NO159886B - Monoklonalt antistoff. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nytt monoklonalt antistoff

til et antigen som finnes på ca. 70% av normale humane thymocytter.

Sammensmelting eller fusjon av musemyelomceller til miltceller fra immuniserte mus av Kohler og Milstein i 175

(Nature 256, 495 - 497 (1975)) viste for første gang at det var mulig å oppnå en kontinuerlig cellelinje for fremstilling av homogent (såkalt "monoklonalt") antistoff. Etter dette epokegjørende arbeid har man gjort store anstrengelser for å fremstille forskjellige hybridceller ("hybridomer"),

og bruke det antistoff som fremstilles av disse hybridomer for forskjellige vitenskapelige undersøkelser. Se lf.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, redaktører, Springer-Verlag, 1978, og de referanser som der er angitt, C. J. Barnstable et al., Cell, 14, 9-20 (mai 1978), P. Parham og W. F. Bodmer, Nature 276, 397 - 399 (november 1978), Handbook of Experimental Immunology,

tredje utgave, bind 2, V.D. Wier, redaktør, Blackwell, 1978, kapittel 25, bg Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15 - 17. Disse referanser angir på samme tid både de fordeler man kan oppnå samt de komplikasjoner som lett oppstår når man ønsker å fremstille monoklonalt antistoff fra hybridomer. Skjønt den generelle teknikk som sådan er godt forstått, så oppstår det i hvert enkelt spesifikke tilfelle mange vanskeligheter og variasjoner. Man har således ikke på forhånd noen forsikring om at når man ønsker å fremstille en gitt hybridpm, så vil den ønskede hybridom oppnås, og at den eventuelt vil gi det antistoff som er ønskelig, eller at det således fremstilte antistoff har den ønskede spesifisitet. Hvorvidt man oppnår et heldig resultat eller ikke, vil i alt vesentlig være avhengig av den type antigen som brukes samt den seleksjonsteknikk som anvendes for isolering av det ønskede hybridom.

Forsøk på å fremstille monoklonalt antistoff til humane lymfocyttcelle-overflateantigener er bare angitt i et par tilfeller, se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De antigener som ble anvendt i de angitte eksperimenter, var dyrkede humane lymfoblastoide leukemiceller og humane kroniske lymfocytiske leukemiceller. Mange av de hybridomer som ble oppnådd, synes å gi antistoff til forskjellige antigener på alle humane celler. Ingen av de angitte hybridomer ga antistoff mot en på forhånd definert klasse eller gruppe av humane lymfocytter.

I den senere tid har man i forskjellige vitenskapeliqe ar-tikler beskrevet fremstilling og prøving av hybridomer som fremstiller antistoff til visse T-celleantigener. Se f.eks. Reinherz, E.L., et al., J. immunol., 123, 1312-1317

(1979), E.L. Reinherz et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979) og P.C. Kung et al., Science, 206, 347-349

(1979).

Det skal understrekes at det er to prinsipielle typer av lymfocytter som inngår i immunsystemet hos mennesker og dyr. Den første gruppen (de thymusavledede celler eller T-celler) blir differensiert i thymuskjertelen fra haemo-poietiske stamceller. Mens de er inne i thymuskjertelen, så blir de differensierende celler betegnet "thymocytter". De modne T-cellene skilles ut fra thymuskjertelen og sirkulerer mellom vevet, lymfene og blodstrømmen. Disse T-cellene danner en stor del av det reservoar man har av resirkulerende små lymfocytter. De har immunologisk spesifisitet og inngår direkte i såkalt cellestyrt immunreaksjon (f.eks.

ved en forkastelse av innpodede organer), som såkalte effektorceller. Skjønt T-cellene som sådanne ikke skiller ut humorale antistoffer, så er de i visse tilfeller nød-vendige for å få utskilt disse antistoffene av den andre gruppen av lymfocytter som er beskrevet nedenfor. Andre typer av T-celler utøver en regulerende mekanisme i andre deler av immunsystemet. Den mekanisme som ligger bak'denne type av cellesamarbeid, er ikke fullt ut forstått.

En annen gruppe av lymfocytter (benmarg-avledede celler eller B-celler) er dem som skiller ut antistoff. De ut-vikles også fra haemopoieitiske stamceller, med deres differensiering er ikke bestemt av thymuskjertelen. I fugler er de f.eks. differensiert i et organ som er ana-logt til thymuskjertelen, og som hos fugler kalles Fabricius Bursa. Hos pattedyr har man imidlertid ikke oppdaget noe tilsvarende organ, og man antar at B-cellene differensieres inne i benmargen.

Det er nå anerkjent at T-cellene kan deles i flere undergrupper, som ofte betegnes "hjelper"-, "suppressor"- eller "undertrykker"- og "dreper"-T-celler, som henholdsvis fungerer slik at de fremmer en reaksjon, undertrykker en reaksjon eller dreper (oppløser) fremmede celler. Disse undergrupper er velkjente i systemer hos mus, men de er bare nylig blitt beskrevet for humane systemer, se f.eks.

R. L. Evans et al., Journal of Experimental Medicine,

bind 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S. F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens" i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, redaktør, Plenum Press, 1977, bind 7, 363-379.

Evnen til å identifisere eller undertrykke grupper eller undergrupper av T-celler er viktig for diagnose av forskjellige lidelser eller tilstander som angår regulering av immunsystemet.

Således har f.eks. visse typer leukemi og lymfom for-skjellig prognose avhengig av om de skyldes B-cellér eller T-celler. Således vil bedømmelsen av lidelsens prognose være avhengig av hvorvidt man kan skille mellom disse to grupper av lymfocytter. Se f.eks. A.C. Aisenberg og J. C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (mars 1975), D. Belpomme et al. i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder et al., redaktører, Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Belpomme et al.,

British Journal of Haematology, 1978, 38, 85.

