PT89511B

PT89511B - Processo para a preparacao de anfiregulina, um regulador bifuncional do crescimento de celulas

Info

Publication number: PT89511B
Application number: PT89511A
Authority: PT
Inventors: Mohammed Shoyab; Greg Plowman; Vicki L Mcdonald; James G Bradley
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1988-01-25
Filing date: 1989-01-24
Publication date: 1994-02-28
Also published as: PT89511A; LU87442A1; KR890011907A

Description

Processo para a preparação de Anfiregulina, um regulador bifuncional do crescimento de células

1. INTRODUÇÃO

A presente invenção refere-se à produção e utilização de Anfirregu1ina, uma nova glicoproteína reguladora do crescimento. As proteínas da presente invenção inibem vigorosamente o crescimento de diversas linhas de células derivadas de tumor, embora promovam o desenvolvimento de células de diversas outras linhas celulares. Encontra-se descrita uma vasta gama de aplicações terapêuticas deste regulador bifuncional, incluindo, mas não se limitando, ao tratamento de ferimentos e ao diagnóstico e tratamento de carcinomas.

2. Antecedentes da Invenção crescimento e diferenciação celulares parecem ser iniciados, promovidos, mantidos e regulados por uma multiplicidade de factores estimuladores, inibidores, e sinérgicos e hormonas.

Parece que a

alteração e/ou o colapso d o mecanismo de homeoscélula é uma causa fundamental das doenças associadas ao incluindo neoplasias. Os factores de modulação do orese estão implicados numa ampla variedade de processos patológicos e fisiológicos, incluindo trandução comun celular, crescimento e desenvolvimento riogenese , resposta imunológica, hematopoiese, sobrevivênc di ferenciação celurlamação, remodulação e reparação de tecidos, a rteroscarcinomas. Justifica-se que haj um grande in em isolar , caracterizar e definir os mecanismos funciona dos factores moduladores do crescimento, devido à sua potencial utilização no diagnóst ico, prognóstico e tratamento de ca rc mas.

Para além disso, a aquisição de conhecimentos sobre factores auxiliarão na compreensão dos mecanismos básicos controlo normal do crescimento e da perda deste nas células de cancro .

factor do crescimento epidérmico (EGF ) , o factor ot de transformação do crescimento (TGFoL. ) , derivado de plaquetas (PDGF), o factor tico (FGF), o factor do crescimento ne de t ransformação do crescimento (TGF(^ co s e II do crescimento (IGF I cimen to hematοpοιético, tais como factor rescimento d o c

r )

IGF e r i

do crescimento fibroblás-
V 0 S 0	(NGF), o	factor
, 0 s	Factores	insulini-
II ) ,	os facto	res do cres-
tropoietina,	os factores

IL- 1 a 6 ) , interleucinas ( de e s timulaçao de colónias (CSF 1 interferoes ( I F N q/, ) factores e Ç·¹ d e necrose de tumor ( T N F <ác , ), leucorregulinas, oncostatina M e outros factores menos definidos constituem proteínas moduladoras do crescimento e diferenciação produzidas por uma diversidade de tipos de cé lulas, sob condições fisiológicas normais ou como resposta a tímulos exógenos. A maioria destes factores parecem actua moldes autocráticos e paracráticos . (Ver revistas: Goust

1., Câncer Res. 46, 1986, 1015-1029, Ro

1986 , 161-66; Pardee

Cance r Res. 4 7,

98 7,

488- 1 491 ; Sachs ,

Sei.

1986

40-47, Marshall

Cell

50; 1987, 5-6; Melcher e Anderson

1987, Cell 30;

987,

715-720; Clemens e M c N u r1 a η,

Bioctiem. J . 226

345-360, 1985;

, e J. Clin. Invest . 7 9,

1987; 319-326;

Sporn e Roberts

J. Clin. Invest . 7 8, 1 986,

329-332, 1986, Old Nature, 326,

1987, 330-331;

Beutler e Ce r am ι ,

N e w Enq. J . Med. 31 6, 1 987, 379-38 5; Weinstein,

J . Cell Bíochem. ,

33, 213-224; Zarling, et a 1 . , Proc. Na11. A c a d .

1987, 9739-9744;

Sporn e

T o d a r ο , N. Enq . J . Med . 3 0 3, 1 98 5,

878-880; Sporn e

Roberts

Nature 313, 1985, 745-747).

Os ésteres de forbol biologicamente activos tal como o

- 0-tetradecaηoi1-forbo1-13-acetato (TPA) são potentes promotores de tumores i n vivo e, proporcionam e modulam uma ampla variedade de respostas biológicas e bioquímicas in vivo, bem como ιn vitro (Blumberg, C r i t . Rev . loxicol . , 1 98 1, 9, 1 5 3- 1 9 7;

Slaga, Câncer Surv. 1983, 2: 595-612). E sabido que algumas yezes o TPA inibe ο crescimento da linha de células MCF-7 do adenocarcinoma da mama humana. Paca além disso, o TPA também altera a morfologia das células MCF-7, visto que as células tratadas com TPA exibem caracteristicas morfológicas de células secretoras. (Osborne, et al., J_. C h i n . Invest . 1 98 1, 67: 954-951;

V a 1e 11 e et. al., Câncer R e s. 1987, 47:1615-1620 ).

. RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à Anfirregu1ina, um novo factor regulador do crescimento celular que apresenta uma actividade bifuncional reguladora do crescimento celular, pouco vulgar. A Anfirregu1ina inibe o crescimento de células neoplásicas, embora aumente o crescimento de certas células normais.

A Anfirregu1ina é uma g 1 icoproteína extremamente hidrófila que possui um peso molecular médio de 22 500 daltons e que ocorre sob duas formas distintas, embora funcionalmente equivalentes, uma forma trincada e uma forma maior. Com excepção dos seis resíduos adicionais N-terminais existentes na forma maior, as duas formas são perfeitamente homólogas ao nível dos aminoácidos (Fig. 12). A presente invenção baseia-se parcialmente, na descoberta dos inventores de que as células MCF-7 tratadas com TPA libertam uma g1icoproteína que inibe o crescimento da linha de células A431 do carcinoma epidérmico e de outras linhas de cé lulas, mas aumenta o crescimento dos fibroblastos humanos nor5 mais e de algumas outras linhas de células.

Descreve-se a presente invenção através de exemplos nos quais se identifica e purifica até à homogeneidade a Anfirregulina, que se caracteriza completamente estruturai e funcionalmente .

Noutros exemplos, descreve-se o isolamento e a sequencia-

ção dos clones de	cADN e genómicos que	codi ficam	o precursor
da An f irregulina.	Utilizaram-se estes	clones para	p r e p a	r a r	v e c -
tores de expressão	capazes de comandar	o elevado	nível	de s	ί n -

tese da Anfirregu1ina biologicamente activa nas células hospedeiras bacterianas transformadas e nas células hospedeiras eucariótlcas transportadas.

dade de invenção que aqui se descreve engloba uma ampla varieutilização para este factor único.

BREVE DESCRIÇÃO DAS

FIGURAS

F ig

HPLC preparativa de fase inversa de penetração ig

HPLC de fase inversa semi-preparativa das fracig

3A .

HPLC analítica de fase inversa da mistura I

-previamente processada.

Fig. 30. HPLC analítica de Fase inversa da mistura II previamente processada.

Fig. 4.	Crornatografia de	percursão	em	gel	das fracções
das Fig. 3A e	3B em colunas Bio	-Sil TSK 250.	Efectuou-se	a
croma tografia	conforme descrito	na Secção	6 .	3.2,	infra.	A)	HPLC
da fracção 35	concentrada (Fig.	3A ) ; B ) HPLC	d a	fracção	36	con -
centrada (Fig.	. 3A) ; C ) HPLC da	fracção 37	c o n c e n	t r a d a ( F	íg .	3A )

D) HPLC conjunta das fracções 41 e 42 concentradas (Fig. 3B).

Fig. 5. Análise de AR e de AR S - pinid 11 -e11ia da (SPE-AR)

purificados por HPLC	de percuração em gel, em colunas Bio-Sil
TSK 250. Efectuou-se	a crornatografia conforme descrito na sec-
ção 6.3.2. infra. Os	indicadores de peso molecular utilizados

foram albumina de ovo, 43KD; quimotrips ι ηogénio A, 25 KD; ribonuclease, 14 KD; e a insulina, 6 KD; A) AR; B) SPE-AR.

Fig. 6. Análise de Ar e de SPE-AR numa coluna (4,6x75 mm) RPSC C^ ultraporosa de fase inversa. 0 gradiente situou-se entre o dissolvente primário TFA a 0,1 % e o dissolvente secundário acetonitrilo com TFA a 0,1% com um débito de 1 ml/minuto, à temperatura ambiente. Recolheram-se fracções de 1 ml. A) AR;

B) SPE-AR.

Fig. 7. Análise SDS-PAGE das Proteínas AR.

t an t e de de ovo,

25,7 KO

Processou-se um gel SDS-PAGE a 15 ?ó (0,75 mm x 1 8 cmx 15 cm com um sistema tampão descontínuo, a uma corrente cons30 miliamperes. Os indicadores de peso molecular utiforam a fosforilase B, 92,5 KD; BSA, 66,2 KD; albumina

KD; anidiase carbónica, 31 KD; qu ι ηotr ι psiη ogéη ι o A, inibidor tripsínico de feijão de soja, 21,5 KD; lactoglobulina 18,4 KD; lisozima, 14,4 KD; apro tonina , 6,2 KD;

subunidades de insulina, 3 KD - Pista 1:

AR; Pista 2:

Pista 3: SPE-AR; Pista 4: NG-SPE-AR. B)

Processou-se um míηι-gel SDS-PAGE a 2□ % (0,75 mmx10cmx7 cm) a uma tensão constante de 200 volts. Uti1izaram-se os mesmos indicadores de peso molecular anteriormente utilizados. Pista

AR; Pista 2:

NG-AR ;

Pista 3 : NG-AR tratado com fosfolipase separado por HPLC de fase inversa ( r p ) .

Fig. 8. Análise

IEF de AR marcado com

25_£

Utilizaram-se os padrões que se seguem compreendidos entre 4,65 e 9,6: ficocianina c om valores de P .

4,65 ; Ç) -lactoglobulina B, 5,1 anidrase carbónica de bovino

6,1; anidrase carbónica humana

6,5: mioglobulina de equino,

7,0; mioglobulina de baleia 8,05 cL -quimotripasina , 8,8; e citocromo C, 9,6.

A) Curva de resposta à dose de AR na inibição da incorporação

2 5 de desoxιuridina marcada com I dentro do

ADN das células

B ) Efeito de AR sobre a estimulação da incorporação de

7 5 desoxiuridina marcada com “ I dentro do ADN dos fibroblastos do prepúcio humano (Sadamoto).

Fig. 10.	1 2 5 Competição da ligação de EGF marcado com I
às células A 4 31	fixadas ou às membranas Dlasmáticas de A431

pelo EGF e AR do murino. Efectuaram-se ensaios de ligação, conforme descrito na secção 6.1.5. infra. Para os ensaios utiliza-

ram-se amostras

de 100^ 1 ou de 50^1 por recipiente com célu-

las ou membranas fixadas, respectivamente.

S imbo 1 o	Frente Receptora Competidor
•	Células Fixadas EGF
A	Células Fixadas AR
O	Membranas EGF
Δ	Membranas AR
Fig . 11.	Análise hidropática de AR e de EGF humana (Kyte
e Doolitle). A)	AR (resíduos 1-84); B) AR (resíduos 44-84):

C) EGF (resíduos 1-53); D) Precursor de AR (resíduos 1-252);

E) Comparação da AR humana (resíduos 1-84) e da EGF humana (re-

síduos I-53) (o	alinhamento está de acordo com a Fig. 13, pelo
que a cisteína,	resíduo 46 do AR completo, corresponde à cis-

teína, resíduo 6 do EGF completo J.

Fig. 12. Sequência aminoácida do AR completo e do AR truncado. Utilizou-se um código padrão de uma única letra para os aminoácidos: Alanina (A); Arginina (R); Asparagina (N);

Acido Aspártico (D); Cisteína (C); Glutamina (0); Acido Glutâmico (E); Glicina (G); Histidina (H) ; Isoleucina (I); Leucina (L); Lisina (X); Metionina (M); Feni1-a 1amina (F); Prolina (P) ; Serina ( S ) ; Treonina (Γ); TriptoFano (W ) ; Tirosina (Y ) ; e Vali n a ( V ) .

Fig. 13. Comparação das sequências aminoácidas da anfirregulina (AR) e dos membros da super-família EGF.

2 5

Fig. 14. A) Ligação de AR marcado com I a celulose a celulose de ADN primitivo (

S)

Comparação da ligação de AR marcado com

1251 a celulose marcado e a celulose de ADN (u com I a celulose ( ) com a ligação ) e com celulose de EGF de ADN

Fig. 15. Peptideos de Anfirregulina de síntese originados por técnicas de Fase sólida. Produziram-se por síntese de fase sólida e, depois, purificaram-se por HPLC de fase inversa cinco peptidos gue correspondem aos resíduos 166-184 (NI9. 259 ),

108-130 (N2. 264), 31-50 (N°. 279), 71-90 (N?. 280) e 221-240 (N ° . 2 81).

Fig. 16. Sequência de nucleótidos e sequência de aminoá1 ο eidos deduzida do clone pAR1 de cADN , que codifica a anfirregu1 ina humana.

Fig. 17. Sequência genómica da anfirregulina humana.

Fig. 18. Diagrama esquemático da estrutura do exão e dos domínios proteicos da molécula de AR, relacionado com a sequência genómica.

F íg .	1 9 .	Sequência	de	nucleótidos	d o	vector da expressão
pDCHBAR1.
Fig .	20 .	Sequência	de	nucleótidos	d e	plaCAPARI.
Fig .	2 1 .	Sequência	de	nucleótidos	de	plaCAPHILE.

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à Anfirregu 1 ina (AR), a sequências de nucleótidos que codificam AR e o precursor de AR, e à produção de AR mediante métodos convencionais ou de ADN recomb inan te.

AR, um novo factor regulador do crescimento celular, expressa-se e é segregado pelas células MCF-7 tratadas com ATP segundo duas formas distintas, ainda que funci□na 1mente equivalentes. As duas formas são estruturalmente idênticas excepto num adicional de 6 resíduos amino-terminais, na forma mais larga.

1

A AR exibe actividade inibidora potente da síntese do ADN nas células neoplásicas e, constitui um potencial e poderoso composto anti-tumor. E de particular interesse a capacidade de AR para promover o crescimento dos fibroblastos e de outras células normais, sugerindo que AR pode ser útil no tratamento de situações que requeiram a aceleração do crescimento celular, por exemplo, queimaduras e ferimentos.

A AR ou os seus fragmentos e derivados têm uma utilização terapêutica potencial muito ampla no tratamento e verificação de neoplasias assim como no tratamento de ferimentos. Também se pode utilizar a AR na modulação da reabsorção óssea e da resposta imunológica e na estimulação de cascatas de ácido araquidónico. Descreve-se o gene da anfirregu1ina, os produtos genéticos e as suas utilizações, mais pormenorizadamente, nas sub-secções e exemplos que se seguem.

5.1. PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DA ANFIRREGULINA

A Anfirregulina é segregada pela linha de células MCF-7 do carcinoma da mama humana, quando tratada com o agente de promoção do tumor 12-0-Tetradecanoi1 -forbo 1- 13 - acetato (TPA). Pode isolar-se a anfirregulina a partir do meio condicionado de uma cultura dessas células MCF-7 tratadas com TPA e purificadas subsequentemente para uma actividade específica elevada. Também se pode isolar a anfirregulina a partir de outras linhas

2 de células com ou sem indução por tratamento com TPA ou com outros agentes promotores de tumores. Em alternativa, pode produzir-se a Anfirregu1ina por técnicas de ADN recombinante , ou por síntese peptidica de fase sólida.

Pode purificar-se a A n f i r r e g u 1 i n a utilizando diversos procedimentos e técnicas conhecidas na especialidade, incluindo, mas não se limitando à cromatografia (por exemplo, cromatografia inversa de fase liquida, cromatografia de permeação de gel, cromatografia de permuta liquida, cromatografia de permuta iónica, crornatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de afinidade), centrifugação, procedimentos de e1ectroforese, solubilidade diferencial ou por quaisquer outras técnicas para a purificação de proteínas.

Num aspecto específico da presente invenção, trataram-se as células MCF-7 com TPA, durante 48 horas e desenvolveram-se em meio recentemente preparado isento de soro, durante 4 dias.

Recolheu-se o meio condicionado resultante e utilizou-se para

preparar AR bruto conforme se descreve na Secção	6.2. infra.
Pode utilizar-se a cromatografia liquida de fase	inversa e a
cromatografia de permeação de gel para purificar	a AR para uma

aparente homogeneidade, conforme se descreve na Secção 6.3. infra, de que resulta uma AR purificada entre 1 842 vezes e 2 270 vezes, em relação ao material bruto, de partida. 0 método é reprodutível e proporciona preparações de AR purificada pos

3 suindo actividades específicas entre 2,7 e 3,4 x 10° unidades/mg de proteína.

5.2. 0 GENE DA ANFIRREGULINA

5.2.1. ISOLAMENTO E CLONAGEM 00 GENE DA ANFIRREGULINA

Na prática do método da presente invenção, pode utilizar-se a sequência de nucleótidos que codifica humana ou o seu equivalente funcional, para recombinantes que comandarão a expressão do lina humana. A sequência de nucleótidos que a an f i rregulina originar moléculas produto anfirregucodifica a AR pode obter-se a partir de fontes celulares que produzem actividade semelhante a AR. Por exemplo, num aspecto específico, utiliza-se a linha celular MCF-7 do carcinoma da mama humana como uma fon te da sequência que codifica os nucleótidos de AR. Pode obter-se a sequência codificante por clonagem do CADN de ARN isolado e purificado a partir dessas fontes celulares ou por clonagem genómica. Tanto o CADN como as bibliotecas genõmicas de clones podem preparar-se a partir de fragmentos de ADN originados segundo técnicas conhecidas na especialidade, incluindo, mas não se limitando, a utilização de enzimas de restrição.

Os fragmentos que contêm o gene para AR podem identificar-se segundo numerosos procedimentos conhecidos na especialidade. Pode utilizar-se, por exemplo, uma porção da sequência aminoácida de AR para deduzir a sequência de ADN, sequência de ADN essa que se pode, depois, sintetizar quimicamente, marcar-se cadioactivamente e utilizar-se como uma sonda de hibridação.

Outros métodos que se podem utilizar para isolar o gene de AR incluem mas não se limitam, a síntese química da própria sequência do gene a partir de uma sequência conhecida que pode, por exemplo, ser derivada da sequência de aminoácidos de AR.

Alternativamente, pode utilizar-se a tradução i n vitro , do mARN se 1 ecciona do , seguida de ensaios funcionais ou imunológicos dos produtos traduzidos. Pode, então, inserir-se num vector de clo nagem adequado o gene isolado e identificado. Pode utilizar-se um grande número de sistemas hospedeiros vedores conhecidos na especialidade. Os vectores possíveis incluem, mas não se limitam, a plasmídeos ou virus modificados em que o sistema vector

é compatível com a	célula hospedeira. Tais vectores incluem,
mas não se limitam	a, bacteriófagos tais como os derivados lambda
ou plasmídeos como	os derivados plasmídicos PBR322 ou pVC. Po-

dem introduzir-se as moléculas recombinantes nas células hospedeiras através de transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc.

Num aspecto particular, efectua-se a clonagem do gene de

AR expresso pelas células MCF-7, se 1 eccιonando o mARN produzido em resposta ao tratamento das células MCF-7 com TPA e construindo uma biblioteca de CADN no bacteriófago \ gt1 0 . Uma vez que as

5 células MCE-7 não tratadas não sintetizam nem segregam, aparentemente, a proteína AR, presumiu-se que a indução de AR pelo

TPA, pudesse, também, ser reconhecida ao nível de transcrição e, desse modo enriquecer-se-ia consideravelmente a biblioteca de CADN com sequências contendo AR. Efectuando a sondagem da biblioteca de CADN com o 1igonuc 1 eótidos degenerados e com oligonuc1eótidos considerados hipoteticamente os melhores, com base na utilização do codão humano ( L a t h e , 1985, J. Mo 1 . B i o 1 . 183 : 1-12) e, conforme se descreve na Secção 8.1. infra, obteve-se como resultado o isolamento de clones de CADN de AR. Utilizaram-se, então, esses clones de cADN para caracterizar o mARN de AR e o gene de AR. Para além disso, pode utilizar-se a sequência de nucleótidos do cADN de AR (secção 8.2, infra e Fig. 16) para se deduzir a sequência de aminoácidos primária de AR .

Devido à degenerescência inerente às sequências que codificam os nucleótidos podem utilizar-se na prática dos métodos da presente invenção outras sequências de

ADN que codifiquem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos funcionalmente equivalente. Tais alterações da sequência dos nucleótidos de AR incluem, supressões, adições ou substituições de diferentes nucleótidos que resultam numa sequência que codifica os mesmos produtos genéticos ou produtos funciona 1mente equivalentes. 0 produto genético pode conter

6 supressões, adições ou substituições de resíduos aminoácidos na sequência, que resultam em alterações silenciosas, produzindo-se, assim, um produto bioactivo. Podem efectuar-se tais substituições de aminoácidos com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade , características hidrófilas e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico; aminoácidos carregados ρosi11 vamente incluem a lisina e a arginina; aminoácidos com grupos polares não carregados ou não polares incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, giutamina, serina, treonina, feni1 a 1anina, tirosina.

Pode utilizar-se o CADN de AR como uma sonda para detectar o mARN de AR nas células MCF-7 induzidas com TPA. 0 mARN de AR possui, aproximadamente, 1400 pb de extensão.

Conforme se descreve na secção 9, infra , pode utilizar-se o CADN de AR para caracterizar o gene de AR. A atribuição cromossómica do gene de AR humana determiη ou-se por hibridação in s i t u de CADN de AR marcado com 3H, com cromossomas normais de metafase, o que revelou que o gene da AR humana reside na região 4 13-21 do cromossoma 4, numa região que se pensa estar envolvida na diferenciação dos linfócitos (ver secção 9.2. infra). Também se utilizou o cADN para isolar o ADN genómico que atravessa o gene AR completo, incluindo a região reguladora da ex

7 tremidade 5'. Descobriu-se que o gene AR possui, aproximadamente, 10 Kb de extensão e está dividido em 6 exões. Incorporou-se a região reguladora da extremidade 5' num vector de expressão contendo um gene (CAT) de cloramfemcol-acetiltransferase sem promotor. Esta construção foi capaz de estimular a transcrição do gene CAT, quando introduzida transitoriamente em células MCF-7, e a actividade foi estimulada 6-7 vezes pela adição de TPA (ver secção 9.4, infra) . Em aspectos específicos da presente invenção pode utilizar-se a região reguladora da extremidade 5' , nos vectores de expressão para controlar a transcrição do gene de AR ou de outros genes estruturais. Também se pode utilizar a construção quimérica AR-CAT para pesquisar factores que regulem a expressão de AR, conforme se descreve na Secção 9A .

5.2.2. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO CONTENDO A

SEQUENCIA DE CODIGO DA ANFIRREGULINA

No sentido de se expressar uma forma de AR, completa, biologicamente activa, será necessário escolher-se um sistema vector de expressão/hospedeiro que proporcione não apenas níveis elevados de transcrição e de tradução, mas o correcto processamento do produto genético. Isto torna-se especialmente importante quando se emprega a sequência completa de código do percursor da Anfirregu1ina nas construções de expressão, uma

8 vez que a forma completa da Anfirregulina parece ser derivada do produto do precursor mediante fenómenos de processamento celular. Por exemplo, pode escolher-se um sistema de células hospedeiras de mamífero devido à sua capacidade de processar e segregar correctamente a Anfirregulina no meio extrace 1 u 1 ar .

Especificamente , parece que se sintetizam duas formas de Anfirregulina completa como a parte média de um percursor comum de 252 aminoácidos, a partir do qual se libertam as duas formas completas por fenómenos de processamento proteolítico alternados. Adicionalmente, efectua-se a glicosilação da Anfirregulina e pode-se submetê-la a sulfatação por tirosina, sublinhando ainda mais a importância de se seleccionar um sistema de expressão que seja capaz de executar estas modificações post-tradução, se desejado, no produto final.

especialista pode utilizar de f o rma igualmente correcta uma diversidade de sistemas anima1/vector de expressão hospedeiro (isto ectores que contêm os elementos necessários para comanda rep1icação, transcrição e tradução da sequência que codifica

AR numa célula hospedeira adequada).

mas não se 1 a, sistemas vectores de ex pressão ricos/células hospedeiras de mamíferos (por exemplo, i tomega 1 vírus vaccinia, adenovirus e semelhantes); s vectores de e χp ressao de vírus de insectos/cé1u1 as de n s e c tos

- pio, baculovirus ); ou sistemas de expressão p r orno t o não

9 viricos derivados dos genomas das células dos mamíferos (por exemplo o promotor meta 1 o-tiοηina do rato).

