NO166532B

NO166532B - Fremgangsmaate for fremstilling av peptidet h-arg-x-z-y-tyr-r.

Info

Publication number: NO166532B
Application number: NO900294A
Authority: NO
Inventors: George Heavner
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1980-06-17
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1991-04-29
Also published as: ES512722A0; IL72392A; NO900294L; EP0565148A2; EP0042291A3; EP0144103A3; JPH0355480B2; EP0144103B1; DK263781A; IL72394A; EP0042291B1; YU152881A; CA1315042C; DK151968B; NO166532C; NO812035L; DK151968C; ES503012A0; IE881720L; IL72393A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår eri fremgangsmåte for fremstilling av nyttige peptider, mer spesielt en oppløsningssyntese-metode for fremstilling av H-ARG-X-Z-Y-TYR-R.

I US patenter 4.190.646 og 4.261.886 er det beskrevet forskjellige peptider som har thymisk og immunologisk funksjon.

Patentet beskriver "thymopoietinpentakloridet" (TP5) og substituerte derivater av dette, mens nevnte søknad beskriver peptidanaloger av TP5 med større virkning enn TP5. Ovennevnte patent og patentsøknad inngår her som referanser. I de ovennevnte patenter blir nevnte peptider fremstilt ved en synteseteknikk i fast fase, vanligvis beskrevet som "Merrifield-syntese". US patentene beskriver også at den klassiske teknikk (dvs. oppløsningssynteseteknikk) kan brukes for å fremstille visse peptider og derivater, men det er ikke beskrevet noen spesifikk klassisk fremgangsmåte eller syntesevei.

Skjønt Merrifield's synteseteknikk i fast fase er hensiktsmessig for fremstilling av små mengder peptider i laboratori-et, så ville den være upraktisk og generelt uøkonomisk for fremstilling av store mengder (dvs. mer enn 100 g) peptid, og for slike større mengder er det mer hensiktsmessig å bruke en oppløsningssynteseteknikk. Denne type teknikk er vanligvis langt billigere enn en teknikk hvor man bruker fast fase, noe som skyldes en lavere enhetspris på enkelte av de reagenser som brukes. Blant de mange typer oppløsningssynteseteknikker som er tilgjengelige for polypeptidfrémstillinger, så har man nå oppdaget visse spesielle syntetiske fremgangsmåter som gir det ønskede peptid på en hensiktsmessig og økonomisk måte.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av H-ARG-X-Z-Y-TYR-R, hvor

X er LYS, og Y er VAL, eller X og Y begge ér SAR, Z er ASP eller GLU, og R er NB2 eller OH, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved de trekk som fremgår fra karakteristikken i det etterfølgende krav.

Fremgangsmåten innbefatter trinnene:

a) dannelse av fragment I som består av H-Y-TYR-R' som beskrevet nedenfor; b) tilføyelse av en beskyttet Z-gruppe (alfa-T-omega-U-Z-OH) til fragment I for dannelse av et fragment IV, som består av alfa-T-omega-U-Z-Y-TYR-R', som beskrevet nedenfor; c) fjerning av den beskyttende gruppen T fra alfa-amino-stillingen på Z-gruppen i fragment IV, for dannelse av fragment IVA; d) kobling av fragment IVA (H-omega-U-Z-Y-TYR-R') til fragment V (alfa-T-omega-T'-ARG-X-OH) som beskrevet

nedenfor. Fragment 5 kan fremstilles som beskrevet nedenfor. Denne syntesevei unngår nødvendigheten av å fjerne L-aragininurenheten fra sluttproduktet, noe som er vanskelig og i enkelte tilfeller nesten umulig;

e) fjerning av de beskyttende gruppene; og

f) isolering og rensing av det resulterende peptid.

Fragment I kan dannes ved følgende trinn:

i) beskyttelse av alfa-aminogruppen på Y-gruppen ved å

la denne reagere med en reagens som vil innføre den beskyttende gruppe T;

ii) aktivering av den beskyttede Y-gruppen som er dannet i trinn i) m.h.t. nukleofilt angrep ved karboksygruppen med et amin, for dannelse av en karboksyaktivert beskyttet Y-gruppe, som beskrevet nedenfor;

lii) omsetning av nevnte karboksyaktiverte beskyttede Y-gruppe med TYR-R'; og

iv) fjerning av den beskyttende gruppen T, hvorved

fragment I dannes.

