NO20110170A1

NO20110170A1 - Probiotiske produkter for barn

Info

Publication number: NO20110170A1
Application number: NO20110170A
Authority: NO
Inventors: William Michael Russell; Michael Ceddia
Original assignee: Mjn Us Holdings Llc
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2011-02-01
Publication date: 2011-03-30
Also published as: RU2011115228A; CN102159086A; HK1160730A1; CA2737805A1; EP2323493A1; CZ2011139A3; BRPI0919173A2; EP2323493B8; HK1158025A1; PE20110933A1; EP2323493B1; EP2323493A4; CN102159086B; ES2398189T3; TW201016145A; RU2520085C2; MX2011002238A; US20100074870A1; PL2323493T3; WO2010033775A1

Abstract

Brystmelkerstatning for spedbarn eller næringsmiddelprodukt for barn som omfatter en proteinkilde, en fettkilde, en karbohydratkilde og B. longum AH1206.

Description

TEKNISK OMRÅDE

[0001]Den foreliggende oppfinnelse vedrører generelt probiotiske brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

[0002]Kort vedrører den foreliggende oppfinnelse, i en utførelsesform, en brystmelkerstatning for spedbarn eller et næringsmiddelprodukt for barn som omfatteren proteinkilde, en fettkilde, en karbohydratkilde og B. longum AH 1206.

[0003]I en annen utførelsesform vedrører den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å redusere inflammasjon i et spedbarn eller barn som omfatter å administrere B. longum AH1206 til spedbarnet eller barnet.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

[0004]For en mere fullstendig forståelse av den foreliggende oppfinnelse, skal det nå vises til den etterfølgende beskrivelse sett i sammenheng med de vedlagte tegninger.

[0005]Figur 1 er en BOX polymerkjedereaksjon (BOX PCR) (bioanalysator) strek-kodeprofil for B. longum AH1206. Basepar størrelser ble bestemt ved å anvende Agilent 2100 programvaren;

[0006]Figur 2 er en kurve som illustrerer fekal uvinning av B. longum AH 1206 over en 8 døgns tilførselsperiode og viser at AH 1206 kan overleve den murine gastrointestinalkanalen;

[0007]Figur 3 er et stolpediagram som viser effekten av B. longum AH1206 på interleukin (IL)-10 cytokinproduksjon ved humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMCer). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av måling (SEM) (n=6);

[0008]Figur 4 er et stolpediagram som viser effekten av B. longum AH1206 til-førsel på eosinofil rekruttering til lungene i sensibiliserte mus. Figur 4 A viser at de totale celler tilstede i bronkoalveolær lavage (BAL) ble redusert i AH1206-tilførte mus; figur 4 B viser at forskjellige celletall på BAL viste at reduksjonen i celletall var primært i den eosinofile populasjon. (Celletall uttrykt på y-aksen (x10<4>);

<*>p<0,05 versus placebo);

[0009]Figur 5 A og B er diagrammer som viser effekten av (A) probiotisk bakterie-stamme AH1206 og (B) placebo på totalt celletall i BAL etter ovalbumin (OVA) utfordring i sensibiliserte dyr (n=1 O/gruppe,<*>= p<0,05 sammenlignet med OVA utfordring alene);

[0010]Figur 6 A og B er diagrammer som viser effekten av (A) B. longum AH 1206 behandling og (B) placebo på luftveis-respondering på metacholin, som bestemt ved forandringer i økt pause (Penh) i OVA-sensibiliserte mus 24 timer etter intranasal utfordring med OVA eller saltvann. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet ± SEM (n=10/grupper<*>p = <0,05 sammenlignet med OVA alene);

[0011]Figur 7 er et diagram som viser tumornekrosefaktor (TNF) cytokinnivå i BAL fluid fra OVA-sensibiliserte mus. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM (n=10,<*>p<0,05 sammenlignet med OVA-utfordring, MRS (deMann, Rogosa og Sharpe) buljongbehandlet kontroll);

[0012]Figur 8 A og B er diagrammer som viser effekten av oral behandling med

probiotisk stamme AH1206 på (A) TNF og (B) interferon (IFN)-y cytokinproduksjon fra aktiverte splenocytter isolert fra OVA-sensibiliserte mus (CD3/CD28 stimulerte splenocytter). Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM (n=10,<*>p=<0,05 sammenlignet med OVA-utfordring, MRS buljongbehandlet kontroll);

[0013]Figur 9 er et diagram som viser at nivåene av OVA-spesifikk immunoglobulin E (IgE) i serum isolert fra mus foret med AH 1206 var signifikant lavere enn kontrollene som ikke var foret med AH1206 (<**>p = <0,01);

[0014]Figur 10 er et diagram som illustrerer effekten av oral behandling av probiotisk stamme AH1206 på TNF-a produksjon fra aktiverte splenocytter isolert fra OVA-sensibiliserte mus (CD3/CD28 stimulerte splenocytter). Gjennomsnittet illustrert for hver gruppe (<*>p= <0,05,<**>p = <0,01 sammenlignet med OVA- og koleratoksin (CT)-utfordring, MRS buljongbehandlet kontroll);

[0015]Figur 11 er et diagram som illustrerer at CD4<+>CD25<+>celler fra dyr foret med AH1206 hadde vesentlig redusert proliferasjon (n=10 for alle grupper unntatt kontrollen, hvori n=20);

[0016]Figur 12 A og B er diagrammer som viser prosentandelen celler i CD4<+>populasjonen som også er CD25<+>, som bestemt ved flow-cytometri (n=11 for ikke-foret gruppe, n =12 for placebogruppe, og n=10 for gruppe foret med AH1206);

[0017]Figur 13 illustrerer at prosentandelen av CD4/CD25<+>celler som uttrykker transkripsjonsfaktoren FoxP3 er signifikant oppregulert i bakterie-frie mus som spiser AH1206 (n = 8 eller 9 per gruppe) (<*>p<0,05 v. placebo); og

[0018]Figur 14 er et diagram som illustrerer stabiliteten av probiotisk stamme AH 1206 i løpet av 3 måneder.

SÆRLIG UTFØRELSE AV OPPFINNELSEN

[0019] Det skal nå detaljert henvises til utførelsesformene av oppfinnelsen, og det er gitt ett eller flere eksempler derpå i det etterfølgende. Hvert eksempel tilveie-bringes gjennom forklaring av oppfinnelsen, og skal ikke være en begrensning av oppfinnelsen. Det vil i realiteten forstås av en fagkyndig på området at forskjellige modifikasjoner og variasjoner kan gjennomføres i den foreliggende oppfinnelse uten at man avviker fra oppfinnelsesrammen. Trekk som illustrert eller beskrevet som deler av en utførelsesform kan for eksempel anvendes i en annen utførelses-form til å gi en ytterligere utførelsesform.

[0020]Således skal den foreliggende oppfinnelse dekke slike modifikasjoner og variasjoner som er innenfor rammen for de vedlagte kravene og deres ekviva-lenter. Andre objekter, trekk og aspekter av den foreliggende oppfinnelse er omtalt i eller fremgår klart fra den etterfølgende detaljerte beskrivelse. En fagkyndig på området skal forstå at den foreliggende omtale er en beskrivelse av kun typiske utførelsesformer, og skal ikke være begrensende for de bredere aspekter av den foreliggende oppfinnelse.

[0021]Som angitt ovenfor vedrører den foreliggende oppfinnelse generelt prebiotiske brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn. Referanser relatert til probiotiske brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn kan inkludere U.S. patent nr. 7 179 460 av Dennen, et al. og 5 922 375 av Luchansky, et al.

[0022]Det tekniske problem som skal løses ved den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe brystmelkerstatninger for spedbarn og næringsmiddelprodukter for barn som inneholder nye probiotika. Således, i en utførelsesform, vedrører den foreliggende oppfinnelse en brystmelkerstatning for spedbarn eller næringsmiddelprodukt for barn som inneholder Bifidobacterium longum stamme AH1206. En deponering av B. longum stamme AH 1206 ble gjort ved the National Collections of Industrial, Marine, and Food Bacteria (NCIMB), Scotland, UK, 11. mai 2006 og ble registrert med deponeringsnummer NCIMB 41382. NCIMB er en internasjonal deponeringsinstitusjon som er godkjent under Budapest konvensjonen. Stammen er syretolerant og galletolerant og passerer gastrointestinal kanalen. I en særlig ut-førelsesform av oppfinnelsen, isoleres B. longum AH1206 fra spedbarn feces.

[0023]I en annen utførelsesform inneholder brystmelkerstatningen for spedbarn eller næringsmiddelproduktet for barn B. longum stamme AH 1206 eller en mutant eller variant derav. Mutanten kan være en genetisk modifisert mutant. Varianten kan være en naturlig forekommende variant av Bifidobacterium. I enkelte utførel-sesformer kan stammen være et probiotika. I andre utførelsesformer kan stammen være i form av en biologisk ren kultur. I ytterligere utførelsesformer er stammen en isolert stamme.

