NO177859B - Fremgangsmåte til produksjon av angiogen faktor - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av angiogen faktor inneholdende et enkeltkjedet polypeptid som viser i hovedtrekk homolqgi med den native angiogene faktor isolert fra humant placentalt vev.

Angiogene faktorer er blitt definert som proteiner som har en rekke egenskaper, nemlig evnen til å (1) øke hastigheten av endotelcelleproliferasjon; (2) øke endotelcelleproteasesyntese; (3) stimulere endotelcellemigrasjon mot proteinforekomsten og (4) forårsake in vivo kapillær proliferasjon. I særdeleshet har det vært observert at substansene klassifisert som angiogene faktorer kan være mitogene ved å påvirke DNA-syntesen i endotelceller, og derved øke hastigheten av endotelcelleproliferasjon og hastigheten ved hvilken nye blodkar blir dannet.

Interrelatert med denne egenskap er angiogene faktorers evne til å øke proteasesyntesen i endotelceller. Disse proteaser inkluderer plasminogen aktivator (PA) og kollagenase. Spesifikt er de angiogene faktorer i stand til å stimulere syntesen av PA og latent kollagenase hvor PA kan omdanne zymogent plasmin til aktivt plasmin, en protease med bred spesifisitet, som i sin tur kan omdanne latent kollagenase til aktiv kollagenase. Disse to proteaser, aktivt plasmin og aktiv kollagenase, er i stand til å nedbryte de fleste proteiner i omliggende vev og på den måte tillate økt invasjon av forskjellige vev, slik som kapillærendotelceller. Ennvidere er angiogene faktorer kjemotaktiske for visse celler, i særdeleshet kapillære endotelceller, dvs. de induserer disse celler til å migrere mot den angiogene faktor.

På bakgrunn av disse egenskaper er det blitt postulert at isolering/fremstilling av en angiogen faktor ville gjøre det mulig å lage en terapeutisk substans med evnen til å øke blodforsyningen til et organ. For eksempel ville det etter visse myokardinfarkter være ønskelig å stimulere regenerering av blodforsyningen til hjertet som ble stanset som et resultat av infarktet eller å stimulere gjenvekst av kar ved kroniske obstruksjoner. I tillegg kan bruken av angiogen faktor stimulere heling av liggesår, kirurgiske incisjoner og langsomt helende sår, i særdeleshet i geriatriske og diabetiske pasi-enter. Ennvidere kan applisering av dette materiale på brannsår bedre hastigheten og graden av heling. Derfor har man søkt en renset angiogen faktor passende for terapeutisk bruk i mennesker. I tillegg tror noen vitenskapsmenn at studiet av en substans med evnen til å stimulere blodkarvekst kan lede frem til prosesser for hvilke blodtilførsel til cancerøse tumores kan hemmes, for derved å utsulte canceren.

Tidligere, selv om en klasse proteiner var blitt identifisert og referert til som "angiogene faktorer", har disse proteiner primært blitt isolert fra ikke-humane kilder. Det er antatt at angiogene faktorer isolert fra ikke-humane kilder ikke ville være egnet for bruk som terapeutiske agens i mennesker på grunn av muligheten for uønskede immunologiske reaksjoner som respons på et fremmed protein. Videre hadde det ikke vært vist hvorvidt disse ikke-humane proteiner individuelt inneholdt de fire identifiserte egenskaper til en angiogen faktor som nevnt ovenfor, eller hvorvidt de observerte egenskaper kunne tilskrives interaksjonene mellom en kombinasjon av proteiner.

Derfor har forskjellige proteiner som er funnet å ha endotelcelle-mitogene egenskaper, blitt delt i to klasser: endotelcelle vekstfaktor-lignende molekyler som er eluert fra heparin-Sepharose med 1 M NaCl og som har sur pl; og fibroblast vekstfaktor-lignende molekyler som binder sterkere til heparin-Sepharose og som har basisk pl. I tillegg mener oppfinnerne at det finnes en tredje art av angiogen faktor, som beskrives som "angiogenin" i artikler nylig publisert av Vallee et al. ved Harvard Medical School, i Biochemistry, 1985, bind 24, pp. 5480-5499. Det er antatt ai; angiogenin, selv om det har noen egenskaper tilhørende en ekte angiogen faktor, er en distinkt art ved at det mangler mitogene egenskaper.

Med dette lappverk av forskning foran seg har oppfinnerne søkt og oppdaget en human angiogen faktor, klassifiserbar som en FGFbasic som i store trekk er homolog med det som er isoler-bart fra humant placentavev, som i ett enkelt molekyl har minst en av de ovenfor identifiserte egenskaper, dvs. er mitogent, kjemotaktisk og har evnen til å stimulere proteasesyntese såvel som evnen til å forårsake in vivo kapillær proliferasjon. Ennvidere søkte oppfinnerne å isolere denne angiogene faktor i en hovedsakelig renset form fra humant placentavev for å bestemme aminosyresekvensene. Aminosyresekvensen av denne isolerte angiogene faktor er nå blitt bestemt. Denne bestemmelse av nevnte aminosyresekvens tillater identifikasjon av DNA-probes for bruk i og fremskaffelse av genomisk eller cDNA-sekvenser som er nyttige i rekombinant-DNA-metoder for syntese av angiogene faktorer.

Hensikten med oppfinnelsen er således å tilveiebringe en fremgangsmåte til fremstilling av en angiogen faktor med ovennevnte egenskaper.

Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte til fremstilling av angiogen faktor som er klassifiserbare som <FGF>basic•

For å kunne bestemme aminosyresekvensen er det fremskaffet rensede former av en angiogen faktor som har ovennevnte egenskaper og aminosyresekvensen i en slik angiogen faktor er bestemt.

For å oppnå hensikten og i samsvar med formålene med den

foreliggende oppfinnelse blir en angiogen faktor beskrevet, som har i det minste ett aktivt sete som har en aktivitet valgt fra gruppen bestående av mitogen aktivitet, kjemotaktisk aktivitet, evnen til å stimulere proteasesyntese og kombinasjoner av

disse. Den syntetiske angiogene faktor blir klassifisert som en FGFbasic og viser overveiende homologi med den native angiogene faktor som er isolerbar fra humant placentavev.

Det gjøres oppmerksom på at mens det er foretrukket at den angiogene faktor selv er i stand til å stimulere proteasesyntese, inkluderer uttrykket "protease" som brukt her aktive eller forløper-former. Eksempler på slike forløpere inkluderer latent eller pro-kollagenase. Videre er det mulig at noen angiogene faktorer ikke direkte stimulerer proteasesyntese. Disse angiogene faktorer vil imidlertid forårsake biologiske responser som i sin tur stimulerer proteasesyntese. Således vil de angiogene faktorer av den foreliggende oppfinnelse enten direkte eller indirekte stimulere proteasesyntese.

En foretrukket angiogen faktor fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse har følgende kjerneaminosyresekvens:

I tillegg vil peptider som har sekvensen være til stede i polypeptidet utenfor kjernesekvensen. I sekvensene skissert her indikerer åpne parenteser nærværet av ett enkelt aminosyreresidium som ikke er fullstendig identifisert. En annen særlig foretrukken angiogen faktor fremstilt ifølge foreliggeliggende oppfinnelse har følgende sekvens:

Aminosyresekvensen angitt ved de foregående forkortelser blir fremsatt i beskrivelsen av de foretrukne utførelsesformer nedenfor.

Videre, for å oppnå hensiktene med den foreliggende oppfinnelse, blir en hovedsakelig ren form av den native angiogene faktor isolerbar fra humant placentavev beskrevet.

Som bemerket ovenfor vedrører den foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte til fremstilling av en angiogen faktor hovedsakelig homolog til en som har blitt isolert i renset form. Fortrinnsvis gir fremstillingen av den angiogene faktor ifølge den foreliggende oppfinnelse en angiogen faktor som et enkelt polypeptid-kjede-protein som hovedsakelig er homologt med, immunologisk ekvivalent med og fortrinnsvis biologisk ekvivalent med nativ angiogen faktor isolerbar fra humant placentavev. Med "biologisk ekvivalent", som brukt i beskrivelsen, er det ment at sammensetningen av den angiogene faktor, fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse besitter mitogene og kjemotaktiske egenskaper og er i stand til å indusere proteasesyntese på den samme måte, men ikke nødvendigvis i den samme grad, som den native angiogene faktor.