Fragment V kan dannes ved følgende trinn:

i) beskyttelse av alfa-aminogruppen og guanidinogruppen i L-arginin ved å la den reagere med reagenser som vil innføre de beskyttende grupper T og T';

ii) aktivering av den beskyttede ARG dannet i trinn i)

m.h.t. nukleofilt angrep ved karboksygruppen med et amin, for dannelse av en karboksyaktivert beskyttet ARG som beskrevet i det etterfølgende; og

ili) reaksjon av nevnte karboksyaktiverte beskyttede ARG

med X-aminosyre, hvorved fragment V dannes.

Hvis X er LYS, så må selvsagt dets epsilon-aminogruppe også egnet beskyttes ved hjelp av den aminobeskyttende gruppen T" under fremstillingen av fragmenter som inneholder X og under deres anvendelse for fremstilling av sluttpeptidet. Nevnte T".-gruppe må lett la seg fjerne under betingelser som ikke ødelegger det resulterende peptid, samtidig som nevnte gruppe må være stabil under fjerning av T-gruppene.

Den alfa-aminobeskyttende gruppen T kan være den samme eller forskjellig for hver av aminosyrene, og må være stabil over-for fjerning i de trinn som brukes for å knytte sammen aminosyregruppene samtidig som den lett må la seg fjerne ved slutten av de forbindende trinn ved betingelser som ikke vil spalte noen av amidbindlngene i peptidet. For visse grupper (f.eks. BOC) frembringes denne fjerning ved hjelp av en sterk syre (f.eks. trifluoreddiksyre), som resulterer i at det intermediære produkt fremstilles som det tilsvarende syreaddisjonssalt (f.eks. trifluoracetat).

Den guanidinobeskyttende, gruppen T' kan være enhver egnet aminobeskyttende gruppe- slik dette er beskrevet nedenfor, eller en nitrogruppe så vel som syreaddisjonssalter slik som hydrokloridet. Blant de aminobeskyttende grupper er det foretrukket å bruke uretanbeskyttende grupper (formel a nedenfor) og substituerte sulfonsyrederivater slik som p-metoksybenzensulfonyl og tosyl. Hydrokloridsaltet er her betegnet "omega"-gruppen for å indikere at den befinner seg på enden av kjeden. Den eksakte posisjon på mange guanidinobeskyttende grupper på kjeden er Ikke definitivt kjent.

Den karboksy-beskyttende gruppen TJ bør la seg lett fjerne under betingelser som ikke ødelegger det resulterende peptid, samtidig som gruppen må være stabil under fjerning av T-gruppene.

R' -gruppen er enten NH'2; (for produktpeptider hvor R er NH2) eller OU (for produktpeptider hvor R er OH).

Eksempler på egnede aminobeskyttende grupper er følgende:

a) hvor Rj er fenyl; tolyl; xylyl; adamantyl; allyl; beta-cyanoetyl; flu-orenylmetyl; benzyl, benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, lavere alkyl og laverealkoksy; nitropropylmetyl; difenylmetyl; cykloheksyl; cyklopentyl; vinyl; t-butyl; t-amyl; dimetyldifluor-metylmetyl; eller dimetylbifenylmetyl; b) hvor R2 er laverealkyl med 2-4 karbon-karbonatomer såsom etyl, isopropyl, t-butyl, o.l., eller laverealkyl med fra 1 til 4 karbonatomer substituert med fra en til fem halogengrupper såsom trifluormetyl, klormetyl, pntakloretyl, o.l.; c) hvor V er S eller 0, og R3 og R4 er benzyl eller laverealkyl; d) hvor R5 og Rf, indivi-elt er laverealkyl, eller R5 og R5 sammen er hvor R7 og Rg hver er hydrogen eller laverealkyl, e)

hvor Rg er hydrogen,

eller nitro; og

f)

hvor Rio er hydrogen,

metyl, halogen eller nitro.

