NO139523B

NO139523B - PROCEDURE FOR PREPARING DOUBLE SALTS OF S-ADENOSIL-L-METHIONIN

Info

Publication number: NO139523B
Application number: NO74742320A
Authority: NO
Inventors: Alberto Fiecchi
Original assignee: Bioresearch
Priority date: 1973-06-27
Filing date: 1974-06-26
Publication date: 1978-12-18
Also published as: NO139523C; NO742320L; SU576922A3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av uhyre stabile doble salter av S-adenosil-L-methionin (SAM) ved hvilken disse kan fremstilles enkelt og økonomisk i industriell skala. The present invention relates to a method for the production of extremely stable double salts of S-adenosyl-L-methionine (SAM) by which these can be produced simply and economically on an industrial scale.

SAM er særlig et produkt av naturlig opprinnelse, som finnes i.alle levende organismer fra bakterier til planter, fra encellede organismer til høyerestående pattedyr innbefattet mennesket, hvis struktur har vært kjent i en tid og som illustreres av følgende formel: SAM is particularly a product of natural origin, which is found in all living organisms from bacteria to plants, from single-celled organisms to higher mammals including humans, whose structure has been known for some time and which is illustrated by the following formula:

hvor X er et ikke spesifikt anion. where X is a non-specific anion.

I levende organismer dannes SAM ved innvirkning av enzymer (S-adenosilmethioninsynthetasis eller S-adenosiltransferasis) i det cytoplasmatiske område ut fra methionin som opptas, med nærings-midlene eller fra ATP som foreligger som energireserve i hver levende celle. In living organisms, SAM is formed by the action of enzymes (S-adenosylmethionine synthetase or S-adenosyltransferase) in the cytoplasmic area from methionine that is absorbed, with the nutrients or from ATP that is available as an energy reserve in every living cell.

Det har også vært kjent i en viss tid at SAM er et produkt av fundamental betydning i et stort antall biologiske reaksjoner med enzymatisk transmethylering, hvorfor det alltid har vært betrak-tet som et meget viktig reagens innen biokjemien. It has also been known for some time that SAM is a product of fundamental importance in a large number of biological reactions with enzymatic transmethylation, which is why it has always been considered a very important reagent in biochemistry.

Det store problem med denne forbindelse har alltid vært dens store ustabilitet ved omgivende eller høyere temperaturer, og fremgangsmåte ved fremstilling av denne er arbeidskrevende og kan ikke lett utføres i industriell skala. The major problem with this compound has always been its great instability at ambient or higher temperatures, and the process for producing it is labor-intensive and cannot easily be carried out on an industrial scale.

I de siste år har det vært forsket mye med henblikk på å stabilisere SAM i en slik grad at det er mulig å anvende denne innen biologisk forskning, og mot fremstilling av salter som er stabile under normal temperatur og fuktighet. In recent years, much research has been done with a view to stabilizing SAM to such an extent that it is possible to use it in biological research, and towards the production of salts that are stable under normal temperature and humidity.

På denne måte har kloridet og sulfatet av SAM vært fremstilt, men disse kan bare anvendes som reagenser innen biokjemien i løpet av kort tid, på grunn av at deres stabilitet selv i tørr tilstand er begrenset ved lave temperaturer. Ennvidere er fremgangsmåten ved fremstilling av disse bare anvendbar ved fremstilling av små mengder,.men ikke for fremstilling i industriell skala. In this way, the chloride and sulfate of SAM have been prepared, but these can only be used as reagents in biochemistry within a short time, due to the fact that their stability even in the dry state is limited at low temperatures. Furthermore, the method for producing these is only applicable for the production of small quantities, but not for production on an industrial scale.

Det er nå ganske uventet funnet nye salter av SAM som er uendelig stabile med tiden ved temperaturer opp til 45° C, og som kan fremstilles ved en ny fremgangsmåte som lett og økonomisk kan utføres i industriell målestokk med høye utbytter. Disse salter har vist seg. ganske overraskende å utvise.en sterk legende styrke i mange områder innen medisinen, ofte tilsynelatende uten forbin- else mellom disse. De nye salter ifølge foreliggende oppfinnelse er doble salter av SAM med p-toluensulfonsyre og svovelsyre, tilsvarende formelen SAM<+>.HS04~.H2S04.2CH3CgH4S03H, og SAM<+>.HS04~. H2S04.CH3C6H4S03H. Quite unexpectedly, new salts of SAM have now been found which are infinitely stable over time at temperatures up to 45° C, and which can be produced by a new method which can be easily and economically carried out on an industrial scale with high yields. These salts have been shown. rather surprising to show. a strong healing power in many areas within medicine, often apparently without connection between these. The new salts according to the present invention are double salts of SAM with p-toluenesulfonic acid and sulfuric acid, corresponding to the formula SAM<+>.HS04~.H2S04.2CH3CgH4S03H, and SAM<+>.HS04~. H2SO4.CH3C6H4SO3H.

Det betydelige tekniske fremskritt som oppnås ved disse nye salter illustreres i den etterfølgende tabell som sammenligner stabiliteten med tiden ved 45 Ci tørr tilstand av de to mest stabile salter av SAM kjent opp til nå, dvs. kloridet og sulfatet, med det nye di-sulfat-di-p-toluensulfonat. Tallene angir prosenten av SAM-residuet etter de angitte tider: The significant technical progress achieved by these new salts is illustrated in the following table which compares the stability with time at 45 Ci in the dry state of the two most stable salts of SAM known up to now, i.e. the chloride and the sulphate, with the new di-sulphate -di-p-toluenesulfonate. The numbers indicate the percentage of the SAM residue after the indicated times:

De erholdte stabilitetsverdier med di-sulfat-mono-p-toluensulfonat er ekvivalent med de som ble oppnådd for di-sulfat-di-p-toluensulfonatet. The stability values obtained with di-sulfate-mono-p-toluenesulfonate are equivalent to those obtained for the di-sulfate-di-p-toluenesulfonate.

Oppfinnelsen angår følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av doble salter av S-adenosil-L-methionin (SAM) med strukturformel The invention therefore relates to a method for the production of double salts of S-adenosyl-L-methionine (SAM) with the structural formula

hvor. n = X-eller; 2 og fremgangsmåten er særpreget ved at where. n = X-or; 2 and the method is characterized by the fact that

a) der fremstilles en konsentrert oppløsning av SAM, a) a concentrated solution of SAM is prepared,

b) tilstedeværende SAM i oppløsningen utfelles ved surgjøring med en oppløsning av picrolinsyre i vann eller i et organisk b) SAM present in the solution is precipitated by acidification with a solution of picrolic acid in water or in an organic

oppløsningsmiddel som er oppløselig i vann, solvent that is soluble in water,

c) SAM-picrolonat oppløses i en blanding bestående av like volum-deler av et organisk oppløsningsmiddel som erJ delvis blandbart c) SAM picrolonate is dissolved in a mixture consisting of equal parts by volume of an organic solvent which is partly miscible

med vann, og av en vandig oppløsning bestående av svovelsyre og p-toluensulfonsyre med like normaliteter på mellom 0,05 og with water, and of an aqueous solution consisting of sulfuric acid and p-toluenesulfonic acid with equal normalities between 0.05 and

0,2, 0.2,

d) SAM-saltet utfelles fra det vandige lag ved tilsetning av 4 8 volum, i forhold til den vandige oppløsning, av et organisk, oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av aceton, methylalkohol, ethylalkohol, propylalkohol, e) det utfelte salt oppløses i en 10-20%-ig oppløsning av p-toluensulfonsyre i methanol, d) The SAM salt is precipitated from the aqueous layer by adding 4 8 volumes, relative to the aqueous solution, of an organic solvent selected from the group consisting of acetone, methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, e) the precipitated salt is dissolved in a 10-20% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol,

f) det doble salt av formelen SAM+.HSO ~.HoS0..2CH~C,H.SO..H f) the double salt of the formula SAM+.HSO ~.HoS0..2CH~C,H.SO..H

4 2 4 3643 utfelles med et organisk oppløsningsmiddel når den minimale nødvendige mengde methanol anvendes i trinn e), mens det doble salt av formelen SAM+.HS0/,~.HoS0/1 .CH-,C,H. SO-.H utfelles 4 2 4 3643 is precipitated with an organic solvent when the minimum required amount of methanol is used in step e), while the double salt of the formula SAM+.HS0/,~.HoS0/1 .CH-,C,H. SO-.H is precipitated

4 z 4 3 6 4 3 4 z 4 3 6 4 3

når et stort overskudd av methanol anvendes i trinn e) when a large excess of methanol is used in step e)

Trinn (a) i fremgangsmåten kan utføres på forskjellige måter som er like effektive for det formål å oppnå en konsentrert løsning av SAM. Step (a) of the method can be carried out in different ways which are equally effective for the purpose of obtaining a concentrated solution of SAM.

Ifølge en alternativ utførelsesform behandles gjær According to an alternative embodiment, yeast is treated

(Saccharomyces Cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis etc.) (Saccharomyces Cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis etc.)

anriket med SAM ved tilsetning av methionin under egnede betingelser (Schlenk,Enzymologia 29, 283 (1965)), med ethylacetat og deretter med svovelsyre med en normalitet mellom 0,1 og 0,5, fortrinnsvis 0,35 N, ved omgivende temperatur for således å bevirke lyse av cellene og overføring av praktisk talt 100 % av tilstedeværende SAM over i løsningen. enriched with SAM by addition of methionine under suitable conditions (Schlenk, Enzymologia 29, 283 (1965)), with ethyl acetate and then with sulfuric acid with a normality between 0.1 and 0.5, preferably 0.35 N, at ambient temperature for thus causing lysis of the cells and transfer of practically 100% of the SAM present into the solution.

