HU219828B

HU219828B - Eljárás K-vitamin-függő proteinek izolálására és tisztítására

Info

Publication number: HU219828B
Application number: HU9500594A
Authority: HU
Inventors: Friedrich Dorner; Bernhard Fischer; Artur Mitterer
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-27
Publication date: 2001-08-28
Also published as: CA2143510A1; EP0669342A2; JPH07258286A; DK0669342T3; CA2143510C; HU9500594D0; DE4406515C1; FI950888L; NO950733D0; FI116526B; NO322372B1; EP0669342A3; ES2161790T3; US5633350A; CZ290471B6; FI950888A0; NO950733L; HUT72844A; CZ53995A3; ATE205218T1

Abstract

A találmány tárgya eljárás K-vitamin-függő proteinek elválasztásáranem K-vitamin-függő kísérőproteinektől pro- teintartalmú oldatból, olymódon, hogy legalább egy anioncserélő kromatográfiát és adott esetbenaffinitási kromatográfiát végeznek. Az eljárás különösen alkalmas aII, VII, IX, X faktor, valamint az S-protein, C-protein és Z-proteintisztítására. A találmány szerinti eljárás segítségével az előállítottK-vitamin-függő protein tisztasága legalább 95%. ŕ

Description

A természetben előforduló proteineken kívül ma már géntechnológiai módszerek alkalmazásával lehetőség van emlősproteinek, és különösen humán proteinek előállítására is rekombináns módszerekkel. Ene a célra idegen DNS-sel transzformált vagy transzfektált gazdasejteket tenyésztenek, és ennek során eukarióta gazdasejtek esetében a rekombináns módon előállított protein oldható formában bekerül a sejttenyészet közegébe [R. G. Wemer és W. Berthold, Drug Rés. 38, 422-428 (1988)]. Azonban, mivel a gazdasejtekből egyéb proteinek is bekerülnek a sejttenyészet közegébe a rekombináns módon előállított kívánt proteinen kívül, egy vagy több tisztítási lépéssel kell a kívánt proteint dúsítani és/vagy izolálni. Ilyen szempontból szükség van olyan módszerekre, amelyek hatékonyan és szelektív módon teszik lehetővé a rekombináns proteinek izolálását a sejttenyésztő közegből.

A rekombináns proteinek tisztítására általában a proteinek fizikai és kémiai tulajdonságait alkalmazzák. Ilyen tulajdonságok a proteinek mérete, a felület természetes töltése, a proteinek hidrofil jellege és oldhatósága. További tisztítási módszerek alapját képezi az egyéb molekulákhoz, például antitestekhez való kötődés. Ugyanez érvényes a proteinek tisztítására természetes forrásokból. Itt is a protein fizikai és kémiai tulajdonsága alapján választják el azt az egyéb kísérőproteinektől.

A K-vitamin-fuggő proteineket ez idáig a proteinek kicsapásán, ioncserélő kromatográfián és gélszűrésen alapuló módszerekkel tisztították [A. L. Bloom és D. P. Thomas, Haemostasis and Thrombosis, Churchill Livingstone, New York, (1897)]. B. Dahlbáck [Biochem. J. 209, 837-846 (1983)] ismertetett egy, az S-protein (PS) tisztítására alkalmas eljárást. Egy bárium-citrátos kicsapás után a PS-t DEAE-Sephacel-en izolálták. J. Maim és munkatársai [Eur. J. Biochem., 187, 737-743 (1990)] rekombináns PS-t (rPS) tisztított monoklonális antitestekkel affinitási kromatográfiás eljárással. B. Osterude és R. Flengsrud [Biochem. J. 145, 469-474 (1975)] IX olvadási faktort FalX izolált bárium-szulfátos kicsapással, és cellulózon végzett ioncserélő kromatográfiával. Az (FalX) tisztítására H. Kim és munkatársai [Sem. Hematol. 28 Suppl., 6, 15-19 (1991)] monoklonális antitesteket alkalmaztak.

Az US 5 055 557 számú szabadalmi leírásban eljárást ismertetnek K-vitamin-fuggő proteinek tisztítására és koncentrálására plazmából, valamint rekombináns módon előállított proteinekből, immunadszorbens segítségével, monoklonális antitest alkalmazásával.

A fenti eljárásban figyelmet kell szentelni annak, hogy sok protein nem különbözik egymástól eléggé, ami frakcionálásukat még bonyolultabbá teszi. Ezért pontos, egymás között koordinált tisztítási lépések kombinációját kell alkalmazni annak érdekében, hogy a proteinek tulajdonságaiban meglévő különbségeket optimálisan kiaknázzuk.

Az emberi és állati vérben természetes körülmények között előforduló proteinek közül számos protein képes kétértékű kationokat megkötni. Ezek a proteinek egy Kvitamin-függő eljárásban szintetizálódnak a sejtekben, amelynek során a kationkötő helyek a glutaminsav (Glu) gamma-karboxi-glutaminsavvá (Gla) alakulása során keletkeznek. Ezek a kationkötő helyek azután kalciumionokkal (Ca²⁺) telítődhetnek. A kalciumionokon kívül a kationkötő helyek általában kétértékű stroncium vagy bárium megkötésére is képesek [B. Fürié és B. C. Fürié, Cell 53, 508-518 (1988)]. A fenti K-vitaminfüggő proteinek közül sokan a vérplazma összetevőjét képezik, és fontos szerepet játszanak a homeosztázisban. Ezekben a K-vitamin-függő proteinekben a gamma-karboxi-glutaminsav-csoportok a szerkezetileg homológ N-terminális Gla-régiókban találhatók [A. Tulinsky, Thromb., Haemost. 66, 16-31 (1991)]. A homológ Gla-régiókat tartalmazó fenti kalciumionkötő proteinek közé tartozik többek között az S-protein (PS), a C-protein, a IX faktor (FalX), a II faktor, a VII faktor, a X faktor és a Z-protein.

