NL9002779A - Viraal middel. - Google Patents

Description

Titel: Viraal middel.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de isolering en karakterisering van het virale middel dat verantwoordelijk is voor post-transfusie niet-A niet-B hepatitis (PT-NANBH) en in het bijzonder op PT-NANBH virale polypeptiden, DNA-volgorden die voor dergelijke virale polypeptiden coderen, expressievectoren die dergelijke DNA-volgorden bevatten en gastheercellen die door dergelijke expressievectoren zijn getransformeerd. De onderhavige uitvinding heeft tevens betrekking op de toepassing van een DNA-volgorde in een kernzuur hybridisatiebepaling voor de diagnose van PT-NANBH. De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op de toepassing van PT-NANBH virale polypeptiden of polyklona-le of monoklonale antilichamen tegen dergelijke polypeptiden in een immune bepaling voor de diagnose van PT-NANBH of in een vaccin voor de preventie daarvan.

Niet-A niet-B hepatitis (NANBH) is volgens definitie een diagnose door uitsluiting en wordt algemeen toegepast ter omschrijving van gevallen van virale hepatitis-infectie bij mensen die niet te wijten zijn aan hepatitis A- of B-virussen. In de meerderheid van dergelijke gevallen is de oorzaak van de infectie niet geïdentificeerd hoewel op klinische en epidemiologische gronden gedacht wordt dat een aantal stoffen verantwoordelijk is zoals samengevat in Shih et al. (Prog. Liver Dis., 1986, 8, 433 - 452). Alleen al in de USA kan tot 10% van bloedtransfusies aanleiding geven tot NANBH waardoor dit een significant probleem wordt.

Zelfs voor PT-NANBH zijn er tenminste verschillende virale middelen die voor de infectie verantwoordelijk zijn en gedurende de jaren heeft men meermalen beweerd het middel te hebben geïdentificeerd, maar dit is in geen van de gevallen bevestigd.

De Europese octrooiaanvrage 88310922.5 betreft de beschrijving van de isolering en karakterisering van het etiologische middel dat ver antwoordelijk is voor PT-NANBH, dat in de aanvrage tevens wordt aangeduid als hepatitis C-virus (HCV). Er werd uit viraal kernzuur verkregen uit de chimpansee geïnfecteerd met PT-NANBH een cDNA-bibliotheek samengesteld, die werd uitgeselecteerd met behulp van humane anti-sera. Er werd een aantal positieve klonen geïsoleerd en de volgorde daarvan bepaald, De resulterende kernzuur- en aminezuurvolgordegegevens, die in de aanvrage zijn beschreven, stellen bij benadering 70% van het lOkb virale genoom voor en zijn geheel afgeleid van het 3'-uiteinde daarvan dat overeenkomt met het niet-structürele coderingsgebied.

Er zijn nu PT-NANBH virale polypeptiden geïsoleerd en gekarakteriseerd door het klonen en tot expressie brengen van DNA-volgorden die voor dergelijke virale polypeptiden coderen. Verrassenderwijze tonen zowel de kernzuur- als aminozuurvolgordegegevens aanzienlijke verschillen met de overeenkomstige gegevens opgègeven in de Europese octrooiaanvrage 88310922.5. In het algemeen bedragen deze verschillen tot ongeveer 20% op het kernzuurniveau en ongeveer 15% op het aminozuurniveau maar. sommige gebieden van dé volgorden tonen zelfs nog grotere verschillen. Het totale niveau van het verschil is veel groter dan men van twee isolaten van hetzelfde virus zou verwachten zelfs indien men geografische factoren in aanmerking neemt, en er wordt aangenomen dat dit aan éën van twee mogelijke oorzaken te wijten is.

In de eerste plaats zijn volgens de onderhavige aanvrage en de voornoemde Europese octrooiaanvrage verschillende bronnen voor het kernzuur bij de cDNA-klonering toegepast. In het bijzonder beschrijft de Europese octrooiaanvrage de toepassing van chimpansee-plasma als bron voor het virale kernzuuruitgangsmateriaal, waarbij het virus in twee gevallen door een chimpansee is gepasseerd. PT-NANBH is uiteraard een humane ziekte en de passage van het virus door een vreemde gastheer, zelfs indien deze nauw verwant is met mensen, zal meestal tot een intensieve mutatie van het virale kernzuur leiden. Bijgevolg behoeven de volgorde-gegevens in de Europese octrooiaanvrage 88310922.5 niet getrouw representatief te zijn voor het actuele virale middel dat voor PT-NANBH bij mensen verantwoordelijk is. In tegenstelling daarmede is volgens de onderhavige aanvrage gebruik gemaakt van viraal kernzuur uit een humane plasmabron als uitgangsmateriaal voor cDNA-klonering. Het is aldus veel meer waarschijnlijk dat de aldus verkregen volgordegegevens overeenkomen met de natieve kernzuur- en aminozuurvolgorden van PT-NANBH.

In de tweede plaats kan het virale middel in meer dan één subtype bestaan en de volgordegegevens, beschreven in de Europese octrooiaanvrage, en die welke in de onderhavige uitvinding zijn toegelicht, komen overeen met afzonderlijke en duidelijk verschillende sub-typen van hetzelfde virale middel. Anderszins kan het mogelijk zijn dat het niveauverschil tussen de twee stellen volgordegegevens ontstaat door een combinatie van deze twee factoren.

De onderhavige uitvinding voorziet in een PT-NANBH viraal poly-peptide met een antigeen dat een aminozuurvolgorde bezit die voor tenminste 90% homoloog is met de aminozuurvolgorde als aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, of een antigeen fragment daarvan is.

SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22 geven de aminozuurvolgorde aan zoals die is afgeleid uit de kernzuurvolgorde. Bij voorkeur is de aminozuurvolgorde tenminste voor 95% of zelfs 98% homoloog met de aminozuurvolgorde aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22. Naar keuze kan het antigeen met een heteroloog polypeptide zijn gefuseerd.

Men kan naar keuze twee of meer antigenen tezamen toepassen hetzij in combinatie of gefuseerd als enkel polypeptide. Door op deze wijze twee of meer antigenen in een diagnostische bepaling toe te passen verkrijgt men meer betrouwbare resultaten bij de toepassing van de bepaling op bloedonderzoek voor PT-NANBH-virus. Bij voorkeur is één antigeen verkregen uit het structurele coderingsgebied (5*-uiteinde) en één ander antigeen uit het niet-structurele coderingsgebied (3'-uiteinde). Het heeft bijzondere voorkeur dat antigenen als een recombinant polypeptide worden gefuseerd. Door deze laatste aanpak verkrijgt men een aantal voordelen doordat de individuele antigenen in een vaste, vooraf bepaalde verhouding (gewoonlijk equimolair) kunnen worden gecombineerd en men alleen een enkel polypeptide behoeft te produceren, te zuiveren en te karakteriseren.

Een antigeen-fragment van een antigeen met een aminozuurvolgorde die tenminste voor 90% homoloog is met die aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22 bevat bij voorkeur minimaal vijf, zes, zeven, acht, negen of tien, vijftien, twintig, dertig, veertig of vijftig aminozuren. De antigene plaatsen van dergelijke antigenen kunnen met standaardprocedures worden geïdentificeerd. Deze betreffen onder andere fragmentering van het polypeptide zelf met behulp van proteolytische enzymen of chemische middelen en het daarna bepalen van het vermogen van elk fragment zich te binden aan antilichamën of een immuunreactie op te wekken bij inoculatie in een dier of geschikt in vitro modelsysteem (Strohmaier et al., J. Gen. Virol., 1982, 59, 205-306). Naar keuze kan hét DNA dat codeert voor het polypeptide worden gefragmenteerd door restrictie-enzymsplijting of door andere welbekende technieken en daarna in het expressiesysteem worden ingevoerd om fragmenten te produceren (naar keuze gefuxeerd aan een polypeptide dat gewoonlijk van bacteriële oorsprong is). De resulterende fragmenten worden geanalyseerd als reeds eerder beschreven (Spence et al., J. Gen. Virol., 1989, 70, 2843-51;

Smith et al., Gene, 1984, 29, 263-9). Een andere aanpak is de chemische synthese van korte peptidefragmenten (3 - 20 aminozuren lang; gewoonlijk 6 aminozuren lang) die de gehele volgorde van het volledige polypeptide bestrijken waarbij elk polypeptide het aangrenzende polypeptide overlapt. (Deze overlapping kan 1 - 10 aminozuren bedragen maar is ideaal n-1 aminozuren, waarin n de lengte van het peptide is; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 3998 - 4002.) Elk peptide wordt als eerder beschreven geanalyseerd met uitzondering dat het peptide gewoonlijk eerst wordt gekoppeld aan een bepaald dragemolecuul om de inductie van een immuunreactie te vergemakkelijken. Tenslotte zijn er voorspellende methoden die analyse van de volgorde op bepaalde bijzonderheden, b.v. hydrofiliciteit, waarvan men aanneemt dat ze met immunologisch belangrijke plaatsen zijn verbonden inhouden (Hopp en Woods, Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, 78, 1824-8; Berzofsky, Science, 1985, 229, 932-40). Deze voorspellingen kunnen dan worden getest met behulp van de recombinant-polypeptide of peptide-benaderingen als eerder beschreven.

Bij voorkeur wordt het virale polypeptide in zuivere vorm geleverd, d.w.z. meer dan 90% of zelfs 95% zuiverheid.

Het PT-NANBH virale polypeptide van de onderhavige uitvinding kan worden verkregen met behulp van een aminozuursynthese-inrichting, indien het een antigeen betreft met niet meer dan ongeveer dertig residuen, of door recombinant-DNA-technologie.

De onderhavige uitvinding voorziet tevens in DNA-volgorden die coderen voor een PT-NANBH viraal polypeptide als hierin gedefinieerd.

De DNA-volgorde van de onderhavige uitvinding kan synthetisch of gekloneerd zijn. Bij voorkeur is de DNA-volgorde als aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22.

Om een PT-NANBH viraal polypeptide met meervoudige antigenen in handen te krijgen heeft het de voorkeur de individuele coderende volgorden te fuseren in een enkel open afleeskader. De fusie dient uiteraard zodanig te worden uitgevoerd dat de antigene activiteit van elk antigeen niet significant wordt verslechterd door zijn relatieve plaats ten opzichte van een ander antigeen. Men dient uiteraard bijzonder te letten op de aard van de volgorden bij de actuele kruispunten tussen de antigenen. De methoden volgens welke enkele polypeptiden verkregen kunnen worden zijn in de techniek welbekend.

De onderhavige uitvinding voorziet tevens in een expressievector die een DNA-volgorde als hierin gedefinieerd, bevat en die in staat is in een geschikte gastheer de DNA-volgorde tot expressie te brengen ter verkrijging van een PT-NANBH viraal polypeptide.

