NO20140949A1

NO20140949A1 - Forbindelse og sammensetning for kontroll av virus

Info

Publication number: NO20140949A1
Application number: NO20140949A
Authority: NO
Inventors: José Luis González Vecino; Adel El-Mowafi; José Miguel Troncoso Kirsten; Nestor Javier González Foretic; Jorge Eduardo Pino Marambio
Original assignee: Ewos Innovation As
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2011-09-27
Also published as: EP2552431A1; NO20121253A1; CA2794480A1; CL2015000848A1; DK2552431T3; CL2012002654A1; NO348141B1; EP2552431B1; NO20220848A1; NO346522B1; WO2011119047A8; CA2794480C; WO2011119047A1; NO20100454A1

Abstract

Det beskrives en propyl-metyl-fenolforbindelse, spesielt Thymol og/eller Carvacrol eller sammensetninger omfattende en propyl-metyl-fenolforbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av infektiøs lakseanemivirus.

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemisk virus, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av infektiøs lakseanemivirus.

Infektiøs lakseanemi, og infektiøs lakseanemivirus ( ISAv)

Infektiøs lakseanemi (ISA) er et dobbelttrådet RNA-virus tilhørende Ortomykso-viridae. Viruset har forårsaket alvorlig økonomisk effekt i mange lakseproduserende regioner, inkluderende Chile, Norge, Skottland, Færøyene, Canada og USA. Sykdommen resulterer i alvorlig anemi i atlantisk laks, påvirker det bloddannende vev inkluderende milt, nyre og likeledes lever og hjerte. Ørret og andre marine orga-nismer kan være asymptomatiske bærere av sykdommen. Nivåer av mortalitet varierer sterkt, men økonomiske tap på opp til 90% har blitt registrert. Toppene på utbrudd forekommer generelt om våren og tidlig sommer med temperaturer rundt 10°C. ISA har forekommet i et temperaturområde av 3°C - 15°C. I 1997 ble ISA listet i European Union Directive 91/67EC og klassifisert som sykdom som en "List I disease".

Smittsom (infektiøs) lakseanemi eller anemi (ISA) er en viral sykdom i atlantisk laks ( Salmo salar) som påvirker fiskeoppdrett i Canada, Norge, Skottland og Chile, og forårsaker alvorlig tap av infiserte farmer.

Som navnet medfører, forårsaker den alvorlig anemi i infisert fisk. I motsetning til pattedyr så har de røde blodceller i fisk DNA, og kan bli infisert med virus. Fisken utvikler bleke gjeller, og svømmer nær vannoverflaten og gisper etter luft. Imidlertid, sykdommen kan også utvikles uten at fisken viser noen ytre tegn på sykdom, og fisken kan opprettholde en normal appetitt, og deretter plutselig dø. Sykdommen kan utvikle seg langsomt gjennom et infisert anlegg, og i de verste tilfeller kan dødsraten nærme seg 100%. Post-mortem-undersøkelser av fisken har vist et spekter av årsaker til døden. Lever og milt kan være oppsvulmet, blokkert eller delvis allerede død. Sirkulasjonssystemet kan stoppe å fungere, og blodet kan være kontaminert med døde blodceller. Røde blodceller som fremdeles er til stede sprenges enkelt, og antallet umodne og skadete blodceller øker.

Infektiøs lakseanemi synes å være mest likt influensavirus. Dets overføringsmodus og naturlige reservoarer for infektiøs lakseanemivirus er ikke fullt forstått. I tillegg til atlantisk laks, kan både sjøgående brun ørret ( Salmo trutta) og regnbueørret ( Oncorhynchus mykiss) infiseres, men de blir ikke syke, så det er tenkt mulig at disse arter kan virke som viktige bærere og reservoarer av viruset.

Viruset kan overleve i sjøvann og, ikke overraskende, en hoved risikofaktor for mange infiserte oppdrettsanlegg er nærhet til et allerede infisert anlegg.

I det siste har det blitt vist at sjølus, en liten krepsparasitt som angriper den beskyt-tende mukus, skjell og skinn i laksen viste seg å bære viruset passivt på dets overflate og dets fordøyelseskanal, men overføring av sykdommen med sjølus har ikke blitt påvist ennå.

