NO301193B1 - Testmetode og reagenssett for denne - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av forekomst av en analytt i et vandig medium.

Påvisningen og/eller bestemmelsen av analytter ved bruk av immunoassay-teknikk er veletablert, spesielt når det gjelder proteiner, så som antigener og antistoffer, så vel som sukkere, lectiner og nukleinsyrer. Mange av dagens teknikker, som kan være meget følsomme, er imidlertid ofte arbeids-krevende og fordrer en rekke trinn som hvert enkelt kan ta lang tid. Det har imidlertid vist seg mulig å forenkle enkelte slike bestemmelser ved immobilisering av en av system-komponentene på en fast bærer, idet dette gjør det lettere å fjerne reagensoverskudd. Slike bestemmelser vil vanligvis innebære bruk av et merket makromolekyl som kan være analytten selv eller en bindings-partner for analytten som bærer en passende merking, så som en radioisotop, en fluorofor eller et enzym som gir en karakteristisk reaksjon.

En forenkling som har vært foreslått er å benytte en farvet substans bundet til en av immunoassay-reaktantene som en synlig markør. Det er imidlertid få farvede substanser som er i stand til å frembringe et tilstrekkelig intenst signal. US-patent 4313734 til Akzona Inc., beskriver bruk av blant annet kolloidalt gull som et slikt farvet materiale, idet det angis at gullpartiklene bør ha partikkelstørrelse på minst 5 nanometer, fortrinnsvis 10 til 100 nm.

Oppfinnerne av Akzona-patentet har senere publisert flere artikler som understreker at større partikler er å foretrekke. Leuvering et al. (J. Immunoassay, 1, 77-91, 1980) beskriver bruk av kolloidalt gull på 60 nm. Denne publikasjon som er nær beslektet med innholdet i patentet, angir at den frembragte farve bare kan sees med det blotte øye ved høyere antigen-konsentrasjoner. Dette stemmer overens med en metode hvor gullet ekstraheres over i en oppløsning.

De samme oppfinnerne (Leuvering et al., J. Immunol. Meth. 45, 183-194, 1981; og 62., 175-184, 1983) har beskrevet hvor-ledes antistoffer og antigener kan agglutinere metall-sol i oppløsninger, hvorved det frembringes forandringer i absorb-sjonsmaksima og ekstinksjonskoeffisienter. Gull-kolloider i området 40-80 nm ble testet og 50 nm funnet å være optimalt.

Disse oppfinnerne har også beskrevet (J. Immunol. Meth., 62, 175-184, 1983) et "sandwich"-testsystem med gull-kolloider. Gull-kolloider i området 25-70 nm ble forsøkt og 55 nm funnet å være optimalt. Denne bestemmelse er basert på immunoassay på ordinære plater og tilsvarer den som er angitt i eksemplene nevnt i US-patent 4313734.

Gribnau et al. har i en oversikt (J. Chromatography, 376, 175-189, 1986) diskutert samtlige teknikker ved bruk av små partikler i immunoassay. Det avsnitt som beskriver kolloidalt gull beskriver flere metoder, men nevner bare gull med diameter på 50 nm.

Europeisk patentsøknad 0158746A til Janssen Pharmaceutica N.V. angår blotting-teknikk (overlay) som kan benyttes for bestemmelse av substanser i komplekse blandinger. Dette patent beskriver blant annet bruk av kolloidalt gull kompleksert til komponenter som reagerer med korresponderende bindings-komponenter på en fast bærer. Patentet understreker imidlertid det spesielle ved blotting-teknikk sammenlignet med bestemmelser av analytter i vandig oppløsning. Selv om det refererer til bruk av gull eller sølvpartikler i størrelsesområdet 3-100 nm, angis partikkelstørrelse på 5-50 nm som foretrukket, og eksemplene omtaler bare 20 nm partikler. Det fremgår intet om fordeler ved bruk av gullpartikler under 5 nm i diameter eller om aktuell bruk av slike partikler.

Surek & Latzko (Biochem. Biophys. Res. Comm., 121, 284-289, 1984) beskriver bruk av kolloidalt gull på 5 nm og 15 nm i en viss blotting teknikk fra elektroforese-gel. Forfatterne fant at 5 nm gullpartikler ga et skarpere farvet elektro-foresebånd av proteiner enn hva 15 nm gullpartikler gjorde, men de nevnte hverken den mer intense totale farving eller den raskere reaksjon som vi har observert.

Baschong et al (Histochemistry, 1985, 83(s) 409-11) beskriver anvendelse av et kolloidalt gullreagens for vev-farging ved elektronmikroskopi, idet partikkelstørrelsen på gullpartiklene er homogent 2,6 nm. Elektronmikroskopi er imidlertid basert på elektronspredningsegenskaper hos gullpartiklene, og en eventuell fordel med små partikler i den sammenheng er ikke relevant for utvikling av intens farge som kan observeres visuelt under anvendelse av et enkelt spektro-meter.