De expressievector bevat normaal controle-elementen van DNA die de expressie van de DNA-volgorde in een geschikte gastheer bewerkstelligen. Deze elementen kunnen afhankelijk van de gastheer variëren maar omvatten gewoonlijk een promotor, ribosoombindingplaats, translatie starten stopplaatsen, en een transcriptie-terminatieplaats. Voorbeelden van dergelijke vectoren omvatten plasmiden en virussen. Expressievectoren volgens de onderhavige uitvinding omvatten zowel extra chromosomale vectoren als vectoren die in het chromosoom van de gastheercel zijn geïntegreerd. Voor toepassing in E. coli kan de expressievector de DNA-volgorde van de onderhavige uitvinding naar keuze als een fusie gekoppeld aan hetzij het 5'- of 3'-uiteinde van de DNA-volgorde die b.v. codeert voor /3-galactosidase of aan het 3'-uiteinde van de DNA-volgorde die b.v. codeert voor het trp E-gen bevatten. Voor toepassing in het insecten bacu-lovirus (AcNPV)-systeem wordt de DNA-volgorde naar keuze gefuseerd aan de polyhedrine-coderingsvolgorde.

De onderhavige uitvinding voorziet tevens in een gastheercel getransformeerd met een als hierin gedefinieerde expressievector.

Voorbeelden van gastheercellen ten gebruike in de onderhavige uitvinding^ omvatten prokaryotische en eukaryotische cellen, zoals bac-teriële, gist-, zoogdier- en insectencellen. Bijzondere voorbeelden van dergelijke cellen zijn E, coli, S. cerevisiae, P. pastoris, Chinese hamster ovariumcellen en muizecellen, en Spodoptera frugiperda en Tricoplusia ni. De keuze van de gastheercel hangt meestal af van een aantal factoren maar indien post-translatiemodificatie van het PT-NANBH virale polypeptide belangrijk is, dan geeft men de voorkeur aan een eukaryotische gastheer.

De onderhavige uitvinding voorziet tevens in een werkwijze voor het bereiden van PT-NANBH viraal polypeptide omvattende het kloneren of synthetiseren van een DNA-volgorde die codeert voor PT-NANBH viraal polypeptide, als hierin gedefinieerd, het zodanig in een expressievector inbrengen van de DNA-volgorde dat de laatste in een geschikte gastheer tot expressie kan worden gebracht, het transformeren van een gastheercel met de expressievector, het kweken van de getransformeerde gastheercel en het isoleren van het virale polypeptide.

Het kloneren van de DNA-volgorde kan met standaardprocedures die in de techniek bekend zijn, worden uitgevoerd. Het is echter bijzonder voordelig in dergelijke procedures gebruik te maken van de hierin beschreven volgordegegevens teneinde de identificatie en de isolering van de gewenste gekloneerde DNA-volgorden te vergemakkelijken. Het RNA wordt bij voorkeur geïsoleerd door het virus uit plasma van geïnfecteerde mensen, geïdentificeerd door betrokkenheid in de overdracht van PT-NANBH te pelletiseren. Het geïsoleerde RNA wordt omgekeerd overgeschreven in cDNA met hetzij statistische of oligo-dT-instructie. Naar keuze kan het RNA aan een voorbehandelingstrap worden onderworpen om elke secundaire structuur die storend zou kunnen werken op de cDNA-synthese te verwijderen, b.v. door verhitting of reactie met methylkwik(II)hydroxyde. Het cDNA wordt gewoonlijk gemodificeerd door de additie van koppelaars gevolgd door knippen met een restrictie-enzym. Het wordt daarna in een klonerende vector ingebracht, zoals pBR322 of een derivaat daarvan, of de lambda-vectoren gtlO en gtll (Huynh et al., DNA Cloning, 1985, Band 1; A Practical Approach, Oxford,IRC Press) geschikt gepakt in virionen, waarna de resulterende recombinant DNA-moleculen worden toegepast voor de transformatie van E. coli waardoor aldus de gewenste bibliotheek wordt gevormd.

De bibliotheek kan worden uitgesorteerd met een standaard uitsor-teringsstrategie. Indien de bibliotheek een expressie-bibliotheek is, kan deze worden uitgesorteerd onder toepassing van- een immunologische methode met antisera, verkregen uit dezelfde plasmabron als het RNA-uitgangsmateriaal en tevens met antisera uit extra humane bronnen waarvan verwacht wordt dat zij positief zijn voor antilichamen tegen PT-NANBH. Aangezien humane antisera gewoonlijk antilichamen tegen E. coli bevatten, hetgeen aanleiding kan geven tot een hoge achtergrond gedurende de uitsortering, heeft het de voorkeur eerst de antisera te behandelen met niet-getransformeerd E. coli-lysaat teneinde eventuele dergelijke antilichamen te verwijderen. Het is voordelig gebruik te maken van een negatieve controle onder toepassing van antisera uit toegewezen humane donors, d.w.z. humane donors die herhaaldelijk zijn onderzocht en waarvan gebleken is dat zij geen antilichamen ten opzichte van virale hepatitis bezitten. Een andere uitsorteringsstrategie zal eruit bestaan gebruik te maken als hybridisatie-probes van een of meer gemerkte oligo-nucleotiden. De toepassing van oligonucleotiden bij het uitsorteren van een cDNA-bibliotheek is algemeen eenvoudiger en betrouwbaarder dan uitsorteren met antisera. De oligonucleotiden worden bij voorkeur gesynthetiseerd onder toepassing van de hierin vermelde DNA-volgorde-informatie. Een of meer extra uitsorteringsronden van het ene of het andere type kunnen worden uitgevoerd om positieve klonen te karakteriseren en identificeren.