Det er derfor svært viktig å finne nye forbindelser og nye måter å behandle og hindre Piscirickettsia salmonis og ISAv-forårsakede sykdommer i fisk.

Det objektive tekniske problem ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe nye effektive midler og fremgangsmåter for å drepe eller regulere Piscirickettsia salmonis og ISAv.

Sammendrag av oppfinnelsen

Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en propyl-metyl-fenol-forbindelse, eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemisk virus, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller kontrahering av infektiøs lakseanemivirus.

Foretrukne utførelser ifølge foreliggende oppfinnelse er gitt i underkravene 2-2, og vedrører én eller flere av følgende trekk:

- nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-metyl-fenol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. Carvacrol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. Thymol.

- sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol.

- konsentrasjonen (av aspekt 1) er ca. 3,7 mg/l applisert til et vandig lokus, og ca. 15 mg/kg som en komponent av et for. - konsentrasjonen (av aspekt 2) er ca. 100 mg/l applisert til et vandig lokus, og ca. 120 mg/kg som en komponent av et for. - sammensetningen er en forsammensetning og hvor mengden av Carvacrol og Thymol er ca. 30 ppm eller mer av nevnte forsammensetning, for eksempel mengden av Carvacrol er ca. 15 ppm og mengden av Thymol er ca. 15 ppm. - forholdet Carvacrol:Thymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.

- nevnte fisk er en Salmonidae.

- nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).

Et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en anvendelse av en propyl-metyl-fenol-forbindelse, eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse for fremstilling av en farmasøytisk og/eller nutrasøytisk sammensetning for behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemisk virus, og/eller for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av infektiøs lakseanemivirus.

Foretrukne utførelser av dette aspekt av foreliggende oppfinnelse er gitt i underkravene 14-23, og vedrører én eller flere av følgende trekk:

- nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-metyl-fenol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. Carvacrol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. Thymol.

- sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol.

- konsentrasjonen (av aspekt 1) er ca. 3,7 mg/l applisert til et vandig lokus, og ca. 15 mg/kg som en komponent i et for. - konsentrasjonen (av aspekt 2) er ca. 100 mg/l applisert til et vandig lokus, og ca. 120 mg/kg som en komponent av et for. - sammensetningen er en forsammensetning hvor mengden av Carvacrol og Thymol er ca. 30 ppm eller mer av nevnte forsammensetning, for eksempel hvor mengden av Carvacrol er ca. 15 ppm og mengden av Thymol er ca. 15 ppm. -forholdet Carvacrol :Thymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.

- nevnte fisk er en Salmonidae.

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere infektiøs lakseanemivirus, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere en propyl-metyl-fenol-forbindelse eller en sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenol-forbindelse.

Foretrukne utførelser av tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse er gitt i underkravene 25-35, og vedrører én eller flere av følgende trekk: - nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres til et lokus som skal beskyttes fra nevnte bakterier eller virus. - nevnte lokus er et vandig miljø og hvor propyl-metyl-fenol-forbindelsen appliseres direkte til det vandige lokus. - nevnte lokus inneholder fisk og som er mottakelige til infeksjoner forårsaket av Piscirickettsia salmonis eller infektiøs lakseanemisk virus, hvor propyl-metyl-fenol-forbindelsen appliseres direkte til fisken, fortrinnsvis med topikal eller oral applisering. - propyl-metyl-fenol-forbindelsen appliseres til fisken som en komponent av foret som mates til fisken.

- nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol, fortrinnsvis 2-isopropyl-metyl-fenol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. Carvacrol.

- nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. Thymol.

- sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol.

-forholdet Carvacrol :Thymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.

- nevnte fisk er en Salmonidae.

Et fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører et fiskefor omfattende konvensjonelle foringredienser så som proteiner, lipider, karbohydrater, vitaminer og mineraler, kjennetegnet ved at nevnte for også omfatter Carvacrol og Thymol.

Fortrinnsvis, nevnte forhold av Carvacrol Thymol er ca. 1:1.

