på vanlig måte som gav det frie octapeptidet Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn. Dette produktet ble renset ved ione-byttekolonne kromatorgrafi for å gi et tynnskikt-kromatograf-isk papirelektroforetisk homogent materiale.
For syntesen av det beskyttede undecapeptidet Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(Obzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, ble det nødvendige tripeptid fragmentet syntetisert utfra Boc-Lys(Z)-OSu og H-Lys(Z)-OH. Dipeptidet Boe- Lys(Z)-Lys(Z)-OH som således erholdtes ble behandlet med 4N HC1 i THF og det dannede salt HCl' H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH fikk så reagere med.Boc-Glu(OBzl)-OSu hvilket gav det ønskede tripeptid Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH. Tripeptidet ble så aktivert med DCC og HOSu ifølge Weygand et al.,
I
Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966), og løsningen av den aktive tripeptidester Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu fremstilt in situ kombinert med trifluoracetatetsaltet H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(Obzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl som stammet fra det tilsvarende blokerte octapeptidet'ved en 30 min behandling med TFA. Etter tilsetning av en liten mengde av en base ble det ønskede beskyttede undecapeptidet Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu (OBzl ) -Glu (OBzl) -Ala-Glu (OBzl ) -Asn-OBzl således erholdt. Fjerning av beskyttelsesgruppen i det beskyttede undecapeptidet Boc-Glu (OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl)-Asn-OBzl med vannfri fluss-syre gav det free undecapeptidet Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn som var homogent ved papir elektroforese etter ione-bytte kolonne-kromatografi.
Syntesen av det beskyttede tetradecapeptide fulgt et lignende skjema. Boc-Leu-OSu ble koblet med H-Lys(Z)-OH hvilket gav Boc-Leu-Lys(Z)-OH .. Etter fjerning av Na<->Boc-gruppen med 4N HC1 i ThF og omsetning med Boc-Asp(OBzl)-OSu erholdtes detbeskyttede tripeptidet Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH som et krystalinskrent fast stoff. Det ble overført i den aktive esteren Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys (Z) -OSu og kondenser med trifloracetatsaltet av H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Asn-OBzl som erholdtes fra TFA-behand.ling av det tilsvarende blokerte undecapeptidet. Det ønskede produktet Boc-Asp(OBzl)-Leu^LYs(Z)-Glu (OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Asn-OBzl erholdtes i godt utbytte. Tynnskikt kromatofrafien indikerte at produktet var homogent. Det fri tetradecapeptide Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn erholdtes fra den beskyttelde forbindelsen ved behandling med vannfri fluss-syre og rensning på ione-bytter kolonne.
På en lignende måte ble det beskyttede amino terminalet tetradecapeptidet H3C-Co-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH sammensatt fra et acetyl tetrapeptid-fragment, et heksapeptid, og et annet tetrapeptid ved å bruke veikjentefremgangsmåter innenfor peptidsyntese-området. For syntesen av det aminoterminale acetyltetrapeptidet, ble H3C-Co-Ser(Bzl)-OBzl fremstilt fra H3C-CO-Ser(Bzl)-OH og benzylbromidet via sesiumsaltet av aminosyren. Hydrasinalyse av H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl gav H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH som et rent kryst alinsk fast-stoff i godt utbytte. Deblokering av Boc-Ala-Ala-OH gav dipeptidhydrokloridsaltet HC1 • H-Ala-Ala-OH. Kobling av dette dipeptidet med Boc-Asp(OBzl)-OSu gav det beskyttede tripeptid Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH som ble isolert som dicykloheksyl aminsaltet. Fjerning ,av aminobeskyttelses gruppen og kondensajon-en med H^C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 via asidmetoden til Honzl and Ruding-er, Collection Czech. Chem.Commun. 2_6 , 2333 (1961), gav det part-sielt beskyttede tetrapeptidet H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH som et reaksjon ved ekvivalente mengder hydrasin behandlet med DGC i nærvær av HOBT gav det ønskede mellomprodukt H3C-CO-Ser(Bzl)-.Asp(OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 .
For syntesen av det beskyttede hektapeptidet Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH2, ble en fremgangsmåte som omfattet trinnvis forlengelse av peptid-kjeden fra den C-terminale ende anvendt. Således ble H-Glu(OBzl)-OH koplet med Boc-Ser(Bzl)-OSu for å gi det'beskyttede dipeptidet Boc-Ser(Bzl)-Glu (OBzl)-OH som ved fjerning av Boc-gruppen og vidre omsetningmed Boc-SEr (Bzl)-OSu gav tripeptidet Boc-Ser (Bzl)-Ser (Bzl)-Glu (OBzl.)-OH. Deproteksjon av en aminogruppe etterfulgt av kondensasjon av det reulterende tripeptidsaltet HCl.'H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH
med Boc-Thr(Bzl)-OSu gav det beskyttede tetrapeptide Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH som ved behandling HC1 i THF fjernet Boc-gruppen og vidre omsetning med Boc-Asp(OBzl)-OSu resulterte i dannelsen av det beskyttede pentapeptide Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH.. Boc-gruppen i denne forbindelsen ble fjernet ved HCl-behandling og det dannede produktet HC1 • H-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH ble så koblet tilBoc-Val-OSu hvilket gav Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH som et krystalinsk rent materiale.
a-karboksylgruppen på den terminale glutamin-syreresten i det forannevnte heksapeptidet ble så spesifikk overført til hydrasid-funksjonen ved omsetning med en ekvivalent mengde hydrasin ved bruk avDCC som koplingsreagens i nærvær av HOBT. Det ønskede beskyttede heksapeptidhydrasid Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser (Bzl)-Ser(Bzl)- Glu(OBzl)-HNNH2ble isolert som rent krystalinsk faststoff i et tilfredstillende utbytte.
For syntesen av det beskyttede tetrapeptid Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr '(Bzl)-Lys (Z)-OH ble en lignende trinnvis fremgangsmåte anvendt i
ved bruk av den N-hydroksysuccinimid aktive ester fremgangsmåten til Anderson et al.,J.Amer. Chem. Soc. 8j5 , 1839 (1964 ). Reaksjonen mellom Boc-Thr(Bzl)-OSu og H-Lys(Z)-OH gav dipeptidet Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH som en olje som ble deprotektertpå a-amino enden og fikk reagere med Boc-Thr(Bzl)-OSu hvilket1 gav tripeptidet Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH som et krystalinsk faststoff. Fjerning av Boc-gruppen og omsetning av det resulterende materiale HC1 • H-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z).OH medBoc-Ile-OSu gav det ønskede beskyttelde tetrapeptid Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH
som en krystalinsk ren forbindelse etter kromatografi på en kisel-gelkolonne. Dette tetrapeptid-fragmentet ble så deprotektert på aminoenden og kondensert med det beskyttede heksapeptidet Boc-Val-Asp (OBzl) -Thr (Bzl) -Ser (Bzl) -Ser (Bzl) -Glu (OBzl) -HNNH2 ved azid-metoden. hvilket gav det beskyttede decapeptidetBoc-Val-Asp(Bzl) hr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)_
OH i godt utbytte..
Fjerning av Boc-gruppen fra decapeptid forbindelsen med TFA og etterfølgende kobling med N-terminale tetrapeptid Ac-Ser(Bzl)-Asp Obzl)-Ala-Ala-HNNH2ved acid fremgangsmåten resulterte i dannelsen av det ønskede beskyttede tetradecapeptidét H^C-CO-Ser(Bzl)-Asp (OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(/Bzl)-Thr(Bzl)-SEr(Bzl)-Ser(Bzl).Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr)Bzl)-Lys(Z)-OH. For den endelige kopling ble dette acetyl tetradecapeptid aktivert med DCC og HOBT og den dannede aktive ester fikk så reagere med TFA H-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-LYs(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(Obzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-Obzl som var fremstilt fra den tilsvarende blokerte forbindelsen ved behandling med TFA hvilket gav det beskyttede acetyl-oktakospeptide H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(QBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr- (Bzl) -Ser (Bzl) -Ser (Bzl) -Glu (OBzl) -Ile-Thr (Bzl) -Thr (Bzl) -'•Lys (Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-GluOBzl)-Asn-OBzl. Behandling med vannfritt HF fjernet alle beskyttelsesgruppene og rensing og ione-byttekronomatografi gav thymosin a^.
På lignende måte fikk man fra det beskyttede tetradecapeptide H3C-CO-Ser(Bzl)-AspOBzlj-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH det fri tetra-
I
decapeptidet H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OI-I.
Syntesen av [Asn 2]-thymosin a, fulgte det samme skjema som syntesen avtymosin a^. Alle mellom produktene som ble brukt var de samme bortsett fra det N-terminale acetyl tetrapeptidhydrasidet H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2. For syntesen av denne forbindelsen ble Boc-Ala-Ala-OH først overført til Boc-Ala-Ala-OBzl som ved selektiv fjerning av Boc-gruppen med HC1 gav dipeptidseter-saltet HC1"H-Ala-Ala- OBzl. Dipeptidet ble så koblet med Boc-Asn-OH ved bruk av DCC/HOBT - metoden til Konig and Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970), hvilket gav det beskyttede dipeptidesteren Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl som ble behandlet med HCL i THF for å fjerne Boc-gruppen. Det reulterende produktet HC1■Asri-Ala-Ala-OBzl ble så kondensert (DCC/HOBT-metoden) med H3C-CO-Ser(Bzl)-OH •DCHA hvilket gav det ønskede tetrapeptidet H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl.
Det tilsvarende hydrasinet H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH^erholdtes i godt utbytte ved hydrasinolyse av denne forbindelsen. Fragment-kondensasjonen mellom hydrasidet og decapeptidet TFA H-Val-Asp(OBzl)-thr(Bzl)-Ser(Bzl)-SEr(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH fra det beskyttede tetradecapeptidet H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(/Bzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH. Denne forbindelsen ble så koblet til det deblokerte C--terminalet tetradekapeptide TFA-sal tet som er ovenfornevnt og gav det tilsvarende beskyttede [Asn 2]-thymosin ci£ Fjérning av alle beksyttelses-gruppene ved behandling med vannfri HF fulgt av kolonneione ione-bytte kronomatografi-rensing gav det
2
ønskede [Asn ]-thymosin mens den samme metoden med det beskyttede tetradecapeptidet H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH gav det acetylerte tetradecapeptidet H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH.