Med "i hovedtrekk homolog" som benyttet i den følgende beskrivelse og krav, menes en grad av homologi med den native angiogene faktor i større utstrekning enn det som er vist ved noen tidligere rapportert renset, hovedsakelig homogen angiogen faktorsammensetning. Fortrinnsvis er graden av homologi i overkant av 50%, fortrinnsvis 60%, og mer foretrukket 7 5%, med særdeles foretrukne proteiner i overkant av 85% eller 90% homologe med det native protein. Graden av homologi som beskrevet ovenfor blir beregnet som prosentandelen av aminosyreresidier funnet i den minste av de to sekvenser som samsvarer med identiske aminosyreresidier i sekvensene som sammenlignes når en kan sette inn fire "hull" i en lengde på 100 aminosyrer for å hjelpe opplinjeringen som foreslått av Dayhoff, M.O. i Atlas of Protein Sequences and Structure, bind 5, side 124 1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., som det spesielt vises til her.

Som beskrevet her blir den angiogene faktor fremstilt ifølge oppfinnelsen som et syntetisk polypeptid. Uttrykket "syntetisk" polypeptid er ment å bety en aminosyresekvens som ikke tidligere er blitt isolert fra naturen i en hovedsakelig renset form. Ved å benytte denne definisjon omfatter "syntetisk" bl.a. polypeptider laget ved rekombinant-DNA-metoder eller syntetisert fullstendig eller delvis in vitro. Spesielt menes syntetiske polypeptider hvor 1 eller 2 aminosyrer er forskjellige fra dem som er fremsatt i de foretrukne sekvenser nedenfor.

Den foretrukne angiogene faktor fremstilt ifølge oppfinnelsen er blitt oppdaget i human placenta-vevsekstrakter, og for første gang er den isolert i en renset form. Med hensyn på den foreliggende søknad skal "ren form" eller "renset form", når benyttet til å referere til den angiogene faktor beskrevet her, bety hovedsakelig ren for andre proteiner som ikke er angiogene faktorer. Fortrinnsvis er den angiogene faktor ifølge oppfinnelsen minst 5 0% ren, mer foretrukket 7 0% ren og enda bedre 80% eller 90% ren.

I tillegg har den angiogene faktor isoleres fra forskjellige tumorer og normale celler. Disse inkluderer SK-Hepl-celler, HeLa-celler og K562-celler, såvel som humane embryonale lungefibroblaster.

Den angiogene faktor kan også isoleres i ren form fra humant placentalt vev ved metoder som innbefatter: (a) innsamling av humant placentalt vev; (b) isolering av den angiogene faktor fra humant placentalt vev ved å fraksjonere det proteinholdige materiale i vevet; (c) identifisering av fraksjonene som har angiogen faktoraktivitet; og (d) kon-sentrering av fraksjonene som viser den angiogene faktor-aktivitet .

Den angiogene faktor kan i henhold til fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse fremstilles som et enkel-kjedet polypeptid som utviser i hovedtrekk homologi med den native angiogene faktor, som er isolerbar fra humant placentalt vev, hvori nevnte angiogene faktor har minst ett aktivt sete som innehar en virkning valgt fra gruppen som består av mitogen aktivitet, kjemotaktisk aktivitet, evne til å stimulere proteinsyntese og kombinasjoner av disse. Denne fremgangsmåte omfatter: isolering av en DNA-sekvens som koder for den angiogene faktor; innsetting av DNA-sekvensen i en vektor som er istand til å uttrykke den angiogene faktor i en verts-mikroorganisme, transformering av vektoren som ineholder DNA-sekvensen i en vertsmikroorganisme, som er i stand til å uttrykke den angiogene faktor; uttrykk av den angiogene faktor fra den nevnte transformerte mikroorganisme; og isolering og rensing av den uttrykte angiogene faktor.

Det proteinholdige materiale som er til stede i humant placentalt vev, blir fraksjonert ved bruk av en kombinasjon av heparin affinitetskromatografi, ionebytterkromatografi og, valgfritt, gelfiltrerings-kromatografi. Den angiogene faktor, som omhandlet her, kan også isoleres ved bruk av monoklonale antistoffer med spesifisitet for de placentale proteiner. I denne utførelsesform bindes antigenet til en matriks (harpiks)-inneholdende monoklonale antistoffer mot det placentale protein og ikke-antigene proteiner er fjernet ved vasking av resinet med buffer. Antigenet blir så fjernet fra antistoffet ved bruk av en buffer med enten høy eller lav pH, eller høy ionestyrke eller kaotropiske agens, alene eller i kombinasjon med en forandring i temperatur.

Fraksjoner oppnådd på denne måte blir så sortert for nærvær av angiogen faktor-aktivitet. Fortrinnsvis blir dette utført delvis ved å evaluere effekten på PA og kollagenasesyntese ved å inkubere passende endotelcelle-kulturer, fortrinnsvis kapillærendotelceller fra pattedyr, i nærvær av angiogen faktor og bestemme latent kollagenase i mediet og bestemt for PA i cellene. Mengden av protease dannet av cellene stimulert av angiogen faktor kan også bestemmes ved immunologiske metoder såsom ELISA- eller RIA-assays eller immunoprecipiterings-metoder.

Den angiogene faktors mitotiske evne blir fortrinnsvis målt ved å inkubere passende endotelceller, fortrinnsvis pattedyr-kapillærendotelceller, i nærvær av angiogen faktor og et radioaktivt merket nukleotid, fortrinnsvis <125>I-iododeoksyuridin (12<5>I-dU). Mengden av 125l-dU inkorporert i trikloreddiksyre-uløselig materiale blir så målt som indikasjon på graden av DNA-syntese. De kjemotaktiske egenskaper av en angiogen faktor blir fortrinnsvis vist ved inkubering av en passende endotelcelle-kultur, fortrinnsvis pattedyrkapillær-endotel-celler, i nærvær av den angiogene faktor og ved å måle cellenes bevegelsesevne i et passende kar, fortrinnsvis et modifisert Boyden-kammer.

Som bemerket ovenfor har oppfinnerne lykkes i å isolere en angiogen faktor fra humant placentalt vev i en hittil util-gjengelig renset form. Isolering av dette protein i en renset form var et nødvendig steg for å oppnå den korrekte sekvens av proteinet og for utviklingen av farmasøytiske sammensetninger inneholdende den angiogene faktor.

En foretrukket angiogen faktor fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse har følgende kjerneaminosyre-sekvens:

I tillegg er peptider som har sekvensene: til stede utenfor kjernesekvensen. En annen særdeles fore-trukkent angiogen faktor fremstilt ifølge oppfinnelsen har følgende sekvens: De foregående forkortelser tilsvarer standard-forkortelser for aminosyreresidier som beskrevet f.eks. i Biochemistry av A. L. Lehninger, 2. utg., Worth Publishers, Inc., New York

(1975), s. 72.

Det antas at aktiviteten av de angiogene faktorer omfattet av kravene ikke blir påvirket hvis noen av eller alle femten, seksten, sytten eller atten N-terminale aminosyreresidier fjernes fra det intakte polypeptid. Således er det ment at alle disse forkortede sekvenser er omfattet i fremstillingen ifølge oppfinnelsen. Ennvidere påtenkes også utvidelse av aminosyresekvensen ved tillegg av opp til 110 aminosyrer til den N-terminale ende av det intakte polypeptid.

Det blir også tatt med at tillegg av polypeptidkjeder til celler N-terminalen av den angiogene faktor vil være omfattet av den foreliggende oppfinnelse. I særdeleshet kan polypep-tidkj eder bli koblet til hvilken som helst av terminalene via proteinfusjonsteknikker. Disse tilleggs-polypeptider kan tjene til å øke den farmakologiske evne til å produsere en ønsket effekt av de nevnte angiogene faktorer. For eksempel kan polypeptidet ved fusjon med andre polypeptider gis større evne til å beholde sin aktivitet i nærvær av lav pH eller høy temperatur, eller det resulterende polypeptid kan vare lenger i sirkulasjon, ha større motstand mot degradering eller økt evne til transport over tarmepitel.

Imidlertid bør det merkes at i disse forandringer bør varia-sjonen av aminosyresekvensene ikke være slik at det provoserer en uønsket immunologisk respons i organismen hvori den angiogene faktor blir administrert, og hvor slik uønsket respons kan påvises å være til så stor ulempe for organismen at fordelene av den angiogene faktor ikke kan rettferdiggjøres. Metodene til å bestemme hvorvidt et biologisk molekyl kunne provosere en slik uønsket immunologisk respons er kjent for dem med vanlige kunnskaper i fagområdet.

De følgende eksempler belyser isolering, rensing og sekvensering av angiogen faktor, fremstilling ifølge oppfinnelsen og anvendeligheten av angiogen faktor.