[0024]Som anvendt heri inkluderer betegnelsene "mutant", "variant" og "genetisk modifisert mutant" en stamme av bifidobakterier hvis genetiske og/eller fenotyp-iske egenskaper er endret sammenlignet med moderstammen. Naturlig forekommende varianter av Bifidobacterium longum inkluderer de spontane endringene av målrettede egenskaper som er selektivt isolert. Tilsiktet endring av egenskapene for moderstammen gjennomføres ved konvensjonelle (in vitro) genetiske mani-pulasjonsteknikker, slik som genspalting og konjugativ overføring.

[0025]Genetisk modifikasjon inkluderer introduksjon av eksogene og/eller endo-gene DNA sekvenser inn i genomet til en bifidobakteriestamme, for eksempel ved insersjon inn i genomet til bakteriestammen ved hjelp av vektorer, som inkluderer plasmid DNA, eller bakteriofager. Naturlige og induserte mutasjoner inkluderer minst enkeltbaseendringer slik som delesjon, insersjon, transversjon eller andre DNA modifikasjoner som kan resultere i endring av aminosyresekvensen kodet for DNA sekvensen.

[0026]Betegnelsen "mutant", "variant" og "genetisk modifisert mutant" inkluderer også en stamme av bifidobakterier som har gjennomgått genetiske forandringer som akkumulerer i et genom i en takt som er konsistent i naturen for alle mikroorganismer og/eller genetiske endringer som forekommer gjennom spontan mutasjon og/eller tilvekst av gener og/eller tap av gener som ikke er oppnådd ved tilsiktet (in vitro) manipulasjon av genomet men er oppnådd gjennom den naturlige seleksjon av varianter og/eller mutanter som tilveiebringer en selektiv fordel for å understøtte overlevelsen av bakterien når eksponert for trykk utenfra slik som antibiotika. En mutant kan dannes ved den tilsiktede (in vitro) insersjon av spesifikke gener i genomet som ikke fundamentalt endrer den biokjemiske funksjonali-teten til organismen, men hvis produkter kan anvendes for identifikasjon eller seleksjon av bakterien, for eksempel antibiotisk resistens.

[0027]En fagkyndig på området vil forstå at mutant- eller variant-stammer av bifidobakterier kan identifiseres ved DNA sekvens homologianalyser med moderstammen. Stammer av bifidobakterier som har en nær sekvensidentitet med moderstammen betraktes til å være mutant- eller variant-stammer. En bifidobakteriestamme med en sekvensidentitet (homologi) på 96% eller mere, slik som 97% eller mere, eller 98% eller mere, eller 99% eller mere med moder DNA sekvensen kan betraktes til å være en mutant eller variant. Sekvenshomologi kan bestemmes ved å anvende on-line homologialgoritme "BLAST" programmet, som er offentlig tilgjengelig på http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/.

[0028]Mutanter av moderstammen inkluderer også avledede bifidobakterie-stammer som har minst 85% sekvenshomologi, slik som minst 90% sekvenshomologi, eller minst 95% sekvenshomologi med 16s-23s intergenisk spacer polynukleotidsekvensen av moderstammen. Disse mutantene kan videre omfatte DNA mutasjoner i andre DNA sekvenser i bakteriegenomet.

[0029]I en utførelsesform av oppfinnelsen er bifidobakteriestammen i form av

levedyktige celler. Alternativt kan bifidobakteriestammen være i form av inaktiverte celler. Betegnelsen "inaktivert" betyr at den metabolske aktiviteten eller reproduk-sjonsevnen til stammen er blitt redusert eller ødelagt. Inaktivering kan forekomme ved en hvilken som helst metode som nå er kjent innenfor området eller som ennå ikke er utviklet. Inaktiveringen kan f.eks. gjennomføres via varmebehandling, frysetørking, ultrafiolett lys, gammastråling, trykk, kjemisk nedbrytning, mekanisk nedbrytning eller endring av pH. Probiotikumet kan for eksempel inaktiveres ved varmebehandling via lagring i området 80°C til 100°C i 10 minutter. Probiotikumet kan også inaktiveres med ultrafiolett lys via stråling i 5 minutter i en avstand av 5 cm fra en 30 watt UVC lampe. Alternativt kan probiotikumet inaktiveres med gammastråling via stråling med 2 kg-Gray (kGy) ved anvendelse av en Cobalt-60 kilde i en avstand av 20 cm. Som anvendt heri, er betegnelsen "inaktivert" synonym med "ikke-levedyktig".

[0030]I en utførelsesform kan B. longum stamme AH1206 være supplert i en formulering for barn eller spedbarn. Betegnelsen "spedbarn" betyr et postnatalt menneske som er mindre enn omtrent 1 år gammel. Betegnelsen "barn" betyr et menneske i alderen som strekker seg omtrent 1 til 12 år gammel. I visse utførel-sesformer, er et barn i aldersområdet fra omtrent 1 til 6 år gammel. I andre ut-førelsesformer er et barn i aldersområdet fra omtrent 7 til 12 års gammel.

[0031]Mengden av B. longum AH 1206 som er supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen kan tilsvare området fra omtrent 1x10<4>til omtrent 1x10<12>koloni-dannende enheter (cfu) per gram formulering. I en annen utførelsesform, kan mengden som er supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen tilsvare området fra omtrent 1x10<6>til omtrent 1x10<9>cfu per gram formulering. I en annen utførelses-form kan mengden som supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen tilsvare området fra omtrent 1x10<9>og til omtrent 1x10<12>cfu per gram formulering. I en annen utførelsesform kan mengden som er supplert i formuleringen ifølge oppfinnelsen tilsvare minst omtrent 1x10<6>cfu per gram formulering.

[0032]Administreringsformen for B. longum AH 1206 i den foreliggende oppfinnelse er ikke kritisk, så lenge en effektiv mengde administreres til et barn eller spedbarn. I noen utførelsesformer administreres B. longum AH1206 til et barn eller spedbarn via tabletter, piller, innkapslinger, dragéer, gel-hetter, kapsler, olje-dråper, posjonsposer, væsker, væskekonsentrater, pulvere, eliksirer, oppløs-ninger, suspensjoner, emulsjoner, pastiller, kuler og kombinasjoner derav. I en annen utførelsesform er B. longum AH1206 innkapslet i et sukker, fett eller poly-sakkarid. I en ytterligere utførelsesform er B. longum AH1206 tilsatt til et matvare-produkt eller drikkeprodukt og konsumert. Matvareproduktet eller drikkeproduktet kan være et kosttilskudd eller et næringsmiddelprodukt for barn slik som en opp-følgings-brystmelkerstatning, melk for oppvekst, drikkevarer, melk, yogurt, frukt-juice, fruktbasert drikk, tyggbar tablett, småkaker, kjeks eller et melkepulver.

[0033]I andre utførelsesformer kan produktet være et næringsmiddelprodukt for spedbarn, slik som en brystmelkerstatning eller et tilskudd for å berike human melk. Som anvendt heri, betyr betegnelsen "brystmelkerstatning" en sammensetning som tilfredsstiller næringsmiddelkrav for et spedbarn ved at den kan være en substitutt for human melk. Betegnelsen "et tilskudd for å berike human melk" betyr en sammensetning som kan tilsettes til human melk for å øke nærings- verdien til den humane melk. I enkelte utførelsesformer er sammensetningen et surgjort produkt (som påkrevd ved bestemte medisinske næringsmiddelregule-ringer).

[0034]Næringsmiddelproduktet kan være et produkt for et normalfødt spedbarn, et for tidlig født spedbarn, et spedbarn med lav fødselsvekt, eller et spedbarn med svært lav fødselsvekt. Som anvendt heri kan betegnelsen "for tidlig født" eller "for tidlig født spedbarn" inkludere spedbarn med lav fødselsvekt eller svært lav fødselsvekt. Spedbarn med lav fødselsvekt er dem som er født fra omtrent 32 til 37 uker ut i svangerskapet eller som veier fra omtrent 1,5 kg til omtrent 2,5 kg ved fødselen. Spedbarn ved svært lav fødselsvekt er dem som er født før 32 uke i svangerskapet eller som veier mindre enn omtrent 1,5 kg ved fødselen. Således kan for tidlig fødte spedbarn inkludere spedbarn som er født før omtrent 37 ukers svangerskap og/eller dem som veier mindre enn omtrent 2,5 kg ved fødselen.

[0035]I bestemte utførelsesformer kan formuleringene administreres enteralt eller parenteralt. Som anvendt heri betyr "enteral" gjennom eller i gastrointestinalkanalen eller fordøyelseskanalen, og "enteral administrering" inkluderer oral til-førsel, intragastrisk tilførsel, transpylorisk administrering eller en hvilken som helst annen introduksjon inn i fordøyelseskanalen. Betegnelsen "parenteral" betyr inntatt i kroppen eller administrert på en måte som er annet enn gjennom fordøyelses-kanalen, slik som intravenøs eller intramuskulær injeksjon.