Det er foreslått at større gullpartikler belagt med immunoassayreagens vil ha evnen til å binde forholdsvis store mengder av merket til analytten eller annet reagens. Våre forsøk har imidlertid vist at når gullpartikler mindre enn 5 nm i gjennomsnittlig diameter anvendes i et fastfase-prøve-system, økes reaksjonshastigheten ved immunoassay-undersøkel-sen i visse tilfeller, og intensiteten av fargen hos den immobiliserte gull-sol er overraskende høyere enn når større gullpartikler anvendes.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en analytt i en prøve, hvor et reagens som omfatter en gull-sol bundet til et stoff som er i stand til spesifikt å binde seg til den nevnte analytt eller til en spesifikk bindings-partner for denne, bringes til immobilisering i bundet form på en fast fase for å gi en indikasjon på forekomsten av, eller mengden av, analytten i prøven ved deteksjon av forekomst, eller intensitet, av farve av immobilisert gull-sol. Fremgangsmåten karakteriseres ved at minst 75 vektprosent av gullpartiklene av den nevnte gull-sol har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nanometer, men ikke mindre enn 3 nanometer.

I mange typer fast-fase-bestemmelse er det fordelaktig å koble en analytt-analog eller en spesifikk bindingspartner for den nevnte analytt til en fast bærer for å frembringe den faste fase som det merkede reagens immobiliseres på. Som et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes også en fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en analytt i en flytende prøve, hvor prøven i et vandig medium bringes i kontakt med (i) en analytt-analog eller en spesifikk bindingspartner for nevnte analytt immobilisert på en fast

bærer og (ii) et merket reagens omfattende en gull-sol bundet

til et molekyl som spesifikt kan bindes enten til nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner for nevnte analytt, hvorved en mengde av det nevnte gull-sol-reagens immobiliseres på bæreren, som ved inspeksjon eller bestemmelse benyttes for å indikere forekomst, eller mengde, av nevnte analytt i prøven, idet minst 75 vektprosent av gullpartiklene i gull-solen har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nm, og ikke mindre enn 3 nm.

Den faste fase som det merkede reagens immobiliseres på, kan alternativt være inert og immobilisere den bundne form av det merkede reagens ved å fange sistnevnte fysisk, f.eks. ved å ikke tillate den bundne form av det merkede reagens å passere gjennom porer i den faste fase, mens ubundet merket reagens tillates passasje gjennom porene.

Den her anvendte betegnelse "analytt-analog" viser til en hvilken som helst forbindelsestype som er i stand til spesifikt å binde seg til en spesifikk bindingspartner for den aktuelle analytt, og innbefatter således en ytterligere mengde av den nevnte analytt.

Som angitt ovenfor, har metoden i henhold til oppfinnelsen fordelen av hurtigere reaksjon mellom gull-sol-reagenset og den immobiliserte reaktant, hvilket gir seg utslag i en kortere inkuberingstid. Farveintensiteten av gull-solen er dessuten forbausende sterkere i systemer hvor reagenset er filtrert gjennom den uoppløselige membran-bærer. Dette kan være en annen fordel som har sammenheng med en hurtigere reaksjon.

Gjennomsnittsdiameteren av en partikkel, som ikke behøver være helt kuleformet, er gjennomsnittet av den lengste og korteste diameter for partikkelen. Det er særlig foretrukket at minst 8 0 vektprosent av gullpartiklene har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nm. Enkelte partier av produktet Colloidal Gold Sol G5 fra Janssen Life Sciences Products, som er kommersielt tilgjengelig som et histologisk farvemiddel, har vist seg nyttig. I et bestemt parti var 85% av partiklene mindre enn 5 nm i diameter, den gjennomsnittlige diameter 4,5 nm med en Gaus-fordeling mellom 1,1 og 7,6 nm.

Gull-sol med gjennomsnittlig partikkeldiameter i området 2-

4 nm kan også hensiktsmessig fremstilles ved svak modifisering av kjent metodikk, f.eks. variasjon av garvesyre-konsentrasjonen i fremgangsmåten til Slot & Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38., 87-93, 1985). Vi har funnet at partikler med en gjennomsnittlig diameter på 4-4,5 nm er å foretrekke da mindre partikler (det vil si partikler mindre enn ca. 3 nm) ikke sedimenterer så godt under vasketrinnene.

Våre resultater tyder på at det foreligger et ca. 1:1 støkiometrisk forhold mellom gull-sol-partikler med en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nm og antistoffer som de kan bindes til. Dette støkiometriske forhold øker til mer enn én gullpartikkel per antistoff når den gjennomsnittlige diameter av partiklene er mindre enn ca. 3 nm. Det tilnærmede l:l-forhold kan tildels være årsak til de gunstigere reak-sjonskinetiske forhold for mindre partikler sammenlignet med tidligere typer partikler som har større antall antistoff per gullpartikkel. Selv om høye forhold mellom antistoff og gull-partikler kan oppnås med partikler av en størrelse foreslått av Leuvering et al. (se ovenfor), kan binding av ett antistoff til et antigen ugunstig påvirke tilgjengeligheten av de øvrige antistoffer på denne partikkel til binding av andre antigen-molekyler.