Visse sykdomtilstander (f.eks. ungdommelig reumatisk artritis, ondartede svulster og agammaglobilinemi) er forbundet med en ubalansert sammensetning av T-cellene.

Det har vært forstått at autoimmunologiske lidelser generelt er forbundet med et overskudd av "hjelper"-T-celler eller et underskudd av visse "undertrykker"- eller "suppressor"-T-celler, agammaglobulinemi er forbundet med et overskudd

av visse "undertrykker"-T-celler eller et underskudd av "hjelper"-T-celler. Ondartede svulster er vanligvis for-bunder med et overskudd av "undertrykker"-T-celler.

I visse typer av leukemi vil et overskudd av T-celler bli fremstilt på et stillestående trinn av utviklingen.

Diagnosen kan således være avhengig av evnen til å påvise denne ubalanse eller nevnte overskudd og kunne bestemme hvilken utvikling som er i overskudd. Se f.eks. J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusion, bind 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24, og de referanser som der er angitt, og E. L. Reinherz et al., J. Clin. Invest.,

64, 392-397, 1979.

Medfødt agammaglobulinemi, en sykdomstilstand hvor der

ikke blir fremstilt noe immunoglobulin, består av minst to distinkte typer. I type I vil underskuddet på immunoglobulin skyldes et overskudd av undertrykker-T-celler,

mens man i type II har en mangel på hjelper-T-celler. I begge typer synes det ikke å være noen mangel eller defekt på pasientens B-celler, dvs. de lymfocytter som er an-svarlige for utskillelsen av antistoffet, men disse B-celler blir enten undertrykket eller "ikke hjulpet", noe som resulterer i en sterkt nedsatt eller en fraværende immun-globulinfremstilling. Typen av medfødt agammaglobulinemi kan således bestemmes ved å undersøke hvorvidt det er et overskudd av undertrykker-T-celler eller et fravær av hjelper-T-celler.

Antisera mot hele gruppen av humane T-celler (såkalt antihumant thymocyttglobulin eller ATG) har vært rapportert å kunne brukes terapeutisk hos pasienter som mottar transplanterte organer. Ettersom den cellestyrte immunreaksjonen (den mekanisme hvorved transplanterte organer forkastes) er avhengig av T-celler, så vil en tilførsel av antistoff til T-cellene hindre eller forsinke denne forkastelses-

prosessen. Se f.eks. Cosimi et al., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T-Celle Monitoring", Surgery 40:155-163 (1976) og de referanser som der er angitt.

Identifikasjon og undertrykking av humane T-cellegrupper

og -undergrupper har tidligere vært oppnådd ved å bruke spontane autoantistoffer eller selektive antisera for human-T-celler, og dette er blitt oppnådd ved å immunisere dyr med humane T-celler, tappe dyrene for blod for derved å

få fremstilt serum, og adsorbere antiserumet med (f.eks.) autologe, men ikke allogeniske B-celler for derved å fjerne antistoffer med uønsket reaktivitet. Fremstillingen av disse antisera er meget vanskelig, spesielt når det gjelder adsorpsjon og rensing. Det adsorberte og rensede antisera inneholder mange urenheter i tillegg til det ønskede antistoff, noe som har flere årsaker. For det første vil nevnte serum inneholde millioner av antistoffmolekyler selv før T-celleimmuniseringen. Videre vil immuniseringen gi en fremstilling av antistoffer mot en rekke antigener som finnes på alle de injiserte humane T-celler.

Det er således ingen selektiv fremstilling av antistoff mot

et enkelt antigen. Videre er styrken på det spesifikke antistoff som fremstilles ved slike fremgangsmåter, vanligvis meget lav (dvs. inaktiv ved fortynninger på mer enn 1:100),

og forholdet mellom spesifikt til ikke-spesifikt antistoff er mindre enn 1/10^.

Se f.eks. nevnte Chess og Schlossman-artikkel som er angitt ovenfor (sidene 365 og etterfølgende), og den artikkelen som som er referert fra Chemical and Engineering News, hvor man har beskrevet ulempene ved de tidligere kjente antisera og de fordeler man kan oppnå ved å bruke monoklonalt antistoff .

Man har nå oppdaget en ny hybridom (0KT6) som er i stand til å produsere nytt monoklonalt antistoff mot et antigen som finnes på ca. 70% av normale humane thymocytter, men ikke på normale humane perifere lymfoidceller (T-celler, B-celler eller null-celler) eller benmargceller.

Det antistoff som er fremstilt, er monospesifikt for en enkel determinant på ca. 70% av normale humane thymocytter og inneholder i alt vesentlig ikke noe annet antihumant immunglobulin, noe som står i motsetning til tidligere kjente antisera (som alltid var forurenset med antistoff som var reaktivt overfor tallrike humane antigener), og tidligere kjente monoklonale antistoffer (som ikke var monospesifikke for et humant thymocyttantigen). Videre kan denne hybridom dyrkes slik at man får fremstilt antistoff uten at det er nødvendig å immunisere og drepe dyr, og derved anvende de meget arbeidskrevende adsorpsjons-og rensingstrinn som tidligere var nødvendig for å

oppnå de urene antisera som er nevnt ovenfor.

Det er følgelig en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye antistoffer mot et antigen som finnes på ca. 70% av normale humane thymocytter.

Ved diagnose av sykdommer eller for identifikasjon av T-celler eller thymocyttundergrupper brukes dette antistoffet.

Andre hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av

den etterfølgende beskrivelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveie-bragt et monoklonalt antistoff av IgG-klassen for bruk som diagnostisk middel, kjennetegnet ved at det reagerer med ca. 70% av normale humane thymocytter, men ikke med normale perifere T-celler, B-celler, null-celler eller benmargceller, reagerer med CEM og MOLT4 cellelinjer, men ikke med HSH2 cellelinjer, til påvisning av T-cellepopulasjoner som er lavere enn normale nivå ved primær gallecirrhose, multippel sklerose og hyper IgE, høyere enn normale nivå ved akutt transplantasjonsavstøpnings-reaksjon, og fullstendig fraværende i myastenia gravis, akutt infektiøs mononukleose, alle trinn i Hodgkin's sykdom og psoriasis.