Eksempel 1

Rensing av en human angiogen faktor fra placentavev

A. Proteinrensing

Termin human placenta ble frosset ved -20°C etter fødsel. De frosne placenta ble knust til små biter, malt med en elektrisk matkutter (General Slicing, Walden, NY) og homogenisert i en matprosessor. Etter homogenisering ble alle følgende trinn utført ved 4°C. De homogeniserte placentaer ble fortynnet med kald 20 mM Tris, pH 7,5, 3 mM EDTA og ble sonikert i 10 min ved 50 W (modell 185 sonikator, Branson Sonic Power Co., Plainview, NY). Generelt gav 1 kg frossen placenta 2 1 sonikat.

Sonikatet ble bragt til pH 4 med HC1, inkubert ved denne pH i

2 min, fulgt av nøytralisering med NaOH. NaCl ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5 M og sonikatet ble sentrifugert ved 10 000 x g i 60 min. Supernatanten ble satt på en 85 x 153 mm kolonne av heparin-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) bragt til likevekt med 0,5 M NaCl/3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5. Kolonnen ble vasket med den samme buffer og eluert med 2 M NaCl/3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5. Eluatet ble fortynnet med 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5 inntil ledningsevnen var 24 mmho og satt på heparin-Sepharose-kolonne nr. 2 (16 x 190 mm). Kolonnen ble vasket med 0,7 M Nacl i 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, og ble eluert med en 0,7-2 M NaCl-gradient i den samme buffer.

Fraksjoner ble undersøkt for protease-induserende aktivitet og de aktive fraksjoner ble konsentrert på en tredje heparin-Sepharose-kolonne (12 x 75 mm). Denne kolonne ble vasket først med 0,8 M NaCl i 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5 og deretter med 0,2 M NaCl i 0,1 M natriumfosfat, pH 6,0 og ble eluert med 2 M NaCl i 0,1 M natriumfosfat, pH 6,0. De aktive fraksjoner fra den tredje heparin-Sepharose-kolonne ble fortynnet med 20 ganger sitt eget volum av 0,1 M natriumfosfat, pH 6,0.

Oppløsningen ble klargjort ved sentrifugering ved 10 000 x g i 30 min og ble satt på en 9 x 72 mm kolonne av CM-Sephadex C-50 (Pharmacia) bragt til likevekt med den samme buffer. Kolonnen ble sekvensielt eluert med 0,15, 0,5 og 2 M NaCl hver i 0,1 M natriumfosfat, pH 6,0, og fraksjonene ble undersøkt for protease-induserende aktivitet.

0,5 M NaCl-eluatet fra CM-Sephadex-kolonnen, som inneholdt den protease-induserende aktivitet, ble konsentrert på en 0,5 ml heparin-Sepharose-kolonne. Denne kolonne ble eluert sekvensielt med 0,5 ml vaskinger med 2 M NaCl i 60 mM natriumfosfat, pH

6,0. All aktivitet ble eluert i den første 1 ml. Dette eluat ble kjørt på en FPLC Superose-12-kolonne (Pharmacia) i 2 M NaCl, 60 mM natriumfosfat, pH 6,0 med en strømningshastighet på 0. 5 ml/min.

En angiogen faktor, som den angiogene faktor fremstilt ifølge de foreliggende krav var i hovedtrekk homolog med ble isolert fra dette eluat. Denne angiogene faktor blir referert til delvis i dette eksempel som "proteinet" eller "proteinene".

B. Karakterisering av protein og konfirmasjon av

angiogen faktor- eaenskaper

1. NaDodS04-PAGE

NaDodSC>4 polyakrylamid-geler med 3% stacking-geler og

10-18% gradient resolving-geler ble laget og kjørt ifølge Laemmlis fremgangmåte, som beskrevet i Nature 277: 680-685 (197 0), som det spesielt vises til her. Proteinene ble detektert med sølvfargingsprosedyren til Wray et al, som beskrevet i Anal. Biochem. 118: 197-203 (1981). De aktive fraksjoner fra denne kolonne inneholdt et enkelt bånd på NaDodSO^-PAGE med en molekylvekt på 18700.

2. Protein-bestemmelse

Proteinkonsentrasjon ble bestemt med Bio-Rad-proteinassay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) ved bruk av bovint serumalbumin som standard. Sekvensinformasjonen for dette protein blir beskrevet i eksempel 4.

3. Mitogene egenskaper - 12<5>I-iododeoksyuridin-inkorporering

Bovin-kapillær endotel (BCE) celler ble isolert fra nyrebarken på nylig slaktede årskalver ved metoden beskrevet av Folkan et al. som rapportert i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76: 5217-5221

(1979) , som det spesielt vises til her. Cellene ble dyrket til konfluens i alfa Minimal Essential Medium (MEM) som inneholdt 10% (v/v) kalveserum og supplert med medium kondisjonert av musesarcoma 180-celler som beskrevet av Gross et al. i J. Cell Biol. 95: 974-981 (1982), som det spesielt vises til her. Når kulturene når konfluens, ble mediet erstattet med MEM som inneholdt 5% kalveserum og ingen kondisjonerende faktorer.

Konfluente kulturer av BCE-celler ble vedlikeholdt i MEM med 5% kalveserum i 7 dager. Mediet ble så erstattet med frisk MEM som inneholdt 5% kalveserum og varierende konsentrasjoner av renset placenta angiogen faktor. Etter 20 timer ble mediet erstattet med Dulbeccos Modified Eagle's medium som inneholdt 5% kalveserum og 0,3 uCi/ml <125>I-iododeoksyuridin (2000 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). Etter en 16 timers inkubasjon i merkningsmediet ble merkningen avsluttet med vasking av cellene med kaldt fosfatbuffret saltvann. Inkorporering av <125>I-iododeoksyuridin i det syreuløselig materiale ble bestemt ved inkubering av cellene i kald 5% trikloreddiksyre (TCA) i 30 min, vasking to ganger med 5% TCA og destillert vann. Det TCA-uløselige materiale ble løst i 0,25 N NaOH og talt i en Packard 5210 gamma scintillasjonsteller.

4. Migrasjonsmålinger

Migrasjonsmålinger ble utført i 200 ul blindbrønner (Nucleopore, Pleasanton, CA) ifølge metoden til Castellot som beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 5597-5601, som det spesielt vises til her, ved bruk av 5 p porestørrelse polykarbonat PVP-frie filtere precoated med gelatin og fibro-nektin. Ti-fold serielle fortynninger av den rensede protease-induserende faktor i MEM inneholdende 0,5% føtalt kalveserum ble plassert i bunn-brønnene. Filtrene ble satt inn og 5 x

10<4> BCE-celler i 200 ul MEM med 0,5% føtalt kalveserum ble tilsatt til de øvre brønner. Etter en 4 timers inkubasjon ved 37°C ble mediet i de øvre brønner fjernet og cellene på den øvre overflate av filtrene ble forsiktig skrapt av med en

bomullsdott. Filtrene ble fjernet, tørket ved romtemperatur, og farget med Wright-Giemsa-farging (Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ). Det totale antall celler på den nedre filteroverflate ble talt med et lysmikroskop (400X forstør-relse) .

5. Målemetode for induksjonen av PA og kollagenase

Konfluente kulturer av BCE-celler som var vedlikeholdt i minst to dager i MEM inneholdende 5% kalvserum ble byttet over i friskt MEM inneholdende 5% kalveserum og testsubstansen. Etter inkubering ved 37°C i 24 timer ble mediet fra kulturene oppsamlet og kollagenase ble bestemt som beskrevet av Moscatelli et al. i Cell 20: 343-351 (1980), som det spesielt vises til her. All kollagenase var i en latent form og ble aktivert med trypsin for å bestemme aktiviteten. Cellelagene fra de samme kulturer ble vasket to ganger med kaldt, fosfatbuffret saltvann og ble ekstrahert med 0,5% (v/v) Triton X-100 1 0,1 M natriumfosfat, pH 8,1, og PA-aktivitet i celle-ekstraktene ble målt som beskrevet av Gross et al., se ovenfor. Forsøk har vist at mengden av PA i celle-ekstrakter er proporsjonal med mengden funnet i behandlet medium. En enhet protease-induserende aktivitet ble definert som mengden nødvendig for å gi halv maksimal stimulering av PA og kollagenasesyntese.

Eksempel 2

Rensing av en angiogen faktor fra humant placentalt vev

Metoden benyttet i eksempel 1 ble fulgt for å oppnå et eluat påsatt den andre heparin-Sepharose-kolonne. Denne kolonne ble vasket med 0,95 M NaCl i 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, og så eluert med 2 M NaCl i samme buffer.

