NO335008B1 - Fremstilling av et fôrstoff, f.eks smaksfremmende middel fra en bakteriekultur som omfatter en metanotrof bakterie. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et forstoff eller en forstoffkomponent, f.eks. et smaks fremmende middel eller et næringsstoff, fra en bakteriell biomasse, og da spesielt fra en bakteriell kultur som omfatter en metanotrof bakterie. Dette produktet kan spesielt brukes som et næringsmiddel eller som et smaks fremmende middel både i matvarer for mennesker og i dyrefor som en erstatning for tradisjonelle gjærderivater.

Det har i de senere år vært mye oppmerksomhet omkring utviklingen av nye proteinkilder som kan inkorporeres i matvarer både for mennesker og/eller i dyrefor. En rekke forskjellige proteinholdige materialer og stoffer har vært foreslått som erstatning for mer tradisjonelle proteinkilder så som fiskemel, soyaprodukter og blodplasma, i matvarer for mennesker og i dyrefor. Disse materialene og stoffene innbefatter proteinholdige mikroorganismer (her også betegnet som "enkeltcelle-proteinet") så som sopp, gjær og bakterier.

Enkeltcelleproteinholdige materialer kan brukes direkte i matvarer, f.eks. som et forstøvningstørket produkt, eller biomassen kan videre bearbeides, f.eks. ved å bruke teknikker som homogenisering og/eller separasjon før bruk. WO 01/60974 beskriver f.eks. produksjonen av et homogenisert derivat av en bakteriell biomasse som har utmerkede funksjonelle egenskaper, og som kan brukes ved fremstillingen av forskjellige matprodukter, f.eks. som et gelmiddel eller som et emulgeringsmiddel.

Larsen et al. 1996, Appl. Bicrobiol. Biotechnol., 45:137-140 beskriver en fremgangsmåte for å redusere nukleinsyreinnholdet av den metanotrofe bakterien Methylococcus capsulatus (Bath) for å tilfredsstille de sikkerhetsmessige standarder for humant forbruk.

De mest anvendte enkeltcelleproteiner i dag er de som er avledet eller fremstilt fra sopp eller gjær. Gjær er f.eks. velkjent i forbindelse med brygging, vinfremstilling og i bakeindustrien. Forskjellige bearbeidede derivater av gjær er også kjent i forbindelse med fremstilling av matvarer. F.eks. vil en autolyse av gjær resultere i en rekke forskjellige cellulære komponenter som kan brukes som smaksstoffer eller krydder i matprodukter, f.eks. ved fremstillingen av forskjellige typer sauser etc. Det er imidlertid generelt nødvendig med relativt store mengder av gjærautolysater for å oppnå de forønskede smaksforbedrende effektene. Videre er autolysen av gjær relativt langsom, og det kan ta flere døgn for å oppnå en egnet grad av nedbrytning. Additiver som virker som autolyseinitiatorer eller stimulatorer, f.eks. tiolmidler, er derfor vanligvis nødvendig for å akselerere autolyseprosessen. Dette øker derfor omkostningene ved kommersiell produksjon av gjærautolysater.

Det er et kontinuerlig behov for alternative stoffer eller materialer som er i stand til å gjøre matprodukter både for mennesker og dyr mer velsmakende, da spesielt materialer eller stoffer som kan fremstilles i store mengder og med relativt lave omkostninger. Det er et spesielt behov for nye materialer som kan virke som smaksforbedrende midler.

Overraskende har man nå funnet at autolysen av en metanotrof bakterie-holdig biomasse, eller et derivat av en slik (f.eks. ved et homogenisert derivat), vil effektivt produsere velsmakenhetsfremmende komponenter, og som kan brukes som næringsstoffer, f.eks. i matvarer eller i matvare komponenter.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således i et aspekt en fremgangsmåte for fremstilling av en matvare eller en matvarekomponent, f.eks. et middel for å gjøre nevnte matvare eller matvarekomponent mer velsmakende, og hvor nevnte fremgangsmåte innbefatter å underkaste en kultur omfattende en metanotrof bakterie og en heterotrof bakterie, eller et derivat av denne (f.eks. et homogenisert derivat) i en autolyse. Autolyserte produkter fremstilt ved denne fremgangsmåten danner et ytterligere aspekt av oppfinnelsen.

Det autolysatet som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse kan typisk brukes som en matvare eller som en matvarekomponent for fisk eller skalldyr, f.eks. slik det er beskrevet i PCT/GB02/03795 (en kopi av denne er innsendt samtidig med foreliggende søknad). På lignende måte kan autolysatet med fordel brukes som et smaksforbedrende middel i matvarer for kjæledyr, da spesielt for hunder, f.eks. slik det er beskrevet i britisk patentsøknad nr. 0203907.1 (en kopi av denne er vedlagt søknaden).

Autolysatet ifølge oppfinnelsen blir fortrinnsvis brukt som en bestanddel for ekstrudert fiskefor i pelletsform. Fiskeforpellets vil typisk også inneholde proteiner og lipider, f.eks. fiskemel og fiske- og/eller planteolje, så vel som små mengder av karbohydrat, f.eks. planteavledet stivelse.

Slik det brukes her omfatter begrepet "autolyse" enhver fremgangsmåte hvor endogene enzymer som forefinnes inne i en celle, så som nukleaser og proteaser, bryter ned komponentene i cellen. Denne "selvnedbrytnings"-prosessen resulterer i produksjonen av forskjellige nedbrytningsprodukter fra cellen som kan innbefatte peptider, aminosyrer, nukleotider, fosfolipider, fettsyrer etc.

Slik det brukes her innbefatter begrepet "smaksfremmende evne" alle egenskaper for et matprodukt, som kan sanses av et menneske eller dyr. Slike egenskaper innbefatter ikke bare aroma, men også smak og struktur. Begrepet "smaksfremmende evne" er her definert til også å omfatte andre av matproduktets egenskaper, f.eks. fordøybarhet. Begrepet "et middel for å forsterke den smaksfremmende evnen" innbefatter her også materialer og stoffer som enten har de forønskede smaksfremmende egenskaper, eller når de er tilstede i et mulig matvareprodukt, effektivt bedrer den smaksfremmende evnen (f.eks. smaken eller lukten) for andre komponenter i matvaren.

Slik det brukes her innbefatter begrepet "derivat" når det brukes i sammenheng med et enkeltcelleproteinmateriale, f.eks. en mikrobekultur, ethvert produkt som kan avledes fra et slikt materiale ved å bruke en nedstrøms prosessteknikk eller teknikker (f.eks. en serie av teknikker) som er velkjente, så som å skille et enkelt-celleproteinholdig materiale fra et fermenteringsmedium eller væske ved sentrifugering og/eller ultrafiltreringsmetoder. Et foretrukket derivat for anvendelse i den her beskrevne fremgangsmåten er et homogenisert derivat av det enkeltcelleproteinmaterialet hvor cellene er brutt i stykker eller nedbrutt som et resultat av mekanisk oppbrytning, hvorved innholdet i cellen blir frigjort. Det homogeniserte materialet vil vanligvis bestå av en viskøs proteinsuspensjon som inneholder både løselige og partikkelformede cellulære komponenter.

I den foreliggende fremgangsmåten vil autolysen generelt bli utført ved å inkubere bakteriekulturen under nøyaktig kontrollerte betingelser. Egnede inkuberings-betingelser som er i stand til å starte den endogene enzymaktiviteten, og som således vil gi et autolysert produkt, kan lett bestemmes av fagpersoner innenfor dette tekniske området. Autolysen utføres fortrinnsvis i fravær av en autolyse-initiator eller stimulator.