A kalciumionok kötődése következtében ezek a proteinek kifejezetten megváltozott tulajdonságokat mutatnak a nem kalciumkötő proteinekkel összehasonlítva. Ezeket a különbségeket használták ki az EP 363 126 számú szabadalmi leírásban, ahol eljárást ismertetnek K-vitamin-függő proteinek izolálására, amelyeket rekombináns úton állítottak elő. Ebben az eljárásban a kétértékű kationokat teljesen eltávolítják, oly módon, hogy a tenyésztőközeghez kelátképző komponenst adnak a protein tényleges izolálása előtt, és így a protein egy ioncserélő gyantához, például Mono Q-hoz képes kötődni. Ezenkívül a proteint egy anioncserélőról eluálják nátrium-klorid és kalciumionok hozzáadásával. Ily módon egy 58%-osra dúsult terméket (C-proteint) kapnak. A szennyeződések (42%) olyan proteinekből állnak, amelyek szintén felszabadulnak az ioncserélőről az alkalmazott sókoncentrációnál (0,15 mol/1). Egy további tisztítási lépésben a kapott protein-kation komplexet egy oszlopon adszorbeálják, amelyhez immobilizált EDTA-t kötnek, majd mossák, és a proteint eluálják. Az eluensben lévő proteineket ioncserélőhöz kötik, és sógradienssel eluálják. Az eluenshez kalcium-kloridot adnak, majd a protein-kation komplexet hidrofób oszlopon adszorbeálják, és a kívánt proteint EDTA-pufferrel eluálják.

Az EP 363 126 számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárás hátránya, hogy a K-vitamin-függő protein nagymértékű konformációs változáson megy keresztül a kalciumionok többszöri eltávolítása és hozzáadása következtében, ami a protein tulajdonságainak megváltozásához vezet [Johanson és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 5554-5560 (1993); J. Stenflo, J. Bioi. Chem. 251, 355-363 (1976)]. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárásnak nincsen ilyen hátránya, mivel a teljes tisztítási folyamat során egyetlen lépésben sem kell a kétértékű fémionokat például kelátképző szerekkel eltávolítani.

A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a K-vitamin-függő proteinek eredeti konformációja és stabilitása a tisztítás során megmarad.

Az EP 354 354 szabadalmi leírásban eljárást ismertetnek a II, VII, IX és X véralvadási faktorok dúsítására. A fenti protrombin-komplex faktorokat úgy izolálják, hogy hidroxil-amino-csoportokat hordozó mátrixon adszorbeálják, amelyhez különösen a IX faktor kötődik

HU 219 828 Β erősen. Az ionerősség függvényében a II, VII és X faktor eluálódik először. Kalciumionok hozzáadása nem játszik szerepet ebben az eljárásban.

Az EP 317 376 számú szabadalmi leírásban eljárást ismertetnek IX faktort tartalmazó humán plazma frakcionálására, amelyben a krioprecipitátumot először kromatográfiásan előtisztítják, majd anioncserélő kromatográfiával és növekvő ionerősségű pufferrel szelektív elúcióval elvégzik az elválasztást, és végül Heparin-Sepharose-on affinitási kromatográfiát végeznek szelektív eluálással. Ebben az eljárásban szintén nem veszik figyelembe, hogy a IX faktor tulajdonságai megváltoznak kalciumionok jelenlétében vagy távollétében.

A találmány célja olyan eljárás kidolgozása volt Kvitamin-fiiggő és kalciumion-kötő proteinek oldatokból történő elválasztására a nem K-vitamin-fiiggő kísérőproteinekből, amelyben nincs szükség a kalciumionok eltávolítására és a proteinek ezzel kapcsolatos lehetséges denaturálására. Ennek az eljárásnak - amely természetes forrásokból kapott, dúsított proteinoldatokkal ugyanúgy kivitelezhető, mint a rekombináns proteinelőállítás során kapott sejttenyészetek felülúszóival egyszerűnek kell lennie, és nagy tisztaságú K-vitaminfüggő proteineket kell eredményeznie.

A fenti célkitűzést a találmány értelmében az 1 -16. igénypontokban leírt eljárással értük el.

A találmány szerinti eljárás első lépésében a K-vitamin-függő proteineket tartalmazó sejttenyészet-felülúszókat, valamint az egyéb módon feldolgozott sejttenyésztő közegeket, a szövettenyészetekből származó felülúszókat vagy természetes forrásból származó proteinoldatokat anioncserélő gyantán kromatografáljuk. A kromatográfiás lépés előtt nem szükséges a proteinoldatból a kétértékű kationokat specifikusan eltávolítani, ellentétben az EP 363 126 számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárással. Sőt meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy alacsony sókoncentrációban kis mennyiségű kalciumion hozzáadásával az anioncserélőn nem kötődnek a K-vitamin-függő proteinek, azonban a nem Kvitamin-fuggő proteinek igen. Először alkalmaztunk a találmány szerinti eljárásban a K-vitamin-fiiggő és nem K-vitamin-függő proteinek elválasztására egy új típusú anioncserélő gyantát, amely hiperdiffuziós tulajdonságokkal rendelkezik, mint például a Q-Hyper D^R Sepracor. Az anioncserélő kromatográfia után affinitási kromatográfiát alkalmazunk, amennyiben a protein további tisztítása szükséges.

A találmány értelmében a K-vitamin-fuggő proteint tartalmazó oldatot egy további proteinkoncentrálási lépéssel dúsítani lehet, anélkül, hogy a proteinoldatból el kellene előzőleg távolítani a kétértékű kationokat, majd az oldatot átszűrjük az anioncserélőn, és adott esetben affinitási oszlopon is kromatografáljuk.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint az egy előtisztítási lépésben (I. lépés) feldúsított proteinkoncentrátumot átszűrjük egy anioncserélőn (2. lépés), majd közvetlenül affinitási oszlopra visszük. Egy előnyös kombináció jellemzői az alábbiak:

a) a K-vitamin-függő proteint tartalmazó oldatot egy anioncserélővei hozzuk érintkezésbe, ezáltal a Kvitamin-függő protein az ioncserélőn adszorbeálódik, és ezután növekvő sókoncentrációval eluáljuk, majd az eluens sókoncentrációját csökkentjük;

b) az a) lépésből származó eluenshez kalciumionokat adunk, majd ismét anioncserélővei hozzuk érintkezésbe olyan körülmények között, amelyek során a nem K-vitamin-függő kísérőproteinek adszorbeálódnak;

c) a b) lépésből kapott, nem adszorbeálódott K-vitaminfuggő proteineket affinitási szubsztráton adszorbeáljuk, és szelektíven eluáljuk.

