NO327200B1 - Kombinasjonspreparat for anvendelse ved demens og fremgangsmate for fremstilling derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et kombinasjonspreparat og en fremgangsmåte for fremstilling av dette

Foreliggende oppfinnelse vedrører, som nevnt, farmasøytiske kombinasjonspreparater for behandling av demens pa grunn av neurodegenerative sykdommer som starter med undergang av kohnergiske nevroner og kohnergisk underskudd (Tohgi et al, Neurosci Lett 177 (1994), sidene 1939-1942) Disse kombinasjonspreparatene kompenserer det kohnergiske underskuddet ved en forsterkning av den via muskannisk reseptor stimulering utløste Ca<2+->avhengige signaltransduksjon En slik forsterkning kan åpenbart oppnås ved kooperative adenosinvirkmnger, og nærmere bestemt ved en kombinasjon av stoffer som forhøyer den ekstracellulære adenosinkonsentrasjon med muskanmske reseptoragonister eller acetylkohnesterasehemmere (ACHE-hemmere) Den hittil hovedsakelig fulgte farmakologiske strategi for behandling av aldersdemens er opprettholdelse av muskannisk reseptoraktivenng ved tilførsel av muskannergiske agomster eller av ACHE nemmere som forhøyer konsentrasjonen av det endogene acetylkohnet (ACH) pa reseptor Om det ved fremadskndende ødeleggelse av kohnergiske neuronsystemer kan oppnås en for regelrett cellefunksjon tilstrekkelig forhøyelse av ACH-speilet ved ACHE-hemming, er tvilsomt Videre viser ACHE nemmere ved manglende spesifisitet betydelige bivirkninger En potensienng av den via muskanmske reseptorer formidlede virkning ved utilstrekkelig ACH konsentrasjon ved andre mekanismer ville følgelig være ønskelig, og kunne danne grunnlag for utvikling av en tilsvarende kombinasjonsterapi

Det er kjent at ACH ikke bare påvirker funksjonene av nerveceller men denmot ogsa av ghaceller (astrocytter) (Messamore et al, Neuroreport 5 (1994) sidene 1473 1476) Idet patologiske ghacellereaksjoner åpenbart spiller en viktig rolle innenfor patofysiologien ved demens (Akiyama et al, BrainRes 632(1993) sidene 249 259) ble dyrkede astrocytter valgt som modellsystem in vitro Påvirkningen av den over muskanmske reseptorer utløste intracellulære Ca<2+->fhgivelse ble undersøkt ved hjelp av den dynamiske fluorescens-billeddannelsesmetode

WO9409787 besknver en synergistisk kombinasjon for behandling av degenerative alderssykdommer, omfattende en adenosinantagonist og en forbindelse med kolinhknende virkning Adenosinantagomsten kan være en xanthinforbindelse

US 4719212 omhandler et terapeutisk middel som inneholder propentofylhn som aktiv komponent Det terapeutiske middelet kan anvendes til a behandle Alzheimer s senil demens

EP296560 beskriver en anvendelse av sykliske arninforbindelser til behandling av Alzheimer s senil demens Det er her oppdaget av pipendindenvater har god virkning for dette formalet Spesielt har pipendindenvater høy og selektiv antiacetylkohnesterase aktivitet og øker derved mengden av acetylkohn som neurotransmitter som er til stede i hjernen

EP260127 tilveiebnnger xanthindenvater som er nyttige til behandling av blant annet neuronale degenerative forstyrrelser og kognitive dysfunksjoner som for eksempel senil demens