Temperaturbetingelsene vil være slike som gjør at autolysen blir optimalisert uten å inaktivere de endogene enzymer, som forefinnes inne i cellene. Typisk vil autolyse-temperaturen ligge i området fra 25-58°C, fortrinnsvis fra 40-55°C, spesielt foretrukket fra 45-55°C, spesielt 50-55°C. Temperaturer mot den øvre del av disse områdene er foretrukket, dvs. ca. 55°C. Hvis det anvendes lavere temperaturer (f.eks. 20°C eller lavere), vil autolysen skje meget langsomt. Når en anvender bakterien Methylococcus capsulatus bør inkuberingstemperaturen fortrinnsvis ikke overstige ca. 58°C. Ved en høyere temperatur kan det skje en inaktivering av de endogene enzymene som forefinnes i cellene (f.eks. proteaser og peptidaser).

Et egnet pH-område for autolysen ligger i området fra 6,2-8,5, fortrinnsvis fra 7,0-8,0, spesielt foretrukket fra 7,0-7,5. Ved en pH som ligger under 5,5 vil det ikke skje noen autolyse. En pH på ca. 7,0 er spesielt foretrukket. Type, mengde og tidspunkt for tilsetting av eventuelle baser som er nødvendig for å opprettholde pH i biomassen innenfor de forønskede grenser under autolysen, kan lett bestemmes av personer innenfor fagfeltet. Egnede baser for pH-regulering innbefatter natriumhydroksid, kaliumhydroksid etc. Det autolyserte produktet kan fremstilles enten ved en kontinuerlig eller porsjonsvis prosess. Fortrinnsvis vil produktet bli fremstilt kontinuerlig. Når det fremstilles porsjonsvis, vil pH på biomassen avta raskt under de første trinn av reaksjonen, dvs. fra ca. 30 min. opptil 1 time etter at inkuberings-prosessen er startet. En antar at dette skyldes oppbrytning av peptidbindingene. Under denne perioden vil det således kunne være nødvendig å øke mengden av base som er nødvendig for å holde pH innenfor de forønskede grenser. Etter dette tidspunkt vil det vanligvis være et fallende behov for den nødvendige mengde av base. pH kan reguleres under autolysen ved hjelp av standardmetoder. Slike metoder innbefatter kontinuerlig kontroll av pH ved titrering i kombinasjon med passende tilsetning av syre/base.

Reaksjonstiden for autolysen vil typisk ligge i området fra ca. 30 min. til 24 timer, f.eks. fra 1-5 timer. En foretrukken reaksjonstid er ca. 4 timer. Vanligvis vil utbyttet av autolysert produkt øke med reaksjonstiden. Inkuberingsperioden kan derfor velges alt etter det forønskede utbyttet av autolysat.

Autolyseprosessen vil vanligvis bli utført i en rørt tankreaktor eller en idealstrøms-reaktor.

Det er forventet at den her beskrevne autolyseprosessen gir et produkt som omfatter fra 40-75 vekt%, dvs. ca. 50 vekt%, av uløselig materiale (som f.eks. omfatter celleveggfragmenter etc), og fra 25-60 vekt%, f.eks. ca. 50 vekt%, løselig materiale (er også betegnet som "den løselige fraksjonen"), som typisk vil omfatte frie aminosyrer (spesielt glutaminsyre), peptider og nukleotider (i alt vesentlig 3'-nukleotider).

Den bakterielle biomasse som brukes i den foreliggende fremgangsmåten kan fremstilles ved å dyrke bakteriene på et egnet medium eller substrat. Den nøyaktige type av vekstmedium som skal brukes for å fremstille biomassen er ikke kritisk med hensyn til gjennomføring av oppfinnelsen, og en rekke forskjellige egnede substrater kan således brukes.

Hensiktsmessig kan enkeltcellematerialet som skal brukes i den foreliggende fremgangsmåten fremstilles ved en fermenteringsprosess, hvor oksygen og et egnet substrat, f.eks. et flytende eller gassformet hydrokarbon, en alkohol eller et karbohydrat, f.eks. metan, metanol eller naturgass, sammen med en næringsmineral-løsning, føres til en rørformet reaktor som inneholder mikroorganismen eller mikroorganismene. En rekke slike prosesser er velkjente og beskrevet innenfor litteraturen, f.eks. i WO 01/60974, DK-B-170824, EP-A-418187 og EP-A-306466. Det er spesielt foretrukket at biomassen som skal autolyseres ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er fremstilt som beskrevet i PCT/GB02/003798 (en kopi av denne er vedlagt søknaden.

Spesielt foretrukket for anvendelse i oppfinnelsen er enkeltcelleproteinmaterialer avledet fra en fermentering av hydrokarbonfraksjoner eller naturgass. Spesielt foretrukket er enkeltcelleproteiner avledet fra en fermentering av naturgass. Ettersom konsentrasjonen av mikroorganismene øker inne i fermenteringskaret eller reaktoren, så vil en del av reaktorinnholdet eller mediet tas ut, hvoretter mikroorganismene kan skilles ut ved hjelp av velkjent teknikk, f.eks. sentrifugering og/eller ultrafiltrering. I en slik fermenteringsprosess er det hensiktsmessig at det medium som kontinuerlig tas ut av fermenteringsreaktoren, har en cellekonsentrasjon på fra 1-5 vekt%, f.eks. ca. 3 vekt%.

Enkeltcellematerialer fremstilt fra to eller flere mikroorganismer kan behandles i overenstemmelse med den foreliggende fremgangsmåten. Skjønt disse kan fremstilles i den samme eller i separate fermenteringsreaktorer, så vil de vanligvis bli fremstilt i den samme reaktoren under identiske fermenteringsbetingelser. Materialet fremstilt i separate fermenteringsprosesser kan blandes før autolyse utføres i overenstemmelse med den foreliggende fremgangsmåten.

Foretrukne bakterier for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen innbefatter Methylococcus capsulatus (Bath), en termofil bakterie opprinnelig isolert fra varme kilder i Bath, England, og innlevert som NCIMB 11132, til den nationale samling av industrielle og marine bakterier, Aberdeen, Skottland. M. capsulatus (Bath) har en optimal vekst ved ca. 45°C, skjønt det kan også skje en vekst mellom 37 og 52°C. Nevnte bakterie er en gram-negativ, ikke-bevegelig rund celle, som vanligvis opptrer i par. De intracellulære membranene er arrangert som bunter av karformede skiver som er karakteristisk for type 1 metanotrofer. M. capsulatus (Bath) er genetisk en meget stabil organisme uten kjente plasmider. Den kan bruke metan eller metanol for vekst, og ammoniakk, nitrat eller molekylært nitrogen som en nitrogenkilde for proteinsyntese.

Ett eksempel på en fermenteringsprosess som bruker naturgass som eneste karbon-og energikilde, er den som er beskrevet i EP-A-306466 (Dansk Bioprotein). Denne prosessen er basert på en kontinuerlig fermentering av den metanotrofe bakterien M. capsulatus som dyrkes på metan. Luft eller rent oksygen brukes for oksygenering, mens ammoniakk brukes som nitrogenkilden. I tillegg til disse substratene vil bakteriekulturen vanligvis kreve vann, fosfat (f.eks. som fosforsyre), og flere mineraler som kan innbefatte magnesium, kalsium, kalium, jern, kobber, sink, mangan, nikkel, kobolt og molybden, vanligvis som sulfater, klorider eller nitrater. Alle de mineraler som brukes ved fremstillingen av enkeltcellematerialet bør være av matkvalitet.