Fortrinnsvis anvendes mengder av vann og acetat mellom 1/20 og 1/5 av vekten av de fuktige celler, og behandlingen utføres i løpet av .15 - 45 minutter-, fortrinnsvis i løpet av 30 minutter. Quantities of water and acetate between 1/20 and 1/5 of the weight of the moist cells are preferably used, and the treatment is carried out within 15 - 45 minutes, preferably within 30 minutes.

Svovelsyre tilsettes deretter og lysen utføres i løpet av 1-2 timer, fortrinnsvis i løpet av 1,5 timer. Det skal bemerkes at lysen av gjærceller utført med en blanding av organisk løsnings-middel og fortynnet svovelsyre er mer hensiktsmessig enn den som normalt utføres med perklorsyre ved omgivende temperatur, eller med maursyre eller eddiksyre ved 60° C og lignende, idet den ikke bare finner sted ved omgivende temperatur som er meget fordelaktig med hensyn til stabiliteten av SAM, men fordi den utføres under slike betingelser at løsningen kan lett filtreres fra celle-resten, og inneholder ikke noe av de forurensninger som foreligger når de andre lyseringsmidler anvendes, og som er vanskelig å fjerne med de kjente metoder for fremstilling av ren SAM. Sulfuric acid is then added and the light is carried out within 1-2 hours, preferably within 1.5 hours. It should be noted that the light of yeast cells carried out with a mixture of organic solvent and dilute sulfuric acid is more appropriate than that which is normally carried out with perchloric acid at ambient temperature, or with formic acid or acetic acid at 60° C and the like, as it not only finds place at ambient temperature which is very advantageous with regard to the stability of the SAM, but because it is carried out under such conditions that the solution can be easily filtered from the cell residue, and does not contain any of the impurities that are present when the other lysing agents are used, and which are difficult to remove with the known methods for producing pure SAM.

Ifølge et annet alternativ utføres trinn (a) ved fremstilling av SAM ved enzymatisk syntese ved virkning av enzymet ATP-methionin-adenosiltransferasis (E.C. 2.4.2.12) på en inkubasjonsblanding inneholdende adenosiltrifosfat (ATP) og methionin. According to another alternative, step (a) in the preparation of SAM is carried out by enzymatic synthesis by the action of the enzyme ATP-methionine-adenosyltransferase (E.C. 2.4.2.12) on an incubation mixture containing adenosyl triphosphate (ATP) and methionine.

Den.vesentlige betingelse for industriell utførelse av denne metode er at enzymet er rent og foreligger i en form som lett kan isoleres både fra den opprinnelige inkubasjonsblanding og fra det dannede SAM. The essential condition for the industrial implementation of this method is that the enzyme is pure and in a form that can be easily isolated both from the original incubation mixture and from the formed SAM.

Det er nå funnet en fremgangsmåte for rensing av enzymet ATP-methionin-adenosiltransferase ved affinitetskromatografi plus en kolonnereaksjonsmetode, hvilket gjør det mulig å oppnå de ovenfor angitte mål. A method has now been found for the purification of the enzyme ATP-methionine-adenosyltransferase by affinity chromatography plus a column reaction method, which makes it possible to achieve the above stated goals.

Affinitetskromatografi,av det spesifike enzym ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved percolering av en løsning inneholdende dette/f.eks. et råekstrakt av gjær eller "Escherichia coli" gjennom en kolonne fyllt med en fast bærer til hvilken en gruppe er kovalent bundet som virker som en konkurrerende inhibitor for enzymet. Det er ganske overraskende funnet at et utmerket fyllstoff for en slik rensekolonne består i en aktivert gel av polysacchari-der til hvilken L-lysin har vært kovalent bundet. Affinity chromatography of the specific enzyme according to the present invention is carried out by percolation of a solution containing this/e.g. a crude extract of yeast or "Escherichia coli" through a column filled with a solid support to which a group is covalently bound which acts as a competitive inhibitor of the enzyme. It has been rather surprisingly found that an excellent filler for such a purification column consists of an activated gel of polysaccharides to which L-lysine has been covalently bound.

Affiniteten av det spesifike enzym til lysinresten bundet til den faste matrise bevirker en forsinkelse i eluering av enzymet fra kolonnen, og gjør det således mulig å oppnå en separasjon fra de andre proteiner i en meget ren tilstand. The affinity of the specific enzyme to the lysine residue bound to the solid matrix causes a delay in elution of the enzyme from the column, and thus makes it possible to achieve a separation from the other proteins in a very pure state.

Imidlertid har separasjonen av enzymet fra eluatet som inneholder dette, for bruk i det neste enzymatiske syntesetrinn, gitt fullstendig utilfredsstillende resultater fordi dets stabilitet etter at det er separert avtar med tiden, og etter å ha vært anvendt én gang ved syntesen av SAM, ble det i tillegg ødelagt i den etterfølgende rensing av SAM. Det er nå funnet at utmerkede resultater oppnås ved å absorbere eluatet inneholdende det spesifike enzym i en egnet fast bærer og ved å utføre den katalytiske reaksjon mellom methionin og ATP i kolonnen, hvilket fører til dannelse av However, the separation of the enzyme from the eluate containing it, for use in the next enzymatic synthesis step, has given completely unsatisfactory results because its stability after being separated decreases with time, and after being used once in the synthesis of SAM, it was additionally destroyed in the subsequent purification of the SAM. It has now been found that excellent results are obtained by absorbing the eluate containing the specific enzyme in a suitable solid support and by carrying out the catalytic reaction between methionine and ATP in the column, which leads to the formation of

SAM. SAM.

En egnet fast bærer består i et polysaccharid aktivert med et reagens som er egnet til å binde proteiner til faste bærere, slik som cyanogenbromid. A suitable solid support consists of a polysaccharide activated with a reagent suitable for binding proteins to solid supports, such as cyanogen bromide.

Ved percolering av en løsning av ATP og méthohin i en egnet bufferløsning gjennom kolonnen erholdes det et eluat ved bun-nen av kolonnen inneholdende SAM. By percolating a solution of ATP and méthoquine in a suitable buffer solution through the column, an eluate containing SAM is obtained at the bottom of the column.

Trinn (b) muliggjør en separering av SAM i meget ren tilstand. I sure, omgivelser vi? faktisk den eneste forbindelse-som utfelles av picroloninsyre væreSAM,scm vist, ved tynnskiktskroma-tografi ifølge Anal. Biochem. 4, 16 - 28 (1971). Picroloninsyre har således en overraskende selektiv virkning. De tidligere anvendte u tfellingsmidler slik som picrinsyre, Reinecke-salt eller borsyre gir meget urene bunnfall som alltid krever en etterfølgende rensing av SAM ved ionebyttekromatografi, en fremgangsmåte som er meget kostbar og vanskelig å utføre industrielt. Det er også vanskelig å oppnå produktet med den nødvendige renhet. Anvendelse av vandige løsninger av picroloninsyre eller løsninger av denne syre i de tidligere angitte organiike løsninger medfører ingen spesielle pro-blemer, og er en metode som utføres ved omgivende temperaturer. Step (b) enables a separation of SAM in a very pure state. In sour, surroundings we? in fact, the only compound that precipitates from picrolonic acid is SAM, as shown, by thin-layer chromatography according to Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971). Picrolonic acid thus has a surprisingly selective effect. The previously used precipitating agents such as picric acid, Reinecke's salt or boric acid give very impure precipitates which always require a subsequent purification of the SAM by ion exchange chromatography, a method which is very expensive and difficult to carry out industrially. It is also difficult to obtain the product with the required purity. The use of aqueous solutions of picrolonic acid or solutions of this acid in the previously indicated organic solutions does not entail any particular problems, and is a method which is carried out at ambient temperatures.

Trinn (c) utføres med vandige løsninger inneholdende p-toluensulfonsyre og svovelsyre i konsentrasjoner begge på mellom 0,05 og 0,2 N, fortrinnsvis 0,1 N, og med et organisk løsningsmid-del som er delvis blandbart med vann slik som methylethylketon eller n^hutanol. Anvendelse av det organiske løsningsmiddel gjør det mulig å redusere den vandige syreløsning og praktisk talt eliminere alt av picroloninsyren. Step (c) is carried out with aqueous solutions containing p-toluenesulfonic acid and sulfuric acid in concentrations both of between 0.05 and 0.2 N, preferably 0.1 N, and with an organic solvent which is partially miscible with water such as methyl ethyl ketone or n^hutanol. Use of the organic solvent makes it possible to reduce the aqueous acid solution and practically eliminate all of the picrolonic acid.

Trinn (d) utføres ved anvendelse av mellom Step (d) is carried out using between

4 og 8 volumer (i forhold til volumet av den vandige løsning) av et løsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av aceton, methylalkohol, ethylalkohol og propylalkohol. 4 and 8 volumes (relative to the volume of the aqueous solution) of a solvent selected from the group consisting of acetone, methyl alcohol, ethyl alcohol and propyl alcohol.

Det er også ganske overraskende funnet at hvis det i trinn (e) anvendes den minimale mengde methanol som er nødvendig til å løse bunnfallet som stammer fra trinn (d), utskilles det doble salt SAM+.HS04".H2S04.2CH3C6H4SO:3H i det etterfølgende utfellings trinn (f) . It is also quite surprisingly found that if in step (e) the minimal amount of methanol necessary to dissolve the precipitate resulting from step (d) is used, the double salt SAM+.HS04".H2S04.2CH3C6H4SO:3H separates out in the subsequent precipitation step (f) .

Hvis imidlertid det anvendes et volum av methanol som er tenkt dobbelt så stort som det nødvendige volum i trinn Xe), utfelles det doble salt SAM<+.>HS04~.H2S04.CH3<C>6<H>4S03H i det etterfølgende utfellingstrinn (f). If, however, a volume of methanol is used which is thought to be twice the volume required in step Xe), the double salt SAM<+.>HS04~.H2S04.CH3<C>6<H>4S03H is precipitated in the subsequent precipitation step (f).