2 M-eluatet ble dialysert mot 0,2 M NaCl/20 mM MES, pH 6,0. Dialysatet ble så klargjort ved sentrifugering ved 100 000 x g i 60 min og ble så satt på en Mono-S-kolonne i et Fast Protein

Liquid Chromatography (FPLC)-system. Kolonnen ble vasket med 0,2 M NaCl/20 mM MES, pH 6,0 og så eluert med en 0,2-2 M NaCl-gradient i 20 mM MES, pH 6,0. Fraksjonenes protease-induserende aktivitet ble så målt. Den protease-induserende aktivitet eluerte ved 0,45-0,6 M NaCl.

Eksempel 3

Rensing av en angiogen faktor fra hepatom-celler

Alle rensetrinnene unntatt FPLC-trinnene ble utført ved 4°C. SK-Hep-l-celler (American Type Culture Collection (ATCC) Accession No. HTB 52) fra konfluente monolag ble skrapt inn i kald PBS og pelletert ved sentrifugering ved 400 x g i 10 min. Cellepelleten ble suspendert i 10 volumer PBS/0,5 M NaCl og sonikert i 3 min ved 50 W i en Branson-sonikator (Plainview, N.Y.). Ekstraktet ble sentrifugert (10 000 x g, 1 time), og supernatanten bevart. Pelleten ble resuspendert i 1 volum av PBS/0,5 M NaCl, sonikert og sentrifugert.

De to supernatanter ble samlet og kjørt gjennom en 28 x 75 mm kolonne av heparin-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert med PBS/0,5 M NaCl. Kolonnen ble vasket med 0,5 M NaCl/3 mM EDTA/100 mM Tris, pH 7,5 og eluert med en 0,5-2 M NaCl-gradient i den samme buffer. Fraksjonenes PA-induserende aktivitet ble bestemt, og de aktive fraksjoner ble samlet og fortynnet med 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5 inntil ledningsevnen ble 20 mmho.

Det aktive materiale ble så kjørt gjennom heparin-Sepharose-kolonne nr. 2 (10 x 75 mm) ekvilibrert med 0,5 M NaCl i 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5. Kolonnen ble deretter vasket, først med 0,5 M NaCl og så med 0,9 M NaCl i 3 mM EDTA/20 mM Tris, pH 7,5, og ble eluert med en 0,9-2 M NaCl-gradient i den samme buffer. De aktive fraksjoner ble konsentrert på en tredje heparin-Sepharose-kolonne (7 x 85 mm), som var vasket med 0,5 M NaCl og deretter eluert med 2 M NaCl, begge i 20 mM MES, pH 6,0. De aktive fraksjoner fra den tredje heparin-Sepharose-kolonne ble fortynnet 1:10 med 20 mM MES, pH 6,0, og løsningen ble klargjort ved sentrifugering ved 100 000 x g i 1 time.

Denne ble så satt på en Mono-S FPLC-kolonne (Pharmacia) ekvilibrert med 0,2 M NaCl/20 mM MES, pH 6,0. Kolonnen ble vasket med 0,2 M NaCl og elusjon ble oppnådd med en multilineær gradient av NaCl (0,2-2 M i 20 mM MES, pH 6,0). Fraksjonenes PA-induserende aktivitet ble målt og de aktive fraksjoner ble samlet og renhet bestemt ved NaDodS04~PAGE.

Eksempel 4

Bestemmelse av aminosyresekvensen fra placental angiogeneses faktor (PAF) isolert fra human placenta

A. LYS- C- peptider

Renset PAF i 20 mM MES, pH 6,0, 0,5 M NaCl ble fremskaffet ved metoden i eksempel 2 ovenfor. Det native protein ble utsatt for fordøyelse med endoproteinase Lys-C som følger: En reaksjonsblanding inneholdende 2 nmol av nativt protein i 350 ul av 20 mM MES, pH 6,0, 0,5 M NaCl ble justert til pH 8,7 ved tilsetting av 15 ul 2 M NH4HCO3, pH 9,0. 1,17 enheter av endoproteinase Lys-C (Boehringer) ble tilsatt og fordøyelse ble utført ved 37°C i 7 h og 30 min. 2-merkaptoetanol ble så tilsatt til en endelig konsentrasjon av 1% (v/v) og inkuberingen fortsatt i 15 min ved 37°C. Trifluoreddiksyre (TFA) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon av 0,1% (v/v) før fraksjonering av fordøyelsesblandingen ved revers fase high performance liquid chromatography (HPLC) ved bruk av en Synchrom RP-8-kolonne. Peptidene ble eluert fra kolonnen (strømningshastighet 1,0 ml/min) med 0,1% TFA i vann (5 min) fulgt av en lineær gradient av acetonitril gjort 0,1% i TFA (0-60% acetonitril over 60 min). Elueringen av peptidene ble fulgt ved <A>215 og <A>28OOQ passende fraksjoner samlet manuelt.

Et peptid som eluerer ved 19% acetonitril ble sekvensert ved automatisert Edman-degradering og gav følgende sekvens:

I denne og følgende sekvenser er et aminosyreresidium som er vist i parenteser, et residium som ikke uomtvistelig er blitt identifisert.

Et peptid som eluerer ved 19,8% acetonitril, ble sekvensert og gav følgende resultat:

Et annet peptid fra det samme digerat eluerte ved 17,5% acetonitril og gav følgende aminosyresekvens:

Et peptid som eluerte ved 26% acetonitril ble utsatt for automatisert Edman-degradering og gav følgende aminosyresekvens :

To ytterligere peptider som eluerte sammen ved 16% acetonitril, ble oppsamlet som en blanding og deretter nyrenset før sekvensering. Den samlede peptid-blanding ble tørket under vakuum, deretter resuspendert i 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 8 M urea. 20 nmol av ditiotreitol (DTT) ble tilsatt og

reduksjonen av mulige disulfid-bindinger ble tillatt å skje i

15 min ved 37°C. Peptidene ble deretter karboksymetylert ved

tilsletning av 60 nmol <3>H-iodoeddiksyre, og blandingen inkubert i 20 min i mørket ved romtemperatur. I tillegg ble 60 nmol DTT tilsatt, fulgt av en 30 min's inkubasjon ved romtemperatur, deretter ble reaksjonsblandingen justert til 0,1% TFA før

nyfraksjonering ved HPLC ved bruk av en Altex C-3 omvendt fase-kolonne. Peptidene ble eluert (strømningshastighet 1 ml/min) fra kolonnen med 0,1% TFA i vann (5 min), fulgt av en lineær gradient av acetonitril gjort 0,1% i TFA (0-60% acetonitril over 120 min).

Peptidet som eluerte ved 13% acetonitril, ble utsatt for automatisert Edman-degradering og gav følgende sekvens:

B. SMP- peptider

Tilleggspeptider ble generert ved fordøyelse av det native PAF-protein med mus-submaksillær-protease.

En oppløsning som inneholdt 2 nmol protein i 35 0 ul 20 mM MES, pH 6,0, 0,5 M NaCl ble justert til pH 8,0 ved tilsetning av 25 ul 1 M NaHCC>3, pH 9,0. Submaxillaris-protease (3,6 ug) ble tilsatt og fordøyelsen ble tillatt å gå i 24 timer ved 37°C. 90 nmole DTT ble tilsatt og inkuberingen ved 37°C fortsatt i 30 min. Karboksymetylering av peptidene ble oppnådd ved tilsats av 360 nmol ^H-iodoeddiksyre og inkubering ved romtemperatur i 20 min i mørket. 360 nmol DTT ble så tilsatt og reaksjonsblandingen justert til 0,1% (v/v) i TFA før fraksjonering av peptidblandingen med RP-8 HPLC som beskrevet ovenfor.

En blanding av peptider som eluerte ved 12% acetonitril ble samlet i én fraksjon, tørket og resuspendert i 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 M urea og deretter fraksjonert ved HPLC ved bruk av en Altex C-3-kolonne og den samme elueringsprotokoll som beskrevet ovenfor for nyopprensing av Lys-C-peptider.

To peptider som eluerte ved (a) 14,8% acetonitril og (b) 15,3% acetonitril, ble utsatt for automatisk Edman degradering og gav følgende aminosyresekvenser:

En rekke peptider ble generert ved digerering av det native PAF med S. aureus protease (V8). 1 mol protein i 500 ul 20 mM Tris-HC1, pH 7,5, 2 M NaCl ble avsaltet ved HPLC ved bruk av en RP-8 omvendt fase-kolonne. Den saltfrie, protein-holdige fraksjon ble tørket inn, resuspendert i 50 |il 50 mM eddiksyre, pH 4,0 og 1 ug V8 protease ble tilsatt. Fordøyelsen ble utført i 18 timer ved 37°C. Peptidene ble fraksjonert ved HPLC ved bruk av en RP-8 omvendt fase-kolonne som beskrevet ovenfor.