Naturgass består i alt vesentlig av metan, skjønt dens sammensetning vil variere fra gassfelt til gassfelt. Det er typisk forventet at naturgass vil inneholde ca. 90 % metan, ca. 5 % etan, ca. 2 % propan og enkelte høyere hydrokarboner. Under fermenteringen av naturgassen vil metanen bli oksidert av metanotrofe bakterier til biomasse og karbondioksid. Metanol, formaldehyd og maursyre er metabolske mellomprodukter. Formaldehyd og til en viss grad karbondioksid vil også bli assimilert i biomassen. Metanotrofe bakterier vil imidlertid ikke være i stand til å bruke substrater som innbefatter karbon til karbonbindinger for vekst, og de gjenværende komponentene i naturgassen, dvs. etan, propan og til en viss grad høyere hydrokarboner, vil bli oksidert av de metanotrofe bakteriene til de tilsvarende karbosykliske syrene (f.eks. vil etan bli oksidert til eddiksyre). Slike produkter vil være hemmende for de metanotrofe bakteriene, og det er derfor viktig at konsentrasjonen av disse vil være lav, fortrinnsvis under 50 mg/l, under produksjonen av biomassen. En løsning på dette problemet er en kombinert anvendelse av én eller flere heterotrofe bakterier som er i stand til å bruke de metabolitter som er fremstilt av de metanotrofe bakteriene. Slike bakterier vil også være i stand til å bruke organiske forbindelser som frigjøres i fermenteringsmediet ved celleoppløsningen. Dette er viktig for å unngå skumdannelse og dessuten å minimalisere risikoen for at kulturen blir forurenset med uønskede bakterier. En kombinasjon av metanotrofe og heterotrofe bakterier vil resultere i en stabil og høytytende kultur.

Egnede heterotrofe bakterier som kan brukes i oppfinnelsen innbefatter DB3, stamme NCIMB 13287 { Ralstonia sp. tidligere kjent som Alcaligenes acidovorans), DB5, stamme NCIMB 13289 ( Brevibacillus agri, tidligere kjent som Bacillus firmus) og DB4, stamme NCIMB 13288 ( Aneurinibacillus sp. tidligere kjent som Bacillus brevis), som hver har en optimal vekst ved en temperatur på ca. 45°C.

DB3 er en gram-negativ, aerob, bevegelig stavformet bakterie som hører til slekten Ralstonia, og som kan bruke etanol, acetat, propionat og butyrat for vekst. DB4 er en gram-positiv, endosporedannende, aerob, stavformet bakterie som hører til slekten Aneurinibacillus, som kan bruke acetat, D-fruktose, D-mannose, ribose og D-tagatose. DB5 er en gram-positiv, endosporedannende, bevegelig, aerob stavformet bakterie fra slekten Brevibacillus, som kan bruke acetat, N-acetyl-glukosamin, sitrat, glukonat, D-glukose, glyserol og mannitol.

Det er spesielt foretrukket at det enkeltcelleproteinmaterialet som skal brukes i foreliggende oppfinnelse, er en mikrobiell kultur som består av metanotrofe bakterier, eventuelt i kombinasjon med én eller flere arter av heterotrofe bakterier, da spesielt en kombinasjon av metanotrofe og heterotrofe bakterier. Slik det brukes her innbefatter begrepet "metanotrof enhver bakterie som anvender metan, metanol og formaldehyd for vekst. Begrepet "heterotrof' brukes for bakterier som bruker organiske substrater forskjellig fra metan, metanol eller formaldehyd for vekst.

Spesielt foretrukket for anvendelse i oppfinnelsen er en mikrobiell kultur som omfatter en kombinasjon av den metanotrofe bakterien Metylococcus capsulatus (Bath) (stamme NCIMB 11132), og den heterotrofe bakterien DB3 (stamme NCIMB 13287) og DB5 (stamme NCIMB 13289), eventuelt i kombinasjon med DB4 (stamme NCIMB 13288). DB3's rolle er å anvende acetat og propionat som er fremstilt av M. capsulatus (Bath) fra etan og propan i naturgassen. DB3 kan utgjøre opptil 10 %, f.eks. fra 68 % av det totale celletallet i den resulterende biomassen. Rollen til DB4 og DB5 er å anvende oppløsningsprodukter og metabolitter i mediet. Typisk vil DB4 og DB5 hver utgjøre mindre enn 1 % av antall celler under kontinuerlig fermentering.

Under produksjon av nevnte enkeltcellemateriale vil pH i fermenteringsblandingen vanligvis bli regulert til å ligge mellom 6 og 7, f.eks. 6,5 + 0,3. Egnede syrer og baser for pH-regulering kan lett bestemmes av personer innenfor fagfeltet. Spesielt egnet for bruk i så henseende er natriumhydroksid og svovelsyre. Under fermenteringen bør temperaturen inne i fermenteringsreaktoren fortrinnsvis holdes i området fra 40-50°C, mest foretrukket 45°C + 2°C.

Egnede fermenteringskar eller reaktorer som kan brukes for fremstilling av enkeltcellematerialet, er de av sløyfetypen, f.eks. av den type som er beskrevet i DK 1404/92, EP-A-306466 og PCT/GB02/003798, eller luftheisreaktorer. En reaktor av sløyfetypen har statiske blandere, noe som resulterer i en høy anvendelse av gassene (opptil ca. 95 %), på grunn av de ideelle strømningsegenskapene i fermenteringskaret eller reaktoren. Gassene føres inn på flere steder langs sløyfen, og forblir i kontakt med væsken inntil de blir utskilt på toppen av reaktoren. Kontinuerlig fermentering oppnås ved å bruke 2-3 % biomasse (på tørrvektbasis), og et fortynningsforhold på 0,02-0,50 pr. time, f.eks. 0,05-0,25 pr. time.

Andre fermenteringskar eller reaktorer som kan brukes for fremstilling av enkeltcellematerialet, innbefatter rørformede eller rørte tankreaktorer.

Ideelt vil den biomassen som fremstilles ved fermenteringen av naturgassen, omfatte fra ca. 60-80 vekt% råprotein; fra ca. 5-50 vekt% urent fett; og fra 3-10 vekt% aske; fra 3-15 vekt% nukleinsyre (RNA og DNA); fra 10-30 g/kg fosfor; opptil 350 mg/kg jern, og opptil 120 mg/kg kobber. Det er spesielt foretrukket at biomassen omfatter fra 68-73 %, f.eks. 70 vekt% urent protein, fra 9-11 %, f.eks. 10 vekt% urent fett; fra ca. 5-10 %, f.eks. 7 vekt% aske; fra 8-12, f.eks. 10 vekt% nukleinsyre (RNA og DNA); fra 10-25 g/kg fosfor, opptil 310 mg/kg jern og opptil 110 mg/kg kobber. Aminosyreprofilen for proteininnholdet bør være næringsmessig gunstig med et høyt innhold av de mer viktige aminosyrene cystein, metionin, treonin, lysin, tryptofan og arginin. Typisk vil disse være tilstede i mengder fra ca. 0,7 %, 3,1 %, 5,2 %, 7,2 %, 2,5 % og 6,9 % henholdsvis (uttrykt som prosent av den totale mengden av aminosyrer). Generelt vil fettsyrene i alt vesentlig bestå av den mettede palmitinsyren (ca. 50 %) og den mono-umettede palmitolinsyren (ca. 36 %). Mineralinnholdet i produktet vil vanligvis omfatte betydelige mengder fosfor (ca. 1,5 vekt%), kalium (ca. 0,8 vekt%) og magnesium (ca. 0,2 vekt%).

Typisk vil den resulterende biomassen bli fremstilt i form av en flytende vandig pasta eller suspensjon. Generelt vil denne i alt vesentlig bestå av helt cellemateriale, skjønt en del av oppbrutt cellemateriale vil også være tilstede.

