NO155477B - Fremgangsmaate ved fremstilling av et konsentrert protrombinkompleks. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den

art som er angitt i krav l's ingress ved fremstilling av et høyrenset konsentrat av faktor IX eller mere generelt av protrombinkompleks.

Forskjellige forsøk på fremstilling av protrombinkomplekser (komplekser som omfatter koagulasjonsfaktorene II, VII, IX

og X), er allerede foreslått for behandling av forskjellige blodkoagulasjonsforstyrrelser, som særlig skyldes mangel på faktor IX (anti-hemofili B) , eller også på en leverinsuffi-sient.

Likeledes er det allerede gjort forsøk på å rense protrombinkomplekset ved å utgå fra friskt eller nyfrosset plasma ved anvendelse av kalsiumfosfat eller en egnet ioneveksler.

Andre fremgangsmåter er også anvendt som f.eks. adsorpsjon

på bariumsulfat eller aluminiumoksyd-gel.

Det er likeledes allerede foreslått å fremstille et konsentrat av faktor IX utgående fra COHN-fraksjon III som erhol-des ved kold fraksjonering av nyfrosset plasma med etanol.

Disse forskjellige produkter har vist seg ustabile fordi visse koagulasjonsfaktorer her befinner seg i "aktivert" tilstand og det har vist seg at ca. 11 % av pasientene som er behandlet med disse konsentrater har utviklet tromboser.

For å råde bot på disse ulemper har M. Wickerhauser allerede forsøkt å inaktivere den aktiverte faktor IX som er tilstede i COHN-fraksjon III, ved tilsetning av heparin til det konsentrat som oppnås ved eluering, og dets kofaktor som oppnås separat utgående fra COHN-fraksjon IV.

Dette har resultert i at en internasjonal komite har anbe-falt formelt at det bør utvikles mindre farlige preparater for tilsetning av heparin til sluttproduktet for å unngå skjebnesvangre virkninger av anti-koaguleringsaktiviteten.

I andre fremgangsmåter er det når produktet først er opp-nådd, likeledes gjort forsøk på å stabilisere det ved tilsetning av heparin og dets kofaktor idet det eksempelvis anvendes et komplett serum som kilde for heparin-kofakto-ren.

De aktuelt foreslåtte konsentrater oppviser imidlertid en betydelig mengde av aktiv faktor på tross av den sluttelige tilsetning av heparin.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte

ved fremstilling av et konsentrat av protrombinkompleks som muliggjør direkte oppnåelse av et ikke "aktivert" konsentrat dvs. som er stabilt og uten risiko for pasientene.

I henhold til oppfinnelsen fremstilles konsentrerte protrombinkomplekser fra en kilde for protrombinkompleks ved at det utføres en absorpsjon fulgt av en eluering, og fremgangsmåten er særpreget ved det som er angitt i krav l's karak-teriserende del, nemlig at det som adsorpsjonsmiddel anvendes en aluminiumoksydgel, og at det i det minste i elueringstrinnet arbeides i nærvær av heparin, og at elueringen utføres med et elueringsmiddel med pH i området 7,5 - 8,5 som samtidig eluerer både protrombinkomplekset, AT III og heparinet, idet det anvendes et elueringsmiddel.

Heparinet aktiverer anti-trombin III. Det aktiverte anti-trombin.III beskytter og stabiliserer protrombinkomplekset.

I de tilfeller da kilden for protrombinkomplekset inneholder AT III i tilstrekkelig mengde, er tydeligvis de to ut-gangskildene sammenblandet til et hele.

I de tilfeller da kilden for protrombinkomplekset ikke inneholder AT III eller bare inneholder en mengde som er util-strekkelig for stabilisering av nevnte kompleks, er det bare nødvendig å tilsette en tilstrekkelig mengde av AT III før elueringen. Fortrinnsvis tilsettes AT III til kilden for protrombinkomplekset før adsorpsjonen.