Os elementos de expressão destes vectores variam na sua robustez e especificidade. Dependendo do sistema hospedeιro/vec tor utilizado, pode usar-se qualquer um de entre numerosos elementos adequados de transcrição e de tradução. Por exemplo, podem utilizar-se os promotores isolados das células dos mamíferos (por exemplo o promotor da metalo-metionina do rato), quando se efectua a clonagem nos sistemas celulares dos mamíferos, ou a partir de vírus que se desenvolvem nestas células (por exemplo, o promotor de 7,5 Kb do vírus vaccinia, ou a repetição da extremidade longa do vírus do sarcoma de murino de Moloney). Também se podem utilizar promotores produzidos por técnicas de ADN recombinante ou de síntese, para proporcionar a transcrição das sequências inseridas.

São também necessários sinais específicos de iniciação para uma tradução suficiente das sequências que codificam a proteína inserida. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos em que o gene completo de AR, incluindo o seu próprio codão de iniciação e as sequências adjacentes, estão inseridos dentro de vectores de expressão apropriados, podem não ser necessários sinais de controlo de tradução adicionais. Contudo nos casos em que apenas uma 'porção da sequência de código se encontra inserida, têm de ser

fornecidos	sinais exógenos de controlo de tradução, incluindo
o codão de	iniciação ATG. Para além disso, o codão de inicia-
ção tem de	estar em fase com a estrutura de leitura das sequên-

cias que codificam AR para assegurar a tradução de toda a inserção. Estes sinais exógenos de controlo de tradução podem ter diversas origens, naturais ou de síntese.

Pode	intensificar-se a eficiência da expressão pela in-

clusão de sequências de atenuação da transcrição, elementos intensificadores , etc.

Podem utilizar-se qualquer dos métodos previamente descritos, para inserção de fragmentos de ADN num vector, para construir vectores de expressão contendo o gene de AR e sinais de controlo de transcrição/tra dução adequados. Estes métodos incluem técnicas i n v i t r o de ADN recomb inante, técnicas de síntese e recombinações in vivo (recombinação genética).

Por exemplo, nos casos em que se utiliza o adenovirus como um vector de expressão, pode ligar-se a sequência que codifica AR a um complexo de controlo transcrição/tradução do adenovirus, por exemplo, o ultimo promotor e uma sequência

leader tripartida.	Pode inserir-se este gene quimérico no
genoma do adenovirus	por recombinação in vitro ou in vivo. A
inserção numa região	não essencial do genoma vírico (por exem-

pio, regiões E1 ou E3) resultaria num vírus recombinante que é

1 viável e capaz de expressar AR em hospedeiros infectados. De modo semelhante, pode utilizar-se o promotor de vaccinia de 7,5 Kb .

Um sistema de expressão alternativo que se pode utilizar para expressar AR consiste num sistema de insectos. Num tal sistema, utiliza-se o vírus de poliedrose nuclear Autoqrapha californica (AcNPV), como um vector para expressar os genes es tranhos. Desenvo 1ve-se o vírus em células de Spodoptera f r u g i p e r d a. Pode efectuar-se a clonagem da sequência que codifica AR em regiões não essenciais (por exemplo, o gene poliedrina) do vírus e colocar-se sob o controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina). Da inserção bem sucedida da sequência que codifica o AR resultará a inactivação do gene da poliedrina e a produção de vírus recombinantes não obstruídos (isto é, vírus que carece de revestimento proteináceo codificado pelo gene da poliedrina). Utilizam-se, depois, estes vírus recombinantes para infectar as células de Spodoptera frugi p e rd a nas quais se expressa o gene inserido.

Vectores retrovíricos preparados em linhas de células empacotadas anfotropicamente permitem a expressão de alta eficiên-

cia em numerosos	tipos de células. Este método permite o acesso
ao processamento	específico de tipo celular, à regulação ou ao
funcionamento da	sequência que codifica a proteína inserida.

Para além disto, pode escolher-se uma estirpe celular hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto genético segundo uma modalidade especifica desejada. Pode elevar-se a expressão de determinados promotores na presença de certos indutoras, (por exemplo, iões de zinco e cádmio para os promotores de meta 1ometionina ) . Para além disso, pode controlar-se a expressão do AR produzido geneticamente. Isto é importante se o produto proteico do gene estranho que se clonou for letal para as células hospedeiras. Para além disso, as modificações (por exemplo, g 11 cosi 1 ação ) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos proteicos são importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem caracteristicas e mecanismos específicos para o processamento de post-tradução e modificação das proteínas. Podem escolher-se linhas de células ou sistemas hospedeiros adequados para se assegurar a modificação e processamento correcto da proteína estranha expressa.

	Os vectores de expressão que	s e	podem utilizar, de	acordo
com a	presente	invenção ,	incluem,	mas	não se limi	t am aos	s e g u i n -
t e s :
	Plasmídeo	pSV2	Neo .	Southern	e t	al . , ( 1 98 2 )	. J. Mol	• Δρ-
p 11 ed	Genetics	1 327	-341 ,	desc ceveram	o plasmídeo	ρ S V 2 Neo.

Plasmideo pSV2 dhfr.0 plasmídeo pSV2dhfr ísubramani et al.

1981, Mol. C e1L B i o 1 . 1 854-864), contém o gene da disodrofolato redutase de ratinho sob o controlo do promotor 5V4Q.

Plasmídeo pΗ 3M . 0 plasmídeo pH3M (Arruffo et al., 1987,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 84, 3365-3369), contém um promotor quimérico composto do intensificadar mais próximo do citomegalovirus (CΜV) humano AD169, fundido com HIV LTR desde a posição -67 à +80. A LTR segue-se uma região de ligação múltipla com os locais, que se seguem, no sentido 5 '-3 ’ : Hind III, Xba I, Xho I, Bstxl, Xhol, PstI, e Xbal. Os indicadores do local de união/poliadenilação do pequeno antígeneTde pSV2 e uma origem S\M0 de replicação encontram-se a jusante da região de ligação múltipla. 0 último, permite a amplificação nas células que contêm o grande antígene T de SV40, tais como as células COS e WOP . Um gene supressor de tARN suporta o crescimento em vedores com base em pVX e bactérias portadoras do plasmídeo P3, tal como MC1061/P3.

Plasmídeo pH3M/b0nCM. Obteve-se o plasmídeo pH3M/bonCM a partir de Njama Malik, Oncogen. Contém a sequência leader e não traduzida TGF-(3da extremidade 5', do símio, fundida com a sequência de código de Oncostatina M inserida dentro de pH3M nos locais Hind ΙΙΙ/Xho I (nivelados). A sequência T CF - c o n s i s t e numa região não traduzida, de 85 pb, na extremidade 5' com início em Hind III (originada a partir da região de ligação múltipla de pSP65) e dum local Pst I adjacente de CADN de T G F - (7¹ ,

s.e g u i d a de 87 pb que codificam a sequência de sinal de 29 am i noácidos que normalmente se cliva entre a sequência dipaptidica glicina-leucina.

Plasmídeo pH3ARP- 0 plasmídeo pH3ARP é um vector que tem como ponto de partida pH3M designado para expressão transitória do precursor AR nas células COS . Contém a região não traduzida da extremidade 5' de AR, de 13 pb, e a região codificante completa e as sequências nou-se este plasmídeo não traduzidas da extremidade 3'. Origiligando o fragmento de 4 K b do vector p H 3 Μ , digerido com HindIII e Xbal , os oligonucleótidos

EVSAL3 e

EVSAL4 e o fragmento de CADN de 1,1 Kb Hgal / Xbal , a partir de ρ A R1 , purificado em gel. Comp1 ementou-se e EVSAL4 na extremidade 5', com locais HindIII , EcoRV, Sall e Hgal . A construção mantém, ainda, os locais de ligação múltipla de EcoRI a Xbal de pEMBL18- imediatamente a seguir à região não tradu zida da extremidade 3'.

	EcoRV	Hgal
		HindIII	Sall
EVSAL3	5 '	AGCTTGATATCGTCGA
EVSAL4	3 '	AC TATAGCAGCTGACGC

Plasmídeo pSVDR/bOM. Obteve-se o plasmídeo pSVDR/boM de

Jeff Kallestad, Oncogen. Consiste numa fusão entre pSV2dhfr e pH3M/boM e proporciona um vector com um cADN conduzido pelo promotor CMV/HIV de pH 3M flanqueado pela sequência de sinal

TGB-β e indicadores de poliadenilação de SV40, em adição ao gene dhfr do ratinho conduzido pelo promotor inicial

SV40. Originou-se, ligando o pH3M/boM digerido com BamHI/Nrnl (nivelado ) a pSV2dhfr digerido com BamHI.

Plasmídeo pHras. 0 plasmídeo pHras é um vector de expressão de mamífero, desenvolvido por Stan Meknight

Univ. de Washington, Dep. of Pharmaco 1 ogy . E um vector que tem como ponto de partida o pML que contém um fragmento de 754 pb de EcoRI a

Tth111I de Harvey Ras LTR, uma região de ligação múltipla com os locais Smal, BamHI, Sall, PstI, HindIII e Ciai, seguida do indicador de ρo 1ia deni1ação/região não traduzida da extremidade

3' do virus da Hepatite B e cADN de DHFR do ratinho. A distãncia entre o local bamHI da região de ligação múltipla e o ATG

DHFR é de 54 pb Plasmídeo pHLARGE. 0 plasmídeo expressão de mamífero, que contém pHLARGE é uma as sequências construção genómicas ,

Kb, de AR de(SmaI a HindIII) conduzidas pelo

LTR ras de

Harvey e seguidas por um gene DHFR sem promotor, não funcional.

E constituído pela ligação de três vias dos fragmentos que se seguem: fragmento SmaI/HindIII, de

4,6 Kb, de pHras: fragmento genómico de AR Smal/HindIII de 6,0

Kb, de p A R H12; e o fragmento genómico de AR, HindIII, de 6,4 Kb a partir de pARHG .

6

Plasmídeo pHLARGIpcD. 0 plasmídeo pHLARGIpcD é uma construção de expressão ρo 1icistrónica de mamífero. Contém a sequência de CADN do precursor de AR seguida pelo gene dhfr do

ratinho comandado	por um único LTR ras de Harvey. A primeira
transcrição é uma	mensagem po1icistrónica com 74 pb entre o co-
dão de paragem de	AR e o codão de inicio ATG de dhfr, permitindo
assim ao ribosoma	reiniciar e dar continuidade à tradução.

Efectuou-se a digestão de pH 3A R P com EcoRV e isolou-se o fragmento de 700 pb. Este fragmento contem a região de 13 pb não traduzida da extremidade 5' de AR, a região completa que codi fica o precursor de AR e sequência, de 21 bp, não traduzida da extremidade 5'.

tado com BamH I

Ligou-se este fragmento com o vector pHras cor nivelado e submetido e fosfatase.

Plasmídeo pLOSNL. Obteve-se o plasmídeo pLOSNL de Dusty

Miller, Fred Hutchison, Câncer Research Center, Seattle, WA . Projectou-se este vector de expressão retrovírico para originar títulos elevados de reservas viricas livres de auxiliares anfotrópicos capazes de infectarem, mas não de se replicarem, num amplo leque de hospedeiros. 0 vector contém: um mutante do vi/ rus LTR da leucemia de murino de Moloney com Geleção dos indicadores de guarnição; sequências psi +; o gene da ornitina transcarbamilase (OTC) contendo dois locais Xhol para inserção de um cADN e subsequente inactivação do gene OTC; SV2Neo, um indicador de selecçao; o LTR da extremidade 3' ; e a estrutura prin

7 cipal resistente à Amp de pBR322.

Piasmídeo pLARSNL .

de expressão retrovírica plasmídeo pLARSNL é uma construção anfotrópica, contendo a região de cADN que codifica o precursor de AR , com carência de um poli(A) final, comandado pelo LTR vírico.

S V 2 N e o permite a selecçao dos trans fectantes que se expressam.

Originou-se o pLARSNL pela ligação do fragmento Sall de

800 pb de pHLARGIpcD com o fragmento de 7,7 Kb do vector pLOSNL digerido com Xhol e tratado com fos fatase .

5.2.3. IDENTIFICAÇÃO DE TRANFECTANTES

OU TRANSFORMANTES QUE EXPRESSAM

A PRODUÇÃO DO GENE DA ANF I RREGULINA

Podem identificar-se as células hospedeiras que contêm a sequência que codifica a AR recombinante e que expressa o produto por completo, biologicamente activo, segundo, pelo menos, quatro vias gerais:

a) hibridação ADN-ADN, hibridação ADN-ARN e hibridação ARN-ARN de sentido oposto; b) presença ou ausência de funções de gene indicador; c) determinação do nível de transcrição conforme se calculou pela expressão das transcrições de mARN de AR, na célula hospedeira; e d) detecçao da produção do gene completo conforme medido por ensaios imunológicos e, finalmente, pela sua actividade biológica.

Pela primeira via, pode detectar-se a presença da sequência que codifica a AR humana, inserida no vector de expressão por hibridação ADN-ADN utilizando sondas que compreendem as sequências de nucleótidos que são homólogas da sequência que codifica a AR humana.

Pela segunda via, pode identificar-se e seleccionar-se o sistema de expressão vector/hospede 1ro com base na presença ou ausência de determinadas funções indicadoras de gene (por exemplo, actividade de timidina quinase, resistência aos antibióticos, resistência ao metotrexato, transformação de fenotipo, formação de corpos de oclusão no baculovírus, etc.). Por exemplo, se a sequência que codifica a AR se encontrar inserida na sequência de gene indicador do vector, podem identificar-se os recombinantes que contêm a sequência que codifica AR, pela ausência da função do gene indicador. De modo alternativo, pode colocar-se um gene indicador de modo encadeado com a sequência

AR sob o controlo do mesmo promotor ou de um promotor utilizado para controlar a expressão da sequência que

AR. A expressão do indicador em resposta à indução ou diferente, codifica selecção indica a expressão da sequência que codifica AR.

No terceiro caso, pode ter-se acesso à actividade transcricional para a região que codifica AR por ensaios de hibridação

Pode isolar-se e analizar-se ARN po 1ia deni1 a do , por exemplo, por análise de mancha Northern utilizando uma sonda homóloga da sequência que codifica AR ou, porções especiais da mesma.

Como alternativa, podem extrair-se os ácidos nucleicos totais da célula hospedeira e efectuar-se ensaios de hibridação com essas sondas.

Pela quarta via, pode estabelecer-se imunologicamente a expressão do produto proteico completo, por exemplo, por manchas Western, ensaios imunológicos como, por exemplo, radio-imuno-precipitação, ensaios imunológicos de ligação enzimática e, semelhantes. Contudo, o teste final do sucesso do sistema da

expressão,	envolve a detecção do gene de AR biologicamente ac-
t i vo . Se a	célula hospedeira segregar o produto genético pode
ensaiar-se.	, o meio isento de células, que se obteve a partir
da cultura	da célula hospedeira de transfecção, quanto 'a acti-

vidade de AR. Se não se segregar o produto do gene, podem ensaiar-se, para tal actividade o produto da lise celular. Em qualquer dos casos, podem utilizar-se ensaios biológicos tais como os ensaios de inibição e estimulação do crescimento, aqui descritos.

5-3. ESTRUTURA DA ANFIRREGUL I NA

A sequenciação de aminoácidos do AR purificado revelou que a preparação é constituída por uma mistura desigual de duas formas aproximadamente idênticas de AR (ver FIG. 12). Uma das formas, a mais longa, compreende, de modo grosseiro, 16% da preparação. A outra forma, uma AR truncada , compreende o restante e a maior parte da preparação e difere da sua parte mais longa apenas no facto de carecer do hexapeptídeo , SVRVEQ amino-terminal. Por outro lado, as duas formas são perfeitamente homólogas ao nível dos aminoácidos.

A AR é uma glicoproteína extremamente hidrófila com um peso molecular médio relativo de 22 500 daltons. 0 tratamento com N-Glicanase, que remove o carbohidrato ligado a N, provoca a migração de AR como uma faixa única, com um peso molecular relativo de 14 000, em perfeita concordância com os cálculos de peso molecular a partir dos dados de cromatografia de permeação de gel, de AR. A AR migron de forma semelhante, sob condições não redutoras. Portanto, a AR é uma glicoproteína de cadeia simples.

Comparou-se a estrutura primária de AR a muitas outras sequências proteicas, estas comparações indicam que AR é a única proteína que não possui homologia estrutural significativa com qualquer das proteínas comparadas. Contudo, a estrutura primária de AR, está relacionada com diversos outros factores do crescimento, a maioria dos quais

E razoável classificar a AR como pertence à super-famí1ιa EGF um membro deste grupo de pro uma vez que diversas das suas características estruturais

1 se encontram em estreito paralelismo com as caracteristicas estruturais altamente conservadas descobertas nas proteínas da

Família EGF. Por exemplo, a sequência N-terminal de AR assemelha-se às sequências N-terminal de TGFqL, UGF e MGF, pelo Facto desta região ser rica em resíduos de prolina, ser ina e t reonina .

A AR também possui locais para a glicosilação da ligação N como têm as regiões

N-terminais do precursor de TGFS e VGF. A AR apresenta ainda homologia de sequência com outras proteínas seme lhantes a EGF com conservação de 6 resíduos de cisteina tervenientes em três ligações dissu1Fidicas o que deFine a estrutura secundária das formas completas destes factores do cimento. Contudo, a análise hidropática revelou di Ferenças signi Ficativas entre as sequênc ias homólogas de AR e EGF. Para mais compa rações entre a Ar e outros membros da superFamília EGF, consultar o

Quadro I, FIG. 13 e secções 9.7 e 9.8.

QUADRO I

PROTEÍNAS	E5PEC IE	REGIÃO IH	REGIÃO 112
EGF	Humana	CLHDGVCMYIE	CNCVVGYIGERC
TGF-oL·	Humana	CFH-GTCRFLV	CVCHSGYVGARC
VGF	Vaccinia	CLH-GDCIHAR	CRCSHGYTG IRC
5GF	Shope	CLNNGTCFTIA	CVCR INYEGSRC
Factor IX	Humana	CLNXGSCKDDI	CWCPFGFEGKNC
F a c t o r X	Humana	CQNXGKCKDGL	CTCLEGFEGKNC
Factor XII	Humana	CLHXGRCLEVE	CHCPVGYTGPFC
Proteína C	Humana	CCGXGTCIDGI	CDCR5GWEGRFC
AR	Humana	C IH-GECKY IE	CKCQQEYFGERC
Avaliação dos	Resultados de	Homologia Combinada para as regiões
IH e ii?	Avaliação de EGF	Avaliação de	Coaq. Avaliação de AR
Família dos factores de crescimento	>20	4 20	4 4 0
Factores de coagulação	< 25	> 25	4 40
Sub-família Anfirregulina	< 20	< 20	>60

As sequências de aminoácidos da Anfirregulina , apresenta das na FIG. 12, bem como os equivalentes funcionais estão dentro

3 do âmbito da presente invenção .

produto A η f i r r e g u 11 η a pode conter, por exemplo, de lecções, adições ou substituições dos resíduos aminoácidos da sequênc de que resu ltam modificações silenciosas, produzindo-se, um produto bioactivo.

ais substituições de aminoácidos podem ser feitas com base na de polaridade, carga, ilidade carac terísticas filas e hidrofobas e/ou natureza antipática dos res nvo 1v idos .

Por exemplo, os aminoácidos carregados te en g1ob am ido aspártico e o ácido glutâmico;

am inoácidos carregados tivamente incluem a lisina e a noácidos com po los não carregados e que possuem valores drofília semelhantes incluem os seguintes: leuc ι so euc valina ; gl icina, alanina; asparagina, glutamina ser , treonina; feni

1-alanina e tirosina.

5.4.

PROPRIEDADES DA ANFIRREGULINA

A AR é uma glicoproteína de cadeia simpl com um peso molecular médio de cerca de 22 500 daltons que tividades bio funcionais moduladores do lulas em cu 11u

EGE dos compa semelhanças funcionais ica a capacidade de AR ibe e x a c factores do crescimen ra. Estruturalmente,

mento	numa	variedade	d e	c é -
a AR	relaciona-se com	a	f a -
to e ,	para	além disso		pode
com	outros	desta f am	í 1	i a
para	c ompe t	ir eficazm	ente

com EGF para ligação a um receptor.

A AR é uma proteína monomérica que necessita, para a sua actividade, de ligações dissu1fídicas, não necessita de glicosilação para as suas actividades biológicas, mantém-se estável nos tratamentos com ácidos e bases moderados, e mantém-se estável quando tratada pelo calor a 56°C, durante 30 minutos. A AR perde, completamente, a sua actividade biológica quando reduzida, quando aquecida a 100°C, durante 5 minutos, quando digerida com tripsina, endopeptidase Lis-C, endopeptidase Arg e endopep11 dase Glu .

A clivagem proteolítica pela fosfolipase D parece converter a AR num fragmento ou fragmentos’'activos com peso molecular relativo de cerca de 5 600, conforme deduzido por análise SDS-PAGE. Os fragmentos activos de AR encontram-se abrangidos pelo presente pedido de patente de invenção e, discutem-se, adiante, na secção 5.5, infra.

A AR apresenta, in vitro, potentes efeitos anti-pro 1iferativos sobre diversas células do cancro humano de origem epitelial. A AR inibe eficazmente, por exemplo, a síntese do ADN das células A431 do carcinoma do adenocarcinoma da mama epidermóide cervical, das epidermal da vulva, das células HTB 132 das células CRL 1550 do carcinoma células HTB 75 do adenoma papilar do ovar ío , das células HTB 1572 do teratocarciη oma do ovário e das células

HTB26 do adenocarcinoma da mama. Nas células A431 tratadas com AR 0,13 nM, observou-se uma inibição de 50 fó na síntese .do ADN .

As células NRK-SA6 do fígado de rato normal, não formam, habitualmente colónias em agar macio. Contudo a associação de EGF e de TGF-C’ exógenos adicionados ao meio de cultura destas células induz o crescimento independentemente de fixação, indicando um fenótipo transformado. A associação de AR e T G F -(? exógenos também induz o crescimento independente de fixação das células NRK-SA6, embora a um nível baixo (ver Quadro V), pondo directamente em evidência que AR e EGF se encontram relacionados funciona 1mente.

A acção sinérgica de AR com TGF-(? implica solidamente a

AR como um importante factor na regulação do crescimento celular. Assim, a presente invenção proporciona instrumentos de investigação, não disponíveis antes, para a investigação da complexa e emergente história do controlo do crescimento celular normal e a perda característica do controlo de crescimento nas células neoplásicas.

A AR também estimula a proliferação dos fibroblastos do

prepúcio humano (Quadro	IV). Observou-se um aumento de duas
vezes na síntese do ADN	destas células, a uma concentração de
AR de cerca de 50 pM. A	estimulação máxima de cerca de seis ve-

zes ocorreu a, aproximadamente, 5 nM.

Não se conhece o mecanismo segundo o qual a AR comanda

6 roliferação ou a inibição do crescimento celular, preliminares apontados para a caracterização receptor de AR sugerem que AR pode possuir um

A AR completa com EGF na ligação ao competir com EGF para se ligar , incluindo, possivelmente o próprio

AR

Sabe-se que a ligação ao estimulação de crescimento tirosinoquιnase. A de modo semelhante a Ρ estudos ção ao específico, e também pode r es comuns cífico de a ordem de da actividade da EGF pode iniciar, tiva ou, de modo contrário, de proliferação limitando o veis para ligação de EGF ou sinais .

receptor em parte

Contudo , da ligareceptor receptor de EGF outros receptoreceptor espede EGF inicia , por activação ligação de AR ao receptor uma resposta proliferapode bloquear o inicio de um sinal número de receptores EGF disponíde outros ligantes que originem

Em alternativa, os dados apresentados no Quadro I sugerem que é possível que a AR iniba o crescimento celular por outro mecanismo. Ensaiou-se a sensibilidade à actividade inibidora de AR de quatro clones da linha de células A431 possuindo locais de ligaçao de EGF, variáveis por célula

A falta de correlação observada entre a sensibilidade a AR e o núme ro de locais de ligação de EGF, por célula, sugere que a ordem de inibição de crescimento originada por AR se iniciou por um fenómeno de ligação ao receptor que não envolve o receptor de EGF. Um tal fenómeno pode antagonizar os sinais de crescimento pro 1iferativo

-, 37 originados por outros factores do crescimento, por exemplo, TGF-OC-. Assim, a AR pode exercer o seu efeito anti-proliferativo por bloqueio específico da resposta mitogénica da célula a TGF-ct ou a outros factores autócrinos do crescimento.

A AR é uma proteína extremamente hidrófila, cuja sequência de aminoácidos origina uma característica hidropática única iigeiramente semelhante às características das outras proteínas da família EGF (FIG. 11). A AR é uma proteína alcalina com um pH de 7,6 a 8,0.

5.4.1.

TPA modificações

CARACTERIZAÇAO DA INDUÇÃO DE AR POR TPA induz uma resposta pleiotrópica nas células, incluindo na morfologia celular, na proliferação e diferenciação celulares, no transporte de membrana, nas interacções receptor-ligando, na fosforilação das proteínas e no metabolismo dos fosfolipidos.