Etter produksjonen av biomassen vil denne generelt bli konsentrert fra fermenteringsmediet, f.eks. ved vanlig sentrifugering og/eller filtreringsmetoder, f.eks. ultrafiltrering. Konsentrasjonen av biomassen kan utføres ved sentrifugering alene. Under sentrifugeringen vil tørrstoffinnholdet i biomassen typisk øke til ca. mellom 15 og 18 vekt%, fortrinnsvis 8-15 %, f.eks. 14 vekt%. Hvis det er nødvendig eller ønskelig kan det brukes filtreringsmetoder (f.eks. ultrafiltrering), for ytterligere å øke innholdet av faste stoffer i biomassen. Ultrafiltrering kan f.eks. utføres ved temperaturer mellom 40 og 50°C, f.eks. mellom 42 og 46°C, noe som vil ytterligere konsentrere biomassen til et produkt som inneholder fra 10-30 %, fortrinnsvis fra 15-25 %, f.eks. 18-22 vekt% av enkeltcellematerialet. Den størrelsesutelukkelse som brukes under ultrafiltreringen vil vanligvis ligge i området på ca. 100000 Dalton. Den resulterende biomassen vil være i form av en vandig suspensjon og vil typisk ha et innhold av faste stoffer varierende fra 10-30 %, fortrinnsvis fra 15-25 %, f.eks. ca. 20 vekt%.

Før autolysen kan biomassen eventuelt underkastes en homogeniseringsprosess hvor mikrobecelleveggene brytes opp, hvorved det frigjøres proteinmateriale fra selve cellestrukturen. Hvis det er nødvendig kan det resulterende homogenatet underkastes ytterligere filtreringsmetoder (f.eks. ultrafiltrering).

Homogeniseringen resulterer i en produksjon av et produkt som fortrinnsvis omfatter i alt vesentlig oppbrutt cellemateriale. F.eks. kan det oppbrutte cellematerialet være tilstede i en mengde på minst 80 %, fortrinnsvis minst 90 vekt%. Typisk vil produktet være en relativt viskøs proteinsuspensjon som inneholder løselige og partikkelformede cellekomponenter.

Det er antatt at homogeniseringstrinnet har liten hvis noen i det hele tatt effekt på smaksegenskapene for det endelige produktet, men kan tjene til å øke utbyttet av tørrstoff i den løselige fraksjonen i det autolyserte materialet. F.eks. kan dette øke tørrstoffinnholdet i den løselige fraksjonen med så mye som fra 20-25 %. Hvor mye tørrstoffinnholdet øker er også avhengig av varigheten på autolyseprosessen. En autolyse av et homogenisert materiale på 24 timer kan f.eks. forventes å resultere i et produkt hvor utbyttet av den løselige fraksjonen er opptil 60 vekt%. I fravær av et homogeniseringstrinn før autolysen, kan det forventes at utbyttet av den løselige fraksjonen er ca. 50 vekt%.

Nedbrytning eller desintegrering av cellene kan f.eks. oppnås ved en mekanisk prosess, så som en sekvens hvor det mikrobielle materialet utsettes for trykkøkning og trykkavlastning. Skjønt homogeniseringen kan utføres på vanlig kjent måte, så vil den fortrinnsvis bli utført ved en høytrykks homogeniseringsprosess, hvor biomassen underkastes forandringer i trykk, fortrinnsvis et trykkfall, som er i stand til å frembringe en celledisintegrering. Typisk vil materialet bli underkastet et trykkfall varierende fra 40 MPa til 120 MPa (400-1200 bar), mer foretrukket fra 40 MPa til 110 MPa (500-1100 bar), f.eks. fra 60 MPa til 100 MPa (600-1000 bar). Et trykkfall på ca. 1000 bar er spesielt foretrukket, og generelt vil trykkfallet være øyeblikkelig. Typisk vil prosessen bli gjennomført i et industrielt homogeniserings-apparat, f.eks. av den type som er tilgjengelig fra APV Rannie, Danmark, under kontrollerte temperaturbetingelser, fortrinnsvis ved en temperatur på mindre enn 58°C, spesielt foretrukket fra 25-50°C, f.eks. fra 25-35°C. En homogeniseringsprosess som er egnet for bruk i den foreliggende oppfinnelsen er f.eks. beskrevet i WO 01/60974 (til Norferm DA).

Det er også andre kjente fremgangsmåter som kan brukes for å gjennomføre homogeniseringen i overenstemmelse med oppfinnelsen. F.eks. kan homogeniseringen utføres ved å underkaste enkeltcellematerialet skjærkrefter som er i stand til å bryte celleveggene. Dette kan utføres ved å bruke en blander hvor materialet føres gjennom en sone hvor det utøves skjærkrefter ved at overflater beveger seg i forhold til hverandre. Generelt vil skjærkrefter bli skapt mellom en bevegelig overflate, f.eks. en roterende overflate, og en statisk overflate, f.eks. i en rotor-stator slik dette er beskrevet i WO 99/08782.

Det er også mulig å bruke andre teknikker som er kjent fra fremgangsmåter for mekanisk celleoppbrytning, f.eks. høyhastighets kulemaling, for derved å få gjennomført homogeniseringen. Ultralydmetoder kan også brukes.

I et foretrukket aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en matvare eller matvarekomponent, f.eks. et materiale som bedrer den smaksfremmende evnen (f.eks. et smaks- eller duftforbedrende middel), og hvor nevnte fremgangsmåte omfatter de følgende trinnene: (a) fremstilling av en vandig suspensjon av en mikrobiell kultur som omfatter en metanotrof bakterie i kombinasjon med én eller flere heterotrofe bakterier; (b) eventuelt homogenisere suspensjonen, fortrinnsvis ved at denne underkastes et trykkfall som er i stand til å frembringe en cellenedbrytning, f.eks. et trykkfall i området fra 40 MPa til 120 MPa, fortrinnsvis fra 50 MPa til 110 MPa, spesielt fra 60 MPa til 100 MPa,

hvorved det fremstilles et homogenisert produkt; og

(c) underkaste det resulterende produkt en autolyse.

Etter autolysen blir autolysatet fortrinnsvis oppvarmet, typisk til en temperatur varierende fra 58-75°C, fortrinnsvis 65-69°C, f.eks. ca. 67°C.

Autolysatet vil omfatte en blanding av løselig og uløselig cellemateriale. Skjønt dette kan brukes direkte (dvs. uten ytterligere bearbeiding) som en komponent eller som en forløper i matprodukter (f.eks. som et middel for å bedre den smaksfremmende evnen eller som en duft eller smakskomponent), så er det foretrukket å skille ut det uløselige cellematerialet. Dette kan utføres ved hjelp av kjente separasjonsprosesser, fortrinnsvis ved filtrering, f.eks. ultrafiltrering. Ultrafiltreringen som kan utføres ved temperaturer mellom 40 og 75°C, f.eks. mellom 50 og 70°C, vil effektivt filtrere ut aminosyrer, peptider og andre mindre molekyler så som nukleotider, som er i stand til å krysse filtermembranen. Det er denne løselige fraksjonen som i alt vesentlig vil bli brukt ved fremstillingen av mateprodukter, f.eks. som et middel for å bedre den smaksfremmende evnen. Den størrelsesutelukkelse som brukes under ultrafiltreringen vil vanligvis ligge i området omkring ca. 20 kD. En kan imidlertid også bruke filtre som har en molekylvektsavskjæring i området fra 10-100 kD. For å bedre utbyttet av produkt, kan autolysatet vaskes flere ganger (dvs. opptil fem ganger, f.eks. opptil tre ganger) med vann etter ytterligere ultrafiltreringstrinn.

Etter separasjon av autolysatet er det forventet at innholdet av faste stoffer i den løselige fraksjonen vil være fra ca. 3-8 vekt%. Innholdet av glutaminsyre og frie aminosyrer (på tørrstoffbasis), kan forventes å ligge i området fra ca. 5-11 % og 40-50 % henholdsvis.

Hvis det er ønskelig kan vanninnholdet i produktet reduseres ytterligere ved fordampningsmetoder som i seg selv er kjente. F.eks. kan slike brukes for å fremstille et produkt som har et tørrstoffinnhold i området fra 20-70 vekt%, f.eks. 30 vekt%. Egnede fordampningsmetoder innbefatter fallende-stigende filmfordampning, fallende filmfordampning og flashfordampning. Hvis det er nødvendig kan denne fordampningen gjentas flere ganger, f.eks. tre ganger. I forbindelse med skumdanningsproblemer under fordampningen, er det mulig å tilsette et antiskumningsmiddel, så som Kirnol V39360 (tilgjengelig fra Griinau Illerissen GmbH, Tyskland). Den mengde av antiskumningsmiddel som er nødvendig for å hindre skumdannelse kan lett bestemmes ved enkle eksperimenter. Passende mengder av antiskumningsmidlet ligger i området fra 0,01-0,05 %, f.eks. ca. 0,02 vekt%.