Et peptid som eluerte ved 17% acetonitril, ble utsatt for automatisert Edman-degradering og gav følgende aminosyresekvens:

Et tilleggspeptid fra V8-fordøyelsesblandingen som eluerte ved 20% acetonitril, ble også sekvensert og gav følgende resultat:

Et V8-peptid som eluerte ved 21% acetonitril, ble sekvensert med følgende resultat:

Ordning av alle aminosyresekvensene listet ovenfor fører til en kjernesekvens for den humane grunnleggende fibroblast-vekstfaktor som følger:

Tilleggspeptider ble isolert og utsatt for automatisert Edman-degradering. Disse aminosyresekvenser er utenfor kjerne-aminosyresekvensen listet ovenfor.

Et peptid som eluerte ved 13% acetonitril ved fraksjonering av submaxillaris-digeratet (se ovenfor), gav følgende aminosyresekvens:

Et LYS-C-peptid som eluerte ved 20% acetonitril, gav følgende aminosyresekvens:

Eksempel 5

Identifikasjon av de karakteristiske egenskaper for den angiogene faktor som gjør den passende for klinisk bruk, som et terapeutisk agens.

Vi har vist at faktoren fra placenta, isolert ved metoden i eksempel 1 eller 2, og faktoren isolert fra hepatoma-celler, har alle tre av de in vitro-egenskaper forutsagt for en angiogen faktor. For det første stimulerer molekylet syntesen av PA og latent kollagenase i BCE-celler ved konsentrasjoner i området fra 0,1 til 10 ng/ml. PA kan omdanne zymogen plasminogen til aktivt plasmin, en protease med bred spesifisitet. Plasminet kan også omdanne latent kollagenase til aktiv kollagenase. Således kan kapillar endotel-celler under påvirkning av lave konsentrasjoner av denne faktor generere minst to proteaser som er i stand til å degradere flesteparten av proteinene i det omliggende vev, noe som ville tillate cellene å trenge gjennom dette vev.

Det rensede molekyl stimulerte PA og kollagenase-syntese i BCE-celler på en dose-avhengig måte (fig. 3A). All kollagenase var i en inaktiv form. Kollagenolytisk aktivitet ble detektert etter trypsin-behandling. Både PA og latent kollagenase blir stimulert i parallell. Halv maksimal stimulering oppsto med en konsentrasjon av protease-induserende faktor på 1 ng/ml. Basalmengden av PA og kollagenase produsert av ubehandlede celler varierte fra eksperiment til eksperiment, og derfor varierte også graden av stimulering. Med svært høye konsentrasjoner av protease-induserende faktor ble stimuleringen av PA-syntese redusert, det ble også kjemotaktisk og mitogen aktivitet. Inkubasjon av BCE-celler i 24 timer med konsentrasjoner av protease-induserende faktor som induserte PA og kollagenase, endret morfologien av cellene fra deres typiske brostenslignende utseende til et mer avlangt, spindel-formet utseende.

For det annet er faktoren kjemotaktisk for BCE-celler. In vivo vil derfor kapillære endotel-celler bli stimulert til å migrere mot faktorkilden. Tilsats av faktoren ved konsentrasjoner mellom 0,001 og 0,1 ng/ml stimulerte BCE-celle kjemotaksi i blindbrønnkamre. Med høyere konsentrasjoner skjedde ikke stimulering av kjemotaksi. Økt celleforflytning fra det øvre kammer til det nedre kammer ble detektert bare når det nedre kammer inneholdt en høyere konsentrasjon av faktoren enn det øvre kammer, noe som viser at ekte kjemotaksi forekom. Kjemokinese var ikke dekkende for mer enn 25% av den observerte økte motilitet.

For det tredje er faktoren mitogen for BCE-celler. Fig. 3B viser at tilsats av den protease-induserende faktor til kulturer av BCE-celler stimulerte inkorporeringen av <125>j_ iododeoksyuridin inn i DNA på en dose-avhengig måte. Ved høyere konsentrasjoner av protease-induserende faktor ble denne stimulerende effekt signifikant redusert. Stimulering av <125>j_ iododeoksyuridin-inkorporering ble oppnådd med de samme konsentrasjoner av faktor som var i stand til å indusere PA og kollagenase. Vi har tidligere bestemt at med rå placenta-sonikat korrellerer økt inkorporering av <125>I-iododeoksyuridin i DNA med andre målinger av mitogenese. Således oppfører denne faktor seg som et trofast endotelcelle-mitogen, og derfor synes et enkelt renset molekyl å ha evnen til å indusere PA og kollagenase i BCE-celler, å stimulere deres replikasjon og å stimulere deres motilitet.

Eksempel 6

Angiogenese-aktivitet

Ved bruk av metoden beskrevet av Dunn et al., som publisert i Anat. Ree. 199: 33-42 (1981), for bestemmelse av angiogense, stimulerte angiogenese-faktoren fra eksempel 2 angiogenese i 81% av eggene ved en dose på 65 ng, plassert på kyllingens chorioallantoide membran.

Eksempel 7

a) N- terminal aminosvresekvens av PAF

Human placental angiogenesefaktor ble renset som tidligere

beskrevet (se eksemplene 1 og 2). Det rensede protein i 20 mM MES-buffer, pH 6,0 og 500 mM NaCl ble avsaltet ved high performance liquid chromatography ved bruk av en RP-8 omvendt fase-kolonne. 250-500 pmol avsaltet protein ble satt på en ABI 47OA gassfase-proteinsekvensator for automatisk Edman-degradering. De resulterende PTH-aminosyrer ble identifisert ved "high performance liquid chromatography" ved bruk av en cyano omvendt fase-kolonne.

Disse eksperimenter resulterte i etableringen av en N-terminal aminosyresekvens for PAF som følger:

I tillegg ble den N-terminale PAF-aminosyresekvens nettopp beskrevet også identifisert ved automatisert Edman-degradering av et Lys-C-peptid som eluerte ved 23% acetonitril i det kromatografiske system beskrevet i eksempel 4, A.

b) C- terminal aminosyresekvens av PAF

Et C-terminalt PAF-peptid ble isolert fra PAF Lys-C-digerat som

beskrevet i eksempel 4. Peptidet eluerte ved 22% acetonitril. Automatisert Edman-degradering av dette peptid gav følgende aminosyresekvens:

Ved å kombinere sekvensdataene fra (i) eksempel 4; (ii) den N-terminale aminosyresekvens av PAF; (iii) den C-terminale aminosyresekvens av PAF; og (iv) cDNA, er en komplett aminosyresekvens for PAF som følger:

1. PAF form 1

2. PAF form 2: N- terminalt blokkert PAF

Fra en serie eksperimenter hvori renset og intakt PAF ble utsatt for automatisert Edman-degradering, ble det klart at en fraksjon av det anvendte protein (50-80%) ikke blir degradert i Edman-prosedyren.

Det konkluderes derfor med at det eksisterer en fraksjon PAF-proteinmolekyler som er N-terminalt blokkert.

Blokkeringsgruppens karakter blir klarest bestemt ved studier av rensede aminoterminale PAF-peptider. Aminoterminale peptider fra enzymatiske degraderinger av PAF (se eksempel 4) ble identifisert ved aminosyreanalyse. De kan også identifiseres ved papirelektroforese eller tynnskiktskromatografi, fulgt av farging med klor/o-tolidin-reagenset som beskrevet av Reindel, F. and Hoppe, W. (1954) i Chem. Ber. 87, 1103-1107, som det spesielt vises til her. (Blokkerte peptider detekteres ikke med ninhydrin (bortsett fra en svak fremkalling av farge med side-kjedene på lysinresidier) uten at de først er hydrolysert).

I tillegg kan små N-terminalt-blokkerte PAF-peptider isoleres ved kromatografi av surgjort termolysin eller pepsin PAF-digerater på Dowex 50, X2 (H+<->form) som beskrevet av Narita et al. (1975) i Protein Sequence Determination, pp. 30-103, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York eller ved kromatografi på sulfoetyl-Sephadex, som beskrevet av Kluh, I.

(1979) i Coll. Czech. Chem. Comm. (Engl. Ed.) 44, 145,147, som det spesielt vises til her.

Strukturen av de korte blokkerte peptider bestemmes ved et utvalg av standard prosedyrer og metoder. Se f.eks. Allen, G.

(1981) i Sequencing of Proteins and Peptides; North Holland Publishing Company, Amsterdam, New York, Oxford eller refe-ranser diskutert der, som som det spesielt vises til her. Disse prosedyrer og metoder inkluderer digerering av N-terminalt blokkerte peptider med karboksypeptidaser, pyroglutamat-aminopeptidase, hydrazinolyse, massespektrometri, nukleær-magnetisk resonansspektrometri, gasskromatografi og fast-atom bombardment massespektrometri som beskrevet av Boissel et al.