Anvendelse av mellomliggende mengder methanol fører til dannelse av blandinger av de to salter. Use of intermediate amounts of methanol leads to the formation of mixtures of the two salts.

Den ytterligere utfelling av det ene eller det andre av de nye salter ifølge oppfinnelsen (trinn f) krever anvendelse av et organisk løsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av methanol, ether, kloroform, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sekundært butylalkohol, isoamylalkohol og tetrahydrofuran. The further precipitation of one or the other of the new salts according to the invention (step f) requires the use of an organic solvent selected from the group consisting of methanol, ether, chloroform, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, secondary butyl alcohol , isoamyl alcohol and tetrahydrofuran.

De doble salter av SAM erholdt ifølge foreliggende oppfinnelse kan lagres uendelig i tørr tilstand praktisk,talt uforand-ret. The double salts of SAM obtained according to the present invention can be stored indefinitely in a dry state practically unchanged.

De etterfølgende eksempler illustrerer fremgangsmåten ved fremstilling av de nye salter ifølge oppfinnelsen. Den nye fremgangsmåte krever ikke temperaturer høyere enn omgivende temperatur i noen av trinnene, pg utføres i surt miljø. Dette er meget viktig for å forhindre spaltning av SAM. Ennvidere kreves ikke kom-plisert og arbeidskrevende trinn slik som kromatografi over kolonner eller ionebytterharpikser eller carbon, hvilket ville være vanskelig å utføre industrielt. The following examples illustrate the method for producing the new salts according to the invention. The new method does not require temperatures higher than ambient temperature in any of the steps, as it is carried out in an acidic environment. This is very important to prevent splitting of the SAM. Furthermore, complicated and labor-intensive steps such as chromatography over columns or ion-exchange resins or carbon, which would be difficult to carry out industrially, are not required.

Eksempel 1 Example 1

Til 90 kg gjær anriket med SAM (6,88 g/kg) ifølge Schlenk (Enzymologia 29, 283 (1965) ble tilsatt 11 liter e.thylacetat og 11 liter vann ved omgivende temperatur. Etter kraftig omrøring i 30 minutter ble 50 liter 0,35N svovelsyre tilsatt idet omrøringen ble fortsatt ytterligere i 1,5 timer. Etter filtrering og vasking med vann, ble det erholdt 140 liter av en løsning inneholdende 4,4 0 g/ liter SAM, tilsvarende 99,5 % av det tilstedeværende i utgangsmate-rialet. To 90 kg of yeast enriched with SAM (6.88 g/kg) according to Schlenk (Enzymologia 29, 283 (1965) were added 11 liters of ethyl acetate and 11 liters of water at ambient temperature. After vigorous stirring for 30 minutes, 50 liters of 0 .35N sulfuric acid added while stirring was continued for a further 1.5 hours. After filtering and washing with water, 140 liters of a solution containing 4.40 g/liter of SAM were obtained, corresponding to 99.5% of that present in the starting feed - the rial.

En løsning av 2,3 kg picroloninsyre i 25 liter methylethylketon ble tilsatt til løsningen under omrøring. Etter henstand over natten ble bunnfallet fraskilt ved sentrifugerihg og vasket med vann. A solution of 2.3 kg of picrolonic acid in 25 liters of methyl ethyl ketone was added to the solution with stirring. After standing overnight, the precipitate was separated by centrifugation and washed with water.

Det således erholdte faste stoff ble tilsatt under omrøring til en blanding av 18 liter av en 0,IN løsning av svovelsyre og p-toluensulfonsyre og 18 liter methylethylketon. Etter henstand ut-skiltes den organiske fase som ble ført til et gjenvinningssystem for picroloninsyre, og den vandige fase ble behandlet med en liten mengde methylethylketon for å fjerne spor av picroloninsyre, og avfargende benkull ble tilsatt hvoretter løsningen ble filtrert. The solid thus obtained was added with stirring to a mixture of 18 liters of a 0.1N solution of sulfuric acid and p-toluenesulfonic acid and 18 liters of methyl ethyl ketone. After standing, the organic phase was separated and sent to a picrolonic acid recovery system, and the aqueous phase was treated with a small amount of methyl ethyl ketone to remove traces of picrolonic acid, and decolorizing bone charcoal was added, after which the solution was filtered.

Qen^e løsning (16,5 liter) inneholdt 33,8 g/liter SAM, tilsvarende 90 % av det foreliggende i gjæren. Når denne ble analysert tynnskiktskromatografisk ifølge Anal. Biochem. 4, 16 - 28 One solution (16.5 litres) contained 33.8 g/litre of SAM, corresponding to 90% of that present in the yeast. When this was analyzed by thin-layer chromatography according to Anal. Biochem. 4, 16 - 28

(1971) viste den seg å inneholde bare SAM uten spor av dets spalt-ningsprodukter eller andre organiske baser. Den ovenfor angitte løsning ble heldt over i 100 liter aceton under omrøring. Etter henstand ble løsningsmidlet dekantert fra og det faste materiale ble løst i, 3 ,3. kg ,av. en .15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol. Etter tilsetning av avfargende benkull ble blandingen filtrert og tilsatt til 25 liter ethylether. 1184 g av et krystal linsk salt utfeltes som var lett filtrerbart, ikke meget hygrbsko-pisk og meget løselig i vann (mere enn 20 %) under dannelse av en (1971) it was found to contain only SAM with no traces of its cleavage products or other organic bases. The above solution was poured into 100 liters of acetone with stirring. After standing, the solvent was decanted from and the solid material was dissolved in, 3 .3. kg, off. a .15% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol. After adding decolorizing bone charcoal, the mixture was filtered and added to 25 liters of ethyl ether. 1184 g of a crystalline salt precipitated which was easily filterable, not very hygroscopic and very soluble in water (more than 20%) forming a

fargeløs løsning. Saltet er bare svakt løselig i methanol og etha-nol og uløselig i aceton, methylethylketon, kloroform, .høyere colorless solution. The salt is only slightly soluble in methanol and ethanol and insoluble in acetone, methyl ethyl ketone, chloroform, .higher

alkoholer og benzen. Ved tynnskiktkromatografi ifølge Anal.Biochem. 4, 16 - 28.(1971) viste produktet seg å være fritt for enhver for-urensning . alcohols and benzene. By thin-layer chromatography according to Anal.Biochem. 4, 16 - 28. (1971) the product proved to be free of any contamination.

Elementæranalyse av saltet ga følgende resultater: Elemental analysis of the salt gave the following results:

-C = 36,39 %, H =4,6 %, S = 16,7 %, N = 8,8 % -C = 36.39%, H = 4.6%, S = 16.7%, N = 8.8%

De beregnede-verdier for C29H42N6^19S5 ^M,w-938»98) er: The calculated values for C29H42N6^19S5 ^M,w-938»98) are:

C — 37,09 %, H = 4,51 %, N = 8,9 %, S = 17,07 % C — 37.09%, H = 4.51%, N = 8.9%, S = 17.07%

Fuktighet bestemt ifølge K. Fischer: 1,7 - 2 % U^V...spektrum av den nye forbindelse viser et absorpsjonsmaksimum ved 260 nm, E* = 182. ;1 cm ;Disse data stemmer overens med en forbindelse av formelen: ; ; Den nye forbindelse ble ennvidere identifisert ved den ensymatiske metode basert på den enzymatiske methylering av nicotin-amid eller guanidineddiksyre med SAM (G.L. Cantoni. J. Biol. Chem., 189, 745 (1951), G. De La Hoba, B.A. Jamieson, S.H. Mudd and H.H. Richards, J. Amer. Chem. Soc. 81, 3975 (1959). ;Eksempel 2 ;,.. ,1,15 kg picroloninsyre løst i 10: liter isobutylalkohol ;ble tilsatt til 70 liter av en løsning som stammet fra lysen av gjærceller, erholdt ved anvendelse av samme råmateriale og samme metode som i eksempel 1. Etter hensatnd over natten ble det dannede bunnfall fraskilt ved sentrifugering. ;Det fraskilte faste stoff ble behandlet med 9 liter av en 0,1N løsning av svovelsyre og p-toluensulfonsyre og med 9 liter methylisobutylketon. Etter henstand separerte den organiske fase, mens den vandige fase ble befridd for spor av picrolonsyre ved vasking med en liten mengde methylisobutylketon. Avfarvende benkull ble tilsatt og blandingen ble filtrert, filtratet ble heldt ..over i 70 liter methylalkohol. Etter henstand ble det dannede faste materiale dekantert fra løsningsmidlet og ble løst i en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol (1,65 kg). Etter avfarving med benkull ble filtratet tilsatt til 10 liter kloroform under dannelse av et lett filtrerbart krystallinsk bunnfall av SAM-disulfat-di-p-toluensulfonat. Det erholdte produkt (1110 g) ga de samme analyse-resultater som produktet ifølge eksempel 1. ;Eksempel 3 ;1,15 kg picroloninsyre løst i 12 liter n-butanol ble tilsatt til 70 liter av en løsning som stammet fra lysen av gjærceller, erholdt ved den samme lysemetode og med det samme råmateriale som i eksempel 1. Etter henstand over natten ble bunnfallet ;fraskilt ved sentrifugering. Det erholdte faste materiale ble delt mellom 9 liter av en 0,1 N løsning av svovelsyre og p-toluensulfonsyre og 12 liter n-butanol. Etter henstand separerte den organiske fase mens den vandige fase ble befridd for spor av picroloninsyre ved vasking med en liten mengde n-butanol. Avfarvende benkull ble deretter tilsatt og blandingen ble filtrert, filtratet ble heldt over i 65 liter n-propylalkohol. Etter henstand ble det faste materiale dekantert fra løsningsmidlet og løst i en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol (1,65 kg). Etter afravning med benkull ble filtratet heldt over i 14 liter n-butanol under dannelse av et lett filtrerbart krystallinsk bunnfall av SAM-disulfat-di-p-toluensulfonat. Sluttproduktet (1155 g) ga de samme analyseresul-tater som produktet ifølge eksempel 1. ;Eksempel 4 ;Rensing av det spesifike enzym ;50 ml Sepharose (polysaccharid fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, sverige) sammenklumpet og suspendert i vann, ble behandlet med cyanogenbromid ifølge kjente metoder for å binde substanser inneholdende amingrupper til matriser bestående av polysaecharidgel. Et overskudd av L-lysin ble tilsatt til den således fremstilte gel. Den ble deretter vasket med henholdsvis destillert vann, en pufferblanding med pH 8,5 og en bufferblanding med pH 4,5. Gelen ble deretter anvendt for å pakke en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en høyde på 30 cm. En bufferblanding bestående av 0,05 M triethanolamin og 0,01 M H2S04med pH 8,0 ble ført gjennom kolonnen inntil det ble erholdt fullstendig likevekt. 2 ml gjærekstrakt inneholdende det spesifike enzym ble fyllt på kolonnen, erholdt ved sonifikering eller homogenisering med tørr is og eventuelt etter anrikning med det spesifike enzym. Kolonnen ble deretter eluert med den samme bufferblanding som ble anvendt for likevekt-behandling, og fordelingen av proteinene i eluatet ble fulgt ved ultrafiolett spektrofotometriske målinger. Samtidig ble syntetaseaktiviteten målt i -forskjellige fraksjoner ifølge J.A.Stakol, Methodes in Enzymology, vol. 6, s. 566 (1963). De fraksjoner som utviste en relevant syntetaseaktivitet ble slått sammen og den således erholdte løsning utviste en spesifik aktivitet på minst 20 ganger større enn råekstraktet. Enzymet kan ytterligere konsentreres i denne løsning ved utfelling med salter, med organiske løsningsmidler eller etter andre kjente metoder for konsentrering av proteinløsninger. ;F remstilling av SAM ;30 ml sammenklumpet Sepharose-gel ble aktivert med cyanogenbromid eller etter en annen kjent metode for å binde proteiner til polysaccharid-gelmatriser. 4 ml av en løsning av det spesifike enzym renset som ovenfor angitt og inneholdende ca. 100 mg protein ble tilsatt den aktiverte gel. Suspensjonen av aktivert gel og enzymløsningen ble omrørt ved 4° C i 18 timer. Harpiksen ble vasket med vann. Vaskevæsken inneholdt ca. 70 % av den totale enzymatiske aktivitet som opprinnelig forelå i løsningen av det spesifike enzym. Ved inkubering av Sepharose fremstilt som ovenfor angitt med den ;ovenfor angitte metode for bestemmelse av syntetaseaktiviteten, ble det observert at ca. 20 % av den totale aktivitet er bundet til polysaccharidet. ;Sepharose fremstilt som ovenfor angitt ble anvendt for å pakke en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en høyde på 20 cm. En løsning inneholdende 0,675 M triethanolamin, 0,150 M magnesium- sulfat, 0,05 M ATP, 0,05 M M-methionin og 0,01 M KC1 ble ført gjennom kolonnen med en hastighet på 5 ml pr. time ved en temperatur på 25 - 27° C. ;Eluatet fra kolonnen ble analysert med hensyn på SAM-innhold og viste at omdannelsen var 30 %. ;Fremstilling av doble salter av SAM med svovelsyre og p-toluen-sulf onsyre ;103 ml eluat inneholdende 6 g/liter SAM ble surgjort med I^SO^til pH 3, og til denne løsning ble tilsatt under omrøring en løsning av 2,3 g picroloninsyre i 25 ml methyletylketon. Etter henstand over natten ble bunnfallet filtrert fra og vasket med vann. Bunnfallet ble på nytt oppløst i 18 ml 0,1 N løsning av H2S04og p-toluensulfonsyre, og i 18 ml methylethylketon. ;Etter omrøring og henstand separerte det organiske lag, ;og det vandige lag ble behandlet med en liten mengde methylethylketon for å fjerne de siste spor av picrolonsyre. Etter separering av vannlaget, ble avfarvende benkull tilsatt og blandingen ble filtrert. 16,5 ml vandig farveløs løsning ble erholdt, hvilken inneholdt 33,8 g/liter SAM, hvilket tilsvarte 90 % av det SAM som forelå å i den opprinnelige løsning. Ved tynnskiktskromatografisk analyse viste løsningen særlig å inneholde bare SAM. 16,5 ml av løsningen ble heldt over i 100 ml aceton. Etter omrøring og henstand ble væsken fraskilt ved dekantering. Det faste materiale ble oppløst i 6,6 g av en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol. Etter tilsetning av avfarvende benkull og filtrering, ble løsningen heldt over i 25 ml ethylether. Løsningen ble filtrert etter henstand og det krystallinske salt veide 0,967 g og hadde sammensetningen: ;SAM<+>.HS04~.H2S04.CH3<C>gH4S03H. ;Analyse: Beregnet for C22<H>3<4>^16<N>6^4;C 34,46 %, H 4,47 %, N 10,96 %, S 16,72 % ;Funnet : C 33,68 %, H 4,65 %, N 10,8 S 16,5 % ;SAM<+>50,5 %, H20 2,1 %, H2S04 25,3 % p-toluensulfonsyre 21,7 % ;Det ultrafiolette spektrum viste et maksimum ved 260 nm, E^ 1%cm<=><1>79. Ved hjelp av fremgangsmåten men ved å anvende 3,3 g av en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol i det etterfølgende utfellings trinn og anvende. 25 ml ethylether , ble det erholdt.1,18 gav saltet SAM+.H2S04.2CH3CgH4S03H med de samme karakteristika som produktet ifølge eksempel 1. ;I noen år har det fra biokjemisk forskning vært kjent at SAM er den eneste spesifike donator av methylgrupper i levende organismer for de biokjemiske reaksjoner for overføring av CH3-gruppen, hvilke er fundamentale reaksjoner i den lipide, proteide og glucide metabolisme. ;I det etterfølgende er angitt enkelte av de mest viktige SAM-avhengige transmethyleringsreaksjoner: a'l N-transmethylering: adenin, carnitin, carnosin, creatin, 2,6-diaminopyrin, adrenalin, guanin, hordenin, N'-nicotinamid, fosfatidilcolin, ricinin, •■- bl O-transmethylering: N-acetylserotonin, dopamin, epinin, d- adrenalin, 1-adrenalin, ergosterol, 1-noradrenalin, pectin, ublikinon, c) S-transmethylering: 2,3-dimercaptopropanol, H2S, methionin, methylmercaptan, S-mercaptopropionsyre, S-mercaptoethanol, ;thiopyrimidin, thiouracyl, ;dl C-transmethylering: cytosin, thymin. ;Med hensyn til den menneskelige organisme betyr dette at SAM virker i de følgende metabole prosesser: biosyntese av cholin, biosyntese av fosfatidylcolin, aktivitet av enzymer krever SH-grupper, metabolisme av catecholaminer, metabolisme av biogene sentroencefaline aminer, metabolisme av serotonin, metabolisme av histamin, metabolisme av vitamin B12 og folinsyre, metabolisme av creatin, metabolisme av myosin, metabolisme av his-toner, metabolisme av RNA, metabolisme av DNA, metabolisme av protein substanser, metabolisme av enkelte hormoner av cyclopentan-perhydrofenantrenkjerner- den viktigste av disse er østrogener - metabolisme av triglycerider. ;Det har også vært kjent en tid at SAM, når denne dernethy-leres av methyltransferase-enzymer, overføres til S-adenosilhomo-cystein (SAO) som er en indirekte donator av hydrosulfidgrupper og således spiller en viktig rolle i metabolisme av alle forbindelser som krever SH-grupper for å kunne utføre den biologiske aktivitet. Spesielt viktig blandt disse er enkelte thioenzymer og sulfurerte aminosyrer. ;SAO decarboxyleres i sin tur i organismen, og det dekar-boxylerte produkt er den prinsipale donator av aminopropylgruppen, hvilken ifølge den ferskeste biokjemiske lære, er uunnværlig for biosyntesen av polyaminer. Prosessen katalyseres av flere enzymer ;.blandt hvilke en spesifik er aminopropyl-transferase. ;Man kan konkludere med at det er kjent at SAM i den.menneskelige organisme er nært sammenkoblet med alle biokjemiske reaksjoner av: A - transmethylering (spesifik giver av CH^-gruppen) B - transsulfurering (spesifik giver av SH-gruppen) ;C - transaminopropylering (spesifik giver av aminopropylgruppen) ;Denne kunnskap kunne føre til den konklusjon at SAM ville kunne ha en terapeutisk virkning ved behandling av patologiske tilstander forbundet med mangeltilstander i organismen med hensyn til de enkelte av de mange produkter som er angitt ovenfor. ;Imidlertid har den store ustabilitet av SAM og mangel på fremgangsmåte for å gjøre den stabil i tilstrekkelig tid under normale omgivende betingelser, forhindret at dette produkt er blitt farmakologisk eller klinisk testet og således forhindret at det er funnet praktisk anvendelse for dette innen den menneskelige terapi. Bare etter fremstilling av de nye SAM-salter ifølge foreliggende oppfinnelse, salter som i praksis er uendelig stabile ved omgivende temperatur, har vært mulig å utføre en systematisk farmakologisk og klinisk undersøkelse som har ført til gjenoppdagelse av de nye salter har terapeutiske egenskaper som er fullstendig overraskende med hensyn til kvalitet og intensitet. ;Fra den store mengde farmakologiske og kliniske data som er oppsamlet for dette nye produkt, vil det her bare bli gitt enkelte eksempler tilstrekkelig til klart å angi de essentielle karakteristika til det nye produkt og dets hovedanvendelse i den menneskelige terapi. ;I de farmakologiske og kliniske data er det for enkel-hets skyld angitt forkortelsen SAM for saltet SAM<+>.HS04~.H2S04. 