Umiddelbart etter fordampningen bør produktet avkjøles, f.eks. til en temperatur i området fra 5-20°C, f.eks. til en temperatur på ca. 15°C.

Typisk vil produktet bli ytterligere bearbeidet i overenstemmelse med forstøvningstørketeknikker som er velkjente. Enhver vanlig forstøvningstørker med eller uten fluidiserende sjiktenheter kan brukes, f.eks. den type 3-SPD-forstøvningstørkeren som er tilgjengelig fra AP V Anhydro, Danmark. Innløpstemperaturen for luften i forstøvningstørkeren bør fortrinnsvis ligge mellom 140 og 250°C, mens utløpstemperaturen bør være fra 80-95°C. Det resulterende produkt vil fortrinnsvis ha et vanninnhold fra ca. 1-10 vekt%, f.eks. fra 2-7 vekt%.

Det resulterende produktet er sterkt hygroskopisk og bør derfor lagres i et fuktighetsfritt miljø (f.eks. i tørre poser) ved lave temperaturer.

Som et resultat av den her beskrevne autolyseprosessen vil det bli fremstilt produkter i overenstemmelse med foreliggende oppfinnelse som er rikt på frie aminosyrer, da spesielt glutaminsyre og peptider. Slike produkter har vanligvis en blek farge, nøytral i smak og er sterkt løselig i vann (f.eks. totalt løselig når det fremstilles en 1 % løsning i varmt vann). Produktene er spesielt brukbare som en komponent eller som en forløper i matprodukter, da spesielt når de brukes som et middel for å øke den smaksfremmende evnen eller for å bedre duft eller smak, f.eks. for å bedre smak eller duft i matvarer for mennesker eller dyr (f.eks. dyrefor).

Et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer et autolysert produkt avledet fra en metanotrof bakterieholdig biomasse eller et derivat av en slik masse (f.eks. et homogenisert derivat), hvor nevnte produkt har et aminosyreinnhold varierende fra 40-80 %, f.eks. fra 50-60 vekt% (på tørrstoffbasis). Et foretrukket produkt i overenstemmelse med oppfinnelsen har et innhold av glutaminsyre varierende fra 5-11 %, f.eks. fra 8-10 vekt% (på tørrstoffbasis).

Et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer anvendelsen av et autolysert materiale eller et bearbeidet derivat av dette slik det er beskrevet her, i eller som en forløper for en matvare, fortrinnsvis som et middel for å bedre den smaksfremmende evnen, f.eks. som en smak- eller duftkomponent.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer et matprodukt som omfatter et autolysert materiale eller bearbeidet derivat av dette slik det er beskrevet her.

Når det brukes som et middel for å bedre den smaksfremmende evnen i matprodukter, så vil det autolyserte materialet eller en bearbeidet utgave av dette, brukes i mengder som effektivt bedrer duft og/eller smak slik den oppleves av forbrukeren. Spesielt foretrukket vil materialet brukes i en mengde som effektivt bedrer matvarens smaksfremmende evne. Typisk vil denne mengden ligge i området fra 0,1-4 vekt%, fortrinnsvis opptil 2 vekt%. Det nøyaktige mengdeforholdet vil være avhengig av flere forskjellige faktorer, ikke minst den type matvare som produktet skal tilsettes, foruten på hvilken måte produktet tilsettes matvaren. Passende nivåer kan lett bestemmes ved enkle eksperimenter.

Det autolyserte produktet som her er beskrevet kan brukes som en erstatning for tradisjonelle gjærderivater. Matvarer som produktet kan tilsettes, innbefatter både matvarer for mennesker foruten i dyrefor. F.eks. kan produktene inkorporeres i matprodukter for mennesker, så som supper, sauser, dressinger, kjøttprodukter så som kjøttboller, emulsjoner så som majones etc. Det her beskrevne produktet er spesielt anvendbart som et smakstilsetningsmiddel i for for kjæledyr, både i våt og tørr tilstand, fortrinnsvis i tørr tilstand. F.eks. kan produktet brukes som en tilsetning til hundefor.

Et biprodukt ved den fremgangsmåten som her er beskrevet, er det såkalte retentatet (dvs. den uløselige fraksjonen) fremstilt etter separasjon av det autolyserte materialet. Dette produktet vil generelt omfatte forskjellige komponenter så som celleveggfragmenter, og har høy næringsverdi. Dette produktet vil f.eks. kunne ha den følgende sammensetning: Vanninnhold (bestemt ifølge M101<1>): 1-10 vekt%, f.eks. ca. 4 vekt%; Askeinnhold (bestemt ifølge EU-kommisjonens direktiv nr. 162/67/EØF): 3-12 vekt%, f.eks. 10 vekt%;

Råfett (bestemt ifølge EU-kommisjonens direktiv nr. 93/28/EØF): 10-20 vekt%, f.eks. 15 vekt%;

Råprotein (bestemt ifølge EU-kommisjonens direktiv nr. 72/199/EØ): 40-60 vekt%, f.eks. 54 vekt%;

RNA (bestemt ifølge M105<2>): 4-10 vekt%, f.eks. ca. 6 vekt%;

DNA (bestemt ifølge M105<2>): 2-5 vekt%, f.eks. ca. 3 vekt%;

Totalt innhold av aminosyrer (bestemt ifølge M295<3>): 39.41 vekt%;

Totalt karbohydrat (bestemt ifølge M140<4>): opptil 15 vekt%, f.eks. 1-12 vekt%, typisk ca. 10 vekt%; og

In vitro fordøybarhet (bestemt ifølge M150<5>): 65-85 % av N, f.eks. ca. 65 % av N.

1: Vannet i prøven blir fordampet ved 105°C over natten. Vanninnholdet blir bestemt ved veiing før og etter tørking.

2. Se Herbert et al., Chemical Analysis of Microbial cells, Methods Microbiol. 5B: 285-328, 1971. 3. Se Waters AccQ.Tag Chemistry Package. Instruction Manual 052874TP, Rev. 1, og Wandelen et al., Journal pf Chromatography A, 763, 11-22. 4. Se Herbert et al., Chemical Analysis of Microbial cells, Methods Microbiol. 5B: 267-269, 1971.

5. Se Boisen, CAB International, sider 135-145, 1991.

Dette biproduktet kan brukes i forskjellige typer matprodukter, spesielt som en næringstilsetning i dyrefor. Det har også vist seg at produktet har gode emulgerende egenskaper og kan derfor brukes som et emulgeringsmiddel i matprodukter for mennesker. Dette produktet og dets anvendelse i matprodukter danner ytterligere aspekter av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vil nå bli mer detaljert beskrevet i de følgende ikke-begrensende eksempler og med referanse til de vedlagte figurer hvor:

Fig. 1 viser skjematisk et apparat for å gjennomføre en fremgangsmåte i overenstemmelse med oppfinnelsen; Fig. 2 viser tørrstoffinnholdet som en funksjon av inkuberingstid, i forskjellige autolysater i overenstemmelse med oppfinnelsen etter ultrafiltrering (MW-avskjæring 20000 D); Fig. 3 viser nitrogeninnholdet som en funksjon av inkuberingstiden i forskjellige autolysater i overenstemmelse med oppfinnelsen; Fig. 4 viser innholdet av MSG som en funksjon av inkuberingstiden i forskjellige autolysater i overenstemmelse med oppfinnelsen; Fig. 5 viser ct-N-innholdet som en funksjon av inkuberingstiden i forskjellige autolysater i overenstemmelse med oppfinnelsen; Fig. 6 viser det frie aminosyreinnholdet i forskjellige autolysater i overenstemmelse med oppfinnelsen; Fig. 7 viser det frie aminosyreinnholdet som en funksjon av inkuberingstiden i et autolysatprodukt i overenstemmelse med oppfinnelsen (autolysat-3); Fig. 8 viser skjematisk tidsforløpet i en autolysemetode ifølge oppfinnelsen; Fig. 9 er et diagram som viser pH versus tid; Fig. 10 er et diagram som viser pH versus tid;

Fig. 11 er et diagram som viser viskositetsutviklingen i forhold til tid; og

Fig. 12 er et diagram som viser viskositetsutviklingen i forhold til tid.