A proteinoquinase C (PKC ) é uma proteínoquinase dependente dos fosfolipidos e de

Ca^-+ que funciona como um receptor para o TPA. A ligação de TPA a PKC resulta na fosforilaçao de numerosos substractos incluindo receptores dos factores do crescimento, proteínas cito-esque1éticas e proteínas reguladoras de t r ans a c t i vação .

C-AMP é outra molécula reguladora que exerce diversos efeitos nas células, em primeiro lugar através da proteinoquinase

A dependente de cAMP. Os níveis intracelulares de cAMP são reindicam

Alguns estudos guiados segundo uma associaçao de activação intermédia do receptor e da inibição da adeni1 atocic1 ase .

que a expressão do gene, induzida por

TAP e cAMP pode convergir segundo uma via comum. Para se estudar a expressão do gene AR, decidiu-se observar o efeito de diversos activadores e inibi dores de ambas estas vias reguladoras, na produção de ARN especifico de AR nas células MCF-7.

A forskolin é um fármaco que activa a adeni1 ato-cic1 ase, o que origina um acréscimo do cAMP intracelular. Quando administrada às células MCF-7 a 25λ*.Μ, durante 4 horas, observa-se uma estimulação acentuada do mARN de AR, sugerindo que as vias cAMP também desempenharam uma função na regulação da expressão de AR.

5.5. PÉPTIDOS, ANALOGOS E DERIVADOS RELACIONADOS COM A

ANFIRREGULINA

Também se contemplou a produção e utilização dos derivados análogos e péptidos relacionados com AR consideram-se abrangidos pelo âmbito da presente invenção.

Tais derivados, análogos e péptidos que exibem actividade moduladora do crescimento, podem aplicav-se no diagnóstico, prognóstico e tratamento de uma ampla variedade de neoplasias. Tais derivados, análogos ou pep tidos podem intensificar ou diminuir as actividades biológicas em comparação com a AR natural e/ou podem expandir ou limitar a variedade de células susceptíveis a GIA de AR, mantendo-se ainda no âmbito da presente invenção. De modo semelhante, a produção e utilização de derivados análogos e peptidos relacionados com AR e que exibem actividade estimuladora do crescimento intensificada ou diminuída e/ou expandem ou limitam a variedade de células responsáveis pela actividade estimuladora do crescimento de AR, podem encontrar aplicações úteis que incluem, mas não se limitam ao tratamento de ferimentos e queimaduras .

Podem produzir-se os derivados, análogos e peptidos relacionados com AR, de procedimentos da presente invenção, segundo uma diversidade conhecidos na especialidade. Os procedimentos e manipulações a nível genético e proteico encontram-se dentro do âmbito da presente invenção.

Ao nível das proteínas, podem utilizar-se numerosas modificações químicas para produzir derivados, análogos ou peptidos semelhantes a AR, por técnicas conhecidas na especialidade que incluem, mas não se limitam à clivagem química específica por endopeptidases (por exemplo, brometos de cianogénio, tripsina, quimiotrιpsina , protease V8 e similares) ou, exopeptidases , acetilação, formilação, oxidação,

5.6. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS etc.

DE ANT I-ANFIRREGULINA

Ainda dentro do âmbito da presente invenção, encontra-se a produção de anticorpos policlonais e monoclonais que reconhecem a Anfirregu 1 ina , ou proteínas com ela relacionadas.

Podem utilizar-se diversos procedimentos conhecidos na especialidade para se produzirem anticorpos monoclonais para ep i topes de AR .

Para se produzirem os anticorpos podem imunizar-se diversos animais a coelhos, ratinhos hospedeiros que incluem mas não se limitam ratos, etc., injectando-os com a proteína

AR ou com um peptido de AR

Podem utilizar-se diversos adjuvan tes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, que incluem mas não se limitam ao adjuvante de

Freund (completo e incompleto), geles minerais tal como o hi dróxido de alumínio, substâncias activas de superfície tais como a 1iso 1ecitina, poliois pluiónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleo, hemacianinas de moluscos gastrópedes de buraco de fechadura (Keyhole limpet), dinitrofeno1, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e o corynebacterium parvum.

Pode preparar-se um anticorpo monoclonal para um epítope de AR, utilizando qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpos por linhas contínuas de células em cultura. Estas incluem, mas não se limitam à técnica do hibridoma, originalmente descrita por Kohler e Milstein (N a t u r e 256, 1975, 495-497), e à técnica mais recente do hibridoma humano de células B (Kosbor et al., Immunoloqy T oday , 4: 7,2,4-1 98 3 ),

1 e à técnica do hibridoma EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. 1985, pp. 77-96).

Podem originar-se os fragmentos que contêm o idiotipo de molé cuia, por técnicas conhecidas. Estes fragmentos incluem exemplo, mas não limitam ao fragmento F (ab')² que pode por produzir-se efectuando a digestão com pepsina da molécula do ant icorpo; fragmentos

Fab' que podem o r iginar-se reduzindo as partes d i s s u 1 f í d i c a s do fragmento F dois fragmentos

Fab ou Fab' que se podem originar tratando molécula do anticorpo com papaína e um agente redutor.

Podem utilizar-se os anticorpos para

AR na detecção quanti tativa e qualitativa do AR maduro do seu precursor e das suas formas subcomponentes, na purificação por afinidade das proteínas AR e na elucidação da bio-síntese, metabolismo e função de AR. Os anticorpos para AR podem também ser úteis como agentes terapêuticos e de diagnóstico.

5.7.

UTILIZAÇÕES DA ANFIRREGULINA

A natureza bifuncional de AR proporciona uma ampla variedade de utilizações in vitro e in vivo. Na prática e no método da invenção, pode utilizar-se qualquer composto que inclua AR, ou seus fragmentos e seus derivados que exibam actividade inibidora do crescimento e/ou estimuladora do crescimento quer sozinhos, quer juntamente com outros factores, ínibidores ou

-42agentes de modulação imunológica, do crescimento, biologicamente activos.

A localização do gene de AR numa região que se encontra envolvida na diferenciação dos iinfócitos sugere que a AR desempenha uma função no desenvolvimento activação ou imunossupressão celulares hematopoiéticos . Esta função tem, ainda, como suporte a homologia entre a região não traduzida de AR3 e as regiões semelhantes das outras citoquinas.

Os compostos expostos podem utilizar-se na modulação da angiogenese, reabsorção óssea, resposta imunológica e em funções efectoras sinópticas e dos neurónios. Também se pode utilizar AR na modulação da cascata de ácido araquidónico . A oxidação enzimática do ácido araquidónico comanda uma grande quantidade de produtos importantes tais como as prostag1andinas , os tromboxanos, as prostaciciinas e 1eucotrieηos. Estes produtos são agentes ubíquos extremamente potentes com efeitos numerosos que incluem, por exemplo, a contracção muscular, a agregação das plaquetas, a migração de leucócitos e a secreção gástrica. A AR, as moléculas relacionadas com AR e as suas composições podem ser especialmente úteis no tratamento de ferimentos e no diagnóstico e tratamento do cancro.

5.7.1. TRATAMENTO DE FERIMENTOS

Pode utilizar-se a AR num método, para tratamento de ferimentos, tais como ferimentos cutâneos, ferimentos da córnea e diversas outras soluções de continuidade do epitélio e do tais como úlceras crónicas, queimaduras, incisões cirúrgicas feridas traumáticas e lesões dos orgãos ocos revestidos de tecido epitelial, tais como o esófago, o estômago , os intestinos grosso e delgado, a boca, e os tractos genital e urinário. 0 método consiste na aplicação tópica de uma composição de tratamento que contém AR num núcleo f1sio 1óg1camente aceitável .

.Podem utilizar-se as composições da presente invenção no tratamento de uma ampla variedade de feridas incluindo substancialmente todas as feridas cutâneas, feridas da córnea e lesões dos orgãos ocos do corpo revestidos de tecido epitelial. As feridas adequadas para o tratamento incluem as que resultam de traumas tais como queimaduras, escoriações, cortes e similares, assim como as resultantes de intervenções cirúrgicas tais como incisões cirúrgicas e enxertos de pele.Outras situações adequadas para o tratamento com as composições da presente invenção incluem situações crónicas, tais como úlceras crónicas, úlceras diabéticas e outras situações (tróficas) de não cicatrização. Pode incorporar-se a AR em veículos fisiológicamente aceitáveis para aplicação na área afectada. A natureza dos veículos varia iargamente e dependerá da localização onde se pretenda a aplicação.

Para a aplicação na pele dá-se preferência a um creme ou a uma base para pomada as pomadas adequadas incluem lanolina,

Silv adene (Marion) (especialmente para o tratamento das queimaduras) (Duke Laboratories ,

South Norwalk, Connectisimilares contendo AR

Se se desejar, é possível incorporar composiem ligaduras ou noutros pensos para feridas para proporcionar a exposição continua da ferida ao peptido.

Também se podem utilizar aplicações sob a forma de aerossol.

A concentração de AR na composição de tratamento não é crítica mas deverá ser suficiente para induzir a proliferação das células epiteliais. Podem aplicar-se as composições na área afectada, usualmente como colírios para os olhos ou como cremes, pomadas ou loções para a pele. No caso dos olhos é aconselhável um tratamento frequente, que será habitualmente aplicado com intervalos de 4 horas ou menos. Na pele, será aconselhável a manutenção contínua da composição de tratamento na área afectada durante a cicatrização, com aplicação da composição de tratamento a 4 vezes por dia ou mais frequentemente.

quantidade utilizada do polipeptido referido variará com o modo de administração, o emprego de outros compostos activo s e similares, estando geralmente compreendida entre cerca d e 1 A_g e 1 0 0 Ju g . Pode utilizar-se o referido polipeptido com um veiculo fisio 1 ogicamente aceitável, tal como uma solução salina, solução saiina de tampão fosfato, ou similares. A quantidade do composto utilizado determinar-se-à, empiricamente, com base na resposta das células i n v i t ro e na resposta de animais de experiência, aos referidos polipeptidos ou composições que contenham os referidos polipeptidos.

Podem utilizar-se os compostos de AR sozinhos ou em associação com outros factores, inibidores ou moduiadores ímunoiógicos do crescimento.

5.7.2. DIAGNOSTICO E TRATAMENTO DE NEOPLASIAS

As composições da presente invenção podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico e tratamento de uma ampla variedade de neoplasias ·

Prevêm-se, no campo do diagnóstico, numerosas aplicações de AR e das moléculas com ela relacionadas. Na prática da presente invenção, podem juntar-se os polipeptidos referidos, a um marcador tal como um radioisótopo, uma enzima, uma substância fluorescente, uma substância quimi 1 uminescente, um fragmento de enzima, uma partícula, etc. Podem utilizar-se tais compostos para titular o número de receptores para AR, numa célula. A identificação dos receptores de

AR constitui uma indicação da potencial reacção da célula aos efeitos biológicos de AR e das moléculas com ela re lacionadas.

Pode utilizar-se a AR, as molécuias relacionadas com AR e/ou os anticorpos que rem, em ensaios competitivos para detectar AR no se lhes refemeio, especial4 6 mente no meio fisiológico. Pode utilizar-se uma variedade de ensaios de diagnóstico conhecidos na especialidade.

A presença e os níveis de AR nos tecidos e fluidos cor porais pode relacionar-se directa ou inversamente com a presença e malignidade detecta r e/ou e prognóstico de determinados carcinomas. Os ensaios que podem quantificar AR, podem utilizar-se no diagnóstico do cancro (Ver Secções 5.6, supra ) .

A presente invenção também se refere à detecção do mARN de AR. Podem utilizar-se, e são bem conhecidos na especialidade, os ensaios que utilizam sondas de ácido nucleico para detectar as sequências que compreendem totalmente ou em parte a sequência conhecida de um gene. Os níveis de mARN de AR podem indicar o aparecimento ou a existência de neoplasias pelo que os ensaios que possam quantificar os níveis de mARN de

AR constituem um valioso instrumento de diagnóstico .

Para além disso, podem detectar-se as células malignas que expressam o receptor de AR utilizando AR ou moléculas relacionadas com AR marcadas, num ensaio de ligação ao receptor , ou utilizando anticorpos para o próprio receptor de distinguir-se as células de acordo com a presença e

AR. Podem densidade dos receptores de AR, proporcionando, desse modo, os meios para prever a susceptibi1idade de tais células à actividade biológica de AR.

A AR pode ser utilizada como um composto anti-neop1ásico .

Para utilização in vivo , os compostos que constituem o objectivo da presente invenção, podem ser administrados segundo diversas vias, que incluem mas não se limitam à injecção, perfusão, administração tópica, administração parentérica, etc.

Pode efectuar-se a administração com qualquer veículo fisiolóe aceitável, incluindo solução salina de tampão fosfato, solução salina, água esterelizada, etc as moléculas com ela relacionadas podem também ser encapsuladas em lipossomas e podem conjugar-se com anticorpos a antigenos específicos de células ou que reconhecem e se ligam tumores, proporcionando, assim, um meio para alvejar as composições da presente invenção.

A AR pode ser útil in vivo para induzir diferenciação terminal nas células do tumor. Estas células desviaram-se do curso normal da diferenciação celular característica das células normais e são capazes de continuar a proliferação. As células normais, em contraste, diferenciam-se em células que são capazes, na maioria das circunstâncias, de ulterior divisão célula

Assim, a capacidade de

AR de react ivar a dife renciação ce normal nos tumores, e, finalmente , fazer para o crescimento contínuo do tumor pode utilizar-se de modo v a íoso nos sistemas de terapia de tumores.

Pode utilizar-se a AR, derivados com ela relacionados, seus análogos e peptidos, sozinhos ou com pelo menos, um outro composto a n t i - p r o 1 i Fe r a t i v o , incluindo, por exemplo, um interFerão, TGF- 1 , TGF-Ç>2, Factor 0 de necrose de tumor, Factor cLde necrose de tumor, etc, no tratamento de carcinomas que reagem a hormonas, que podem afectar uma grande variedade de orgãos, tais como os pulmões, a mama, a próstata, o cólon, etc. Também se podem tratar os carcinomas que reagem a hormonas, induzindo a produção de AR nas células cancerosas. Os indutores incluem mas não se limitam a estrogéneos tais como o estradiol 1 7 - , compostos com actividade estrogénica e compostos com actividade anti-estrogénica tal como o TamoxiFen. Também se pode utilizar qualquer associação destes compostos como um indutor.

Podem utilizar-se, i n v i t r o , os compostos da presente invenção, para inibir o crescimento de células ou de linhas de células sensíveis a AR distinguindo-as das células que não são sensíveis. Deste modo, as misturas heterogéneas de linhas de células podem estar isentas de células indesejáveis, se as células indesejáveis Forem sensíveis à actividade inibidora do crescimento de AR.

Podem utilizar-se os compostos da presente invenção, por exemplo, i n v i t ro para eliminar as células malignas da medula, para transplantes autólogos da medula e para eliminar ou inibir a proliFeração de células malignas no sangue antes de re-inFusão.

Pode determinar-se a concentração mais eFicaz de AR para inibir a proliferação de uma dada célula adicionando diversas concentrações de AR à célula do tumor com interesse e verificando a quantidade de inibição da proliferação celular

A concentração mais eficaz de indutores individuais e/ou associações de indutores pode ser determinada verificando a produção de

AR nas células cancerosas.

6. EXEMPLO: PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARAC TER IZAÇAO

DA ANFIRREGULINA HUMANA

As sub-secções seguintes descrevem a purificação e caracterização da Anfirregulina produzida pelas células MCF-7 tratadas com TPA.

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS

Uti1izaram-se os procedimentos que se seguem para induzir a síntese de AR nas células MCF-7 e para preparar e caracterizar a AR substancialmente pura.

6.1.1. ELECTROFORESE EM GEL DE SDS-POL I A CR I LAH I DA

Analisaram-se as proteínas em placa de geles SDS-PAGE (sistema Bio-Rad normal ou mini) conforme descrito (Laemmli, N a t u r e 22 7:680-68 5, 1 970 ) e detectaram-se por coloração com prata (Merril et al., Science 211: 1437-1439, 1981)

-- 50 6.1.2. FOCALIZAÇffO ISOELECTRICA

Efectuou-se a focalização isoeléctrica , essencialmente, de acordo com o descrito nas instruções da Isaiab lechmcal para os geles Resolve IEF. Resumidamente, colocaram-se as amostras sobre geles de agarose previamente fundidos (85x100 mm, a pH 3-10) e foca 1izou-se numa unidade de focalização isoeléctrica Resolve, modelo FR-25OO utilizando um gerador para a electroforese, controlado por um computador Bio-Rad, modelo 3000XÍ. Efectuou-se a focalização dos padrões Bio-Rad IEF ao lado da amostra, coraram-se e exposeram-se os geles a uma película Kodak X-Omat, com um projector DuPont Cronex mais um écran de amplificação .

6.1.3. IODAÇAO DAS PROTEÍNAS , 1 2 5

Marcaram-se as proteínas com I utilizando o método da cloramina T (Barridge, Methods Enzymol. 50:54-65, 1978).

6.1.4. DETERMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS

Determinaram-se as concentrações das proteínas pela absorção a diversos comprimentos de onda (210 a 280 nm). Uti1izaram-se os métodos de Lowry (Lowry et al., _J . B i o 1 . Chem. 1 9 3 : 26 5 - 2 7 5,

1951) e Bradford (Anal . B iochem. 72: 248- 2 5 2, 1 9 76 ) com albumina de soro de bovino como padrão.

1 . 1 . 5 . ENSAIO DE LIGAÇAO DE EGF MARCADO COM I

Efectuaram-se os ensaios em placas de cultura de tecidos com 48 cavidades em que se utilizaram células A4 31 fixadas em formalina e/ou recentemente desenvolvidas, conforme descrito (Carpenter et a., 1979, /. B i o 1 Chem . 254, 1 979, 4484-4891;

Shoyab et al., 1979, Natura 279:387-391, 1979; Delarco, et al., /. B i o 1 Chem . 2 5 5:3685-3690, 1 980 ), ou por imobilização de membranas em placas de cloreto de polivinilo de 96 cavidades, conforme descrito (Kimba II e Warren, Biochem. Biophys. Acta 77 1 :8 2-88, 1 984 ) .

6.2. PRODUÇÃO DE ANFIRREGUL I NA

6.2.1. RECOLHA DO MEIO CONDICIONADO A PARTIR DE CÉLULAS

MCF-7 TRATADAS COM TPA

Efectuou-se a cultura de células MCF-7 em frascos de cultura de tecidos Corning T 150 num volume total de 25 ml de IMDM a 50% (Meio de Dulbeco Modificado de Is c o v e) + DMEM a 50% contendo 0,6 ytg/ml de insulina e soro de feto de bovino a 15% inactivado pelo calor (meio MCF-7 completo). Efectuou-se a sementeira de, aproximadamente, 1 x 10^ células por frasco e incubou-se a 37°C com CO^ a 5 %. No 6°. dia removeu-se completamente o meio e adicionou-se a cada frasco 20 ml de meio MCF-7 completo, recentemente preparado, contendo 100^g/ml de TPA. Decorridas

2 quarenta e oito horas, removeu-se o meio e lavou-se cada um dos frascos com 15 ml de ID ΜM a 50% de +DMEM a 50% (meio isento de soro) e adicionou-se a cada um dos frascos 25ml de meio isento de meio isento de soro recentemente preparado e, incubou-se a 3 7°C com C0₂ 3 5%. Decorridos quatro dias, recolheu-se o meio isento de soro, condicionando, centrifugou-se para se removerem os detritos e armazenou-se a -20°C. Introduziu-se de novo nos frascos 25 ml de meio isento de soro e recolheu-se o meio condicionado isento de soro de três em três ou de quatro em quatro dias.

Ensaiou-se a actividade inibidora do crescimento ( G IA ) de uma aliquota de meio condicionado de cada colheita nas células A431 do carcinoma epidermóide humano. Recoiheram-se , geralmente, 3 ou quatro séries de meio condicionado a partir de cada lote de células MCF-7 tratadas com TPA.

6.2.2. ISOLAMENTO DA AR BRUTA

Descongelaram-se cerca de 4500 ml de meio condicionado e centrifugaram-se a 4°C durante 15 minutos a 3500 rpm. Concentrou-se o sobrenadante num concentrador de 2 litros Amicon utilizando uma membrana YM10 (Amicon) a 4°C. Quando o volume atingiu cerca de 200 ml, adicionou-se 1000 ml de água fria Mili-E-Q e voltou a concentrar-se a mistura para 200 ml. Removeu-se o concentrado e transferiu-se para um tubo de centrífuga Cornina de 2 50 ml arrefecido previamente. Adicionou-se cu idadosamente , com agitação, ácido acético concentrado, até uma concentração

-534 final de

1M de ácido acético. Deixou-se a mistura em repouso, durante 1 hora a 4°C e centrifugou-se, durante 20 minutos a 40 000 g a 4°C numa centríguga Sorvai RC-58. Removeu-se o sobrenadante e armazenou-se a 4°C. Efectuou-se a suspensão do agregado em 30 ml de ácido acético 1 M e voltou a centrifugar-se , conforme se descreveu antes.

Removeu-se, de novo, o sobrenadante, cuidadosamente, agregou-se com o primeiro sobrenadante e, dia 1 isaram-se , depois contra 17 litros de ácido acético 1 M num tubo de diáiise de poros espectrais n5. 3 (peso molecular de admissão de, aproxi-

madamente ,	3000). Mudou-se três vezes o tampão de diáiise, num
período de	dois dias. Liofi1izou-se o produto retido. Removeu-se
o material	seco, misturou-se pesou-se e armazenou-se a -20°C

até subsequente utilização. Designa-se este material por pó bruto .

6.3. PURIFICAÇÃO DA ANFIRREGULINA

6-3.1. CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE FASE INVERSA

Efectuou-se uma suspensão de 950 mg de pó bruto (a partir de aproximadamente 9 litros de meio condicionado isento de soro) em 300 ml de TFA a 0,1 % (ácido trifluoroacético) e, centrifugou-se durante 20 minutos a 7 000 xg. Removeu-se cuidadosamente o sobrenadante e aplicou-se numa coluna de C 18 prepa5 A rativa (2,54 cm x 27 cm; 55-105 micron; Waters) equilibrada com TFA a 0 °ó em água. Efectuou-se a suspensão do suporte cromatográ Fico em acetonitrilo (MeCN) com TFA a 0,1 % colocou-se a suspensão numa coluna de 2,54 cm de diâmetro e lavou-se a coluna com 400 ml de acetonitrilo com

TFA a

0,1% e depois equilibrou-se com 600 ml de TFA a 0,1% em agua.

débito Foi de ml/minuto e efectuou-se a cromatografia à temperatura ambiente.

Lavou-se a coluna com 650 ml de TFA a

0,1 % em água. Recuperou-se, conjuntamente o material de lavagem e de penetração. Depois, efectuou-se a eluição, passo a passo, conforme se segue: 1)

650 ml de MeCN a

0 % / H 0 com TFA a

0,

0' .

'0 1

2)

650 ml de MeCN a

0 % / H 0 com

TFA a 0,1%; 3) 650 ml

MeCN a 60%/H_?0 com TFA uma alíquota

650 ml de MeCN a 100% com TFA a 0,1%. Tomou-se

O' /0 .

de cada uma das fracções e ensaiou-se quanto a

Nas Fracções de penetração e lavagem surgiu cerca de 7 7% da actividade total GIA.

Injectaram-se as fracções de penetração e de lavagem, isocraticamente , numa coluna preparativa Partisil 10 ODS-3 (10 micron, 2,2x50 cm, Whatman) ligada a um sistema (Waters) de crornatografia liquida de alta resolução (HPLC). 0 débito fixou-se em 4 ml/minuto. Uma vez passada a amostra para a coluna, lavou-se a coluna com 250 ml de TFA a 0,1% em água. 0 gradiente linear teve origem entre o dissolvente primário, TFA, a 0,1% em água e o dissolvente secundário, acetonitrilo contendo TFA a 0,1%.

5

As condições do gradiente, foram: de 0 a 15% em 10 minutos:

de 15 a 15% em 30 minutos; de 15 a 25% em 150 minutos e de 65 a 100% em 10 minutos. Todos os dissolventes eram de grau de HPLC. Recolheram-se fracções de 14 ml e ensaiaram-se quanto a GIA alíquotas de cada uma das fracções. Observaram-se dois picos nítidos de actividade (Fig. 1).

Purificou-se a caracterizou-se, subsequentemente, o primeiro pico de eluição (eluido entre 20 e -23% de acetonitrilo).