Den aminobeskyttende gruppen f) som er bidentat, kan bare brukes for alfa-aminogruppene på L-arginin eller L-valin eller alfa-amino eller epsilon-aminogruppene på L-lysin, men ikke for alfa-aminogruppen i sarkosin. Den aminobeskyttende gruppen for sarkosin-alfa-aminogruppen må være monodentat p.g.a. metylsubstituenten på denne aminogruppen. De gjen-værende aminobeskyttende grupper kan brukes for alle aminosyrer .

Slik det brukes her, innbefatter begrepet "halogen" fluor, klor, brom og iod, men klor og brom er de foretrukne. Be-grepene laverealkyl og laverealkoksy innbefatter henholdsvis mettede alifatiske hydrokarboner med fra ett til seks karbonatomer slik som metyl, etyl, isopropyl, t-butyl, n-heksyl, o.l., samt de tilsvarende alkoksyder såsom metoksy, etoksy, isopropoksy, t-butoksy, n-heksoksy, o.l. Metyl er den foretrukne laverealkylgruppe, og metoksy er den foretrukne laverealkoksygruppe.

De reagenser som brukes for å innføre disse beskyttende grupper (vanligvis de tilsvarende syreklorider, skjønt andre derivater også kan brukes), vil i enkelte tilfeller bli betegnet som "beskyttende gruppereagenser". Andre egnede beskyttende grupper er f.eks. beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J. F. W. McOmie, redaktør, Plenum Press, N.Y., 1973.

Det er foretrukket at hver T og T" er de samme, og kan være benzyloksykarbonyl (CBZ) eller trifluoracetyl (TFA). Det er foretrukket at T' er hydrokloridsaltet.

En rekke forskjellige reagenser kan brukes for å fremstille de karboksyaktiverte, beskyttede aminosyregrupper som er beskrevet ovenfor.

En type karboksyaktivert, beskyttet aminosyregruppe er en aktiv ester. Eksempler på reagenser som kan brukes for å fremstille egnede aktiverte estere, er fenol, fenol hvor fenylringen er substituert med fra en til fem grupper valgt fra gruppen bestående av halogen (f.eks. klor eller fluor), nitro, cyano og metoksy:; tiofenyl; N-hydroksyftalimid; N-hydroksysuksinimid; N-hydroksyglutarimid; N-hydroksybenzamid; 1-hydroksybenzotriazol, o.l. Andre egnede midler er f.eks. beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", J. F. W. McOmie, redaktør, slik denne er referert ovenfor. I de etterfølgende spesifikke eksempler vil man vanligvis anvende N-hydroksysuksinimid eller 1-hydroksybenzotriazol.

Andre aktiveringsmetoder såsom den blandede eller symmetriske anhydridmetoden, syrekloridmetoden og azidmetoden er vel-kjente, og er f.eks. beskrevet i Bodansky et al., "Peptide Synthesis", 2. utgave, 1976, sidene 85-128. Disse andre fremgangsmåtene kan også brukes.

Av hensiktsmessighetsgrunner vil de følgende forkortelser bil brukt for å betegne de forskjellige aminosyrer:

Et eksempel på en fremgangsmåte er diagrammessig vist på den følgende fig. 1:

Et eksempel på en fremgangsmåte er vist diagrammessig på den følgende fig. 2:

Foreliggende fremgangsmåte er vist diagrammessig på den følgende fig. 3:

Et eksempel på fremstilling av H-ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2 er diagrammessig vist på den følgende fig. 4:

Et eksempel på fremstillingen av H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH er diagrammessig vist på den følgende fig. 5:

I de ovennevnte figurer er de beskyttende grupper represen-tert ved U, T, T<*> og T" som angitt ovenfor, mens karboksy-aktiveringen av aminosyregruppen er angitt med bokstavene

"OA".