Foreliggende fremgangsmåte kan finne anvendelse i et hvilket som helst fast-fase-system for påvisning eller bestemmelse av analytter. De følgende typer av bestemmelser er typiske: 1. Et "sandwich"-system hvor komponent A er bundet til en fast bærer. Testoppløsningen med analytt B tilsettes, hvorved B bindes til A. Gull-merket komponent C tilsettes og siden C binder seg til B, immobiliseres det kolloidale gull og farver den faste bærer.

Komponentene A, B og C er alle av reseptor-ligandtyper hvor både A og C reagerer med B, mens A og C ikke direkte bindes til hverandre.

2 En "sandwich"-teknikk som i 1, bortsett fra at testopp-løsningen med analytt B og gull-merket komponent C blandes og blandingen tilsettes til den faste bærer som komponent A er bundet til. 3. En konkurranse-basert bestemmelse hvor komponent A er bundet til en fast bærer. Testoppløsningen med analytt B blandes med en kjent mengde gull-merket analytt B og tilsettes til den faste bærer. B og gull-merket B vil konkurrere om binding til A og en reduksjon av farven av kolloidalt gull på den faste bærer indikerer økende mengder av analytt B i testoppløsningen. 4. En konkurranse-basert bestemmelse som i 3, men sekven-siell tilsetning av testoppløsning og gull-merket B. 5. Overskudd av komponent A merkes med kolloidalt gull og blandes med testoppløsning inneholdende ukjent mengde av analytt B. A og B kobles deretter. Blandingen tilsettes til en porøs bærer hvortil komponent B er immobilisert. Gjenværende ubundet merket A vil kobles til det immobiliserte B på en fast bærer. 6. Analytt B omsettes med gull-merket komponent C, eventuelt sammen med én eller flere andre bindingspartnere for analytt B for å danne et kompleksaggregat. Reaksjons-blandingen får diffundere gjennom et inert filtermedium med porer som er for små til at kompleksaggregatet passerer gjennom, men store nok til å tillate overskudd av gull-merket komponent C til å passere gjennom.

Den faste fase eller bærer som det merkede reagens immobiliseres til, kan ha en rekke former hvorav følgende er illustrerende: En plaststav, eventuelt dekket med lag av et hvilket som helst porøst materiale. Staven kan dyppes i reaksjons-oppløsningen for å utføre de ulike bestemmelsestrinn.

Veggen på et reagensglass, en vegg i en mikrotiterplate eller veggen av et hvilket som helst annet passende reak-sjonskammer.

Et porøst materiale, hensiktsmessig en membran, hvor reaksjonsoppløsningen kan diffundere gjennom transversalt eller lateralt. Ved bruk av filtreringsprinsippet, er det en fordel om slike materialer tillater reagensoverskudd å passere gjennom og hensiktsmessig kombineres med et

absorbens for slikt væskeoverskudd.

Kuler (innbefattet mikrokuler) som kan isoleres ved sentrifugering, filtrering eller når kulene inneholder ferromagnetiske forbindelser, magnetisme.

Koblingen av analytt-analogen eller en spesifikk bindingspartner for den aktuelle analytt til bæreren kan være kovalent, elektrostatisk eller hydrofil eller en kombinasjon av disse metoder. Slike metoder er velkjent på området.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan benyttes for å påvise eller bestemme en lang rekke analytter som kan velges for eksempel fra følgende ligand-reseptorpar: antigen/- antistoff, hapten/antistoff, hormon/hormonreseptor, sukker/- lectin, biotin/avidin-(streptavidin), protein A/immuno-globulin, enzym/enzym-kofaktor, enzym/enzym-hemmer og nukleinsyre-par (DNA-DNA, DNA-RNA eller RNA-DNA). Minst én av slike reaksjonspartnere kan være bundet eller kompleksert med andre molekyler. Biotin eller avidin eller et bredt område av antistoffer kan kobles til andre molekyler for å gi anordninger for bestemmelse av sistnevnte. For eksempel kan en spesifikk nukleinsyre-sonde (probe) merkes via innføring av biotinylert nukleosid-trifosfat. En slik sonde kan etter binding til analytten DNA eller RNA, deretter påvises eller bestemmes ved bruk av avidin eller streptavidin merket med gull-sol.