[0036]Formuleringene ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe minimalt, delvis eller totalt næringstilskudd. Sammensetningene kan være nærings-supplementer eller måltidserstatninger. I enkelte utførelsesformer kan sammensetningene administreres sammen med en matvare eller næringsmiddelsammensetning. I denne utførelsesformen, kan sammensetningene enten være iblandet matvaren eller næringsmiddelsammensetningen før inntak ved individet eller kan administreres til individet enten før eller etter inntak av en matvare eller næringsmiddelsammensetning. Sammensetningen kan administreres til for tidlig fødte spedbarn som mottar brystmelkerstatning for spedbarn, brystmelk, tilskudd for å berike human melk eller kombinasjoner derav. Sammensetningene kan, men behøver ikke, være næringsmessig sett fullstendige. Med betegnelsen "næringsmessig sett fullstendig" menes at sammensetningen inneholder adekvate næringsmidler for å opprettholde sunn helse i forlengede perioder.

[0037]I enkelte utførelsesformer kan oppfinnelsen omfatte et prenatalt kosttilskudd som skal konsumeres av en gravid kvinne, for derved å tilveiebringe B. longum AH1206 til fosteret i livmoren. I andre utførelsesformer kan oppfinnelsen omfatte et postnatalt kosttilskudd som skal forbrukes av en ammende mor for derved å tilveiebringe B. longum AH1206 til det postnatale spedbarn via morens melk.

[0038]Dersom B. longum AH 1206 administreres via en spedbarns-brystmelkerstatning eller næringsmiddelprodukt for barn, kan formuleringen være nærings-middelmessig fullstendig eller inneholde passende typer av mengder av lipid, karbohydrat, protein, vitaminer og mineraler. Mengden av lipid eller fett kan typisk variere fra omtrent 3 til omtrent 7 g/100 kcal. Lipidkilder kan være en hvilken som helst kilde som er kjent eller anvendt innen teknikken, for eksempel melkefett, eggeplomme, lipid, fiskeolje, vegetabilske oljer slik som palmeolje, soyabønneolje, palmolein, palmekjerneolje, kokosnøttolje, triglyceridolje med medium kjede-lengde, solsikkeolje med høyt oleinsyreinnhold, olivenolje, saflorolje med høyt oleinsyreinnhold og estere av fettsyrer.

[0039]Mengden av protein kan typisk variere fra omtrent 1 til omtrent 5 g/100 kcal. Proteinkilder kan være en hvilken som helst som kjent eller anvendt innen teknikken, for eksempel melkeprotein, ikke-fettholdige melkefaststoffer, ikke-fettholdig melk, valle protein, kasein, soyaprotein, animalsk protein, kornprotein, vegetabilsk protein eller kombinasjoner derav. Formuleringen kan inneholde proteiner og/eller peptider som er rike på glutamin/glutamat. Proteinkilden kan være intakt, delvis hydrolysert eller omfattende hydrolysert. Proteinkilden kan i noen utførelsesformer være en kombinasjon av intakt protein og hydrolysert protein. Proteinkilden kan være et isolat eller et konsentrat.

[0040]I bestemte utførelsesformer kan sammensetningen ifølge oppfinnelsen inneholde en nitrogenkilde (dvs. aminosyrer og/eller protein) slik at den totale mengden av aminosyrer eller protein kan være fra omtrent 1 g/100 kilokalorier (kcal) til omtrent 10 g/100 kcal av den totale sammensetning. I enkelte utførel-sesformer omtrent 2 g/100 kcal til omtrent 6 g/100 kcal. Mengden av lipidkilde per 100 kcal av den totale sammensetning kan være større enn 0 g opp til omtrent 6 g, i noen utførelsesformer fra omtrent 0,5 g til omtrent 5,5, g, og i andre utførelses-former fra omtrent 2 g til omtrent 5,5 g, og mengden av ikke-fiber karbohydratkilde per 100 kcal av den totale sammensetning kan være omtrent 5 g til omtrent 20 g, og i enkelte utførelsesformer fra omtrent 7,5 g til omtrent 15 g. Mengden av vitaminer og mineraler i den næringsmessige fullstendige sammensetning kan være tilstrekkelig til å oppfylle 100% av U.S. rekommandert daglig inntak (RDI) på omtrent 500 til omtrent 3000 kcal, i enkelte utførelsesformer fra omtrent 1000 til omtrent 3000 kcal. I en spesiell utførelsesform kan sammensetningen være proteinfri. I en slik utførelsesform kan sammensetningen inneholde en protein-ekvivalent kilde som omfatter 100% frie aminosyrer.

[0041]Mengden av karbohydrat kan typisk variere fra omtrent 8 til omtrent 12 g/100 kcal. Karbohydratkilder kan være en hvilken som helst som er kjent eller anvendt innen teknikken, for eksempel laktose, fruktose, glukose, maissirup, maissirup-faststoffer, maltodekstriner, sukrose, stivelse, rissirup-fastoffer, risstivelse, modifisert maisstivelse, modifisert tapiokastivelse, rismel, soyamel og kombinasjoner derav. Formuleringen kan inkludere hvilken som helst eller flere av et tilsetningsstoff, en bakteriekomponent, en legemiddelentitet eller en biologisk forbindelse.

[0042]Passende kan kommersielt tilgjengelige brystmelkserstatninger for spedbarn og andre formuleringer anvendes i praksis ifølge oppfinnelsen. Enfamil, Enfamil Premature Formula, Enfamil med jern, Laktofri, Nutramigen, Pregestimil og ProSobee (tilgjengelig fra Mead Johnson & Company, Evansville, IN. U.S.A.) kan for eksempel suppleres med passende nivåer av B. longum AH 1206 og i praksis anvendes ifølge oppfinnelsen.

[0043]Formuleringen ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inkludere ett eller flere av de etterfølgende vitaminer eller derivater derav som inkluderer, men som ikke er begrenset til, biotin, vitamin Bi, tiamin, tiaminpyrofosfat, vitamin B2, riboflavin, flavin-mononukleotid, flavin-adenin-dinukleotid, pyridoksinhydroklorid, tiamin-mononitrat, folinsyre, vitamin B3, niacin, nikotinsyre, nikotinamid, niacinamid, nikotinamidadenindinukleotid, tryptofan, biotin, pantotensyre, vitamin B6, vitamin B12, kobalamin, metylkobalamin, deoksyadenosylkobalamin, cyanokobalamin, kalsiumpantotenat, vitamin C, askorbinsyre, vitamin A, retinol, retinal, retinoinsyre, beta-karoten, vitamin D, vitamin D3, kalciferol, cholekalciferol, dihydroksy vitamin D, 1,25 dihydroksycholekalciferol, 7-dehydrokolesterol, cholin, vitamin E, vitamin E acetat, vitamin K, menadion, menakinon, fyllokinon, naftokinon og blandinger derav.

[0044]Formuleringen ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inkludere ett eller flere av de etterfølgende mineraler eller derivater derav som inkluderer, men som ikke er begrenset til, fosfor, kalium, svovel, natrium, docusatnatrium, klorid, mangan, magnesium, magnesiumstearat, magnesiumkarbonat, magnesiumoksid, magnesiumhydroksid, magnesiumsulfat, kopper, kuprisulfat, jodid, bor, sink, sinkoksid, krom, molybden, jern, karbonyl-jern, ferri-jern, ferrofumerat, poly-sakkarid-jern, fluorid, selen, molybden, kalsiumfosfat eller acetat, kaliumfosfat, magnesiumsulfat eller-oksid, natriumklorid, kaliumklorid eller-acetat, ferriorto-fosfat, alfa-tokoferylacetat, sinksulfat eller-oksid, kopperglukonat, kromklorid eller -pikolonat, kaliumjodid, natriumselenat, natriummolybdat, fyllokinon, cyanokobalamin, natriumselenitt, koppersulfat, inositol, kaliumjodid, kobolt og blandinger derav. Ikke-begrensende eksempler på derivater av mineralforbindelser inkluderer salter, alkalisalter, estere og chelater av en hvilken som helst mineralforbindelse.

[0045]Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan også inneholde emulgerings-midler og stabilisatorer slik som soyalecitin, karragenan og kombinasjoner derav. Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan eventuelt inneholde andre substanser som kan ha en fordelaktig effekt slik som laktoferrin, nukleotider, nukleosider, immunoglobuliner og kombinasjoner derav.

[0046]I en utførelsesform av oppfinnelsen kan B. longum AH 1206 administreres i kombinasjon med ett eller flere probiotika. Betegnelsen "probiotika" betyr en mikro-organisme som utviser fordelaktige effekter på vertens helse. Et hvilket som helst probiotika som er kjent innen teknikken kan aksepteres i denne utførelsesform med den betingelse at det gir det tilsiktede resultat. I en spesiell utførelsesform kan probiotikaet velges fra Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Bifidobacterium longum arter og Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12.1 en utførelsesform kan den eller de ytterligere probiotika være levedyktige eller ikke-levedyktige.