Med henvisning til fig. 4 kan fragment I vanligvis fremstilles på følgende måte. For å beskytte aminogruppen i sarkosin fremstiller man et vannoppløselig, basisk addisjonssalt av sarkosin i vann. Hensiktsmessig kan dette basiske addisjonssalt fremstilles ved å oppløse sarkosin i et svakt molart overskudd av natriumhydroksyd. Denne oppløsning blir så samtidig tilsatt et svakt overskudd av en reagens for å innføre den beskyttende gruppen T (f.eks. det tilsvarende benzyloksykarbonylklorid) og en oppløsning av en base (f.eks. natriumhydroksyd) for å reagere med syren (f.eks. HC1) som dannes under reaksjonen. Reagensen med den beskyttende gruppen må være I oppløsning og er fortrinnsvis syrekloridet. Etter at reaksjonen er ferdig, ble overskuddet av den reagens som innførte den beskyttende gruppe, fjernet (f.eks. ved ekstraksjon med dletyleter eller et annet organisk opp-løsningsmiddel som er ublandbart med vann), fulgt av en isolasjon av det beskyttede sarkosin fra uomsatt sarkosin, noe som skjer ved en behandling med syre (f.eks. saltsyre). Syrebehandlingen omdanner det basiske addisjonssaltet av det ubeskyttede sarkosin til et syreaddisjonssalt av ubeskyttet sarkosin, og dette er oppløselig 1 vann. Imidlertid vil syrebehandlIngen omdanne det beskyttede sarkoslnbasiske addisjonssaltet bare til beskyttet sarkosin, ettersom det nå Ikke er mulig å fremstille et syreaddisjonssalt p.g.a. den beskyttede aminogruppen. Dette beskyttede sarkosin er uoppløselig i vann, og det lar seg lett utskille fra saltet av det ubeskyttede sarkosin, f.eks. ved en ekstraksjon med et ublandbart organisk oppløsningsmlddel slik dette er beskrevet ovenfor. Med begrepet "ublandbart organisk oppløsnings-mlddel" forstås alle vanlige kjente organiske oppløsnings-midler som ikke lar seg blande med vann, f.eks. dletyleter, etylacetat, benzen, toluen, xylen, o.l. Det foretrukne beskyttede sarkosin, N-benzyloksykarbonylsarkosin, er en kjent forbindelse. En fremgangsmåte for dets fremstilling er vist av R.S. Tipton og B.A. Pawson, J. Org. Chem., 26, 4698

(1961), og forbindelsen er kommersielt tilgjengelig fra Bachem, Inc., Torrance, CA.

I syntesen for kondensasjonen av dette beskyttede sarkosin med L-tyrosInamldmolekylet for fremstilling av fragment I, bør det aminobeskyttede sarkosin vanligvis aktiveres på en eller annen måte for å fremme dannelsen av bindingen. Skjønt det vanligvis er foretrukket å utføre denne aktivering ved at man danner en "aktivester", så kan man også bruke andre aktiveringsmetoder, såsom ved hjelp av et blandet eller symmetrisk anhydrid, azid eller syreklorid.

Man kan bruke enhver aktivester av det beskyttede sarkosin, skjønt den foretrukne aktive ester er den som dannes ved hjelp av hydroksysuksinimid. Den aktive ester av det beskyttede sarkosin fremstilles ved å reagere ekvivalente mengder av det beskyttede sarkosin og en aktiv esterreagens i en opp-løsning av et egnet organisk oppløsningsmiddel såsom tetrahydrofuran, dioksan, dimetylformamid, pyridin, o.l. Denne oppløsning blir så tilsatt en ekvivalent mengde av et koblingsmiddel, typisk dicykloheksylkarbodiimid. Skjønt andre koblingsmidler også er effektive, så er dicykloheksylkarbodiimid spesielt brukbart p.g.a. at biproduktet fra koblingsreaksjonen er meget lite oppløselig i de typer oppløsningsmidler som brukes, hvorved det lett kan fjernes ved filtrering, og man får det koblede produkt i oppløsning. L-tyrosinamid er kommersielt tilgjengelig (f.eks. fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) eller kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

Det neste trinn i fremstillingen av fragment I består i at man reagerer en molar ekvivalent mengde av L-tyrosinamid med den beskyttede sarkosinaktive ester i nærvær av en ekvivalent av et saltdannende materiale såsom et organisk tertiært amin. Skjønt ethvert organisk tertiært amin kan brukes, så har man funnet det meget tilfredsstillende å bruke trietylamin. Opp-løsningsmiddelet er et egnet organisk oppløsningsmiddel av den type som er beskrevet ovenfor. De uomsatte aminosyrer fjernes, ved behandling av reaksjonsblandingen med en syre (f.eks. eddiksyre) eller ved ekstraksjon med et ublandbart organisk oppløsningsmiddel slik det er beskrevet ovenfor.