Det monoklonale antistoffet kan hensiktsmessig fremstilles ved at man: i) fortynner og dyrker de sammensmeltede cellene som er oppnådd ved at mus er blitt immunisert med humane thymocytter, deres milter har blitt fjernet og en suspensjon av miltceller dannet, og ved at nevnte miltceller deretter har blitt sammensmeltet med musemyelomceller i nærvær av en sammensmeltings-promotor, idet nevnte fortynning og dyrking foretas i separate brønner i et medium som ikke vil under-støtte de usammensmeltede myelomcellene;

ii) bedømmer supernatanten i hver brønn inneholdende

en hybridom for tilstedeværelse av antistoff til E-rosett-positive rensede T-celler eller humane thymocytter;

iii) selekterer og kloner et hybridomproduserende antistoff som reagerer med ca. 70% av normale humane thymocytter, men ikke med normale humane perifere

T-celler, B-celler, null-celler eller benmargceller; og

iv) utvinner antistoffet fra supernatanten over nevnte kloner, eller overfører nevnte kloner intraperitonealt i mus og innhøster de ondartede ascites eller serum fra nevnte mus.

Hybridomen som produserer foreliggende antistoff, ble fremstilt generelt ved at man brukte den fremgangsmåte som er beskrevet av Milstein og Kohler. Etter immunisering av mus med normale humane thymocytter ble miltcellene fra de immuniserte mus koblet sammen med celler fra en musemyelomcellelinje, og de resulterende hybridomer ble undersøkt for å finne ut hvilke som hadde overliggende væsker inneholdende antistoff som ga selektiv binding til normale E-rosett-positive human-T-celler og/eller thymocytter.

De ønskede hybridomer ble deretter klonet og karakterisert. Som et resultat av dette fikk man en hybridom som produ-serte antistoff (betegnet 0KT6) mot et antigen på ca.

70% av normale humane thymocytter. Ikke bare reagerer dette antistoff med ca. 70% av normale humane thymocytter, men det reagerer ikke med normale perifere blodlymfoidceller eller benmargceller.

På bakgrunn av de vanskeligheter man tidligere har hatt i forbindelse med ondartede cellelinjer som antigenet, så

var det overraskende at foreliggende fremgangsmåte ga den ønskede hybridom. Det skal understrekes at p.g.a. hybrid-cellefremstillingens uforutsigbare natur så kan man ikke ekstrapolere fra ett antigen eller ett cellesystem til et annet. Man har i virkeligheten oppdaget at bruken av en T-celle-ondartet cellelinje eller rensede antigener fremstilt fra celleoverflaten som antigenet ikke ga noe heldig resultat.

Både den aktuelle hybridom og det antistoff som fremstilles av denne er her betegnet "OKT6", og hva som omtales i hvert enkelt tilfelle, vil fremgå av sammenhengen. Den benyttede hybridom er innlevert den 21. november 1979 til The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, og ble gitt ATCC aksesjonsnummer CRL 8020.

Fremstillingen og karakteriseringen av hybridomen og det resulterende antistoff vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse og eksempler.

Fremgangsmåten for fremstilling av hybridomen eller hybridcellelinjen innbefatter generelt følgende trinn: A. Immunisering av mus med normale humane thymocytter. Skjønt man har funnet at CAF^-mus er å foretrekke, så kan

man også bruke andre musestammer. Selve immuniseringen og thymocyttkonsentrasjonen må være slik at man får fremstilt brukbare mengder av egnede splenocytter. Tre immunise-ringer hver 14. dag med 2 x 10 7 celler pr. mus pr. injeksjon i en 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning viste seg å være effektiv.

B. Fjerning av miltcellene fra de immuniserte mus og fremstillingen av miltcellesuspensjon i et passende medium. Ca. 1 ml medium pr. milt er tilstrekkelig. Denne eksperiment-teknikk er kjent.

C. Sammensmelting eller kobling av suspenderte milceller med musemyelomceller fra en egnet cellelinje ved hjelp av en egnet sammensmeltingsfremmende forbindelse. Det foretrukne forhold er ca. 5 miltceller pr. myelomcelle. Man kan bruke ca. et totalt volum på 0,5-1,0 ml sammen-smeltingsmedium for ca. 10 Q splenocytter. Det er kjent og lett tilgjengelig mange musemyelomcellelinjer, og disse kan enten oppnås fra forskjellige typer av universitets-laboratorier eller cellebanker, såsom the Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. Den cellelinje

som brukes, bør fortrinnsvis være av den såkalte "legemiddelresistente" type, slik at usammensmeltede myelomceller ikke

vil overleve i et selektivt medium, mens hybridene vil overleve. Den mest vanlige gruppen er 8-azaguanidinresistente cellelinjer, som mangler enzymet hypoxantinguanidinfosfori-bosyl-transferase, og vil således ikke kunne leve i et HAT (hypoksantin, aminopterin og thymidin)-medium. Det er generelt foretrukket at myelomcellelinjen som brukes, bør være av den såkalte "ikke-utskillende" type, dvs. at den ikke i seg selv fremstiller noe antistoff, mens man også

kan bruke "utskillende" typer. I visse tilfeller vil imidlertid de utskillelde myelomcellelinjer være å foretrekke. Skjønt den foretrukne sammensmeltingsfremmende forbindelse er polyetylenglykol med en midlere molekylvekt på ca. 100 - ca. 4.000, så kan man også bruke andre forbindelser som fremmer en sammensmelting slik dette er kjent i industrien.