[0047]I en annen utførelsesform av oppfinnelsen kan B. longum AH1206 kombineres med ett eller flere prebiotika. Betegnelsen "prebiotika" betyr en ikke-fordøybar næringsbestanddel som stimulerer vekst og/eller aktivitet av probiotika. Et hvilket som helst prebiotika som er kjent innen teknikken vil være aksepterbart i denne utførelsesform med den betingelse at det gir det ønskede resultatet. Prebiotika som er anvendbare i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse kan inkludere oligosakkarider, polysakkarider og andre prebiotika som inneholder fruktose, xylose, soya, galaktose, glukose og mannose. Mere spesifikt kan prebiotika som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse inkludere laktulose, glukoligosakkarid, inulin, polydekstrose, galakto-oligosakkarid, frukto-oligosakkarid, isomalto-oligosakkarid, soyabønne-oligosakkarider, laktosukrose, xylo-oligosakkarid og gentio-oligosakkarider.

[0048]I en ytterligere utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse kan formuleringen inneholde andre aktive midler slik som langkjede poly-umettede fettsyrer (LCPUFA'er). Passende LCPUFA'er inkluderer, men er ikke begrenset til, a-linoleinsyre, y-linoleinsyre, linoleinsyre, linolensyre, eicosapentensyre (EPA), arakidonsyre (ARA) og/eller docosaheksaensyre (DHA). I en utførelsesform administreres B. longum AH1206 i kombinasjon med DHA. I en annen utførelses-form administreres B. longum AH1206 i kombinasjon med ARA. I en ytterligere utførelsesform administreres B. longum AH1206 i kombinasjon med både DHA og ARA. Kommersielt tilgjengelig brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder DHA, ARA eller en kombinasjon derav kan være supplert med B. longum AH1206 og anvendes i den foreliggende oppfinnelse. For eksempel Enfamil LI PIL, som inneholder effektive nivåer av DHA og ARA, er kommersielt tilgjengelige og kan være supplert med B. longum AH 1206 og anvendes i den foreliggende oppfinnelse.

[0049]I en utførelsesform administreres både DHA og ARA i kombinasjon med B. longum AH1206.1 denne utførelsesform kan vektforholdet ARA:DHA være fra omtrent 1:3 til omtrent 9:1.1 en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er dette forholdet fra omtrent 1:2 til omtrent 4:1.1 en ytterligere utførelsesform, er forholdet fra omtrent 2:3 til omtrent 2:1.1 en spesiell utførelsesform er forholdet omtrent 2:1.1 en annen spesiell utførelsesform av oppfinnelsen er forholdet omtrent 1:1,5.1 andre utførelsesformer, er forholdet omtrent 1:1,3.1 ytterligere utførelses-former, er forholdet omtrent 1:1,9.1 en særlig utførelsesform er forholdet omtrent 1,5:1.1 en ytterligere utførelsesform er forholdet omtrent 1,47:1.

[0050]I bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen, er nivået av DHA i området fra omtrent 0,0% til 1,00% av fettsyrer, uttrykt i vekt. Nivået av DHA er omtrent 0,32 vekt%. I noen utførelsesformer kan nivået av DHA være omtrent 0,33 vekt%. I en annen utførelsesform kan nivået av DHA være omtrent 0,64 vekt%. I en annen utførelsesform kan nivået av DHA være omtrent 0,67 vekt%. I en ytterligere ut- førelsesform kan nivået av DHA være omtrent 0,96 vekt%. I en ytterligere ut-førelsesform kan nivået av DHA være omtrent 1,00 vekt%.

[0051]I utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er nivået av ARA i området fra 0,0% til 0,67% av fettsyrer, uttrykt i vekt. I en annen utførelsesform kan nivået av ARA være omtrent 0,67 vekt%. I en annen utførelsesform kan nivået av ARA være omtrent 0,5 vekt%. I en ytterligere utførelsesform kan nivået av DHA være i området fra omtrent 0,47 vekt% til 0,48 vekt%.

[0052]Dersom inkludert, er den effektive mengde DHA i en utførelsesform av oppfinnelsen typisk fra omtrent 3 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 150 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en utførelsesform av oppfinnelsen, er mengden fra omtrent 6 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 100 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en annen utførelsesform, er mengden fra omtrent 10 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 60 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en ytterligere utførelsesform er mengden fra omtrent 15 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 30 mg per kg kroppsvekt per døgn.

[0053]Dersom inkludert, er den effektive mengden av ARA i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse typisk fra omtrent 5 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 150 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en utførelsesform av oppfinnelsen, varier mengden fra omtrent 10 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 120 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en ytterligere utførelsesform, varier mengden fra omtrent 15 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 90 mg per kg kroppsvekt per døgn. I en ytterligere utførelsesform, varierer mengden fra omtrent 20 mg per kg kroppsvekt per døgn til omtrent 60 mg per kg kroppsvekt per døgn.

[0054]Dersom en brystmelkerstatning for spedbarn benyttes, kan mengden av DHA i brystmelkerstatningen for spedbarn variere fra omtrent 5 mg/100 kcal til omtrent 80 mg/100 kcal. I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, varierer DHA fra omtrent 10 mg/100 kcal til omtrent 50 mg/100 kcal; og i en annen utførelsesform fra omtrent 15 mg/100 kcal til omtrent 20 mg/100kcal. I en særlig utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, er mengden DHA omtrent 17 mg/100 kcal.

[0055]Dersom en brystmelkerstatning for spedbarn benyttes, kan mengden av ARA i brystmelkerstatningen for spedbarn variere fra omtrent 10 mg/100 kcal til omtrent 100 mg/100 kcal. I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, varierer mengden av ARA fra omtrent 15 mg/100 kcal til omtrent 70 mg/100 kcal. I en annen utførelsesform, varierer mengden av ARA fra omtrent 20 mg/100 kcal til omtrent 40 mg/100 kcal. I en særlig utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, er mengden ARA omtrent 34 mg/100 kcal.

[0056]Dersom en brystmelkerstatning for spedbarn anvendes, kan brystmelkerstatningen for spedbarn være supplert med oljer som inneholder DHA og ARA ved å anvende standard teknikker som er kjent innen teknikkens stand. DHA og ARA kan for eksempel tilsettes til brystmelkerstatningen ved å erstatte en ekvivalent mengde av en olje, slik som solsikkeolje med høyt oleinsyreinnhold, som normalt er tilstede i brystmelkerstatningen. Som et annet eksempel, kan oljene som inneholder DHA og ARA tilsettes til brystmelkerstatningen ved å erstatte en ekvivalent mengde av resten av den totale fettblandingen som normal er tilstede i brystmelkerstatningen uten DHA og ARA.

[0057]Ved anvendelse, kan kilden for DHA og ARA være en hvilken som helst kilde som er kjent innen teknikken slik som marin olje, fiskeolje, encelle-olje, egge-plommelipid og jernlipid. I enkelte utførelsesformer er kilden for DHA og ARA encelle Martek olje, DHASCO eller variasjoner derav. DHA og ARA kan være i naturlig form, med den betingelse at resten av det LCPUFA kilden ikke resulterer i noen vesentlig ødeleggende effekt på spedbarnet. Alternativt kan DHA og ARA anvendes i raffinert form.

[0058]i en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er DHA og ARA kilder encelle-oljer som omtalt i U.S. patenter nr. 5 374 567; 5 550 156 og 5 397591, som er innlemmet i sin helhet heri som referanse. Den foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til bare slike oljer.

[0059]I en utførelsesform anvendes en LCPUFA kilde som inneholder EPA i kombinasjon med B. longum AH 1206. I en annen utførelsesform, anvendes en LCPUFA kilde som er i alt vesentlig fri for EPA i kombinasjon med B. longum AH 1206.1 en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, blir for eksempel en brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder mindre enn omtrent 16 mg EPA/100 kcal supplert med B. longum AH1206 og anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelsesform, blir en brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder mindre enn omtrent 10 mg EPA/100 kcal supplert med B. longum AH1206 og anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I en ytterligere utførelsesform, blir en brystmelkerstatning for spedbarn som inneholder mindre enn omtrent 5 mg EPA/100 kcal supplert med B. longum AH1206 og anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En annen utførelsesform av oppfinnelsen inkluderer en brystmelkerstatning for spedbarn supplert med B. longum AH 1206 som er fri for selv spormengder av EPA.

[0060]Det vil forstås at kombinasjonen av B. longum AH 1206 og probiotika, prebiotika, LCPUFA'er eller andre aktive bestanddeler kan administreres i en enkelt formulering eller som separate formuleringer som administreres samtidig eller på forskjellige tidspunkter og med anvendelse av den samme eller forskjellige administreringsruter.

[0061]I en utførelsesform av oppfinnelsen kan formuleringen anvendes ved immu-niseringsprotokoller og vaksinasjonsprotokoller. Oral immunisering ved å anvende probiotiske bakterier som vektorer vil ikke bare beskytte verten mot infeksjon, men også erstatte de immunologiske stimuli som patogenet normalt ville utløse, noe

som således bidrar til vertens immunologiske utvikling.