Nadat men een eerste positieve kloon heeft geïdentificeerd kan de bibliotheek opnieuw worden uitgesorteerd op aan vullende positieve klonen onder toepassing van de eerste kloon als een hybridisatieprobe. Naar keuze of tevens, kunnen verdere bibliotheken worden samengesteld en deze kunnen worden uitgeselecteerd onder toepassing van immunoselec-ties of hybridisatieprobes. Op deze wijze kunnen verdere DNA-volgorden worden verkregen.

Naar keuze kan de DNA-volgorde die codeert voor PT-NANBH viraal polypeptide worden gesynthetiseerd onder toepassing van standaardprocedures en dit kan onder bepaalde omstandigheden de voorkeur hebben boven het kloneren van het DNA (Gait, Oligonucleotlde Synthesis; A Practical Aproach, 1984, Oxford, IRL Press).

Aldus kan de gewenste DNA-volgorde, gekloneerd of gesynthetiseerd, in een expressievector worden ingebracht met behulp van bekende en standaardtechnieken. De expressievector wordt normaal geknipt met restrictie-enzymen en de DNA-volgorde ingebracht door uiteinde- of verschoven uiteinde-ligatie. De knip wordt gewoonlijk aangebracht bij een restrictieplek op een geschikte plaats in de restrictievector en wel zodanig, dat wanneer eenmaal ingébracht de DNA-volgorde onder controle staat van de functionele elementen van het DNA die de expressie daarvan bewerkstelligen.

Transformatie van een gastheercel kan met standaardtechnieken worden uitgevoerd. Een bepaald fenotype merkstof wordt gewoonlijk toegepast om een onderscheid te maken tussen de transformanten die met succes de expressievector hebben opgenomen en die welke dat niet hebben gedaan. Het kweken van de getransformeerde gastheercel en de isolering van het PT-NANBH virale polypeptide kan tevens met standaardtechnieken worden uitgevoerd.

Antilichaam-specifiek ten opzichte van een PT-NANBH viraal polypeptide van de onderhavige uitvinding kan onder toepassing van het polypeptide worden gevormd. Het antilichaam kan polyklonaal of monoklonaal zijn. Het antilichaam kan worden gebruikt voor het kwaliteitscontrole-onderzoek van partijen PT-NANBH viraal polypeptide; de zuivering van PT-NANBH viraal polypeptide of viraal lysaat; epitoop in kaart brengen; wanneer gemerkt als een conjugaat in een concurrerend type bepaling, voor antilichaambepaling; en in antigeen detectiebepalingen.

Men kan een polyklonaal antilichaam tegen een PT-NANBH viraal po-lypeptide van de onderhavige uitvinding verkrijgen door een PT-NANBH viraal polypeptide naar keuze gekoppeld aan een drager in een zoogdier, zoals een muis, rat, schaap of konijn, te injecteren om een immuunreac-tie op te wekken en het aldus geproduceerde antilichaam te winnen. Het PT-NANBH virale polypeptide wordt algemeen toegediend in de vorm van een injecteerbare formulering, waarin het polypeptide met een fysiologisch aanvaardbare verdunner wordt gemengd. Adjuvantia, zoals Freund's complete adjuvans (FCA) of Freund's incomplete adjuvans (FIA), kunnen in de formulering worden opgenomen. De formulering wordt normaal gedurende een geschikte tijdsperiode in de gastheer geïnjecteerd, waarbij plasma-monsters op geschikte intervallen worden genomen voor de bepaling op anti-PT-NANBH viraal antilichaam. Wanneer een geschikt niveau van activiteit is verkregen, wordt van de gastheer bloed afgetapt. Antilichaam wordt daarna geëxtraheerd en gezuiverd uit het bloedplasma met behulp van standaardprocedures, b.v. proteïne A- of ionenuitwisselingschroma-tografie.

Men kan een monoklonaal antilichaam tegen een PT-NANBH viraal polypeptide volgens de onderhavige uitvinding verkrijgen door cellen van een immortaliserende cellijn te fixeren met cellen die antilichamen tegen het virale polypeptide produceren en de gefuseerde geïmmortaliseer-de cellijn te kweken. Typerend wordt een niet-humaan zoogdier, zoals een muis of rat, met het virale polypeptide geïnoculeerd. Nadat voldoende tijd is verlopen tot de gastheer een antilichaamreactie heeft opgebouwd, worden antilichaam producerende cellen zoals de splenocyten, verwijderd. Cellen van een geïmmortaliseerde cellijn, zoals een muize-of rattemyelomacellijn, worden met de antilichaam producerende cellen gefuseerd en de resulterende fusies uitgeselecteerd om een cellijn te identificeren, zoals een hybridoma, die het gewenste monoklonale antilichaam afscheidt. De gefuseerde cellijn kan worden gekweekt en het monoklonale antilichaam uit de kweekmedia worden gezuiverd op soortgelijke wijze als de zuivering van polyklonaal antilichaam.

Diagnostische bepalingen, gebaseerd op de onderhavige uitvinding, zijn geschikt ter vaststelling van de al dan niet aanwezigheid van PT-NANBH-infectie. Zij zijn ook geschikt voor het volgen van de behandeling van een dergelijke infectie, b.v. tijdens interferon-therapie.