Det er na funnet at Cl-adenosin potensierer den muskannergiske intracellulære Ca - frigivelsen i dyrkede astrocytter hos rotte pa konsentrasjonsavhengig mate (se fig 1 3,

tabellene 1 og 2) Følgelig males allerede i nærvær av 1 nm Cl adenosin en ca tretti gangers potensienng av den ved ACH utløste intracellulære Ca<2+->forhøyelse Effekten kunne ikke hemmes ved en nikotimsk ACH reseptor antagonist, men kunne imidlertid blokkeres ved en muskannisk reseptorantagomst (tabell 3) Likeså potensierte Cl-adenosin den ved den muskannergiske agomsten oksotremonn-M utløste intracellulære Ca<2+> frigivelse (tabell 4) En stor del av eksperimentene som påviser den potensierende Cl-adenosineffekt (n > 200) gjennomføres ved en ACH-konsentrasjon pa 100 nM I denne lave konsentrasjon er ACH alene uvirksom Ogsa Cl-adenosin alene er uvirksom over det testede konsentrasjonsomradet (3 nM til 3 uM) Dosevirkningsekspenmenter for bestemmelse av den for utløsningen av et Ca 9+-signal i kooperasjon med 100 nM ACH nødvendige Cl-adenosinkonsentrasjon, gir en potensierende effekt ved mikromolare Cl adenosinkonsentrasjoner Terskelkonsentrasjonen ligger ved 1 uM Idet Cl-adenosin i sin reseptoraffinitet tilsvarer det endogene adenosin (Daly et al, Life Sei 28 (1981) sidene 2083-2097), betyr det at tilsvarende ogsa en forhøyelse av det ekstracellulære adenosmspeil fra fysiologisk nanomolart konsentrasjonsomrade (Ballann et al Acta Physiol Scand 142 (1991) sidene 97-103) til 1 nM er tilstrekkelig til a bnnge underterskels-ACH-konsentrasjoner pa muskannisk reseptor til virkning

Fra disse ekspenmentelle resultater fremgår det at påvirkningen av den over de muskanmske reseptorer formidlede kolinergfunksjon ved demens kan forhøyes ved en forhøyelse av den ekstracellulære adenosinkonsentrasjon Sistnevnte skulle være mulig ved koplet-tilførsel av en adenosin-opptakshemmer som propentofylhn (Parkinson et al, Gem Pharmacol 25 (1994), sidene 1053-1058) En farmakologisk forhøyelse av den ekstracellulære adenosinkonsentrasjon ville ogsa tillate en lavere dosenng av den i en kombinasjonsbehandling eventuelt anvendte ACHE-hemmer, henholdsvis muskanmske reseptoragomster, hvilket ville redusere faren for uønskede bivirkninger Oppfinnelsen vedrører følgelig et kombmasjonspreparat, inneholdende minst 1) en forbindelse som oppviser en acetylkolinesterase-hemmevirkmng eller muskannergisk virkning valgt fra gruppen l-benzyl-4-[(5,6-dimetoksy-l-indanon)-2-yl]-metylpipendin og milamelm,

2) en forbindelse som forhøyer det endogene ekstracellulære adenosmspeilet,

valgt fra gruppen av xantmdenvater med formel I

og/eller fysiologisk godtagbare salter av forbindelsen med formel I, hvorved R<1> står for a) oksoalkyl med 3-8 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, b) hydroksyalkyl med 1 8 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, og hvis hydroksygruppe utgjør en pnmær, sekundær eller tertiær

alkoholfunksjon, eller

c) alkyl med 1-6 karbonatomer hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrene<*>, R2 star for

a) hydrogenatom eller

b) alkyl med 1-4 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet,

R<3> star for

a) hydrogenatom,

b) alkyl med 1-6 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, c) alkyl med 1-6 karbonatomer hvis karbonkjede er avbrutt med et oksygenatom,

eller

d) oksoalkyl med 3-8 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, og

3) en farmasøytisk bærer med overadditiv økning av den muskanmske virkningen ved neurodegenerative sykdommer for samtidig adskilt eller tidsmessig forskjøvet anvendelse

Spesielt foretrukket anvendes som forbindelse med formel 11-(5 oksoheksyl)-3-metyl 7-n-propylxantin (propentofylhn)