Eksempel 1 - Fremstilling av autolysat

En mikrobiell kultur som bestod av Methylococcus capsulatus (Bath) (stamme NCIMB 11132), DB3 (stamme NCIMB 13287) og DB5 (stamme NCIMB 13289), ble fremstilt i en fermenteringsreaktor av sløyfetypen ved kontinuerlig aerob fermentering av naturgass i et ammonium/mineralsaltholdig medium (AMS) ved 45°C, pH 6,5. AMS-mediet inneholdt det følgende pr. liter: 10 mg NH3, 75 mg H3P04-2H20, 380 mg MgS04-7H20, 100 mg CaCl2-2H20, 200 mg K2S04, 75 mg FeS04-7H20, 1,0 mg CuS04-5H20, 0,96 mg ZnS04-7H20, 120^g CoCl2-6H20, 48 Hg MnCl2-4H20, 36^g H3BO3, 24^g NiCl2-6H20 og 1,20^g NaMo04-2H20.

Fermenteringsreaktoren ble fylt med vann som på forhånd var varmebehandlet ved 125°C i 10 sek. Tilsetning av forskjellige næringsstoffer ble regulert alt etter deres forbruk. Med gradvis oppbygning over tid ble den kontinuerlige fermenteringen utført med en biomasse på 1-3 % (på tørrvektsbasis).

Biomassen ble underkastet sentrifugering i en industriell kontinuerlig sentrifuge ved 3600 rpm, fulgt av en ultrafiltrering ved å bruke membraner som hadde en utelukkelsesstørrelse på 20000 Daltons. Det resulterende produktet som inneholder ca. 12-20 vekt% biomasse, ble så eventuelt underkastet homogenisering i en industriell homogenisator (trykkfall: 1000 bar (100 MPa); innløpstemperatur: 15°C), for derved å få fremstilt en homogenisert biomasse. 12 % suspensjonen av biomasse ble oppvarmet til den optimale reaksjonstemperaturen på 55°C, og pH ble justert til 7,0-7,5 ved å tilsette NaOH. Inkuberingstiden var 4 timer, og i løpet av dette tidsrom ble temperaturen på massen holdt i området fra 50-55°C, mens pH ble holdt i det optimale området fra 7,0-7,5.

Etter inkubering ble biomassen underkastet ultrafiltrering ved en temperatur varierende fra 50-70°C ved å bruke en membran med en molekylær utelukkelsesgrense på ca. 20 kD. Hvis det var nødvendig ble gjentatte vaskinger av biomassen med vann fulgt av ytterligere ultrafiltreringstrinn, for derved eventuelt å øke det forønskede utbyttet av permeat, som vil inneholde ca. 4,2 vekt% tørrstoff.

Det resulterende produkt eller permeat ble avkjølt og lagret i en lukket beholder før dampbehandling.

Fordampning ved temperaturer varierende fra 60-70°C i nærvær av et antiskummemiddel, vil ytterligere øke innholdet av faste stoffer i produktet til ca.

35 vekt%.

Eksempel 2 - Fremstilling og egenskaper for autolysater

Fremgangsmåte

Autolysater ble fremstilt ved hjelp av følgende fremgangsmåte:

1. En mikrobiell kultur (biomasse) ble fremstilt ved en fermenteringsprosess som beskrevet i eksempel 1. Den samlede biomasse ble konsentrert til et tørrstoffinnhold på fra 6-8 vekt% ved sentrifugering.

2. Homogenisering: trykkfall fra 1000 til 0 bar.

3. Homogenisatet ble underkastet ultrafiltrering.

4. Temperatur og pH ble justert som angitt i tabell 1 (se nedenfor).

5. Inkubering i 4 timer.

6. Etter inkubering ble 1,1 1 filtrat (20000 MW utelukkelse) utskilt.

7. Filtratet ble sterilisert ved oppvarming til 90°C i 10 min.

8. Etter sterilisering ble autolysatet avkjølt og plassert i en fryser.

9. Filtrering (maksimum 20 % tørrstoff).

10. Konsentratet ble avkjølt og forstøvningstørket (inn- og utløpstemperatur:

200°C/90°C), og prøvene ble merket som autolysatene 1-5.

Under ultrafiltreringstrinnet (trinn 6), ble produktets egenskaper (dvs. filtratet eller permeatet) bestemt på forskjellige trinn. 100 ml filtrat ble tatt ut etter 30 min., 1 time, 2 timer og 3 timer etter starten på inkuberingen (for autolysat 5 ble prøvene bare testet etter 1 time). Filtreringsprøvene ble hver sterilisert som beskrevet i trinn 7. For hver prøve (så vel som for prøver av de endelige produkter, dvs. etter 4 timers inkubering), så ble tørrstoffinnholdet målt, og prøven ble så frysetørket. De frysetørkede prøvene ble analysert for følgende egenskaper: innhold av protein, amino-nitrogen, MSG (glutamin syre) og frie aminosyrer.

Resultater og diskusjon

Smaksprøve

I en smaksprøve var det bare minimale forskjeller med hensyn til smak mellom autolysatene 1-4 med en liten preferanse for autolysat 3. Intensiteten av "en svak gjæraktig lukt" lot seg sammenligne med den standard lette gjær som brukes i dag. Smaken på autolysat 5 var ubehagelig.

Kjemisk analyse

Ved fremstillingen av autolysatene 1-4, ble det tatt prøver etter en halv, 1, 2, 3 og 4 timer etter at inkuberingen var startet, for å bestemme hvorledes produktet utviklet seg over tid.

Fig. 2 viser økningen over tid for tørrstoffinnholdet i de forskjellige prøvene etter ultrafiltrering (MW-utelukkelse 20000 D). Resultatene viser at autolyseprosessen skjer i alt vesentlig lineært når inkuberingstemperaturen holdes mellom 45 og 55°C, mens pH ligger i området fra 7-8. Etter en halv time vil ca. 30 % av tørrstoffet passere filteret, etter 2 timer ca. 40 % og etter 4 timer ca. 48 %. Tidligere eksperimenter har vist at etter 24 timers inkubering vil ca. 55 % av tørrstoffet passere filteret. Fig. 3 viser at nitrogeninnholdet (proteiner, peptider og frie aminosyrer) i produktet er ca. 11 vekt% for inkuberingstider mellom 2 og 4 timer.

Etter 2 timers inkubering vil innholdet av MSG (glutaminsyre) i autolysatene i alt vesentlig være konstant (se fig. 4). Et glutaminsyreinnhold på mellom 8 og 9 vekt% er spesielt gunstig sammenlignet med vanlige gjærautolysater, som typisk har et glutaminsyreinnhold på mellom 3 og 7 %.

Fig. 5 viser hydrolysegraden for protein i autolysatene (a-N er et uttrykk for antallet frie a-aminogrupper som er tilstede i produktet). Hydrolysegraden på produktet ble beregnet på følgende måte: a-N x 100 %/N. For hvert autolysat i overenstemmelse med foreliggende oppfinnelse var hydrolysegraden ca. 60 %, noe som viser at en større del av produktet består av frie aminosyrer. Dette ble bekreftet ved aminosyreanalysen (se tabell 2), som viste at fra 50-60 % av autolysatene bestod av frie aminosyrer.