Bij bepaling voor de diagnose van virale infectie kan men in wezen drie verschillende benaderingen aannemen nl. de detectie van viraal kern-zuur, van viraal antigeen of viraal antilichaam. Viraal kernzuur wordt algemeen als de beste indicator van de aanwezigheid van het virus zelf beschouwd en daardoor worden naar men aanneemt, ook materialen geïdentificeerd die infectueus zijn. De detectie van kernzuur is gewoonlijk ech ter niet zo direct als de detectie van antigenen of antilichamen aangezien het doelwitniveau zeer laag. Viraal antigeen wordt toegepast als een merkstof op de aanwezigheid van een virus en als indicator van infectueusheid. Afhankelijk van het virus kan de hoeveelheid antigeen die in het monster aanwezig is, zeer laag en moeilijk té detecteren zijn. Antilichaamdetectie is betrekkelijk direct omdat in feite het gastheer-immuunsysteem reactie op een infectie versterkt door grote hoeveelheden circulerend antilichaam te produceren. De aard van de antilichaamreac-tie kan dikwijls klinisch geschikt zijn, b.v. IgM- in plaats van IgG-klasse antilichamen zijn een indicatie van een recente infectie, of de reactie op een bepaald viraal antigeen kan samenhangen met het opruimen van het virus. Aldus hangt de juiste benadering die voor de diagnose van de virale infectie wordt aangenomen af van de bepaalde omstandigheden en de nagestreefde informatie. In het geval van PT-NANBH kan een diagnostische bepaling elk van deze drie benaderingen omvatten.

In een bepaling voor de diagnose van PT-NANBH waarbij de detectie van viraal kernzuur is betrokken, kan de methode bestaan uit het hybri-diseren van viraal RNA dat in een proefmonster aanwezig is, of cDNA gesynthetiseerd uit een dergelijk RNA, met een DNA-volgorde die overeenkomt met de nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, en het uitsorteren van de resulterende kernzuurhybriden om elk PT-NANBH viraal kernzuur te identificeren* De toepassing van deze methode is gewoonlijk beperkt tot een proefmonster van een geschikt weefsel, zoals een leverbiopsie, waarin het virale RNA meestal in een hoog niveau aanwezig is. De DNA-volgorde die overeenkomt met de nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22 kan de vorm aannemen van een oligonucleotide of een cDNA-volgorde die naar keuze binnen een plas-mide aanwezig is. Het uitsorteren van de kernzuurhybriden wordt bij voorkeur uitgevoerd door toepassing van een gemerkte DNA-volgorde. Men kan een of meer extra uitsorteringsronden van een of ander type uitvoeren om de hybriden verder te karakteriseren en aldus elk PT-NANBH viraal kernzuur te identificeren. De stappen van hybridisatie en uitsorteren worden volgens in de techniek bekende procedures uitgevoerd.

In verband met de beperkte toepassing van deze methode ter bepaling van viraal kernzuur, omvat een voorkeurs- en meer geschikte methode het synthetiseren van cDNA uit viraal NRA dat in het proefmonster aanwezig, het versterken van een voorgekozen DNA-volgorde die overeenkomt met een voortzetting van de nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, en het identificeren van de voorgekozen DNA-volgorde. Het proefmonster kan van elk geschikt weefsel of fysiologische vloeistof afkomstig zijn en is bij voorkeur geconcentreerd wat betreft eventueel aanwezig viraan RNA. Voorbeelden van een geschikt weefsel omvatten een leverbiopsie. Voorbeelden van geschikte fysiologische vloeistoffen omvatten urine, plasma, bloed, serum, zaad, tranen, speeksel of cerebro-spinale vloeistoffen. Voorkeursvoorbeelden zijn serum en plasma.

De synthese van cDNA wordt normaal uitgevoerd door geïnstrueerde omkeertranscriptie onder toepassing van statistische, vastgelegde of oligo-dT-instructienucleotiden. Het instructienucleotide is met voordeel een oligonucleotide dat overeenkomt met de nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22 en ontworpen ter verrijking van cDNA dat de voorgekozen volgorde bevat.

De versterking van de voorgekozen DNA-volgorde wordt bij voorkeur uitgevoerd volgens de polymerase-ketenreactie (PCR) techniek (Saiki et al., Science, 1985, 230, 1350-4). Bij deze techniek wordt eén paar instructie-oligonucleotiden toegepast waarvan er één overeenkomt met een deel van de nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22 en waarvan de ander is gelokaliseerd aan de 3'-kant van de eerste en overeenkomt met het deel van de complementaire volgorde, welk paar daartussen de voorgekozen DNA-volgorde vastlegt. De oligonucleoti-den zijn gewoonlijk tenminste 15, optimaal 20 - 26 basen lang en hoewel enkele verkeerde aanpassingen kunnen worden getolereerd door variatie van de reactieomstandigheden, dient het 3'-uiteinde van de oligonucleo-tiden perfect complementair te zijn om effectief te kunnen instrueren.

De afstand tussen 3'-uiteinden van de oligonudeotiden kan ongeveer 100 tot ongeveer 2000 basen bedragen. Het is gebruikelijk dat één van het paar van oligonudeotiden dat in deze techniek wordt toegepast, tevens wordt toegepast voor instructie van de cDNA-synthese. PCR-techniek zelf wordt aan het cDNA uitgevoerd in een enkelstrengsvorm onder toepassing van het enzym, zoals Taq-polymerase, en een overmaat van de instructie oligonudeotiden gedurende 20 - 40 kringlopen in overeenstemming met gepubliceerde protocollen (Saiki et al., Science, 1988, 239, 487 -491).