Tilsetningen av heparinet foretas før elueringen. Sagt på

en annen måte er det mulig å tilsette heparinet til elue-ringsmidlet, hvoretter elueringen gjennomføres. Men fortrinnsvis tilsettes heparinet til kilden for protrombinkomplekset eller til kilden for AT III før adsorpsjonen. Heparinet kan også bringes i kontakt med adsorbsjonsmidlet og deretter bringe dette i kontakt med startmaterialkilden eller kil-dene .

Når det er nødvendig å tilsette AT III til kilden for protrombinkomplekset, utføres denne tilsetning fortrinnsvis samtidig med tilsetningen av heparinet.

I den foretrukne utførelsesform av fremgangsmåten er således protrombinkomplekset beskyttet under hele varigheten av fremgangsmåten.

Som utgangskilde anvendes fortrinnsvis den fraksjon som oppnås fra det frosne plasma, etter eliminasjon av cryo-bunnfallet, en fraksjon som kalles "cryo poor plasma" eller CPP.

Det kan imidlertid likeledes anvendes et plasma som er nyfrosset eller ikke.

Det kan også som utgangsmateriale anvendes COHN-fraksjon III til hvilken det passer å tilsette antitrombin AT III, eksempelvis i form av COHN-fraksjon IV. Som utgangsmateriale kan det likeledes anvendes fraksjon IV alene, fordi denne fraksjon IV også er kilde for protrombinkomplekset.

Når det startes med et plasma tilsettes fortrinnsvis heparinet så snart som mulig og om mulig før frysningen.

Mengden heparin som skal tilsettes er en funksjon av kvali-teten til protrombinkomplekskilden. Denne mengde varierer vanligvis mellom 0,1 og HU. pr. ml av kildematerialet.

Adsorpsjonen gjennomføres med aluminiumoksydgel som har

vist seg spesielt egnet for adsorpsjon og deretter for den etterfølgende eluering av protrombinkomplekset.

Adsorpsjonen gjennomføres ved den temperatur som er fordel-aktig, og det arbeides vanligvis ved en temperatur under om-givelsestemperaturen, eksempelvis 0 - 15°C, fortrinnsvis 2 - 8°C.

Elueringen gjennomføres med ethvert middel som samtidig

kan eluere protrombinkomplekset og AT III. Det anvendes vanligvis en buffer med passende ionestyrke.

Ifølge en spesiell utførelsesform adsorberes kilden, f.eks. en CPP-fraksjon som er tilsatt heparin, på aluminiumoksyd-gelfhvoretter elueringen gjennomføres, mellom 0°C og omgi-velsestemperaturen.

Den eluerte fraksjon kan renses ved pH ca. 7 ved hjelp av

en eller flere tilsetninger av polyetylenglykol (PEG) (5-10 %) som utfeller uønskede proteiner. Fortrinnsvis utføres utfelningen med PEG ved en temperatur under omgivelsestempera-turen, f.eks. 0-8°C og spesielt ved 2-4°C.

Etter å ha eliminert utfelningen av de forurensende pro-teinene ved sentrifugering, justeres pH i den ovenstående væske til en verdi i området 4,8 - 5,2, og PEG tilsettes til en konsentrasjon på 12 til 20 % og bunnfallet som inneholder protrombinkomplekset isoleres. Denne utfeining ut-føres likeledes ved lav temperatur. Det oppnådde protrombinkomplekset gjenoppløses deretter og denne sluttløsningen underkastes eventuelt filtrerings-, fordelings- og lyofili-serings-operasjoner.

Konsentratet av protrombinkompleks fremstilt ifølge oppfinnelsen kan særlig anvendes som medikament for behandling av koagulasjonsforstyrrelser, spesielt mangel på faktor IX, men også ved blødningssykdommer hos nyfødte, overstigelse av dosen av courmarin-medikamenter og sykdommer i leveren i fremskredet tilstand. Det administreres på vanlig måte.

Kompleksene har farmakologiske egenskaper og den uskadelig-het som er vanlig for andre konsentrater av rensede protrombinkomplekser, men skiller seg fra dem særlig ved fravær av eller kvasi-fråvær av uønskede trombotiske komplikasjoner.