2CH3CgH4S03H. ;De administrerte mengder er også alltid av SAM.HS04 .H2S04.2C<H>3<C>g<H>4S03H. Imidlertid gjelder de angitte data også det andre doble salt. ;Toksisitet - Samsaltet ifølge oppfinnelsen har vist seg å være absolutt fri for akutt toksisitet, kronisk toksisitet, lokal into-leranse og bivirkninger. DL501 mus er større enn 6 g/kg/os og 2,5 g/kg/i.p. ;Tester over toleranser og toksisitet ble utført på rotter av Wlstar- og Sprague-Dowley-stammen administrert med 10 - 20 mg/kg . pr. dag i 12 måneder, og etter endt behandling viste de forskjellige organer og systemer ingen patologiske forandringer. ;Teratogenese-tester ble utført på kaniner og rotter: ;selv med administrering av massive doser av SAM, ca. 10 ganger den maksimale terapeutiske dose, ble det ikke observert noen teratogene virkninger eller noen misdannelser i fosteret eller i det ferdige utviklede foster. ;Tilsetning av doser opp til 0,1 - 0,2 mg/ml av produktet i levende kulturer av human lymfocytes eller leverceller fra mus bevirker ingen forandringer i sprengningsindekset (blasticising index) for de cellulære elementer. Intravenøs administrering i doser opp til 40 kg/kg fremkalte ingen pyrogene utslag i kaninene. ;Venøs administrering i kaniner og katter på 4 0 mg/kg bevirket ingen forandring i card trykk, hjerte- og respirasjonsfrekvens eller EKG-kurven. ;Den lokale toleranse ved intramuskulær injeksjon, selv etter administreringer gjentatt over 180 dager, og ved intravenøs injeksjon i randvev av den auriculære pavilion i kaniner, er utmerket. ;I unge friske mennesker av begge kjønn som ble underkastet administrering ved den hurtige intravenøse metode eller ved phleboclysis av doser av SAM 10 - 300 mg/kg (midlere vekt 70 kg), ble det ved samtidig undersøkelse av det minimale og maksimale trykk av puls og respirasjonsfrekvens ved 1, 5, 15, 20, 30, 60 minutter og ved 2, 3, 6, 8, 10, 12, 24 timer fra endt administrering ikke observert noen variasjon fra normale verdier. ;EKG-kurven viste en variasjon i PQ-intervallet, ST-seksjonen, eller ikke nærvær av ekstrasistol eller andre forandringer ved 30sek, 1, 2, 3, 5, 10 og 20 minutter fra administrering. ;I det hemopoetiske system og i lever- og nyrevirksomhet ble det ikke-observert noen variasjoner som var statistisk signifikant fra det normale. ;Farmakologi ;Det skal gjentas at når det i den etterfølgende beskrivel-se tales om administrering av SAM, menes det at følgende er blitt administrert: SAM<+>.HS<0>4~.H2S04.2CH3C6H4S03H og/eller SAM<+.>HS04'.H2S04.CH3C6H4S03H. ;For å bestemme indikativt hvordan SAM fordeles i vevene, ble det fremstilt S-adenosilmethionin (methyl C"^) . Fordelingen av ' dette produkt i rotter ble undersøkt ved administrering av en dose på 10 mg/kg/e.v lik 24 jjci av radioaktivt produkt. Den spesifike aktivitet til produktet var 58 mCi/m mol. Parallelt med dette ble det foretatt en autoradiografisk undersøkelse på mus. Resultatene av disse to forsøk viser at SAM fordeles meget hurtig til alt vev. ;I den etterfølgende tabell er oppført data for hver av de berørte organer: ;Fordeling av SAM i rottevev. ;Verdiene er uttrykt i yg/g. ; ; Det ble følgelig fastslått at de nye salter ifølge foreliggende oppfinnelse avgir CH3~gruppen til alt vev som er utstyrt med methyltransferase-aktivitet. Med andre ord er de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen istand til valgfritt å lokalisere seg selv i alle organer utstyrt med methyltransferase-systemer. Dette ble fastslått ved suksessive farmakologiske tester. En serie av tester utført på rotter er vist ved at de nye forbindelser utviser en betydelig beskyttende og legende virkning av leversteatosis ved hyperlipid-hyperproteindiet ifølge Handler, i steatosis ved akutt alkoholintoksicasjon og ved andre toksiske midler (carbontetra-klorid, brombenzen etc.) ved administrering av bare 15 mg/kg/ip, både morfohistokjemisk og analytisk, idet SAM betydelig reduserer akkumulering av lipider ved det hepatocide nivå mens det begunsti-ger gjenoppbygning av normale nivåer av fosfolipider redusert etter intoksikasjon med CC14- ;Hepatisk fosfolipider i rotter etter intoksikasjon med CCI4og behandling med SAM. ; Verdiene er de gjennomsnittlige + E.S. av 10 verdier for ;hver gruppe. Ved undersøkelse av den hepatoprotektive beskyttende aktivitet ble det anvendt en eksperimentell anordning som fremkaller i rottene de såkalte hepatisk cholesteroldegenerering (Ridout and Coll., Biochem. J.52, 99, 1952). I denne metode oppnås ved hjelp av en egnet diet en gjenkallende økning i det totale hepatiske fett og hepatisk cholesterol i dyrene. Forbindelser som virker i den lipide metabolisme reduserer eller opphever denne økning. ;Dyrene ble delt i seks grupper. Den første gruppe ble administrert med en diet som ble variert etter behag. Den annen gruppe ble administrert med Ridout basisdiet (20 g pr. rotte pr. dag), de andre grupper ble administrert med samme diet i samme dose men anriket med cholesterol i en mengde av 0,2 g/rotte/dag. Behandlingen varte i 3 uker. ;Gruppene 4, 5-og 6 ble administrert med SAM i de følgende doser: 1, 2, 5 mg/kg/i.p. pr. dag ;Etter 3 uker ble alle dyrene avlivet, leveren ble fjernet og totalt fett (Best and Coll., Biochem. J.40, 368, 1966) og cholesterol (Sperry and Brand, J. Biol. Chem. 150, 315, 1943) ble bestemt. ;Resultatene viste at de grupper som ble underkastet behandling med SAM i doser på 1 - 2 mg/kg/i.p. ble bare svakt beskyttet, mens gruppen som ble behandlet med 5 mg/kg/i.p. ble fullstendig beskyttet. ;Hepatisk cholesterol og totalt fett etter endt forsøk (gjennomsnittlig pr., gruppe) : ; Andre farmakologiske virkeområder var den anti-inflamma-toriske effekt og analgesiske effekt som ble utvist av SAM. ;Av de forskjellige tester skal nevnes de mest klassiske, nemlig ødem fremkalt av carragenine og av eggehvite som en test for akutt inflammasjon, og granuloma fremkalt fra bomullspellets og arthritis som en test for kronisk inflammasjon. I alle tilfeller var SAM aktiv både når den ble administrert oralt (dose mellom 20 og 100 mg/kg) og parenteralt (doser mellom 10 og 20 mg/kg) i sammenligning med andre kjente farmasøytiske produkter (Ibuprofen - indometacina). De analgesiske tester var varmplatetesten og strekktesten fremkalt-av eddiksyre, og Randal- og Selitto-testen utført på rotter. Det nye produkt viste seg å være aktivt i disse tester i sammenligning med kjente farmasøytiske produkter. ;Et ytterligere farmakologisk virkeområde var den mulige virkning av SAM på søvn-tiden fremkalt av barbiturater. For dette formål ble det utført ét forsøk hvor grupper av mus mottok hexobarbital i en dose på 80 mg/kg/i.p. ifølge metoden beskrevet av Holten og Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol. 1956, 12, 346), en gruppe var kontrollgruppen og den andre gruppe mottok SAM i en dose på 10 mg/kg/i.p. ; Som det fremgår av de ovenfor angitte data utviser SAM en aktivitet med hensyn til å forlenge søvn-tiden som fremkalles av hexobarbital. ;Kliniske tester ;Hvor det i det etterfølgende, er angitt administrering av SAM, angir dette administrering av SAM<+.>HS04~.2CH3CgH4S03H og/eller SAM+.HS04".H2S04CH3CgH4S03H. ;Etter de indikasjoner man fikk fra de farmakologiske tester, ble de kliniske tester rettet mot syklige tilstander hvor følgende syntes primært eller sekundært å være forandret: ;1 - metabolisme av lipider ;2 - metabolisme av protider og glucider ;3 - metabolisme av catecholaminer og biogene aminer. ;1. Fra tester utført klinisk på flere hundre pasienter ved ;bruk av doser av SAM varierende over et vidt område, ble det funnet at den nye forbindelse fremkalte et hurtig fall i leverlipidene ved hepatosteatosis av varierende patogenese,, hvilket kunne identifiseres ved biopsi undersøkelse endt behandlingssyklus, selv etter 60 dager fra endt behandling. ;Administrering av produktet bevirket også et markert fall i de høye verdier av total chalesterolemia, av hypertriglyceridemia og en normalisering av forandrede 3/a-lipoproteinforhold i pasienter med hyperdialipidemia i ukompensert tilstand. Denne hypo ;Denne hypocholesterol-nedsettende og hypolipid-nedsettende virkning ble også fastslått selv i doser på 20 - 30 mg administrert 2-3 ganger pr. dag, og er proporsjonal med dosen. ;I ren arteriosclerose med kliniske manifestasjoner av det psyko-påvirkelige område, ved turbemnesis og sekundær centroence-phalics (svekkelse ved arteriosclerotisk encephalopathia) og tegn på cerebral hypoxia, har administrering av SAM intramuskulært eller i alvorligere tilfeller, ved intravenøs injeksjon eller ved sakte phleboclysis, i doser mellom 20 og 40 mg 3 til 4 ganger pr. dag, vist en meget fordelaktig modifisering av symtomatologien. ;Særlig i rene hypoxydotiske tilstander har mange gjenvun-net livsfunksjoner meget hurtig og statistisk signifikant. ;I post-apoplektiske syndromer ble det funnet en hurtigere gjenoppbygning av det kliniske system. ;2. Det ble foretatt en klinisk behandling med flere hundre pasienter som var angrepet av: sekundær hypoprotidemia og disproti-demias, vedvarende eller aggressive hepatopathias, precyrrotisk eller cyrrotiske tilstander, malabsorpsjonsyndromer, protid-splittende syndromer. Administreringen av doser varierende mellom 20 og 200 mg SAM pr. dag intramuskulært eller intravenøst eller ;oralt, alt etter sykdommens tilstand, bevirker en statistisk betydelig (økning i den totale protidemia,. en økning i albuminkvoten og en ;tendens til å normalisere de endrede prosentuelle forhold mellom de elektroforetiske fraksjoner, i serumet. Denne proteinoppbyggende aktivitet har ofte vært fulgt av en meget betydelig forbedring i den subjektive