Fortrinnsvis, Carvacrol og Thymol foreligger i fiskeforet i en mengde på ca. 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Utførelser av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet, ved hjelp av eksempler med referanse til følgende figurer, hvor: Figur 1 viser observert overlevelse av regnbueørret med et utbrudd av SRS gitt forskjellige behandlinger som beskrevet i eksempel 3. Hver kurve angir at bur. «Kontroll» er et kommersielt for (EWOS Silva), hvor «BG» er en boost premiks, og «BG + ny» er boost premiks og 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol, dvs. et representativt eksempel på en «forbindelse i samsvar med oppfinnelsen». Figur 2 viser estimerte risikoforhold (relativ risiko for død) i relasjon til kontrollfor (risiko tatt som 1 og markert med stiplet rød horisontal linje). Feilmarginer viser 95% pålitelighetsintervaller. «BG» er en boost premiks, og «BG + ny» er boost premiks og 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol. Figur 3 viser CT-verdiene for P. salmonis i hjernevev ved initiering av forsøket beskrevet i eksempel 3 oppnådd gjennom qPCR. Figur 4 viser CT-verdiene for P. salmonis i hjernevev ved slutten av forsøket beskrevet i eksempel 3 oppnådd gjennom qPCR. Figur 5 viser CT-verdiene for P. salmonis i nyrevev ved initiering av forsøket beskrevet i eksempel 3 oppnådd gjennom qPCR. Figur 6 viser CT-verdiene for P. salmonis i nyrevev ved slutten av forsøket beskrevet i eksempel 3 oppnådd gjennom qPCR.

Eksperimentell seksjon

Eksempel 1 - effekt av carvacrol på Piscirickettsia salmonis

Formålet med dette forsøk er å evaluere effektiviteten av carvacrol, og en kombina-sjon av carvacrol og tymol mot Piscirickettsia salmonis ( P. salmonis) med in vitro bestemmelse av Minimum Inhibitorisk Konsentrasjon (MIC).

Materialer og metoder

Fremstilling av testforbindelsene

Fremstilling av arbeidsløsninger av carvacrol og tymol ble utført av Laboratory of Ecological Chemistry, Faculty of Chemistry, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Carvacrol (Sigma Aldrich 98% standard kvalitet) ble fortynnet i destillert vann/etanol-løsning opp til 200 ppm (benevnt "CAR1"). Carvacrol + tymol (Sigma Aldrich 98% standard kvalitet) 1:1 (volum:volum) ble fortynnet i DMSO/destillert vann ved 200 ppm (benevnt "CAR2"). Alle produkter, forrådsløsninger og arbeidsløsninger ble lagret under avkjøling (4°C) og ble håndtert under et laminært strømnings-kammer for å unngå kontaminering av produktene som skal evalueres.

Antibakteriell effektivitet

Evalueringen av MIC av de forskjellige løsninger av carvacrol og tymol mot P. salmonis ble utført ved ADL Diagnostics, Puerto Montt, Chile. Seks forskjellige isolater av P. salmonis ble oppnådd fra kliniske tilfeller mottatt ved ADL Diagnostics og fikk vokse ved 18°C i agar PSA1, spesifikk for P. salmonis. De forskjellige isolater ble bekreftet med TaqMan® RT-PCR (A. Casanova, J. Obreque C, A.M. Sandino G. og J. Jashés. 2001. tRNA-gener ble funnet i Piscirickettsia salmonis 16S-23S rDNA spacer region (ITS). FEMS Microbiology Letters. Vol. 197: 19-22)

(http://www3.appliedbiosystems.com/). Isolater ble merket som: Ps1: PM-10908; Ps": PM-10877; Ps3: PM10795; Ps4: PM-10766; Ps5: PM-10727 og Ps6: PM-10707.

Minimum inhibitorisk konsentrasjon ( MIC)

MIC for de seks isolater ble bestemt ved anvendelse av en standardisert metode på National Comitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2005) basert på standard M49-P (2005), som involverer å utføre serielle fortynninger av produktet (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,1; 1,5; 0,7; 0,35; 0,18; 0,09 ppm) for å bestemme den minimale konsentrasjon som inhiberer bakteriell vekst.

Inokulum fra rene isolater i agar PSA ble opptatt for å oppnå en konsentrasjon av 0,5 McF, som ble utsådd med de forskjellige fortynninger av testforbindelser for å evaluere antibakteriell effekt i dyrkningsmikroplatene. Mikroplatene ble inkubert ved 18°C i 241. Deretter ble en avskrelling utført med hver fortynning på en agar plate PSA, som deretter ble inkubert i 10 dager for å observere vekst av P. salmonis.