I et vidre aspekt av foreliggende oppfinnelse er det funnet at flere av mellomprodukt peptidene som brukes i ovenfornevnte syntese av thymosin og [Asn 2]-thmosin a, har aktivitet ved regul-ering og diffrensiering og funksjon av T-celler, nemlig
Thymosin a.^ [Asn 2]-thymosin eller de foran-nevnte nye okta-, undeca- eller tetradecapeptider som danner en del av foreliggende oppfinnelse og deres farmaseutisk fordraglige salter kan gis til varmblodige pattedyr ved partenteral applikasjon enten intraven-øst ,subkutant eller intramuskulært. Disse forbindelsene er sterke immunopotensierende middler ved en daglig dosering i om-rådet fra ca 1-100 mg/kg.kroppsvekt pr dag ved intravinøs administrering. Åpenbart vil den nødvendige dose variere med den spesielle tilstanden som behandles, tilstandens grad og behandling-ens varighet. En egnet doseringsform for farmaseutisk anvendelse er et 1 mgl lyofilisert thymosin a^, [Asn 2]-thymosin a, eller et av de forannevnte peptidfragmenter derav' som skal rekonstitueres før bruk ved tilsetning av sterilt vann eller saltvann.
Også omfattet av rammen for foreliggende oppfinnelse ligger de farmaseutisk fordraglige salter avthymosin..a^ , [Asn 2]-thymosin og de forannevnte pe<p>tidfragmenter derav. Egnede salter omfatter natrium og kaliumsaltene eller saltene med sterk organisk base som guandin. Dertil kan parrionene til disse kationene slik som klor, bromid, sulfat, fosfat, meleat, acetat, citrat, benzoat, succinat, nalat, ascorbat o.l., innbefattes i fremstillingen..
Forkortelsene som brukes heri har følgende betydning: Boc=t-butyloksykarbonyl; Bzl=benzyl;DCC=dicycloheksylkarbodimid; DMF-dimetylformamide; THF=tetrahydrofuran; HOSu= N-hydroksysuccin-imide; Triton B=40% metanolløsning av trimetylbenzylammonium hyd-roksyd; NMM=N-metylmorfolin; CHA=cycloheksylamin; DCHA=dicyclohe-ksylamin; Z=benzyloksykarbony1; DMSO=dimetylsulfoksid; TFA=tri-fluoracetik syre; TLC= tynt lag kromatografi; Et3N=trietylamin; HOBT=l-hydroksybenzotriazole.
be følgende eksempler beskriver i detalj syntesen av thymosin i og [Asn 2]-thymosin a]_-
Selvom spesifikke beskyttelsés grupper har blitt anvendt i be-skrivelsen av syntesen av thymosin og [Asn 2]-thymosin vil det være åpenbart for enhver fagmann å anvende ekvivalente beskyttelsesgrupper i sådanne synteser.
I
Eksempel 1
A.a) Boc-Asn-OH (11.0 g,47.5 mmol) ble oppløst i 200 ml MeOH og
20 ml vann ble tilsatt. Løsningen ble titrert til pH 7,0 med en 20 % vanndigløsning av Cs-jCO^(ca. 55 ml). Blandingen ble inndampet til tørnet og resten ble fordampet 2 ganger fra DMF (120 ml hver, 45°C). Det erholdte faste hvite stoff ble så rørt med 8,9 g benzylbromid (52 mmol) i 120 ml DMF i 6 timer. Ved inndampning
til tørhet og behandling med et stort volum vann, ble produktet øyeblikkelig fast. Det ble oppsamlet ved filtrering , oppløst i etylacetat, vasket med vann, tørket over Na^SO^, inndampet til en fast masse og krystalisert fra et etylacetat med petroleter. Utbyttet 13.8 g (90,3 %) av Boc-Asn-OBzl; m.p. 120-122°C; [ct]p<5>= -17,29° (c=l,DMF) .
Boc-Asn-OBzl (13.7 g, 42,4 mmol) ble oppløst i 80 ml THF og behandlet med 500 ml 4N HC1 i THF. Blandingen fikk stå 45 min. hvorunder noe produkt begynte å utfelles. Ved behanling med 1000 ml eter ble et hvitt faststoff øyeblikkelig dannet. Produktet ble filtrert,.vasket med eter og tørket over NaOH-pellets i våkum. Utbyttet: 10.3 g (94 %) av HC1'H-Asn-OBzl; m.p. 122-126°C; [a]^<5>= +6.82°.
b) H-Glu(OBzl)-OH (7.0 g, 29.5 mmol) ble finknust med en morter og så rørt med 8,88 g (32.3 mmol) av Boc-Ala-OSu i 48 timer i
250 ml D11F i nærvær av 6 mlNMM. Noe mer enn NMM ble tilsatt for å holde reaksjonen svakt basisk under reaksjonen. Løsningsmiddel-et ble avdampet og resten fordelt mellom 300 ml etylacetat og 500 ml H20 som inneholdt 2 ml av 10% H2S04*Det organiske skiktet ble så vasket 3 ganger med vann, tørket over Na2S04og inndampet til'tørhet. Produktet ble tatt opp i et lite volumeter og behandlet med et stort volum Petroleter. Et hvit amorft faststoff ble erholdt som var homogent i TCL. Utbyttet:11,0 g(91.5%) av . Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH;m.p. 84-88°C; ta]^<5>= 8,08°(c=l,DMF.
Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH (10.4 g,25.4 mmol), HC1 • H-Asn-OBzl(6.56 g, 25.4 mmol) og HOSu (5.9 g,50,8 mmol) ble oppløst i DMF (250 ml, 0°C). DCC (5.7 g,27.6 mmol) ble tilsatt umidelbart etterfulgt av Et3N (3.5 ml). Blandingen ble rørt ved 0°C i to. timer og så ved 25°C i 40 timer hvorunder noe mer Et^N. ble tilsatt fra tid til annen for å holde reaksjonen svakt basisk. De uløslig dannede biproduktene ble frafiltrert og filtratet inndampet- til tørhet. Det resterende oljeaktige materiale størknet ved behandling av vann. Rå-produktet ble tatt opp i CHCl^og vasket med vann (3x), tørket over en Na2SO^og inndampet. til et mindre volum. Noé faststoff som.ble dannet på dette trinnet ble frafiltrert (sterkt forurenset med dicycloheksylurea) og filtratet behandlet med petroleter. Et krystalinsk produkt ble erholdt. Utbytte: 8.0 g (51.4 %) avBoc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl); m.p. 102-105°C; [a]^<5>12.5°(c=l,DMF.
c) H-Glu(OBzl)-OH (4.74 g, 20 mmol) ble knust i en morter og rørt med Boc-Glu(OBzl)-OSu (0.7 g, 20 mmol) i DMF i 36 timer i
nærvær av 3.6 ml NMM. Den dannede løsningen ble inndampet til en sirup og behandlet med vann. Det oljeaktige pepitatet ble tatt opp i etylacetatet, vasket suksesivt med 5% HOAc og vann (3x) , tørket over Na2SO^og inndampet til tørhet hvilket gav 14.03 g av en klar olje. Den fikk stå under petroleter. Den resterende oljeaktige Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH veide lo.2 g (90%). TLC
25 o
indikerte at produktet var homogent. q = -7-59 (c=l,DMF).
d) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl) (28.2 g; 46 mmol ble behandlet med 1.1 liter 4N HCl i THF i 1 time. Avdampning av løsningsmidd-el og overskuddsyre etterlot en olje som ble inndampet 2 ganger til med friskt THF. Restoljen gikk over til et faststoff ved behandling av et stort volumeter. Det faste HCl • H-Ala-Glu (OBzl)-Asn-OBzl ble rørt med Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH 825,6 g, 4 6 mmol) ,HOSu (10.6 g, 92 mmol) og DCC 810,9 g 5 3mmol). i DMF (54 0 ml) ved 0° i en time og så ved 25° i 48 timer. Et^N ble tilsatt for å holde reaksjonen svakt basisk over hele tidsrommet (ca. 16 ml Et^N totalt). De uløslige biproduktent som ble dannet ble frafiltrert og filtratet inndampet til tørhet. Rå-produktet ble oppløst i CHCl^, vasket med vann (3x), tørket over en Na2SO^
og inndampet itl tørhet. Produktet ble fast ved behandling ved petroleter. Omkrystalisasjonen fra isopropanol gav 28.9 g(59.8 %) av Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(obzl)-Asn-OBzl;m.p. 169-175°C; [a]^<5>=-11.78° (c=l,DMF).
■Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (3.9 g,3.48 mmol)
ble behandlet med 15 ml 4N HCl i THF i 30 min. Noe krystalinsk produkt startet og dannes. Eter (210 ml) ble tilsatt.og det felte fastestoff oppsamlet og vasket med eter. Rå-materialet ble krystalisert fra MeOH og eter. Utbyttet: 2.53 g(75.1 %) av HCl-H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl: m.p. 14 8-151°C:
[a]p<5>=-3.65° (c = 1, DMF).
e) Boc-Val-OSu (12.6 g,40 mmol) og H-Val-OH 84.68 g,40 mmol) ble kondensert i DMF 8250 ml) i 96 timer i nærvær av 2 ml Et^N.
Mer Et^N ble tilsatt ved behov for å holde reaksjonen svakt basisk Det resterende uløslige materiale ble fra filtrert og filtratet inndampet til tørhet (45°C). Resten ble fordelt mellom eteren og fortynnet H2S04(ca. 1%) og det organiske skiktet vasket med vann (3x), tørket over en Na2S04og inndampet til en.skummet glatt masse. Produktet ble krystalisert fra eter dg petroliumeter. Utbyttet: 12.2 g(96.4%) av Boc-Val-Val-OH; m.p. 155-158°C; [ct]^<5>= +1.lo° (c = 1, DMF).
Boc-V<p>J.-Val-OH (40,5 g, 128 mmol) ble behandlet me'-"' 1,8 1 av.