Eksempelvis skal nevnes følgende forbindelser med formel I

l-(5 hydroksy 5-metyl heksyl) 3 metyl xantin,

7-(etoksymetyl l-(5-hydroksy-5 metyl heksyl)-3 metyl xantin,

l-(5-oksoheksyl)-3,7 dimetylxantin,

7 (2-oksopropyl)-l,3 di-n-butyl-xantin eller

1-heksyl 3,7-dimetyl xantin

Egnede fysiologisk godtagbare salter av xantindenvatene med formel I er eksempelvis alkali- jordalkah- eller ammoniumsalter innbefattende slike av fysiologisk godtagbare organiske ammoniumbaser

Fremstillingen av forbindelsen med formel I foregår under standardbetingelser og pa kjent mate (US 4 289 776, US 4 833 146 US 3 737 433)

Utgangsstoffene for omsetningene er kjente eller lar seg lett fremstille ved fremgangsmåter som er kjente fra litteraturen Under begrepet "overadditivt' forstas virkninger som er større enn summen av enkeltvirkningene

Foretrukne kombinasjonspreparater inneholder propentofylhn og 1-benzyl 4-[(5,6 dimetoksy l-indanon)-2 yl]-metylpipendin

Kombinasjonspreparatet ifølge oppfinnelsen egner seg eksempelvis for behandling av demens spesielt aldersdemens

Kombinasjonspreparatet ifølge oppfinnelsen kan ogsa omfatte kombinasjons-forpaknmger eller sammensetninger, hvon bestanddelene er stilt ved siden av hverandre og derfor kan anvendes samtidig, adskilt eller tidsmessig trinnvis, pa ett og samme menneskelige eller animalske legeme

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for fremstilling av kombinasjonspreparatet som er kjennetegnet ved at man bearbeider 1) en forbindelse som oppviser en acetylkolinesterase-hemmevirkning eller muskannergisk virkning

2) en forbindelse som fornøyer det endogene ekstracellulære adenosinspeilet, og

3) en farmasøytisk bærer

pa vanlig mate, til en farmasøytisk admimstrenngsform

Kombinasjonspreparatet ifølge oppfinnelsen kan foreligge som dosenngsenhet av legemiddelformer som kapsler, (innbefattende mikrokapsler som generelt ikke inneholder farmasøytisk bærer, tabletter innbefattende drageer og piller) eller kapsler, hvorved ved anvendelse av kapsler kapselmatenalet ivaretar funksjonen av bæreren, og innholdet kan foreligge f eks som pulver gel, emulsjon, dispersjon eller oppløsning Spesielt fordelaktig og enkelt er det imidlertid a fremstille orale (perorale) preparater med de to virkestoffkomponentene 1) og 2), som inneholder den beregnede mengde av virksomme stoffer sammen med enhver ønsket farmasøytisk bærer Ogsa en tilsvarende formulering (kapsler) kan anvendes for rektal behandling Likeledes er den transdermale tilførselen i form av salver eller kremer parenteral (mtrapentoneal, subkutan, intravenøs, intraartenell, intramuskulær) injeksjon eller infusjon av oppløsninger eller orale tilførsler av oppløsninger, som inneholder kombinasjonen ifølge oppfinnelsen, mulig Salver, pastaer kremer og puddere kan ved siden av de virksomme stoffer inneholde de vanlige bærestoffer, f eks animalske og vegetabilske fettyper voks parafiner, stivelse, tragant, cellulosedenvater, polyetylenglykoler, silikoner, bentonitter, talkum, sinkoksyd, melkesukker, kiselsyre aluminiumhydroksyd kalsiumsihkat og polyamidpulver eller blandinger av disse stoffer

Tablettene, pillene eller granulatlegemene kan fremstilles ved vanlige fremgangsmåter som presse-, neddykkmgs- eller virvelsjiktrfemgangsmater eller kjeledragenng og inneholde bæremidler og andre vanlige hjelpestoffer som gelatin, agarose, stivelse (f eks potet-, mais eller hvetestivelse), cellulose som etylcellulose, sihsiumdioksyd, forskjellige sukkere som melkesukker, magnesiumkarbonat og/eller kalsiumfosfater Dragenngsoppløsningen bestar vanligvis av sukker og/eller stivelsessirup og inneholder for det meste ogsa gelatin, gummi arabicum polyvinylpyrrohdon, syntetiske cellulose-estere, overflateaktive stoffer, myknere, pigmenter og lignende tilsatser, tilsvarende teknikkens stand For fremstilling av legemiddelformene kan ethvert vanlig flyt-regulenngs-, smøre eller ghdemiddel som magnesiumstearat og skillemiddel anvendes