Als verfijning van deze techniek kunnen er verschillende ronden van versterking zijn, waarbij elke ronde wordt afgewerkt door een verschillend paar oligonucleotiden. Na de eerste versterkingsronde kan aldus een inwendig paar van oligonucleotiden dat een kortere DNA-volgorde vastlegt (van b.v. 50 - 500 basen lang) voor een tweede versterkingsronde worden gebruikt. In deze iets meer betrouwbare verfijning, aangeduid als "genestelde PCR", vormt uiteraard de eindversterkte DNA-volgorde de voorgekozen volgorde. (Kemp et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 86(7), 2423-7 en Mullis et al., Methods in Enzymology, 1987, 155, 335 -350).

De identificatie van de voorgekozen DNA-volgorde kan worden uitgevoerd door analyse van de PCR-produkten over agarose-gel. De aanwezigheid van een band bij het molecuulgewicht berekend voor de voorgekozen volgorde, is een positieve indicator van viraal kernzuur in het proefmonster. Andere methoden van identificatie omvatten die, gebaseerd op Southern blotting, vlek-blotting, oligomeerrestrictie en DNA-volgorde.

De onderhavige uitvinding voorziet tevens in een testkit voor detectie van PT-NANBH viraal kernzuur, welke omvat: i) een paar instructie-oligonucïeotiden waarvan er één overeenkomt met een deel van de nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, en waarvan de andere is gelokaliseerd aan de 3'-kant van de eerste en overeenkomt met een deel van de complementaire volgorde, waarbij het paar daartussen een voorgekozen DNA-volgorde vastlegt; ii) een omgekeerd transcriptase-enzym voor de synthese van cDNA uit een proefmonster RNA stroomopwaarts van het instructie-nucleotide overeenkomende met de complementaire nucleotide-volgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22; iii) een enzym dat in staat is de voorgekozen DNA-volgorde te versterken; en naar keuze iv) wasoplossingen en reactiebuffers.

Het is voordelig dat de testkit tevens een positief controlemon-ster bevat om de identificatie van viraal kernzuur te vergemakkelijken. De eigenschappen van de instructie-oligonucïeotiden en de enzymen zijn bij voorkeur als boven beschreven in saiuenhang met de PCR-techniek.

In een bepaling voor de diagnose van PT-NANBH waarbij detectie van viraal antigeen of viraal antilichaam is betrokken, kan de methode bestaan uit het in contact brengen van een proefmonster met een PT-NANBH viraal polypeptide van de onderhavige uitvinding, of een polyklo-naal of monoklonaal antilichaam tegen het polypeptide, en het vaststellen of er al dan niet een antigeen-antilichaam-binding binnen het proefmonster aanwezig is. Voor dit doel kan worden voorzien in een testkit die omvat een PT-NANBH viraal polypeptide, als hierin gedefinieerd, of een monoklonaal of polyklonaal antilichaam daarvoor, en middelen voor het bepalen of er al of niet een binding met antilichaam of antigeen, die resp. in het proefmonster aanwezig zijn, bestaan. Het proefmonster kan uit elk geschikt weefsel en fysiologische vloeistof als boven vermeld worden afgenomen voor de detectie van viraal kernzuur. Indien een fysiologische vloeistof wordt verkregen kan deze naar keuze worden geconcentreerd op eventueel aanwezig viraal antigeen of antilichaam.

Men kan diverse bepalingsformaten toepassen. Het PT-NANBH virale polypeptide kan worden gebruikt voor het selectief invangen van antilichaam ten opzichte van PT-NANBH uit de oplossing, voor het selectief merken van het reeds ingevangen antilichaam of zowel voor het invangen als merken van het antilichaam. Daarnaast kan het virale polypeptide worden toegepast in een veelvoud van homogene bepalingsformaten waarbij het antilichaam dat met het antigeen reactief is, in oplossing wordt gedetecteerd zonder afscheiding van fasen.

De typen bepalingen waarin het PT-NANBH virale polypeptide wordt toegepast voor het invangen van antilichaam uit de oplossing betreffen het immobiliseren van het polypeptide op een vast oppervlak. Dit oppervlak moet op enigerlei wijze wasbaar zijn. Voorbeelden van geschikte oppervlakken omvatten polymeren van verschillende typen (gevormd in micro-titer-putjes; kralen; dompelstaafjes van verschillende typen; aspiratie-filters; elektroden; en optische apparaten), deeltjes (b.v. latex; gestabiliseerde rode bloedcellen; bacteriële of schimmelcellen; sporen; goud of andere metallische of metaal bevattende solen; en eiwitachtige colloïden) waarbij de gebruikelijke afmeting van het deeltje 0,02 - 5 micrometer is, membranen (b.v. van nitrocellulose; papier; celluloseace- taat; en hoogporeus/hoog specifiek oppervlak-membranen van een organisch of anorganisch materiaal).

Het PT-NANBH virale polypeptide kan aan het oppervlak worden bevestigd door passieve adsorptie uit een oplossing met een optimale samenstelling die oppervlakactieve middelen, oplosmiddelen, zouten en/of chaotropen kan omvatten; of door actieve chemische binding. Actieve binding kan geschieden via een groot aantal reactie of actiyeerbare functionele groepen die aan het oppervlak kunnen worden geïntroduceerd (b.v. condensatiemiddelen; actieve zure esters, halogeniden en anhydri-den; amino-t hydroxyl- of carboxylgroepen; sulfhydrylgroepen; carbonyl-groepen; diazogroepen; of onverzadigde groepen). Naar keuze kan de actieve binding geschieden via een proteïne (dat zelf passief of via actieve binding aan het oppervlak is bevestigd), zoals albumine of caseïne, waaraan het virale polypeptide chemisch door diverse methoden kan worden gebonden. Het op deze wijze toepassen van een proteïne kan voordelen opleveren vanwege het isoëlektrische punt, de lading, de hydrofiele eigenschappen of andere fysisch-chemische eigenschappen. Het virale polypeptide kan tevens aan het oppervlak (gewoonlijk maar niet noodzakelijkerwijze een membraan) na elektroforetische isolering uit een reactiemeng-sel, zoals door immuunprecipitatie, worden bevestigd.