A műveleti lépések fent említett előnyös kombinációját az alábbiakban részletesen ismertetjük.

A proteinkoncentrálási lépésben (1. lépés) a rekombináns vagy természetes eredetű K-vitamin-függő proteint tartalmazó oldatot anioncserélővei hozzuk érintkezésbe. Ez egyszerű keveréssel vagy egy oszlopon átvezetéssel történhet. A K-vitamin-függő protein a kísérőproteinekkel együtt egy alacsony koncentrációjú sóoldatban (minimális sókoncentráció) található. Ilyen körülmények között a K-vitamin-fuggő protein számos egyéb proteinnel együtt megkötődik az anioncserélőn. A sókoncentráció (ionerősség) növelésével a K-vitamin-függő protein ezután szelektíven felszabadítható az anioncserélőről.

A sejttenyészet felülúszói rendszerint egy festéket tartalmaznak, amely az aktuális pH-t jelzi. Az ilyen festék - például fenolvörös - zavarossá teszi a tiszta proteinoldatot, erősen kötődik a szokásosan alkalmazott anioncserélőhöz, például a Q Sepharose Fást Flow-hoz (Pharmacia) vagy a MacroPrep^R-hez (Bio-Rad), és a proteinmeghatározás hullámhosszán, azaz 280 nm-en fényt abszorbeál. Ez zavaija a proteinek tisztítását sejttenyésztő közegekből. Ennek kiküszöbölésére a találmány értelmében a sejttenyészet felülúszóját először egy hiperdiffüziós tulajdonságú anioncserélőn (Q-Hyper D^R, Sepracor) szűrjük keresztül. Kimutattuk, hogy a fenolvörös festék nemspecifikus kötődése minimálisra csökkenthető, ha QHyper D^R-t alkalmazunk anioncserélőként. A festék az anioncserélőről már a minimális koncentráció alatti sókoncentrációknál eluálódik. Ily módon az eluált proteineket jobban lehet detektálni a kromatográfia során. Ezenkívül a zavaró kompetitív reakció a proteinek és a festék között az anioncserélőn nagymértékben elkerülhető.

A további anioncserélő kromatográfia (2. lépés) abból áll, hogy a K-vitamin-függő proteint tartalmazó oldat ionerősségét a minimális sókoncentráció alatti értékre csökkentjük dialízissel, vagy sómentes pufferrel történő hígítással, és kis mennyiségben kalciumionokat adunk hozzá. Ezután a proteinoldatot ismét érintkezésbe hozzuk az anioncserélővei, és/vagy átszűrjük azon. Ezáltal meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a K-vitamin-függő proteinek nem kötődnek az anioncserélőhöz, és a nem K-vitamin-függő kísérőproteinek a szubsztráton adszorbeálódnak. Ez a proteinek eltérő töltéséből adódik, ami a kalciumionok kötődése következtében alakul ki. A Kvitamin-függő proteint - most az előzetes lépésben a szennyező proteinektől továbbtisztítottan - közvetlenül kapjuk (további sófüggő eluálás nélkül).

A protein tisztítására sok esetben elegendő az előtisztítási lépés (1. lépés) kombinálása az anioncseré3

HU 219 828 Β lővel történő tisztítással (2. lépés). Ily módon a második tisztítási lépés annál hatékonyabb, minél kevésbé szennyezett a tisztítandó K-vitamin-fuggő protein a kísérőproteinekkel.

Az anioncserélőn végzett második tisztítási lépésben a K-vitamin-fuggő protein nem kötődik az anioncserélőhöz a sávszélesség minimális sókoncentrációja alatti bizonyos sókoncentráció megválasztása és kalciumionok hozzáadása miatt.

A Gla-régióval rendelkező K-vitamin-fuggő proteinek kalciumkötő tulajdonságainak felhasználásával ezeket úgy választjuk el a kísérőproteinektől, hogy bizonyos ionerősségeknél csak a kísérőproteinek kötődnek az anioncserélőhöz, míg a K-vitamin-fuggő proteinek az anioncserélőn anélkül jutnak át, hogy ahhoz kötődnének. Ezért a természetes forrásból származó K-vitamin-fuggő proteineken kívül a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas a Gla-régióval rendelkező K-vitamin-fuggő rekombináns proteinek - például a C-protein, IX faktor, II faktor, VII faktor, S-protein és Z-protein tisztítására.

A fenti 1. és 2. lépésben előnyös, ha ugyanazt az anioncserélőt alkalmazzuk, és különösen jó eredményeket kapunk abban az esetben, ha az anioncserélő kromatográfiát oszlopon végezzük.

A soron következő lépésben (3. lépés), azaz az affinitási kromatográfiában végbemegy a K-vitamin-fuggő protein kötődése az affinitási mátrixhoz. Ebben a lépésben a K-vitamin-fuggő protein az affinitási mátrixon adszorbeálódik. Ez esetben az anioncserélővei sorba kapcsolt előtisztítási lépés különösen előnyösnek bizonyul, mivel ezzel számos szennyező protein eltávolítható. Ez megkönnyíti a K-vitamin-fuggő protein eluálását az affinitási mátrixtól, és lehetővé teszi a kívánt protein nagy tisztasággal történő izolálását.