Reuniram-se as fracções 47 a 62. Adicionaram-se 224 ml de TFA a 0,1% em água, às fracções reunidas. Injectou-se a mistura isocraticamente numa coluna semi-preparativa A BondapacK-C18 (7,8 x 300 mm, Watters), com um débito de 2 ml/minuto, à temperatura ambiente. As condições de gradiente linear foram de 0 a 1 7?ó em 10 minutos; de 17 a 17% em 30 minutos; de 17 a

25?ó em 3 20 minutos-e de 25 a 100% em 40 minutos.

caudal foi de 1 ml/minuto durante o gradiente e recolheram-se fracções de ml. Tomaram-se alíquotas e ensaiaram-se quanto a GIA. Obser varam-se dois picos máximos de actividade efectuando a eluição a concentrações de acetonitrilo de aproximadamente 20% e 21%, respectivamente (Fig. 2.).

Reuniram-se as fracções 49-53. Adicionaram-se 20 mi de

TFA a 0,1% às fracções reunidas. Aplicou-se a mistura ísocraticamente numa c o 1 u n a/*—Bond ap a ck-C 1 8 ( 3,9x 300 mm, Waters) a um débito de 1 ml/minuto, à temperatura ambiente. As condições do gradiente foram de 0-18% em 10 minutos; de 18-18% em 30 minutos; de 18-25% em 280 minutos; de 25-100% em 20 minutos, o débito foi de 0,4 ml/minuto e reco 1 heram-se fracções de 2 ml. A maior parte da actividade emergiu da coluna a uma concentração de acetonitrilo de cerca de 21,5% (FIG. 3A). Reuniram-se as fracções 54-59 (FIG.2) e efectuou.se a cromatografia, exactamente conforme se descreveu antes na FIG. 3A. Eluiu-se a maior parte da actividade, a partir da coluna a uma concentração de acetonitrilo de ap r o x i ma dame n t e 22,2°á (FIG. 3B ) .

6.3.2 CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇAO EM GEL

Concentraram-se individualmente as fracções 35 a 38 (FIG.

3A ) para contendo cerca de 70/^1, utilizando um concentrador Speed-vac ao qual se adicionou um volume igual de acetonitrilo

TFA a 0,1%. Injectou-se esta amostra de 1 4 0 1 em duas colunas Bio-5il TSK-250 (de 7,5 x 300 mm cada, Bio-rad) dispostas de modo encadeado. Efectuou-se a com uma fase móvel de acetonitrilo a à temperatura ambiente e o débito foi eluiçao isocraticamente

0 % / H 0 com TFA a 0,1%, de 4 ml/minuto e a veiocidade do papel de fracções de 0,4 ml

FIGS. 4A , 4B e 4C, registo de 0,25 cm/minuto; recolheram-se e ensaiaram-se aliquotas quanto a GIA. Nas apresentam-se as caracterís11cas cromatográficas das fracções

35, 36 e 37, (FIG.3A) respectivamente.

7

Reuniram-se as fracções 41 e 42 (FIG. 3Θ) e concentraram-se para 7 □ p- 1 e depois submeteram-se a c r orna t og r a f i a de permeação em gel, conforme se descreveu antes. Na FIG. 4D fornecem-se as características crornatográficas.

6.4. ENSAIOS DE CRESCIMENTO CELULAR

6.4.1. ENSAIO DE MODULAÇAO DO CRESCIMENTO

CELULAR UTILIZANDO A INCORPORAÇÃO

EM ADN DE DEXIURIDINA MARCADA COM ¹²⁵I

Efectuaram-se os ensaios em placas de 96 cavidades de fundo chato (Falcon 3072). Uti1izaram-se como células de ensaio as células (A431) do carcinoma epidermoide da vulva humana, para se ensaiar a actividade inibidora do crescimento (GIA) e fibroblastos do prepúcio humano (Sadamoto) como células indicadoras da actividade estimuladora (GSA). Colocaram-se em todas íi as cavidades, excepto nas cavidades periféricas 3,5 x 10 células em 50/11 1 de DMEM enriquecido com soro de feto de bovino a 5% inactivado pelo calor (FBS), penicilina/estreptomicina (PS) e glutamina (meio de ensaio). Nos recipientes periféricos colocou-se 50/ 1 de PBS . T rês horas mais tarde, adicionou-se a cada recipiente 50/^1 de amostra de ensaio em meio de ensaio, enquanto os recipientes de controlo receberam apenas de meio de ensaio. Uti1izaram-se três cavidades para cada concentração da amostra de ensaio. Incubaram-se as placas a 37°C, durante 2 a sg dias. Depois disto, adicionaram-se 100 £Ί de uma solução de ? 5 1 7 5 —

I-iodo-2'- ~ I-desoxiuridina / 4 Ci/mg-0,5mli/ml(2/izl)ml em meio de ensaio)_7 a cada uma das cavidades e incubaram-se as placas a 37°C. Decorridas 4 a 6 horas, aspirou-se o meio das cavidades e lavou-se uma vez com 200^1 de PBS. Depois, a d ι cionaram-se 200 J-Ll de metanol a cada cavidade, incubaram-se as placas durante 10 minutos à temperatura ambiente e, removeu-se o metanol por aspiração. Adicionaram-se 200 /Dl de hidróxido de sódio 1M a cada cavidade, incubaram-se as placas durante 30 minutos a 37°C. Removeu-se o hidróxido de sódio com rolhões titertek (Flow Labs). Transferiram-se os rolhões para tubos de plástico de 12 x 75 mm e contaram-se num contador de raios

2 5 gama para quantificar a incorporação de I-IVdR .

6.4.2. ENSAIOS DE COLONIAS EM AGAR MACIO

Adicionou-se uma camada base de 0,5 ml de agar a 0,5?!

(Agar Nob1e; Difco Laboratories, Detroit Michigan) em DMÉM contendo FBS a 10?ó inactivado pelo calor, a placas de cultura de tecidos, Costar, de 24 cavidades. Colocou-se, por cima da camada basal de agar, 0,5 ml de agar a 0,3 ?□ , contendo a mesma mistura meio/FBS, 5-10x10^ células de ensaio e os factores a serem ensaiados, a diversas concentrações. Incubaram-se as placas a 3 7°C em atmosfera humidificada de C 0 ? a 5?á em ar e voltou a suprir-se, passados 7 dias pela adição de 0,5 ml de agar a 0 , 3contendo o mesmo meio e as mesmas concentrações do material

9 de teste. Enumeraram-se as colónias que não se fixaram nem foram tingidas e registou-se o número de colónias superior a 20 entre o 75. e o 145. dia.

6.4.3. ENSAIO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR

Colocaram-se 2,1 χ 10^ células A431 por cavidade em 0,3ml de meio (D Μ E M com FB5 a 10 %, de 24 cavidades (cerca de 2

P/S, glutamina) em .

cm por cavidade) e placas Gostar incubaram-se durante 2 horas a 37°C. Depois, introduziram-se amostras de ensaio a diversas concentrações, em em cada cavidade duplicado. Os recipientes de controlo receberam meio sem qualquer amostra.

Incubaram-se as placas a 37°C durante 72 noras. Depois, aspirou-se o meio, lavaram-se as células com 1 ml de PBS/cavidade·, separaram-se com 0,5 ml de tripsina (0,5?ó)-EDTA (0,5 mH) e con taram-se, utilizando um contador Coulter.

6.5. ANALISE DA ESTRUTURA PRIMARIA DE AR

6.5.1. REDUÇÃO E S-PIR ID ILET ILAÇA0

Secou-se a AR ( 20-30 Ag) num tubo de microcentri fugação de 1,5 ml, de po 1ipropi1eno e efectuou-se a sua suspensão em 100/^1 de ureia 3 M em Tris-HCl a 0,05 M, pH 7,5. Adicionaram-se 4 ^jul de 2-me r c a p t oe t ano 1 , m i s t u ra r am-s e os ingredientes, submeteram-se a um jacto de azoto e incubaram-se a 25°C. Decorridas

2,5 horas, adicionou-se à mistura 4

J de 4 - ν i η i 1 ρ i r i d i η a recentemente destilada, submeteu-se jacto de azoto e incubou-se durante novamente, o tubo a um horas a 25°C. Acidificou-se a mistura reaccional para pH 2, com TFA a 10%. Purificou-se a AR S-piridi1eti1 a d a por HPLC rp utilizando uma colunaJ/-Bonda p a k C 1 8 (3,9x300 mm, Waters).

Aumentou-se linearmente a concentração de acetonitrilo (1%/minuto) durante 55 minu tos, a um débito de ml/minuto. A AR S-piridi1eti1 a d a (SPE-AR) eluiu-se em acetonitrilo a cerca de 26,5%, uma concentração de acetonitrilo aproximadamente 4% superior do que para a AR não tratada.

6-5-2. TRATAMENTO COM N-GLICANASE

Secou-se a AR ou a AR S-piridiletilada (10-20 Ji/g ) em t u bos de microcentrifugaçào de po 1 ipropi leno de 1,5 ml, efectuou-se uma suspensão em 80 p/1 de tampão fosfato 0,1 M, a pH 5,5, adicionaram-se 10-20^1 de N-Glicanase (0,25 unidades//^l, G e n z i m a ) , incubou-se a mistura durante 16 horas a 37°C e adicionaram-se

0,9 ml de TFA a à mistura reaccional e injectou-se a amostra numa coluna ultraporosa RPSC C^ rp HPLC (4,6 x 75 mm,

Altex ) a um débito de 1 ml/minuto, previamente equilibrada com o solvente primário TFA a 0,1%. Utilizou-se como dissolvente se cundário acetonitrilo com TFA a 0,1%. Aumentou-se linearmente a concentração de acetonitrilo (0,4%/minuto) durante 85 minutos, à temperatura ambiente. Eluiram-se a aproximadamente 16,5 e

-612 0,5?ό de concentração de acetonitrilo a AR N-desglicosilada a AR N-desglicosilada e S-p i r i d i le t i 1 ada respectivamente.

6.5.3.

CLIVAGEM ENZIMATICA DE AR S - Ρ I R I D I L E T I L A D A

TRATADA COM N-GLICANASE

Efectuou-se a clivagem com endopeptidase Lis-C em 60 //1 de tampão Tris-ácido acético 0,1M, a pH 8,0 a 25°C, durante 16 horas. A proporção enzima/substrato era de 1 para 5 (peso/ /peso). Efectuaram-se as gigestões com endopep11 d ase-Arg e com S . a u r e u s V 8 protease, em 80 /q de Tris-HCL 0,05 M, a pH 8,0

e carbonato	de hidrogénio e amónio a 0,1 M, a 37°C, durante
16 horas. A	proporção enzima/substracto foi, novamente, de 1
para 5 .

6.5.4. CLIVAGEM QUÍMICA

Para clivagem por CNBr do resíduo de metionina, secaram-se py g de AR S-piridi 1 eti1 a da tratada com N-Glicanase, em tubos de microcentrifugação de polipropileno de 1,5 ml, efectuou-se a suspensão em 75 /-d de ácido fórmico a 7 0%, depois, adicionou-se

5 de solução de CNBr (25mg/ml em HCOOH a 7 0 ?ó) , misturou-se, e submeteu-se o tubo a um jacto de azoto. Efectuou-se a reacção durante 22 horas a 25°C, ao escuro. Diluiu-se para 1,1 ml com água, a mistura reaccional e, secou-se num concentrador Speed-Vac. Efectuou-se a suspensão das amostras secas em 20 llzl de

2-aminoetanol, deixou-se em repouso durante 10 minutos a 22 C e, depois, secou-se sob vazio. Efectuou-se a suspensão da mistura em 0,9 ml de TFA a 0,2%

6.5.5. ISOLAMENTO DE PEPTIDOS

Separaram-se os peptidos numa coluna Cl 8 de HPLC de fase inversa (4,6 x 100 mm, Whatman) ligada a um sistema de HPLC (Waters). Aplicou-se a amostra acidificada (pH 2,0' numa coluna equilibrada com TFA a 0,1% (dissolvente primário) com um caudal de 1 ml/minuto e lavou-se depois a coluna com cerca de 15 ml de TFA a 0,1%. Uti1izaram-se gradientes lineares entre o dissolvente primário e o dissolvente secundário acetonitrilo com TFA

a 0,1%. As condições do	gradiente foram de	0 a 5 0%	em	125 minu-
tos para um caudal de 0	,5 ml/minuto.
6.5.6. Análise de	Aminoácidos
As amostras secas	foram hidrolisadas	c o m H C L	e m	ebulição
constante (5,7 M, Pierce) contendo fenol a	1 % ( v / v )	) sob pressão
reduzida, num balão de	hidrólise, de vidro,	, vedado	com	Te flon

durante 16 horas.

Secaram-se os hidrolisados num concentrador

Speed Vac (Savant

Instruments) e derivaram-se com isotiocinato de fenilo durante minutos à temperatura ambiente. Ana 1isaram-se os derivados aminoácidos de fenilcarba-milo por HPLC rp numa coluna de Octadecilo (4,5 χ 250 mm, IB M) .

gradiente linear efectuou-se entre o dissolvente primário, acetato de sódio 0,15 M, a pH 6,4, trietiiamina a 0,05% titulada para pH 6,4 com ácido acético e o dissolvente secundário, acetoni trilo a 60% para um caudal de ml/minuto , a 38°C .

6.5.7.

Determinação da Sequência de Aminoácidos

Determinaram-se as sequências peptídicas com um sequen ciador de fase gasosa Applied Biosystem, modelo 475, conforme descrito por (Hewick et al., J Biol. Chem. 256: 7990-7997, 1981). E f e c t u a r am - se três ciclos prévios de degradação de Edman antes da aplicação da amostra para cada processamento. Utilizou-se TFA a 25% para converter os derivados triazoiínicos em aminoácidos fenil-tio-hidantoínicos

Efectuou-se a identificação dos aminoácidos fenil-tio-hidantoínicos de modo contínuo num analisador, Modelo 120 A PTH (Applied Biosystem) conforme descrito (Hunkapi1ler e Hood, Science 219: 650-659, 1983).

6.5.8. DIVERSOS TRATAMENTOS

Uti 1 izaram-se para estas experiências 50- 1 00 unidades de AR semipura (passo semi prep. rp C18) ou aparentemente pura (Quadro 1). Obtiveram-se a 0-Glicanase e a N-Glicanase na Genzime, Corp., Boston. Obtiveram-se todas as outras enzimas na Bochringer Mannheim Biochemicals ou Worthington Biochemicals. Efectuaram-se os tratamentos em 50-200 1 de tampão adequado.

Utilizou-se um excesso de enzimas, habitualmente 5-20% (p/p ) da concentração do substracto. Após tratamento, analisaram-se as amostras em relação a GIA, eliminando os materiais que interferem, por diversos meios analíticos. Na maioria dos casos, ajustou-se o pH das amostras para cerca de 2 com TFA a 10%. Aplicaram-se as amostras numa coluna 03 RPSC de ultra-poros de fase inversa (4,6x75 mm, Altex) equilibrada com TFA a 0,1%. Lavou-se, depois a coluna com o primeiro dissolvente com TFA a 0,1%. Depois, iniciou-se a eluição utilizando acetonitrilo com TFA a 0,1% como dissolvente secundário. As condições do gradiente foram de 0 a 50% durante 0,2 minutos e de 50 a 50% durante 19,8 minutos. 0 caudal foi de 0,5 ml/minuto e recuperaram-se fracções de 2 ml. Tomaram-se alíquotas e ensaiaram-se quanto a GIA. Eluiu-se a actividade de AR, usualmente, na fracção 4 .

6.6. ESTUDOS DE LIGAÇAO DE ADN

Efectuou-se a ligação de AR a celulose natural de ADN do timo de vitela, a ADN desnaturado do timo de vitela e a celulose, conforme descrito (Herick e Alberts, Methods in Enzymology , 21: 198, 1971). Hidrataram-se novamente as celuloses (10 mg) em 500 1 de tampão de carga (Tris 20 mH, a pH 7,4, glicerol a 10%, EDTA 1 -mercaptoetanol 1 mM, 100 g/ml de BSA e NaCL 50 nM). Efectuaram-se as reacções em duplicado em tubos eppendorf de 1,5 ml com 300 1 (volume empacotado) de amostras

- 6 5 de celulose hidratada, lavadas 5 vezes com tampão de carga.

Depois , adicionou-se a cada tubo 0,2 ng de actividade específica de

AR marcada com

2 5

I, de 425 li/ g ou de outra proteína marcada

2 5 com I em 250 1 de tampão de carga. Agitaram-se as amostras e incubaram-se a 4°C durante 20 minutos com agitação periódica e, depois, lavaram-se 5 vezes com 200 1 de tampão de carga, por lavagem. Efectuou-se a eluição, passo a passo, com NaCL 0,1 Μ, 0,15 M, 0,25 Μ, 0,6 Μ, 1 M e 2 M em tampão de carga (5 vezes com 200 1 para cada concentração). Definiu-se como material de ligação específica aquele que se eluiu a uma concentração de NaCL de 0,25 M ou superior. Considerou-se não especificadamente ligado o material que se eluiu a uma concentração de NaCL de 0,15 M, ou inferior.

6.7. RESUL TADOS

6.7.1. PRODUÇÃO DE AR PELAS CÉLULAS MCF-7

TRATADAS COM TPA.

As células MCF-7 desenvolvidas num substracto plástico exibem características epite1ióides : as células são pequenas e de configuração poligonal. 0 TPA induz modificações morfológicas profundas, de um modo que depende da dose. A seguir ao tratamento com TPA, as células MCF-7, perdem a sua morfologia bem definida, tornam-se arredondadas e expandem-se. 0 TPA despoleta uma redução no número de células e um aumento do volume

6β celular, dependentes da dose, quando se compara com as células não tratadas.

meio condicionado isento de soro das células MCF-7 não contém qualquer actividade inibidora do crescimento detectável para as células A431. Contudo verificou-se que os sobrenadantes isentos de soro recolhidos a partir de células MCF-7 tratadas com TPA durante 2 a 3 dias inibiam a proliferação das células A431 do carcinoma epidermóide. A indução óptima da actividade inibidora observou-se entre 25 e 100 hg/ml de TPA. Mesmo depois de se remover o TPA as células MCF-7 tratadas com TPA segregavam esta actividade no meio isento de soro, pelo menos, durante oito dias. Apesar de se ter verificado uma redução da actividade inibidora do crescimento, algum tempo após a remoção de TPA, estes resultados indicam que a Anfirregu1ina induziu ou aumentou a expressão das células MCF-7 que se trataram com TPA .

6.7.2. CARACTERIZAÇAO INICIAL

Quadro I resume os efeitos dos diversos tratamentos físicos, químicos e enzimáticos na actividade antiproliferativa da Anfirreguiina. A GIA (actividade inibidora do crescimento) da Anfirregulina resistiu ao tratamento com ácido acético 1 M, hidróxido de amónio 1 M, ureia 6 M e metaperιod ato de sódio 0,01 Μ, aquecendo a 56°C durante 30 minutos, e os tratamentos com neuraminidase, N-Glicanase, O-Glicanase, lipase, fosfolipase A2, C ou D. No entanto, a actividade foi sensível ao aquecimento a 100°C, durante 10 minutos, à redução, ao tratamento com 4-vιni1piridina e redução, e à digestão com proteinases como a Tripsina, endopeptidase-Lys-C , endopep11d ase-Arg e en dopeptid ase-G1u (V-8). Estes resultados sugerem que a Anfirregulina é uma proteína que contém cisteínas com ligações dissulfídicas que são essenciais para a sua actividade biológica.

Esta proteína pode conter porções oligossacaridicas e/ou lipidicas que não se destinam, obrigatoriamente, à sua actividade biológica .

QUADRO II

Efeitos de Diversos Tratamentos sobre a GIA da Anfirregulina

Tratamento '

Percentagem de controlo

Acido Acético 1M durante 2 horas a 4 ⁰ C102

N H 4 0 H 1M durante 2 horas a 4°C97

56°C durante 30 minutos96

1OQ°C durante 10 minutos5

Ureia 6 N Í2h a 25°C)82

2-mercaptoeta no 1 0,2 M' (2,5h a'25°C)6

2-mercaptoeta η o 1+ 4 vinilpiridina (2.5h a 25°C) + (2h a 25°C)1

Metaperiodato de sódio 0,01 (6 h a 4°C no escuro) 86

TPCK-tripsina (6 h a 37°C)3

TPCK-trpsιna+inibidor da tripsina de soja (6 h a 37°C) 82 Inibidor da trpsina de soja (6 h a 37°C)109

Endopep11d ase Lys-C (20 h a 25°C)5

Endopeptidase Arg (16 h a 37°C)4

Endopeptidase Glu (16 h a 37°C)6

Neuraminidase(l6ha37°C)103

N-Glicanase (16 h a 37°C) ·90

0-Glicanase (16 h a 37°C)102

Neuraminidase + N-Glicanase (16 h a 37°C)94

Neuram ι nidase + 0-Glicanase (16 h a 37°C)105

FosfolipaseA2(6ha37°C)82

Fosfolipase C (6 h a 37°C)95

Fosfolipase D (6 h a 37°C)80

Lipase (6 h a 37°C)

6.7.3. PURIFICAÇÃO DA ANF IRREGULINA

No Quadro III apresenta-se um resumo da purificação da anfirregu 1 ina . Atingiu-se uma purificação de 1842 vezes com um rebdimento de 5,1% para a fracçao TSK 25Q-I e obteve-se uma purificação de 2 270 vezes com uro rendimento de 1 , 7?ó para a fracçao TSK

250-11. 0 método é reprodutível. Purificou-se a anfirregulina em quatro ocasiões diferentes, obtendo-se resultados semelhantes.

A actividade específica da anfirregu 1 ina purifi3,4 x 1 O⁶ cada situa-se no intervalo compreendido entre 2,7 a unidades/mg de proteína. A anfirregu1ina purificada da coluna

TSK-250-I, tendo uma actividade específica de cerca de 3,0 x 10⁶ utilizou-se para determinações estruturais e outros estudos bioquímicos .

QUADRO III

F racção	Resumo Volume (mL)	da Purificação da Anfirregu 1 ina	(GIA)
Proteína ( g)	GIA * (unidade X10 ⁷	Actividade Especí fica s unidades por mg	Rendi- ^:mento 0' /0	'Purificação (N°. de vezes)
Bruta	300	916 600	1363	1 ,49	100	1
Prep. C18 Passagem de caudal e lavagem	950	532 000	1052	1 ,98	77,2	1 ,3
Prep- rp. ODS	225	2 281	286	125,43	21 ,0	84,2
Semi prep. rp-018-Ι	20	339	'97	286,14	7,1	192,0
-II	20	235	92	391,49	6,7	262,7
Anál rp. Cl 8-1	6	242	50	206,61	3,7	138,7
-II	6	173	46	265,89	3,4	178,4
T5K 250-1	3,6	25,5	70	2.745,10	5,1	1 -842,3
I-A	1,6	6,6	15	2.272,73	1,1	1.525,3
I-B	1,2	11,4	33	2.894,74	2,4	1.942,8
I-C	0,8	7,5	22	2.933,33	1 ,6	1.968,7
TSK 250-11	1,2	6,8	23	3.382,35	1,7	2.270,0

* Fornecem-se os pormenores na secção 6.1.3. e nas suas sub-secções supra Definiu-se uma unidade de GIA como a quantidade de factor necessária para

125 inibir em 50% a incorporação nas células A431 de I-desoxiuridina.

6.7.4. ANALISE POR HPLC DE ANFIRREGUL I NA (AR) E DE

ANF IRREGULINA 5-P I RIDILETILADA (SPE-AR)

Nas FIGS. 5A e 5B, apresentam-se, respectivamente, a cromatografia de permação de gel de AR e de SPE-AR numa coluna

TSK 250 (7,5 x 600 mm, Bio-Rad). A actividade eluiu-se conjun-

tamente com o	pico de proteína (5A). Determinou-se o peso mole-
cular de AR e	de SPE-AR a partir dos dados da FIG. 5 e verifi-
cou-se serem,	aproximadamente, 14 000 e 17 000, respectivamente.

Os pesos moleculares calculados para as estruturas de AR truncada e de AR, apresentados na FIG. 12 são de aproximadamente 8 500 e 9 100 daltons, respectivamente.

Eluiu-se a AR e a SPE-AR como picos simples simétricos a partir de uma coluna (4,6 x 75 mm, Altex) HPLC rp C3RPSC de ultraporos (FIG. 6A e B). A GIA purificou-se conjuntamente com o pico de proteína (FIG. 6A). A SPE-AR eluiu-se a uma concentração de acetonitrilo de cerca de 21 % aproximadamente superior em 4?á à concentração de acetonitrilo da proteína não tratada. Estes resultados sugerem que a AR é rica em resíduos de cisteína que são modificados pela 4-viηi1piridina, tornando, assim, a AR mais hidrófoba eluindo-se, por consequência, a uma concentração de acetonitrilo mais elevada

6.7.5. ANALISE SDS-PAGE DE AR

A FIG. 7A apresenta uma análise de AR, de AR tratada por

N.-gl ícanase	(NG-AR), SPE-AR e de SPE-AR tratada por N-glicanase
(NG-SPE-AR)	em acrilamida a 15% sob condições redutoras (FIG.
7A ) . A AR e	a SPE-AR migraram no gel, como uma faixa única di-

fusa e ampla, com peso molecular médio relativo de 22 500, num intervalo compreendido entre cerca de 20

000 e 25 000 (Pistas e 3 ) . Do tratamento de AR e

SPE-AR com

N-glicanase resultou a migração mais rápida destas proteínas .

migraram como uma faixa única com pesos moleculares médios de

000 e 14 500 daltons, tados semelhantes quando a 15%, sob condições não respectivamente. 0bservaram-se resul se processaram as proteínas sobre gel redutoras (dados não apresentados).

tratamento de AR com neuraminidase, o-glicanase, ou conjuntamente com neuraminidase e o-glicanase, não alterou a sua mobilidade e1ectroforética no gel quer em condições redutoras, quer em condições não redutoras. Assim, a AR é uma g 1 icoproteína de cadeia simples que contém uma ou mais cadeias o 1 igossacarídeas ligadas a N, as quais não são necessárias para a GIA de AR i n v i t r o .