Når analytten er en av de ovenfor angitte, vil en bindingspartner for bruk i henhold til oppfinnelsen i alminne-lighet være den andre par-komponenten. I sandwich-systemer hvor analytten bindes både til en immobilisert bindingspartner og til en bindingspartner merket med gull-sol, kan bindings-partnerne være like eller forskjellige. Fortrinnsvis vil hver bindingspartner være et antistoffreagens rettet mot ulike, vel adskilte analytt-determinanter.

Det er underforstått at uttrykket "antistoff" her skal innbefatte

(a) enhver av de forskjellige klasser eller under-klasser av immunoglobulin, f.eks. IgG, IgM, oppnådd fra ethvert av

de anvendte dyr;

(b) monoklonale antistoffer; og

(c) fragmenter av antistoffer, monoklonale eller polyklonale,

som beholder et antigen-bindingssete, dvs. fragmenter som mangler Fc-delen (f.eks. Fab, Fab', F(ab'))2) eller så-kalte "halvmolekyl"-fragmenter oppnådd ved reduktiv spaltning av de disulfid-bindingene som forbinder H-kjede-komponenter i det intakte antistoff.

Nedenfor er angitt en ikke fullstendig liste av typer av immunogener som kan påvises eller bestemmes etter fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Spesielt interessante analytter for bestemmelse etter fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er blodproteiner, så som fibrin-nedbrytningsprodukter, f.eks. D2, som bindes av immunoglobuliner så som IgG og humant C-reaktivt protein.

Analyttoppløsningen kan benyttes direkte eller kan for-tynnes, f.eks. med en passende bufferoppløsning. Gull-sol-preparatet kan også fremstilles i forskjellige fortynninger ved bruk av en passende bufferoppløsning, hvor fortynningene er valgt for å gi en farve av ønsket intensitet (dvs. optisk tetthet eller refleksjon) etter fullført bestemmelse. Det kan være ønskelig å vaske bæreren for å fjerne reagensoverskudd, f.eks. med en bufferoppløsning, før bestemmelsen for å redusere bakgrunnsfarve.

Når bestemmelsen er basert på den totale mengde av gull-sol som er igjen på den immobiliserte bærer, kan farven anslås med et reflektometer, densitometer eller med en lignende anordning.

Bæreren som benyttes for å immobilisere en av bindings-partnerne i bestemmelsen eller en analytt-analog, kan for eksempel være nitrocellulose, papir eller celluloseacetat aktivert med reagenser så som cyanogenbromid og nylon modifi-sert ved innføring av tertiære aminogrupper. Slike bærere benyttes hensiktsmessig i form av porøse membraner.

I en særlig foretrukket fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, er den inerte bærer en membran, for eksempel en nylon-membran så som Hybond.N (produkt fra Amersham International) som lett adsorberer proteiner og som har porer som tillater væskepassasje. Et absorbentlag så som cellulose-blotting-papir anbringes hensiktsmessig på den ene side av membranen og et flytende ugjennomtrengelig ark, fortrinnsvis hvitt, anbringes over laget. Et lignende væske-ugjennomtrengelig ark legges over den annen side av membranen, idet et hull, f.eks. ca. 3,5 mm bredt, er laget i dette ark for å tillate påføring av analytt-oppløsning og prøvevæsker til membranen. Først aktiveres membranen ved tilførsel av et lite volum f .eks. 2 fil, av en vandig oppløsning inneholdende en kjent mengde av bindingspartner for analytten, fulgt av tørring, f.eks. ved henstand ved romtemperatur. Et kjent volum av den vandige oppløsning inneholdende analytten, f.eks. ca. 25 fil, tilføres derefter til membranen og får passere gjennom denne inn i den underliggende absorberende pute. En vandig oppløsning, f .eks. 25 fil, inneholdende en kjent mengde av kolloidale gull-sol-partikler merket med en bindingspartner for analytten, som kan være den samme som eller forskjellig fra den som opprinnelig ble påført på membranen, påføres derefter og får passere gjennom membranen.

Et lite volum vann eller buffer' kan eventuelt tilføres for å vaske gjennom gull-sol-reagenset og således minimalisere. • bakgrunnsfarve. Mengden av gull-sol immobilisert på membranen bestemmes derefter ved hjelp av et reflektometer eller ved det blotte øye ved sammenligning med en farveskala.

Ved driftsmetoden (6) angitt ovenfor, kan membranen være et arkmateriale med den ønskede porøsitet som kan være inert eftersom dens eneste funksjon er å virke som et filter. Aggregering av analytten med komponenten C kan forsterkes ved å tilføre to eller flere forskjellige bindingspartnere for analytten for å frembringe en form for tverrbinding som fører til større aggregater. Alternativt kan komponent C omfatte bindingspartneren for analytten immobilisert på kuler, f.eks. monodisperse kuler så som "Dynospheres" (Dyno Particles AS, Oslo, Norge).