Resultater og diskusjon

MIC for carvacrol (CAR1) nådde en verdi i området 3,7 til 7,4 ppm. For det bestemte tilfellet av CAR2 ble MIC oppnådd på 3,7 ppm i alle isolatene som ble testet, noe som indikerer at tymol ville forsterke den antibakterielle virkning av carvacrol alene (Tabell 1).

Følgende konklusjoner kan trekkes fra dette eksperiment:

Eksempel 2 - antiviral effekt av Carvacrol og Thymol mot ISAv

ISAv er et alvorlig problem for chilensk lakseindustri med en høy registrering av mortaliteter i de siste to år.

Det objektive formål med forliggende forsøk er å undersøke den antivirale effektivitet av carvacrol og tymol mot ISAv.

Materialer og metoder

Fremstilling av produktene

Fremstilling av arbeidsløsninger av carvacrol ble utført av Laboratory of Ecological Chemistry, Faculty of Chemistry, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Carvacrol (Signa Aldrich 98% standard kvalitet) ble fortynnet i destillert vann/etanol-løsning opp til 200 ppm (benevnt "CAR1"). Alle produkter, forrådsløsning og arbeids-løsninger ble lagret under kjøling (4°C) og ble håndtert under laminær strømnings-kammer for å unngå kontaminering av produktene som skal evalueres.

Stamme av ISAv

Det ble anvendt en stamme av ISAv oppnådd fra ADL Diagnostic (ADL-PM3205-ISAV-07), som ble isolert fra en nyre av atlantisk laks (ASK-1) innfestet med ISAv i Isla Lemuy, Chiloé, Chile. Det isolerte virus ble bekreftet, gjennom Indirekte immun-fluorescens (IFAT) og RT-PCR.

Utfordring med ISAv

Elleve fortynninger ble fremstilt med carvacrol (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1, 1,5, 0,7, 0,35, 0,18, 0,09 mg/l). Hver fortynning ble utfordret med ISAv i en konsentrasjon av 107 25TCID5o (median vevsdyrkningsinfektiv dosering; den mengde av et patogent middel som vil produsere patologisk forandring i 50% av cellekulturene som er inokulert), i løpet av 30, 60, 120 og 360 minutter). Deretter ble hver fortynning av carvacrol med ISAv inokulert i et monosjikt av ASK-1-celler (Atlantic salmon Kidney-1 celler, isolert og opprettholdt i ADL Diagnostic) og inkubert i 10 dager. Nærvær av ISAv i hvert sjikt av celler ble bestemt, gjennom I FAT (indirekte fluorescent antistofftest).

Resultater

Carvacrol viste en effekt mot ISAv i høy fortynning (100 mg/l) testet in vitro, etter virusadsorpsjon (Tabell 2). Etter 60 minutter inhiberte carvacrol replikasjon av ISAv i alle replika.

Følgende konklusjoner oppnås fra dette eksperiment:

Eksempel 3 - effekten av Carvacrol og Thymol mot Piscirickettsia salmonis i regnbueørret under en vekstfase

Formålet med dette stadium er:

1) Undersøke effektiviteten av Carvacrol og Thymol mot Piscirickettsia salmonis i regnbueørret (O. mykiss). 2) Evaluere dersom pulsbehandlinger med Carvacrol og Thymol har en effekt på mortalitet i forbindelse med et P. salmonis utbrudd.

Mellom november 2009 og desember 2009 ble et forsøk utført i Caniglia sjøfelt-fasilitet av Mainstream (XI Region, Chile). Caniglia-stedet har 16 bur på 30 m x 30 x med et automatisk foringssystem. Hvert bur inneholdt nær 50.000 fisk under grow-out-perioden. I Caniglia-forsøk ble regnbueørret (O. mykiss) anvendt i alle burene med fisk av vekt 1,280 g til 2,240 g.

I forsøket ble fisk foret et kommersielt for (EWOS Silva) som kontrollfor. For hver behandling ble det samme kommersielle for anvendt som base men supplert med: i) en dosering av 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol pluss boost premix (BG + ny) og ii) kun boost premix (BG). Boost premix som ble anvendt inneholdt immun-stimulant, vitamin C og prebiotika (0,5% av formuleringen).