Fortnnnsvis har preparatene form av mantel-/kjernetabletter eller flersjiktstabletter hvorved virkekomponent 2 befinner seg i mantelen henholdsvis kjernen henholdsvis i et sjikt mens virkestoffkomponent 1 befinner seg i kjernen henholdsvis i mantelen,

henholdsvis i et annet sjikt Virkestoffkomponentene kan ogsa foreligge i retardert form eller adsorbert pa retardenngsmatenalet, henholdsvis innesluttet i retardenngsmatenalet (f eks slike pa cellulose- eller polystyrenharpiksbasis, f eks hydroksyetylcellulose) En forsinket frigivelse av de virksomme stoffer kan ogsa oppnås ved at det aktuelle sjiktet, henholdsvis delen, utstyres med vanlige magesaftuoppløsehge overtrekk

Doseringen som anvendes er naturligvis avhengig av forskjellige faktorer som det levende vesen som behandles (dvs menneske eller dyr), alder, vekt, generell helse tilstand graden av symptomer, sykdommen som skal behandles, eventuelle ledsagende sykdommer (om tilstedeværende), typen av den ledsagende behandling med andre legemidler, eller hyppigheten for behandlingen Doseringen administreres generelt flere ganger pr dag og fortrinnsvis 1-3 ganger pr dag De anvendte mengder av enkelt virkestoff avhenger herved av den anbefalte dagsdose for det aktuelle enkeltstoff og skal generelt i kombinasjonspreparatet ligge pa 10 -100 % av den anbefalte dagsdose, fortnnnsvis pa 20 - 80 % spesielt pa 50 % Den egnede behandling med kombinasjonen ifølge oppfinnelsen består følgelig f eks i admimstrenng av en enkeltdosenng av kombinasjonspreparatene ifølge oppfinnelsen bestående av 1) 100 mg til 600 mg fortnnnsvis pa 200 til 400 mg propentofylhn, spesielt 300 mg propentofylhn, og 2) 2 mg til 20 mg, fortnnnsvis 5 til 10 mg 1-benzyl 4-[(5 6-dimetoksy 1-indanon)-2 yl]-metylpipendin,

hvorved mengden naturligvis er avhengig av antall enkeltdosennger og ogsa av sykdommen som skal behandles og en enkeltdosenng kan besta av flere samtidig administrerte dosenngsenheter

Farmakologiske eksempler

Astrocyttkulturer

Corteks-astrocyttkulturer stammer fra hjernekanten av 19 20 dager gamle Wistar rotte-embryoer som er tatt fra moderdyret etter avlivning under eternarkose Etter preparenng av hjernen ble kantvevet suget av med en pipette og opptatt i Dulbecco s modifiserte Eagle medium (DEM) under tilsetning av 15 % fetalt kalveserum Etter filtrering gjennom hnsepapir ble cellesuspensjonen plantet pa glassobjektbærere (besjiktet med polyetylenimin) og dyrket i kulturflasker ved to gangers mediumvekshng pr uke under standard betingelser i dyrkmngsskap Etter ca 7 dager ble cellene høstet og etter trypsinenng (for eliminering av nerveceller) igjen utplantet i en konsentrasjon pa 5 x IO<4 >celler/cm<2> og dyrket i ytterligere 6 8 dager til forsøksbegynnelse Disse kulturer besto i et omfang pa mer enn 95 % av astrocytter som oppviser en positiv immunreaksjon for astrocytt-markøren GFAP (surt gha-fibnlært protein)

Fluorescens-billeddannelsesforsøk for maling av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjon, og dens eksperimentelle påvirkning