symtomologi og de. generelle objektive tilstander. ;,3. Spesielt overraskende resultater ble oppnådd ved klinisk anvendelse av det nye enzymatiske salt ifølge oppfinnelsen, hvor det forelå svekkede systemer som klart har forbindelse med modifikasjoner i utveksling av biogene aminer, f.eks.: ;a) patologiske systemer med neuropsykiatrisk relevans, ;b) Parkinsons sykdom og Parkinsonisme av varierende eziopathoge-nese, c) Antifologistisk og analgetisk virkning i behandling av osteo-arthritis, og antalgetisk aktivitet i visse neurologiske manifestasjoner, ;d) forstyrrelser av søvn-rytmen. ;Med hensyn til punkt a) har en omfattende kasustri utført ;ved undersøkelse av den kliniske adferd og Hamilton og Wittenberg-tester, klart vist at administrering av doser varierende mellom 20 og 50 mg SAM 3-4 ganger pr. dag i løpet av 5 - 15 dager, uten noen annen form for terapi, fremkaller en betydelig remissjon av de hovedparametere som taes i betraktning ved diagnosen av depressive former. ;Med hensyn til punkt b) vedrørende behandling av Parkinsons sykdom og Parkinsonisme, er det funnet at: Administrering av SAM i doser på 10 - 40 mg pr. dag intramuskulært eller intravenøst, eller oralt, alt avhengig av sykdommens tilstand, sammen med den vanlige terapi medLevodopa, gor opphav til en statistisk mer betydelig forbedring i akinesia og stivhet i.forhold til hva som oppnås hos pasienter behandlet bare med Levodopa. Gunstige modifikasjoner ble også funnet ved Parkinsons tremor, hvilket ikke kan modifiseres med Levodopa alene. ;Administrering av SAM forbedrer betydelig den Levodopa-avhengige psykiske ubalanse, særlig med hensyn til depressive tilstander og psykiske manifestasjoner av irritativ type. ;Administrering av SAM i de ovenfor angitte doser blokkerer betydelig bivirkninger av Levodopa i forskjellige organer og systemer, særlig med hensyn til nausea, vomit, nedsatt appetit, hypo-tensjon, asthenia, cephalea, hypersudorasjon. og insomnia. ;Med hensyn til punkt c) har farmakologiske resultater vist at SAM har en betydelig antiflogistisk og analgesisk aktivitet, og har vist seg å være aktiv i alle osteoarthritiske former behandlet med en dose på 30 mg.to ganger pr. dag intramuskulært eller intravenøst og 30 - 50 mg oralt 4 ganger pr. dag. ;Etter bare 7 dagers behandling ble de muskulære spasmer, ;bevegelsesbegrensning, lokalisert smerte og stivhet influert betydelig for å placebo. Intet tilfelle av gastrisk pyrosis ble observert i de 90 tilfelle som ble behandlet. Undersøkelse over skjult blod i feces viste ingen modifikasjon under behandlingen. ;Sammenlignet med et ikke-steroid antiflogistisk legemiddel som van-ligvis anvendes i en dobbelblind-undersøkelse, utviste SAM en terapeutisk effektivitet lik indomethacin. ;Den analgetiske aktivitet av SAM ble også undersøkt i forskjellige pasienter med forskjellige neurologiske tilstander: neuritis, polyneuritis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torti-collis. ;Den terapeutiske effekt ble oppnådd fra den første dag med administrering av en dose av 15 mg to ganger pr. dag intramuskulært eller 30 - 50 mg 3 - 4 ganger pr. dag oralt. ;Analoge resultater ble erholdt i pasienter med tilbake-vendende og resistent cephalalgia med administreringen av legemid-let oralt i tyggbare tabletter. ;Med hensyn til punkt c), dvs. forstyrrelser av søvn-våken-rytmen, spesielt med hensyn til insomnia, er det nye produkt ifølge oppfinnelsen istand til med en dose på 10 - 30 mg oralt betydelig å forbedre de forandrede søvn-våken-forhold ved å fremkalle fysiolo-gisk søvn uten å måtte anvende bruk av barbiturater eller andre forbindelser med cortical og centroencefali depressiv virkning. ;Som det fremgår fra det ovenfor angitte åpnes det nye og vide perspektiver innen den menneskelige terapi. De anvendelsesområder som allerede er kartlagt er: behandling av hepatopiase, ;hyperdislipidemia, utbredt eller lokal arteriosclerose, psykiatriske manifestasjoner av depressiv og neurologisk type, degenerativ arthropathies, neurologiske smerte-manifestasjoner og forstyrrelser av søvn-våken-rytmen, mens mange andre anvendelsesområder fremdeles må undersøkes og kartlegges. ;De nye SAM-salter administreres fortrinnsvis intramuskulært eller intravenøst, eller i orale eller sublingale tabletter, ;eller i kapsler. ;Den terapeutiske dose av SAM ligger mellom 5 og 3 00 mg pr. dag, avhengig av den spesielle type og sykdommens tilstand. ;Større doser kan anvendes om nødvendig på grunn av at sal-tene ifølge oppfinnelsen er absolutt fri for toksisitet. * Moisture determined according to K. Fischer: 1.7 - 2% U^V...spectrum of the new compound shows an absorption maximum at 260 nm, E* = 182. ;1 cm ;These data agree with a compound of the formula: ; ; The new compound was further identified by the enzymatic method based on the enzymatic methylation of nicotinamide or guanidineacetic acid with SAM (G.L. Cantoni. J. Biol. Chem., 189, 745 (1951), G. De La Hoba, B.A. Jamieson, S.H. Mudd and H.H. Richards, J. Amer. Chem. Soc. 81, 3975 (1959). ;Example 2;,.. ,1.15 kg of picrolonic acid dissolved in 10: liters of isobutyl alcohol; was added to 70 liters of a solution which derived from the light of yeast cells, obtained using the same raw material and the same method as in example 1. After standing overnight, the precipitate formed was separated by centrifugation. The separated solid was treated with 9 liters of a 0.1N solution of sulfuric acid and p-toluenesulfonic acid and with 9 liters of methyl isobutyl ketone. After standing, the organic phase separated, while the aqueous phase was freed from traces of picrolonic acid by washing with a small amount of methyl isobutyl ketone. Decolorizing bone charcoal was added and the mixture was filtered, the filtrate was poured ..over in 70 liters of methyl alcohol. After standing, the solid formed was decanted from the solvent and was dissolved in a 15% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol (1.65 kg). After decolorization with bone charcoal, the filtrate was added to 10 liters of chloroform, forming an easily filterable crystalline precipitate of SAM-disulfate-di-p-toluenesulfonate. The product obtained (1110 g) gave the same analysis results as the product according to example 1. ;Example 3 ;1.15 kg of picrolonic acid dissolved in 12 liters of n-butanol was added to 70 liters of a solution which originated from the light of yeast cells, obtained by the same lysis method and with the same raw material as in example 1. After standing overnight, the precipitate was separated by centrifugation. The solid material obtained was divided between 9 liters of a 0.1 N solution of sulfuric acid and p-toluenesulfonic acid and 12 liters of n-butanol. After standing, the organic phase separated while the aqueous phase was freed from traces of picrolonic acid by washing with a small amount of n-butanol. Decolorizing bone charcoal was then added and the mixture was filtered, the filtrate was poured into 65 liters of n-propyl alcohol. After standing, the solid material was decanted from the solvent and dissolved in a 15% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol (1.65 kg). After stripping with bone charcoal, the filtrate was poured into 14 liters of n-butanol, forming an easily filterable crystalline precipitate of SAM-disulfate-di-p-toluenesulfonate. The final product (1155 g) gave the same analysis results as the product according to example 1. ;Example 4 ;Purification of the specific enzyme ;50 ml of Sepharose (polysaccharide manufactured by Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) were clumped together and suspended in water, treated with cyanogen bromide according to known methods for binding substances containing amine groups to matrices consisting of polysaccharide gel. An excess of L-lysine was added to the gel thus prepared. It was then washed with distilled water, a buffer mixture of pH 8.5 and a buffer mixture of pH 4.5, respectively. The gel was then used to pack a column with a diameter of 1.5 cm and a height of 30 cm. A buffer mixture consisting of 0.05 M triethanolamine and 0.01 M H 2 SO 4 of pH 8.0 was passed through the column until complete equilibrium was obtained. 2 ml of yeast extract containing the specific enzyme was filled onto the column, obtained by sonification or homogenization with dry ice and possibly after enrichment with the specific enzyme. The column was then eluted with the same buffer mixture used for equilibration treatment, and the distribution of the proteins in the eluate was followed by ultraviolet spectrophotometric measurements. At the same time, the synthetase activity was measured in -different fractions according to J.A.Stakol, Methods in Enzymology, vol. 6, p. 566 (1963). The fractions that exhibited a relevant synthetase activity were combined and the solution thus obtained exhibited a specific activity of at least 20 times greater than the crude extract. The enzyme can be further concentrated in this solution by precipitation with salts, with organic solvents or by other known methods for concentrating protein solutions. Preparation of SAM 30 ml of clumped Sepharose gel was activated with cyanogen bromide or by another known method for binding proteins to polysaccharide gel matrices. 4 ml of a solution of the specific enzyme purified as above and containing approx. 100 mg of protein was added to the activated gel. The suspension of activated gel and enzyme solution was stirred at 4°C for 18 hours. The resin was washed with water. The washing liquid contained approx. 70% of the total enzymatic activity originally present in the solution of the specific enzyme. When incubating Sepharose prepared as indicated above with the method indicated above for determining the synthetase activity, it was observed that approx. 20% of the total activity is bound to the polysaccharide. Sepharose prepared as above was used to pack a column with a diameter of 1.5 cm and a height of 20 cm. A solution containing 0.675 M triethanolamine, 0.150 M magnesium sulfate, 0.05 M ATP, 0.05 M M-methionine and 0.01 M KCl was passed through the column at a rate of 5 ml per minute. hour at a temperature of 25 - 27° C. The eluate from the column was analyzed for SAM content and showed that the conversion was 30%. ;Preparation of double salts of SAM with sulfuric acid and p-toluene-sulfonic acid ;103 ml of eluate containing 6 g/liter of SAM was acidified with I^SO^ to pH 3, and to this solution was added with stirring a solution of 2, 3 g of picrolonic acid in 25 ml of methyl ethyl ketone. After standing overnight, the precipitate was filtered off and washed with water. The precipitate was redissolved in 18 ml of 0.1 N solution of H 2 SO 4 and p-toluenesulfonic acid, and in 18 ml of methyl ethyl ketone. ;After stirring and standing, the organic layer separated, ;and the aqueous layer was treated with a small amount of methyl ethyl ketone to remove the last traces of picrolonic acid. After separation of the aqueous layer, decolorizing bone charcoal was added and the mixture was filtered. 