Oppfinnelsen innbefatter også reagenssett for å utføre fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, og disse omfatter (a) en fast fase hvortil et merket reagens bringes til immobilisering for å gi en indikasjon på nærvær eller mengde av analytten i prøven og (b) et merket reagens, hvor det karakteristiske består i at det merkede reagens omfatter en gull-sol bundet til en substans som spesifikt kan binde seg til nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner for denne, hvor minst 75 vektprosent av gullpartiklene i den nevnte gull-sol har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nm og ikke mindre enn 3 nm. En foretrukket form av reagenssett består av (a) en fast bærer for immobilisering av en analytt-analog eller en spesifikk bindingspartner for analytten, eller et kompleks av analytten med én eller flere reagenser, (b) nevnte analytt-analog eller bindingspartner og (c) et reagens som består av en gull-sol bundet til et molekyl som spesifikt kan bindes til analytten eller en spesifikk bindingspartner for denne, hvor minst 75% av partiklene i gull-solen har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nm og ikke mindre enn 3 nm. Den faste fase som inngår i settet kan eventuelt være en fast bærer som er klar for å bringes i kontakt med analytten av brukeren, ved forutgående kobling av en analytt-analog eller en spesifikk bindingspartner for analytten til bæreren. For enkelte bestemmelser kan et slikt sett innbefatte en standardmengde av analytten, en standardmengde av en spesifikk bindingspartner for denne og gull-sol reagenset. Standardmengder av analytt eller spesifikk bindingspartner eller reagens kan være i form av vandige oppløsninger, eller, hva som vil være mer vanlig, lyofiliserte preparater egnet for oppløsning ved tidspunktet for bruk. For én bestemmelsesform, kan den faste bærer være en inert porøs membran som tjener til å holde tilbake et kompleks av analytten og en bindingspartner i aggregert form, men tillater diffusjon av gull-sol-reagenset, som i metode 6 ovenfor. I et slikt system kan størrelsen av analytt-komplekset økes ved å knytte den nevnte bindingspartner eller analytt-analog til relativt store partikler, f.eks. ovennevnte Dynospheres.

De følgende eksempler er kun angitt som illustrasjon:

Eksempel 1

Kolloide gullpartikler

Partikler med en dokumentert gjennomsnittsstørrelse på mindre enn 5 nm ble anskaffet fra Janssen Pharmaceuticals. Den gjennomsnittlige partikkelstørrelse ble bekreftet å være 4.5 nm og med 85% av partiklene mindre enn 5 nm, ved å benytte en sub-mikron partikkelanalysator modell A4 fra Coulter.

Partiklene ble merket med et monoklonalt IgG (fra mus) med spesifisitet for D2, et nedbrytningsprodukt av fibrin-polymerer, ved å benytte fremgangsmåten beskrevet av Slot & Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38: 87-93, 1985). Densiteten av partikkeloppløsningen ble regulert ved bruk av en buffer, hvor en 1:20 fortynning skulle gi en optisk tetthet på 2,0 ved 580 nm.

Testanordning

En lxl cm bit av nylon-membran (Hybond N fra Amersham med porestørrelse 450 nm) ble anbragt under en strimmel av hvit polyvinylklorid (PVC), 0,28 mm tykk og med et 3,5 mm hull sentrert over membranen. Membranen ble festet til plasten ved bruk av dobbelsidig tape. PVC-strimmelen med den tilknyttede membran ble deretter festet til et 1 mm tykt lag cellulose-blotting-papir (Schleicher & Schuell) til det tape-området som ikke var dekket av membranen. Anordningen ble lukket nedentil av en annen PVC-strimmel, 0,40 mm tykk, festet til puten ved bruk av dobbeltsidig tape. Denne konstruksjon gjør det mulig for væske å passere gjennom hullet i den øvre PVC-strimmel og gjennom membranen og akkumulere i det nevnte lag.

Aktivering av membranen

Membranen ble aktivert ved tilsetning av 2 fil av en

3.6 mg/ml oppløsning av et ytterligere monoklonalt IgG (mus),

rettet mot D2. Membranen i innretningen fikk tørke ved romtemperatur før bruk.

Testutførelse

25 /il plasma som eventuelt inneholdt D2 eller plasma anriket med renset D2, ble anbragt på membranoverflaten i testanordningen. Etter ca. 1 minutt hadde oppløsningen passert gjennom membranen og inn i det ovenfor omtalte lag. 25 /il av gull-oppløsningen ble deretter tilsatt til membranen. Når denne gikk gjennom, resulterte nærværet av D2 i prøven i en rødaktig farve av gull på membranen. Farveintensiteten ble visuelt sammenholdt med konsentrasjonen av D2 i prøven, innen bestemte konsentrasjonsnivåer. Bakgrunnsfarven for kontroller kunne reduseres ved tilsetning av 25 /il vann.