Ved begynnelse av forsøket (6-8 dager etter gjenutplanting) ble de dyrkede astrocyttene paladet med en Ca<2+->fluorescensmarkør, og nærmere bestemt et ved inkubenng med 5 um fura 2-acetoksymetylester (Molecular Probes) i BHKR (biokarbomsert, hepes-bufret Kreps-Ringeroppløsnmg) ved 37°C 11 time Etter oppladningen ble glassbærerne inneholdende de dyrkede astrocytter overført til et malekammer og installert pa fluorescens billeddannelses-maleplaten tilhørende lnvert-fluorescensmikroskopet ( Zeiss Axiovert 100 , "Zeiss Fluar 40 x Objektiv ) Her ble kammeret under forsøksvangheten (som regel 20-30 min) kontinuerlig perfundert med temperaturkontrollert (37°C) BHKR ved en strømmngshastighet pa 600 (xl/minutt Malingen foregikk med FUCAL-fluorescens-billeddannelsessystemet (TILL Photonics GmbH, Planegg), hvorved etter stimulering ved to eksitasjonsbølgelengder ved 340 og 380 nM den emitterte fluorescens-overbølgelengde pa 420 nM ble malt ved hjelp av et CCD kamera ("CS 90", Theta System, Grobenzell) og den tilsvarende Ca<2+ >konsentrasjonen ble beregnet Malingene foregikk i tidsmessige avstander pa 12 sek, i hvert tilfelle før, under og etter tilsats av de forskjellige forsøksstoffene til perfundert medium Endringer av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjonen ble bestemt pa enkeltcelleplanet og nærmere bestemt i forskjellige, i hvert tilfelle adekvat fastlagte malevinduer De forskjellige forsøksstoffer (acetylkohn eller oksotremonn i nærvær eller fravær av Cl adenosin) ble som regel tilsatt for tidsvarigheten pa 1 minutt til perfusjonsmediet Idet de utløste intracellulære Ca<2+->økmngene var transiente, ble de i resultattabellene og -kurvene fremtredende endringer av den intracellulære Ca - konsentrasjon relatert til de i ethvert tilfelle malte toppverdier

Tabell 1

Fornøyelse av den intracellulære Ca -konsentrasjon (nM)

Intracellulær Ca2+- konsentrasion [ nM]

Acetylkohn ( nM) uten tilsats + 1 uM Cl- adenosin 3_ 14 17 ± 2 87

10_ 23 59 + 4 25

100 2 18 ± 18 56 27 ± 6 7

300 1 4 ± 1 57 107 27 ± 9 41

1000 19 83 + 3 24

3000 41 91 ± 5 59 182 18 + 12 27

6000 73 79 + 10 94 10 000 126 79 ± 12 07 220 99 + 10 97 30 000 214 20 + 10 38

100 000 192 74 + 16 61

300 0001 203 49 + 15 46

Gjennomsnittsverdien +SEM antall målte celler n=45 (for hver maleverdi)

Tabell 1 viser at dose-virkmngskurven for den ved ACH i astrocytter utløste intracellulære Ca<2+->forhøyelsen ved samtidig virkning av 1 uM Cl-adenosin, forskyves betydelig mot venstre Her ma ACH-speilet bare utgjøre 100 nM for a frembringe et like stort Ca<2+> signal, for hvilket en tre ganger høyere ACH konsentrasjon (mer enn 3 uM) vil være nødvendig i fravær av en koopererende adenosinvirkning Den for denne kooperative effekt nødvendige kritiske adenosinforhøyelse ligger i et omrade som farmakologisk skulle oppnås ved behandling med adenosinopptaksblokkenngsmidlet propentofylhn Tabell 2 viser for en Ca<2+->mobihsenng nødvendige Cl-adenosinkonsentrasjoner i nærvær av 100 nM ACH

Gjennomsnittsverdier+SEM i prosent av den intracellulære Ca<2+->forhøyelse, som ble oppnådd i fravær av antagonister ved 100 nM acetylkolm og 1 uM Cl-adenosin (kontrollverdi = 100 %) Som kontrollverdi ble det malt en intracellulær Ca<2+->forhøyelse pa 98 4 ± 6 4 nM (n = 125)