Fig. 6 viser aminosyresammensetningen for autolysatene etter 4 timers inkubering under de betingelser, som er angitt i tabell 1.

For det meste vil de forskjellige autolysebetingelsene frigjøre ekvivalente mengder av aminosyrene. Rent unntaksvis ble det observert høyt innhold av arginin i autolysat-3 og en stor mengde av prolin i A-I og A-2. Sammenligning med A-5 indikerer at prolinfrigjøringen er assosiert med en inkuberingstemperatur på 45°C. Glutamininnholdet i A-ler lavere enn i de andre produktene. Glutamin ble bare observert i små mengder i A-I og A-3 (inkubering ved pH 7). De små variasjonene antyder at det er de samme enzymene som virker innenfor hele det studerte området med hensyn til prosessbetingelser (pH: 7-8 og inkuberingstemperatur: 45-55°C).

Fig. 7 viser det frie aminosyreinnholdet i A-3 som en funksjon av tiden. Det kan ikke observeres noen spesiell forskjell i aminosyreprofilen over en inkuberingsperiode fra lA til 4 timer, noe som betyr at inkuberingstiden i alt vesentlig kan velges på basis av det forønskede endelige ultrafiltreringsutbyttet (se fig. 2).

Konklusjoner

Det er mulig å endre tørrstoffinnholdet i utgangsmaterialet (trinn 1) og inkuberingstiden uten at dette påvirker de viktige parameterne (høy MSG og fritt aminosyreinnhold, total løselighet, blek farge og nøytral smak) på autolysatproduktet. Øket tørrstoff og redusert inkuberingstid reduserer utbyttet. Et optimalt utbytte kan bestemmes på basis av den forønskede grad av proteinhydrolysen i det gjenværende biproduktet.

Eksempel 3 - Fremstilling av autolysat

Det blir fremstilt et autolysat ved hjelp av følgende fremgangsmåte:

1. Det ble fremstilt en mikrobiell kultur (biomasse) ved en fermenteringsprosess som beskrevet i eksempel 1. Den samlede biomassen ble konsentrert til et innhold fra 12-22 % tørrstoff ved sentrifugering.

2. Homogenisering: trykkfall fra 1000-0 bar.

3. Autolyse: temperatur og pH ble justert til området fra 50-55°C og 7,0-7,5 henholdsvis.

4. Inkubering: opptil 4 timer.

5. Produktet ble sterilisert ved oppvarming til en temperatur mellom 70 og 90°C. 6. Produktet ble forstøvningstørket (innløps-/utløptemperatur: 180-250°C/90°C).

Eksempel 4

Autolysatmetode

Det ble fremstilt et autolysat ved hjelp av følgende fremgangsmåte:

1. Det ble fremstilt en mikrobiell kultur som beskrevet i eksempel 1. Den samlede biomassen ble konsentrert til et tørrstoffinnhold mellom 12 og 22 % ved sentrifugering og/eller ultrafiltrering.

2. Homogenisering: trykkfall fra 1000-0 bar.

3. Autolyse: Temperatur og pH ble justert i området fra 50-55°C og 7-7,5 henholdsvis.

4. Inkubering under autolysen i fra 2-6 timer.

5. Homogenisering: trykkfall fra 1000-0 bar.

6. Produktet ble oppvarmet til mellom 65 og 95°C.

7. Produktet ble forstøvningstørket (innløp/utløp/tilførsel) 180-300°C/70-90°C/ 15-70°C.

Et prosesseksempel er vist på fig. 8, hvor A = oppvarming, B ) autolyse og C = avkjøling.

Det ble utført analyser av autolysatene fremstilt som beskrevet ovenfor. Resultatene er vist i tabell 3 nedenfor.

Resultatene etter en autolyse av materialet etter sentrifugering og materialet etter sentrifugering og etterfølgende ultrafiltrering, er nesten identiske. Det er imidlertid en stor forskjell når prøvene er homogenisert før autolysen.

Eksempel 5

Alfa- aminoinnhold i autol<y>sater

Det ble fremstilt en bakteriekultur som beskrevet i eksempel 1 (5°C), og denne ble homogenisert ved 900-1000 bar, og lagret i beholdere. Etter homogeniseringen ble temperaturen hevet til 44,5°C.

En prøve ble lagret uten temperaturkontroll, mens én prøve ble lagret ved 4°C uten en ytterligere kontroll av pH. pH ble målt manuelt.

Eksperimentet uten temperaturkontroll viste en starttemperatur på 44,5°C og en pH på 6,6. Etter 24 timer var temperaturen 22°C mens pH var 5,1. Under denne lagringen økte innholdet av alfa-amino N fra 1-2 %.

Eksperimentet med den avkjølte referanseprøven viste ingen forandring i pH-verdien. For å oppnå en pH-reduksjon i denne prøven er det nødvendig med ytterligere lagring. Under lagringen økte innholdet av alfa-amino N fra 1-1,34 %.

Tabell 4 viser at innholdet av alfa-aminonitrogen i den homogeniserte kulturen ligger mellom 1 og 2 % av tørrstoffinnholdet, etter langvarig lagring.

Hydrolysegraden defineres som prosent spaltede peptidbindinger. For hver peptidbinding som hydrolyseres vil det dannes en fri alfa-aminosyre. Tilstrekkelig autolyse til å fremstille smaksfrembringende produkter kan defineres som prosent alfa-aminosyrenitrogen i tørrstoffet. Autolyse for å oppnå slike smakstilsetningsprodukter vil resultere i et alfa-aminonitrogeninnhold på mellom 2 og 6 %, 3-5 % eller typisk 4 vekt%. F.eks. vil den grunnleggende kulturen inneholde fra 1-1,1 % alfa-aminonitrogen, mens det homogeniserte produktet inneholder 1-2 % alfa-aminonitrogen avhengig av lagringsbetingelsene, slik det er vist i tabell 4 ovenfor. Ytterligere økning av alfa-aminonitrogen i det homogeniserte produkt kan oppnås ved titrering ved pH 7-7,5 og temperaturer over 40°C. På den annen side vil en pH på 5-5,5 stabilisere biomassen.

Eksempel 6

Kontroll av pH og viskositet under den første fasen av autolysen

Konsentrat (dvs. materiale oppsamlet etter sentrifugering) og retentat (dvs. materiale oppsamlet etter ultrafiltrering) ble homogenisert ved 1000 bar, mens temperaturen ble kontrollert ved hjelp av varmevekslere.

Tabell 5 og 6 nedenfor viser prosessparameterne.

De porsjonsvise eksperimentene ble utført ved hjelp av et kontrollutstyr, en buffertank og en homogenisator. Fig. 9 viser den eksperimentelle oppsetningen hvor A er konsentrat eller retentat, 1 er temperaturkontrollen, 2 er redokselektroden, 3 er pH-elektroden, 4 er homogenisatoren ved 1000 bar, 5 er tilførselsstrømmen av medium, 6 er produktet, 7 er røreren mens 8 er autolysereaktoren.

Porsjonsvis hydrolyse av den homogeniserte biomassen ble utført i en fermentor Drive Assembly Modell nr. M1200-200 utstyrt med reaktorene modell FS-314 (New Brunsqick Scientific Co. Inc. New Jersey) med et totalt arbeidsvolum på henholdsvis 14 1 og 101. Reaktorene ble senket ned i et temperaturkontrollert vannbad (+ 1°C), hvor det ble utført kontinuerlig røring hvis intet annet er angitt. pH ble målt. Den indre pH ble kontrollert eksternt. Reaktorene ble operert uten gjennomluftning, og rørehastigheten var 100-300 rpm.

Prøver ble tatt ved å pumpe ut biomassen under kontinuerlig røring hvis intet annet er angitt. På dette stadium ble pH og viskositet målt. Prøver for senere analyse ble lagret i frosset tilstand.