[N HCl i THF i 60 min. Inndampning for å fjerne overskuddet av syre og løsningsmiddel etterfulgt av behandling med eter gav 34,5 g HCl •H-Val-Val-OH som et hvitt amorft pulver. Det ble behandlet med Boc-Glu(OBzl)-OSu (55,6 g, 128 mmol) i en liter DMF i 24 timer i nærvær av 54 ml Et^N. Reaksjonsblandingen.ble filtrert for å fjerne noe uløslig materiale og filtratet inndampet til tørrhet. Den gjenværende oljeaktive rest ble opptatt i EtOAc (1.5 1) og vasket med 5 % HOAc (2x) etterfulgt av vann (3x) ..
Det organiske skiktet ble tøket (Na2SO^) og inndampet til tørr-het og gav en fargeløs klar olje som ikke krystaliserte. Den ble så oppløst i 3,2 1 eter og behandlet med CHA (17 ml) inntil blandingens pH var 7.5. De.t faste erholdte salt ble oppsamlet og omkrystalisert fra MeOH og eter. Utbyttet: 58.9 g (72.7%)
av Boc-Glu (OBzl)-Val-Val-OH CHA; m.p. 158 - 160°C; [a]^<5><=>33,4.1°
.(c = 1, MeOH) .
Boc-Glu(Obzl)-Val-Val-OH \ CHA (1.69 g, 2 66 mmol) ble opp-, slemmet i vann (40 ml) og etylaminacetat (40 ml), i en skille trakt under tilsetning av 4 ml 1 M H^SO^. Etter kraftig røring bppiøste det faste stoff og det organiske skiktet ble vasket flere ganger med vann, tørket over Na^GO^og inndampet til en ' olje 81,45 g). Det således erholdte fri tripeptridet ble så kondensert med 2.58 g HCl • H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (2.61 mmol) i 15 ml DMF i nærvær av HOSu (0.612 g.5.32 mmol), NMM (0,3 ml,2.66 mmol) og DCC (o,63 g, 3,06 mmol) i løpet av en time ved 0°C og 60-timer ved 25°C. Mer enn NUM ble tilsatt ved behov for å holde reaksjonen svakt basisk. Et uløslélig dannet bi-produkt ble frafiltrert og filtratet inndampet til tørrhet (45°C). Den gjenblivende oljeaktivresten størknet ved behandling med vann. Det faste rå-produktet ble oppløst i DMF (50 ml) og felt med MeOH (300 ml) Utbyttet : 2.25 g 358.7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl; m.p. 277-280°C [a]^5 =-12.43° (c = 1, DMF).
Dette produktet (0,72 g, 0 49 mmol) ble hydrogenert over 15% Pd/ BaSO^(0,5 g) i 3 timer, ved 3.4 atm i en blandina av 4 0 ml DMF/30 ml MeOH/ 2 ml H^O. Blandingen ble så filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Det ble deretter behandlet med 5 ml' TFA i 3 0 min. og den erholdte rest etter avdampning av syren . ble revet flere ganger med eter. Det dannede faste stoffet ble tatt opp i vann (20 ml) og lyofilisert og gav 0,47 g rå-produkt. Forbindelsen ble satt på en 3 x 32 cm kolonne av et sterkt basisk polysterenharpiks (Bio-Rad AG1-X 2) som var ekvilibrert med pH 8.1 ammoniumacetat buffer (2% HOAc innstilt på pH 3.1 med NH^) .. Kolonnen ble eluert suksesivt med 200 ml av o,o25 M pH 5.5 NH4OAc,0.025 m HOAc, 0,05 M HOAc, 0,25 M HOAcm 0,5 M HOAc, 0,75 M HOAc, IM HOAc. Fraksjoner nå 12 ml ble oppsamlet og eluatet fra hvert rør undersøkt ved TLC. Fraksjonene som inneholdt det ønskede materialet (rørne 225-229) ble slått sammen og lyofilisert 2 ganger og gav 0,223 g (48.1%) av ren Glu-Val-Val--Glu-Glu-Ala^-Glu--Åsn som var homogent i TLC og papir elektroforese.
f) Boc-Lys(Z)-OH (15 g, 39.5 mmol) ble rørt med HOSu (5.3 g, 50.5 mmol) og 8.66 g, 42 mmol) i THF (250 ml) i tre
timer. Et uløselig biprodukt ble frafiltrert og filtratet inndampet til tørrhet,. Den gjenværende sirup (24,2 g) ble behandlet med iso-propanol (150 ml), og petroleter (150 ml)' aav et olje aktivt produkt (21.g ) som ikke krystaliserte. Den 1!
'{rå aktive esteren Boc-Lys (Z)-OSu ble således brukt for kondensasjon med K-Lys(Z)-OH (10,6 g, 33 mmol) i DMF (250 ml) i 72 timer i nærvær av 5.5 ml Et. Mer Et^N ble tilsatt ved leilighetsvis for å holde den røret reaksjonsblandingen svakt basisk.
En liten mengde uoppløst materiale ble så frafiltrert og filtratet inndampet til tørrhet (45°C). Den tilbakeblivende olje-resten ble behandlet med 1,5 ml 5 % HOAc. Det utfelte produktet ble ekstrahert over i et etylacetat og den organiske fasen vasket "med vann, tørket over en Na^SO^og inndampet til en olje. Den ble krystalisert fra etylacetat (300 ml) som inneholdt DCHA
(10 ml) som et salt. Omkrystalisasjonen fra MeOH og eter gav 22.7 g (72.5 %) av Boc-Lys (Z ) -Lys (Z) -OH * DCHA; m.p.' 160 - 162°C;
[a]^<5>= - 2.21° (c = l,MeOH).
Boc-Lys (7.) -OH DCHA (10. g, 12.14 mmol) ble fordelt mellom EtOAc•(1 liter) og'0,1 N H?S04(1 liter). Det or<q>ansiske skiktet ble så vasket.med vann (3x), tørket over et Na2SO^og inndampet til tørrhet (7.9 g). Den frisyren, Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH som således erholdtes ble behandlet med friskt fremstilt
4N HCl i THF i 3 0 minutter. Løsningsmiddelet oa syre-overskudd. ble avdampet (30°C) og resten refordampet 2 ganger med THF.
Den tilbakeblivende rest størknet ved behandling med eter. Salt et HCl•H.Lys(Z)-Lys(Z)-OH ble oppsamlet ved filtrering og vasket flere ganger med eter og gav 6.7 g hvitt pulver. Det ble opp-løst i DMF (70 ml), kjølet i is-bad og behandlet med Et^N (1.63 ml) fulgt av Boe- Glu(OBzl)-OSu (5.54 g, 12.76 mmol). Blandingen ble rørt. i 0°C i en time og så ved 2 5°C i 2 4 timer. Mer Et-jN ble tilsatt i løpet av denne tiden for å holde reaksjonen nær pH 7.5. Noen ml eddiksyre ble tilsatt for å surgjøre reaksjonen (pH 3.,5) og løsningsmiddelet fjernet ved inndampning. Den dannede resten ble tatt opp i EtOAc, vasket med. vann (3x), tørket over Na2SO^ og inndampet til tørrhet hvorved produktet begynte og bli fast. Det ble revet i eter og rekrystalisert fra etylacetat. Utbyttet: 7.26 g (69.5 %)• av Boc-Glu(OBzl)-Lys (Z)-Lys (Z)-OH; m.p. 153 - 155°C; [a]p<5>= -2.71° (c = 1, THF..
g) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl)-Asn-OBzl (1.7 g, 1.16 mmol ble behandlet med TFA (24 ml)
i 3 0 minutter. Etter fordampning av syre-overskudd (3 0°c) ble j
ires t-en revet med eter. Det erholdte pulveret ble vasket grundig, med eter og petrol-eter og tørket overNaOH i våkum og gav tri-fluouracetatsaltet av oktapeptidet (1.71 q). Den aktive ester Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu ble så fremstilt in situ ved
å røre Boe—Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH (0.993 g. 1.16 mmol), HOSu (0.16 g, 1.4 mmol) og DCC (0,274 g,1.33 mmol) i 15 ml DMF
i 0°C i 3 timer. Denne løsningen som inneholdt den aktive tri'
-peptid-ester ble tilsatt octapeptid-saltet CF3COOH•H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)- Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (1.71 g) sammen med 0,2 ml Et. Noen flere dråper F,t3N og DMF (15 ml.)
ble tilsatt og blandingen rørt 3 dager ved 25°C. En gelaktig halvfast-masse oppstod. Den ble surgjort ved eddiksyre og behandlet med vann. Det hvite faste.presipitat ble oppsamlet og vasket. (H?0,MeOH, eter) og gav 2,2 5 g råprodukt som ble smeltet ved 310-313°C. Det ble op<p>løst i DMF og felt med MeOH. Utbyttet: 1.75 g (63.3 %) av Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ala-Glu (OBzl) --Asn-OBzl; m.<p>.314-316°C; 2 5 o [a]D = 13.63 (c =1, DMSO); homogeneous i TLC. Boc-Glu (OBzl) -Lys (7.) -Lys (Z) -Glu (OBzl) -Val-Val-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(Obzl)-Asn-OBzl (0,5 g, 0,226 mmol), ble o<p>pløst i 2 ml TFA og rørt med 15 ml HF ved 0°C i 15 min. Etter avdampning av syre-overskudd (0°C), ble resten oppløst i 5 % vandig HOAc, vasket med eter (3x), inndampet til et lite volum og leofylisert og gav o,34 g rått produkt. Det ble kromato-grafert på ionebytte-kolonnen som er beskrevet ovenfor for oktapeptid og gav 0,13 g (42.1%) av ren Glu-Lys-Lys-Clu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn; [a]^<5>-85.65° (C = 1, H?0).