Instrumentell analyse av testresultatene

Testresultatene ble avlest instrumentelt ved bruk av et reflektometer (Color Eye, Macbeth), forbundet med en IBM PC og ved bruk av Macbeth's programvare. De oppnådde reflektometer-verdiene ved bruk av instrumentet viste, innen et visst område, lineær korrelasjon mellom farveintensitet og D2-konsen-trasjon.

Eksempel 2

Fremgangsmåten i Eksempel 1 ble gjentatt ved bruk av gull-kolloider med en gjennomsnitts størrelse på 4,7 nm, 15 nm og 3 0 nm. Samtlige kolloider ble anskaffet fra Janssen Pharmaceuticals. Kolloidene ble merket med antistoffer til metningspunktet (målt etter fremgangsmåten til Slot & Geuze), med antistoffer.

Samtlige kolloidsuspensjoner ble fortynnet til OD525 = 0 ,1 ved bruk av 2 mmol/liter natriumfosfatbuffer (pH 6,4).

Undersøkelsen ble foretatt som i Eksempel 1 for hver partikkelstørrelse. Positive resultater ga en farve på den faste membran som var av omtrent samme intensitet for 15 og 3 0 nm kolloider. Denne intensitet var ca. halvparten av intensiteten av 4,7 nm kolloidet. Målinger ved reflektometri, som i Eksempel 1, bekreftet våre visuelle funn.

Eksempel 3

Fremgangsmåtene og oppsettet i Eksempel 2 ble gjentatt med monoklonale antistoff (mus) rettet mot humant C-reaktivt protein (CRP). Siden CRP er en pentamer, ble det samme antistoff benyttet i membranen (5 /il inneholdende 2 fig antistoff ble tilsatt) så vel som på gull-konjugatet. Prøven tilsatt til membranen var et humant serum inneholdende ca. 4 0 fig CRP/ml fortynnet 15 ganger i destillert vann. 20 /il ble tilsatt til membranen, etterfulgt av 2 0 fil av det kolloidale gull-konjugat mettet med antistoff og fortynnet som i Eksempel 2. Resultatene var omtrent de samme som i Eksempel 2 og viste at farveintensiteten oppnådd med 4,7 nm gull var minst 1,5 ganger den intensitet som oppsto med 15 nm eller med 3 0 nm gull-kolloid.

Eksempel 4

Fremgangsmåten og oppsettet i Eksempel 2 ble gjentatt ved bruk av gull-kolloider med en gjennomsnittlig størrelse på ca. 3, 4 og 4,5 nm. Kolloidene ble fremstillet ifølge Muhlpfordt (1982, Experientia 38, s. 1127-28) ved å øke mengden av garve-syre for å redusere partikkelstørrelsen. Partikkelstørrelsen ble bekreftet ved elektronmikroskopi. Siden titreringen av slike små partikler med hensyn til antistoff-metning måtte antas å være vanskelig, ble titreringen foretatt med 4,5 nm partikler, mens den samme mengde av antistoff ble benyttet med 3 og 4 nm. Fremgangsmåten var i alle henseende den samme som i beskrivelsen i Eksempel 2. Resultatene viste at den resul-terende farve var en tanke mer intens med 3 nm enn med 4 nm gull-kolloider, som på sin side var identisk med den for 4,5 nm.

Det skal bemerkes at håndteringen av 3 nm gull-kolloid-konjugater under vaskebehandlingene fordret bruk av en ultra-sentrifuge for å sedimentere de meget små partiklene. På alle andre måter oppførte disse partiklene seg på samme måte som 4 og 4,5 nm partiklene.

Eksempel 5

15 nm og 3 0 nm kolloidalt gull (anskaffet fra Janssen Pharmaceuticals, Belgia) og 4,5 nm gull-partikler fremstillet etter metoden beskrevet i Eksempel 4, ble benyttet. Kolloidene ble konjugert til monoklonalt IgG (mus) som var spesifikk for D2, som beskrevet i Eksempel 1. De kolloidale gull-konjugatene ble tilslutt fortynnet til OD525 = 0, 010 ved bruk av 2 mmol/- liter natriumfosfatbuffer (pH 6,4).

På membraner på ca. 0,5 x 2,0 cm fremstillet fra Hybond C (Amersham UK) ble det applisert 10 /il D2 (0,5 mg/ml i 0,15 mol/liter NaCl) og tørket i ca. 30 minutter. Frie bindingsseter ble deretter blokkert ved inkubering av membranene med 2 ml 1% serumalbumin (storfe) i fosfatbuffret saltoppløsning (pH 7,4) i 3 0 minutter. 7 membraner ble undersøkt for hver størrelse av gull-kolloid. Hver membran fremstillet som ovenfor, ble anbragt i sine respektive reagensrør som var tilsatt 2 ml av én av de fortynnede kolloidale gull-konjugatene. Membranene ble fjernet fra rørene til passende tidsintervaller, renset med fosfatbuffret saltoppløsning og tørket. Mengden av gull-kolloid ble målt ved bruk av et reflektometer som i Eksempel 1.