Do tratamento de NG-AR ou de AR com fosfolipase D (PLD) (couve, cabbage) resultou a redução de GIA para 80% do controlo. Submeteu-se a NG-AR tratada com PLD a rp-HPLC numa coluna C3 e analisaram-se os picos activos purificados por SDS-PAGE a 20% (FIG. 7B). Observou-se uma única banda de 5 600 M1. Estes resultados indicam que PLD ou alguma(s) protease(s) de contaminação na preparação de PLD converteram a AR em fragmento(s) a c t i v o ( s ) .

3

6.7.6 . ANALISE DE AR POR FOCALIZAÇAO ISOELECTRICA (IEF) ? 5

Efectuou-se a analise IEF de AR marcada com ~ I conforme descrito na Secção 6.1.1.2., supra. A AR concentrou-se como uma ampla faixa simples com P j. entre 7,6 e 8 (FIG.8). A NG-AR concentrou-se como uma faixa única com Pde cerca de 8,05.

Assim, a AR é uma g 1 icoproteína Básica N-ligada de cadeia simples.

6.7.7. PROPRIEDADES BIOLÓGICAS

Na FIG.9 proporciona-se a inibição da incorporação da

2 5

I - desoxiuridina dentro do ADN das células A 431 , por diferentes concentrações de AR purificadas. Observou-se uma inibição de 5 0% na síntese do ADN a, aproximadamente, 0,2 ng/cavidade. Então, observou-se, uma inibição de 50% na síntese do ADN nas células do carcinoma epidérmico humano a uma concentração de 0,13 nM de proteína pura. Contudo, dever-se-à ter em conta que a GIA de AR depende de condições experimentais tais como o número de cé 1 u 1 as/cavidade (densidade celular), tempo de aplicação do factor, duração do tratamento, concentração do soro e outras variáveis.

Quando se desenvolvem as células A431 na ausência ou na presença de diversas concentrações de AR, e se verifica o crescimento celular por uma contagem directa de células, verifica-se que a AR inibe a proliferação de A431 de um modo que depende

-74da dose (dados não apresentados). Assim, o grau de incorpora12 5 ção de I - d e s o x 1 u r i d i n a dentro do ADN e uma boa medida do crescimento celular.

Na FIG.9 apresenta-se a estimulação da incorporação de

2 5

I - desoxiuridina dentro do ADN dos fibrobiastos do prepúcio humano (Sadamoto) por diversas concentrações de AR purificada. Observou-se uma estimulação duas vezes superior da incorpora_12 5 çao de I-desoxiuridina a, aproximadamente, 0,7 ng/ml ou a, aproximadamente, 0,05 nM de AR. A resposta máxima foi uma esti12 5 mulação de, aproximadamente 6 vezes da incorporação de I-desoxiuridina nestes fibrobiastos. Assim, a AR actua como um factor de crescimento para os fibrobiastos humanos mesmo na presença de FBS a 5?ó.

Investigou-se o efeito de AR na incorporação de

125 l - de soxiuridina dentro do ADN de diversas linhas de células tumorais e não tumorais e de algumas linhas de células não humanas.

Os dados apresentam-se no Quadro IV. A AR inibiu o crescimento de diversos clones de células A431 células HTB132 do carcinoma da mama humana células HTB 1575 di tetracarcinoma do ovário humano, células CRL 155 do carcinoma epidermal da região cervical humana, células HTB75 do adenoma papilar do ovário humano e, das células HTB 26 do adenocarcinoma da mama humana. Não manifestou qualquer efeito significativo sobre uma diversidade ' > 12 5 de células (Quadro 3). A AR estimula a incorporação de I-de75

soxiuridina

em diversas linhas de células de fibroblastos hu-

manos, nas células CRL 7386 do tumor da pituitária humana, nas células HTB 77 do adenocarcinoma do ovário humano, nas células BSC1 do rim do macaco verde Africano e nas células SA6 do rim do rato. A AR não afectou significativamente a proliferação

das células	T,B ou endoteliais. A AR não suprime as respostas
citotóxicas	ou pro 1iferativas das células T humanas, em reac-
ções mistas	de culturas de leucócitos (ΓΊ L C ) .

A AR é uma proteína monomérica que requer pontes dissulfídicas entre cadeias, para a sua actividade, que não necessite de glicosilação para actividade, que se mantém estável sob tratamentos ácidos e básicos, moderados e, que se mantém estável quando tratada pelo calor a 56°C, durante 30 minutos. A AR perde completamente a sua actividade biológica quando reduzida, quando aquecida a 100°C durante 5 minutos, quando digerida com tripsina, end opeptidase-Lis-C , endopeptidase-Arg ou endopeptidase-Glu .

QuaΊ 6

QUADRO IV

EFEITOS DA ANFIRREGULINA NA PROLIFERAÇÃO CELULAR ^a

CÉLULAS INDICADORAS

ACTIVIDADE INIBIDORA

DO CRESCIMENTO (UNIDADES)^b

ACTIVIDADE ESTIMULADORA DO CRESCIMENTO

Q (unidades)

Humanas	A431 do Carcincma Epidenráide da vulva	125
Humanas	HTB132 do Adenocarcincma da mama	240
Humanas	CRL155O do Carcincma Epidermóide da região cervical	28
Humanas	HTB75 do Adencma Papilar do ovário	19
Humanas	HTB1572 do Teratocarcincma do ovário	55
Humanas	HTB26 do Adenocarcinoma da mama	5
Humanas	A375 do Melanoma	N.D.	N.D.
Humanas	ZR753O do Adenocarcincma da mama	N.D.	N.D.
Humanas	MCF-7 do Adenocarcinoma da mama	N.D.	N.D.
Humanas	A549 do Adenocarcinoma do pulmão	N.D.	N.D.
Humanas	PC3 do Adenocarcincma da próstata	N.D.	N.D.
Humanas	H3347 do Carcincma do cólon	N.D.	N.D.
Humanas	CEM (células T) linfoblastóides	N.D.	N.D.
Humanas	Célula 8 transformadas por EBV	N.D.	N.D.
Humanas	Hep 2 do Carcincma epidérmico da laringe	N.D.	N.D.
Humanas	CRL 1594 do carcincma cervical	N.D.	N.D.
Humanas	HTB 77 do Adenocarcincma do ovário		25
Humanas	Fibrcblastos do prepúcio (Sadamoto)		225
Humanas	Fibrcblastos do prepúcio (Goodwin)		70
De Bovino	Células endoteliais de coração de feto	N.D.	N.D.
De Murídeo	3T3/Balb	N.D.	N.D.
De Símio	BSC-1 de rim do macaco verde africano		65
De Símio	SAG de Rim do macaco verde africano		45

a - E fectuou-se a suspensão de 125 unidades (GIA nas células A431) de AR em 250 ^1 de meio de ensaio, diluído cinco vezes, em série ccm meio de ensaio. Utilizaram-se seis diluições para cada célula.

Ensaiaram-se as Fracções quanto à sua actividade moduladora do crescimento e calcularam-se as unidades de GIA e de GSA.

b - Definiu-se uma unidade GIA como a quantidade de factor necessária para inibir em 50% a incorpora125 ção de I-desoxiuridina, dentro das células.

c - Definiu-se uma unidade GSA ccmo a quantidade de factor necessária para aumentar em lOOPó a incorpo125 ração de I-desoxiuridina dentro das células.

N.D. = Não detectável.

- 77 Observou-se o efeito da AR e de EGF sobre a formação de colónias de células NRK-SA6, em agar macio, na presença ou na ausência de TGF-p e, apresentam-se os resultados no Quadro V .

A EGF induziu o crescimento independente de fixação das células SA6 de um modo que depende da dose, na presença de IGE-^ , ao passo que se verificou que a AR é um indutor muito fraco da formação de colónias Sa-G em agar macio (Quadro V ) .

QUADRO V

Efeito de AR e de EGF sobre a formação da colónia de células NRK-SA6 em Agar macio

Adição (por ml)

Número de colónias por 6 campos

Sem	adição				0
TGF	- P ( 1 ng)				0
AR	(2 ng )				0
AR	(4 ng )				0
AR	(2 ng ) +	TGF-	3(1	ng )	7
AR	(4 ng) +	T GF - jí	3 (1	ng )	8
EGF	(2 ng )				0
EGF	(4 ng )				6
EGF	(2 ng) +	TGF-	P	( 1 ng )	30
EGF	(4 ng ) +	TGF-		( 1 ng )	1 1 4

Efectuaram-se os ensaios conforme descrito nesta secção.

Definiram-se as colónias como um cacho de, pelo menos, seis células .

/78

6.7.8. EFEITO DE AR SOBRE A LIGAÇAO DE EGF

AOS SEUS RECEPTORES ESPECÍFICOS

Descobriu-se que a AR inibe a ligação de ? 5

I-EGF às lulas A431 bem como às membranas plasmáticas de

A431 (FIG.

10).

Verificou-se uma inibição de 50% da ligação de ²⁵I-EGF às celulas fixadas e às membranas celulares a cerca

1,8 Dide EGF, respectivamente, enquanto se verificou urna redução

0% na ligação de EGF às células e membranas celulares ximadamente, 1,8 η M e 5,7 nM de

AR, respectivamente. A

EGF não marcada inibe completamente, em

125 racção do receptor de I-EGF, elevadas concentrações em ambos os sistemas.

No entanto, a competição máxima com AR foi de

5 ?ó e de 5 0% para a ligação às células e membranas celulares, respectivamente. As curvas de competição para AR, também não foram paralelas às observadas com EGF. Estes resultados sugerem que AR exibe uma afinidade menor para os receptores de EGF do que a EGF. A

AR pode, também, possuir o seu receptor específico estreitamente relacionado com o receptor de

Se 1 eccionaram-se diversos clones da linha de células A4 3 1 com sensibilidade variável para a inibição de e observou-se uma falta de correlação entre a sensibilidade

AR e o número de receptores de EGF por célula ou KD (Quadro

QUADRO VI

Falta de Correlação entre a Sensibilidade da Anfirregulina de Diversos Clones de A431 e o Número KD do receptor de EGF

Parâmetros de ligação a Sensibilidade

EGF Relativa

Clone de A431____________Locais de ligação por célula K (NH) (GIA) AR

D

A-3	4,6	X	10	1 ,80	34
F-8	9 _;	,0	X	10⁵	3,13	20
A-2	5 .	, 1	X	10⁵	1 ,38	1 1
A-8	5,	,3	X	10⁵	3,18	1

Seleccionaram-se diversos clones de A431, desenvolvendo-os em agar macio. Efectuou-se a ligação de EGF, conforme descrito na Secção 6.6.1.5., supra . Ca 1cu1 aram-se os KD e o número de locais de ligação a partir de diagramas de Scatchard (Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. 51:660-672, 1949.

6.7.9. ESTRUTURA QUÍMICA DA ANFIRREGULINA

Deduziu-se a sequência de aminoácidos de AR a partir de uma análise de micro-sequência da proteína S-piridi 1 eti1 ad a (SP E-AR ) e dos fragmentos originados pela endoproteinase Lis C, estafi1 ococa 1 aureus V8 e endopeptidase Arg. As sequências da proteína truncada e da proteína contendo seis aminoácidos adicionais são as seguintes:

AR Truncada

1 U

V

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Ρ P Q

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K T

1 0 E

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E

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78 K

AR mais extensa

1

1 0

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V

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40

50

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G K

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R

N

R K K

K

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E F Q N F C

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60

70

80

84

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G

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E

H

L

Ε A V

T

C

K

c

Q

Ε Y F G E R

C

G

E

K

Na sequência anterior utiliza-se para cada aminoácido a abreviatura padrão de uma letra do aminoácido. Indicam-se entre parênteses os resíduos aminoácidos para os quais há dúvidas quanto à sua identidade. A letra X indica um aminoácido de identidade desconhecida. Descobriu-se que a quantidade de AR mais extensa era de cerca de 16% da AR truncada.

Comparou-se a sequência proteica de AR, com todas as outras proteínas da base de dados da National Biomedical Research Foundation (PIR 13); Genetic sequence Data Bank (Bolt Beraneck e Newman, Inc . , Los Alamos National Laboratorv; Release fr 50) e com a biblioteca de sequências de ADN (Release, /^12) do European Molecular Biology Laboratory. Estas pesquisas revela ram que AR é uma nova proteína e um membro da super-família EGF dos factores do crescimento. Esta família inclui EGF (ratinhos, seres.humanos, ratos, bovinos, etc.), TGF-, factores do crescimento virai (vaccinia, mixo, e fibroma de Shope), ac tivador do plasminogénio humano, factor IX de bovino, factor humano, receptor LDL, a proteína C de bovino, proteína do núcleo do proteo glicano humano, produto do gene de Drosophila Notch, produto do gene do C. elegans lin 12 e produto do gene específico da linhagem de células do ouriço do mar S. purpuratus. O alinhamento da estrutura de AR com as estruturas das proteínas da super-família EGF revela a AR, de modo idêntico ao de outros membros da super-família EGF, contém os seis resíduos essenciais de cisteína, de contraste, conserva o intervalo do resíduo de cisteína e contém alguns dos aminoácidos característicos e altamente conservados. Parece que a AR se situa entre os membros da família dos factores do crescimento que se assemelha a EGF, TGF e aos que se assemelham a MGF, SFGF, especialmente no que diz respeito ã utilização de asparagina. Por exemplo, na posição 2 (a primeira cisteína = 1) todas as TGFs e EGFs possuem prolina, YGF possui Glicina e MGF, SFG e AR têm asparagina. No mesmo anel, na posição 7 as EGFs e VGFs possuem glicina, as TGFs possuem glutamina e a MGF, SFGF e AR possuem asparagina. No entanto, no terceiro anel a AR não possui a configuração beta conservada na posição 34 (uma asparagina em MGF e SFGF e, uma glicina em todos os outros membros) mas possui um ácido glutâmico potencial, de configuração beta inferior. A AR possui uma estrutura diferente para o terceiro anel altamente conservado que pode afectar a ligação ao receptor. A AR não possui os resíduos de asparagina, utilizados, possivelmente, nas MGF e SFGF como locais de glicosilação abrangidos pela estrutura adequada do factor de crescimento.

A sequência N-terminal de AR possui alguma analogia com as sequências N-terminais de TGFs, VGF e MGF, devido ao facto de ser rica em prolinas, serina e treoninas e tal como as TGFs e VGF possui locais de glicosilação potencial N-ligados (de facto possui um desses locais) assim como tem a possibilidade de glicosilação da ligação 0 na região rica em serinas, treo ninas e prolinas. Esta região encontra-se altamente conservada entre o terminal N dos percursores de TGF e o terminal N de

UGF e parece ser uma região altamente glicosilada.

A AR é uma proteína extremamente hidrófila, especialmente na região que contém os aminoácidos de 8 a 45 (FIG.2). A carac teristica hidropática de AR apresenta uma pequena semelhança com a dos outros membros da família EGF. A característica hidropática da porção C-terminal de AR, que se pensa estar estruturalmente relacionada com outros membros da família EGF, não é semelhante às características dos outros membros desta família (FIG. 11 B e C).

6.7. 10. A AR LIGA-SE ESPECIFICAMENTE AO ADN

Ensaiou-se a

125

I-AR quanto à sua capacidade para se ligar a celulose celulose de ADN desnaturado e a celulose de ADN natural utilizando o ensaio descrito antes na Secção 6-6.

supra .

Os resultados que se apresentam na FIG. 14A indicam que a AR se liga especi ficamente a ambas as celuloses de ADN, natural e desnaturado, mas não se liga à celulose. A ligação ao ADN natural foi três ou quatro vezes superior à ligação ao ADN des naturado .

A capacidade de AR para se ligar especificamente ao ADN diferencia AR de todos os outros membros da super-famí1ia EGF. Por exemplo, a EGF não é capaz de se ligar a celulose de ADN (FIG. 14 B). Os resultados sugerem de um modo sólido que o aminoácido hidrófilo 45 N-terminal, de AR que não se encontra presente em EGF ou nos outros membros da família EGF pode ser uma sequência de localização nuclear envolvida na projecção de AR para o núcleo, onde o factor interactua com o ADN.

. EXEMPLO: ANTICORPOS PARA A ANFIRREGUL IMA

A produção de anticorpos para AR e AR de síntese e de peptidos percursores de AR encontra-se descrita nas sub-secções seguintes .

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS . 1 . 1 . síntese peptidica de fase solida

Produziu-se e purificou-se a anfirregulina de acordo com o descrito na Secção 6, supra. Sintetizaram-se cinco peptidos que correspondiam aos resíduos 31-50 (NS. 2 79 ), 7 1 -90 (N5 . 280),

108-130 (N9. 264), 166-184 (N9. 259) e 221-240 (N°. 281) da estrutura primária de AR (FIG. 15) por técnicas em fase sólida num sintetizador automático de peptidos da Applied Biosystems In c., essencialmente conforme descrito (Merrifield, 7· A m e r. Chem . Soc. 85: 2 1 49, 1 963 ). Efectuou-se a clivagem dos peptidos sintetizados a partir de suportes de resina utilizando um procedimento importante de clivagem HF (Tam et al·., _J. A me r . Chem . S o c . 1 05: 6442, 1988 ). Purificaram - se os peptidos de síntese por HPLC de fase inversa.

7.1.2. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

Prepararam-se os anti-soros policlonais para o AR completo e para os peptidos de AR de síntese, quimicamente conjugados com (KLH) hemocianina de moluscos gasterópodes de buraco de fechadura (Keyhole limpet) em coelhos brancos adultos, mas ainda jovens, da Nova Zelândia. Conjugaram-se os peptidos de síntese com KLH conforme descrito (Ishikawa et al., Immunoassav 4 235, 1 983 ); Não se conjuqou o AR maduro.

Efectuou-se a emulsão com sistemas adjuvantes Ribi (Ribi Immunochem. Research. Inc. Hamilton, MT) da AR ou dos peptidos

- 85 conjugados .

A dministrou-se a cada um dos coelhos uma dose total de 1 ml

0,8 ml por via intramuscular, em dois loca ι s na parte poste ior de cada uma das pernas e 0,2 ml por via subcutânea apenas num local.

Para originar anti—soros contra a AR completa, utilizaram-se yig de AR madura para a primeira inoculação de 15 yUg para as injecções subsequentes, de reforço. Para originar anti-soros contra os peptidos de

AR, de síntese, utilizaram-se 100 yig do peptido conjugado para culação e 50^4g para os reforços subsequentes, de reforço administraram-se de três em três ou a primeira inoAs inoculações de quatro em quatro semanas e sacrificaram-se os coelhos 10 a 14 dias as injecções de reforço.

7.1.3. I MUNOPRECIΡITAÇA0

Marcou-se ra dioactivamente λο 125 .

a AR com I utilizando método da cloramina T (Barridge,

Methods Enzymol. 50:54-65, 1978).

Combinaram-se 10 JiLL de soros policlonais (ou diluição em PBS)

5 de I-AR (50 ng/ml. actividade específica de 425 com

acordo e com 30yxl de PBS e ensaiaram-se, essencialmente, de com o já descrito (Le Bier et al., J. Immunol. 129:2287-2292 ,

982 ) .

7.1.4. ENSAIO RADIQ-IMUNOLOGICO

Diluiram-se os soros policlonais 1:50 em PBS. Diluiu-se

2 5 :200 I-AR (lyAg/ml, actividade especifica de 425yAÍí/yAg)

Ο , 1 ?ó (Tris 20 mM a pH 7,4, EDTA 5mM, NaCL 150 mM, com TNEN/BSA a

NP-40 a	0,05%, BSA a 0,1%). Combinaram-se 10 ybl de AR não mar-
cada (1	mg/ml), 10 jx 1 de soros policlonais diluídos e 3□y. 1 de
1 2 5 I -AR	e, incubaram-se à temperatura ambiente durante 45 minu-

tos.

Preparou-se a solução de proteína A-sefarose do seguinte

modo ·.	re-hidrataram-se 200 mg de proteína A-sefurose seca, Phar-
m á c i a	, com 1,4 ml de PBS e lavaram-se e diluiram-se para 400 j^l
80 yii	do material re-hidratado , com uma solução contendo Tris

100 nM a pH 8,1, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 0,5%, PMSF 2 mM ,

Aprotinina a 1% e 0,5 y*g/ml de Leupeptina. Adicionou-se, então, à mistura, 20 y^l de uma solução de proteína A e incubou-se durante um período adicional de 30 minutos. Depois, lavaram-se duas vezes as pérolas de sefarose com 500 yjl de TNEN/BSA a 0,1%, efectuou-se nova suspensão em 50 jaX de SB (Tris 80 nM, a pH 6,8, SDS a 3%, glicol a 15%, azul de bromofenol a 0,01%, β -mercaptoetanol a 5%) e aqueceu-se a 100°C, durante 5 minutos. Centrifu garam-se as amostras e ensaiaram-se os sobrenadantes no que respeita a radioactividade num contador gama. Com este procedi mento detectou-se apenas 100 pg de AR.

7.1.5. ENSAIO IMUNO-ABSORVENTE DE LIGAÇAO ENZIHATICA

Modificou-se o procedimento micro-ELISA, de fase sólida, a partir da patente de invenção norte-amer ι cana com o número de série 740124, depositada a 30 de Maio de 1985. Prepararam-se

as micro-placas de cultura Terasaki pela adição a cada recipiente de 5 /1 de peptidos de síntese de AR diluídos em PBS a diversas concentrações e deixando, depois a solução secar,

durante a noite, à	temperatura ambiente. A d ι cionaram-se às pla-
cas Blotto a 5 % em	PBS e deixou-se em repouso à temperatura
ambiente durante 1	hora. A seguir, adicionou-se a cada cavidade
diluições de 10 /11	de solução de anticorpo policlonal (diluído

em PBS/B1 otto a 1?ó/Triton X - 1 0 0 a 0,05%), incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente e, depois, lavou-se quatro vezes em PBS. Adicionou-se a cada cavidade 5 /d de anti-IgG do coelho desenvolvida na cabra e conjugada com peroxidase (Capgol) numa diluição de 1:1000 em PBS/Blotto a 1%/Triton X-100 a 0,05%, incubou-se durante 1 hora a temperatura ambiente e, depois, lavou-se seis vezes com PBS. Adicionou-se lOyQl de Solução de Cromagan Micro EIA (Genetic Systems Corp.) numa diluição de 1:20, e, leu-se então a absorvência a uma OD^g^ após 10 minutos e 40 minutos de acordo com o protocolo do Genetic Systems Micro EIA.

7.1.6. MANCHADE WESTERN

Efectuou-se a e1ectroforese das amostras em gel de poliacrilamida a 15% ou em gel de tricina-poliacrilamido a 16% e num aparelho de mini-gel BioRad. Colocou-se então o gel adjacente a uma camada de η11roce 1 u1 ose e interca 1 ou-se na sequência de tal modo que a nitroce lulose ficou posicionada no lado catódico. Efectuou-se a transferência das proteínas utilizando uma corrente de 400 mA a um potencial constante, durante 30 minutos. Removeu-se, então a nitrocelulose e, embebeu-se em 81 o 11 o a 2,5%/ /PBS/NP-40 a 0,2%, durante uma noite a 4°C.

Depois, expôs-se o filtro de nitrocelulose ao anti-soro diluído em tampão de reacção Blotto a 2,5%/PBS/NP-40 a 0,2%, durante 90 minutos, à temperatura ambiente, numa plataforma oscilante, seguindo-se-lhe quatro lavagens (5 minutos por cada lavagem) em Blotto a 2,5%/PBS/NP-40 a 0,2%.

Adicionou-se, então, à camada de nitrocelulose proteína

A conjugada com fosfatase alcalina (Cappei) diluída 1:500 em Blotto a 2,5%/PBS/NP-40 a 0,25%, e, incubou-se durante 60 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. Depois, lavou-se quatro vezes (3 minutos para cada lavagem) o filtro com PBS/NP-40 a 0,2%, seguido de 5 minutos em tampão APS (Tris 100 η M a pH 9,5, NaCl 100 mH, MgC12 5 mM) . Desenvolveu-se o filtro em reagente de côr (40 ml de tampão APS, 12 mg de 5-brorno-4-c1oro - 3-indoi1-fosfato (Sigma), 6,8 mg de nitroazul de tetrazólio (Sigma), preparado imediatamente antes de se utilizar e filtrou-se através de um filtro de 0,2 yjm, arrefeceu-se com H₂0 e, depois, deixou-se secar ao ar.