Under forsøket ble et utbrudd av SRS (Salmonid Rickettsial Septikemi) observert etter 13. november. For å undersøke dets konsekvenser ble det vurdert en behandling med funksjonelle for (BG og BG+ny) og deretter sammenlignet med kontrollgruppen. Forsøket ble utført som en puls på 21 dagers foring, startende den 26. november.

Hver dag ble død fisk tatt fra burene og analysert direkte for mulige årsaker til mortalitet, og deretter registrert som kumulativ mortalitet av dette forskningssted. Ved starten og slutten av pulsen (26. november og 17. desember, respektivt), ble prøver av hjerne og nyre tatt fra 10 døende fisk pr. bur. Prøvene ble fiksert i etanol og vev ble analysert med qPCR av PCR-laboratoriet til EWOS Innovation Chile (X Region, Chile). Relative konsentrasjoner av DNA som foreligger under den ekspo-nentielle fase av reaksjonen ble bestemt ved å plotte fluorescens mot syklusnummer på en logaritmisk skala, hvor syklus hvorved fluorescens fra en prøve krysset terskelverdien ble benevnt syklustersket (CT).

Overlevelsesdata var tilgjengelig for alle bur og disse data ble først omdannet til en egnet form for overlevelsesanalyse ved å tilføye antallet overlevende individer ved slutten av monitoreringsperioden med en «overlevd» status (sensur). Alle mortaliteter ble gitt en «død» status. Deretter ble effektene av behandlinger på overlevelsesforhold modellert med et multinivå Cox proporsjonal risikomodell (kinship package of R). Antilogg av Cox-modellen av fikserte effektparametere kan tolkes som risikoforhold. Pålitelighetsintervallene av risikoforholdene ble beregnet med posterior simulering hvor man antar multivariat normal fordeling av parameterne med den estimerte felles varians-kovarians matriks og eksponentiering av posteriore fordelinger før man tar antilogaritmiske verdier. Bur-til-bur-varians ble ikke vurdert i denne simulering.

Resultater

Forkonsumpsjon mellom grupper av fisk var tilsvarende under hele perioden av forsøket og under pulsing av de funksjonelle for (0,7% - 0,88% kroppsvekt/dag). Figur 1 viser den observerte overlevelse av fisken ved forskjellige behandlinger. Hver kurve innen et subplot angir et bur. Figur 1 viser observert overlevelse for regnbueørret med et utbrudd av SRS gitt forskjellige behandlinger som beskrevet i eksempel 3. Hver kurve angir et bur. «Kontroll» er et kommersielt for (EWOS Silva), mens «BG» er en boost premix, og

«BG + ny» er boost premix og 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol.

De estimerte risikoforhold i relasjon til kontrollfor med tilnærmet 95% pålitelighetsintervaller er gitt i Tabell 3.

Dette er også vist grafisk i Figur 2 som viser de estimerte risikoforhold (relative risiko for død) i forhold til kontrollfor (risiko tatt som 1 og markert med stiplet rød horisontal linje). Feilmarginer viser 95% pålitelighetsintervaller.

Begge indikerer at BG + ny behandling hadde redusert relativ risiko for mortalitet med ca. 20%. Posterior sannsynlighet for redusert risiko for mortalitet var ca. 90%. BG-behandling viste en tilsvarende sikkerhetsrisiko til kontrollfor med en sannsynlighet for en reduserende effekt på ca. 48%.

Frekvensfordelingen av CT-verdi for hjernevev analysert med qPCR er presentert i figurer 3 og 4, ved initiering og ved slutten av pulsen. I starten ble det observert en tilsvarende fordeling av CT-verdier mellom behandlingene (Figur 3), med en modus i området 34 til 36. Disse resultater bekrefter utbruddet av SRS. Etter 21 dager med forskjellige behandlinger ble det observert at 95% av fisken foret med BG+ny hadde CT-verdier >36, sammenlignet med 80% for kontroll (Figur 4). BG-foret fisk hadde lavere CT-verdier enn de to andre behandlinger. En høyere CT-verdi betyr lavere nivåer av bakterier i vevet. Derfor, etter 21 behandlinger oppnådde foret BG+ny høyere ytelse i å redusere P. salmonis sammenlignet med kontrollfor og BG-for.