Resultatene viste at farveutviklingen i reagensrør med 4,5 nm gull-kolloider var mer enn 3 ganger større enn for 15 nm eller 30 nm gull-kolloidet. 15 nm og 30 nm førte til innbyrdes meget like sett av resultater.

Eksempel 6

Eksempel 5 ble gjentatt ved bruk av en fullstendig sandwich. Membranene ble applisert monoklonalt IgG (mus) spesifikt for D2 (10 /il inneholdende totalt 5 /ig antistoff) og tørket.

Membranene ble deretter "blocked" og inkubert med 2 ml av en oppløsning inneholdende 0,1 mg/ml renset D2 i fosfatbuffret saltoppløsning (pH 7,4) inneholdende 1% albuminserum (storfe), i 1 time ved 37°C. Membranene ble deretter renset og inkubert med gull-kolloid-konjugater i henhold til fremgangsmåten i Eksempel 5.

Det ble oppnådd et lignende resultat som viste at farveutvikling ved bruk av 4,5 nm gull-kolloid-konjugat ga ca. den dobbelte intensitet som 15 nm eller 3 0 nm kolloidene.

Eksempel 7

Eksempel 6 ble gjentatt ved å erstatte to D2-spesifikke antistoff med det samme CRP-spesifikke antistoff i membranen så vel som på gull-konjugatet. Fremgangsmåten og anvendte media var forøvrig identiske.

Farveutviklingen forårsaket av 4,5 nm gull-kolloid-konjugater hadde ca. 3 ganger den intensitet som ble oppnådd med 15 nm gull som igjen var ca. 1,2 ganger mer intens enn 30 nm gull.

Eksempel 8

To monoklonale antistoffer (mus) spesifikke for D2 som benyttet i foregående eksempler, ble behandlet som følger: Et av antistoffene ble konjugert til gull-kolloider med henholdsvis 4,5 nm, 15 nm og 30 nm. Kolloidene ble oppnådd på samme måte som i Eksempel 5. Konjugatene ble fremstillet som i Eksempel 5 og fortynnet til OD525 = 0 , 010 i 50 mmol/liter Tris HCl-buffer (pH 7,4) inneholdende 0,15 mol/liter NaCl, 0,01% Tween 20 og 1% serumalbumin (storfe).

Det andre antistoffet ble konjugert til 3 \ i partikler (Dynospheres CA-031-A, Dyno Particles AS, Norge). Partiklene ble preaktivert for proteinkobling av produsenten. Antistoffet ble oppløst for å gi 170 /xg/ml i 10 mmol/liter natriumfosfatbuffer (pH 7,5) med 0,15 mol/liter NaCl og 30 mg/ml partikler. Denne blanding ble tilsatt et halvt volum av 0,05 mol/liter natriumboratbuffer (pH 9,5), hvorpå blandingen ble rotert end-over-end i 20 timer ved 20°C. Partiklene ble deretter vasket, sentrifugert og resuspendert i en fosfatbuffer (pH 7,5). Eventuelle gjenværende aktive grupper ble blokkert ved inkubering med 1 mol/liter etanolamin (pH 9,5) inneholdende 0,1% Tween 20, ved 20°C i ytterligere 20 timer. Partiklene ble deretter vasket 2 ganger med 50 mmol/liter Tris HCl (pH 7,4) inneholdende 0,1 mol/liter NaCl, 0,01% serumalbumin (storfe) og 0,1% Tween 20.

Partiklene fremstillet på denne måte kan holde seg i homogen suspensjon i minst 1 time. 1 mg partikler vil binde ca. 5 fig antistoff.

Alikvoter av ca. 1 mg partikler ble sentrifugert og resuspendert i 0,5 ml av hver av de tre gull-kolloid-konjugat-oppløsningene justert til 0,1 mg/ml renset D2 og inkubert ved end-over-end blanding ved 20°C. Til visse tidsrom ble alikvoter av 50 fil tatt ut fra blandingen og tilsatt til en testanordning som beskrevet i Eksempel 1 som hadde en membran fullstendig blokkert med serumalbumin fra storfe.

Ved å benytte denne fremgangsmåte vil gull-kolloid-konjugater klebe til partiklene og etter filtrering i anordningen, vil de farvede gull-kolloider bli holdt igjen i filteret. Ubundne kolloidale gull-konjugater vil passere gjennom filteret.