Til slutt fjerner man den alfa-aminobeskyttende gruppen fra sarkosin, fortrinnsvis med trifluoreddiksyre, hvorved man får fragment I.

Fremstillingen av fragment II starter vanligvis med L-aspartinsyre som beskyttes på sin beta-karboksygruppe eller L-glutaminsyre som beskyttes på sin gamma-karboksygruppe. Denne beta- eller gamma-karboksylgruppen blir vanligvis betegnet som "omega"-gruppen i overensstemmelse med vanlig nomenklatur for å indikere at den sitter I enden av kjeden.

Eksempler på egnede karboksybeskyttende grupper er benzyl og benzyl hvor fenylgruppen er substituert med fra en til tre grupper valgt fra> gruppeni besÆående av ha-logen (fe.eks. klor eller brom),, nitro, C1-C3 laverealkoksy (f.eks. metoksy) eller Cj<-G3-laverealkyl (f.eks. metyl). Se ovenfor refererte bok av McOmie for ytterligere beskrivelse av slike grupper. Benzyl er den foretrukne gruppe. Denne beta-beskyttede L-aspartinsyre eller gamma-beskyttede L-glutaminsyre er kommersielt tilgjengelig fra Bachem, Inc., Torrance, California, eller kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter.

Denne beta-beskyttede L-aspartinsyre eller gamma-beskyttede L-glutaminsyre (omega-U-Z) reageres så med nevnte alfa-aminobeskyttede sarkosin som er blitt aktivert (f.eks. ved en omdannelse til en aktiv ester) slik dette er beskrevet ovenfor, hvorved man får fremstilt fragment II. På fig. 2 er Z

ASP.

Fragmentene I og II knyttes sammen til det beskyttede tetra-peptid alfa-T-SAR-beta-U-ASP-SAR-TYR-NH2 (fragment III) ved å reagere ekvivalente mengder i et passende aprotisk opp-løsningsmiddel såsom dimetylf ormamld i nærvær av et svakt overskudd av et koblingsmiddel såsom dicykloheksylkarbodiimid. Det er også foretrukket å utføre denne reaksjon i nærvær av en forbindelse som gjør at man får minimal racemisering 1 tilknytning til karboksylgruppen på L-lysin-delen av fragment I, og øke reaksjonshastigheten, og man kan f.eks. bruke 1-hydroksybenzotriazol. Som I forbindelse med fragment II, så blir den alfa-aminobeskyttende gruppen på sarkosindelen av fragment III fjernet med trifluoreddiksyre, hvorved man får fragment IIIA.

Etter en koblingsreaksjon som tilsvarer den som ble brukt for å binde sammen fragmentene I og II, så blir til slutt en alfa-amino- og guanidino-beskyttet L-arginingruppe knyttet til aminosluttgruppen i fragment IIIA, hvoretter man fjerner alle beskyttende grupper og får det ønskede pentapeptidamid. Fjerningen av de beskyttende grupper kan f.eks. utføres ved behandling med hydrogengass i nærvær av en palladium-på-karbon-katalysator i et egnet reduserende oppløsningsmiddel slik dette er beskrevet ovenfor (fortrinnsvis vandig eddiksyre). Hydrogengass trenger ikke å være under et trykk som er høyere enn 1 atmosfære, skjønt bruken av trykk er hensiktsmessig ettersom dette akselererer reduksjons-hastigheten.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres slik det generelt er beskrevet ovenfor.

I foreliggende fremgangsmåte blir fragment V fremstilt ved å la et alfa-amino og guanidinobeskyttet L-arglnln reagere med en molar ekvivalent av en X-aminosyre i nærvær av 1-hydroksy-benzotrlazol. Etter dette blir fragment V knyttet til fragment IVA.