16.5 ml of aqueous colorless solution was obtained, which contained 33.8 g/liter of SAM, which corresponded to 90% of the SAM present in the original solution. By thin-layer chromatographic analysis, the solution was particularly found to contain only SAM. 16.5 ml of the solution was poured into 100 ml of acetone. After stirring and standing, the liquid was separated by decantation. The solid material was dissolved in 6.6 g of a 15% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol. After addition of decolorizing bone charcoal and filtration, the solution was poured into 25 ml of ethyl ether. The solution was filtered after standing and the crystalline salt weighed 0.967 g and had the composition: ;SAM<+>. HS04~. H2SO4. CH3<C>gH4SO3H. ;Analysis: Calculated for C22<H>3<4>^16<N>6^4;C 34.46%, H 4.47%, N 10.96%, S 16.72% ;Found : C 33 .68%, H 4.65%, N 10.8 S 16.5% ;SAM<+>50.5%, H20 2.1%, H2S04 25.3% p-toluenesulfonic acid 21.7% ;The ultraviolet spectrum showed a maximum at 260 nm, E^ 1%cm<=><1>79. By means of the method but by using 3.3 g of a 15% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol in the subsequent precipitation step and use. 25 ml of ethyl ether, was obtained. 1.18 gave the salt SAM+. H2S04.2CH3CgH4S03H with the same characteristics as the product according to example 1. For some years it has been known from biochemical research that SAM is the only specific donor of methyl groups in living organisms for the biochemical reactions for the transfer of the CH3 group, which are fundamental reactions in the lipid, protein and glucose metabolism. In what follows, some of the most important SAM-dependent transmethylation reactions are indicated: a'l N-transmethylation: adenine, carnitine, carnosine, creatine, 2,6-diaminopyrine, adrenaline, guanine, hordenine, N'-nicotinamide, phosphatidylcholine, ricinin, - bl O-transmethylation: N-acetylserotonin, dopamine, epinine, d-adrenaline, 1-adrenaline, ergosterol, 1-noradrenaline, pectin, ubliquinone, c) S-transmethylation: 2,3-dimercaptopropanol, H2S, methionine, methylmercaptan, S-mercaptopropionic acid, S-mercaptoethanol, ;thiopyrimidine, thiouracil, ;dl C-transmethylation: cytosine, thymine. With regard to the human organism, this means that SAM acts in the following metabolic processes: biosynthesis of choline, biosynthesis of phosphatidylcholine, activity of enzymes requiring SH groups, metabolism of catecholamines, metabolism of biogenic centroenkephalin amines, metabolism of serotonin, metabolism of histamine, metabolism of vitamin B12 and folic acid, metabolism of creatine, metabolism of myosin, metabolism of histones, metabolism of RNA, metabolism of DNA, metabolism of protein substances, metabolism of certain hormones by cyclopentane-perhydrophenanthrene nuclei - the most important of these is estrogens - metabolism of triglycerides. It has also been known for some time that SAM, when it is then methylated by methyltransferase enzymes, is transferred to S-adenosylhomo-cysteine (SAO) which is an indirect donor of hydrosulfide groups and thus plays an important role in the metabolism of all compounds that requires SH groups to be able to carry out the biological activity. Particularly important among these are certain thioenzymes and sulphurised amino acids. ;SAO is decarboxylated in turn in the organism, and the decarboxylated product is the principal donor of the aminopropyl group, which, according to the latest biochemical theory, is indispensable for the biosynthesis of polyamines. The process is catalyzed by several enzymes, among which a specific one is aminopropyl transferase. One can conclude that it is known that SAM in the human organism is closely connected with all biochemical reactions of: A - transmethylation (specific donor of the CH^ group) B - transsulfuration (specific donor of the SH group) ;C - transaminopropylation (specific donor of the aminopropyl group) ; This knowledge could lead to the conclusion that SAM could have a therapeutic effect in the treatment of pathological conditions associated with deficiency states in the organism with regard to the individual of the many products indicated above. However, the great instability of SAM and the lack of methods to make it stable for a sufficient time under normal ambient conditions have prevented this product from being pharmacologically or clinically tested and thus prevented it from finding a practical application for it in human therapy . Only after the production of the new SAM salts according to the present invention, salts which in practice are infinitely stable at ambient temperature, has it been possible to carry out a systematic pharmacological and clinical investigation which has led to the rediscovery of the new salts having therapeutic properties which are completely surprising in terms of quality and intensity. From the large amount of pharmacological and clinical data collected for this new product, only a few examples will be given here sufficient to clearly indicate the essential characteristics of the new product and its main use in human therapy. ;In the pharmacological and clinical data, for the sake of simplicity, the abbreviation SAM is indicated for the salt SAM<+>. HS04~. H2SO4. 2CH3CgH4SO3H. ;The administered quantities are also always of SAM.HS04. H2S04.2C<H>3<C>g<H>4S03H. However, the given data also apply to the other double salt. Toxicity - The co-salt according to the invention has been shown to be absolutely free of acute toxicity, chronic toxicity, local intolerance and side effects. DL501 mice are greater than 6 g/kg/os and 2.5 g/kg/i.p. ;Tolerance and toxicity tests were performed on Wlstar and Sprague-Dowley strain rats administered at 10 - 20 mg/kg. per day for 12 months, and after the end of treatment the various organs and systems showed no pathological changes. ;Teratogenesis tests were performed on rabbits and rats: ;even with the administration of massive doses of SAM, approx. 10 times the maximum therapeutic dose, no teratogenic effects or any malformations in the fetus or in the fully developed fetus were observed. Addition of doses up to 0.1 - 0.2 mg/ml of the product in living cultures of human lymphocytes or liver cells from mice causes no changes in the blasticising index of the cellular elements. Intravenous administration in doses up to 40 kg/kg produced no pyrogenic rashes in the rabbits. ;Venous administration in rabbits and cats at 40 mg/kg caused no change in cardiac pressure, heart and respiratory rate or the ECG curve. ;The local tolerance by intramuscular injection, even after administrations repeated over 180 days, and by intravenous injection into the marginal tissue of the auricular pavilion in rabbits, is excellent. ;In young healthy people of both sexes who were subjected to administration by the rapid intravenous method or by phleboclysis of doses of SAM 10 - 300 mg/kg (average weight 70 kg), on simultaneous examination of the minimum and maximum pressure of the pulse and respiratory rate at 1, 5, 15, 20, 30, 60 minutes and at 2, 3, 6, 8, 10, 12, 24 hours from the end of administration no variation from normal values was observed. ;The ECG curve showed a variation in the PQ interval, ST segment, or no presence of extrasystole or other changes at 30sec, 1, 2, 3, 5, 10 and 20 minutes from administration. In the haemopoietic system and in liver and kidney activity, no statistically significant variations from normal were observed. ;Pharmacology ;It should be repeated that when the following description talks about the administration of SAM, it is understood that the following has been administered: SAM<+>. HS<0>4~. H 2 SO 4 . 2 CH 3 C 6 H 4 SO 3 H and/or SAM<+. >HS04'. H2SO4. CH3C6H4SO3H. In order to determine indicatively how SAM is distributed in the tissues, S-adenosylmethionine (methyl C"^) was prepared. The distribution of this product in rats was investigated by administering a dose of 10 mg/kg/e.v equal to 24 jjci of radioactive product. The specific activity of the product was 58 mCi/m mol. In parallel with this, an autoradiographic examination was carried out on mice. The results of these two experiments show that SAM is distributed very quickly to all tissues. The following table lists data for each of the affected organs: ;Distribution of SAM in rat tissue. ;The values are expressed in yg/g. ; ;It was consequently determined that the new salts according to the present invention release the CH3~ group to all tissues equipped with methyltransferase activity. In other words, the new compounds of the invention are capable of selectively localizing themselves in all organs equipped with methyltransferase systems. This was established by successive pharmacological tests. A series of tests carried out on rats r is shown by the fact that the new compounds exhibit a significant protective and healing effect of liver steatosis in the hyperlipid-hyperprotein diet according to Handler, in steatosis in acute alcohol intoxication and in other toxic agents (carbon tetrachloride, bromobenzene etc.) when administering only 15 mg/ kg/ip, both morphohistochemically and analytically, as SAM significantly reduces the accumulation of lipids at the hepatocidal level while favoring the rebuilding of normal levels of phospholipids reduced after intoxication with CC14-; Hepatic phospholipids in rats after intoxication with CCI4 and treatment with SAM. ; Values are the mean + E.S. of 10 values for each group. When investigating the hepatoprotective protective activity, an experimental device was used which induces in the rats the so-called hepatic cholesterol degeneration (Ridout and Coll., Biochem. J.52, 99, 1952). In this method, a recalling increase in the total hepatic fat and hepatic cholesterol in the animals is achieved with the help of a suitable diet. Compounds that act in the lipid metabolism reduce or cancel this increase. The animals were divided into six groups. The first group was administered a diet that was varied at will. The second group was administered with the Ridout basic diet (20 g per rat per day), the other