7.2. CARACTERIZAÇAO DOS ANTICORPOS DE AR

Os soros policlonais desenvolvidos contra a AR madura e contra os peptidos de síntese, de AR, caracterιzam-se por radio₇imuηο-precipitaçãο, ensaio radio-imuηo 1ógico , ELISA e marcação Western. No Quadro VII apresentam-se os resultados.

QUADRO VII

CARACTERIZAÇÃO DOS ANTICORPOS PARA A ATIRREGULINA

E PEPTIDOS DE AR. DE SÍNTESE

Métodos de Ensaio

Soros Poligonais

para	RIP
AR completa	1:256^a
Peptido 259	1 : 256
Peptido 264	1 :256
Peptido 279	ND
Peptido 280	ND
Peptido 281	ND

RIA	ELISA	W B
^1:250 (.100 pb)°	ND	1:250 (1 ng )
ND	ND	ND
1:250 (.100 pb)	1:100 (5 ng )	1:100 (0.1 ng) 1 : 500 (1 ng )
ND	1:100 (5 ng )	ND
ND	1:100 (5 ng )	ND
ND	1:10 0 (b ng)	ND

a- Diluição dos anti-soros necessários & Os valores entre parênteses indicam a sensibilidade do método

RIP: ra dio-imuno-precipitação

RIA: ensaio radio-imuno1ógico

ELISA: ensaio de imuno-absorção de ligação enzimática

WB : marcação Western

ND: não determinado

8. EXEMPLO : CLONAGEM DO CADN do PRECURSOR DA

ANFIRREGULINA

Exemplo seguinte descreve a clonagem e análise dos cADNs que codificam o percursor da A n f i r r e g u 1 i n a a partir das células MCF-7 do carcinoma da mama humana, tratadas com TPA.

8.1. MATERIAIS E MÉTODOS

8.1.1. PREPARAÇAO DE ARN

Isolou-se o ARN a partir de células subconf1uentes desenvolvidas em recipientes de cultura de tecidos T150 ou a partir de amostras de tecidos recentemente congelados, utilizando o método de Guanidinum descrito por Chirgwin (Biochemistry , 1 8 , 1 979, 5294). Lavaram-se com PBS as células de quatro T150, trataram-se com tripsina, lavaram-se novamente com PBS e efectuou-se uma suspensão do agregado em 8 ml de uma solução de isotiocinato de quanidina 4 M. Cortou-se o ADN fazendo passar a solução através de uma agulha de calibre 18. Colocou-se a amostra, formando uma camada sobre 2,4 ml de Csll 5,7 M num tubo Beckman SW41TÍ e centrifugou-se a 32 000 rpm durante 20 horas a 20°C. Efectuou-se nova suspensão dos agregados em 300 yll de CsCl 2,5 M e precipitou-se com 2 volumes de EtOH, à temperatura ambiente. Efectuou-se nova suspensão do agregado em 300 yzl de H^O, depois ad i c i on a r a m-s e 30 yxl de acetato de sódio (pH 5,2) 3 M e 800 de EtOH e precipitou-se o ARN a - 7 0 ° C .

1

Repetiu-se a precipitação e secou-se rápidamente o ARN, voltou a efectuar-se a sua suspensão em 100 yjl de H^O, quantificou-se a uma θθ260 ^{6 armazenou-se a} ~70°G·

Θ . 1 . 2 . MARCAÇAO COM INICIAÇAO ALEATÓRIA COM P-TTP

Excisaram-se os fragmentos específicos da região que codifica AR a partir de gel (Bio-Rad) e marcaram-se com de agarose de baixa temperatura ³²P-TTP (NEM, 3000 Ci/mmol) utili zando o método de iniciação aleatória, desenvolvido por Fein berg ( 1 98 3, Anal. B i ochem. , 1 37, 1 983, 266).

Removeram-se os desoxi-ribonuc1eosid os não incorporados, por crornatografia , numa coluna de 1,5 ml Sephadex 50. As acti9 vidades específicas foram, de tipicamente 0,5-2,5x10 cpm/ug.

8.1.3. GELES DE ARN E ANALISE DE MANCHA DE NORTHERN

Efectuou-se a electro fo rese de 10 ou 20 jxq do ARN total em geles de agarose a 1,2% formaldeído para análise Northern. Prepararam-se os geles de agarose/forma 1 deído em ácido morfo11ηo-propaηossu1fónico (MOPS), a pH 7,0, 40 mM/EDTA 1 mM/acetato de sódio 10 mM/formaldeído desionizado 2/2M (pH 5,6) num aparelho de gel IBI VCV com placas congeladas. Desnaturou-se o ARN no mesmo tampão com formamida a 50%, a 65°C, e processou-se em 1 X MOPS, a 20-30 mA , durante 3-5 horas. Secou-se o gel em χ 55 C, durante 30 minutos e transferiu-se para membranas Hybond-N (Amersham), reticuladas por UV (1200 yiJouies) hibridou-se previamente e, hibridou-se em 5X 5SPE (1 X SSPE consiste em NaCl 0,18 M/fosfato de sódio 10 mH a pH 7,7, EDTA 0,1 mH), 5X Denhardfs, SDS a 0,5% e 20 yjg/ml de ADN de espenra de salmão desnaturado, como veículo.

Efectuaram-se as hibridações a 42°C durante 16 horas

3 2

2x10 cpm/mi de P-ARBP1. Lavaram-se as manchas diversas vezes em 2xSSC com SDS a 0,1% à temperatura ambiente, a seguir, com 1 x SSC/SDS a 0 , 1 %, a 65°C, e expuseram-se num dispositivo Kodak X-OMAT com dois écrans de amplificação Dupont Lightning Plus a -70°C. Designaram-se as faixas como (+) se se apresentavam claramente visíveis após exposição durante uma noite, por (+/-) se se mostraram visíveis após 3 dias de exposição e por (++) se se mostraram detectáveis após 6 horas.

8.1.4. CLONAGEM Oe CADN

Efectuou-se a colheita das células MCF-7 para se obter o ARN, após tratamento com 100yjg/ml de 12-0-tetradecanoil-forbo 1-13 - acetato (TPA) durante 24,40 e 72 horas.

Isolou-se o ARN Poli (A) a partir de alíquotas de agregados destas amostras e utilizou-se como a matriz para a síntese de

ADN de cordão duplo, essencialmente

1983, Gene 25:263, 1983).

conforme descrito (Gluber e Hoffman

Ligou-se o CADN cortado em G, no local

3

E-coR I de gt 1 0 , utilizando adaptadores o 1 i g o n u c 1 e o t i d i c o s BR1 (Rose et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei. U.5.A. 83:1261-1265, 1968).

t

De um modo específico, desnaturaram-se, mediante aquecimento, ^tg cfe ARN (poli A)⁺ de células MCF-7 tratadas com TPA e, prepararam-se com 5 yjg de Oligo (dt) utilizando 100 U de transcriptase inversa num volume de reacção de 45 ^11. Efectuou-se a síntese do segundo cordão com 4 U de ARNase H e 115 V de ADN pol I de E_. c o 1 i U t i 1 i z a r am - s e 10 ^lg de ADN polimerase Γ4 para remover as extremidades salientes, criando extremidades niveladas. Efectuou-se a classificação por tamanho do cADN de cordão duplo de 6,8^ug, completo, numa coluna Sephadex G 50 para se seleccionarem os CADNs com mais de 500 pb e cortou-se em dG 150 ng de CADN com desoxinuc 1 eo11 di 1 o transferase terminal. Ligou-se o CADN cortado em dG no local E coR I de ^gt10 utilizando adaptadores BR1(AAΤTCCCCCCCCCCCC ) . Empacotou-se in v i t ro o ADN ligado (Grosveld et al., Gene 1 3:22 7-2 3 7, 1 98 1 ) ι

e colocou-se na £. coli, C 600 rK mK hfl com uma eficiência de 10^ recombinantes/ yjg de cADN. Extrairam-se os filtros de nitrocelulose com 2,5x10^ recombinantes e efectuou-se o rastreio dos filtros com sondas oligonucleotidicas degeneradas e de me3 2 lhor hipótese marcadas com P (Quadro VIII, a seguir) derivadas da sequência primária de AR, conforme se determinou pela degradação automatizada de Edman da AR reduzida tratada por N-Glicanase e da AR S-piridi1-e111ada (Secção 6, supra).

Sonda Quadro VIII Extensões d •H

O c ⁽Φ o σι α j-j φ c φ cr»

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A análise de restrição revelou um pequeno número de locais na inserção cADN de pARl, com locais únicos para Bsm I, Eco RV, H q a I, Nae I, P un II, Sma I, 5 s t I, e dois locais para Ssp I. Não ocorreu digestão da inserção com B a mH I, Cia I, Eco RI, Ηιn d III, K pn I, Pst I, 5 p h I, S t u I e X b a I. Isolou-se um fragmento de 170 pb de Bsm I a Pvu II e utilizou-se para efectuar a sondagem de uma segunda biblioteca de cADN de 100 000 recombinantes que se construiu essencialmente, conforme refe rido antes. I dentificaram-se treze clones positivos possuindo inserções de cerca de 300 pb a 1,3 Kb, seis superiores a 1 Kb e cinco que continham um local S s t I único, que se sabe possuir 100 pb a partir da extremidade 5' de pAR1. Efectuou-se a sub-clonagem de quatro das cinco últimas inserções (pAR3, pAR5, pAR9, pAR13) para posterior restrição e análise sequencial. Todos estes clones possuíam idênticos esquemas de restrição com base em B sm I, Eco RV, Pun II, 5 s t I e Sma I, excepto o pAR 9 que possuía uma porção truncada de 100 pb na extremidade 3' e que se descobriu, mais tarde ser originário de uma sequência A, presumivelmente suficiente para se ligar com oligo (dT).

8.2. ANALISE DA SEQUENCIA DE NUCLEÓTIDOS DOS CLONES

DE cADN de AR

Utilizaram-se precursores de oligonucleótidos exactos para sequenciar ambos os cordões do clone pAR 1 de 1230 pb, utilizando o método de terminação da cadeia didesoxi (Sanger et al.,

P-roc. Natl. Acad. Sei : U . S . A . 7 4: 5463-5467, 1977). Na FIG. 16 apresenta-se a sequência de nucleótidos completa e a sequência aminoácida deduzida do clone pAR 1. Uma sequência de leitura aberta de 965 pb tem início no nucleótido número 1 .

primeiro

AUG situa-se na posição 210 mas não está em conformidade com o consenso óptimo de Kodak para os locais de início de transferência (Kodak, Nucleic Acids Research 12:857-872, 1984, Kodak, Ce 1 1 44:283-292; 1986) devido à ausência de uma purina na posição -3. No entanto, estes tripletos AUG podem funcionar como o codão de iniciação, conforme observado por Kodak em cerca de 3% das mensagens examinadas e, é de possível importância a presença de uma adenosina na posição -1 em todas estas AUGs menos favorecidos e no mARN de AR.

Embora uma segunda metionina se encontre localizada no nucleótido 378 o que está conforme a sequência de consenso iniciai, crê-se que o primeiro AUG seja o verdadeiro local de início de transferência uma vez que se encontra seguido por uma extensão previsível de 19 aminoácidos, de resíduos predominantemente hidrófobos in te r romp idos por 3 prolinas ,característico de uma sequência peptídica de sinal (Heijne,

J. Biochem.

133:17-21, 1983).

A sequência de leitura, aberta , mais longa que inicia com uma metionina codifica um polipéptido de 252 aminoác idos que inclui o peptido de sinal de resíduo 19. A sequência cod i 9 7 ficante encontra-se precedida por 209 nucieótidos da sequência não transferida da extremidade 5' a que se segue a sequência não transferida da extremidade 3'. Uma sequência potencial principal de adição poli (A), ARTAA, localiza-se 64 nucieótidos a montante de uma extensão de 15 resíduos adenilados, que se presume ser a extremidade de poli (A). A região não transferida da extremidade 3' de AR contém quatro cópias da sequência ΑΓΤΤΤΑ que também se encontra presente em certas linfoquinas, citoquinas e protooncogenes. Em GM-CSF esta sequência medeia a desestabi 1 ização e a degradação de ARN. (Shaw, Ce 1 1 46:6 59:667, 1 986 ). A conservação deste motivo em moléculas funciona 1mente semelhantes sugere que AR também pode estar relacionada com esta classe de linfoquinas.

A sequência de CADN confirma a sequência peptidica de AR completa (Secção 6 , supra) excepto, na posição aminoácida 113 (FIG.15) que se sequenciou como aminoácido aspártico (D) pela análise de proteínas e que se deduziu como asparagina (AAT=N) a partir de clones de cADN . De cinco cADNs que se examinaram, todos possuíam a extremidade 5' nos primeiros 25 pb da sequência de pAR1.

A comparação da sequericia de cADN com as sondas de melhor hipótese, apresentaram 74% (ARK41) e 77% (ARK31) de homologia total. Nenhuma das sondas possuía mais do que oito pb consecutivos semelhantes, mas, no total, 50 de 67 nucieótidos alinhados para AKK41 produziram um sinal detectável sob condições de rigor muito baixo. A utilização do códon pela sequên cia do mARN de AR difere consideravelmente das frequências de utilização referidas por

Lathe (Lathe

J . Mol. B i o 1

183: 1-12,

1985), o que explica que os o 1igonuc1eotid os degenerados originem sinais muito evidentes nestas circunstâncias. A partir das sequências do cADN e das proteínas, deduziram-se duas proteínas de pesos moleculares de 9772 e 9173, para as duas for-

mas do AR completo	com base nas sequências de cADN (FIG.16)
e proteica (Secção	6.7.9. supra). Na FIG. 11D., apresentam-se
as características	hidropáticas do precursor de AR.

precursor de AR possui três locais potenciais de N-giicosilação, um na extremidade N (posição 30 na FIG. 16) e 2 na região hidrófila do AR completo (posições 113 e 119). Sabe-se que a glicosilação contribui com 10-12 Kd para o peso molecular do AR completo, e é possível que surja a partir da adição de carboidratos num ou em ambos estes locais no domínio hidrófilo.

domínio rico em serina N-terminal do percursor de AR (FIG.15) contém três locais potenciais de sulfatização de tirosina, em

Y⁸¹, Y⁸³, Y⁸⁷

, com base na presença de resíduos ácidos, aminoá-

eidos que induzam rotação e a ausência de resíduos que possam contribuir para impedir a formação de ácido esteárico. A maioria

das proteínas	sulfatadas na tirosina são proteínas secretoras.
Crê-se que as	modificações de sulfatação da Tirosina estejam
envolvidas na	activação, transporte ou processamento proteolítico

das proteínas precursoras- 0 domínio rico em serina de AR, também pode conter cadeias de carboidratos ligados a 0, o que proporciona a abundância de resíduos serιna/treonina (23 entre 81) nesta região da molécula, que são locais para ligações

deste	tipo. Sob	este ponto de	vista	, identificaram-	s e	formas
0-glicosiiadas e	outros membros da	família EGF, TGF	-c(	( I gno t z
et a 1	. , RNAS , 83	, 6307-6311,	1986).
	Nenhum dos	resíduos de	serina	no precursor de	AR	se ajusta

à sequência de consenso para os locais de fosfori1 ação da quinase dependente de cAMP (Grima et al. , Proc. N a 11. A c a d. Sei.

U 5 . A . 82:617-621, 1985), acontecendo o mesmo com qualquer dos resíduos de tirosina que manifestam simi 1 iarida de na sequência de flanco, com os resíduos de fosfotiros ι na . 0 domínio hidrófilo da proteína AR madura é composto por numerosos aminoácidos carregados positivamente (16 de 37 resíduos são lisina ou arginina), incluindo duas extensões consecutivas de 4-5 resíduos básicos carregados. A sequência principal de alvo nuclear do antígeno T longo SV40 é semelhante a esta região de AR e contém uma sequência KKKRK característιca precedida por pequenos aminoácidos (glicina, alanina,pro 1ina ) que podem permitir a formação de uma estrutura d -helicoidal (Burglin et al., EMBO 6:2617-2625, 1987, Dingwall, et al., EMBO 6:69-74, 1987.

A análise de mutação definiu quatro resíduos Básicos consecutivos como característica predominante da sequência de localização nuclear SV40 (Lanford, Cell, 37, 1984, 801-813). Crê-se

100 que outras proteínas nucleares com extensões semelhantes de aminoácidos básicos estejam envolvidas no alvo nuclear, incluindo a neoplasmina, o vírus T grande do polioma histonas, e C-myc. Da fusão de diversas sequências principais nucleares com o genes da piruvatoquinase da galinha, albumina, ímunogiobulina, ferritina e /3-ga 1 actosida de , resultou a localização destas outras proteínas citop1ásmicas , para o núcleo (Moreland, Mol. C e 11 . Biol. 7:4048:4057, 1 987 ). Não se verificou se as sequências hidrófilas de AR estão envolvidas no objectivo deste modulador do crescimento; contudo, a capacidade de AR para se ligar especificamente ao ADN implica que AR desempenha um papel funcional no núcleo. No que respeita a este assunto, AR pode regular a síntese de ADN, o ciclo celular ou uma diversidade de outros fenómenos nucleares.

precursor TGF-olcontém múltiplas cisteínas no domínio citoplásmico C-terminal, alguns dos quais sofrem ligações covalentes de palmitato (Bringman, Ce 11 , 48, 429-440, 1 987 ).

Como contraste, o precursor de

AR não possui quaisquer cisteínas no seu domínio citoplásmico e, desse modo não se espera que contenha resíduos de palmitato

Embora se desconheça a função biológica da 1igação palmitato isto representa ainda uma outra di ferença entre AR e outros membros da super-famí1ia EGF.

8.3. FONTES CELULARES DE SÍNTESE DE ANF I RREGUL I NA

- 1 01

A análise de mancha de Northern (Thomas, Ρ N A S , 7/,

5201, 1980) utilizando fragmentos de cADN de AR marcados ?

com d “P demosntrou a hibridação de uma única espécie de ARN de 1,4 Kb a partir de vários tecidos humanos normais e de várias linhas de células tumorais. Observaram-se uma faixa única de manchas Northern, utilizando quer AREB1 (um fragmento BstE Ií-Pun II de 480 pb de pAR1 contendo a região de código completa do AR madura e parte do precursor N-1 e r m i n a 1 e dos domínios de transmembrana ) . quer AR170 (um fragmento

Bsm I -Pun

-terminal

II de 170 pb da pAR1 contendo apenas a metade Cda AR completa) como sondas marcadas radioactivamente. Os resultados que se apresentam no quadro IX, abaixo, indicam que se observou um nível baixo

AR no tecido normal adulto do pulmão e pâncreas. Qbservou-se uma expressão mais baixa, ainda no tecido normal do fígado, do rim e do cérebro.

QUADRO IX

Tecidos Humanos

Normais

ARN de AR

Pulmão

Fígado

Pâncreas

Rim

Baço

Cérebro

Placenta ₊ /+ /Intestino fetal

102

Apesar de se ter isolado or ι g ι na 1 mente, a AR a partir

d e	células	MCF-7 tratadas	por	TPA _:	, interessava	determinar
0	tempo da	indução por TPA	d o	ARN	de AR destas	células. Tra
taram-se as células MCF-7	com	TPA	durante 0,1,	3,6,18,24 e
48	horas,	isolou-se o ARN	total e	verteu-se em	cada pista

um gel de agarose formaldeidico a 1 , 2 ?ó , transferiu-se

0 Jig de para membranas de nylon e efectuou-se o rastreio com uma sonda ARBP1 complementar da região de código completa do AR maduro .

Observou-se um aumento impressionante de ,4 Kb na espécie tratamento com T P A com níveis máximos atingidos entre as e 24 horas.

Análises de manchas Northern subsequentes tendo como sonda ³²P-ARBP1 do ARN de demonstraram que a estimulação por TPA da síntese

AR noutras linhas de células cancerosas da mama apesar de apresentar níveis máximos nunca atingiram valores tão elevados como os das células MCF-7 induzidas por TPA.

Ensaiou-se um painel de linhas de células de tumor quanto aos níveis de ARN de

AR antes e após 24 horas de indução com

TPA. Os resultados, encontram-se resumidos no Quadro X seguir. Com um pequeno número de excepções, as únicas fontes de ARN de AR detectável foram linhas carcinomatosas mama humana tratadas com TPA.

Uma de tais excepções é CaKi-1, uma linha carcinomatosa de células claras do rim humano que expressa, constιtutivamente, níveis elevados de ARN de AR comparáveis às quantidades observadas nas células MCF-7 i n duzidas com TPA. Todas as linhas de células carcinomatosas

- HÍ3 da mama tratadas com TPA e que sobreviveram, demonstraram hibridização específica com AR.

A AR desempenha aparentemente um papei funcionai no pulmão, pâncreas, rim, fígado e cérebro adultos, provavelmente, envolvida numa ampla variedade de processos, incluindo cicatrização de ferimentos, regeneração tecidular e manutenção das células nervosas.

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IILJf Fibroblastos de prepúcio

- 105 9. EXEMPLO: CLONAGEM GENQMICA E ANALISE DO GENE

DA ANFIRREGULINA exemplo que se segue descreva a clonagem genómica do gene da anfirregulina humana, a sua estrutura e sua organização intrão/exão. Também se discutem as implicações funcionais e de evolução, no que respeita à super-famí 1 ι a EGF dos factores do crescimento.

9.1. MATERIAIS E MÉTODOS

9.1.1. H1BRIDAÇ0ES DE MANCHAS SOUIHERN

Isolou-se o ADN genómico total (Maniatis, i n

Molecular

C1on i ng: A Laboratory Manual,

1982,) a partir de células sub-confluentes em recipientes cultura tecidos T150. Efectuou-se a ção digestão de 20 /g de ADN com e fectuou-se a conforme especificado, enzimas de restrigel com de agarose a 0,8%, manchou-se sobre Hynbond-N (Amersham) tampão de suporte 20 x SSC (Southern, J. Mol. Biol.98,

1975, 503-517), e ligou-se o ADN por exposição a uma onda curta

UV de 1 2 00yjJoules. Hibridaram-se os filtros a 65°C durante uma noite em tampão de hibridação (6xSSC, solução de Denhardt

X , SDS a 0,5% e 20 yig / ml de ADN de esperma de salmão, desnaturado e cortado) contendo 2 x 10^ cpm do fragmento específico de AR marcado com P, por mililitro. Marcaram-se as sondas aleatoriamente a uma actividade específica de

Lavaram-se exaustivamente os filhos em 1xSSC,

-radiografaram-se durante a noite a -70°C.

o vector . 1 . 2 . CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENOMICA

Escolheu-se o bacteriológico lambda L47.1 como de clonagem e preparam-se as extremidades receptores tratadas com fosfatase, após digestão com Bam Hl, EcoRI e Hind III.

Efectuou-se a digestão com Hind III do lecular das células MCF-7, efectuou-se de agarose de baixa temperatura a 0,8%

ADN de elevado peso mo a e 1 e c t r o f o r e s e em gel (Bio Rad) e fraccionou-se.

Fundiu-se a 65°C a fracção de agarose enriquecida com o mento de restrição desejado, extraiu-se o ADN com fenol precipitou - se , depois com etanol e voltou a efectuar-se e NaOAC , uma suspensão a 25-10Oyig/ ml. As construções de bibliotecas consistiram na ligação, durante uma noite, a 14°C, de

100 ng das porções receptoras do bacteriófago lambda L47.1 e de 40 ng de

ADN fraccionado extraído, num volume de reacção de 5 yjl lizando ADN ligase T4 (Biolabs). Empacotou-se i n v i t ro o fago recombinante com preparado com as clts b2 Red 3 Eam extractos (Grosveld, Gene 13, 1981, 227-237) estirpes ΒΗΒ268ΘΝ205 rec A (lambda imm ⁴ » - Λ S Λ

Sam 7) e BHB2690 N205 recA (lambda imm clts b2 red 3 Dam15 das bibliotecas na

Sam7) da E_. co 1 i . Efectuou-se a titulação

E. coli LE392. Efectuou-se o rastreio dos clones genómicos com sondas de ADN específico de AR por hibridação em placa in s ι tu (Benton, Sc ience 1 96, 1 977, 1 80- 1 82 ), e isolou-se o ADN a partir de uma placa de clones positivos purificados (Huynh, in DNA cloninq techmques: a praticai a p p r o a c h D. Glover, ed. (Oxford: IRL Press), 198 5, pp. 49-78). Excisaram-se a inserções Hind III e subclonaram-se dentro do pEMBL 18 para análise de restrição e propagação.

9.1.3. ENSAIO DA EXTENSÃO INICIADORA

Isolou-se o ARN a partir das células M C F- 7 , conforme ⁷ descrito na Secção 8, supra . Marcou-se com “P a extremidade dos o 11gonuc1eótidos de síntese complementares dos nucleotidos 40 a 60 (ARAP) e 76 a 97 (ARcP) na sequência de cADN de AR, com polinucleotidoquinase T para uma actividade específica g

de 2-5x10 cpm/^g. Utilizou-se um milhão de cpm de oligonucleotidos marcados para iniciar (prime) a síntese do primeiro cordão de ADN em 50

de ARN de

MCF-7 essencialmente conforme descrito na Secção 8.1.4. supra.