A találmány szerinti eljárás tartalmazhat egy vírusinaktiválási lépést is, amely szakemberek számára ismert, és amely a Κ-vitamin-függő proteint tartalmazó oldatok fizikai-kémiai vagy kémiai eljárásokkal történő kezelését foglalja magában. Erre a célra számításba jöhet az antivirális anyagok jelenlétében végzett kezelés, adott esetben besugárzással vagy hőkezeléssel kombinálva. A találmány szerinti eljárásban a vírusinaktiválás a K-vitamin-függő proteinek nem K-vitamin-fuggő kísérőproteinektől való elválasztása előtt mehet végbe.

A találmány szerinti eljárás az 1., 2. és 3. tisztítási lépések kombinációjából áll, amelyeket bármilyen sorrendben elvégezhetünk. Azonban az 1. igénypont szerinti eljárási lépés mindig kötelező. A tisztítási lépéseket és/vagy eredményeket az 1-12. ábrák szemléltetik az alábbiak szerint.

1. ábra: rekombináns S-protein tisztítása sejttenyészet-felülúszóból kromatográfiával, Q-Hyperen (előzetes lépés=1. lépés);

2. ábra: rekombináns S-protein tisztítása kromatográfiával, Q-Hyper D-n, kalciumionok hozzáadásával (2. lépés);

3. ábra: tisztított rekombináns S-protein SDS-PAGE gélelektroforézise (A: sejttenyészet-felülúszó; B: tisztított rPS);

4. ábra: rFalX tisztítása kromatográfiával, Q-Hyper D-n (1. lépés);

5. ábra: rFalX tisztítása kromatográfiával, Q-Hyper D-n, kalciumionok hozzáadásával (2. lépés);

6. ábra: rFalX SDS-PAGE gélelektroforézise (A:

sejttenyészet-felülúszó; B: tisztított rFalX);

7. ábra: rFalX tisztítása kromatográfiával, Heparin-Sepharose-on (3. lépés);

8. ábra. rFalX tisztítása kapcsolt kromatográfiával,

Q-Hyper D-n és Heparin-Sepharose-on (2. és 3. lépés);

9. ábra: a 8. ábra szerint kapott rFalX SDS-PAGE gélelektroforézise;

10. ábra: rFall tisztítása sejttenyészet-felülúszóból kromatográfiával, Fraktogel^R EMD TMAE 650-en (1. lépés);

11. ábra: rFall tisztítása kromatográfiával, Fraktogel^R EMD TMAE 650-en (2. lépés);

12. ábra. rFall analízise SDS-PAGE gélelektroforézissel (A: sejttenyészet-felülúszó; B: tisztított Fali).

Az S-protein, a IX faktor és a II faktor találmány szerinti tisztítását az alábbi példákkal szemléltetjük.

1. példa

a) rPS tisztítása anioncserélő kromatográfiával

Az alábbi példában egy hiperdiffuziós tulajdonságokkal rendelkező, kvatemer amin típusú anioncserélőt (Q-Hyper D, Sepracor) alkalmazunk.

Anyagok:

oszlop: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm χ 4 cm;

A puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0;

B puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 0,18 mol/1

NaCl;

C puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 0,4 mol/1 NaCl;

D puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 1 mol/1 NaCl.

A rekombináns proteint (rPS) szokásos laboratóriumi módszerekkel izoláltuk Vero-sejtek (majomvesesejtek) vacciniavírussal történő fertőzése után, sejttenyésztő módszerek alkalmazásával. A Vero/vaccinia expressziós rendszereket és sejttenyésztési körülményeket részletesen ismertették F. G. Falkner és munkatársai [Thrombosis and Haemostasis, 68, 119-124 (1992)],

N. Barrett és munkatársai [AIDS Rés., 5, 1598-171 (1989)] és F. Domer és munkatársai [AIDS Research and Clinical Trials, Marcel Dekker, Inc., New York (1990)]. Az rPS expressziója kereskedelmi forgalomból beszerezhető, szintetikus DMEM-közegben megy végbe. A sejttenyésztés befejezése után a tenyészet felülúszóját centrifugálással izoláltuk, és szintetikus proteázinhibitorral (Pefabloc^R SC, Pentapharm) kezeltük

O, 1 mmol/1 koncentrációban.

Az oszlopot a gyártó előírásai szerint regeneráltuk és ekvilibráltuk A pufferrel. Ezután a rekombináns Sproteint tartalmazó sejttenyészet-felülúszóból 485 ml-t vittünk fel az oszlopra 10 ml/perc sebességgel. Az oszlophoz nem kötődő anyagot ugyanezzel az átfolyási se4

HU 219 828 Β bességgel A pufferrel átmosva távolítottuk el. Ezután az oszlopot először B pufferrel, majd C pufferrel eluáltuk. Ezt követően D pufferrel eluáltuk az oszlopot. A protein adszorpcióját a kromatográfia során szokásos módon 280 nm-nél követtük. A kromatográfia befejeztével a proteinkoncentrációt Bradford-módszerrel határoztuk meg [M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 - 254 (1976)]. Az S-protein-tartalmat kereskedelmi forgalomban kapható ELISA-rendszerrel (Asserachrome Protein S, Boehringer Mannheim), valamint véralvadási vizsgálat segítségével (Protein S clotting test, Boehringer Mannheim) határoztuk meg.

Azt találtuk, hogy majdnem az összes rPS kötődött a mátrixhoz. Az rPS-t az anioncserélőről 0,4 mol/1 nátrium-kloriddal (C puffer) eluáltuk.

A fent említett anioncserélő alkalmazásával a brómfenolvörös festék - amely a sejttenyésztő közegben a szokásos módon jelen volt - már 0,18 mol/1 sókoncentrációnál eluálódott az oszlopról, amely lényegesen megkönnyítette az rPS ezt követő izolálását 0,4 mol/1 nátrium-klorid-koncentrációnál. Ez egy előnyt jelent, egyéb anioncserélők alkalmazásával összehasonlítva.