h) Boc-Leu-OSu (4.0 g, 12 .. 2 mmol) og H-Lys (Z)-OH (3.42 g, 12.2 mmol) ble kondensert i DMF (75 ml) i løpet av 48 timer i
nærvær av Et3N (1,7 ml). Reaksjonsblandingens pH ble holdt ved 7.5 ved tilsetning av Et3N periodisk som vanlig. Det gjenværende uløslige materiale ble frafelt og filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Den dannede skumaktige -glassmassen ble oppløst, i eter (2 00 ml) og blandingen behandlet med 3 ml DCHA for å gi
krystalinsk materiale som ble oppsamlet vasket med eter og omkrystalisert fra MeOH og eter. Utbyttet: 5.7.g (69.5%) av Boc-Leu-Lys(Z)-OH-DCHA; m.p. 140-142°C; [a]^<5>= -7.20° (c = l.MeOH). i i'
3oc-Leu-Lys(Z)-OH-DCHA (2,97 g, 4.4 mmol) ble overført i den fri-syren (fordelt mellom EtOAc og 0,1 N H7S0^) og den erholdte fargeløse olje (2,2 g) ble behandlet med 4N HCl i THF (40 ml)
i 30 min. Syre overskuddet og løsningsmiddelet ble fordampet (30°C) og resten behandlet med eter. Den gjenblivende oljen
ble oppløst i eteret og inndampet 2 ganger mer med friske eter. Resten ble så rørt med Boc-Asp(OBzl)-OSu (1.85 gr 4.4 mmol) i nærvær av Et3N (1.85 ml) natten over. Reaksjonsblandingen ble så inndampet til tørrhet og gav en oljerest som ble tatt opp i etylacetat, vasket med vann (3x), tørket over en Na2S04 og inndampet til tørrhet igjen. Det således erholdte rå-produkt ble krystalisert fra etylacetat og petroleter og gav 1.52 g (49.6%) av ren Boc--Asp (OBzl)-Leu-Lys (Z ) -OH; m.n. 109-111°C; t"^5 -16.14°
(c = 1, DMF).
Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(Obzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (1.2 g,0,545 mmol) ble behandlet med 35 ml TFA i 30 min. Syreoverskuddet ble raskt fordam<p>et og resten revet med eter flere ganger og gav 1.2 g av undecapeptid TFA-saltet som et hvitt pulver. Det ble o<p>nl^st i en blanding av DMF (5 ml) og DMSO (2 ml) og behandlet med Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys (Z) -OSu fremstilt in situ ved av røre Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys (Z)-OH (0,381 g. 0,545 mmol) med HOSu (0,126 g, 1.1 mmol) og DCC (0,124 g, 0,599 mmol) i 3 ml DMF ved 0°C i tre timer. Blandingen som inneholdt den aktive tripeptid esteren og undecapeptid ble rørt ved 0°C i 2 timer og så ved 2 5°C i tre dager hvorunder'Et^N ble tilsatt fra tid til annen for å holde pH svakt basisk. En gelatinaktig substans ble dannet. Den ble revet med 5 % HOAc og det resulterende hvite faste stoff ble filtrert og vasket med vann, MeOH og eter og gav 1,28 g rått-materiale som smeltet ved 325-326°C. Represipitering av'DMF/DMSO (10 ml/5 ml) ogMeOH (230 ml) gav 1.22 g (80.2%) av ren Boc-Asp
(OBzl) -Leu:-Lys (Z) -Glu (OBzl) -Lys (Z) -Glu (OBzl) -Val-Val-Glu (OBzl) - Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ala--Glu (OBzl)-Asn-OBzl) ; m.<p>. 326-327°C;
[oUq5 ■= -15.71° (c = 1, DMF/DMSO).
Dette produktet (1,128 g. 0,404 mmol) ble blandet med 7 ml anisol og behandlet med 25 ml vannfritt HF ved 0°C i 15 min.. Syre-
{overskuddet ble fordampet (0°C) og den qjenblivende rest fordelt mellom eter og vann. Vann-skiktet ble op<p>vasket 2 ganger med eter inndampet til halvparten av det opprinnelige volumet og lyofilisert hvilket gav 0,69 g rått materiale. Det ble kronomatografert på den ovenfor beskrevne måte for oktapeptid. Materiale som ble eluert i rørene 101-120 ble oppsamlet og lyofilisert hvilket gav 0,25 g produkt som ble vist å være litt forurenset med mindre forurensninger. Det ble derfor rekomato-grafert på samme kolonne hvilket gav 0,155 g (22%) av ren Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-- Glu-Glu- Ala-Glu Asn. Papirelektroforese indikert-at det var homogent. [a]^<5>= -86,27°
(c = 1, 0,1 N HCl).
B.a) .H-Ser(Bzl)-OH (18.6 g, 95.4 mmol) ble o<pp>last i 45 ml triton B, inndampet til tørrhet og resten re--f ordampet to ganger med DMF (10 0 ml hver). Resten ble så rørt med AcOSu (16.9 g, 95.4 mmol) i 150'ml DMF i 20 timer. N-metylmorfulin ble tilsatt fra tid til annen for å. holdt reaksjonsblaningen svakt basisk. Løsningsmiddelet ble fjernet og ekstraksjon av produktet med EtOAc ble etterfulgt av vask med små mengder 10% HOAc, og H20 (produktet er vannløslig, bruk et lite volum H20). Tørkning over Na-^SO^ og inndamping til tørrhet igjen' gav en kalr olje 14.5 g, Ac-Ser.(Bzl) -OIJ. Forbindelsen krystaliserte ikke. Den ble derfor oppløst i en blanding av 300 ml' MeOH
og 30 ml H20, titrert til. pH 7.0 med. 20 % Cs„C03og inndampet til en fast masse. Saltet ble refordampet 2 ganger mer med DMF og rørt med benzyl - bromid (15.4 g, 91 mmol) i 250 ml
DMF i 13 timer. Etter fordampningen av løsningsmiddelet ble resten tatt opp i H20 (600 ml) og det dannede oljeaktige produkt ble ekstrahert over EtOAc. Det ble vasket medK20. tørket over Na-jSO^ og fordampet til. en sirup som ved podinge øyeblikkelig krystaliserte. Den ble krystalisert fra EtOAc og petroleum eter hvilket gav 10,42 g (32.2 % totalt) av H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl; m.p. 39-91°C.
H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl (2.2 g, 6.73 mmol) ble oppløst i 75 ml
EtOH og rørt forsiktig med 5 ml.H2NNHp natten over. Noe uløslig-stoff som presipiterte ble frafiltrert og filtratet ble inndampet til en olje som størknet ved behandling med eter. Produktet ble omkryst.alisert fra et lite volum EtOH og eter hvilket gav j i "i 1,40 g (32,3%) av H^C-CO-Ser(Bzl)-HNNH^; m.p. 128-130 C; +5.30° (c MeOH). D
b) L-alanin (3.57 g, 40 mmol) ble oppløst i 18,3 ml triton B (40 ml), inndampet til tørrhet og den oljeaktiverest
reinndampet 2 ganger ved -DMF (30 ml hver). Det erholdte salt ble rørt med 11,45 g Boe- Ala- OSu (40 ml) i 40 ml DMF, med 4 ml NMM tilsatt i 20 timer. Løsningsmiddelet ble fjernet og
resten tatt opp i 10 % HOAc (100 ml ). Produktet ble ekstrahert i EtOAc (4x100 ml), vasket to ganger med et lite volum H20, tørk-et over Na2S04, inndampet til et lite. volum og behandlet med petroleter inntil det ble uklart. Et krystalinsk produkt ble dannet ved lagring i kjøleskap natten over. Utbyttet : 3.2 g(76.3%)
av Boc-Ala-Ala-OH; m.p. 115-113°C,
Boc-Ala~Ala-OH (36.2 g, 139 mmol) ble behandlet med 3 1 4 N HCl
i THF i 30 min. Inndampning og opparbeiding som normalt gav en - oljeaktiv-masse som størknet ved behandling med eter . Produktet ble omkrystalisert fra etanol med eter hvilket gav
9.1 g (33,3%) av HCl • H-Ala-Ala-OH; m.p. 209-211°C-.HCl•H-Ala-Ala-OH (2,36 g, 12 mmol) ble oppløst i 20 ml DMF,kjølt i et isbad og behandlet med 1,63 ml av Et^N(12 mmol) etterfulgt av Boc-Asp(Bzl)-OSu (12 mmol). Blandingen ble rørt forsiktig ved 0°C i 2 timer også 25°C natten over, hvorunder en ekvivalent mengde av Et3N(12 mmol) ble tilsatt i små porsjoner hvilket holdt reaksjonens pH nær 3.0. Noen ml HOAc ble tilsatt og den surgjorte blanding inndampet til tørrhet.Det dannede produktet ble ekstrahert over i EtOAc, vasket med H^O (3 ganger), tørket over Na^So^, og inndampet til en oljeaktivrest (6 g). Den ble oppløst i EtOAc og titrert til pH 3,0 ved DCHA. Det krystalinske saltet feltes ut- og ble omkrystalisert fra iso-propanol og petroleter hvilket gav 5.1 g (65.7%) av Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH• DCHA;m,p. 138-141°; [ct]^<5>= -13.33° (c = 1, MeOH).
Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH'DCHA (3.5 g, 5.4 mmol) ble fordelt mellom 500 ml EtOAc og 350 ml H?0 som inneholdt lo ml 10 % H2S04. Det vandige skiktet ble ekstrahert en gang til EtOAc (250 ml) og det sammenslåtte EtOAC skiktet vasket to ganger med H20;
tørket over Na2S04, og inndampet til tørrhet hvilket gav et I
én glassaktig masse av Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH (2.5 g).
Dette materialet ble behandlet med 200 ml friskt fremstilt 4N
HCl i THF i 30 min., inndampet ved 32°C til en sirup og reinndampet to ganger til med THF. Den oljeaktige resten ble fast ved behandling med eter. Dette HCl•H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH (1.93 g, 4.83 mmol) ble brukt i den neste reaksjonen som innebefattet azid-kobling med H^C-CO-Ser(Bzl)-N3 som var fremstilt fra' 1.24 g H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2(4.9 mmol) i 25 ml DMF (-25°C) med 7.42 ml 3.3 N HCl i THF (24.5 mmol) og 0,99 ml i-amylnitrit (7.35 mmol) rørt i.-30°C i 30 min. Azid-løsningen som var fremstilt ble kjølt ned til -35°C, blandet med 4.1 ml Et3N og så behandlet med det hvite pulveret av HCl H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH (1.93 g)
som var fremstilt ovenfor. Blandingen ble rørt ved -20°C i 30 min og så ved 4°C i to dager. Noe mer Et3N ble tilsatt for å holde reaksjonen svakt basisk. Normal opparbeiding av en krystalinsk masse som ble krystalisert fra THF og petroleter hvilket gav 1.85 g (65.6 %) av' H3C-CO-Ser (Bzl)-Asp (OBzl)-Ala-Ala-OH m.p. 167-170°C; [a]^<3>= 18.91° (c = 1, DMSO).