(1985) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 8448-8452.

3. PAF form 3: Trunkert oa utvidet PAF

Det er blitt vist at bovin nyrefibroblast-vekstfaktor (FGF) mangler et antall aminosyrer fra N-terminalen. (Baird, A. et al. (1985); Regul. Pept., in press) (Gospodarowicz, D. (1986) Meth. Enzymol., in press). Den trunkerte fibroblast-vekstfaktor beholder sin evne til å binde seg til FGF-reseptoren, som vist av Neufeld, G. og Gospodarowicz, D. (1985) i J. Biol. Chem.

260, 13860-13868, noe som indikerer at N-terminalen av proteinet ikke spiller noen viktig rolle i interaksjonen av FGF med dens celleoverflate-reseptor. Derfor forventes det at både trunkerte og utvidede former av PAF vil beholde reseptor-bindingsaktiviteten. Den maksimale N-terminale PAF-avkutting eller -utvidelse som fremdeles tillater biologisk PAF-aktivitet, gjenstår å bli bestemt.

Eksempel 8: En cDNA- klon av PAF

SK-HEP-l-celler ble dyrket i Eagles Minimal Essential Media supplert med 10% føtalt kalveserum, ikke-essensielle aminosyrer og Pen-Strep. RNA ble isolert fra celler ved bruk av NP-40-lyseringsprosedyren som beskrevet av Maniatis et al. i Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, pp. 191-193), som det spesielt vises til her. Poly (A)<+> mRNA ble valgt ved oligo dT-kromatografi (BRL) ved bruk av prosedyren til H. Aviv og P. Leder beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1972, 1408, som det spesielt vises til her. 5 ug mRNA ble brukt for å syntetisere 8 ug dobbelttrådet cDNA ved bruk av oligo dT primet 1. tråds syntese og RNase H-DNA-polymerase-mediert 2. syntese som beskrevet av Gubler og Hoffmann i Gene, 25 (1983) 263-269, som det spesielt vises til her. Amersham-reagenser ble brukt i denne prosedyre. De følgende reaksjoner, med mindre noe annet er angitt, ble utført ifølge fabrikantens spesifikasjoner. Dette cDNA ble "blunt ended" ved bruk av 10 enheter T4 DNA-polymerase (Amersham). EcoRI-seter ble beskyttet med 400 enheter EcoRI-metylase (New England Biolabs) og 100 mM S-adenosyl-metionin. En lik massemengde EcoRI-linkere (New England Biolabs, 8 mer) ble tilkoblet med 1 enhet T4 DNA-ligase (Promega Biotec). Overskudd av linkere ble fjernet ved digerering med 200 enheter EcoRI (New England Biolabs), og

100 ng av dette cDNA ble ligert inn i 1 ug EcoRI-digerert, alkalisk fosfatase-behandlet lambda gt-10 DNA (Vector Cloning Systems). DNA'et ble pakket in vitro (Vector Cloning Systems), og når plated på E. coli stammen C600 HFLa resulterte i 8,2 x 10<5->rekombinanter.

Design av oligonukleotid-prober

To blandede sekvens-oligonukleotid-prober ble brukt for iso-leringen av SK-HEP-1 cDNA-klonen. Probene består av samlinger av alle mulige DNA-sekvenser for en gitt aminosyresekvens. Probene ble laget for å selektere aminosyresekvenser i kjerne-PAF-aminosyresekvensen beskrevet i denne søknad.- Probe nr. 5 ble hybridisert til DNA kodende for aminosyresekvensen Ile-Lys-Gly-Val-Cys-Ala, og er en 17-mer bestående av 192 sekvenser:

192-fold degenerert, 17 mer

Kode X = A, T, G eller C

N = A eller G

Y = T eller C

Z = T, C eller A

Probe nr. 8 ble hybridisert til DNA kodende for aminosyresekvensen Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe, og er en 20-mer bestående av 25 6 sekvenser:

256-fold degenerert, 20-mer

Begge probene ble syntetisert på en Applied Biosystems DNA-syntesizer. De ble gel-renset og radiomerket med [7 -32p] ATP (Amesham) ved bruk av T4 polynukleotid kinase (Pharmacia) til en spesifikk aktivitet på 4-6 x 10^ cpm/pmol.

Hybridiseringstemperaturene ble valgt til 2°C under det beregnede Tm for det mest AT-rike medlem av hver samling som beskrevet av S. V. Suggs et al., (Developmental Biology Using Purified Genes (forl. D. D. Brown and C. F. Fox), 683-693

(1982) Academic Press, New York), som det spesielt vises til her. Den endelige vasking ble utført ved den beregned Tm for det mest AT-rike medlem av samlingen (dvs. 2°C over hybridi-seringstemperaturen).

Sortering

cDNA-biblioteket ble platet ved en tetthet på 50 000 plaques pr. 150 mm Luria-Bertoni-agarplater med E. coli C600 HFLa-celler og NZCYM-topp-agarose (0,7%). Fag DNA ble overført til duplikate nitrocellulosefiltere (Schleicher og Schuell, BA 85) og klargjort for hybridisering som beskrevet av Benton og Davis i Science, 196: (1979) 180-182, som det spesielt vises til her. Filtrene ble prehybridisert ved 48°C i 2 h i en oppløsning inneholdende 6X SSC (20X SSC er 3M NaCl, 0,3 M natriumcitrat, pH 7,5), 2X Denhardts oppløsning (100X Denhardts oppløsning er 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrrolidon og 2% BSA), 0,1% SDS, 0,05% natriumpyrofosfat og 100 mg/ml gjær tRNA. Probe nr. 8 ble tilsatt til 0,2 pmol/ml og tillatt å hybridisere i 16 h. Etter hybridisering ble filtrene vasket som følger: tre ganger i 15 min hver med 6X SSC og 0,1% SDS ved omgivelsetemperatur fulgt av en endelig 8 min's vask ved 50°C. Filtrene ble så tørket og autoradiografert i 24 h på Kodak XAR5-film og en "lightening plus" forsterkningsskjerm ved -70°C. Plaques som gir positive signaler ved duplikate filtere, ble plukket ut for opprensing. Disse plaques ble så testet med probene nr. 5 og nr. 8 i en annen runde med opprensing og en plaque som hybridiserte til begge prober, ble valgt som den beste kandidat til å kode for angiogenese-faktoren.

DNA ble preparert fra denne fag ved platelysater og formamid-ekstraksjon som beskrevet av R. W. Davis, D. Botstein og J. R. Roth i Advances Bacterial Genetics: A Manual for Genetic Engineering (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980), som det spesielt vises til her. En EcoRI-fordøyelsesblanding av dette DNA frigjorde en 1,1 kb innsatsbit med størrelsen målt i en 1% agarosegel. Denne innsatsbit ble renset ut av en 5% akrylamidgel for subkloning som beskrevet av Maniatis et al., se ovenfor, 173-179. Innsatsbiten ble ligert inn i EcoRI-digerert bakteriofag M13 mp 19 RF DNA, og dets sekvens ble bestemt ved bruk av dideoksynukleotid-metoden til Sanger et al. beskrevet i J. Mol. Biol. 94, 441 (1975), som det spesielt vises til her. Analyse av den fremskaffede sekvens viste en åpen leseramme kodende for den primære struktur av PAF.

Basert på proteinsekvensdata (se eksempel 7) og publisert FGF-informasjon (Esch et al. (1985); Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 6507-6511) synes det som om flere aktive PAF-former kan dannes: Form 1 PAF (se også eksempel 7) kan produseres fra dette DNA ved initiering av translasjon ved et punkt 5' for sekvensen AGTMAA... og derpå følgende post-translasjons-splitting av AG-bindingen ved en prosess som enda ikke er bestemt. I tillegg kan en form 3 PAF produseres ved initiering av translasjon ved MAA-sekvensen, siden dette er et konsensus-initieringssete (M. Kozak, Microbiol. Rev. 1983, bind 47, 1-45) med valgfri proteolytisk fjerning av Methionine. Form 3 PAF kan også produseres ved initiering ved andre funksjonelle initieringsseter. Disse seter kan lett skjelnes fra hverandre av en med vanlige kunnskaper i faget, i særdeleshet i lys av lærdommen inneholdt her. I tillegg kan post-translasjonell prosessering av det første translasjonprodukt følge etter dette, selv om slik prosessering ikke er nødvendig. Form 2 PAF kan også produseres fra form 1 eller form 3 av PAF ved en hittil ukjent prosess som fører til blokkering av den frie aminogruppe ved N-terminalen.