D. Fortynning og dyrking i separate beholdere av blan-dingen av usammensmeltede miltceller, usammensmeltede myelomceller og de sammensmeltede celler i et selektivt medium som ikke vil fremme veksten av de usammensmeltede myelomceller i et tilstrekkelig langt tidsrom til at de usammen-

smeltede cellene dør (ca. 1 uke). Fortynningen kan være av den begrensende typen, dvs. en type hvor volumet av fortynningsmiddelet er statistisk beregnet slik at man isolerer et visst antall celler (vanligvis 1-4) i hver separat beholder (f.eks. i hver brønn av en mikrotiterplate). Mediet er et (f.eks. et HAT-medium) som ikke vil understøtte vekst av den legemiddelresistente (f.eks. 8-azaguaninresistente) usammensmeltede myelomcellelinjen. Disse myelomvellene vil således dø og forsvinne. Ettersom de usammensmeltede miltcellene er ikke-ondartede, så har de bare et begrenset antall generasjoner. Etter et visst tidsrom (ca. 1 uke)

så vil således de usammensmeltede miltcellene ikke lenger reprodusere seg. De usammensmeltede cellene vil på den annen side fortsette å reprodusere seg ettersom de har den ondartede egenskapen fra myelomopphavet og evnen til å overleve i det selektive mediet fra miltcelleopphavet.

E. Bedømmelse av væsken i hver beholder (brønn) inneholdende en'hybridom for et nærvær av antistoff til E-rosett-positive rensede human-T-celler eller thymocytter.

F. Utvelgelse eller selektering (f.eks. ved begrensende fortynning) og kloning av de hybridomer som fremstiller eller gir det ønskede antistoff.

Så snart den ønskede hybridom er valgt ut og klonet, så

kan det resulterende antistoff fremstilles på én av to måter. Det reneste monoklonale antistoff fremstilles in vitro ved å dyrke den ønskede hybridom i et egnet medium i et egnet tidsrom, hvoretter man utvinner det ønskede antistoff fra supernatanten. Det egnede medium og en egnet lengde med hensyn til vekst er kjent eller kan lett bestemmes. Denne in vitro-teknikk gir i alt vesentlig monospesifikt monoklonalt antistoff, i alt vesentlig fritt for andre spesifikke antihumane immunglobuliner. Det er en liten mengde av annet immunglobulin til stede, ettersom mediet inneholder xenogent serum (f.eks. serum fra kalve-foster). Imidlertid så vil denne in vitro-fremgangsmåte ikke gi tilstrekkelig mengde eller konsentrasjon av antistoff for visse formål, ettersom konsentrasjonen av monoklonalt antistoff bare er ca. 50^ug/ml.

For å fremstille en langt større konsentrasjon av noe mindre rent monoklonalt antistoff så kan den ønskede hybridom inji-seres i mus, fortrinnsvis syngenisk eller semi-syngenisk i mus. Hybridomen vil der frembringe en dannelse av antistoff produserende svulster etter en egnet inkubasjonstid,

og dette vil resultere i en høy konsentrasjon av det ønskede antistoff (ca. 5-20 mg/ml) i blodstrømmen, og i det perito-neale eksudat (ascites) i museverten. Skjønt disse muse-verter også har normale antistoffer i sitt blod og ascites, vil konsentrasjonen av disse normale antistoffer bare være 5% av den monoklonale antistoffkonsentrasjonen.

Ettersom disse normale antistoffer videre ikke er anti-

humane i sin spesifisitet, så vil det monoklonale anti-

stoff som oppnås fra innhøstet ascites eller fra serum,

i alt vesentlig være fritt for et eventuelt forurensende antihumant immunglobulin. Dette monoklonale antistoff har høyt aktivitetsnivå (aktivt ved fortynninger på 1:50.000 eller høyere) og høyt forhold mellom spesifikt og ikke-spesifikt immunglobulin (ca. 1/20). Fremstilt immun-

globulin som innbefatter de k- lette myelomkjeder er ikke-spesifikke, "nonsense"-peptider som bare fortynner det monoklonale antistoff uten å svekke dets spesifisitet.

Eksempel I

Fremstilling av monoklonale antistoffer

A. Immunisering og somatisk cellehybridisering

CAF, hunnmus (Jackson Laboratories, 6-8 uker gamle) ble immunisert intraperitonealt med 2 x 10 7humane thymocytter i en 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning med 14 dagers mellomrom. 4 dager etter den tredje immuniseringen ble miltene tatt ut av de nevnte mus, og det ble fremstilt en enkelt cellesuspensjon ved å presse vevet gjennom et nett av rustfritt stål.

Cellesammensmeltingen ble utført ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet av Kohler og Milstein. 1 x 10 splenocytter ble smeltet sammen i 0,5 ml av et sammensmeltings-medium som besto av 35% polyetylenglykol og 5% dimetylsulf-oksyd i "RPMI 1640" medium med 2 x IO<7> P3X63Ag8Ul myelomceller som man fikk fra Dr. M. Scharff, Albert Einstein Col-lege of Medicine, Bronx, NY. Disse myelomceller utskiller IgG^ K-lette kjeder.

B. Seleksjon og vekst av hybridomer

Etter cellesammensmelting ble cellene dyrket i et HAT-medium (hypoksantin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% C02 i fuktig atmosfære. Flere uker senere ble 40-100^ul av supernatanten fra kulturer inneholdende hybridomer tilsatt en pellet av 10^ perifere lymfocytter som var utskilt i E-rosett-positive (E<+>) og E-rosett-negative (E ) populasjoner, som var fremstilt fra blodet av friske pasienter slik det er beskrevet av Mendes (J. Immunol. 111:860, 1973). En påvisning av musehybridomantistoffer som binder seg til disse celler, ble bestemt ved indirekte immunofluorescens. Celler som var inkubert med kultursupernatanter, ble merket med et fluorescerende geit-anti-mus IgG ("G/M FITC") (F/p = 2,5); og de fluorescerende antistoff-belagte celler ble deretter analysert ved hjelp av en "Cytofluorograf FC200/4800A" slik det er beskrevet i eksempel III. Hybridomkulturene inneholdende antistoffer som reagerte spesifikt med E<+->lymfocytter (T-celler) og/eller thymocytter ble valgt ut og klonet to ganger ved hjelp av begrensende fortynnings-metode i nærvær av understøttende celler. Deretter ble klonene overført intraperitonealt ved å injisere 1 x 10<7 >celler av et gitt klon (0,2 ml volum) i CAF^-mus som på forhånd var injisert med 2,6,10,14-tetrametylpentadekan. Ondartet ascites fra disse mus ble så brukt for å karakterisere lymfocytter slik det er beskrevet nedenfor i eksempel II. Det foreliggende hybridantistoff OKT6 ble påvist ved hjelp av standardteknikk til å være en IgG-^-undergruppe.