'H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH (0,825 g. 1,41 mmol)'ble oppløst i 4 ml DMF og avkjølt til 0°C i et isbad. Løsningen ble tilsatt H2NNH2(54.3 mg ; 1.69 mmol) etterfulg av HOBT-
H20 (0,475 g,3.10 mmol) og -DCC (0,32 g. 1,55 mmol). Blanding-
en ble justert til pH 7.5 med NMM og rørt ved 0°C i'2 timer etterfulgt av 17 timer ved 25°C, Reakajorismassen ble en gel i løpet av denne tiden.. Den ble fortynnet med MeOH og det faste materialet som ble tilbake ble oppsamlet på et sugefilter og vasket grundig MeOH, eter og petroleter hvilket gav et materiale som smeltet ved 2 29-2 32°C. Produktet ble så felt fra DMF og MeOH hvilket gav 0,51 g (61.0%) av H3C-CO~Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-. Ala-Ala-HNNH2; m.p. 230-232°C; [ a]* 5 = -17.94° (c = 1. DMSO).
c) H-Glu(OBzl)-OH (39.4 g, 166 mmol) ble rørt med Boc-Ser(Bzl)-OSu (65.0 g, 166 mmol) i 900 ml DMF natten over i nær-var av Et3N(2.3 ml, 165 mmol). Mer Et3N ble tilsatt i løpet av denne tiden for å holde reaksjonsblandingen svakt basisk. Den klare løsningen ble inndampet til tørrhet og den oljeaktige resten fordelt mellom EtOAc (1,5 1) og 5% HOAc (2 1). Det organiske skiktet ble vasket med H20 (2 ganger), tørket over Na2S04 og konsentrert til en klar olje (90,0 g) som ble tatt opp i 3 liteif eter og behandlet med 25 ml cycloheksylamin. Det faste stoffet som ble danned ble rekrystalisert fra MeOH og eter. Utbyttet; 76.2 g (74.8%) Boc-Ser (Bzl) --Glu (OBzl) -OH-CHA; m.p. 154-156°C; [a]^5 =■+ 6.32° (c = 1, MeOH).
Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH-CHA (76.2 g, 124 mmol) ble oppslemmet i en blanding av.1.5 liter av H20-og EtOAc hver. Denne blandingen ble tilsatt 10 % ^SO^ inntil den ble sur (pH ca. 2,5) og det faste'stoffet gikk i oppløsning. Det organiske skiktet som inneholdt den fri dipaptid-syren ble vasket med K90 ( 2 ganger), tørket og inndampet til tørrhet hvilket gav en klar olje (63,5 g)-. Den ble behandlet med 3 liter friskt fremstilt 4.1 N HCl i THF
i 45 minutter og inndampet til en oljeaktivrest som ble reinndampet to ganger til med THF. Resten HCl • II-Ser (Bzl)-Glu (OBzl)-OH ble oppløst i DMF (500 ml),kjølt til 0°C, og behandlet med Boc-Ser(Bzl)-OSu (43.66 g, 124 mmol) øyeblikkelig etterfulgt
av 27 ml Et-^N. Blandingen ble rørt natten over ved 25°C hvor under mer Et^N ble tilsatt leilighetsvis for å holde reaskjons-blandingen svakt basisk. Noen små mengder av uorganisk stoff ;: ble fjernet ved filtrering og filtratet ble inndampet til en '•. olje som ble tatt opp i EtOAc, vasket med 5 % HOAc og H,,0, tørk-et over Na2S04og igjen fordampet til tørrhet. Produktet ble krystalisert fra EtOAc med petroleter. Utbyttet: 71.8 g(33.7%) av Boc-Ser (Bzl)-Ser (Bzl)- Glu (OBzl)-OH ; m.p. 112-113°C; [a<]>^<5>=. +17,91° (c =1, THF).
Boc-Ser (Bzl)-Ser (Bzl)-Glu (OBzl)-OH .(71.6 g,104 mmol) ble behandlet med 2. 7 1 friskt fremstilt 3.9 N HCl i THF i 45 min.. Blandingen ble inndampet til tørrhet og resten inndampet 2 ganger til med THF hvilket gav en fast masse (59,3 g, m.p. 161-165°C). Den ble oppsamlet og vasket med eter og rørt i 500 ml DMF med Boc-Thr(Bzl)-OSu (38.2 g, 94 ,mmolj i nærvær av Et3N
(25 il) i 0 C i 1 time også ved 25 C i 15 timer. Mer Et^N
(14.5 ml) ble tilsatt i flere porsjoner i løpet av denne tiden for å holde reaksjonen svakt basisk. Noe dannet uløslige materiale frafiltrert og filtratet inndampet til en olje som ble oppløst i EtOAc (1,5 1), vasket med 5% H20 (2x), tørket over Na2SO^og inndampet til én fast masse. Produktet ble omkrystalisert fra EtOAc og petroleter hvilket gav 64.8 g (73.1%) av Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH:m.p. 115-113°C;
.Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH (54.5 g, 61,7 mmol) ble behandlet med HCl i THF (1,5 liter; 4.1 N) og opparbeidet . som vanlig hvilket gav HCl H-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)- Glu(
(OBzl)-OH (46.3 g, 56.6 mmol) som et hvitt pulver. Det ble så rørt i DMF (500 ml) med Boc-Asp(OBzl)-OSu (23.7 g, 56 mmol) i 0°C i 2 timer i nærvær av Et-^N (16 ml). Balndingen blé vidre rørt i 25°C i 15 timer hvorunder ytteligere 7.4 liter Et^N
ble tilsatt. Produktet ble opparbeidet som vanlig krystalisert fra CH2C12og petroleter. Utbyttet: 50.35 g (82.7%) av Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH; m.p. 111-113°C; [alp<5>= +7,21° ( c = 1,DMSO).
Boc-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH (50.0 g,
46 mmol) ble avmasket med HCl (4.15 N) i THF og opparbeidet som vanlig hvilket gav 45,'4 g hvitt fast stoff. Den ble oppløst i THF (1,5 liter) og behandlet med eter (7 liter). Ved én stand på 0°C natten over erholdtes et hvitt fast nulver (44,0 g, m.p- 179-184°C) . Deler av dette materialet HCl • H-Asp (OBzl).-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH (43.7 g, 42,7 mmol)
ble så oppløst i 500 ml DMF, avkjølt til 0°C og behandlet med Et^NdO ml). Blandingen ble rørt i 15 timer hvorunder mer Et^N (7,9 ml) ble tilsatt i flere porsjoner for å holde reaksjonen svakt basisk. Det uløslige stoffet ble fjernet ved filtrering og filtratet inndampet til tørhet. Den oljeaktive resten ble, oppløst i CH2C12, vasket med 5 % KOAc, H-jO, tørket over Na2S04, og inndampet til et mindre volum (0,5 liter) under tilsetning av petroleter. Produktet krystaliserte langsomt ved henstand natten over. Det ble omkrystalisert fra THF og isopropanol hvilket gav 26.3' g(51.4%) av Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(Obzl)-OH; m,p. 174-177°C: [a]^<5>= +0,34° (c 1, THF).
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)- OH (13.0 g; 10.94 mmol) ble oppløst i DMF (50 ml) avkjølt til 0°C og så behandlet med H,NNH2(0,421 g; 13,. 14 mmol) HOBT (3.683 g; 24.1.mmol) og DCC (2,48 g; 12,04 mmol), NMM ble så tilsatt inntil reaksjonen viste pH 7.5. Blandingen ble rørt 13 timer og-fUt-rert for å fjerne uløslige biprodukter. Filtratet ble inndampet til tørhet og resten behandlet med H20. Det dannede faste stoff ble oppsamlet og krystalisert fra DMF og isonronanol hvilket gav 8.7 g (66.4%) av Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu (OBzl)-HNNH2; m.p. 215-213°C; [ a]* 5 = [37.62° (c = 1 DMSO).
d) Boc-Thr(Bzl)-Lys(Z) OH (14.0 g, 24.5 mmol) ble behandlet med 500 ml 4,0 N HCl i THF i 30 min,, inndam<p>et til tør-het og g jeninndampet 2 ganger med friskt TIIF. Denne oljeaktivresten størknet ved behandling med eter. Det størkede pulvere (11,4 g ,21.6 mmol) av dipeptid-hydrokl.oridsaltet ble så opp-løst i 140 ml DMF,' avkjølet til 0°C og behandlet med Boc-Thr(Bzl)-OSu (8,8 g, 21.6 mmol) etterfulgt av 3.5 ml Et^N. Noen dråper Et^N ble tilsatt å holde reaksjonsbetingelsene svakt basiske mens blandingen ble rørt i ytteligere 24 timer ved 25°C. Den ble surgjort med 5 ml HOAc og så fortynnet med et stort volum vann. Det faste rå-produktet som utfeltes ble oppsamlet, oppløst i EtOAc, vasket méd n^CK tørket over Na^SO^ , og inndampet til tørhet hvilket gav en glassaktig fast masse. Krystal-isasjonen fra EtOAc og petroleter gav 13.8 g (83.7%) av Boc-Thr (Bzl ) -Thr (Bzl ) -Lys ( Z ) -OH ; m.D. 110-112°C; [a]25 = +19,45°
D
(c = 1, EtOAc).
Boc-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH (41.5 g, 54 mmol) ble behandlet med 500 ml friskt fremstilt 3.55 N HCl i THF i 25 min..ved inndampning til. en sirup som ble gjeninndampet 2 ganger med friskt THF. Den oljeaktige resten størknet ved behandling med eter.