groups were administered with the same diet in the same dose but enriched with cholesterol in an amount of 0.2 g/rat/day. The treatment lasted for 3 weeks. ;Groups 4, 5 and 6 were administered with SAM in the following doses: 1, 2, 5 mg/kg/i.p. per day ;After 3 weeks all the animals were sacrificed, the liver was removed and total fat (Best and Coll., Biochem. J.40, 368, 1966) and cholesterol (Sperry and Brand, J. Biol. Chem. 150, 315, 1943 ) was determined. The results showed that the groups that were subjected to treatment with SAM in doses of 1 - 2 mg/kg/i.p. was only slightly protected, while the group treated with 5 mg/kg/i.p. was completely protected. ;Hepatic cholesterol and total fat after the end of the trial (average per, group) : ; Other pharmacological areas of action were the anti-inflammatory effect and analgesic effect exhibited by SAM. Of the various tests, the most classic should be mentioned, namely edema induced by carrageenan and egg white as a test for acute inflammation, and granuloma induced by cotton pellets and arthritis as a test for chronic inflammation. In all cases, SAM was active both when administered orally (dose between 20 and 100 mg/kg) and parenterally (dose between 10 and 20 mg/kg) in comparison with other known pharmaceutical products (Ibuprofen - indomethacin). The analgesic tests were the hot plate test and the stretch test induced by acetic acid, and the Randal and Selitto tests performed on rats. The new product proved to be active in these tests in comparison with known pharmaceutical products. A further area of pharmacological action was the possible effect of SAM on sleep time induced by barbiturates. For this purpose, one experiment was carried out in which groups of mice received hexobarbital at a dose of 80 mg/kg/i.p. according to the method described by Holten and Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol. 1956, 12, 346), one group was the control group and the other group received SAM at a dose of 10 mg/kg/i.p. ; As can be seen from the above data, SAM exhibits an activity with respect to prolonging the sleep time induced by hexobarbital. ;Clinical tests ;Where in the following, administration of SAM is indicated, this indicates administration of SAM<+. >HS04~.2CH3CgH4S03H and/or SAM+. HS04". H2S04CH3CgH4S03H. ;Following the indications obtained from the pharmacological tests, the clinical tests were aimed at morbid conditions where the following appeared to be primarily or secondarily altered: ;1 - metabolism of lipids ;2 - metabolism of proteins and glucids ;3 - metabolism of catecholamines and biogenic amines. ;1. From tests performed clinically on several hundred patients using doses of SAM varying over a wide range, it was found that the new compound induced a rapid drop in liver lipids in hepatosteatosis of varying pathogenesis ,, which could be identified by biopsy examination at the end of the treatment cycle, even after 60 days from the end of treatment. ;Administration of the product also caused a marked drop in the high values of total cholesterolemia, of hypertriglyceridemia and a normalization of altered 3/a-lipoprotein ratios in patients with hyperdialipidemia in an uncompensated state.This hypo ;This hypocholesterol-lowering and hypolipid-lowering effect ning was also established even in doses of 20 - 30 mg administered 2-3 times per day, and is proportional to the dose. ;In pure arteriosclerosis with clinical manifestations of the psycho-affective area, in turbemnesis and secondary centroence-phalics (weakening in arteriosclerotic encephalopathy) and signs of cerebral hypoxia, the administration of SAM intramuscularly or in more severe cases, by intravenous injection or by slow phleboclysis , in doses between 20 and 40 mg 3 to 4 times per day, showed a very beneficial modification of the symptomatology. ;Especially in purely hypoxydotic conditions, many regained vital functions very quickly and statistically significantly. In post-apoplectic syndromes, a faster reconstruction of the clinical system was found. ;2. A clinical treatment was carried out with several hundred patients who were affected by: secondary hypoprotidiemia and dysproti-demia, persistent or aggressive hepatopathies, pre-cirrhotic or cirrhotic conditions, malabsorption syndromes, protein-splitting syndromes. The administration of doses varying between 20 and 200 mg of SAM per day intramuscularly or intravenously or orally, depending on the state of the disease, causes a statistically significant (increase in the total proteinemia, an increase in the albumin ratio and a tendency to normalize the altered percentage ratios between the electrophoretic fractions, in the serum. This protein-building activity has often been followed by a very significant improvement in the subjective symptoms and the general objective conditions. ;,3. Particularly surprising results were obtained in the clinical application of the new enzymatic salt according to the invention, where there were weakened systems which are clearly connected with modifications in the exchange of biogenic amines, e.g.: ;a) pathological systems with neuropsychiatric relevance, ;b) Parkinson's disease and Parkinsonism of varying eziopathogenes, c) Antiphlogistic and analgesic effect in the treatment of osteo-arthritis, and analgesic activity in certain neurological manifestations, ;d) disturbances of the sleep rhythm. With regard to point a), an extensive case study carried out by examining the clinical behavior and Hamilton and Wittenberg tests clearly showed that administration of doses varying between 20 and 50 mg of SAM 3-4 times per day during 5 - 15 days, without any other form of therapy, induces a significant remission of the main parameters taken into account in the diagnosis of depressive forms. With regard to point b) regarding the treatment of Parkinson's disease and Parkinsonism, it has been found that: Administration of SAM in doses of 10 - 40 mg per day intramuscularly or intravenously, or orally, all depending on the state of the disease, together with the usual therapy with Levodopa, gives rise to a statistically more significant improvement in akinesia and rigidity compared to what is achieved in patients treated only with Levodopa. Favorable modifications were also found in Parkinson's tremors, which cannot be modified with Levodopa alone. ;Administration of SAM significantly improves the Levodopa-dependent psychological imbalance, particularly with regard to depressive states and psychological manifestations of an irritative type. Administration of SAM in the doses indicated above significantly blocks side effects of Levodopa in various organs and systems, particularly with regard to nausea, vomit, reduced appetite, hypotension, asthenia, cephalea, hypersudoration. and insomnia. With regard to point c), pharmacological results have shown that SAM has a significant antiphlogistic and analgesic activity, and has been shown to be active in all osteoarthritis forms treated with a dose of 30 mg twice per day. day intramuscularly or intravenously and 30 - 50 mg orally 4 times per day. ;After only 7 days of treatment, the muscular spasms, ;motion limitation, localized pain and stiffness were influenced significantly to placebo. No case of gastric pyrosis was observed in the 90 cases treated. Examination of occult blood in faeces showed no modification during treatment. Compared with a non-steroidal antiphlogistic drug commonly used in a double-blind study, SAM showed a therapeutic efficacy similar to indomethacin. ;The analgesic activity of SAM was also investigated in different patients with different neurological conditions: neuritis, polyneuritis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torti-collis. ;The therapeutic effect was achieved from the first day of administration of a dose of 15 mg twice per day. day intramuscularly or 30 - 50 mg 3 - 4 times per day orally. ;Analogous results were obtained in patients with recurrent and resistant cephalalgia with the administration of the drug orally in chewable tablets. With regard to point c), i.e. disturbances of the sleep-wake rhythm, especially with regard to insomnia, the new product according to the invention is capable of significantly improving the changed sleep-wake- conditions by inducing physiological sleep without having to use barbiturates or other compounds with cortical and centroencephalic depressant effects. As can be seen from the above, new and wide perspectives are opened up within human therapy. The application areas that have already been mapped are: treatment of hepatopiase, hyperdyslipidemia, widespread or local arteriosclerosis, psychiatric manifestations of a depressive and neurological type, degenerative arthropathies, neurological pain manifestations and disturbances of the sleep-wake rhythm, while many other application areas still need to be are examined and mapped. ;The new SAM salts are preferably administered intramuscularly or intravenously, or in oral or sublingual tablets, ;or in capsules. ;The therapeutic dose of SAM is between 5 and 300 mg per day, depending on the particular type and condition of the disease. Larger doses can be used if necessary because the salts according to the invention are absolutely free of toxicity.*

Claims

Process for the preparation of double salts of S-adenosyl-L-methionine (SAM) with structural formula

where n = 1 or 2, characterized by a) a concentrated solution of SAM is prepared, b) SAM present in the solution is precipitated by acidification with a solution of picrolic acid in water or in an organic solvent that is soluble in water, c) SAM picrolonate is dissolved in a mixture consisting of equal parts by volume of an organic solvent that is partially miscible with water, and of an aqueous solution consisting of sulfuric acid — and p-toluenesulfonic acid with equal normalities of between 0.05 and 0.2, d) the SAM salt is precipitated from the aqueous layer by adding 4 - 8 volumes, relative to the aqueous solution, of an organic solvent selected from the group consisting of acetone, methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, e) the precipitated salt is dissolved in a 10 - 20% solution of p-toluenesulfonic acid in methanol, f) the double salt of the formula SAM<+.>HS04".H2S04.2CH3C6H4S03H is precipitated with an organic solvent when the minimum required amount of methanol is used in tr into e), while the double salt of the formula SAM<+>.HS04~.H2S04.CH3CgH4S03H is precipitated when a large excess of methanol is used in step e).