Eksempel II

Karakterisering av 0KT6- reaktivitet

A. Isolering av lymfocyttpopulasjoner

Humane perifere blodmononukleære celler ble isolert fra friske pasienter (alder 15-40) ved hjelp av Ficoll-Hypaque tetthetsgradientsentrifugering fulgt av den teknikk som er beskrevet av Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest, 21 (Suppl. 97): 77, 1968. Ufraksjonerte mononukleære celler ble utskilt i overflate-Ig<+> (B) og -lg (T pluss null) populasjoner ved hjelp av en "Sephadex G-200" anti-F(ab')2~ kolonnekromatografi slik det er beskrevet av Chess et al. i J. Immunol. 113:1113 (1974). T-cellene ble utvunnet ved

å E-rosettdanne lg -populasjonen med 5% saueerytrocytter.

Den rosettdannede blanding ble lagt over Ficoll-Hypaque og den utvunnede E<+->pellet behandlet med 0,155-molar NH.C1

(10 ml pr. 10 8 celler). Den T-cellepopulasjonen man opp-nådde på denne måten, var mindre enn 2% EAC-rosett-positiv og mer enn 95% E-rosett-positiv slik det kunne bestemmes ved hjelp av standardfremgangsmåter. I tillegg til dette innhøstet man den ikke-rosettdannende lg - (null-celle) populasjonen fra Ficoll-interfasen. Den sistnevnte populasjonen var mer enn 5% E og mindre eller lik 2% sig . Overflate-Ig -(B) populasjonen ble oppnådd fra "Sephadex G-200"-kolonnen ved eluering med normalt humant gamma-globulin slik dette er beskrevet tidligere. Denne polula-sjonen var mer enn 95% overflate-Ig<+> og mindre enn 5% E<+>.

Normale humane benmargceller ble oppnådd fra normale og friske pasienter ved utsuging ved hjelp av en sprøyte.

B. Isolering av thymocytter

Normale humane thymuskjertler ble oppnådd fra'pasienter hvis alder varierte fra 2 måneder til 14 år, og som var underkastet korrigerende hjerteoperasjoner. Nylig opp-

nådde porsjoner av thymuskjertelen ble umiddelbart plas-

sert i 5% kalvefosterserum i medium "199", og deretter finfordelt med barberblad og skalpeller, og så opparbeidet til en enkeltcellesuspensjon ved å presses gjennom et fint nett. Cellene ble deretter lagt over Ficoll-Hypaque og så spunnet og vasket som beskrevet tidligere. De fremstilte thymocytter var mer enn 95% levende eller lik eller mer enn 90% R-rosett-positive.

C. Cellelinjer av T- opprinnelse og T- akutte lymfoblas-

tiske leukemiceller

T-cellelinjene CEM, HSB-2 og MOLT-4 fikk man fra Dr.

H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA).

De leukemiske celler ble oppnådd fra 25 pasienter med diagnosen T-celle-ALL. Disse individuelle svulstene var på forhånd bestemt til å være av T-celleopprinnelse p.g.a.

sin spontane rosettdannelse med saueerytrocytter (mer enn 20% E<+>) og reaktivitet med T-celle spesifikt hetero-

antisera anti-HTL (B.K.) og A99 slik det er beskrevet tidligere. Svulstpopulasjonene var konservert ved -196°C

ved hjelp av flytende nitrogen med 10% DMSO og 20% AB

humant serum inntil man skulle utføre overflatekarakteri-seringen. Alle svulstpopulasjonene som ble analysert,

var mer enn 90% blastiske ved hjelp av Wright-Giemsa-morfologi på cytosentrifugepreparater.

Eksempel III

Cytofluorografisk analyse og celleseparasjon

Cytofluorografisk analyse av monoklonale antistoffer med

alle cellepopulasjoner ble utført ved indirekte immunofluorescens med fluorescein-konjugert geit-anti-mus IgG

"G/M FITC" idet man brukte en "Cytofluorograf FC 200/4800A". Kort beskrevet så ble 1 x IO<6> celler behandlet med 0,15 ml OKT5 ved en fortynning på 1:500, inkubert ved 4°C i en halv time og så vasket to. ganger. Cellene ble så reagert med 0,15 ml av en 1:40-fortynning "G/M FITC" ved 4°C i en halv time, sentrifugert og vasket tre ganger. Cellene ble så analysert på cytofluorografen og intensiteten på fluoresce-ringen pr. celle ble notert ved hjelp av en pulshøyde-analysator. Et lignende reaktivitetsmøster kunne man se ved en fortynning på 1:10.000, mens ytterligere fortynning ga tap av reaktivitet. Bakgrunnsfarging ble oppnådd ved å erstatte 0,15 ml av 1:500 ascites fra en CAF^-mus som var intraperitonealt injisert, med en ikke-produserende hybrid-klon.

I eksperimenter hvor det inngikk antistoff og komplement-utstyrt lymfolyse, ble thymocytter og perifere T-celler dyrket over natten fulgt av en selektiv oppløsning og deretter analysert på cytofluorografen.