Den ble oppsamlet og vasket med eter hvilket gav 37.4 g rått-hydrokloridsalt av tripeptidet oppløst i 500 ml DMF avkjølt til 0°C og behandlet med Boc-Ile-OSu 817.4 g, 53 mmol) etterfulgt av 16 ml Et^N. Blandingen ble rørt ved 25°C natten over hvorunder mer Et^N ble tilsatt i små porsjoner ( 6.2 ml totalt ) for å holde svakt basiske betingelser. Den resulterende blandingen ble filtrert og filtratet inndampet til en olje som ble ekstrahert over i EtOAc, vasket med 5% HOAc, H?0 , tørket over Na-jSO^, og inndampet hvilket gav en gulaktig olje. Den ble krystalisert. fra EtOAc og petroleter. Det således erholdte rå faste stoffet (39,6 , m.p. 140 - 142°C) ble funnet å være forurenset med flere små forurensninger. Materialet ble så kromat-ografert på kisel gel kolonne (70-230 mesh, 4.7 x 67 cm) ved bruk av CHCl^/MeOH (95:5. v/v) som eluent. Fraksjonene som innef holdt det ønskede produkt ( Kontrolert ved TC1 ) ble slått sammen og inndampet hvilket gav et oljeaktivt produkt som ble krystalisert fra CHC13 og petroleter. Utbytte: 19.1 g(41,2%)
av Boe-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH: m.p. 144-146°C: [a]2<5>= +2.40° (c = 1, CHC13).
Boc-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH (0,439 g 0,496 mmol) ble behandlet med 4 N HCl i THF i 3o min. og opparbeidet som vanlig hvilket gav 0,39 g av HCl • H-Ile-Thr (Bzl) -Thr (Bzl.) -Lys (Z) -OH. Boc-Val-Asp (OBzl) -Thr (Bzl).-Ser (Bzl) -Ser (Bzl) -Glu (OBzl) -HNNH^
(o,59 g. 0,492 mmol) ble så oppløst i 6 ml av DMF, avkjølt til - 2<5>°C.og behandlet med 0,5 7 ml 4,3 N HCl i THF (2.46 mmol) umiddelbart fulgt av 0,1 ml i-amylnitrit (0,74 mmol). Etter røring ved -20° - -25°C i 30 min ble temperaturen senket til -35°C hvoretter 0,42 ml Et3N og HCl•H-ILe-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH (0,39 g, fremstilt som ovenfor) bie tilsatt. Blandingen ble . rørt til -20°C i 30 min og så ved 4°C i 48 timer hvorunder Et3N ble tilsatt fra tid.til annen for å holdt pH på ca 7.5. Blandingen ble så fortynnet med 250 ml 5% HOAc og det dannede faste produktet ble oppsamlet og vasket med H20, MeOH, eter og tørket over NaOH-pellets i våkum hvilket gav 0,32 g rått materiale (m.p. 244-254°C).
Det ble.oppløst DMSO og presipitert ved tilsetning av MeOH.. Utbyttet:0,698 g (81,7%) av Boc-Val-Asp(Bzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser (Bzl)-Glu(OBzl)-ILe-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH; m.p. 263-271°C.
H3C-CO-Ser (Bzl)-Asp (OBzl)-Ala-Ala-HNNH2 (0,4.08.g, 0,63.mmol) oppslemmet i 10 ml DMF ble avkjølet til -20°C og behandlet med frisk fremstilt 5.43 N, KCl i THF (0,627 ml, 3.4 mmol) etter-, fulgt av 10% i-amylnitrit i DMF (1,39 ml, 1,03 mmol).Etter 30 min. røring ble den avkjølt ned til -30°C hvoretter Et-^N (0,476 ml, 3.4 mmol) ble tilsatt etterfulgt av TFA-saltet av decapeptidet H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr (Bzl ) -Ly s ( Z ) -OH ( 1, 334 g, 0,63 mmol). Blandingen ble rørt
i -20°C i 30 min og så ved 4°C i 5 dager hvorunder mer Et^N®9DMSO ble tilsatt for å holde reaksjonen under svakt basiske betingelser og forhindre at gelen ble dannet. Reaksjonsblandingen ble helt i 5% HOAc (300 ml) og det faste dannede<p>resipitatet ble oppsamlet vasket med H20,MeOH, eter, og tørket hvilket gav i
1,49 g materiale som smeltet ved 296-299°C. Produktet ble re-presipitert fra DMSO med MeOH. Utbyttet: 1,4 0 g (35.37%) av H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-LYs(Z)-OM; [a]2<5>= +6.37°
(c = l,DMSO).
Det erholdte tetradecapeptidet (1,35 g.0,558 mmol) ble rørt med HOBT-H20 (o,18S g,l,23 mmol) noen få minutter i en blanding av
15 ml av hver av DMF og DMSO. Blandingen ble.så kjølet i et is-bad hvoretter DCC (0,126 g,0,614 mmol) ble tilsatt og røring fortsatte i 2 4 timer i samme temperatur. I en adskilt kolbe ble det. Boc--Asn (OBzl) -Leu-Lys (Z) -Glu (OBzl) -Lys (Z ) --Lys.(Z) -Glu (OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl (4,0 g, 1,43 mmol) behandlet med 40 ml TFA, i 25 min. og TFA-saltet av det dannede tetradecapeptidet raskt felt under tilsetning av volum-eter. Det dannede faste stoff onpsamlet og vasket grundig med eter hvilket gav 3.74' g. hvitt pulver (TFA-saltet av C-terminalt tetradecapeptid). Deler av dette materialet (1,567 g, 0,5533 mmol) ble satt til den aktive esteren som stammet fra amino terminalt tetradecapeptid som fremstilt ovenfor' i en DMFDMSO blanding. Noen få dråper N.MM ble tilsatt for å bringe reaksjonens pH til 7.5-8,0 og røring ble fortsatt en time ved 0°C
og så fem dager ved 25°C.Reaksjonsblandingen ble så helt i 1 5 1 5% eddiksyre. Det presioiterte produkt ble vasket grundig med H20, MeOH, DMF, MeOH og eter hvilket gav 2.2.1 g av det ønskede produkt, H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(BZL)-Ser (Bzl),-Ser (Bzl) -Thr (Bzl) - Ile-Thr (Ezl) -Thr (Bzl) -Lys (Z) -Asn (OBzl) - Leu-LYs(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl som smeltet over 300°C.
Det beskyttede oktacosapentidet (2.21 g,0,435 mmol) ble oppløst
i 8 ml TFA, blandet med 4 ml anisol og rørt med vannfritt. iHF
ved 0°C ved 30 min. Syrene ble fjernet ved 0°C (vakum-destila-sjonen) og den faste resten som ble tilbake ble onnløst i 200
ml H90, vasket 2 ganaer med eter, inndamnet til halvparten av volumet og leofylisert ' hvilket gav 1.1 g rå-produkt. Det ble renset ved en gang gjennom en Sefakex<R>'G-1<0>kolonne ( 3 x 30 cm; 0,2M HOAc) og så en DEAE-Sefadex^kolonne (3 x 75 cm) under elu-ering med økende konsentrasjon av ammonium acetat (pH 7.0 ,0,025.M, 0,25M) etterfulgt av fortynnet eddiksyre. Fraksjonene som inne-!
holdt det ønskede materialet ble slått sammen og leofylisert hvilket gav 0,231 g H3C"CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [tymosin a^] som et amort hvitt pulver.
På akrylamid gel isoelektrisk fokus beveger det syntetiske materialet seg identisk med det naturlige tymosin a, isolert
fra bovintymus-kjertel (Proe.Nati. Acad. Sei. (USA). 7 4, 725 (1977)).
Eksempel 2
Boc-Ala-Ala-OH (7,23 g, 27,3 mmol) ble opnløst i en blanding
av 200 ml MeOH'og 20 ml H20. Cs2C03løsning (20% vanndig) ble tilsatt -inntil pH nådde 7.0' ( ca 30 ml) og den resulterende nøytrale løsningen ble inndampet til tørhet. Resten ble reinndampet 2 ganger med DMF (15 0 ml) og det gelantiløse faste'stoffet som ble tilbake ble rørt i 120 ml DMF med benzylbromid
(7,2 g, 4 2 mmol) i 15 timer. Løsningsmiddelet ble så fjernet ved inndampning og resten behandlet med 500 ml vann. Produkt-
et presipiterte som en vandig olje som gradvis størknet ved ' henstand. Den ble tatt opp i EtOAc (400 ral) vasket med H2'0
(3x), tørket over Na^So^q^<i>nndam<p>et til en sirup som ved behandling med petroleter begynte og krystalisere. Produktet ble omkrystalisert fra EtOAc og petroleter hvilket gav 7.2 g.
(73,8%) Boc-Ala-Ala-OBzl; .m.p. 71-73°C.
Boc-Ala-Ala-OBzl (6.0 g, 17,15 mmol) ble -behandlet med 380 ml frisk fremstilt 4 N HCl i THF i 30 min, Syre-overskudd og løsn-ingsmiddelet ble avdampet og den tilbakeblivende sirup gjennin-dampet 2 ganger med friskt THF. Resten størknet øyeblikkelig ved behandling med eter. Den ble omkrystalisert fra MeOH og eter hvilket gav 4.30 g (76,4%) HCl•H-Ala-Ala-OBz1; [a]^<5>=-38,86°
(c = 1 , MeOH).
HCl'H-Ala-Ala-OBzl (4.25 g 14,83 mmol) ble oppløst i DMF (60 ml) avkjølet til 0°C og rørt med Boc-Asn-OII (3,45 g, 14.33 mmol) HOBT (4,02 g, 28,6 mmol), NMM (2ml) og DCC (3.37 g, 16.35 mmol) ved 0°C i to timer og så ved 25°C i 20 timer. Mer NMM ble tisatt fra tid til annen for å holde reaksjonen svakt basisk. De u— j
. løslig dannede biproduktene ble frafiltrert og filtratet inndampet til tørrhet. Den oljeaktive resten størknet umiddelbart etter behandling med vann. Den ble tatt onn i EtOAc, vasket med H"20 (3x) , tørket over Na^SO^og inndampet til et mindre volum hvorved produktet begynte å krystalisere. Det samme volum petroleter ble tilsatt og blandingen fikk stå natten over. Rå-produktet ble omkrystalisert fra THF og petroleter hvilket gav 5.2 g(75.6%) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl; m.p. 153-155.°C; [«lp<5>=-55.61°
(c = 1, MeOH).
Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl (2.2 g, 4.75 mmol) ble behandlet med 220
ml 4.0 n HCl i THF i 30 min. Syreoverskudd og løsningsmiddelet ble avdampet og resten igjeninndampet to ganger med friskt THF. Det oljeaktive produktet størknet ved behandling av eter. Det ble revet med mere frisk eter og oppsamlet hvilket gav et hvitt pulver (1,85 g). Det således erholdte hydrokloridsaltet ble oppløst i 4 0 ml DMf og avkjølt til 0°C ved tilsetning av H^C-Co-SER-Ser(Bz1)-OH•DCHA (1.97 g, 4.75 mmol). Etter røring
ved 0°C i 30 min. kunne utfelling■av DCHA-HCl konstateres og HOBT (1,19 g) lbe tilsatt etterfulgt av DCC(1,03 g, 5.23 mmol). Reaksjonen ble så justert til pH 7.5' med noen få dråper NMM og rørt ved 0°C i 2 timer og så ved 2 5°C natten over. Det uløs-lige biproduktet ble fjernet ved filtrering og filtratet inndampet til en svakt farget fast masse. Den ble grundig vasket med H-jO og EtOAc hvilket gav et brungult farget pulver som ble krystalisert fra DMF (40 ml) og isopropanol (500ml). Utbyttet: 1,57 g(56,9%) H3C-CO-Ser (Bzl) --Asn-Ala-Ala-OBz 1 ;m p. 213-215°C;
[a]25 =-23.11° (c = 1, DMSO).
D
H3C--CO-Ser (Bzl)--Asn-Ala-Ala-OBzl (1,57 g,2.69 mmol). ble oppløst
i 20 ml DMF og rørt med 2 ml H2NNH2i 13 timer. Det dannede faste produktet ble oppsamlet og vasket grundig med.DMF,EtOH,
og eter hvilket gav 1 22g(89,6%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2, m.p. 262-264°C; [a]^5 =-26,7 (c = 1, DMSO).
Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-ILe-Thr (Bzl) -Thr (Bzl) -Lys ( Z ) -OH (0,698 g, 0,353 mmol). ble behandlet med 10 ml TFA i 30 min. og peptidsaltet ble felt med eter. Det . ble samlet på et sugefilter, vasket med eter og tørket hvilket gav 0,652 g materiale .(0,333 mmol som TFA-salt),I en adskilt > flaske ble , H^C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH,,(0,17 g, 0,335 mmol) oppslemmet i 7 ml DMF og behandlet med 0,27 ml 6.13 N HCl i THF ved -20°C. Blandingen ble tilsatt o,63 ml 10%i-amylnitrit i DMF og løsningen rørt med samme temperatur i 3 0- min. Temperaturen ble senket til -30°C hvoretter 0,234 ml Et3N (1,67 mmol) ble tilsatt etterfulgt av TFA-saltet av decapeptidet (o,652 g) som ovenfor fremstilt. Blandingen ble fortynnet med 3 ml DMSO ved -20°C og justert svakt basisk (pH 7.5) med noen får dråper Et^N. Den ble rørt ved -2 0°C i 3 0 min og så ved 4°C i 5 dager. Mer DMSO (5 ml) og Et^N ble tilsatt i løpet av denne perioden for å opprettholde det svakt basiske betingelsene og hindre reaksjonsblandingen i en gel. Hele løsningen ble så helt i 5% HOAc (250 ml) hvilket gav en hvitfelning som ble oonsamlet, vasket med H20, MeOH, eter og tørket. Rå-produktet (0,702 g, m.p. 290-291°C ble gjenfelt fra DMSO med MeOH. Utbyttet: 0,348 g (42.0%) H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser (Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH; m.p. 296-293°C (dec.);[a]2<5>= +3.77° (c = 1, DMSO).
Det erholdte produkt (0,8 66 g, 0,37 3 mmol) ble rørt med HOBT. H20 (0,126 g, 0,32 mmol) i en blanding av DMSO ( 8 ml) og
DMF (6 ml) og avkjølt i et isbad. Blandingen ble behandlet med DCC (0,035 g, 0,411 mmol) og så rørt ved 0° i 24 timer . Den ble så blandet med TFA-saltet av tetradecapeptidet som var fremstilt som.i eks. IB.d( 1,05 g, 0, 373 mmol) og ytteligere 2 ml DMSO. Noen.dråper NMM ble tilsatt for å bringe pH til 7,5-3,0 og røringen ble fortsatt ved 0°C i 1 time og så ved 25°C i 5 dager. Opparbeiding som beskrevet i eks. IB.d, gav 1 ,5775 g av det fullstendig beskyttede octacosapeptidet. H3C-CO-Ser(Bzlj-Asn-Ala--Ala-Val-Asp (OBzl) -Thr (Bzl) -Ser (Bzl) -Ser (Bzl) -Glu (OBzl) - Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)Lys (Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl.
Det fullsteridig beskyttede octacosapeptidet (1,57 g, 0,32 mmol) ble oppløst i lo ml TFA som inneholdt 3 ml anisol.Blandingen ble rørt med 45 ml HF ved 0°C i 30.min og så opparbeidet som beskrevet i eks. IB.d. Rensning og Sefadex<R>G-10 og DEAE-sefadex<R>kolonnen som ovenfor beskrevet gav 0,238 g H3C-CO-SEr-Asn--Ala-Ala-Val-Asp-Thr-SEr-Ser-Glu-Ile-THr.Thr-Lys-Asp<->Seu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [(Asn 2)-tymosin ct^]som i hvitt amorft produkt. Forbindelsen beveget seg i stillingen litt mindre sur enn naturlig tymosin på akrylamid gelen med isoelektrisk fokus i overenstemmelse med forskjellen i struk-tur.
Claims (17)
1.
2 Fremgangsmåte ved fremstilling " av thvmosin a, eller dets [Asn ]-analoger og i deres farmaseutisk fordragelige salter karakterisert ved : at fremgangsmåten består i å fjerne beskyttelses gruppene fra et beskyttet okhacosa-peptid med sekvensen
2
hvor X er Asn eller Asp(OR );
R"'" er en kovensjonell beskyttelses gruppe for hydroksylgruppen i serinresten, .
2 4 6
R , R ,R er konvensjonelle karboksylgruppe
beskyttelsesgrupner,
3 R er en konvensjonell beskyttelsesgruppe
for hydroksylgrup <p> en i treonin og R 5 er en konvensjonell beskyttelsesqru <p> pe
for -aminogruppen i lysinresten og, om ønsket, overføre den erholdte forbindelsen i et farmaseutisk fordraglig.salt.2. Fremgangsmåte ved fremstilling av thymo.sin karakterisert ved at fremgangsmåten består i , å fjerne beskyttelsesgruppene fra et beskyttet octacosapeptid med sekvensen
hvor Bzl er benzyl og Z er benzyloksykarbonyl.
3. Fremgangsmåte ved fremstilling av [Asn"]-thymosinc t^karakterisert ved at fremgangsmåten består
i å fjerne beskyttelsesgruppene fra beskyttet octacosapeptid med sekvensen
hvor Bzl er benzyl og Z er benzyloksykarbonyl.
4. Fremgangsmåte ved fremstilling av thymosin a, eller dets [Asn 2]-analogi ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved atfjerningen av beskyttelses gruppene utføres med vannfritt hydrogehfluorid.
5.2 Fremgangsmåte ved fremstilling av thymosin an eller dets [Asn ]-analoge ifølge krav 1, karakterisert ved at det beskyttede octacosapeptidet med sekvens I fremstilles ved kondensasjon av et beskyttet tetradecapeptid med sekvensen
med et beskyttet tetradeca <p> eptid med sekvensen(II)
hvor X,r\ R <2> , R^, R^ , R~' og R^ er som angitt i krav 1,
R 7 er hydrogen eller en aktiverende gruppe.
6. Fremgangsmåte ved fremstilling av thymosin i-følge krav 2 eller 4, karakterisert ved at det beskyttede octacosapeptidet med sekvensen Ia erholdes ved kondensasjon av det aktiverte beskyttede tetradecapeptidet med
sekvensen
med trifluoreddiksyre-saltet av det beskyttede tetradecapeptidet med sekvensen
hvor Bzl er benzyl, Z er bensyloksykarbonyl og BT er benzotriazoly1.
7. Fremgangsmåte ved fremstilling av [Asn ]-thymosin ifølge krav 3 eller 4 karakterisert ved at det beskyttede octacosapeptidet med sekvensen Ib erholdes ved kondensajson av det aktiverte beskyttede tetradecapeptidet med sekvensen
med trifluoreddiksyre-saltet av det beskyttede pétradecapeptidet med sekvensen
hvor Bzl,er benzyl, Z er benzyloksykarbonyl og Bt er benzotriazolyl.
8. [Asn 2]-thymosin og farmaseutisk fordragelige salter derav.
9. H3C-CO-Ser(R1)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser (R <1> )-Ser(R <1> )-Glu(OR <4> )-Ile-Thr(R <3> )-Thr(R <3> )-Lys(R <5> )-Asp(OR <2> )- Leu-
. Lys(R5)-Glu(OR4)-Lys(P5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val-Glu(OR4)-Glu (OR <4> )-Ala-Glu(OR <4> )-Asn-OR <6>
karakterisert ved at R"*" er en konvensjonell beskyttelses gruppe for hydroksyl-gruppen i serinresten,
2 4 6
R ,R ;r er konvensjonelle karboksyl-grupper beskyttelsesgrupper,
R 3er en konvensjonell beskyttelses-gruppe for hydroksyl-gruppen i threoninresten og
er en konvensjonell beskyttelses gruppe for aminogruppen ilysinresten.