Na het in aanraking brengen (in reactie brengen) van het oppervlak dat het PT-NANBH virale polypeptide bevat met een proefmonster, waarbij men tijd voor de reactie laat en zonodig de overmaat monster door één van diverse methoden wordt verwijderd (zoals wassen, centrifugeren, filtreren, magnetisme of capillaire werking) wordt het ingevangen antilichaam door elk middel gedetecteerd dat een detecteerbaar signaal zal geven. Dit kan b.v. worden bereikt door toepassing van een gemerkt molecuul of deeltje als boven beschreven, dat met het ingevangen antilichaam in reactie zal treden (b.v. proteïne A of proteïne G en dergelijke; anti-speciës of anti-immunoglobuline-sub-type; rheumatoïdefactor; of antilichaam ten opzichte van het antigeen, toegepast in een concurrerende of blokkerende wijze) of elk molecuul dat een epitoop bevat dat in het polypeptide aanwezig is.

Het detecteerbare signaal kan optisch of radioactief of fysisch-chemisch zijn en kan direct worden geleverd door het molecuul öf deeltje te merken met b.v. een kleurstof, een radioactieve merkstof, een elek-troactieve verbindingssoort, magnetisch resonante verbindingssoorten of fluorforen, of indirect door het molecuul of deeltje te merken met een enzym dat zelf in staat is aanleiding te geven tot de meetbare verandering van een bepaald type. Naar keuze kan het detecteerbare signaal worden verkregen door b.v. agglutinering toe te passen of via een bre-kings- of dubbele-brekingseffect indien het oppervlak de vorm heeft van deeltjes.

Bepalingen waarin PT-NANBH viraal polypeptide zelf wordt toegepast voor het merken van een reeds ingevangen antilichaam, vereisen een bepaalde soort van merking van het antigeen waardoor dit kan worden gedetecteerd. Het merken kan direct door chemische of passieve hechting van b.v. een radioactieve merkstof, een magnetische resonante verbindingssoort, deeltje- of enzymmerkstof aan het polypeptide geschieden; of indirect door een vorm van een merkstof aan het molecuul te hechten dat zelf met het polypeptide in reactie zal treden. De chemie van de binding van de merkstof aan het PT-NANBH viraal polypeptide kan direct via een reeds in het polyamide aanwezige eenheid, zoals een aminogroep, of via een tusseneenheid, zoals een maleïmidegroep, geschieden. Het invangen van het antilichaam kan op elk van de reeds vermelde oppervlakken door elke reactant plaatsvinden met inbegrip van passieve of geactiveerde adsorptie hetgeen zal resulteren in de binding van het specifieke antilichaam of de immuuncomplexen. In het bijzonder kan de invanging van het antilichaam geschieden door anti-verbindingssoorten of anti-immuno-globuline-sub-type, door rheumatoïde factor, proteïne A, G en dergelijke, of door een molecuul dat een epitoop aanwezig in het polypeptide, bevat.

Het gemerkte PT-NANBH polypeptide kan in een concurrerende bin-dingswijze worden toegepast waarbij de binding daarvan met een specifiek molecuul op elk van de boven geïllustreerde oppervlakken wordt geblokkeerd door antigeen in het monster. Naar keuze kan het worden toegepast op een niet-concurrerende wijze waarbij het antigeen in het monster specifiek of niet-specifiek aan elk van de bovengenoemde oppervlakken wordt gebonden en tevens wordt gebonden aan het specifieke bi- of polyvalente molecuul (b.v. een antilichaam) waarbij de resterende valenties worden toegepast voor het invangen van het gemerkte polypeptide.

In homogene bepalingen worden dikwijls het PT-NANBH virale polypeptide en een antilichaam afzonderlijk zodanig gemerkt, dat wanneer het antilichaam met het virale polypeptide in vrije oplossing in reactie treedt, de tweê merkstoffen in interactie treden en b.v. niet-stralings-overdracht van energie, ingevangen door de ene merkstof naar de andere merkstof toelaten bij een geschikte detectie van de geëxciteerde tweede merkstof of de gedoogde eerste merkstof (b.v. door.fluorimetrie, magnetische resonantie of enzymmeting). De toevoeging van hetzij viraal polypeptide of antilichaam in een monster resulteert in een beperking van de interactie van het gemerkte paar en aldus in een verschillend signaal-niveau in de detector.

Een geschikte gegevensbepalingsinvoér voor het detecteren van PT-NANBH antilichaam is de directe sandwich-enzym-immunobepaling (EIA) gegevensinvoer. Een PT-NANBH viraal polypeptide wordt op microtiterput-jes bekleed. Een proefmonster en een PT-NANBH viraal polypeptide waaraan een enzym wordt gekoppeld, worden gelijktijdig toegevoegd. Elk in het proefmonster aanwezig PT-NANBH antilichaam bindt zowel aan de virale po-lypeptidebekleding van het putje als aan het enzym-gekoppelde virale polypeptide. Typerend wordt hetzelfde virale polypeptide aan beide kanten van de sandwich toegepast. Na wassen wordt gebonden enzym gedetecteerd met behulp van een specifiek substraat waarin een kleurwijziging is betrokken. Een testkit ten gebruike in een dergelijke EIA omvat: (1) een PT-NANBH viraal polypeptide gemerkt met een enzym; (2) een substraat voor het enzym; (3) een middel om een oppervlak te leveren waarop een PT-NANBH viraal polypeptide is geïmmobiliseerd; en (4) naar keuze wassen van de oplossingen en/of buffers.