E ksempel IV

Oppløsning av lymfoide populasjoner med monoklonalt antistoff og komplement

40 x 10^ perifere T-celler eller thymocytter ble plassert i 15 ml plastrør. Cellepellets ble inkubert med 0,8 cm <3>av OKT3, OKT4, OKT8 og normal asciteskontroll fortynnet til 1:200 i PBS, resuspendert og inkubert ved 20°C i 1 time. Deretter ble 0,2 cm 3 friskt kaninkomplement tilsatt de antistoff behandlede populasjonene, resuspendert og ytterligere inkubert ved 37°C i et ristende vannbad i 1 time. Deretter ble cellene nedsentrifugert, og levende celler ble tellet ved hjelp av trypanblått-eksklusjon. Etter telling ble cellene vasket to ganger til i 5% FCS, og så plassert i slutt-mediet ("RPMI 1640") (inneholdende 20% AB<+> humant serum, 1% penicillin-streptomycin, 200 mM L-glutamin,"25 mM "HEPES" buffer, og 0,5% natriumbikarbonat) og inkubert over natten i fuktig atmosfære med 5% CC^ ved 37°C. Fig. 1 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert normale humane thymocytter med OKT6 og andre monoklonale antistoffer ved en 1:500-fortynning og "G/M FITC". Bakgrunnsfluorescensfarging ble oppnådd ved å inkubere hver populasjon med en 1:500-fortynning av ascitisk væske fra en mus injisert med en ikke-produserende klon. Fig. 2 viser trinnene i en intrathymisk differensiering hos mennesket.,

Produksjonen av hybridomen og fremstilling av karakterisering av det resulterende monoklonale antistoff ble utført som beskrevet i ovennevnte eksempler. Skjønt store mengder av det foreliggende antistoff ble fremstilt ved å injisere den foreliggende hybridcelle intraperitonealt i mus og deretter høste ondartet ascites, så er det klart at nevnte hybridcellelinje kunne dyrkes in vitro ved hjelp av velkjent teknikk, hvoretter antistoffet kunne innvinnes fra supernatanten.

Tabell 1 viser reaktiviteten på OKT6, 0KT8, OKT9 og OKT10 med forskjellige humane lymfoidcellepopulasjoner. Det OKT6 mono-, klonale antistoff er reaktivt med ca. 70% av de normale humane thymocytter og ikke med andre prøvede lymfoidceller. Dette reaktivitetsmønsteret er én prøve ved hjelp av

hvilken det foreliggende antistoff OKT6 kan påvises og skilles fra andre antistoffer..

Fig. 1 viser et representativt fluorescensmønster oppnådd på cytofluorografen etter at man hadde reagert normale humane thymocyttsuspensjoner med en 1:500-fortynning av OKT3, 0KT4, 0KT5, OKT6, 0KT8, OKT9, OKT10 og "G/M FITC". Lignende reaktivitetsmønstre kunne ses med ytterligere 12 normale humane thymocyttpopulasjoner som ble prøvet. Det fremgår av tegningen at det eksisterer signifikante for-skjeller både m.h.t. prosentvis reaktivitet. og fluorescensintensitet for hver av disse nonoklonale antistoffer. Således vil f.eks. 0KT9 reagere med ca. 10% av thymocyttene med lav fluorescensintensitet mens OKT5, OKT6, OKT8 og OKT10 reagerer med ca-. 70% av thymocyttene ved en høyere fluorescensintensitet. OKT4 reagerer med 75% av thymocyttene og ligger intermediært mellom OKT9 og monoklonale antistoffer som gir en større fluorescensintensitet. I tillegg til dette viser fig. 1 at ca. 15% av thymocyttene kan påvises ved hjelp av 0KT3 ved indirekte immunofluorescens. OKT1 er ikke vist p.g.a. at dennes reaktivitetsmønster er

i alt vesentlig identisk med det man finner for OKT3 på thymocytter. Reaktivitetsmønsteret på fig. 1 er en annen prøve ved hjelp av hvilken foreliggende antistoff 0KT6 kan påvises og skilles fra andre antistoffer.

Tabell 2 viser fordelingen av antigener definert ved hjelp

av forskjellige monoklonale antistoffer på humane perifere T-celler og lymfocytter slik dette kunne bestemmes ved en serie oppløsningseksperimenter slik det er beskrevet i eksempel IV. Ettersom bare OKT3, OKT4 og OKT 8 var komplementfikserende monoklonalt antistoff, så ble disse tre brukt.

Som vist i tabell 2A så reagerer hele T-cellepopulasjonen

med OKT3, mens OKT4, OKT5 og OKT8 reagerer med 60, 25 og 34% av T-cellene, respektivt. Oppløsning med OKT4 og komplement senket det totale tall med 6 2% og spesifikt fjernet 0KT4<+->populasjonen. I tillegg til dette så øket prosentsatsen av 0KT5<+-> og OKTS^-celler, og det var ingen effekt pa det absolutte tall av OKT5 + - og OKT8 +-T-celler. Disse eksperimenter antyder at OKT4<+-> var distinkt fra 0KT5+- og OKT8<+->populasjonene. Ytterligere støtte for denne konklusjonen ble oppnådd ved oppløsning av T-celler med 0KT8 og komplement. I dette tilfelle øket ■ prosentsatsen av 0KT4<+->T-celler, mens det absolutte tall forble det samme,

og 0KT8<+-> og OKT5<+->populasjonene ble eliminert. Disse resultater viser videre at OKT8<+->populasjonen var resiprok

i forhold til 0KT4<+->populasjonen og inneholdt den totale 0KT5<+->T-celleundergruppen.

Lignende eksperimenter med humane thymocyttpopulasjoner

ga forskjellige resultater. Som vist i tabell 2B var ca.

75% av thymocyttene 0KT4<+> eller 0KT8<+>. Etter en oppløs-

ning med enten 0KT4 eller 0KT8, så beholdt man bare ca.