Az rPS ioncserélőn való tisztításának (1. lépés) lényeges eredményeit az 1. ábrán és az 1. táblázatban is10 mertetjük. Az 1. példában leírtak szerint végzett tisztítással az rPS-antigénnek a sejttenyésztő közegben lévő összes proteinre vonatkoztatott 3% mennyisége 8%-ra növekedett a 0,4 mol/1 nátrium-klorid-frakcióban lévő proteinekre vonatkoztatva. A specifikus aktivitás 25-szö15 rösére növekedett.

1. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	S-protein antigénaktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
Sejtfelülúszó	485	0,108	137	11	0,1
Nem kötött frakció	560	0,05	4	0	0
0,18 mol/1 NaCl	60	0,014	4	0	0
0,4 mol/1 NaCl	14	0,537	1700	1358	2,5
1 mol/1 NaCl	20	0,54	4	0	0

b) rPS tisztítása a kisérőproteinek adszorpciójával anioncserélő kromatográfia segítségével, kalciumionok hozzáadásával (2. lépés)

Ugyanazt az anioncserélő típust alkalmaztuk, mint az 1. példa a) lépésében.

Anyagok:

oszlop: Q-Hyper D, Sepracor; 1 cmx4 cm;

készülék: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0;

B puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 0,15 mol/1

NaCl, 10 mmol/1 CaCl₂;

C puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,0, 1 mol/1 NaCl.

Az oszlopot a gyártó előírása szerint regeneráltuk és ekvilibráltuk B pufferrel. A rekombináns S-proteint - amelyet a sejttenyészet felülúszójából az 1. példa a) lépésében leírtak szerint izoláltunk - az A pufferrel 2,5-szeresre hígítottuk, ezáltal a nátrium-klorid koncentrációja 0,18 mol/1 alá csökkent. Kalcium-kloridot adtunk hozzá 10 mmol/1 koncentrációban. Ezután a proteinelegyet az oszlopra vittük, és a meg nem kötött proteint az oszlopról a B pufferrel kimostuk. A kötött proteint a C pufferrel eluáltuk. A kromatográfia előrehaladtát az 1. példa a) lépésében leírtak szerint követtük, és meghatároztuk a megfelelő proteinkoncentrációt.

Az eredmények azt mutatják, hogy az rPS átfolyt az oszlopon, míg a többi protein főtömege az oszlopon kötve maradt. Ezeket a szennyező proteineket azután 1 mol/1 NaCl-dal eluáltuk. A fenti kísérlet lényeges eredményeit a 2. ábra és a 3. ábra, valamint a 2. táblázat mutatja.

Az 1. példa b) lépésében leírt tisztítás során az rPS antigéntartalma 12-szeresre növekedett a többi proteinhez viszonyítva. A specifikus aktivitás 14-szeresre növekedett. A denaturáló elektroforetikus analízis [U.

K. Laemmli, Natúré 227, 680-685 (1970)] azt mutatta (3. ábra), hogy az 1. példa b) lépésében leírt tisztítással az rPS-t 95%-nál nagyobb tisztasággal izoláltuk.

2. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	S-protein antigénaktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
1. példa a) lépésében kapott preparátum	34	0,215	680	543	2,5
Nem kötődő frakció	34	0,014	600	520	37
1,0 mol/1 NaCl	10	0,332	83	0	0

HU 219 828 Β

2. példa

a) rFalX tisztítása anioncserélő kromatográfiával

Ebben a példában hiperdiffuziós tulajdonságokkal rendelkező, kvatemer amin típusú anioncserélőt (Q-Hyper D, Sepracor) alkalmaztunk.

Anyagok:

oszlop: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm χ 4 cm; készülék: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 5,5;

B puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 0,18 mol/1

NaCl;

C puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 0,3 mol/1 NaCl;

D puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 5,5, 1,0 mol/1 NaCl.

A rekombináns IX faktort (rFIX) az 1. példa a) lépésében az rPS-re ismertetett eljárással analóg módon kaptuk.

Az oszlopot a gyártó előírásainak megfelelően regeneráltuk és ekvilibráltuk A pufferrel. Ezután az oszlopra felvittük a rekombináns IX faktort tartalmazó sejttenyészet felülúszójából 1997 ml-t, 10 ml/perc sebességgel. Az oszlophoz nem kötődött anyagot ugyanezzel az átfolyási sebességgel az A pufferrel mosva távolítottuk el. Ezután az oszlopot először a B pufferrel, majd a C pufferrel eluáltuk. Ezt követően végeztük az eluálást a D pufferrel.

A kromatográfia során a protein adszorpcióját a szokásos módon követtük 280 nm-en. A kromatográfia befejeztével a proteinkoncentrációt Bradford-módszerrel határoztuk meg [M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)]. A IX-faktor-tartalmat a kereskedelmi forgalomban kapható véralvadási teszttel (Faktor IX clotting, Immuno) határoztuk meg.

Az eredmények azt mutatják, hogy majdnem az összes rFalX kötődött az anioncserélőhöz. Az rFalX-et az anioncserélőről 0,3 mol/1 NaCl-dal eluáltuk. Analóg eredményeket kaptunk egyéb kvatemer anioncserélők alkalmazásával is. Másrészről Q-Hyper D-t alkalmazva a brómfenolvörös festék - amelyet a sejttenyésztő közeg szokásos módon tartalmazott - már 0,3 mol/1 sókoncentrációnál eluálódott az oszlopról, amely lényegesen megkönnyítette az rFalX ezt követő izolálását 0,3 mol/1 NaCl-koncentrációnál. Egyéb anioncserélők nem rendelkeznek ezzel az előnyös tulajdonsággal. Az rFalX anioncserélőn végzett tisztításának alapvető eredményeit a 4. ábra és 3. táblázat tartalmazza. A 2. példa a) lépésében ismertetett tisztítással az rFalX 20-szorosára dúsult; a specifikus aktivitás 12-szeresére növekedett.

3. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	IX faktor aktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
Sejttenyészet-felülúszó	1997	0,178	100	0,56
Nem kötött frakció	2100	0,091	0	0
0,18 mol/1 NaCl	94	0,382	162	0,41
0,3 mol/1 NaCl	94	0,300	2099	6,86
1 mol/1 NaCl	93	0,09	32	0,35

b) rFalX tisztítása a kíséröproteinek adszorpciójával, anioncserélő kromatográfia segítségével, kalciumionok hozzáadásával

Anioncserélőként Q-Hyper D-t alkalmaztunk, amelyet a 2. példa a) lépésében is alkalmaztunk.

Anyagok:

oszlop: Q-Hyper D, Sepracor; 2 cm χ 4 cm; készülék: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,4;

B puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,4, 0,15 mol/1

NaCl, 10 mmol/1 CaCl₂;

C puffer: 20 mmol/1 Bis-Tris/HCl, pH 7,4, 1,0 mol/1 NaCl.

Az oszlopot a gyártó előírásainak megfelelően regeneráltuk és ekvilibráltuk A pufferrel. 85 ml 2. példa a) lépése szerint előállított rekombináns IX faktort A pufferrel kétszeresére hígítottunk, ily módon a nátriumklorid koncentrációja 0,15 mol/l-re csökkent. Kalciumkloridot adtunk hozzá 10 mmol/1 koncentrációban. Ezután a proteinelegyet felvittük az oszlopra, és a meg nem kötött proteint B pufferrel eluáltuk. Az oszlophoz kötődött proteint C pufferrel eluáltuk. A kromatográfia lefolyását a 2. példa a) lépésében leírtak szerint követtük. A proteinkoncentrációkat és enzimaktivitásokat meghatároztuk.

Az eredmények azt mutatják, hogy az rFalX az oszlopon változatlanul átfolyt, míg a szennyező proteinek főtömege az oszlopon kötve maradt. Ezek a szennyező proteinek azután 1 mol/1 nátrium-kloriddal eluálódtak.

Az alapvető eredményeket az 5. ábra, 6. ábra és 4. táblázat mutatja. A 2. példa b) lépésében ismertetett tisztítás során az rFalX specifikus aktivitása négyszeresére növekedett. A Laemmli szerint végzett denaturáló elektroforetikus analízis azt mutatta (6. ábra), hogy a 2. példa b) lépésében ismertetett tisztítással az rFalX-et 80%-osnál nagyobb tisztasággal izoláltuk.

HU 219 828 Β

4. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	IX faktor aktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
2. példa a) lépésében kapott preparátum	170	0,153	1040	6,7
Nem kötődő frakció	200	0,04	1076	27,5
1 mol/1 NaCl	20	0,45	0	0

c) rFalX tisztítása affinitást kromatográfiával Az alábbiakban a 2. példa a) lépésében kapott rFalX-et affinitási kromatográfiával tisztítottuk. Affinitási mátrixként Heparin-Sepharose-t alkalmaztunk.

Anyagok:

oszlop: HiTrapR Heparin, Pharmacia; 5 ml; készülék: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4;

B puffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4,0,15 mol/1 NaCl;

C puffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4,0,3 mol/1 NaCl;

D puffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4,1 mol/1 NaCl.

Az oszlopot a gyártó előírásainak megfelelően regeneráltuk és ekvilibráltuk A pufferrel. Ezután az oszlopra felvittünk 78 ml 2. példa a) lépése szerint előállított rFalX-et, és a meg nem kötött proteint az oszlopról az A pufferrel mostuk le. Ezután az oszlopot a B pufferrel, majd a C pufferrel eluáltuk. Ezt követően a D pufferrel végeztük az elúciót. A kromatográfia lefolyását a 2. példa a) lépésében leírtak szerint követtük; a proteinkoncentrációkat és enzimaktivitásokat meghatároztuk.

Az eredmények azt mutatják, hogy az rFalX teljesen megkötődött az oszlopon, és csak 0,3 mol/1 nátrium-kloriddal eluálódott. Ezzel az eljárással azonban az rFalX-cel együtt további proteinek is eluálódtak, és így nem lehetett ezeket az rFalX-től elválasztani. Az rFalX specifikus aktivitása csak 4,5-szeresre növekedett a 2. példa c) lépése szerinti eljárásban.

Az alapvető eredményeket a 7. ábrán és az 5. táblázatban közöljük.

5. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	IX faktor aktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
2. példa a) lépésében kapott preparátum	78	0,121	788	6,5
Nem kötődő frakció	90	0,038	0	0
0,15 mol/1 NaCl	10	0,10	0	0
0,3 mol/1 NaCl	22	0,053	1572	29,6

3. példa rFalX tisztítása az anioncserélő kromatográfia és az affinitási kromatográfia közvetlen összekapcsolásával

Ebben a példában a 2. példa a) lépése szerint előállított rFalX-et tisztítottuk oly módon, hogy először egy anioncserélőre vittük fel, majd egy affinitási oszlopra. Anioncserélőként Q-Hyper D-t alkalmaztunk; ez egy hiperdiffúziós tulajdonságokkal rendelkező, amino típusú anioncserélő. Affinitási mátrixként Heparin-Sepharose-t (HiTrap^R Heparin, Pharmacia) alkalmaztunk. A Q-Hyper D oszlopot közvetlenül a Heparin-Sepharose-oszlop elé kapcsoltuk. A két oszlop közé csak egy minimálisra csökkentett méretű hajlékony cső összeköttetés volt, adott esetben egy szeleppel.

Anyagok:

1. oszlop: Q-Hyper D^R, Sepracor; 2 cmx4 cm;

2. oszlop: HiTrap^R Heparin, Pharmacia; 5 ml; berendezés: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 20 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4;

B puffer: 20 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4, 150 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 CaCl₂;

C puffer: 20 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4,1,0 mol/1 NaCl; D puffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4, 0,15 mol/1 NaCl;

Epuffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4,0,3 mol/1 NaCl;

F puffer: 50 mmol/1 Tris, 20 mmol/1 nátrium-citrát, pH 7,4,1 mol/1 NaCl.