Isolasjon og rensing av det resulterende urene produkt kan oppnås ved en kombinasjon av utkrystallisering og ione-utbytningskromatografi (fortrinnsvis ved å bruke ammonium-acetat-pH 5 som elueringsmiddel), og ved å bruke tynnsjikts-kromatografi for å fastslå Identiteten på forbindelsene i hver fraksjon. Skjønt det er angitt flere eksempler på isolasjons- og rensingsteknikk I følgende eksempler, så er det selvsagt underforstått at også andre fremgangsmåter kan brukes.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også sammensetninger som kan brukes for gjennomføring av de foreliggende fremgangsmåter (dvs. fra fragmentene I, IV, IVA og V samt andre mellomprodukter) så vel som de beskyttede produkter.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen, og de angitte temperaturer er i °C.

Eksempel 1

Fremstilling a. v/ fragment It SAR- TYR- NH2

A. BOC- sarkosin- hvdroksvsukslnimidester ( BOC- SAR- OSu) t

BOC-sarkosin (24,78 g, 0,13 mol) og N-hydroksysuksinimid (15,5 g, 0,13 mol) ble oppløst i 300 ml tørr THF og avkjølt til —5°. En oppløsning av dicykloheksylkarbodlimid (26,98 g, 0,13 mol) i 100 ml tørr THF ble tilsatt i løpet av 15 min. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten og hensatt ved romtemperatur. Det utskilte faste stoff ble frafUtrert, og oppløsningsmiddelet fordampet under redusert trykk til et hvitt, fast stoff. Dette ble utkrystallisert fra 250 ml absolutt etanol ved 4°, og man fikk 32 g (68$) av et hvitt, fast stoff, smeltepunkt 121-123°.

TLC: RF = 0,81, CHCl3/MeOH 9/1

(silisiumdioksydgel G, 250 mikron)

p.m.r. (S, CDC13): 1,45, S, 9H, BOC; 2,83, S, 4H, -OSu; 2,93, S, 3H, N-CH3; 4,27, S, 2H, -CH2-.

M.S.: M+ 286

B. BOC- sarkosyl- L- tryptosinaroid ( BOC- SAR- TYR- NH2)

L-tyroslnamid (2,17 g, 10 mmol) og trletylamin (1,01 g, 10 mmol) ble oppløst i 25 ml tørr metanol. BOC-sarkosin-hydroksysuksinimid (2,86 g, 10 mmol) ble tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Flyktige forbindelser ble fjernet under redusert trykk, og resten delt mellom EtOAc (50 ml) og en NaCl-oppløsning [50 ml (25 ml H20 + 25 ml mettet NaCl)] . Fasene ble skilt, og den organiske fase vasket to ganger til med samme type NaCl-oppløs-ning, og så tørket med magnesiumsulfat. Tørkemiddelet ble fjernet ved filtrering, og oppløsnlngsmidlet fordampet under redusert trykk. Resten ble kromatografert på 75 g 2,5 cm vid kolonne av Sillear CC7 idet man brukte etylacetat som elueringsmiddel. Forbindelsen ble eluert ved omkring 390 ml. De neste 475 ml ble oppsamlet og fordampet til 1,55 g'(44£) av et hvitt faststoff.

TLC: (Silisiumdioksydgel GF) Rf = 0,46 CHCl3/MeOH 9/1

C. Sarkosyl- L- tvrosinamld. trifluoracetat ( TFA- SAR- TYR- NH2): BOC-sarkosyl-L-tyrosinamid (1,30 g, 3,7 mmol) ble oppløst i 15 ml trifluoreddiksyre ved 0°. Oppløsningen ble omrørt i 1 time ved 0°, og oppløsningsmiddelet fjernet ved redusert trykk. Den resulterende olje ble behandlet med 50 ml vannfri eter og ga 1,27 g (94#) av et hvitt faststoff.

p.m.r. (S, CD30D): 2,3, S, 3H, N-CH3; 3,00, d, 2H, -CH2-C; 3,7, S, 2H, -N-CH2-C=0; 6,9; q, 4H, aromatisk

Eksempel II

Fremstilling av fragment IV og fragment IVA: H- beta- benzvl-ASP- VAL- TYR- benzylester. trifluoracetat ( beta- benzyl- L-aspartyl- L- valyl- L- tyrosin- benzylester. trifluoracetat)