Trataram-se os produtos com extrairam-se com fenol e clorofórmio precipitaram-se com etanol, desnaturaram-se em formamida a 80?á a 100°C, durante minutos e ana 1isaram-se por electroforese sobre geles padrão de sequênciação de poliacrialimida a 8- ureia 7 M .

9.1.4. ENSAIO CAT

Desenvolveram-se as células

M C F - 7 conforme se descreveu na Secção 6.2.1. supra. Para cada um dos

1-2x10^ células num recipiente de 100 mm ensaios, cclocaram-se em 10 ml de meio e,

I 08 horas mais tarde, adicionaram-se às células 20 yjg de ADN plasmidico helicoidal precipitado com fosfato de cálcio ( Sou thern e Berg, 1982). Lavaram-se as células com meio recentemente preparado 4 horas após a transfecção e submeteram-se a um choque de glicerol a 25% durante 90 novamente as células e cobriram-se com segundos. Lavaram-se ml de meio recentemente preparado contendo ou 100 ng/ml de TPA. Lavaram-se e recolheram-se as células

0 horas após o choque de glicerol e submeteram-se a 1 ise por t ra tamen to com u

M (pH 7

8). Ensaiou-se a actividade CAT essencialmente conforme descrito por Gorman et al., (1982). Adicio1 à nou-se extracto celular (3-50 yil ) a 2,5 mci C-cloramfemcol (NEN) num volume de reacção de 150 yil de Tris 0,5 M (pH 7,8),

AcetílCoA 0,5 mM. Incubaram-se as reacções a 3 7°C durante 2 horas, extrairam-se com 1 ml de acetato de etilo e desenvolveram-se sobre placas TLC de gel de sílica com CHC1}:1 -butaηo 1 (95:5). Secaram-se as placas

TLC e auto-radiografaram-se. Quan tificou-se o cloramfenicol acetilado e não acetilado, por con tagem das regiões excisadas num Optifluor. Ca 1 cu1 aram-se as unidades de actividade enzimática CAT em yjg de cloramfenicol acetilado por hora, por^yg de proteína no extracto celular.

9.1.5. HIBRIDAÇÃO CR0M05S0MICA IN SITU

Marcou-se por início (prime) aleatório o plasmido pAR9 com ³H-TTP e utilizou-se para se hibridar com células da

109 metafase humana normais preparadas a partir de linfócitos do sangue periférico estimulados com fito-hem ag1utinina , na banda 500-800. esta sonda corresponde a um cADN de AR que não possui mais do que a região não transferida da extremidade 3' e, inserida no local EcoRI de pEΜBL18 .

A hibridação processou-se conforme previamente descrito (Le Bean, P NA S , 82, 6692-6696, 1 98 5,) com 2,4, 20 e 40 ng de sonda por ml de mistura de hibridação. Prepararam-se as auto-radiografias utilizando uma emulsão de rastreio nuclear KodaK

NTB-2 e fotografias expostas durante 7-60 dias.

Visualizou-se faixa cromossómica corando com mostarda de quinicrina.

9.2. LOCALIZAÇAO CROMOSSOMICA D0 GENE AR

Determinou-se a atribuição cromossómica do gene da AR humana por hibridação in si tu cADN de AR marcado com h com cromossomas normais da metafase. Registaram-se os grãos prateados de 50 extensões de metafase sendo

30% distribuídos de modo não aleatório nas faixas 4q13-4q 2 1 .

Con f i rmou-se o resultado por reacção em cadeia de polimerase híbrido de células somáticas hamster/humanas, contendo apenas o cromossoma 4. Os o 1 igonuc1eótidos iniciadores dos exão 3 de AR e do intrão de flanco, originaram derivados do um fragmento

PCR de 220 pb apenas no ADN humano e no ADN híbrido contendo o cromossoma 4, enquanto 0 ADN do hamster foi negativo.

1 Q

A região cromossómica 4q13-4q21 também contém os genes para gro ou para a actividade estimuladora do crescimento do Melanona (A π i s o w i c a , A., et a 1 . , Proc. Natl. A c a d . Sei. U.S.A , 84, 1 98 7, 7 1 88 - 7 1 9 2; Richmond, A., et al., E Μ B 0 J . , 1 988 202 5-2033), o receptor c-Kit (Yarden et al., E'-1B . J . 6 , 1987, 3 3 4 1 -3351, factor plaquetário 4 (PF4) (Griffin et al., Cytoqenetic Celt Genet., 45, 1987, 43-73), factor IP-10 gama indutor do interferão (Luster, A.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84, 1987, 1868-1871) ligação de vitamina D a proteínas (compotes específicos de grupo) (Cooke, N.E. et al., H uma n Genetics

McCombs J . L .

et a 1. , Cytogenet Cell Genet ,

1986,

62-64) e estaterina, uma proteína salivar reguladora cálcio (Sabatini L.M. et al.

, AM. J. Hum. Genet . , 4 1, 1 9 8 7,

1048-1060). 0 gene para EGF encontra-se localizado distalmente na região 4q25.

Gro, IP-10 e PF4 pertencem a uma classe de peptldos relacionados estruturalmente que podem constituir, uma família

de factores de	crescimento formando cacho no cromossoma 4.
c-Kit codifica	um receptor da superfície celular que se encon-
t r a estrutural	e funcionalmente relacionado com diversos recep-

tores de factores de crescimento e que contém uma actividade quinásica específica da tirosina, incluindo o receptor EGF, o

oncogene Eu, o

receptor PDGF e o receptor insulinico.

Os genes para os ligantes e para os seus receptores

1 1 s_ituam-se, geralmente sobre cromossomas distintos, mas alguns dιstribuiram - se por localizações cromossómicas comuns (Groffin, Nucl. Acids Res . 1 1:63 3 1 -6339, 1 983, PeHenati, Proc. N a 11 .

Acad. Sei. U.S.A . 84 : 2970 : 2974, 1 98 7 ). Não se identificou o ligante para C-Kit e, deve testar-se a AR para uma tal actividade.

Em muitas doenças malignas observaram-se translocações específicas. A aberração citogénica mais frequentemente registada na leucemia 1infob1ástica aguda congénita (ALL), t ( 4 ; 1 1 ) (q21;q23) envolve a região para a qual a AR se distribuir (Heim,

S. et a 1 .

Leukemia,

1987, 16-23). Actualmente as ALLs encontram-se classificadas morfologicamente conforme definido pelo Grupo de Cooperação Franco-Ang1 o-Americaηo (FAB), por indicadores de células T e 8 e por análise Cromossómica. Estas classificações servem de base ao diagnóstico, prognóstico e tratamento da ALL. Um terço de todos os casos de ALL envolvem translocações específicas e, t (4 ; 11 ) corresponde a um grupo de fraco prognóstico mais frequente nas crianças de idade inferior a 16 meses com uma média de sobrevivência inferior a 1 ano (Kocova et al., Câncer Genetics and Cytoqenetics 16, 1985,

21-23). Também se fez referência a translocações envolvendo a região 4q21 nos linfomas T (Levine, E.G. et al., Câncer Res. 46 1 986, 6481 -6488 ) e a um caso de leucemia mie1 ob1ás11ca aguda (AML) (Selypes, A. et al., Human Gene t , 76, 1 986, 1 06- 1 08 ).

Esta região contém, também os genes do síndroma da disgenesia dental e dapigmentação desigual (piebald trait) num distúrbio

1 2 hereditário que resulta da pigmentação desigual da pele devido à deficiente migração e diferenciação deme 1 aη ob 1 astos (Hoo, J.J. et al., Human Genet , 73. 1 986, 230-231).

Estudos de conexão entre a AR e os distúrbios genéticos localizados nos cromossomas 4q13-4q21 permitem determinar a importância desta localização conjunta. Análises citogenéticas convencionais sugerem que a região 4g21 contém genes que se encontram envolvidos na diferenciação linfocitária. Por último, estas associações podem sugerir actividades biológicas adicionais ou aplicações para esta molécula reguladora do crescimento.

9.3. CLONAGEM GENOMICA

A análise de mancha Southern (Secção 9.1 supra) do ADN de MCF-7, digerido com Hind III, Eco RI, ou 8 amΗI apresentou bandas únicas de 12 kb, 8 kb e 20 kb, respectivamente, quando se hibridou com uma sonda de 830 pb. (pARl digerido com Pvu II /

2 /Bsm Iémarcado com P) que contém a porção 5' do gene de AR, sugerindo que AR possui um gene de uma única cópia. Uma sonda de 170 pb (AR 170, Bsm I -P vu II) a partir da extremidade 3' da AR completa, incluindo as regiões que codificam os domínios Citoplásmico e de transmembrana, hibridados com os mesmos fragmentos Hind III, EcoRI e Bam Hl e ainda com um fragmento adicional Hind III de 7,5 Kb, implica que a maior parte da região que codifica AR se encontra dividida entre dois fragmentos

3

Hind III de 12 e 6,5 Kb. Pela análise Southern de produtos de digestão de ADN placentário humano, do cérebro humano, de melanoma humano (SK-MEL 28), de cancro da mama humana (HTB36), do carcinoma epidermóide humano (A431) e do cancro do pulmão humano e sugere que o gene de AR não sofreu grandes modificações ou amplificações.

Os inventores decidiram clonar os dois fragmentos Hind III de ADN de MCF-7 desde que eles contivessem, provavelmente a maior parte senão a totalidade do gene de AR e as suas sequências de flanco. 0 ADN de MCF-7 digerido com Hind III, foi fraccionado e, ligaram-se as fracções adequadas dentro do L47.1.

De entre os numerosos

ARH1 2 e z^ARHó , para clones positivos, se1eccio naram-se dois, caracterização mais pormenorizada. As inserções de 12 e 6,4

Kb, subclonaram-se dentro do pEΜBL18 e cartografaram-se os diversos locais de restrição. Utilizando os o 1igonuc1eotidos principais exactos e dirigindo a sequênclação de diversos pequenos sub-clones determinou-se a sequência de todos os exões e das suas junções aos intrões, revelando não existirem discrepâncias com a sequência de cADN.

9.4. CARAC TER IZAÇAO DA REGIÃO REGULADORA 5' DE AR

A clonagem genómica de AR conduziu ao isolamento do fragmento de 6,5 kb da sequência de flanco da extremidade 5' contida no fragmento Hind III de 12 Kb. Subclonou-se e efectuou-se

1 4 a sequenciação de ambos os cordões do fragmento de 688 pb a partir do primeiro local EcoRI da extremidade 5' do exão 1 até o local Swa I do exão 1 (posição 40 no cADN). Estes dados apresentam-se na FIG. 17.

Efectuou-se o início da extensão sobre A R N de M C F - 7 com o 11gonuc1eó11 d os separados a partir do exão 1. A maior parte do local de início de transcrição, confirmada por ambos os o 1 igonuc1eotidos , localizava a 1 pb da extremidade 5' do clone de cADN mais longo. Observaram-se dois locais menores nas posições +1 e +2 na sequência de cADN, confirmando que a muitos dos clones de cADN possuíam quase sempre a extensão total.

Com o objectivo de se confirmar de modo funcional a região reguladora do gene AR construiu-se um gene quimérico (pXAREICAT) contenda a região de flanco da extremidade 5' de AR , de 688 pb, de EcoRI a Swa I (sequências 648 a +40, sendo +1 o local principal de início de transcrição) que comanda a expressão de um gene que carece de promotor, c1 oramfenico 1 acetil-transferase (CAT). Esta construção é capaz de estimular a transcrição do gene CAI quando transitoriamente introduzida nas células MCF-7, e estimulou-se 6 a 7 vezes a actividade pela adição de TPA.

Isto confirma estrutural e funcionalmente que se efectuou a clonagem da extremidade 5 do gene de

AR .

Depois, construiu-se uma série de mutantes com delecção de

CAT da extremidade contendo as sequências de

AR, de -539 a +40 pb (Ela), de

-387 a + 40pb (E1b) , de -277 a +40 pb (Ele) , de -148 a +40 pb d e

-ΊΊ a +40 pb (Ele), de -79 a +40 pb ( Ε 1 g ) , ou de +19 a +40 pb (Ε1h) no mesmo vector. Perdeu-se a actividade basal quando eliminou para além da porção -77 isto é , E1h não apresento u actividade mensurável e todas estas construções apresentar am uma expressão 3,5 vezes aumentada em resposta a 48 hode tratamento com

100 ng/ml de TPA. Também se podem utiliestas construções em ensaios transitórios para estabelecer os efeitos de quaisquer morfogenios, mitogénios, factores do crescimento, fármacos, ou extractos brutos de fermentação na regulação da expressão de AR, possibilitando a identificação de novos agentes terapêuticos.

Experiências nucleares demonstraram um acréscimo de trans-

crição de AR de	3 a 5 vezes, em resposta a TPA, sugerindo que
um acréscimo de	actividade do promotor, é responsável, pelo
menos em parte,	pela indução de AR por TPA. As análises Northern

ei a s células M C F - 7 tratadas com TPA na presença ou ausência de actinomicina D identificam a AR como um ARN relativamente está vel com um tempo médio de vida da expressão de AR em resposta tada, envolvendo um aumento da estável .

superior a 4 horas. A indução a TPA é, no entanto, multifacetranscrição de um mARN um pouco

9.5. ORGANIZAÇAO INTRHO/EXAO D0 GENE DE AR, DOMÍNIOS

DA PROTEÍNA AR E IMPLICAÇÕES EVOLUTIVAS E FUNCIONAIS

1 6

Na FIG. 17 apresenta-se a sequência genómica completa da Anfirregulina humana e as afinidades entre os exões e os domínios proteicos da molécula de AR representam-se esquematicamente na FIG. 1 Θ .

As análises da extensão iniciadora de mARN de AR e estudos utilizando construções do promotorquimérico AR/CAI (CAT=cloramfenicol acetι1-transferase, um gene indicador) localizam um promotor funcion-a-1 entre 64 pb da extremidade 5' e o final do clone de cADN mais extenso. Para além disso, existe uma caixa TATA de consenso 29 pb a montante da extremidade 5' da sequência de cADN.

A extremidade 3' do gene encontra-se precedida por uma sequência de sinal de poliadenilação de consenso, 64 nucleotidos a partir do pro 1 ongamento poli (A) no cADN. A transcrição primária do gene AR é de, aproximadamente, 10,2 Kb.

precursor da AR humana é codificado por seis exões e abarcam 10,2 kb do ADN genómico. Os exões AR rondam os 112 a 270 pb, em extensão, e são interrompidos por intrões entre 1,25 Kb e 2,1 Kb. Os cinco intrões de AR interrompem a sequência de código de tal modo que muitos dos domínios proteicos são produtos de um único exão. 0 exão 1 codifica os antecessores peptidos principais e não transferidos da extremidade 5', o exão 2 codifica o precursor N-terminal. 0 exão 5 contém a região citoplásmica e o exão 6 representa a região não transferida da

extremidade 3' . Os exões 3 e 4, em conjunto, codificam a proteína AR madura, incluindo ambas as sequências hidrófilas e semelhantes a EGF, bem como o suposto domínio da transmembrana. A junção entre os exões 3 e 4 ocorre entre a segunda e a terceira espiral da região semelhante a EGF.

Quando as junções de exões se encontram dispostas no mesmo alinhamento das sequências de aminoácidos de AR, EGF e TGF- c< , é evidente que todas estas proteínas são codificadas por dois exões e, por este facto, o intrão de interrupção se encontra localizado na mesma posição. Para além disso, o exão 3' de cada também codifica o domínio da transmembrana das proteínas precursoras correspondentes. Por contraste, a região semelhante a EGF está contida num único exão em todos os outros homólogos de EGF, nos mamíferos, para os quais se determinou a estrutura do exão: incluindo a repetição de nove similares

d e	EGF	no precursor	de	EGF; (Gray, Nature,	30 3 ,	1 983,	722-725 ) ;
d e	três	no receptor	de	LDL (Yamamoto, Cell,	39,	1 984 ,	27-38 ) ;
e	um na	fibromectina	do	rato (Patel Emb. J.	, 6,	1 987,	2565-2572)

e no factor XII da coagulação humana (Cool, J . Biol . Chem. , 262, 1987, 13662-13673).

Homólogos invertebrados, tais como o gene da Drosophilia Notch e lin-12 do C_. eleqans também contêm repetições múltiplas semelhantes a EGF. (Kidd, Molec. Cell. Biol. 6 , 1986,

3094-3108; Grenwald, Cell, 43, 1985, 583-590). De modo distinto

-118 dos genes dos mamíferos, a maioria das repetições semelhantes a EGF na Notch encontram-se contidas numa única região codificadora com apenas quatro dos trinta e seis motivos divididos por sequências intervenientes. E digno de nota que dois destes quatro apresentaram um evidente alinhamento com AR do que com o consenso de repetição de Notch e um deles encontra-se, mesmo, interrompido por intrão na mesma sequência CxC tal como EGF,

TGF-C<e AR. 0 gene lin-12 de nemátodos contém, pelo menos, onze unidades semelhantes a EGF, nove das quais estão contidas no primeiro exão e as duas restantes se encontram em exões separados com a unidade semelhante a EGF intacta ladeada por

As diferenças na estrutura dos exões que codificam a repetições semelhantes a EGF a partir de diversos organismos, sugerem que estes devem ter origens diferentes. Um grupo contém o motivo semelhante a EGF ligado por intrões e o outro grupo, do qual AR é um membro, possui um motivo interrompido. A similaridade de sequência entre os dois grupos pode ser o resultado de evolução convergente ou da inserção do intrão após a sua divergência a partir de um gene ancestral comum.

A localização do intrão na mesma sequência CXC de EGF, TGF - , AR e numa das repetições da Notch sugere uma origem comum, mas um exame mais cuidadoso revela diferentes fases do intrão. Pôr o intrão em fase significa que o intrão inter-, ϊ 1 9 rompe a sequência de leitura após o primeiro (I), segundo (II

ou terceiro (0)	nucleótidos de um codão. Crê-se que o facto
do intrão estar	em fase tem importância evolutiva visto que
pode permitir o	equívoco do precursor funcional contendo exões
entre proteínas	diferentes. A EGF e TGF-cXpossuem um intrão

em fase II na unidade semelhante a EGF, enquanto AR e Notch

possuem intrões

em fase I. Observou-se uma deslocação semelhante

de um nucleótido no penúltimo intrão dentro do domínio da protease do factor B do complemento e da elastase (Camball, Ρ ιΝ A S , 80, 1 983, 4464; Swift, J. Biol. Chem . 2 59 , 1 984, 1 42 7 1 ). As posições não aleatórias destes intrões podem implicar a presença nestes genes de uma sequência de inserção específica do intrão. Como alternativa, pode ter-se exercido pressão selectiva para dividir a região de código neste local. A comparação

de sequências no

local da junção exão-intrao da unidade seroe-

lhante a EGF para a EGF humana, TGF-//humana e AR humana e a primeira repetição Notch, não revelou repetições directas como as que se observaram muitas vezes com os elementos transροηíveis . Contudo, os quatro, possuem a sequência gtaagt na vizinhança da junção. Esta sequência deve desempenhar alguma função na

origem ou junção

deste intrão.

Os homólogos de EGF virais não contêjj intrões; contudo, um alinhamento entre VGF, TGF-oí , e· AR indica que a homologia se estende através do domínio da transmembrana enquanto os factores do crescimento do mixoma e dos vírus de Shope terminam

- 120 antes desta região hidrófoba. Estudos recentes tornaram evidentes que o precursor de TGF-£)(se sintetiza como uma proteína de transmembrana e a clivagem proteolítica diferencial resulta na secreção de Formas maiores que podem ser específicas do tipo de célula (Feixido, Nature , 3 26, 1 98 7, 88 5-88 5 ).

Outros homólogos de EGF que contém os antecessores de transmembrana incluem os Factores de revestimento, LDL, e os genes homeóticos Notch e lin-12, embora nenhum deles seja adjacente a uma repetição semelhante a EGF. A presença do motivo EGF em diversos precursores ligados a membranas sugere que em algumas circunstâncias devem ser processados como um Factor do crescimento segregado ou podem permanecer associados à membrana e podem desempenhar uma Função na comunicação intercelular e/ou intracelular.

Alguns dos homólogos de AR incluem génes homeoticos de invertebrados. Os genes homeóticos encontram-se envolvidos na regulação do desenvolvimento celular. Por exemplo, o gene Notch é um mediador da progressão correcta de uma célula ectodérmica num neuroblasto ou num dermoblasto. Nos mutantes Notch todas estas células se tornam células nervosas e a descendência toda ela constituida por tecido nervoso e sem revestimento, perece. Um gene homeótico pode Funcionar de um modo autócrono para estabelecer ou manter um determinado estádios nas células que expressam o gene e podem estar envolvidas na regulação de tais

2 1 estádios nas células adjacentes através de interseções célula a célula. 0 modo como a funciona para regular o estádio de desenvolvimento de determinados tipos de células deverá ser investigado.

9.6. PROCESSAMENTO DA ANFIRREGULINA COMPLETA

A caracterização do cADN de AR revelou que as formas de 78 e 84 aminoácidos de AR se sintetizaram como a porção média de um precursor de transmembrana de 252 aminoácidos (Secção

8.2. supra). Os locais para a clivagem proteolítica do precursor de AR que resultaria da libertação da AR completa não se ajustam aos locais de clivagem de qualquer protease conhecida. Os locais da extremidade N-terminal são Asp-Asp/Ser-V a 1 e Glu-Gln/Val-Val enquanto o local C-terminal é Glu-Lis/Ser-Met. As duas formas de AR parecem ser o resultado de um processo proteolítico alternado a partir de um precursor comum uma vez que todo o cADN e todos os ciones genómicos revelaram possuir a mesma sequência nesta região. De modo interessante, verificou-se que há um intrão que se situa entre os dois locais de clivagem N-terminais e é possível que a inconstância do intrão pudesse também contar para estas diferenças.

As células MCF-7 produzem 80% da sua AR na forma mais longa de 84 aminoácidos enquanto a linha de células HTB-36 do cariocaccinoma produz 80% da sua AR na forma mais curta de 78

- 12 2 aminoácidos. Para determinar se esta diferença tem conexoes com alterações do nível do ADN, utilizou-se a técnica da reacçã□ da polimerase

S c i e n c e , 2 3 3, 1 986,

076-1078) para se isolar o exão 3 de AR das células HTB-36, uma linha que produz , cons111u11vamente , níveis elevados de mARN de AR. Utilizou-se um o 1igonuc 1 eó11 do com sentido específico do intrão de AR e um oligonucleotido de sentido oposto a partir da região codificadora do exão 3 para amplificar específicamente o fragmento interveniente de 220 pb do gene de AR a partir de ambas as fontes de ADN. A análise de sequênciação directa, não demonstrou discrepâncias quer na junção intrão-exão, quer na sequência que codifica o exão 3 entre estas duas fontes de ADN, sugerindo, para além disto, que as duas formas de AR resultam da clivagem proteolí tica alternada do precursor.

9.7. COMPARAÇAO ESTRUTURAL ENTRE AR E OS FACTORES

DO CRESCIMENTO SEMELHANTES A EGF.

A AR apresenta, de um modo evidente homologia de sequência com outras proteínas semelhantes a EGF, com conservação das 6 cisteínas envolvidas em 3 pontes dissu1fídιcas, o que define a estrutura secundária dos factores do crescimento completamente desenvolvidos. Comparações previamente efectuadas (assistidas por computador) das sequências de aminoácidos conduziram à classificação dos motivos semelhantes a EGF em

123

dois grupos

distintos: factores do crescimento e factores da

coagulação sanguínea (ver Figura 13). Escolheram-se dois diagramas sequenciais para se compararem com as sequências AR ou de outro ADN ou proteínas conhecidas. A selecção baseou-se na aparente capacidade destas sequências para fazer a distinção entre os dois grupos de proteínas e no facto de serem necessárias poucas soluções de continuidade para se obter um alinhamento óptimo. No Quadro 1 apresentam-ss as sequências exactas. A primeira região corresponde aos primeiros 11 aminoácidos do segundo anel de EGF e a segunda corresponde ao terceiro anel

de cisteína	de EGF. Seleccionaram-se , para se originarem se-
quências de	consenso com base na sua homología estrutural e

funcionai devidamente estabelecida, quatro representantes de

cada um dos

grupos dos factores do crescimento e dos factores

da coagulação sanguínea. Escolheram-se sequências humanas, sempre que possível, uma vez que se pretendia, finalmente, compará-las com a AR humana. Os factores do crescimento incluem:

EGF humana,	TGF-oZ, VGF e factor do crescimento de Shope e os
factores de	coagulação incluem: os factores IX, X, XII e a
proteína C,	humanos. Também se fez a avaliação da AR contra

a base de dados para ambos estes blocos de homología. Ponderou-se a sequência de consenso com base na frequência com que um resíduo aparecia numa dada posição análises de estrutura-função

de diversos	derivados de TGF-CX, de VGF e de EGF levaram, re-
c en t emen te,	a identificação de diversos resíduos que são neces-
sários para	a actividade biológica destes factores do cresci-

mento. Proteínas recombinantes, peptidos de s í n t e s e , d

O r i v a d o s químicos específicos de um local e degradação proteolí têm sido gerar moléculas alteradas

Algumas lizações u em posições são relativas g e n e r a alinhamento na

FIG.

steínas (posições 1, 19,15, e 37) e os seus issulfídicos (1-15, 9-26, 28-37) sao necessárias para idade biológica, as extensões N-terminais têm pouco efe to na actividade e é necessário um resíduo aromático (F,Y) posição 8, uma alteração não conservativa de Y

J

D⁴¹ resulta na perda de actividade e/ou na perda dramática receptor ou de auto-fosfori1 ação.

imos dois adapta-se ritérios ligação ao

AR madura comp 1 etamente ainda comp i ta a EGF nalguns a todos estes parâmetros excepto nos ú que definem os receptor runca-se este para de EGF e/ou pa imedia tamen te resíduos necessários pa antes último e a crucial 1 a ligação ao receptor ios mitogénicos.

actividade mitogénica.

podem . n⁴¹ de D de EGF

No entanto, nao possui , embora substitua estas diferenças ser responsáveis pelo efeito cinético de ligação ao r não saturável e pelas suas marcadas diferenças funciona i s de

EGF em de te rminados ensaios tais como os de sinergismo

TGF-β, o efeito d iferencial nos sub-clones A431 seleccionados, ligaçao-cruzada ensaios de fosfori1 ação, e a sua capacidade para se ligar ao

ADN. A extensão extremamente hidrófila da e x tremidade N da AR completa também pode transmitir algumas destas

125 diferenças na ligação ao receptor ou actividade biológica.