Az anioncserélőt tartalmazó oszlop kivezetését egy hajlékony csőcsatlakozáson keresztül közvetlenül összekapcsoltuk az affinitási kromatográfiás oszlop bevezetésével, ezáltal a folyadékáram először az 1. oszlopon, majd közvetlenül a 2. oszlopon folyt keresztül.

Az oszlopokat a gyártó előírásai szerint regeneráltuk és ekvilibráltuk B pufferrel. 70 ml rFalX-et - amelyet a 2. példa a) lépésében leírtak szerint izoláltunk sejttenyészet-felülúszóból - az A pufferrel kétszeresére hígítottuk, így a nátrium-klorid koncentrációja 0,15 mol/l-re csökkent. Ezután kalcium-kloridot adtunk

HU 219 828 Β hozzá 10 mmol/1 koncentrációig. Ezután a proteinelegyet az 1. oszlopra vittük fel (Q-Hyper D^R) 2,5 ml/perc sebességgel, és közvetlenül átvittük a 2. oszlopra (Heparin-Sepharose), és a meg nem kötött proteint az oszlopokról B pufferrel mostuk ki. Ezután az 1. oszlopot el- 5 választottuk a 2. oszloptól, és a folyadékáramot közvetlenül vittük fel a 2. oszlopra. A 2. példa c) lépésében leírtakkal analóg módon a heparinoszlopról a meg nem kötött proteint D pufferrel végzett mosással távolítottuk el. A heparinoszlopot E pufferrel eluáltuk. Ezután az 10 elúciót F pufferrel végeztük. Analóg eredményeket kaptunk, mint amikor a minta felvitele után a Q-Hyper D^Roszlopot nem választottuk el a heparinoszloptól, hanem a heparinoszlop eluálása céljából a folyadékáramot közvetlenül a heparinoszlopon vezettük keresztül egy köz- 15 beiktatott szelepen keresztül.

Az 1. oszlophoz (Q-Hyper D^R) kötődött proteineket C pufferrel eluáltuk.

A kromatográfia előrehaladtát a 2. példa a) lépésében leírtak szerint követtük; meghatároztuk a protein- 20 koncentrációkat és az enzimaktivitásokat.

Az eredmények azt mutatják, hogyha a mintát a beiktatott Q-Hyper D^R oszlopra vittük fel, az rFalX ezen akadálytalanul áthaladt, és teljesen az utána elhelyezett heparinoszlopon adszorbeálódott. Az rFalX-et az utóbbiról 0,3 mol/1 nátrium-kloriddal eluáltuk.

Az alapvető eredményeket a 8. ábra, 9. ábra és a 6. táblázat mutatja.

A 3. példában ismertetett tisztítással az rFalX 8,4-szeresére dúsult; a specifikus aktivitás 8,8-szeresére növekedett. Denaturáló elektroforetikus analízissel (Laemmli szerint) kimutattuk (9. ábra), hogy az rFalX-et a 3. példa szerinti tisztítással 95%-nál nagyobb tisztasággal izoláltuk.

A 3. példában az rFalX tisztítását a 2. példa a), b) és

c) részében ismertetett eljárások közvetlen kombinálásával hajtottuk végre, amelyekben ugyanazt a kiindulási anyagot alkalmaztuk. A 2. példa c) lépésében ismertetett tisztítással összehasonlítva azonban nagyobb dúsulást és nagyobb specifikus aktivitást kaptunk az anioncserélő kromatográfia és affinitási kromatográfia kombinálásával. A kétféle kromatográfiás eljárás kombinálásával nyilvánvalóan korábban elválasztódtak az olyan szennyező proteinek, amelyek kedvezőtlenül befolyásolták az affinitási szubsztráton az elválasztási eljárást, ami az affinitási szubsztrát nagyobb specificitását és szelektivitását eredményezte.

6. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	IX faktor aktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
2. példa a) lépésében kapott preparátum	140	0,0196	123	6,3
Nem kötődő frakció	160	0,01	0	0
0,15 mol/1 NaCl	32	0,01	0	0
0,3 mol/1 NaCl	10	0,019	1041	54,8
1 mol/1 NaCl	30	0,015	0	0

4. példa rFalí tisztítása anioncserélő kromatográfiával Az alábbi példában karos szerkezetű kvatemer amin típusú anioncserélőt (Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck) alkalmaztunk.

Anyagok:

oszlop: Fraktogel EMD TMAE 650 M, Merck,

1,6 cmx5 cm;

berendezés: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4;

B puffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4, 200 mmol/1 NaCl;

Cpuffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4, 300 mmol/1 NaCl;

D puffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4, 1 mol/1 NaCl.

A rekombináns II faktort a sejttenyésztő eljárások szokásos laboratóriumi módszerei szerint izoláltuk [Falkner és munkatársai, Thrombosis and Haemostasis,

68, 119-124(1991)].

Az rFalí expresszióját kereskedelmi forgalomban kapható szintetikus DMEM tápközegben végeztük. 60

A sejtmentes tenyészet-felülúszót centrifugálással kaptuk.

Az oszlopot a gyártó előírásai szerint regeneráltuk és ekvilibráltuk A pufferrel. Ezután 200 ml sejttenyészet-felülúszót - amely a rekombináns II faktort tartal45 mázzá - az oszlopra vittünk 4 ml/perc sebességgel. Az oszlophoz nem kötődő anyagot A pufferrel végzett mosással távolítottuk el ugyanezzel az átfolyási sebességgel. Ezután az oszlopot először B pufferrel, majd C pufferrel mostuk. Ezután az eluálást D pufferrel végeztük. 50 A proteinadszorpciót a szokásos módon 280 nm-en követtük a kromatográfia során. A kromatográfia befejeztével a proteinkoncentrációt Bradford módszere segítségével határoztuk meg. A II-faktor-tartalmat véralvadási teszt (Thrombinzeit, Immuno AG) segítségével határoztuk meg.