[0062]I en utførelsesform av oppfinnelsen er formuleringen anvendbar for å behandle, redusere og/eller forebygge inflammasjon. Som anvendt heri betyr betegnelsen "behandle" å bli bedre av en sykdom, komme seg etter sykdom eller helbrede en sykdom, lidelse eller et symptom på en sykdom eller tilstand. Betegnelsen "redusere" betyr å svekke i omfang, mengde eller grad. Betegnelsen "forebygge" betyr å stanse eller hindre en sykdom, lidelse eller et symptom på en sykdom eller tilstand gjennom en eventuell handling.

[0063]I en spesiell utførelsesform omfatter oppfinnelsen anvendelsen av B. longum AH 1206 for fremstilling av en sammensetning for å redusere eller forebygge inflammasjon i et spedbarn eller et barn. Eksempler 2-6 indikerer hver at administrering av B. longum AH1206 kan redusere eller forebygge inflammasjon i et spedbarn eller et barn. Inflammasjonen kan reduseres eller forebygges i mage-tarm-kanalen, luftveiene, eller kan reduseres systemisk. Reduksjon eller forebygging av inflammasjon kan forbedre allergier eller astma.

[0064]I denne utførelsesformen kan inflammasjonen være respiratorisk inflammasjon slik som astma, allergisk rhinitt, sinusitt, luftveisinflammasjon, infeksjon i øvre deler av luftveiene, influensa, krupp, respiratorisk syncytialvirus, bronkitt, bronkiolitt, pneumoni eller luftveis-lumen inflammasjon. Likeledes kan inflamma sjonen være gastrointestinal inflammasjon, slik som diaré, inflammatorisk tarm-sykdom, Crohns sykdom, enterokolitt, ulcerøs kolitt, allergisk kolitt, irritabel tarm, pouchitt, post-infeksjon kolitt, Clostridium difficile- as$ os\ er\. diaré, Rotavirus-assosiert diaré, eller post-infektiv diaré, eller diarésykdom som skyldes et infek-sjonsmiddel, slik som E. coli. I andre utførelsesformer kan inflammasjonen være systemisk, slik som revmatoid artritt. Betegnelsen "systemisk" som anvendt heri, betyr som vedrører eller som rammer hele kroppen.

[0065]I enkelte utførelsesformer kan reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedre eller forhindre atopiske tilstander eller sykdommer. Reduksjon eller forebygging av inflammasjon kan for eksempel forbedre eller forhindre atopisk dermatitt. I en spesiell utførelsesform kan reduksjon eller forebygging av inflammasjon forbedre eller forebygge vanlig sykdommer hos spedbarn eller barnesykdommer. Reduksjon eller forebygging av inflammasjon kan for eksempel forbedre eller forhindre diaré eller akutt otitis media. I en annen utførelsesform kan reduksjon eller forebygging av inflammasjon forbedre eller forhindre matallergier.

[0066]Man mener at B. longum AH1206 virker ved å antagonisere og ekskludere pro-inflammatoriske mikroorganismer fra mage/tarmkanalen eller fra inflamma-sjonsstedet. Man mener også at B. longum AH 1206 virker ved å redusere nivåene av pro-inflammatoriske cytokiner.

[0067]I en særlig utførelsesform kan stammen modifisere nivåene av IL-10 i et individ. IL-10 produseres ved T-celler, B-celler, monocytter og makrofager. Dette cytokinet øker proliferasjon og differensiering av B-celler til antistoff-utskillende celler. IL-10 utviser for det meste anti-inflammatoriske aktiviteter. Det oppregulerer IL-1RA ekspresjon ved monocytter og undertrykker majoriteten av monocytt-inflammatorisk aktivitet. IL-10 inhiberer monocyttproduksjon av cytokiner, reaktive oksygen- og nitrogen-mellomprodukter, "major histocompatibility complex" (MHC) klasse II ekspresjon, parasitt dreping og IL-10 produksjon via en feed-back mekanisme. Dette cytokinet har også blitt vist til å blokkere monocyttproduksjon av intestinal kollagenase og type IV kollagenase ved å interferere med et prostaglan-din E2-cyklisk adenosin monofosfat (PGE2-CAMP) avhengig spor og kan derfor være en viktig regulator av bindevevsdestruksjonen som man ser ved kroniske inflammatoriske sykdommer. Således, i en utførelsesform, kan stammen oppregu- lere eller indusere sekresjon av IL-10 nivåer i spedbarn eller barn som konsumerer stammen.

[0068]I andre utførelsesformer, vil B. longum AH 1206 nedregulere eller nedsette sekresjon av TNF-a, IL-2, IL-4, IL-5 og/eller IFN-y eller andre pro-inflammatoriske cytokiner eller kjemokiner. TNF-a, et pro-inflammatorisk cytokin, initierer en kaskade av cytokiner og biologiske effekter resulterende i en inflammatorisk tilstand. I noen utførelsesformer, kan prosentandelen av T regulerende celler økes ved B. longum AH1206 administrering. I andre utførelsesformer inhiberer administreringen av B. longum AH1206 induksjonen av en OVA-spesifikk IgE respons.

[0069]I noen utførelsesformer er formuleringen ifølge oppfinnelsen anvendbar for å opprettholde homeostasen i immunsystemet. I andre utførelsesformer er formuleringen ifølge oppfinnelsen anvendbar for å forbedre eller øke immuniteten i et individ.

[0070]I noen utførelsesformer kan den økte immunitet eller suppresjon av inflammasjon inkludere stimulering av intestinal integritet; reduksjon av intestinal permeabilitet, forbedring av mucin syntese, sekresjon og/eller kvalitet; forbedring av maturasjon og differensiering av intestinalt epitel; forbedring av næringsabsorp-sjon; økning i produksjon av oppløselige faktorer som overfører antimikrobiell aktivitet; stimulering av, forbedring av eller understøttelse av resistens mot infeksjon; understøttelse av cellulære eller humorale responser mot virusinfeksjon eller bakterieinfeksjon; økt cytotoksisitet (både anti-viral og anti-tumor); understøttelse av systemiske og/eller mukosale vaksinasjonsresponser; økning eller understøt-telse av cellulær og/eller humoral immunitet; økning eller understøttelse av naturlig immunitet (inkluderende neutrofiler, fagocytter, makrofager og naturlig drepercelle aktivitet); økning eller understøttelse av adaptiv T og B celle immunitet; stimulering av et hjelper T celle 1 (Th1) cytokin spor (økt IL-1, IL-2, IFN-y, IL-12, TNF-a; human leukocytt antigen-Dr (HLA-Dr) ekspresjon); suppresjon av inflammasjon eller produksjon av systemiske og mukosale inflammatoriske mediatorer (som inkluderer cytokiner og/eller kjemokiner); reduksjon av følsomhet ved å redusere total og/eller allergen-spesifikk IgE; reduksjon av produksjon av allergiske cytokiner; reduksjon av en Th2 understøttende immunoglobulin profil; og kombinasjoner derav.

[0071] Produksjonen av multifunksjonelle cytokiner over et vidt spekter av tumor-typer foreslått at signifikante inflammatoriske responser pågår i pasienter med cancer. Således, i en utførelsesform av oppfinnelsen, kan B. longum AH1206 anvendes for å behandle symptomene på cancer. På grunn av de anti-inflammatoriske egenskapene til B. longum AH 1206, kan denne bakteriestammen redusere grad av malign celletransformasjon. Videre kan intestinalbakterier produsere, fra kost-forbindelser, substanser med genotoksis, karcinogen og tumor-fremmende aktivitet og tarmbakterier kan aktivere pro-karcinogener mot DNA reaktive midler. Generelt har Bifidobacterium arter lave aktiviteter av xenobiotiske metaboliserende enzymer sammenlignet med andre populasjoner i tarmen slik som bacteroider, eubacteria og clostridia. Derfor vil økning av antallet Bifidobacterium bakterier i tarmen fordelaktig kunne modifisere nivåene av disse enzymene.

[0072]I spesielle utførelsesformer kan B. longum AH1206 administreres i kombinasjon med anti-inflammatoriske terapier slik som ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler (NSAID'er) eller infliximab.

[0073]Tarm-mikrofloraen hos spedbarn etableres raskt i de første få ukene etter fødselen. Naturen til denne intestinal-kolonisering bestemmes initialt ved tidlig eksponering for miljømessige mikrobekilder så vel som spedbarnets helsetilstand. Spedbarn som er født med keisernitt, for tidlig fødte eller andre spedbarn som til-bringer deres første del av livet i en steril inkubator, og/eller spedbarn som for tilført antibiotika tidlig i livet vil sannsynligvis ha signifikante utsettelser av utvikling av en frisk tarmflora. Fordi disse spedbarna ikke har muligheten til å erverve en frisk tarmflora fra deres mødre eller fra omgivelsene, kan konsumering av B. longum AH 1206 fordelaktig bidra til en rett utvikling og funksjon av mage/tarm-immunsystemet.