Tabell 3 viser at den ved Cl-adenosin potensierte ACH effekt utgjør en representativ over muskanmske reseptorer formidlet ACH-effekt, som antagoniseres ved en muskannisk reseptorblokkerer, men ikke ved en nikotimsk reseptorblokkerer

Tabell 4 viser at Cl adenosin ogsa potensieres ved det ved en muskannisk reseptoragonist utløste Ca<2+->signal Fig 1 viser resultatene av et fluorescens-billeddannelsesforsøk som beskrevet pa side 7 100 nM ACH samt 1 uM Cl-adenosin anvendt alene er uvirksomt Deres kombinasjon fører til en dramatisk forhøyelse av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjon innenfor astrocyttene De i Ca<2+> fhtt medium gjennomførte forsøk viser denmot en lavere men stadig intracellulær massiv Ca økning innenfor astrocyttene nar ACH og Cl adenosin anvendes sammen, disse viser at intracellulært Ca<2+> mobiliseres Fig 2 viser et fluorescens-billeddannelsesekspenment som beskrevet pa side 8, hvorved dosevirkningskurven av den ved ACH i astrocytter utløste intracellulære Ca 9+-forhøyelse, ved samtidig virkning av 1 uM Cl adenosin, forskyves betydelig mot venstre Her ma ACH speilet bare utgjøre 100 nM for a frembnnge et like stort Ca2+ signal, for hvilket en tre ganger høyere ACH konsentrasjon (mer enn 3 uM) vil være nødvendig i fravær av en koopererende adenosinvirknmg Fig 3 viser resultatene av et fluorescens-billeddannelsesforsøk som beskrevet pa side 7 hvorved de for en Ca2+-mobihsenng nødvendige Cl adenosinkonsentrasjoner bestemmes i nærvær av 100 nM ACH

Claims (4)

1 Kombinasjonspreparat, karakterisert ved at det inneholder minst

1) en forbmdelse som oppviser en acetylkolmesterase-henimevirkning eller muskannergisk virkning valgt fra gruppen l-benzyl-4-[(5,6 dimetoksy-1-mdanon)-2-yl]-metylpipendm og milamehn,

2) en forbindelse som forhøyer det endogene ekstracellulære adenosinspeilet, valgt fra gruppen av xantindenvater med formel I og/eller fysiologisk godtagbare salter av forbmdelsen med formel I, hvorved R<1> står for a) oksoalkyl med 3-8 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, b) hydroksyalkyl med 1-8 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, og hvis hydroksygruppe utgjør en primær, sekundær eller tertiær alkoholfunksjon, eller c) alkyl med 1-6 karbonatomer hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, R<2> står for a) hydrogenatom eller b) alkyl med 1-4 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet R3 star for a) hydrogenatom, b) alkyl med 1-6 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, c) alkyl med 1-6 karbonatomer, hvis karbonkjede er avbrutt med et oksygenatom, eller d) oksoalkyl med 3-8 karbonatomer, hvis karbonkjede kan være rettkjedet eller forgrenet, og

3) en farmasøytisk bærer, med overadditiv økning av den muskanmske virkningen ved neurodegenerative sykdommer, for samtidig, adskilt eller tidsmessig forskjøvet anvendelse

2 Kombinasjonspreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at de den inneholdte forbindelser er propentofylhn og 1 benzyl-4-[(5,6-dimetoksy-l indanon)-2-yl]-metylpipendin

3 Anvendelse av et kombinasjonspreparat ifølge et eller flere av kravene 1-2, for fremstilling av et legemiddel for behandling av neurodegenerative sykdommer, spesielt aldersdemens

4 Fremgangsmåte for fremstilling av et kombinasjonspreparat ifølge et eller flere av kravene 1-2 karakterisert ved at man bearbeider

1) en forbindelse som oppviser en acetylkohnesterase hemmevirkning eller muskannergisk virkning

2) en forbindelse som forhøyer det endogene ekstracellulære adenosinspeilet, og

3) en farmasøytisk bærer, pa vanlig mate, til en farmasøytisk administrenn<g>sform