Azt találtuk, hogy majdnem az összes rFalí megkötődött az anioncserélő gélen. Az rFall-t az anioncserélőről 0,3 mol/1 NaCl-dal eluáltuk. Ezenkívül - szemben az egyéb, amino típusú anioncserélőkkel, például a MacroPrep^R (BioRad) vagy Q-Sepharose Fást Flow (Phar8

HU 219 828 Β macia) anioncserélővei - a brómfenolvörös festék amelyet a tenyészközeg felülúszója szokott módon tartalmazott - már 0,2 mol/l NaCl-koncentrációnál eluálódott az oszlopról, ami lényegesen megkönnyítette az rFall ezt követő izolálását 0,3 mol/l nátrium-kloriddal. 5

Az rFall anioncserélőn való tisztításának alapvető eredményeit a 10. ábra és a 7. táblázat tartalmazza. A 4. példa szerinti tisztítással az rFall specifikus aktivitása 3,5-szeresére növekedett.

7. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	II faktor aktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
Sejttenyésztő közeg	200	0,45	50	0,1
Nem kötődő frakció	200	0,177	2	0,01
0,2 mol/l NaCl	40	0,4	6	0,015
0,3 mol/I NaCl	45	0,36	150	0,42
0,4 mol/l NaCl	32	0,25	0	0

b) rFall tisztítása a kísérőproteinek adszorpciójával anioncserélő kromatográfia segítségével, kalciumionok hozzáadásával

Anioncserélő gyantaként Fraktogel EMD TMAE 650 M-et (Merck) alkalmaztunk.

Anyagok:

oszlop: Fraktogel EMD TMAE 650 M,

1,6 cmx5 cm;

berendezés: Pharmacia FPLC LCC-500;

A puffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4;

B puffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4, 150 mmol/1

NaCl, 10 mmol/1 CaCl₂;

C puffer: 50 mmol/1 Tris/HCl, pH 7,4, 1,0 mmol/1 NaCl.

Az oszlopot a gyártó előírásainak megfelelően regeneráltuk és ekvilibráltuk B pufferrel. A rekombináns II faktort - amelyet a 4. példa a) lépésében leírtak szerint izoláltunk a sejttenyészet felülúszójából - A pufferrel kétszeresére hígítottuk, így a nátrium-klorid koncentrációja 0,2 mol/l-nél kisebb értékre csökkent. Ezután

CaCl₂-ot adtunk hozzá 10 mmol/1 koncentrációban. Ezt követően a proteinelegyet az oszlopra vittük, és a nem kötődő proteint az oszlopról B pufferrel kimostuk. A megkötött proteint C pufferrel eluáltuk.

A kromatográfia lefolyását az előző példákban leírtakhoz hasonlóan követtük, és meghatároztuk a proteinkoncentrációkat. Az eredmények azt mutatják, hogy az rFall akadálytalanul áthaladt az oszlopon, míg a szenynyező proteinek döntő többsége az oszlopon megkötve maradt. Ezeket a proteineket eluáltuk 1 mol/l nátriumkloriddal.

Az alapvető eredményeket all. ábrán, 12. ábrán és 8. táblázatban foglaljuk össze. A 4. példa a) lépése és b) lépése szerinti tisztítás során az rFall specifikus aktivitása 11-szeresére növekedett.

A denaturáló elektroforetikus analízis (Laemmli szerint) azt mutatja, hogy a 4. példa a) és b) lépésében ismertetett tisztítással az rFall-t 95%-nál nagyobb tisztasággal izoláltuk (9. ábra).

8. táblázat

Minta	Térfogat	Protein	II faktor aktivitás	Specifikus aktivitás
(ml)	(mg/ml)	(mE/ml)	(E/mg)
4. példa a) lépésében kapott preparátum	80	0,18	75	0,41
Nem kötődő frakció	80	0,015	75	4,6
1,0 mol/l NaCl	15	0,62	0	0

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás K-vitamin-fuggő protein elválasztására nem K-vitamin-fuggő kísérőproteinektől egy proteintartalmú oldatból, azzal jellemezve, hogy az oldathoz kalciumionokat adunk, és a kalciumtartalmú oldatot anioncserélővei hozzuk érintkezésbe olyan körülmények között, amelyek között a kísérőproteinek adszorbeálódnak, míg a K-vitamin-fuggő protein nem.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a K-vitamin-függő proteint tartalmazó oldatot egy további anioncserélővei hozzuk érintkezésbe olyan körülmények között, amelyek között a K-vitamin-fuggő protein az ioncserélőn adszorbeálódik, majd mossuk, eluáljuk és adott esetben az eluens ionerősségét csökkentjük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem adszorbeálódott K-vitamin-függő proteint egy affínitási szubsztráton adszorbeáljuk, és szelektíven eluáljuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azt a 2. és 3. igénypont szerinti eljárási lépésekkel

HU 219 828 Β hajtjuk végre azok bármely kombinációjában vagy sorrendjében.
5. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztási lépést azonos anioncserélővei hajtjuk végre, előnyösen kromatográfia segítségével.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anioncserélőként hiperdiffuziós tulajdonságokkal rendelkező anioncserélőt alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy anioncserélőként Q-Hyper D^R szubsztrátot alkalmazunk.
8. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anioncserélőként karos szerkezettel rendelkező anioncserélőt alkalmazunk.
9. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy affinitási szubsztrátként heparinkötő szubsztrátanyagokat, Heparin-Sepharose-t vagy heparinagarózt alkalmazunk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proteinoldat ionerősségét az eluálás után 0,15-0,2 mol/l-re csökkentjük.
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kalcium-kloridot adunk hozzá 1,0 mmol/1 minimális koncentrációig.
12. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proteinoldat pH-értéke 4 és 9 közötti.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a K-vitamin-függő protein az II, VII, IX, X faktor, S-protein, C-protein vagy Z-protein.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proteineket géntechnológiai eljárásokkal állítjuk elő, és a transzformált vagy transzfektált sejtek tenyészetének felülúszójából izoláljuk.
15. Eljárás egy K.-vitamin-fiiggő protein izolálására az 1-14. igénypontok szerint.
16. Eljárás nem K-vitamin-függő kísérőproteinek izolálására az 1-14. igénypontok szerint.