[0074]I noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, har spedbarnet eller barnet behov for behandling, reduksjon eller forebygging av inflammasjon. Individet kan ha en risiko for inflammasjon som skyldes genetisk predisposisjon, diett, livsstil, sykdom eller lidelser. Et for tidlig født spedbarn eller et spedbarn med immun-supresjon kan for eksempel ha en risiko for inflammasjon og kan derfor ha behov foren slik behandling, reduksjon eller forebygging.

[0075]Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan emballeres i en hvilken som helst type beholder som er kjent innen teknikken for anvendelse når det gjelder lagring av næringsmiddelprodukter slik som glass, belagt kartong, plast og belagte metallbokser. I enkelte utførelsesformer er sammensetningen emballert via blåse-fylle-forsegle emballeringsteknikker. I andre utførelsesformer er sammensetningen tilveiebrakt som en enkelt-dose beholder. Emballeringen av sammensetningen kan gjennomføres under aseptiske forhold. I noen utførelsesformer fremstilles sammensetningen slik at den er aksepterbar for direkte avlevering til et for tidlig født spedbarn via nasogastriske sonder, nasoduodenalsonder eller nasojejunalsonder.

[0076]Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være lagringsstabil. Med "lagringsstabil" er det ment at sammensetningen, i en form som er lett å forbruke, forblir i en enkelt homogen fase (dvs. separerer ikke til mer enn en fase ved visuell inspeksjon), og/eller som ikke bunnfeller ved visuell inspeksjon etter lagring over natten i et kjøleskap.

[0077]De etterfølgende eksempler beskriver forskjellige utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse. Andre utførelsesformer innenfor rammen av de her angitte krav vil fremkomme klart for en fagkyndig på området ut fra beskrivelsen eller utførelsen av oppfinnelsen som omtalt heri. Beskrivelsen skal, sammen med eksemplene, betraktes til kun å være eksempelvise, hvor rammen for oppfinnelsen er indikert ved kravene som etterfølger eksemplene. I eksemplene er alle prosent-andelene gitt på vektbasis dersom annet ikke er indikert.

Eksempel 1

[0078]Dette eksempel illustrerer karakteriseringen av bakterier isolert fra sped-barnsavføring.

Isolering av probiotiske bakterier

[0079]Frisk avføring ble oppnådd fra et 2-dager gammelt guttespedbarn som ble ammet og seriefortynninger ble utplatet på TPY (trypticase, pepton og gjærekstrakt) og MRS (deMann, Rogosa and Sharpe) medier supplert med 0,05% cystein og mupirocin. Plater ble inkubert i anaerobe glasskrukker, (BBL, oksoid) ved å anvende CO2genererende kit (Anaerocult A, Merck) i 2-5 døgn ved 37°C. Grampositive, katalase-negative stav-formede eller bifurkerte/pleomorfe bakterie-isolater ble strøket ut for renhet på komplekse ikke-selektive medier (MRS og TPY). Isolater ble rutinemessig kultivert i MRS eller TPY medium dersom annet ikke angitt ved 37°C under anaerobe forhold. Presumptive Bifidobacterium ble anbrakt i 40% glyserol og lagret ved -20°C og -80°C.

[0080]Etter isolering av en ren bifidobakteriestamme, tildelt betegnelsen AH1206, ble mikrobiologiske egenskaper bestemt og er oppsummert i tabell 1 nedenfor. AH 1206 er en gram-positiv, katalase-negativ pleomorfisk formet bakterie som er fruktose-6-fosfat-fosfoketolase positiv som bekrefter dens identitet som en bifido-bakterie. Ved å anvende minimalt medium hvori en enkelt karbonkilde ble innført, var AH1206 i stand til å vokse på alle de testede karbonkildene (glukose, laktose, ribose, arabinose, galaktose, raffinose, fruktose, maltekstrakt, mannose, maltose, sukrose).

Identifikasjon av arter

[0081]16 s intergenisk spacer (IGS) sekvensering ble gjennomført for å identi-fisere bifidobakterieartene som er isolert. Kort ble DNA isolert fra AH1206 ved å anvende 100 ul ekstraksjonsoppløsning og 25 ul vevspreparatoppløsning (Sigma, XNAT2 Kit). Prøvene ble inkubert i 5 minutter ved 95°C og deretter ble 100 ul nøy-traliseringsoppløsning (XNAT2 kit) tilsatt. Genomisk DNA oppløsning ble kvantifisert ved å anvende et Nanodrop spektrofotometer og lagret ved 4°C. PCR ble gjennomført ved å anvende IGS primere, IGS L: 5-GCTGGATCACCTCCTTTC-3'

(SEQ ID NO 3) som er basert på SEQ ID NO 1 og IGS R: 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID NO 4) som er basert på SEQ ID NO 2. Cykliseringsbetingelsene var 94°C i 3 minutter (1 syklus), 94°C i 30 sekunder, 53°C i 30 sekunder, 72°C i 30 sekunder (28 sykluser). PCR reaksjonen inneholdt 4 Ml (50 ng) DNA, PCR blanding (XNAT2 kit), 0,4 uM IGS L og R primer (MWG Biotech, Tyskland). PCR reaksjoner ble gjennomfør på en Eppendorf termo-cykliseringsanordning. PCR produktene (10 ul) ble kjørt sammen med en molekylvekt markør (100 bp stige, Roche) på en 2% agarose EtBr farget gel i TAE for å bestemme IGS profilen. PCR produkter av bifidobakterium (enkeltbånd) ble renset ved å anvende Promega Wizard PCR rensekit. De rensede PCR produktene ble sekvensert ved å anvende primer sekvensene (ovenfor) for den intergeniske spacer regionen. Sekvensdata ble deretter søkt mot National Center for Biotechnology Information (NCBI) nukleotid databasen for å bestemme identiteten til stammen ved nukleotidhomologi. De oppnådde DNA sekvens dataene ble underkastet NCBI standard nukleotid-til-nukleotid homologi BLASTt søkemotoren (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Det nærmeste match med sekvensen ble identifisert, og deretter ble sekvensene sammenstilt for sammenligning ved å anvende DNASTAR MegAlign programvare. De oppnådde sekvenser kan ses i

sekvenslisten hvori SEQ ID NO 1 er IGS fremover sekvensen og SEQ ID NO 2 er IGS revers sekvensen. Søk i NCIMB databasen viste at AH 1206 har en unik IGS sekvens med sin nærmeste sekvenshomologi med en Bifidobacterium longum. En papirkopi og et datamaskin-lesbart format av sekvenslisten for tabell 3 inn-sendes hermed og er herved innlemmet ved referanse. Den datamaskinlesbare filen på disketten er identifisert som AH1206_ST25.txt, størrelse: 2 KB, dannet 12. september 2008.

[0082]For å utvikle en strekkode PCR profil for AH1206, ble PCR gjennomført ved anvendelse av BOX primere. Cykliseringsbetingelsene var 94°C i 7 minutter (1 syklus): 94°C i 1 minutt, 65°C i 8 minutter (30 sykluser) og 65°C i 16 minutter. PCR reaksjonen inneholdt 50 ng DNA, PRC blanding (XNAT2 kit) og 0,3 uM BOXA1R primer (5-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (SEQ ID NO 5) (MWG Biotech, Tyskland). PCR reaksjonene ble utført på en Eppendorf termocykliseringsanord-ning. PCR produktene (1 ul) ble kjørt sammen med en molekylvekt markør (DNA 7500 stige, Agilent, Tyskland) ved å anvende DNA 7500 LabChip på Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Tyskland). Strekkoden (PCR produkt profil) ble bestemt ved å anvende Agilent Bioanalyzer programvaren hvor topptall (PCR produkter) og størrelse ble identifisert (figur 1).

Antibiotiske sensitivitetsprofiler

[0083]Antibiotiske sensitivitetsprofiler for B. longum stammen ble bestemt ved å anvende "dise susceptibility" analysen. Kulturer ble dyrket i et passende buljong-medium i 24-48 timer, utplatet (100 ul) på agarmedier og skiver som inneholdt kjente konsentrasjoner av antibiotika ble anbrakt på agaren. Stammer ble under-søkt for antibiotikasensitivitet etter 1-2 døgns inkubasjon ved 37°C under anaerobe forhold. Stammer ble betraktet til å være sensitive dersom inhiberingssoner på 1 mm eller større ble sett. Den minste inhiberende konsentrasjon (MIC) for hvert antibiotika ble bestemt uavhengig. MIC for clindamycin, vancomycin og metronidazol var henholdsvis 0,32, 0,75 og 0,38.

Mage/ tarmgjennomgang

[0084]For å bestemme om Bifidobacterium longum kunne overleve ved lave pH verdier som er ekvivalente med dem som man finner i magen, ble bakterieceller høstet fra nye kulturer som var dyrket over natten, vasket to ganger i fosfatbuffer (pH 6,5) og resuspendert i TPY buljong som var innstilt til pH 2,5 (med 1M HCI). Celler ble inkubert ved 37°C og overlevelse ble målt ved intervaller på 5, 30, 60 og 120 minutter ved å anvende platetellemetoden. AH1206 overlevde godt i 5 minutter ved pH 2,5, mens ingen levedyktige celler ble oppdaget etter 30 minutter.