. Θ . 5UB-CATEG0RIA AR DA SUPER-FAM IL IA EGF

Caiculou-se uma matriz de distâncias evolutivas com base no alinhamento da FIG. 13 e na análise por computado baseada no Quadro

I . Utilizou-se esta dendrograma para a super-família

EGF .

A pesquisa requer a presença de cisteínas e aumenta um ponto por cada resíduo que se harmonize com a sequência de consenso ponderado. Esta árvore evolutiva prevê que a AR se situe numa nova sub-categoria dos factores do crescimento semelhantes a EGF, com base na homologia funcional e estrutural. Um tal modelo vaticina que possam existir outros membros desta família dos factores do crescimento que possam identificar por homologia com os padrões de sequências anteriores, com base em três critérios: uma pontuação associada com as duas regiões dos factores do crescimento superior a 20, uma pontuação associada com a região dos factores de coagulação inferior a 20, e uma pontuação associada com a região AR. Esperar-se-ia que todas as novas moléculas que se ajustassem a estes critérios também tivessem alguma homologia funcional com EGF, TGF-OÍ, VGF ou AR.

As moléculas com pontuação associada a região AR superior a 40 classificar-se-iam como um membro da família AR dentro da super-família EGF e estariam englobadas no âmbito da pre126 sente invenção.

^{1 0} · EXEMPLO: EXPRESSÃO BACTERIANA DA ANF IRREGULINA

10.1. MATERIAIS E MÉTODOS

10.1.1. CONSTRUÇÕES DE PLASMlDEOS

Plasmídeo pARD1. 0 plasmídeo pARD1 contém o Fragmento de cADN EcoRI de 1,4 Kb (pAR1) de pEMBL18 com uma alteração de T para C na posição do nucleótido 532 no cADN que corresponde à sequência vaiina-vaiina na extremidade amina da AR completa, esta alteração de bases foi conseguida pela mutagénese dirigida de um local e confirmada por análise de sequenciação. A construção permite o acesso à junção entre o domínio do precursor amino-terminal de AR e a região hidrófila criando um local Dd e I (C T A A G ) .

Plasmídeo pARSTOP. 0 plasmídeo pARSTOP é uma construção intermédia que se utiliza na preparação do vector de secreção de AR. Efectuou-se a digestão do pARD1 com Ssρ I e Xba I e isolou-se o fragmento de 515 pb que codifica os 9 aminoácidos da extremidade carboxi da AR madura, os territórios citoplásmico e de transmembrana e a região não transferida da extremidade 3'. Purificou-se em gel o fragmento de A,7 Kb (Ssp I-Xba I) da restante porção amino-terminal de cADN de AR e ligou-se com os o 1 igonuc1eo11dos complementares AR5T0P1 e ARST0P2 (abaixo

2 7 indicados) tratados com quinase e ligados. Estes oligonucleótidos possuem uma extremidade complementar 5' compatível com

um local	SspI seguida de uma sequência que codifica os 9 ami-
noácidos	carboxi-terminais da sequência de AR completa, um
c o d ã o de	paragem TAA e os locais EcoRV e Xbal .

Y FGERCGEK* EcoP.V/Xba I

5' ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT

ARST0P2 3

TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTC TA TAGAGTC

Plasmídeo pbAR. 0 plasmídeo pbAR contém o TGF-[5 1ea der sem promotor ligado à forma de AR completa de 78 aminoácidos. Foi construído, ligando os oligonucleótidos b L A RN 3 e bL ARN4 com o fragmento Ddel a Xbal, de 240 pb do pASTOP, dentro do pEMBL18 digerido com EcoRI/Xbal. bLARN3 e bLARNi são complementares, criando uma extremidade saliente EcoRI 5' e uma ex tremidade saliente Ddel 3' e um único local interno Nae I compatível com o que se encontra próximo da extremidade carboxi-terminal da sequência leader de TGF-^ . A ligação destruirá o local Ddel e regenerará a sequência de aminoácidos correcta, va 1 ina-va 1ina na extremidade amina da AR completa.

- Ί 2 8 -

PHIL1 PHIL2	Sst I I AGVVKPPQNKTESE 5' GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA 3'CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT
PH IL 1 PHIL2	NTSDKPKRKKKGG 5' AAATAC T TCAGA T AAACCC A A AAG A A AG A.AAAAGGGAGG 3’ TTTATGAAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC EcoR I KNGKNRRNRKKKN
PH IL 1 PHIL2	5¹ CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG 3' GTTTTTACCTTTTTTAGCTTCTTTGTCTTTCTTCTTCTTAA

Plasmídeo pDCHBARI. 0 plasmídeo pDCHBARI é um vector de expressão de mamífero (FIG. 19) designado para a secreção da forma processada de 78 aminoácidos da AR completa. Contém a sequência leader de TGF-/sequência de AR completa do pbAR comandada pelo promotor CMV/HIV, flanqueada por um sinal de po 1iadeni1 ação SV40. 0 vector contém, ainda, SV2dhfr no mesmo sentido transcriciona1 . Efectuou-se a digestão de PSVDR/bOM com Nae I e XbaI e, purificou-se o vector de 6 Kb a partir da sequência que se excisou e, que codi fica 0 n c o H . Também se efectuou a digestão de pbAR com NaeI e Xba1 e isolou-se o fragmento de 260 pb que codifica os 5 aminoácidos carboxi - terminais da sequência de sinal de TGF-β e a sequência de 7Θ aminoácidos de AR madura seguida de um codão de terminação e de sítios E c o R V e X b a I . Verificaram-se as junções por análise de sequencιação .

29

Plasmídeo pDCHBPHILE. 0 plasmídeo pDCHBPHILE é um vector de expressão de mamífero designado para a secreção de uma proteína quimérica AR/EGF. Também se configurou o plasmídeo de modo a facilitar a futura fusão das construções entre o domínio hidrófilo de AR e outros factores do crescimento.

Criaram-se estas construções pela ligação do fragmento de 6,5 Kb resultante da digestão do vector pDCHBARI com SstII/Xbal com o fragmento EcoRI/Xbal de 175 pb contendo o gene de EGF humano de síntese e os oligonucleotidos Ρ ΗIL1 e PHIL2. Estes oligonucleó tidos são complementares das extensões S s t I I da extremidade 5' e E c o R I da extremidade 3' e codificam o último resíduo da sequência de sinal de TGF-^e o domínio hidrófilo de AR, completo. 0 pDCHBARI proporciona o promotor C Μ V/ΗIV , toda a sequência principal de.TGF-^3 , com excepção do último aminoácido, e a sequência de ρo 1ia deni1ação SV40. Obteve-se do Dr. Timothy M.

Rose (Oncogen) o fragmento de EGF, que inclui sítios convenien tes para manipulação futura.

10.1.2. PREPARAÇAO DO VECTOR pTAC plasmídeo TacPaK/EGF foi obtido através do Dr. Timothy

M. Rose (Oncogen) e é composto pelas seguintes unidades: uma

sequência	de um promotor híbrido trp-lac e a sequência Shine-
-Delgarno	do gene Cro isoladas como um fraqmento BqlII/BamHÍ
do vector	de expressão p135-1 que, por sua vez, é derivado do

pDR540 (Pharmacia); a sequência principal da fosfatase alcalina

30 derivada dos o 1 i g o n u c 1 e o t i d o s de síntese TacPaKI e TacPaK2 (Dr. Rose, Oncogen); a sequência de EGF, de síntese a partir do plasmídeo pBM22/PAK/EGF ; a região de terminação de transcrição; a porção principal do pBR22 com o gene de resistência à neomicina totalmente derivado do plasmídeo p135-1. EFectuou-se a digestão de TacPaK/EGF com BamHI preencheram-se duas bases com dATP e dGTP para criar um local compatível com Sall com bases niveladas e, digeriu-se, depois, com Pvul

Esta digestão remove o gene EGF de síntese e a maioria da sequência princ i pa 1 da

FosFatase alcalina mas deixa o promotor Tac, as sequências

Shine-delgarno e o

ATG da iniciação, intactos. PuriFicou-se em gel o Fragmento de 2,8 Kb .

10.1.3. PREPARAÇAO DE UM FRAGMENTO MODIFICADO

DE cADN de ANFIRREGULINA

EFectuou-se a digestão do plasmídeo pARSTOP com Sall, preencheram-se duas bases com TTP e dCTP para criar um sítio compatível com uma extensão BamH I com duas bases preenchidas (dATP, dGTP) e, digeriu-se, depois, com DdeI e B q 1 I . Foi necessária a última digestão para remover o ADN que migrava a partir do Fragmento desejado de 242 pb que codifica a Forma curta da AR completa com início em VKPP e Fim em CGEK, seguida de um codão de paragem introduzido sinteticamente. PuriFicou-se em gel o Fragmento de 243 pb.

131 -

10.1.4. PREPARAÇAO DOS OLIGONUCLEOTIDOS DE

SÍNTESE ALKPAR1 E ALKPAR2

Os o 1igonuc1eótidos ALKPAR1 e ALKPAR2 de síntese e complementares foram projectados com uma porção saliente Pvul 5' compatível com o fragmento parcialmente preenchido Pvul/BamHI de TacPaK/EGF e uma extensão D d e 13 ' compatível com o fragmento parcialmente preenchido Dde I /S a 11 de pARSTOP. Sintetizaram-se num Applied Biosystems 01igonuc1eotιde Syntesiser e purificaram-se a partir de um gel de acrilamida. Adicionaram-se fos fata s e s aos oligonucleotidos, com quinase T _Λ e, uniram-se quan tidades equimolares com arrefecimento lento, após desnaturação pelo calor.

Pvul Ddel

IALALLPLLFTPVTKAVV

ALKPAR1 5'

ALKPAR2 3'

CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3'

TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5'

10.1.5. LIGAÇAO E ISOLAMENTO DE ptacAPARI

Ligou-se, utilizando ADN ligase, o fragmento de AR de

243 pb, parcialmente preenchido, que se estende desde Ddel a

Sa11, o fragmento de 2,8 Kb, parcialmente preenchido, PvuI/BamH I do vector TacPaK/EGF e os oligonucleotidos ALKPA R1+2, tratados com quinase, unidos, e, transformou-se no interior de células competentes J M10 9 de E_. col i e seleccionaram-se sobre placas

LB/neomicina . Confirmou-se a construção correcta com digestões

52 de restrição e sequênciação do ADN. Na FIG. 20 indica-se a sequência de pTacAPAR.

10.1.6. PREPARAÇAO DO DOMÍNIO QUIMÉRICO HIDRQFILO

DE AR/FRAGMENTO 00 GENE DE EGF

Efectuou-se a digestão do plasmídeo pDCHBPHILE com S s t I I e X b a I para originar o fragmento de 286 pb, que codifica os últimos 2 resíduos da sequência principal de TGF-^(AG), 37 resíduos do domínio hidrófilo de AR (VVKP . . . RKKK ) e a sequência de síntese de 53 resíduos da sequência de EGF humana completa. (NSDS... WELR). Purificou-se em gel o fragmento de 286 pb.

10.1.7. PREPARAÇAO 005 0L IGONUCLEOTIDOS DE SÍNTESE

APAREGF1 E APAREGF2

Projectaram-se os o 1igonuc1eotidos complementares, de síntese, APAREGF1 e APAREGF2 com uma extremidade saliente Pvul

5' compatível com o fragmento Pvuí/Xbaí de pTacAPARI e uma extensão S s 11I 3' compatível com o fragmento SstII/Xbal de pDCHBPHILE. Sintetizaram-se os o 1igonuc1eotid os num Applied Biosvstems 011gonuc1eotide Synthesizer e purιfιcaram-se a partir de um gel de acrilamida. Adicionaram-se com quinase T4, fosfatos aos o 1igo nuc1eotidos e juntaram-se quantidades equimolares com arrefecimento lento , após desnaturação pelo calor.

- 133 Pvul

SstII

I ALALLPLLFTPVTK

APAREGF1 5'

APAREGF2 3'

CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACACC 3

TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5

LIGAÇAO E ISOLAMENTO DE pTACAPHILE

Ligaram-se, utilizando ADN ligase, o fragmento SstII/ / /X b a I de 286 pb, que codifica o domínio h i d r ó f 11 d e AR ligado à sequência completa de EGF, o fragmento Pvul/Xbal de 2,8 Kb do vector pTaCAPAPI e, os o 1igonuc 1 eotid os APAREGF1+2 tratados com quinase e juntos, transformaram-se dentro da E.. co 1 i J M1 0 9 competente e seleccionaram-se em placas de LB/neomicina . Confirmou-se que a construção era correcta por digestões de restrição e sequenciação de ADN. Na FIG. 21 apresenta-se a sequência de nucleótidos de pTacAPHILE. 0 produto de transferência esperado deverá ser clivado entre o dipeptido Ala-Gli imediatamente a seguir à sequência principal da fosfatase alcalina, adιcionando-se, deste modo, um resíduo adicional (glicina) ao domínio hidrófilo de AR. Os resíduos nucleótidos que diferem da sequência humana normal apresentam-se nos de tipo forte ( F I G . 2 0 ) .

10.1.9. PURIFICAÇÃO DA ANF I RREGULI NA RECOMBINANTE

Transformaram-se os plasmídeos pTacAPARI e pTacAPHILE nas células competentes JM109 da Ej . c o 1 i . e d e s e η v o 1 v e r a m - s e

134 de modo confluente em 10 ml de LB a 37°0 a uma A de 0,7.

oUU

Induziram-se, então as culturas com 100 u M de IPTG e deixou-se desenvolver durante 24-72 horas. Centrifugaram-se as culturas, duas vezes, a 5000 rpm, cada uma delas durante 15 minutos, guardou-se o agregado e a purificação continuou com o sobrenadante. Concentraram-se 10 vezes as amostras num aparelho de ultrafiltração Amicon com membranas YM5 (peso molecular de corte 5000).

Diluiu-se o concentrado com 5 volumes de água MILLIQ e reconstιtuiu-se para um décimo o volume da cultura original. Adicionou-se ácido acético glacial 1M e, colocaram-se as amostras a 4°C, durante 2-24 horas. Centrifugaram-se as amostras a 19 000 rpm, durante 20 minutos a 4°C em tubos OaKridge no rotor SS34, extraiu-se o agregado com 20 ml de ácido acético 1M e reuniram-se os sobrenadantes. Depois, efectuou-se a diálise dos sobrenadantes purificados contra ácido acético 0,1Μ, durante 2 dias, 1iofi1izaram-se e armazenaram-se a -20°C.

Ensaiaram-se, através de ensaios de_ imuno-marcação e de inibição do crescimento (GIAs), os agregados celulares e os sobrenadantes brutos secos, paca a proteína AR. 0 agregado ce1 u 1 a r de 50 yd de uma cultura confluente, sobrenadantes secos, processou-se num gel

Tricine a 16%,corou-se com Fast Green ou de 1 00-200 yjl de de po1iacria 1im ι d a e transferiu - se para nitroce1u1 ose. As manchas Western efectuaram-se conforme se descreveu na secção 7.1.6. supra.

135

10.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os agregados celulares, a partir dos transformantes por tadores de pTacAPARI apresentaram quantidades importantes de proteína imuno-reactiva que migrava a 10 KD assim como alguns produtos de degradação e prováveis dímeros.

Os sobrenadantes possuíam aproximadamente,

100-200 ng/ml de

AR imuno-reactiva segregada. A GIA nos sobrenadantes registou uma actividade de aproximadamente 150 ng/ml de AR, na linha de células indica doras A431-A3, por comparação com os padrões de AR natural purificada. Por este sistema, produziram-se grandes quantidades de proteína imuno-reactiva, a maior parte da qual permaneceu agregada dentro da célula. Ensaios de preparação perip1ásmicas e de sobrenadantes indicaram a secreção da proteína activa após 2-3 dias de crescimento.

ptacAPHILE proporciona os meios convenientes segundo os quais se podem ligar o domínio hidrófilo de AR ao N-terminal de qualquer gene de clonagem. Esta região pode transmitir característica de ligação alteradas ao receptor normal de ligação coordenada, funcionar como uma sequência de localização nuclear, ligar-se ao ADN ou, permitir o transporte através de lípidos ou de outras membranas normalmente impermeáveis ao factor agre gado.

11. DEPOSITO DE MICRORGANISMOS

Depositaram-se no Agricultural Research Culture Collection,

36

N.o r t h e r n Regional

Research Center ( N R R L ) os seguintes microrganismos a que se atribuíram os seguintes números de registo:

Microrganismo	Plasmídeo	N9 . de Depós i to
Escherichia	c o 11	HB101	pAR1	B-18438
Escherichia	co 11	HB1 01	pARH12	B-18439
Escherichia	co 1 i	HB101	pARH6	B-18440
Escherichia	c o 1 i	JM109	p TacAPAR1	B-18441
Escherichia	c o 1 i	JM109	pT acAPHILE	B-18442

âmbito da presente invenção não se limita às linhas de células depositadas nem às concretizações aqui divulgadas, que se pretende sejam considerados, apenas, como ilustrações de um aspecto da invenção e, qualquer seu equivalente funcional é abrangido pelo âmbito da presente invenção. Na realidade, para o especialista será notório que se poderão fazer modificaçoes da invenção para além das apresentadas e aqui descritas, a partir da descrição anterior, ções abrangidas pelo âmbito das

Consideram-se estas modificareivindicações, em anexo.

Também se deverá entender que todos os números de pares de bases e de resíduos nucleotidos e peptidos aminoácidos e dimensões dadas para os são aproximados e utilizados com finalidades descritivas.

Claims

NOVAS REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de Anfiregulina, um regulador bifuncional do crescimento de células com actividade inibidora do crescimento em linhas de células de cancro humano de origem epitelial, actividade estimuladora do crescimento em fibroblastos de furesquina humana cultivados in vitro uma sequência de aminoácidos

de V V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K G G K N G K N R R N R K K K N P c N A E F Q N F c I H G E c K Y I E H L E A V T C K c Q Q E Y F G E R C

G Ε K, ou, SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPK

R K K K G G K N G K N R R N R K KKNPCNAEF Q N F C I H G E C K Y I Ε H L Ε A V T C K C QQEYFGERC GE K, um peso molecular de cerca de 8 500 a 25 000 daltons e um pi compreendido

entre 7,6 e 8,0 aproximadamente, caracterizado pelo facto:

-138-

a) de se cultivar células MCF-7 na presença de 12-0-tetradecanoíl-forbol-13-acetato (TPA);

b) de se recolher os meios condicionados a partir das células MCF-7; e

c) de se isolar a Anfiregulina dos meios condicionados.
2. - Processo para a preparação de Anfiregulina caracterizado pelo facto:

a) de se cultivar uma célula de Escherichia coli que contém uma sequência de nucleotidos que codifica Anfiregulina sob o controlo de uma segunda sequência de nucleotidos que regula a expressão dos genes de forma a produzir um péptido ou proteína com actividade de Anfiregulina pela célula de Escherichia coli; e

b) de se recuperar a Anfiregulina da cultura.
3. - Processo para a preparação do gene da Anfiregulina, caracterizado pelo facto:

a) de se preparar uma colecção de DNA genómico a partir de DNA genómico de células humanas;

b) de se sondar a colecção com sondas de DNA específicas de Anfiregulina; e

c) de se isolar o gene da Anfiregulina.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o gene da Anfiregulina incluir a sequência de núcleo

-139- tidos essencialmente como esboçado a seguir:

BSí GMTKAUKCACCTGGCniUACATUKGGCTGTUUIGGTGIAGGTAAMrniMGTGCAlMTHGGCMlMIAMKAICMIAMUtl H» MIGTTGA TGACGCÚCClGGGtCACATAMGAMUGGGAGTUGGGUITIGAMTKIGGCCACTKACAGAMlGGGIGGúMGúGCC ÍCHUIIG -tSí AGAIAGMGCCCAKCUCAíGMGCMHCCTCATTGAGTICKKGTCCTTUKCTIGTIGUMCATCAGGCAMCTCAC TCT 1GGK IIAMG1 A ·»« CTTIUCAKIAMlACGGMCKnCUTnMKCCTGICIGnGUUTGHMGUtACAMUGGTUKAUGTTIGMACAKICGACTKIG -Μ4 IUGGTACUGCIC£GUAC1CCAGlCC!GCTCGCCCTC*AAAACGGCTIGCAaiAUCinTMGHCCACnCUICTCAGCGMICCHACGC*C‘ -»« GAGCAG&GCCTGHKCKCGCACAlAAGTHKGGGTAGCACCncIGGGGCGCCGaCIGCCKCACtCACGGCCG&GCCTIGACCKAIGIXCiaG -758 GCCCCCKCCGGC1MGCCUIAM«GGCAGGTGCGCGC£GCCCTACAUCG7KGCACACCTGGGIGCCAGCGCCCC*UGGKCCGGGaCAGCCCGA .IU GGCGCCGCGCCCGCC&CCCCUGCKCCCMGCCIICUGAGCGGCGCÂCACTCCCGGICKCACKGCKHCCMCACCCGC 1CGTI HGCGGCaGCT

1 10 x ι * f ι t r , * r *16 AU GCC CC6 CTG CU CCG CCG GCG CCG to

V V l 3 l L I l C $ «

31 G1G GIG CTG 1CG CK HG AU CIC GGC 1CA GttgaggattcaKtgcgctgaactgctçggctclcctcccalggcaggl.. (7.1 ib).

I

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agcaaaaaUlggcclgt gaga tgtgggtt tala. .(1.4 kb). .aat talaUcaagl tlgagaçactctlgtcaataaa Ict 11 tc U 1t1 lag£T

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TTTMCCAMcaaattgagagt tlgaalattagtlctgalattgcaaoactccagtglaettttctc

-140-

5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a célula humana ser uma célula MCF-7.
6. - Processo para gerar um anticorpo que identifique um epítope de An.f ireguli.na, caracterizado pelo facto:

a) de se inocular um animal hospedeiro com uma dose adequada de um composto que contém um péptido purificado correspondendo ao epítope; e

b) de se isolar os anti-soros gerados pelo animal hospedeiro.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o epítope incluir a sequência de aminoãcidos

DTYSGKREPFSGDHSADGFE.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o epítope incluir a sequência de aminoãcidos

S S SEPSSGADYDYSEEYDNE.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o epítope incluir a sequência de aminoãcidos

VKPPQNKTESENTSDKPKRKKKG.

Lisboa, 10 de Maio de 1989

O Agente Or.cici de ProprisHaris Industriei

-141RESUMO

Processo para a preparação de Anfiregulina, um regulador bifuncional do crescimento de células”

Descreve-se uma proteína que possui uma sequência de amino ácidos que compreende:

1 V V X F 10 20 T S D K F K ?. y y y C- G y κ g P Q N K 7 E S Σ K 30 N R R 40 N F. K K K K F C N À Σ F Q N T c : 50 [ H G Σ C X Y I Σ H 60 L Σ AVTCKCÇQ Σ 70 Y Σ G Σ R C C- 7S Σ X

Descreve-se também um processo para a preparaçao de Anfiregulina, uma proteína de modulação de crescimento bifuncional nova, caracterizado pelo facto:

a) de se. cultivar uma célula de Escherichia coli que contém uma sequência de nucleotidos que codifica Anfiregulina sob o controlo de uma sequência de nucleotidos que regula a expressão dos genes de .forma a produzir um péptido ou proteína com actividade de Anfiregulina pela célula de Escherichia coli: e

b) de se recuperar a Anfiregulina da cultura.