BOC-beta-benzyl-L-aspartinsyre og en molar ekvivalent mengde av 1-hydroksybenzotriazolmonohydrat ble oppløst i tørr DMF, og oppløsningen ble avkjølt til 0°. Deretter tilsatte man en molar ekvivalent mengde av dicykloheksylkarbodilmld, og det hele ble omrørt 1 time ved 0°. Reaksjonsblandingen ble så tilsatt en oppløsning i DMF av en molar ekvivalent mengde av trietylamln og L-valyl-L-tyrosin-benzylester, trlluoracetat (fremstilt ved å bruke fremgangsmåtene fra eksempel I, men å bruke en ekvivalent mengde av L-valin istedenfor det der nevnte sarkosin), og det hele ble omrørt over natten ved romtemperatur. Produktet ble isolert fra reaksjonsblandingen etter at reaksjonen var ferdig, og BOC-gruppen ble fjernet hvorved man fikk det ønskede produkt.

Eksempel III

Fremstilling av fragment V; tri- CBZ- ARG- epsilon- CBZ- LYS- OH

( tri- CBZ- L- arglnin- epsilon- CBL- L- lysln)

En suspensjon av tri-CBZ-L-arginin-para-nitrofenylester (1,40 g, 2 mmol) i 3 ml THF ble tilsatt epsilon-CBZ-L-lysin (625 mg, 2,2 mmol). Deretter tilsatte man trietylamin (450 mg, 4,4 mmol), og det hele ble omrørt i 48 timer ved romtemperatur. Deretter ble oppløsningsmiddelet fjernet under redusert trykk, og 20 ml metanol ble tilsatt resten. Metanolen ble fjernet, og det faste stoff ble vasket med ytterligere 10 ml metanol. Det samlede filtrat og vaskeoppløsning ble fordampet under redusert trykk til en olje, og denne ble kromatografert på en 10 ml silisiumdioksydgelkolonne idet man brukte 0-556 metanol/kloroform som elueringsmiddel. Den annen forbindelse som kom ut av kolonnen, var det ønskede produkt, slik dette kunne påvises ved p.m.r.; utbytte 75 mg.

Analyse: Beregnet for CaRso^b0!!' 2/3 CHC13:

Eksempel IV

Fremstilling av pentapeptld ( annet alternativ)

Molare ekvivalenter av tri-CBZ-L-arginyl-epsilon-CBZ-L-lysin og 1-hydroksybenzotriazol ble oppløst i tørr DMF hvoretter man tilsatte en molar ekvivalent av dicykloheksylkarbodiimid. Oppløsningen ble tilsatt en oppløsning av molare ekvivalenter av beta-benzyl-L-aspartyl-L-valyl-L-tyrosin-benzylester-trifluoracetat og trietylenamin i DMF, og hele blandingen ble omrørt over natten. Produktet ble isolert fra reaksjonsblandingen etter fjerning av faste rester, hvoretter de beskyttende grupper ble fjernet, noe som ga H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH.

Eksempel V

Ved å bruke fremgangsmåtene fra eksemplene II-IV, men anvende ekvivalente mengder av egnede utgangsforblndelser, fikk man fremstilt: beta-benzyl-ASP-SAR-TYR-NH2

gamma-benzyl-GLU-VAL-TYR-benzylester

gamma-benzyl-GLU-SAR-TYR-NH2

B0C-SAR-beta-benzyl-ASP-SAR-TYR-NH2

BOC-epsilon-CBZ-LYS-gamma-benzyl-GLU-VAL-TYR-benzylester BOC-SAR-gamma-benzyl-GLU-SAR-TYR-NH2