Prøver ble tatt ut fra en rørt tankreaktor og målt umiddelbart ved 2,5 rpm, 5 rpm, 10 rpm, 30 rpm, 50 rpm og 100 rpm ved hjelp av et Brookfield viskosimeter. I resultatavsnittet er det bare vist målingene ved 30 rpm.

Resultater og diskusjon

Fig. 10 og 11 viser pH som en funksjon av tid for homogenisert konsentrat og retentat henholdsvis.

Ved 15°C etter 5-9 timer var pH stabil i det homogeniserte konsentratet og retentatet, se fig. 10 og 11. Ved høyere temperaturer ble pH redusert fra 6,2-6,4 til 5,2-5,4, og pH-reduksjonshastigheten øket med temperaturen. For det homogeniserte retentatet var pH-reduksjonshastigheten nesten dobbelt så høy som for hastigheten i det homogeniserte konsentratet. Forskjellene mellom konsentrat og retentat kan forklares ved tørrstoffinnholdet eller biomassens status på de forskjellige prosesstrinnene. Ved slutten av alle eksperimentene var imidlertid pH-verdien stabilisert til mellom 5 og 5,5.

Den reduserte pH-verdien skyldes sannsynligvis syredannelse på grunn av en begrenset peptidnedbrytning og/eller sukkeromdannelse. Sukkeromdannelse kan brukes for å redusere innholdet av reduserende sukker før autolysetrinnet for autolysatet. Hydrolysegraden (DH) er definert som prosent peptidbindinger som er spaltet. For hver peptidbinding som blir hydrolysert, vil det dannes en fri alfa-aminosyre. Produktet kan defineres som prosent alfa-aminosyrenitrogen av tørrstoffet. Autolysen for å oppnå et smakstilsetningsprodukt (som definert tidligere), vil resultere i et alfa-aminonitrogeninnhold på mellom 2 og 6 %, 3-5 % eller typisk 4 %. Fig. 12 og 13 viser viskositeten som en funksjon av tiden for homogenisert konsentrat og retentat henholdsvis, i rørte reaktorer. Fig. 12 og 13 viser at viskositeten var lavere for det homogeniserte konsentratet enn for retentatet. Når det ble anvendt røring var viskositeten på det homogeniserte konsentratet mindre enn 10 cP. Det homogeniserte retentatet hadde en viskositet over 20 cP. Som en funksjon av tiden viste viskositeten mindre forandringer etter 1 time, bortsett fra at konsentrateksperimentet ved 35°C hvor viskositeten øket etter 4 timer.

Viskositeten sank med temperaturen. Økende tørrstoff vil gi stigende viskositet. Viskositeten som funksjon av temperatur, pH og konsentrasjon bør kontrolleres under bearbeidingen. Det er f.eks. ønskelig å unngå at viskositeten bygger seg opp slik at det blir lettere å utføre senere blanding (under titrering).

Hvis det homogeniserte retentatet eller konsentratet lagres på en laboratoriebenk vil viskositeten øke. Disse suspensjonene utvikler seg også til et gel-lignende stoff med høy viskositet. Det homogeniserte retentatet bør derfor lagres i reaktor uten gjennomlufting og røring under kontrollerte betingelser med hensyn til temperatur. pH ble ikke kontrollert i dette tilfellet.

Fig. 14 viser viskositeten for det homogeniserte retentatet som en funksjon av tiden, hvor stoffet på punkt A utvikler seg til et deiglignende stoff med ekstrem viskositet, mens målingene stoppet ved punkt B, mens ved punkt C ble deigen løseliggjort.

Sammenlignet med det rørte produktet så øker viskositeten radikalt uten røring. Det homogeniserte retentatet fikk en økende viskositet som en funksjon av tiden, og den øket raskere ved høyere temperaturer. Viskositeten ved 35°C øket mindre enn ved 27°C, men den opprinnelige viskositeten (og tørrstoffet) ved 35°C var lavere enn ved 27°C.

Urørte suspensjoner ga voluminøse deiglignende stoffer, noe som skyldes gassdannelse og aggregering. Det er derfor ønskelig at det homogeniserte materialet bør røres for å unngå økning både med hensyn til viskositet og volum.

Viskositetsøkningen skyldes sannsynligvis en aggregering av polymerer og celleavfall fra den homogeniserte biomassen. En aggregering ga partikkelstørrelser på mellom 10 og 100 |j,m for lagret homogenisert biomasse, mens en frisk homogenisert suspensjon hadde partikler som var mindre enn 1,5 |j,m.

Betingelsene etter homogeniseringen bør fortrinnsvis og ønskelig kontrolleres for å oppnå gode bearbeidingsbetingelser med hensyn til viskositet.

Uten titrering vil pH bli redusert. pH-reduksjonen øker med temperaturen (15-45°C), og pH skyldes sannsynligvis både peptidnedbrytning og syredannelse på grunn av sukkeromdannelse. Ved 15°C var pH på den homogeniserte biomassen stabil i fra 5-9 timer, noe som indikerer lav reaksjonshastighet, mens den ved 45°C ga en mer brå forandring fra pH 6,2-5,2.1 alle eksperimentene ble pH stabilisert ved verdier mellom 5 og 5,5.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en matvare eller en matvarekomponent, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter å underkaste en mikrobiell kultur som omfatter en metanotrof bakterie og en heterotrof bakterie, eller et derivat av nevnte kultur, en autolyse.

2. Fremgangsmåte i følge krav 1, omfattende følgende trinn: (a) fremstille en vandig suspensjon av en mikrobiell kultur som omfatter en metanotrof bakterie i kombinasjon med én eller flere heterotrofe bakterier; (b) eventuelt homogenisere suspensjonen; og (c) underkaste det resulterende produkt en autolyse.

3. Fremgangsmåte i følge krav 1 eller krav 2, hvori nukleaser og proteaser fordøyer komponentene i cellene i løpet av autolysen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, hvori fremgangsmåte ytterligere omfatter et trinn for å separere det autolyserte produktet.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, hvori nevnte kultur er blitt fremstilt ved å bruke metan som karbonkilden.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, hvori nevnte kultur omfatter Methylococcus capsulatus.

7. Fremgangsmåte i følge krav 6, hvori nevnte kultur ytterligere omfatter Ralstonia sp. DB3 (stamme NCIMB 13287) og Brevibacillus agri DB5 (stamme NCIMB 13289), eventuelt i kombinasjon med Aneurinibacillus sp DB4 (stamme 13288).

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-7,hvori autolysen utføres ved en temperatur på minst 25°C.

9. Autolysert produkt, hvori produktet er fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8.

10. Autolysert produkt avledet fra en biomasse omfattende en metanotrof bakterie og en heterotrof bakterie, eller et derivat derav, hvori produktet har et aminosyreinnhold varierende fra 40-80 vekt% på tørrstoffsbasis.

11. Produkt ifølge krav 10, hvori produktet har et innhold av frie aminosyrer varierende fra 40-50 vekt% på tørrstoffsbasis.

12. Produkt ifølge krav 10 eller krav 11, hvori produktet har et glutaminsyreinnhold varierende fra 5-11 vekt% på tørrstoffsbasis.

13. Anvendelse av et autolysert materiale eller bearbeidet derivat av dette ifølge ethvert av kravene 9-12, som sådan, i eller som en forløper for en matvare.

14. Anvendelse av et autolysert materiale eller bearbeidet derivat av dette ifølge ethvert av kravene 9-12, som et additiv i kjæledyrfor.

15. Matprodukt, omfattende et autolysert materiale eller bearbeidet derivat av dette ifølge ethvert av kravene 9-12.

16. Matprodukt ifølge krav 15,hvori matproduktet er et hundefor eller et additiv til dette.

17. Matprodukt ifølge krav 15,hvori matproduktet er et fiskefor.

18. Matprodukt ifølge krav 17, hvori fiskeforet ekstrudert fiskefor i pelletform.