[0085]På vei ut fra magen, blir putative probiotika eksponert for gallesalter i tynn-tarmen. For å bestemme den evnen som B. longum har til overleve eksponering for galle, ble kulturer utstrøket på TPY agar plater supplert med 0,3% (vekt/volum), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% eller 10% porcine galle. B. longum AH1206 vekst ble observert på plater som inneholdt opp til 1% galle.

[0086]I en murin modell ble evnen hos B. longum AH 1206 til å passere mage/ tarmkanalen bestemt. Mus konsumerte 1x10<9>AH1206 daglig, og feces pelleter ble undersøkt for tilstedeværelse av den tilførte mikroorganismen. Deteksjon av AH 1206 ble forenklet ved å isolere en spontan rifampicin-resistent variant av bifidobakerium. Innlemmelse av rifampicin i TPY platen ble anvendt for å bestemme passering og forsikre at kun tilførte rifampicin-resistente bifidobakterier ble dyrket. Feces prøver ble samlet daglig og B. longum passering gjennom mage/ tarmkanalen ble bekreftet (figur 2).

Anti- mikrobiell aktivitet

[0087]De indikator-patogene mikroorganismene som anvendes i dette studium ble propagert i det etterfølgende medium under de etterfølgende vekstbetingelser: Salmonella typhimurium (37°C, aerob) i Tryptone Soya buljong/agar supplert med 0,6% gjærekstrakt (TSAYE, oksoid), Campylobacterjejuni (37°C, anaerob) og E. coli 0157:H7 (37°C, anaerob) på blodagarmedium, og Clostridium difficile (37°C, anaerob) i forsterket klostridium medium (RCM, oksoid). Alle stammene ble inokulert i nylaget medium og dyrket over natten før anvendt i forsøkene.

[0088]Antimikrobiell aktivitet ble detektert ved å anvende den utsatte metoden. Kort ble B. longum AH 1206 inkubert i 36-48 timer. Ti-ganger seriefortynninger ble utplatet (100 ul) på TPY agar medium. Etter inkubasjon over natten, ble platene med distinkte kolonier dekket med indikatorbakterien. Indikatorplenen ble fremstilt ved å inokulere et smeltebelegg med 2% (volum/volum) av en over natten indikatorkultur som ble helt over overflaten av de inokulerte TPY platene. Platene ble re-inkubert over natten under betingelser som er passende for vekst av indikatorbakterien. Indikatorkulturer med inhiberingssoner som er større enn 1 mm i radius ble betraktet til å være sensitive for testbakterien. B. longum AH1206 inhiberte veksten av alle de patogene organismene som ble testet, med klare soner som målte 14, >80, 13,33 og 17 mm for Salmonella typhimurium, Campylobacterjejuni, E. coli 0157:H7 og Clostridium difficile, henholdsvis.

Eksempel 2

[0089]Dette eksempel illustrerer cytokinproduksjon ved PBMCer som respons på B. longum. PBMCer ble isolert fra friske donorer ved densitetsgradientsentrifuge-ring. PBMCer ble stimulert med den probiotiske bakteriestammen i en 72 timers periode ved 37°C. På dette tidspunkt ble kultursupernatanter samlet, sentrifugert, delt i like deler og lagret ved -70°C inntil de ble målt for IL-10 nivåer ved anvendelse av cytometrisk kuleanalyser (BD BioSciences). AH1206 induserte signifikant sekresjon av det anti-inflammatoriske cytokin IL-10 ved humane PBMCer, som forslår at denne stammen kan anvendes som et anti-inflammatorisk middel in vivo (figur 3). Som et anti-inflammatorisk middel, kan den være anvendbar til å redusere og forebygge inflammasjon i mennesker.

Eksempel 3

[0090]Dette eksempel illustrerer effekten av B. longum AH 1206 på svekkelsen av respiratorisk sykdom i en murin astmamodell. Dette studium benyttet en Balb/c OVA-sensibilisert musemodell med allergisk luftveisinflammasjon. Mus ble sensibilisert ved intraperitoneal injeksjon av OVA, og sykdommen ble initiert ved intranasal eksponering med OVA. Tjuefire timer etter den siste eksponering (dag 15), ble mus underkastet målinger for luftveis responderbarhet etterfulgt av BAL prosedyre. OVA-sensibiliserte, saltvannseksponerte mus tjente som kontroller. Ved å begynne på dag 1 (dvs. på tidspunktet for første OVA sensibilisering), mottok dyr B. longum AH1206 via en sonde i 14 påfølgende dager. Dyr ble sondeforet med MRS buljong som tjente som kontroller.

[0091] Luftveisinflammasjon ble bestemt ved antall inflammatoriske celler i BAL fluid. Celler ble fjernet fra BAL fluid ved sentrifugering og cellene ble resuspendert i fosfatbufret saltvann (1 ml). BAL celler ble farget med tryptan blå, og levedyktige celler ble telt ved å anvende et hemocytometer. Utstryk av BAL celler ble fremstilt med en cytospin (Thermo Shandon, Pittsburg, PA) og farget med HEMA 3 reagens (Biochemical Sciences, Swedesboro, NJ) for differensialcelletall, hvor totalt 200 celler ble telt for hver skylling. Konsumering av B. longum AH 1206 reduserte signifikant det totale BAL tall sammenlignet med placebo hvor majoriteten av denne forskjell blir sett i den eosinofile populasjon (figur 4).

[0092] Dette studium ble gjentatt for videre å undersøke om den probiotiske bakteriestammen Bifidobacterium longum AH1206 undertrykker allergiske responser i en OVA-sensibilisert musemodell med allergisk luftveisinflammasjon. Kort ble voksne BALB/c hannmus sensibilisert ved intraperitoneal injeksjon av OVA på dag 0 og dag 6. På dager 12 og 14 ble mus eksponert intranasalt for OVA. Tjuefire timer etter den siste eksponering (dag 15), ble mus underkastet målinger av luftveis responderbarhet etterfulgt av BAL prosedyre. OVA/alum-sensibiliserte, saltvanneksponerte mus tjente som kontroller. Dyr mottok probiotika eller placebo gjennom hele forsøket. Luftveisinflammasjon (cytokintall og celletall) ble bestemt ved å telle inflammatoriske celler i BAL fluid. Luftveis responderbarhet ble også målt ved å anvende Buxco pletysmografen for hele kroppen. Splenocytter ble også isolert fra OVA-sensibiliserte mus og ble inkubert i nærvær av anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer hvoretter cytokinnivåer ble målt i supernatanten ved flow-cytometri.

[0093]B. longum AH 1206 behandling resulterte i en signifikant reduksjon i celler utvunnet fra BAL fluid etter OVA eksponering, sammenlignet med dyr som var til-ført buljong (figur 5). Luftveisresponderbarhet ble målt og OVA sensibiliserte mus vist en økning i luftveistyperesponderbarhet (AHR) overfor metakolin sammenlignet med mus som var eksponert fra saltvann. Ingen modulering av denne økte luftveisresponderbarheten overfor metakolin, som bestemt ved forandringer i økt pause, ble sett (figur 6).

[0094]BAL cytokinnivåer ble målt ved cytometrisk kuleanalyse, og ingen signifikante forskjeller ble sett for IL-10, IFN-y, IL-6 og CCL2 nivåer. AH1206 reduserte signifikant TNF-a nivåer sammenlignet med OVA kontroll (figur 7).

[0095]Cytokinnivåer i splenocytt supernatanter ble kvantifisert ved cytometrisk kuleanalyse (CBA) etter in vitro OVA eller anti-CD3 anti-CD28 stimulering. Økt IL-10 frigivelse fra OVA stimulerte splenocytter, assosiert med in vivo OVA sensi bilisering, ble ikke observert i AH1206-f6rede mus. Der var ingen signifikant forskjell i IL-6, TNF og MCP-1 (CCL2) nivåer. IL-10 frigivelse fra CD3/CD28 splenocytter ble ikke økt i AH1206-f6rede dyr. Utskillelse av de pro-inflammatoriske cytokiner TNF-a og IFN-y var imidlertid signifikant redusert i splenocytt-kultur-supernatantene av AH1206-f6rede dyr (figur 8). Ingen signifikante forskjeller ble sett for de andre cytokinene som ble målt.

Eksempel 4

[0096]Formålet med dette studium var å undersøke om de probiotiske bakterier, Bifidobacterium longum AH 1206, undertrykker allergiske responser i en OVA-indusert allergi musemodell. BLAB/c mus ble oppdelt i grupper (8/gruppe) og ble foret med placebo, Bifidobacterium longum AH 1206 eller destillert vann i fire uker. Alle musene ble ukentlig sondeforet oralt med ovalbumin og koleratoksin i 300 ul fosfatbufret saltvann (PBS), med utelukkelse av en av destillert vann gruppene som ble sondeforet oralt med kun 300 ul (PBS) som en kontroll. Etter fire ukers behandling, ble en blodprøve fra hver mus samlet via fasialvenepunksjon, og en etterfølgende enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ble gjennomført for å måle OVA-spesifikke IgE nivåer. Miltceller og mesenteriske lymfeknuteceller ble isolert og stimulert in vitro med LPS og antiCD3/CD28 og det immunodominerende OVA peptidet. Th1 og Th2 cytokiner ble målt ved cytometrisk CBS.