Eksempel 9: Uttrykk av PAF

Prinsippet for uttrykk av PAF er som følger. Et 1,1 kb EcoRI-fragment isolert fra lambda gtlO-klonen kan subklones inn i plasmidet pUC9. Dette fragment inneholder alle de PAF-kodende sekvenser. To mindre fragmenter fra denne subklon er til nytte i konstruksjonen av ekspresjonssystemer. Det ene er et 367 bp Aval til BamHI-fragment som inneholder aminosyreresidiene 17 t.o.m. 137 av den PAF-kodende sekvens, ved å telle GTMAA-residiene av det placentale form 1-protein som 1-5. Det andre er et 405 bp Ncol til BamHI-fragment som inneholder aminosyreresidiene 4 t.o.m. 137 av den PAF-kodende sekvens. Syntetiske adaptorer kan så kobles til for å fullføre den kodende sekvens ved begge ender av disse restriksjonsfragmenter for å gi translasjons-initiering, terminering eller koblende sekvenser og for å bibringe sekvensene som er nødvendige for kobling til en passende ekspresjonsvektor.

PAF isolert fra human placenta inneholder en sekvens som starter med GTMAA. cDNA-klonene isolert fra SK-Hep-l-celler indikerer at andre former for PAF kan syntetiseres, startende minst 100 aminosyrer oppstrøms for GTMAA-sekvensen, eller startende med MAA. Den placentale form ble valgt for ekspresjon i gjær (S. cerevisiae) og bakterier (E. coli). Den potensielle SK-Hep-l-form og enhver annen aminoterminalt trunkert form kan uttrykkes ved små modifikasjoner av prosedyrene beskrevet nedenfor, som bør være innlysende for en fagmann. De består av endring av de syntetiske adaptere brukt til å koble den aminoterminale ende av cDNA-fragmentet (enten Ncol-setet eller Aval-setet) til ekspresjonsvektorene. Alternativt kan plasmider som uttrykker trunkerte former, konstrueres fra GTMAA-formene beskrevet nedenfor ved oligonukleotid-dirigerte deletion mutagenese (som beskrevet av M. Inouye, K. Nakamura, S. Inouye og Y. Masui i "Nucleic Research Future Development",

K. Mizobuci, I. Watanabe og J. D. Watson, fori., Academic Press, New York, pp. 419-436, 1983, som det spesielt vises til her.

Adaptorer

De følgende adaptorer ble syntetisert på en Applied Biosystems DNA synthesizer og gelrenset. De 5'-endene ble fosforylert med T4 polynukleotidkinase (Pharmacia). Par av komplementære oligonukleotider ble sammensmeltet som følger for å danne den dobbelttrådede adaptor. Ekvimolare mengder av hver oligonukleotid ble tilsatt til en løsning av 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 og 1 mM EDTA. Denne oppløsning ble oppvarmet i et kokende vannbad. Vannbadet ble så fjernet fra varmen og tillatt å kjøles ned til omgivelsetemperatur i løpet av 2 h. Det følgende er en liste og beskrivelse av adaptorene som ble benyttet.

Eksempel 10: Konstruksjon av aiær- ekspresionsplasmider En plasmid, pGS185, avledet fra pUC 8, men manglende restrik-sjonsseter i polylinkeren fra Hind III-setet til Smal-setet ble konstruert ved å fordøye pUC 8 med Hind III, fulgt av ligering til et Hind III/SmaI-adaptor (Amersham, Kat. nr. DA1006), som ikke rekonstruerer Hind III-setet, fordøyelse med Smal og ligering i fortynnet løsning (1 ng/ml), fulgt av transformasjon av E. coli JM 83. Det riktige plasmid ble identifisert ved å fordøye plasmid DNA isolert fra transformantene med EcoRI, Smal eller Hind III. En transformant inneholdende et plasmid som manglet Hind III-setet, men inneholdt EcoRI-sete og Smal-sete, ble identifisert på denne måte.

Et EcoRI-fragment inneholdende gjær MF 1-genet ble renset ved gel-elektroforese fra plasmidet pCY17 som beskrevet av J. Kurgan og I. Herskowitz i Cell 30:933 (1982) og ligert inn i EcoRI-kuttet pGS185. Denne ligeringsblanding ble brukt til å transformere E. coli HB101 ved å selektere for ampicillin-resistens. Plasmid DNA ble isolert fra transformantene og nærværet av den korrekte innsatsbit fastslått ved å fordøye DNA med EcoRI. Dette er plasmid pGS285.

Plasmid pGS285 ble fullstendig fordøyd med Hind III og re-ligert under fortynnede forhold (1 ng/ml) for å eliminere tre av de fire interne Hind III-seter i MF 1-genet som observert av Kurjan og Herskowitz, ibid. Den korrekte konstruksjon ble utvalgt som beskrevet ovenfor. Dette er plasmid pGS385.

For sete-rettet mutagenese ble MF 1-genet fjernet fra pGS385 ved fordøyelse med EcoRI, gelrenset (1,5 Kb) og ligert til EcoRI fordøyd M13 mpl8 RF. Ligeringsblandingen ble brukt for å transformere E. coli 71-18, og kloner inneholdende MF 1-genet i riktig orientering ble identifisert ved hybridisering til det [<32>P] merkede MF 1-gen. MF 1-sekvensen ble endret fra GTA TCT TTG GAT AAA AGA til GTA AGC TTG GAT AAA AGA ved bruk av standard sete-rettede in vitro mutagenese-metoder beskrevet av Zoller og Smith (Methods in Enzymology, bind. 100, 1983, Academic Press, Inc., p. 468). Sekvensen av det mutante a-faktor-gen MFa-H ble fastslått ved dideoksysekvensering.

MFa-H-genet ble fjernet ved fordøyelse av RF-formen av M13 mpl8-klonet med EcoRI, gel-rensing av det resulterende 1,5 Kb EcoRI-fragment ved akrylamid-gelelektroforese og ligering til EcoRI-kuttet pGS185. Den resulterende ligeringsblanding ble brukt til å transformere E. coli HB101 og kolonier inneholdende plasmidene med MFa-H-genet ble så identifisert ved hybridisering med <32>P-merket 1,5 Kb EcoRI-fragment inneholdende MFa-H-genet. Dette plasmid blir betegnet pGS286.

PAF-genet ble satt inn i pGS286 som følger. Adaptorene nr. 1 og nr. 2 ble ligert til PAF NcoI/BamHI-fragmentet. Ligeringsblandingen ble elektroforisert på en polyakrylamidgel, og PAF DNA med de tilknyttede adaptorer ble identifisert ved en økning i molekylvekt. Dette korrekt adapterte DNA-fragment ble eluert fra gelen og ble ligert til Hind III/Sali digerert pGS286. E. coli HB101 ble transformert med ligeringsblandingen og ampicillinresistente kolonier ble valgt. Transformanter inneholdende plasmider med den riktige insatsbiten ble identifisert ved hybridisering med adaptorene IA og 2A, radiomerket ved inkubering med i^-^<2>?] ATP og T4 polynukleotid kinase. Et plasmid konstruert og isolert på denne måte er betegnet pGS286-PAF. Dette plasmid inneholder MFa-H-genet fusjonert, i leserammen, til PAF-genet ved Hind III-setet i "pre-pro" regionen av MFa-H-genet. Når de blir plassert i gjær, er det vist at slike konstruksjoner dirigerer syntesen, prosesseringen og sekresjonen av heterologe proteiner som vist av A. J. Brake et al., 1981 (PNAS (USA) 81:4642).

EcoRI-fragmentet inneholdende fusjonen av MFa-H-genet og PAF er PGS286-PAF. Dette fragment ble isolert ved fordøyelse med EcoRI og polyakrylamid-gelelektroforese. Det ble gjort buttendet med T4 DNA polymerase, og Pstl-adaptorer (Pharmacia) ble tilkoblet med T4 DNA-ligase. Fragmentet ble så ligert inn i Pstl fordøyet vektor pCl/1 (A. J. Brake et al. 1981) (PNAS, (USA) 81:4642) og

E. coli HB101 transformert med ligeringsblandingen og TET - kolonier ble utvalgt. Riktige konstruksjoner ble identifisert

ved hybridisering til PAF-genet. Dette plasmid ble introdusert i S. cerevisiae DBY 746 (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA) med de to micron DNA-plasmid fjernet som beskrevet av Toh-E og Wickner (Journal of Bacteriology, 145, 1981, 1421-1424) ved standard transformasjonsprotokoller. Transformanter som uttrykker PAF, ble utvalgt ved sin reaktivitet med affinitetsrenset anti-PAF IgG.