Oppfinnelsen skal nå beskrives mere i detalj ved hjelp av et utførelseseksempel.

Utgangsmaterialet er den nevnte CPP-fraksjon, dvs. den rest som fås fra et frosset plasma som så smeltes og hvorfra det cryo-utfelte fjernes.

Til denne fraksjon tilsettes heparin på en slik måte at det i blandingen oppnås ca. 0,5 enhet pr. ml plasma CPP.

Deretter gjennomføres adsorpsjon ved en lav temperatur, mellom 0 og 8°C, og fortrinnsvis mellom 2 og 4°C, på en aluminiumoksydgel i forholdet 10 til 20 ml gel pr. liter heparin-plasma.

Det rystes, sentrifugeres og gelen isoleres.

Deretter elueres gelen med en passende klassisk buffer som elueringsmiddel. Eksempelvis kan det anvendes en buffer som inneholder 0,25 m kalsiumfosfat, 0,17 m trinatriumcitrat-pentahydrat og 0,003 m EDTA. pH justeres til 7,5 - 8,5 og elueringen utføres med et volum av buffer av størrelsesorden en tredevtedel av volumet av plasma-CPP. Elueringen utfø-res på vanlig måte ved å bringe gelen i suspensjon i elue-rings-bufferen og ved å omrøre suspensjonen. Deretter ut-føres en sentrifugering og eluatet isoleres.

Deretter justeres pH i eluatet til ca. 7, og temperaturen til 2 - 4°C, hvoretter det tilsettes 5 - 10 % vekt/volum

av PEG (polyetylenglykol). Blandingen rystes, hvoretter den sentrifugeres og bunnfallet fjernes og supernatanten isoleres .

Så senkes pH i den erholdte væske til en verdi av størrel-sesorden 4,8 - 5,2, PEG tilsettes til et innhold på 12 - 20 % PEG iberegnet det opprinnelig tilsatte PEG og økningen i volum, blandingen rystes og sentrifugeres og bunnisoleres. Dette trinn gjennomføres likeledes ved en lav temperatur.

Bunnfallet oppløses igjen, fortrinnsvis ved omgivelsestempe-ratur, i en oppløsning som eksempelvis inneholder natrium-klorid eller trinatriumcitrat, idet oppløsningsvolumet er 1/2 til 1/3 av eluatvolumet. Etter oppløsningen justeres pH til det oppnås en klar oppløsning som oppviser en full-stendig oppløsning, noe som skjer ved ca. pH 7.

Det gjenstår å utføre en filtrering, fortrinnsvis med mem-bran, og minst sluttfiltreringen foretas under sterile be-tingelser .

Deretter oppdeles det oppnådde produkt sterilt i ønskede ali-kvoter hvoretter lyofilisering foretas straks etter innfrys-ning.

Det oppnås på denne måte et konsentrat av faktor IX som er praktisk talt fritt for uønsket aktivitet.

Administrasjonen av det lyofiliserte konsentratet utføres parenteralt. Konsentratet er ikke toksisk i de vanlige ak-tive doser.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et konsentrat av protrombinkompleks ,ved hvilken en kilde for protombinkomplekset og en kilde for anti-trombin III (AT III) bringes i kontakt med et adsorpsjonsmiddel som både kan adsorbere protrombinkomplekset og anti-trombin III, etterfulgt av eluering, karakterisert ved at det som adsorpsjonsmiddel anvendes en aluminiumoksydgel, og at det i det minste i elueringstrinnet arbeides i nærvær av heparin, og at elueringen utføres med et elueringsmiddel med pH i området 7,5 - 8,5 som samtidig eluerer både protrombinkomplekset, AT III og heparinet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tilsettes heparin til kilden for protrombinkomplekset eller til kilden for AT III før adsorpsjonen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at adsorpsjonsmiddelet bringes i kontakt med heparinet før det bringes i kontakt med utgangsmaterialet eller utgangsmaterialene.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at heparinet og elueringsmiddelet blandes sammen før elueringen.