Frekvensfordelingen av CT-verdien for nyrevev analysert ved qPCR er presentert i

Figur 5 og Figur 6, ved initiering og ved slutten av pulsen. I starten ble det observert en tilsvarende fordeling av CT-verdier på ca. 34 til 36 for alle behandlinger (Figur 5). Disse resultater bekreftet utbrudd av SRS. Etter 21 dager med de forskjellige

behandlinger ble det observert at 45% av fisken foret med BG+ny var negative for P. salmonis. Videre, 80% av fisken foret med BG hadde CT-verdier >36 sammenlignet med 65% for kontrollen (Figur 6). Derfor, etter 21 dagers behandling oppnådde BG+ny-for høyere ytelse i å redusere P. salmonis sammenlignet med BG-for og kontrollfor.

Følgende konklusjoner kan oppnås fra dette forsøk:

- Carvacrol og Thymol tilsatt i for (BG+ny) i en dosering av 30 ppm (15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol) viste seg å være mer effektiv i å redusere mortalitet av regnbueørret forårsaket av SRS-utbrudd enn BG-for og kontrollfor. - Carvacrol og Thymol tilsatt i for (BG+ny) i en dosering av 30 ppm (15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol) oppnådde høyere ytelse i å redusere P. salmonis sammenlignet med kontrollfor og BG-for. - En puls av Carvacrol og Thymol tilsatt i foret i en dosering av 30 ppm (15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol) i 21 dager, kan redusere mortaliteten av regnbueørret etter et utbrudd av SRS.

Definisjoner anvendt i søknaden

Propyl-metyl-fenyl er en fenolforbindelse substituert med propyl og metyl på den aromatiske ringstruktur.

Carvacrol er forbindelsen 5-isopropyl-2-metylfenol (C6H3CH3(OH)(C3H7)), og er en monoterpenoidfenol. Den har en karakteristisk skarp, varm lukt av oregano og en pizzalignende smak. Den er tilstede i den essensielle olje av Origanum vulgare, olje fra timian, og olje oppnådd fra karse og vill bergamott.

Tymol er forbindelsen 5-isopropyl-2-metylfenol, og er en monoterpenoidfenolderivat av cymol, isomerisk med carvacrol, funnet i timianolje, og ekstrahert som en hvit krystallinsk substans med en god aromatisk lukt og sterke antiseptiske egenskaper.