Eksempel 11: Peri<p>lasmisk sekresjon i E. coli

For å regulere uttrykket av PAF i en form egnet for eksport til periplasma i E. coli, ble de følgende regulerende elementer benyttet: en tac-promotor på plasmid pCJ-1 for initiering av transkripsjon ved høye nivåer; en lac-operator på plasmid pCJ-1 for transkripsjonsregulering; en lac-repressor (lac I), kodet på kromosomet av E. coli-linje JM107. For å fremme periplas-misk eksport av PAF ble DNA kodende for Omp A-ledepeptidet koblet til DNA kodende for PAF på en slik måte at det C-terminale Ala for dette peptid vil bli fusjonert med N-terminale Gly på PAF form 1 på en slik måte at Ala-Gly-bindingen av det første produkt vil spaltes av E. coli-ledepeptidasen for å gi det modne PAF.

E. coli sekresjonsvektoren ble konstruert som følger. Adaptorene nr. 5 og nr. 4 ble ligert til PAF Aval/BamHI-fragmentet. DNA med den riktige størrelse ble eluert fra en polyakrylamidgel og ligert til Omp A leder DNA og EcoRI/Pstl digerert M13 mpl9 RF. E. coli JM107 ble transformert med ligeringsblandingen. Transformanter inneholdende PAF-genet ble bestemt ved restriksjonskartlegging og sekvensen av konstruksjonen ble bekreftet ved dideoksysekvensering. EcoRI/Pstl-fragmentet inneholdende PAF-genet ble isolert fra RF DNA ved restriksjon med EcoRI og Pstl og eluering fra en polyakrylamidgel. Dette ble ligert inn i EcoRI/Pstl fordøyet pCJ-1 og E. coli MJ107 ble transformert med ligeringsblandingen. Kolonier som produserer PAF ble valgt ved vekst på TET-plater og immunosortering med affinitetsrenset anti-PAF IgG.

Eksempel 12: Cvtoplasmisk uttrykk i E. coli

For å regulere uttrykket av PAF i en form som gjør at PAF blir igjen i E. coli-cytoplasma, ble de følgende operasjonelle elementer brukt: tac-promotoren på plasmid pCJ-1; lac-operatoren på plasmid pCJ-1 og lac-repressoren (lac i^) på kromosomet av E. coli-linjen JM107; en konsensus Shine-Dalgarno-sekvens; og, for å initiere et høyt nivå av translasjon, et fragment fra Omp A-lederpeptidet som benyttes som en translasjonskobler. Translasjons-koblingssekvensen omfatter DNA kodende for translasjons-initieringsregionen av Omp A-genet, de første åtte aminosyrer av Omp A-lederpeptidet, konsensus Shine-Dalgarno-sekvensen beskrevet ovenfor og en translasjons-terminator. Translasjons-koblingssekvensen skal settes inn mellom lac-operatoren og translasjons-initierings-setet på PAF-genet, og overlapper den sistnevnte. (De karakteristiske kjennetegn for translasjonskobleren er innlemmet i DNA-sekvensen vist med adaptorene for sekrert uttrykk i E. coli).

PAF-genet ble innsatt i pCJ-l-plasmidet med translasjonskobleren som følger: Adaptor nr. 3 og Omp A translasjonskobler ble koblet til PAF Aval/Pstl-fragmentet fra M13 mpl9-konstruksjonen beskrevet i eksempel 11. Dette fragment ble renset fra en polyakrylamidgel. Dette fragment ble så ligert inn i EcoRI/Pstl fordøyet M13 mpl9 RF og ligeringsblandingen brukt til å transformere E. coli JM 107-celler. Plaques inneholdende PAF-genfusjonen ble valgt ved restriksjonskartlegging. Konstruksjonens sekvens ble så bekreftet ved dideoksysekvensering. EcoRI/Pstl-fragmentet inneholdende PAF-genfusjonen ble eluert fra en polyakrylamidgel og ligert inn i EcoRI/Pstl digerert pCJ-1, og E. coli JM107-celler ble transformert med ligeringsblandingen. Kolonier som viste tetracyklinresistens, ble valgt og PAF-produksjon ble bekreftet ved immunosortering med affinitetsrenset anti-PAF IgG.

Det vil være klart for fagfolk at forskjellige modifikasjoner og variasjoner av prosessene og produktene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan utføres. Derfor er det ment at den foreliggende oppfinnelse dekker disse modifikasjoner og variasjoner av denne oppfinnelse så lenge de ligger innenfor rammen av de vedlagte krav og deres ekvivalenter.

Eksempel 13: Cvtoplasmisk uttrykk i E. coli

M13- og mpl9-sekresjons-konstruksjonen beskrevet i eksempel 11 ble digerert med Nrul og Ncol og det store fragment ble eluert fra en gel. Adaptor nr. 6 ble så ligert inn i NruI/NcoI-kuttet DNA. E. coli-linjen JM107 ble transformert med ligeringsblandingen. Plaques inneholdende PAF-genfusjonen ble bekreftet ved dideoksysekvensering. EcoRI/Pstl-fragmentet inneholdende PAF-genfusjonen ble eluert fra en polyakrylamidgel og ligert inn i EcoRI/Pstl digerert pCJ-1 og E. coli JM107-celler ble transformert med ligeringsblandingen. Koloniene som viste tetracyklinresistens ble valgt og PAF-produksjonen ble fastslått ved immunosortering med affinitetsrenset anti-PAF IgG.

Adaptor nr. 6

Eksempel 14: Identifikasjon av mRNA

Total RNa ble isolert fra de følgende cellelinjer: SK HEP-1 humane hepatoma-celler, humane embryonale lunge (HEL)-celler, RPMI 7272 humane melanoma-celler og muse-sarcoma 180-celler. Poly A pluss minus budbringer RNA (mRNA) ble så isolert ved bruk av oligo (DT) cellulosekromatografi. 15 ug poly A pluss minus RNA fra hver av de ovennevnte cellelinjer ble separert ved elektroforese på en 1,25% agarose/formaldehyd-gel. Disse RNA'ene ble transformert til en zeta-probe membran. En cDNA-probe mot human basic FGF fra SK HEP-1 humane hepatomaceller (FGF15, EcoRI-innsatsbiten) ble merket med <32>P-DCTP ved "nick" translasjonsprosedyren til en spesifikk aktivitet av 8,64 X IO<8> cpm/ug. Hybridisering av <32>p<->BFGF cDNA-proben til det overførte RNA ble utført i 5 0% formamid, 6X SSC, 2X Denhardts løsning, 1% SDS, 0,05% natriumpyrofosfat og 175 ug/ml tRNA i 16 h ved 42°C. Zeta-probe-membranen ble så vasket ill hver av 0,5X SSC/1% SDS, 0,2X SSC/1% SDS, 0,IX SSC/1% SDS i 15 min ved 65°C og i 0,1X SSC/1% SDS i 15 min ved 70°C. Membranen ble så tørket og autoradiografi utført i 1 og 3 dager ved -80°C. SK HEP-l-celler, HEL-celler og RPMI 7272-celler inneholdt hver fire arter av RNA med størrelsene 8,0 KB, 4,3 KB, 2,3 KB og 1,0 KB som hybridiserte til cDNA-proben beskrevet ovenfor. cDNA-proben hybridiserte ikke til noen av RNA-spesiene fra mus-sarcoma 180-celler.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til produksjon av angiogen faktor som inneholder et enkeltkjedet polypeptid som viser i hovedtrekk homologi med den native angiogene faktor isolerbar fra humant placentalt vev, og at den angiogene faktor har i det minste ett aktivt sete med en aktivitet valgt fra gruppen bestående av mi togen aktivitet, kjemotaktisk aktivitet, evnen til å stimulere proteasesyntese og kombinasjoner av disse, karakterisert ved at den omfatter a) oppnåelse av en nukleinsyresekvens som koder for den angiogene faktor, som fortrinnsvis har aminosyresekvensen eller særlig foretrukket aminosyresekvensen (b) innsetting av nukleinsyresekvensen i en vektor med evnen til å uttrykke seg i en verts-mikroorganisme, (c) transformasjon av vektoren inneholdende nukleinsyresekvensen inn i en verts-mikroorganisme, fortrinnsvis E. coli eller S. cerevisiae, med evne til å uttrykke den angiogene faktor, (d) uttrykk av den angiogene faktor fra den nevnte transformerte mikroorganisme ved å anvende egnede operasjonelle elementer, og (e) rensing av den uttrykte angiogene faktor, fortrinnsvis ved immunologisk affinitetsrensing.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at verts-mikroorganismen er transformert med PGS286-PAF, fortrinnsvis definert som produkt av en prosess hvori MFa-H-genet er fusjonert med placenta angiogenisk faktor-genet.