tri-CBZ-ARG-SAR-OH

ARG-SAR-ASP-SAR-TYR-NH2

ARG-SAR-GLU-SAR-TYR-NH2

ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH

ARG-TYR-GLTJ-VAL-TYR-OH

De pentapeptider som er fremstilt i ovennevnte eksempler hadde alle den samme farmakologiske aktivitet som TP5, som er beskrevet i ovennevnte US-patenter.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av peptidet H-ARG-X-Z-Y-TYR-R, hvor X er LYS, og Y er VAL, eller X og Y er begge SAR, Z er ASP eller GLU, og R er OH eller NH2, karakterisert ved at man A) danner et fragment I som består av H-Y-TYR-R', hvor R' er OU eller NH2; Y er SAR eller VAL; og U er benzyl eller benzyl hvor fenylgruppen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, C1-C3 laverealkyl og C1-C3 laverealkoksy, ved I) beskyttelse av alfa-aminogruppen i Y-aminosyren ved å la den reagere med en reagens som vil introdusere den beskyttende gruppen T; hvor T er valgt fra: a)

hvor R^ er fenyl; tolyl; xylyl;

adamantyl; allyl; beta-cyanoetyl; flu-orenylmetyl; benzyl, benzyl hvor fenylringen er substituert med fra 1 til 3 grupper valgt fra halogen, nitro, laverealkyl og laverealkoksy; nitropropylmetyl; difenylmetyl; cykloheksyl; cyklopentyl; vinyl; t-butyl; t-amyl; dimetyldifluor-metylmetyl; eller dimetylbifenylmetyl; b)

hvor R2 er laverealkyl med 2-4 karbon-karbonatomer eller laverealkyl med 1-4 karbonatomer substituert med fra 1 til 5 halogengrupper; c)

hvor V er S eller 0, og R3 og R4 er benzyl eller laverealkyl; d) hvor R5 og Rf, indivi-elt er laverealkyl, eller R5 og R5 sammen

er

hvor R7

og Rg hver er hydrogen eller laverealkyl, e) hvor Rg er hydrogen, eller nitro; og f) hvor Rio er hydrogen, metyl, halogen eller nitro;

forutsatt at T er monodentat når X er SAR; II) aktivering av den beskyttede Y dannet i trinn i) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert beskyttet Y-aminosyre; ill) omsetning av nevnte karboksyaktiverte

beskyttede Y med TYR-R', hvor R' har den ovenfor angitte betydning; iv) fjerning av den beskyttende gruppen T, hvorved fragment I dannes; B) danner fragment IV som består av alfa-T-omega-U-Z-Y-TYR-R' hvor T, TJ, Z, Y og R' har de ovenfor angitte betyd-ninger ved i) beskyttelse av alfa-amino- og omega-karboksygruppene i Z-aminosyren ved å la den reagere med reagenser som vil introdusere beskyttelsesgruppene T og TJ; ii) aktivering av den beskyttede Z dannet i trinn i) med hensyn til nukleofilt angrep ved alfa-karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktivert, beskyttet aminosyre; og ili) omsetning av nevnte karboksyaktiverte

beskyttede aminosyre med fragment I, hvorved fragment IV dannes; C) danner fragment IVA som består av H-omega-TJ-Z-Y-TYR-R', ved fjerning av den beskyttende gruppen T fra fragment IV; D) danner fragment V som består av alfa-T-omega-T<*->ARG-X-OH, ved i) beskyttelse av alfa-aminogruppen og

guanidinogruppen i L-arglnin ved å la den reagere med reagenser som vil Introdusere dé beskyttende grupper T og T', hvor T' har

den éamme' betydning som T eller en nitrogruppe samt syréaddisjonssalter; ii) aktivering av den beskyttede ARG dannet i trinn i) med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av en karboksyaktlvert beskyttet ARG, som ytterligere beskrevet nedenfor; og 111) omsetning av nevnte karboksyaktiverte beskyttede ARG med X-amlnosyre (beskyttet på epsllon-amlnogruppen dersom X er LYS), hvorved fragment V dannes; E) aktivering av X-aminosyreesteren i fragment V med hensyn til nukleofilt angrep ved karboksygruppen av et amin, til dannelse av et kaboksyaktivert fragment V; F) lar det karboksyaktiverte fragment V dannet i trinn E) reagere med fragment IVA dannet i trinn C) til dannelse av alfa-T-omega-T'-ARG-X-omega-U-Z-Y-TYR-R'; G) fjerner gruppene U, T, T<*> og T" til dannelse av peptider H-ARG-X-Z-Y-TYR-R; og H) isolerer og renser det resulterende peptid.