Claims

Propyl-metyl-fenolforbindelse, eller sammensetning inneholdende en propyl-metyl-fenolforbindelse for anvendelse i behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, og/eller ved anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av infektiøs lakseanemivirus.
2. Forbindelse i samsvar med krav 1, hvor nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol.
3. Forbindelse i samsvar med krav 1, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-metyl-fenol.
4. Forbindelse i samsvar med krav 1, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. Carvacrol.
5. Forbindelse i samsvar med krav 1, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. Thymol.
6. Sammensetning i samsvar med krav 1, hvor sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol.
7. Sammensetning i samsvar med krav 1 eller 6, hvor sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol, og hvor konsentrasjonen er ca. 3,7 mg/l, applisert til et vandig lokus, og ca. 15 mg/kg som en komponent av et for.
8. Sammensetning i samsvar med krav 1 eller 6, hvor sammensetningen omfatteren blanding av Carvacrol og Thymol, hvor konsentrasjonen er ca. 100 mg/l applisert til et vandig lokus, og ca. 120 mg/kg som en komponent av et for.
9. Sammensetning i samsvar med krav 1 eller 6, hvor sammensetningen er en forsammensetning omfattende ca. 30 ppm Carvacrol og Thymol, foreksempel 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol.
10. Sammensetning i samsvar med krav 6, hvor forholdet Carvacrol:Thymol er i området 1:3 til 3:1, mer foretrukket 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.
11. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1 -10, hvor nevnte fisk er en Salmonidae.
12. Forbindelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 1-11, hvor nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).
13. Anvendelse av en propyl-metyl-fenolforbindelse, eller sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenolforbindelse for fremstilling av en farmasøytisk og/eller nutrasøytisk sammensetning for behandling og/eller profylakse av infektiøs lakseanemi (ISA) og/eller sykdommer forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, og/eler for anvendelse i dreping, bekjemping eller regulering av infektiøs lakseanemivirus.
14. Anvendelse i samsvar med krav 13, hvor nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol.
15. Anvendelse i samsvar med krav 13, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-metyl-fenol.
16. Anvendelse i samsvar med krav 13, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. Carvacrol.
17. Anvendelse i samsvar med krav 13, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. Thymol.
18. Anvendelse i samsvar med krav 13, hvor sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol.
19. Anvendelse i samsvar med krav 13 eller 18, hvor sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol, og hvor konsentrasjonen er ca. 100 mg/l applisert til et vandig lokus, og ca. 120 mg/kg som en komponent av et for.
20. Anvendelse i samsvar med krav 19, hvor sammensetningen er en forsammensetning og hvor mengden av Carvacrol og Thymol er ca. 30 ppm eller mer av nevnte forsammensetning, for eksempel hvor mengden av Carvacrol er ca. 15 ppm og mengden av Thymol er ca. 15 ppm.
21. Anvendelse i samsvar med krav 18, hvor forholdet Carvacrol:Thymol er i området 1:3 til 3:1, fortrinnsvis 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.
22. Anvendelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 13-21, hvor nevnte fisk er en Salmonidae.
23. Anvendelse eller sammensetning i samsvar med et av kravene 13-22, hvor nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regn-bueørret ( Oncorhynchuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).
24. Fremgangsmåte for å drepe, bekjempe eller regulere infektiøs lakseanemivirus, hvor fremgangsmåten omfatter å applisere en propyl-metyl-fenolforbindelse eller en sammensetning omfattende en propyl-metyl-fenolforbindelse.
25. Fremgangsmåte i samsvar med krav 24, hvor nevnte propyl-metyl-fenolforbindelse appliseres til et lokus som skal beskyttes fra nevnte bakteria eller virus.
26. Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, hvor nevnte lokus er et vandig miljø og hvor nevnte propyl-metyl-fenolforbindelse appliseres direkte til det vandige lokus.
27. Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, hvor nevnte lokus inneholder fisk og hvor disse er mottakelige for infeksjoner forårsaket av infektiøs lakseanemivirus, hvor nevnte propyl-metyl-fenolforbindelse appliseres direkte til fisken, fortrinnsvis ved topikal eller oral applisering.
28. Fremgangsmåte i samsvar med krav 25, hvor nevnte propyl-metyl-fenol-forbindelse appliseres til fisken som en komponent av foret som mates til fisken.
29. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 24-28, hvor nevnte forbindelse er isopropyl-metyl-fenol, fortrinnsvis 2-isopropyl-metyl-fenol.
30. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 24-29, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-2-metyl-fenol, dvs. Carvacrol.
31. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 24-30, hvor nevnte forbindelse er 2-isopropyl-5-metyl-fenol, dvs. Thymol.
32. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 24, hvor sammensetningen omfatter en blanding av Carvacrol og Thymol.
33. Fremgangsmåte i samsvar med krav 32, hvor forholdet Carvacrol:Thymol er i området 1:3 til 3:1, mer fortrinnsvis 1:2 til 2:1, og mest foretrukket ca. 1:1, basert på vekt.
34. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 24-33, hvor nevnte fisk er en Salmonidae.
35. Fremgangsmåte i samsvar med krav 34, hvor nevnte fisk er valgt blant gruppen som består av atlantisk laks ( Salmo salar), regnbueørret ( Oncorhynchuss mykiss), Coho-laks ( Oncorhynchus kisutch) og arktisk røye ( Salvelinus alpinus).
36. Fiskefor omfattende konvensjonelle foringredienser så som proteiner, lipider, karbohydrater, vitaminer og mineraler,karakterisert vedat nevnte for også omfatter Carvacrol og Thymol.
37. Fiskefor i samsvar med krav 36, hvor nevnte forhold CarvacrokThymol er ca. 1:1.
38. Fiskefor i samsvar med krav 36, hvor Carvacrol og Thymol foreligger i fiskeforet i en mengde av ca. 15 ppm Carvacrol og 15 ppm Thymol.