[0097]Der var signifikant mindre OVA-spesifikk IgE i gruppen som var foret med AH 1206 sammenlignet med placebogruppen og positiv kontrollgruppen (figur 9). Den negative kontrollgruppen og gruppene foret med AH 1206 var ikke forskjellige, som foreslår at AH1206-f6ring fullstendig forhindret induksjonen av en OVA-spesifikk IgE respons. Dette eksempelet foreslår videre at AH1206 administrering kan forhindre inntreden av inflammasjon i mennesker. Statistikker ble beregnet ved å anvende den uparede T-testen.

[0098]Splenocytter ble isolert fra BALB/c mus som hadde fått tilført probiotika, placebo og destillert vann og som enten ble ustimulert eller stimulert med lipo-polysakkrid (LPS), antiCD3/CD28 eller det immundominerende OVA peptidet og deretter analysert for cytokinproduksjon av TNF-a, IL-2, IFN-y, IL-4 og IL-5 ved Th1/Th2 cytometrisk kuleanalyse. Cytokinresultatene er oppsummert i tabell 2.

[0099]I ustimulerte splenocytter ble ingen forandringer observert sammenlignet med kontrolldyr. TNF-a og IFN-y frigivelse fra LPS-stimulerte splenocytter var signifikant større for AH1206-f6rede dyr sammenlignet med de negative kontrollene men disse nivåene var konsistente med dem som var observert med OVA-sensibiliserte og kolera toksin-administrerte positive kontroller. CD3/CD28 stimulering viste grundige forandringer i lymfocyttsignalering i gruppen tilført probiotika. Dyr tilført AH1206 utskilte signifikant mindre TNF-a sammenlignet med de positive kontrollene, men nivåene var høyere sammenlignet med de negative kontroller (figur 10). Dyr tilført AH1206 hadde signifikant lavere nivåer av IFN-y, IL-2, IL-4 og IL-5 sammenlignet med positive kontroller som ikke var tilført probiotika.

Eksempel 5

[00100]Dette studium undersøkte effekten av probiotisk konsumering på regula-torisk T celle tall og aktivitet i friske mus. BALB/c mus (1 O/gruppe) fikk tilført Bifidobacterium longum AH 1206 eller placebo i tre uker. Etter probiotika/placebo konsumering, ble CD4<+>CD25<+>T regulatoriske celler isolert og deres in vitro under-trykkende aktivitet ble bestemt ved å måle proliferasjon av anti-CD3/CD28 stimulerte CFSE-merkede CD4<+>responder T celler ved å anvende flow-cytometri. CD4<+>responder T celler ble ko-inkubert med CD4<+>CD25" T celler som en kontroll. Prosentandelen CD4<+>CD25<+>celler (regulatoriske T celler) i murine splenocytter som også var FoxP3 positive ble bestemt i milten til mus tilført probiotika eller placebo.

[00101]Prosentandelen CD4<+>celler som prolifererte når ko-inkubert med CD4<+>CD25<+>celler fra mus tilført probiotika/placebo ble sammenlignet med prosentandelen CD4<+>celler som prolifererte når ko-inkubert med CD4<+>CD25" celler fra den samme forsøksmusen. I hvert tilfelle var T celle proliferasjon mindre i kulturer som inneholdt CD4<+>CD25<+>celler sammenlignet med kulturer som inneholdt CD4 celler alene og tomme for CD25<+>celler (figur 11).

[00102]Prosentandelen celler i CD4<+>populasjonen som også var DC25<+>ble bestemt (figur 12). Gruppen tilført Bifidobacterium longum AH1206 hadde signifikant mere CD4<+>T celler som var CE25<+>(dvs. T regulatoriske celler) enn deres placebo-tilførte motstykker (p= 0,0081). Dette foreslår at prosentandelen T regulatoriske celler i CD4<+>populasjonen ble økt signifikant ved tilførsel av AH1206. Dette resultat indikerer at AH1206 administrering kan redusere eller forhindre inflammasjon i et menneske.

[00103] Antallet CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>celler i hele splenocyttpopulasjonen til mus som var foret med probiotika eller placebo ble også bestemt. Antallet CD4<+>CD25<+>T regulatoriske celler som uttrykker FoxP3 var uforandret i milten til mus foret med probiotika i forhold til placebo eller dyr som var uten noen tilførsel.

Eksempel 6

[00104] Bakteriefrie mus ble innkjøpt i 6 ukers alder og ble holdt i den bakteriefrie enheten ved den biologiske serviceenheten i UCC. Dyr konsumerte den prebiotiske stammen Bifidobacterium longum AH 1206 i 14 døgn eller forble bakteriefrie. Induksjon av T regulatoriske celler ble bestemt ved flow-cytometri.

[00105]Antallet CD4<+>CD25<+>Foxp3<+>celler i milten til bakteriefrie dyr, som var foret med AH 1206 ble signifikant økt etter foring med AH 1206 (figur 13). Igjen indikerer dette resultatet at AH 1206 administrering kan redusere eller forhindre inflammasjon i et menneske. Totale CD3/CD4 eller CD3/CD8 tellinger forble uendret.

Eksempel 7: Stabilitetsresultater

[00106] Stabiliteten til den prebiotiske stammen-AH1206 ble bestemt i løpet av 3 måneder ved 30°C (figur 13). Resultatene indikerer at LGG var en dårlig utøver over testperioden med et 2 log fall over 3 måneders perioden mens AH 1206 var ganske stabil uten noe tap av levedyktighet målt over perioden.

[00107] Alle referanser som angitt i denne beskrivelsen som inkluderer, uten begrensning, alle vitenskapelige artikler, publikasjoner, patenter, patentsøknader, presentasjoner, tekster, rapporter, manuskripter, brosjyrer, bøker, internett-oppslag, tidsskrifter, artikler og periodiske artikler er herved innlemmet i sin helhet ved referanse. Omtalen av referansene heri er kun ment for å oppsummere for-fatternes påstander og ingen innrømmelse er gjort om at eventuelle referanser utgjør den kjente teknikk. Søkerne reserverer retten til å utfordre nøyaktighet og relevansen til de angitte referanser.

[00108]Disse og andre modifikasjoner og variasjoner av den foreliggende oppfinnelse kan gjennomføres av en fagkyndig på området uten at man avviker fra oppfinnelsesrammen, som mere spesielt er angitt i de vedlagte kravene. I tillegg skal det forstås at aspekter av de forskjellige utførelsesformer kan byttes ut, både i sin helhet eller delvis. Videre vil en fagkyndig på området forstå at den foregående beskrivelse kun er eksempelvis, og skal ikke begrense oppfinnelsen slik den er videre beskrevet i de vedlagte kravene. Rammen for de vedlagte kravene bør derfor ikke begrenses til beskrivelsen av versjonene som er inneholdt deri.

Claims

1. Brystmelkerstatning for spedbarn, karakterisert vedat den omfatter en proteinkilde, en fettkilde, en karbohydratkilde og B. longum AH1206.

2. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, hvori brystmelkerstatningen for spedbarn omfatter B. longum AH 1206 i området fra omtrent 1x10<4>cfu til omtrent 1x10<10>cfu per gram brystmelkerstatning for spedbarn.

3. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, hvori B. longum AH1206 er levedyktig.

3. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, hvori B. longum AH1206 er ikke-levedyktig.

5. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som videre omfatter et ytterligere probiotika.

6. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 5, hvori det ytterligere probiotika omfatter LGG.

7. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som ytterligere omfatter et prebiotika.

8. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 7, hvori prebiotikaet er valgt fra gruppen som består av laktulose, gluko-oligosakkarid, inulin, polydekstrose, galakto-oligosakkarid, frukto-oligosakkarid, isomalto-oligosakkarid, soyabønne oligosakkarider, laktosukrose, xylo-oligosakkarid og gentio-oligosakkarider.

9. Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som videre omfatter minst en LCPUFA.

10 Brystmelkerstatning for spedbarn som angitt i krav 1, som videre omfatter ARA og DHA.

11. Næringsmiddelprodukt for barn, karakterisert vedat det omfatter en proteinkilde, en fettkilde, karbohydratkilde og B. longum AH1206.

12. Fremgangsmåte for å redusere eller forhindre inflammasjon i et spedbarn eller et barn, karakterisert vedat den omfatter administrering av B. longum AH1206 til spedbarnet eller barnet.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, hvori reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedrer allergier.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, hvori reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedrer astma.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, hvori reduksjonen eller forebyggingen av inflammasjon forbedrer en sykdom som er valgt fra gruppen som består av diaré, respiratoiske infeksjoner og otitis media.