I løpet av en halv times inkubering ble alikvoter tatt ut hvert 5. minutt. Farveintensiteten som oppsto med 15 nm eller 3 0 nm kolloider var omtrent den samme på alle punkter, med en lineær økning opptil ca. 20 minutter. Intensiteten frembragt med 4,5 nm kolloider var ca. 2,5 ganger høyere etter 5 minutter og denne intensitetsdifferanse avtok etter 10 minutter. Av de ovenfor angitte eksempler fremgår det at gull-kolloider med en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nm tillater raskere reaksjon og gir mer intens farveutvikling enn tidligere kjente gull-kolloid-konjugater.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en analytt i en prøve, hvor et reagens som omfatter en gull-sol bundet til et stoff som er i stand til spesifikt å binde seg til den nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner for denne, bringes til immobilisering i bundet form på en fast fase for å gi en indikasjon på forekomsten av, eller mengden av, analytten i prøven ved deteksjon av forekomst, eller intensitet, av farve av immobilisert gull-sol karakterisert ved at minst 75 vektprosent av gullpartiklene av den nevnte gull-sol har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nanometer, men ikke mindre enn 3 nanometer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven i et vandig medium bringes i kontakt med (i) en analytt-analog eller en spesifikk bindingspartner for nevnte analytt immobilisert på en fast bærer og (ii) et merket reagens omfattende en gull-sol bundet til et molekyl som spesifikt kan bindes til nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner for denne, hvorved en mengde av det nevnte gull-sol-reagens immobiliseres på bæreren, som ved inspeksjon eller bestemmelse av farven benyttes for å indikere forekomst eller mengde av nevnte analytt i prøven, idet minst 75 vektprosent av gullpartiklene i gull-solen har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nanometer og ikke mindre enn 3 nanometer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved åt minst 80 vektprosent av gullpartiklene i gull-solen har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nanometer og ikke mindre enn 3 nanometer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at minst 85 vektprosent av gullpartiklene i gull-solen har en gjennomsnittlig diameter som er mindre enn 5 nanometer og ikke er mindre enn 3 nanometer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at formen av den faste fase eller bærer er valgt fra en stav som kan dyppes ned i opp-løsningen, et porøst materiale eller en vegg i et reaksjons-kammer, og at materialet av den faste fase eller faste bærer er valgt fra nitrocellulose, papir, celluloseacetat, nylon eller annet polymermateriale som biologiske substanser kan bindes til.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den faste fase eller faste bærer er et porøst materiale og at det benyttes anordninger for å forbedre væsketransporten gjennom det porøse materiale.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at analytten og reagenset blandes før de blir bragt i kontakt med den faste fase.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at analytten bringes i kontakt med den faste fase etter at reagenset er bragt i kontakt med den faste fase.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at en absorberende pute er anordnet på det porøse materialet, et væske-ugjennomtrengelig ark er anordnet på overflaten av nevnte absorberende pute fjernt fra nevnte porøse materiale, og et væske-ugjennomtrengelig ark med ett eller flere hull er anordnet på overflaten av nevnte porøse materiale fjernt fra nevnte absorberende pute, og prøven og reagenset tilføres suksessivt til ett av nevnte hull og bringes til å diffundere på tvers gjen nom nevnte porøse materiale ved absorpsjon i nevnte absorberende pute.

10. Reagenssett for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av en analytt i en prøve som omfatter (a) en fast fase hvortil et merket reagens bringes til immobilisering for å gi en indikasjon på forekomst eller mengde av analytten i prøven og (b) et merket reagens, karakterisert ved at det merkede reagens omfatter en gull-sol bundet til et stoff som spesifikt kan binde seg til nevnte analytt eller til en spesifikk bindingspartner for denne, hvor minst 75 vektprosent av gullpartiklene i den nevnte gull-sol har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nanometer, men ikke mindre enn 3 nanometer.

11. Reagenssett ifølge krav 10, karakterisert ved at den faste fase eller bærer har en form som er valgt fra en stav som kan dyppes ned i oppløsningen, et porøst materiale eller en vegg i et reak-sjonskammer, og at materialet av den faste fase eller faste bærer er valgt fra nitrocellulose, papir, celluloseacetat, nylon eller annet polymermateriale som biologiske substanser kan bindes til.

12. Reagenssett ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at den faste fase er et porøst materiale og at det benyttes anordninger for å forbedre væsketransporten gjennom det porøse materiale.

13. Reagenssett ifølge krav 10-12, karakterisert ved at minst 8 0 vektprosent, fortrinnsvis minst 85 vektprosent av gullpartiklene i den nevnte gull-sol har en gjennomsnittlig diameter på mindre enn 5 nanometer, og ikke mindre enn 3 nanometer.

14. Reagenset ifølge krav 12, karakterisert ved at en absorberende pute er anordnet på det porøse materialet, et væske-ugjennomtrengelig ark er anordnet på overflaten av nevnte absorberende pute fjernt fra nevnte porøse materiale, og et væske-ugjennomtrengelig ark med ett eller flere hull er anordnet på overflaten av nevnte porøse materiale fjernt fra nevnte absorberende pute, idet den absorberende pute er effektiv til å frembringe tverrgående diffusjon av nevnte prøve og reagens gjennom nevnte porøse materiale etter tilførsel til ett av nevnte hull.