25% av thymocyttene. Hovedmengden av de gjenværende thymocyttene var reaktive med 0KT3, mens bare en liten gruppe var reaktive med 0KT6. Disse resultatene viser at bare en større del av de humane thymocyttene bærer 0KT4-, 0KT5-, 0KT6- og 0KT8-overflateantigener på samme celle.

I tillegg viser tabell 2 at etter behandling med 0KT8

eller 0KT4, var det en markert økning i modne thymocytter som hadde 0KT3-antigen. Hovedmengden av 0KT3-reaktive thymocytter var således allerede skilt i 0KT4<+-> eller 0KT8<+->undergrupper, ettersom hovedmengden av gjenværende celler etter en 0KT4- eller 0KT8-oppløsning er 0KT3<+>. Hvis 0KT3<+->subpopulasjonen var både 0KT4<+> og 0KT8<+>, så skulle en opp-løsning med begge typer monoklonalt antistoff ha fjernet de 0KT3-reaktive thymocyttene.

For ytterligere å bestemme forholdet mellom de 0KT3-

reaktive thymocytt-subpopulasjonene og andre monoklonalt antistoffdefinerte thymocyttfraksjoner, så ble thymocytter behandlet med 0KT3 og komplement og residuale celler, så sammenlignet med ubehandlede thymocyttpopulasjoner. Som gitt i tabell 2 så fjernet 0KT3 og komplement 25% av thymocyttene. Videre var det intet større tap av 0KT4-, 0KT5-, 0KT6- eller 0KT8-reaktive populasjoner. Disse resultatene .antyder at hovedmengden av thymocytter med 0KT6-markering finnes i den nevnte 0KT3 -populasjonen. I tillegg til dette antyder resultatene videre at thymocytter som samtidig uttrykker antigener definert med 0KT4, 0KT5 og 0KT8, er begrenset til OKT3 -populasjonen. Det skal bemerkes at den 0KT9-reaktive populasjonen av thymocyttene ikke ble svekket etter 0KT3- og komplementbehandling av de ufraksjonerte thymocyttene, noe som viser at den nevnte 0KT9<+->

subpopulasjonen i alt vesentlig er begrenset til OKT - thymocyttpopulas j onen.

Basert på disse resultater har det vært mulig å beskrive trinnene i den intrathymiske utviklingen av humane thymocytter. Som vist på fig. 2 bærer nesten alle thymocyttene OKTlO-markering. I tillegg til dette erverver thymocyttene på et tidlig trinn 0KT9-markering (Thyl og Thy2, respektivt). Dette trinn definerer en mindre mengde thymocytter og utgjør ca. 10% av den ufraksjonerte populasjonen. Deretter erverver de humane thymocytter et thymocytt-enestående antigen definert ved OKT6 og som samtidig uttrykker OKT4, OKT5 og OKT8 (Thy4). Den sistnevnte subpopulasjonen representerer størstedelen av thymocyttene og utgjør fra 70-80% av den thymiske populasjonen. Med ytterligere modning mister thymocyttene 0KT6-reaktivitet, oppnår 0KT3- (og OKT1-)-reaktivitet, og skiller seg i OKT4 - og 0KT5 /OKT8 -undergrupper (Thy7 og Thy8). Til slutt synes, det som om thymocytten skilles over i den perifere T-celledelen, den taper så sin OKTlO-markering ettersom dette antigen mangler i nesten alle de perifere T-lymfocyttene. Mulige overgangstrinn mellom disse tre hovedtrinnene i den thymiske utviklingen er betegnet med Thy3, Thy5 og Thy6 på fig. 2.

Ettersom akutt lymfobiastisk leukemi av T-opprinnelse antas

å være avledet av umodne thymocytter, bestemte man forholdet mellom svulstceller fra individer med T-ALL og de nevnte foreslåtte trinn i den intrathymiske differensieringen.

25 svulstcellepopulasjoner fra individer med T-ALL og

3 T-cellelinjer som på forhånd var studert med vanlige anti-T-cellereagenser og E-rosettdannelse, ble undersøkt. Som vist i tabell 2 var størstedelen av nevnte T-ALL-leukemiske celler reaktive med enten OKT10 alene eller OKT9 og OKT10 og reagerte ikke med andre monoklonale antistoffer. 15 av de 25 tilfeller som ble undersøkt, synes å ha tidligere thymocyttantigener (trinn I). I motsetning til dette var bare 5 av 25 tilfeller reaktive med 0KT6, noe som antyder en avledning fra en mer moden thymuspopulasjon (trinn II). Denne T-ALL-gruppen var i seg selv heterogen m.h.t. 0KT4-, 0KT8- og 0KT9-reaktivitet, noe som er vist i tabell 3. Celler fra 2 av 5 pasienter hadde de mest vanlige thymocyttantigener såsom 0KT4, 0KT6 og 0KT8. Det skal bemerkes at 0KT5 ikke var til stede i noen av disse 5 trinn II-svulstene, skjønt man observerte 0KT8-reaktivitet. Det sistnevnte resultat antydet klart at 0KT5 og 0KT8 definerer forskjellige antigener eller forskjelliga determinanter på det samme antigen. Til slutt kom 1 av 25 pasienters svulster fra en moden thymocyttpopulasjon (trinn III) slik denne kunne defineres ved sin reaktivitet med 0KT3. Dette individs svulst var dessuten reaktiv med 0KT5, 0KT8 og OKT10. Av de 25 leukemiske populasjoner som ble analysert, kunne bare 4 svulster ikke klart karakteriseres. 3 var positive med 0KT4 og 0KT8, men manglet 0KT3 og 0KT6, og representerte høyst sannsynligvis overganger fra Thy4 og Thy7, 8. Ett av de 25 tilfellene synes å være en overgang fra Thy3 til Thy4, ettersom den hadde både 0KT8- og OKTlO-reaktivitet.