10. H3 C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl(-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-Asp (OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu (OBzl) -Ala-Glu (OBzl) -Ala-Glu (OBzl) -Asn-OBzl
karakterisert ved at Bzl er benzyl og Z er benzyloksykarbonyl.
11. H C-CO-Ser(R1)-Asp(OR2)-Ala-Ala-Val-Asp(OR2)-Thr(R3)-Ser(R <1> )-Ser(R )-glu(OR4)-Ile-Thr(R3)-Thr(R3)-Lys(R3)-Asp(OR2)-Leu-Lys (R5)-Glu(OR4)-Lys(R5)-Lys(R5)-Glu(OR4)-Val-Val-Glu(OR4)-Glu (OR <4> )-Ala-Glu(OR <4> )-Asn-OR <6>
karakterisert ved at
R1 er en konvensjonell beskyttelses gruppe for hydroksylgruppen i serdinresten,
2 4 6
R , R og R er konvensjonelle karboksylgrupper
i
beskyttelsesgru <p> per,
R er en konvensjonell beskyttelses gruppe for
hydroksyl-gruppen i threonin-resten,
R 5 er en k'onvensjonell beskyttelses gruppe for
aminogruppeh i lysihresten.
12. H3C-CO-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr (Bzl) --Ser (Bzl) -Ser (Bzl) -Glu (OBzl) -Ile-Thr (Bzl) -Thr (Bzl)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu (OBzl ) -Glu (OBzl ) -Ala-Glu (OBzl ) -Asn-OBzl
karakterisert ved at Bzl er benzyl og Z er benzyloksykarbonyl.
13. ri3 C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser~ Glu-Ile-Thr-Thr-Lys og farmaseutisk fordragelig salter derav.
14. H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys og farmaseutisk fordragelige salter .derav.
15. Asp--Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu~. Asn og farmaseutisk fordragelige salter, derav.
16. Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn og farmaseutisk fordragelige salter derav.
17. Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn og farmaseutisk fordragelige salter derav.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78989877A | 1977-04-22 | 1977-04-22 | |
| US05/871,563 US4116951A (en) | 1977-04-22 | 1978-01-23 | [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO781404L true NO781404L (no) | 1978-10-24 |
Family
ID=27120967
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO781404A NO781404L (no) | 1977-04-22 | 1978-04-21 | Fremgangsmaate ved fremstilling av thymosin alfa-1 og en analog forbindelse |
| NO821608A NO148924C (no) | 1977-04-22 | 1982-05-13 | Analogifremgangsmaate ved fremstilling av immunpotensierende peptider. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO821608A NO148924C (no) | 1977-04-22 | 1982-05-13 | Analogifremgangsmaate ved fremstilling av immunpotensierende peptider. |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS53137914A (no) |
| AT (1) | AT364470B (no) |
| CA (1) | CA1113088A (no) |
| CH (3) | CH641152A5 (no) |
| DE (1) | DE2817082A1 (no) |
| DK (1) | DK147918C (no) |
| ES (1) | ES469016A1 (no) |
| FI (1) | FI781241A7 (no) |
| FR (2) | FR2401134A1 (no) |
| GB (1) | GB1590668A (no) |
| GR (1) | GR71886B (no) |
| HU (1) | HU180783B (no) |
| IT (1) | IT1113134B (no) |
| LU (1) | LU79488A1 (no) |
| NL (1) | NL7804364A (no) |
| NO (2) | NO781404L (no) |
| PT (1) | PT67937B (no) |
| SE (1) | SE447262B (no) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4116951A (en) * | 1977-04-22 | 1978-09-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof |
| DE2919592A1 (de) * | 1979-05-15 | 1981-01-15 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur herstellung von thymosin- alpha 1 und derivaten davon |
| EP0033384B1 (de) * | 1980-01-18 | 1984-02-15 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunstimulierender Wirkung, und Thymosin-alpha-1-Fragmente |
| US4339427A (en) * | 1980-04-14 | 1982-07-13 | Hoffmann-La Roche Inc. | Radioimmunoassay of thymosinα |
| EP0056594B1 (de) * | 1981-01-14 | 1984-09-12 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Thymosin-alpha-1-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunregulierender Wirkung und Thymosin-alpha-1-Fragmente |
| CN1058500C (zh) * | 1993-02-03 | 2000-11-15 | 施塞克龙药品公司 | 胸腺素α－1衍生物 |
| US6262230B1 (en) * | 1994-01-28 | 2001-07-17 | Sciclone Pharmaceuticals Inc. | Analogs of thymosin α1 |
-
1978
- 1978-04-17 CH CH408878A patent/CH641152A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-04-18 DK DK169478A patent/DK147918C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-04-19 DE DE19782817082 patent/DE2817082A1/de not_active Ceased
- 1978-04-20 GR GR56036A patent/GR71886B/el unknown
- 1978-04-20 FR FR7811686A patent/FR2401134A1/fr active Granted
- 1978-04-21 IT IT22629/78A patent/IT1113134B/it active
- 1978-04-21 SE SE7804612A patent/SE447262B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-04-21 GB GB1574/78A patent/GB1590668A/en not_active Expired
- 1978-04-21 LU LU79488A patent/LU79488A1/de unknown
- 1978-04-21 JP JP4673978A patent/JPS53137914A/ja active Pending
- 1978-04-21 ES ES469016A patent/ES469016A1/es not_active Expired
- 1978-04-21 NO NO781404A patent/NO781404L/no unknown
- 1978-04-21 HU HU78HO2067A patent/HU180783B/hu unknown
- 1978-04-21 FI FI781241A patent/FI781241A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1978-04-21 PT PT67937A patent/PT67937B/pt unknown
- 1978-04-21 AT AT0286178A patent/AT364470B/de not_active IP Right Cessation
- 1978-04-21 CA CA301,643A patent/CA1113088A/en not_active Expired
- 1978-04-24 NL NL7804364A patent/NL7804364A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-12-15 FR FR7835404A patent/FR2405926A1/fr active Granted
-
1982
- 1982-05-13 NO NO821608A patent/NO148924C/no unknown
- 1982-11-05 CH CH645082A patent/CH641153A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-11-05 CH CH644982A patent/CH640218A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT7822629A0 (it) | 1978-04-21 |
| IT1113134B (it) | 1986-01-20 |
| FR2401134A1 (fr) | 1979-03-23 |
| CA1113088A (en) | 1981-11-24 |
| AT364470B (de) | 1981-10-27 |
| FR2401134B1 (no) | 1983-09-30 |
| GR71886B (no) | 1983-08-04 |
| ATA286178A (de) | 1981-03-15 |
| CH641152A5 (en) | 1984-02-15 |
| GB1590668A (en) | 1981-06-03 |
| DE2817082A1 (de) | 1978-11-02 |
| PT67937B (en) | 1980-04-07 |
| CH640218A5 (en) | 1983-12-30 |
| ES469016A1 (es) | 1980-01-01 |
| SE447262B (sv) | 1986-11-03 |
| JPS53137914A (en) | 1978-12-01 |
| DK169478A (da) | 1978-10-23 |
| SE7804612L (sv) | 1978-12-20 |
| NO821608L (no) | 1978-10-24 |
| FR2405926B1 (no) | 1983-09-09 |
| DK147918C (da) | 1985-08-19 |
| HU180783B (en) | 1983-04-29 |
| NL7804364A (nl) | 1978-10-24 |
| PT67937A (en) | 1978-05-01 |
| NO148924B (no) | 1983-10-03 |
| FR2405926A1 (fr) | 1979-05-11 |
| LU79488A1 (de) | 1979-05-25 |
| DK147918B (da) | 1985-01-07 |
| CH641153A5 (en) | 1984-02-15 |
| FI781241A7 (fi) | 1978-10-23 |
| NO148924C (no) | 1984-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4116951A (en) | [Asn2 ]-thymosin α1 and analogs thereof | |
| US4148788A (en) | Synthesis of thymosin α1 | |
| Yang et al. | . beta.-Phenacyl ester as a temporary protecting group to minimize cyclic imide formation during subsequent treatment of aspartyl peptides with hydrofluoric acid | |
| DK170618B1 (da) | Alfa-Humant atrium-natriuretisk polypeptid, fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidet og diuretisk præparat eller hypotensorpræparat indeholdende polypeptidet | |
| US4656250A (en) | [Nle8, Nle18, Tyr34 or Phe34 ]-h-PTH peptide derivatives | |
| JP2891882B2 (ja) | ヒト−レラキシンｈ２遺伝子 | |
| US20240124517A1 (en) | Method for producing peptide compound containing n-substituted-amino acid residue | |
| MX2008015935A (es) | Sintesis de un peptido insulinotropico. | |
| NO167924B (no) | Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive thymopentinanaloger | |
| NO843664L (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av insulinderivater, hvis b-kjede er forlenget c-terminal, nye basisk modifiserte insulinderivater, midler inneholdende disse og deres anvendelse | |
| CA2024855C (en) | Process and intermediates for producing glucagon | |
| US20220153804A1 (en) | Process of preparation of glucagon-like peptide-1 (glp-1) receptor agonists and their analogs | |
| US20240116980A1 (en) | Compound or salt thereof and preparation method and application of same | |
| CN102239176A (zh) | 用于制备治疗性肽的方法 | |
| NO781404L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av thymosin alfa-1 og en analog forbindelse | |
| US5508382A (en) | Peptides and processes for producing cyclic peptides | |
| WO2019001459A1 (zh) | 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物 | |
| NO166449B (no) | Gonadoliberinderivater. | |
| CA1045626A (en) | Process for the manufacture of peptides containing cystine | |
| GB1590645A (en) | Process for preparing hentriacontapeptide having activity in reducing blood calcium levels | |
| EP0056274B1 (en) | Indole derivatives and a method for production of peptides | |
| US5252705A (en) | Peptide derivatives | |
| DK150145B (da) | Antigeniske peptider indeholdende 10-11 aminosyrerester | |
| EP0292256A2 (en) | Peptides having ANF activity | |
| KR840000054B1 (ko) | 티모신 α₁의 제조방법 |