T-cellelinjer avledet fra T-ALL-svulstpopulasjoner representerte også celler fra en spesifikk tilstand med hensyn til intrathymisk differensiering. Som vist i tabell 4 var HSB utelukkende reaktive med 0KT9 og OKT10, og vil derfor definere en svulstpopulasjon avledet fra trinn I. I kon-trast til dette var CEM reaktive med 0KT4, 0KT6, 0KT9 og OKT10 og syntes å være avledet fra en trinn II-thymocytt. Til slutt syntes MOLT-4 å representere en leukemisk trans-formasjon ved et trinn mellom HSB-2 og CEM ettersom den uttrykte 0KT6, 0KT8, 0KT9 og OKT10.

Tabell 5 viser forholdet mellom nivået av perifere T-celler og T-celleundergrupper og forskjellige sykdomstilstander. Disse forhold kan brukes for diagnostiske formål (f.eks.

for å påvise akutt infektiøs mononukleose) ved å analysere blodprøven fra et individ som man mistenker for å ha en av disse sykdomstilstander, for derved å kunne bestemme nivået av T-celler og T-celleundergrupper. Disse forhold kan

også brukes for terapeutiske formål hvor årsaken til sykdomstilstanden er et for høyt nivå av T-celleundergrupper (f.eks. type I medfødt agammaglobulinemi).

Andre hybridcellelinjer (hybridomer) som fremstiller monoklonalt antistoff og som er fremstilt (betegnet 0KT1, 0KT3, 0KT4 og 0KT5), er beskrevet i de følgende norske patentsøknader 800793; 801214; 801216; og 802751.

Tallene i parentes indikerer det antall pasienter som ble bedømt og undersøkt.

Skjønt bare en enkelt hybridcellelinje (hybridom) som fremstiller en enkelt monoklonalt antistoff mot en human thymocyttantigen er beskrevet, så er det innforstått at foreliggende oppfinnelse innbefatter alle monoklonale antistoffer som har de egenskaper som er beskrevet her. Man kunne bestemme at det foreliggende antistoff 0KT6 hører til undergruppen IgG^, som er én av de fire undergruppene av muse-IgG. Disse undergrupper av immunoglobulin G skiller seg fra hverandre ved såkalte "fikserte" områder, skjønt et antistoff til et spesifikt antigen vil ha et såkalt "variabelt" område som sunksjonerer identisk uansett hvilken undergruppe av immunglobulin G det tilhører. Dette betyr at et monoklonalt antistoff som oppviser de egenskaper sorh er beskrevet her, kan være av undergruppen IgG-^, IgG2a, IgG2b, eller IgG-j, eller av gruppene IgM, IgA eller av andre kjente Ig-grupper. For-skjellene mellom disse grupper eller undergrupper vil ikke påvirke selektiviteten med hensyn til antistoffets reaksjons-mønster, men kan påvirke ytterligere reaksjon mellom antistoffet og andre stoffer eller forbindelser, f.eks. komplement eller anti-mus-antistoffer. Skjønt foreliggende antistoff er spesifikt IgG-^, så er det underforstått at antistoffer som har samme reaktivitetsmønster som beskrevet her inngår i foreliggende oppfinnelse uansett til hvilken immun-globulinklasse eller -underklasse de tilhører.

Skjønt bare et eksempel på hybridcellelinje (hybridom) er beskrevet her, så er det underforstått at man lett kan følge den teknikk med hensyn til immunisering, sammensmelting og seleksjon som er beskrevet her, for derved å fremstille antistoffer som har de reaktivitetsegenskaper som er beskrevet her. Ettersom.individuelle hybridcellelinjer fremstilt fra en kjent musemyelomcellelinje og miltceller fra en kjent art av mus ikke kan ytterligere identifiseres uten med henvisning til det antistoff som fremstilles av hybridcellelinjen, så er det underforstått at alle hybridcellelinjer som gir antistoff med de reaktivitetsegenskaper som er beskrevet ovenfor, inngår i foreliggende oppfinnelse, og det samme gjelder fremgangsmåter for fremstilling av dette antistoff idet man bruker nevnte hybridcellelinje.

Ved diagnose av sykdommer brukes monoklonalt antistoff 0KT6 eller annet monoklonalt antistoff som viser samme reaktivitets-mønster. Det foreliggende antistoff kan brukes for å påvise og studere intrathymisk differensiering slik det er angitt på fig. 2. Unormale tilstander i trinn II-differensieringen kan påvises ved hjelp av et avvik fra ovennevnte 70% OKT6<+->thymocytter. Videre kan foreliggende antistoff brukes for å diagnostisere lidelser eller sykdomstilstander slik dette er vist i tabell 5. Denne teknikk kan brukes idet man anvender OKT6-antistoff alene eller i kombinasjon med andre antistoffer (f.eks. OKT3 - OKT10). Reaktivitetsmønsteret med en rekke antistoffer til T-celler og T-celleundergrupper vil kunne gi mer presis påvisning av visse lidelsestilstander enn det som er mulig ved hjelp av tidligere kjente diagnostiske metoder.

Claims (2)

1. Monoklonalt antistoff av IgG-klassen for bruk som et in-vitro diagnostisk middel, karakterisert ved at det reagerer med ca. 70% av normale humane thymocytter, men ikke med normale humane perifere T-celler, B-celler, null-celler eller benmargceller, reagerer med CEM og M0LT4 cellelinjer, men ikke med HSB2 cellelinjer, til påvisning av T-cellepopulasjoner som er lavere enn normale nivå ved primær gallecirrhose, multippel sklerose og hyper IgE, høyere enn normale nivå ved akutt transplantasjonsavstøpnings-reaksjon, og fullstendig fraværende i myastenia gravis, akutt infektiøs mononukleose, alle trinn i Hodgkin's sykdom og Psoriasis.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert ved at det er produsert av en hybridom med ATCC nr. CRL 8020 (0KT6) dannet ved sammensmelting av celler fra en musemyelomlinje og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med humane thymocytter.