De virale polypeptiden van de onderhavige uitvinding kunnen in een vaccinformulering voor het induceren van immuniteit ten opzichte van PT-NANBH in mensen worden opgenomen. Voor dit doel kan virale polypeptide worden aangeboden in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager.

Ten gebruike in een vaccinformulering kan het virale polypeptide naar keuze worden voorgesteld als een deel van een hepatitis B-kernfusie-deeltje, als beschreven door Clarke et al. (Nature, 1987, 330, 381-384) of een polylysine-gebaseerd polymeer, als beschreven in Tam (PNAS, 1988, 85, 5409 - 5413). Naar keuze kan het virale polypeptide worden bevestigd aan een bepaalde structuur, zoals liposomen of ISCOMS.

Farmaceutisch aanvaardbare dragers omvatten vloeibare media, geschikt ten gebruike als geleidingsstoffen ter invoering van het virale polypeptide in een patiënt. Een voorbeeld van dergelijke vloeibare media is een pekeloplossing. Het virale polypeptide zelf -kan als een vaste stof in de drager worden opgelost of gesuspendeerd.

De vaccinsamenstelling kan tevens een adjuvans voor het stimuleren van de immuunreactie bevatten waardoor het effect van het vaccin wordt versterkt. Voorbeelden van adjuvantia omvatten aluminiumhydroxyde en aluminiumfosfaat.

De vaccinsamenstelling kan een eindconcentratie van viraal polypeptide in het traject van 0,01 - 5 mg/ml, bij voorkeur 0,03 - 2 mg/ml bevatten. De vaccinsamenstelling kan in een steriele houder worden opgenomen, welke dan wordt afgedicht en bij lage temperatuur, b.v. 4°C, wordt opgeslagen of kan worden gevriesdroogd.

Teneinde immuniteit bij mensen ten opzichte van PT-NANBH te induceren kunnen een of meer doseringen van de vaccinsamenstelling worden toegediend. Elke dosis kan 0,1 - 2 ml, bij voorkeur 0,2 - 1 ml bedragen. Een methode om de immuniteit ten opzichte van PT-NANBH bij mensen te induceren omvat het toedienen van een effectieve hoeveelheid van een vaccinsamenstelling, als hiervoor gedefinieerd.

De onderhavige uitvinding voorziet tevens in de toepassing van een PT-NANBH viraal polypeptide voor de bereiding van een vaccin ten gebruike bij het induceren van immuniteit ten opzichte van PT-NANBH bij mensen.

De vaccins van de onderhavige uitvinding kunnen volgens elke geschikte methode voor het toedienen van vaccins met inbegrip van orale of parenterale (b.v. intraveneuze, subcutane of intramusculaire) injectie worden toegediend. De behandeling kan bestaan uit een enkele dosis van vaccin of een veelvoud van doseringen over een bepaalde tijdsperiode.

De volgende getransformeerde stammen van E. coli werden bij de Nationale Verzameling van Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, 61, Colindale Avenue, Londen, NW9 5HT gedeponeerd op de vol- gende data: i) E. coli TG1, getransformeerd door pDX113 (WD001); depot Nr. NCTC 12369; 7 december 1989; ii) E.coli TG1, getransformeerd door pDX128 (WD002); depot Nr. NCTC 12382; 23 februari 1990; iii) E. coli TG1, getransformeerd door pl36/155 (WD003); depot Nr.

NCTC 12428; 28 november 1990; iv) E. coli TG1, getransformeerd door pl56/92 (WD004); depot Nr.

NCTC 12429; 28 november 1990; v) E. coli TG1, getransformeerd door pl29/164 (WD005); depot Nr.

NCTC 12430; 28 november 1990; vi) E. coli TG1, getransformeerd door pDX136 (WD006); depot Nr. NCTC 12431; 28 november 1990.

In de figuren toont Figuur 1 een voorstelling van de produktie van pDXl22, beschreven in voorbeeld 7; Figuur 2 toont een voorstelling van de produktie van twee andere gefuseerde volgorden beschreven in voorbeeld 17, terwijl Figuur 3 restrictiekaarten van SEQ ID No.: 21 en 22 weergeeft.

In de volgordelijst zijn de SEQ ID No.: 1 - 25 gerangschikt waarnaar in de beschrijving en conclusies wordt verwezen.

De volgende voorbeelden dienen ter illustratie van de uitvinding. VOORBEELD I: Synthese van cDNA.

Samengevoegd plasma (160 ml) van twee individuen (aangeduid als A en L) waarvan bekend was dat dit NANBH had overgebracht via transfusies, Werd verdund (1 : 2,5) met fosfaat gebufferde pekel (PBS) en daarna gedurende 5 uren bij 4°C a 190.000 g (b.v. 30.000 tpm in MSE 8x50 rotor) gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistoflaag wérd als een bron van specifieke antilichamen vastgehouden voor aansluitend uitselecteren van de cDNA-bibliotheken. Dé pellet werd opnieuw in 2 ml van 20 mM tris-hydrochloride, 2 mM EDTA 3% SDS, 0,2 M NaCl (2 x PK) gesuspendeerd, 3-maal met een gelijk volume fenol, 3-maal met chloroform, 1-maal met ether geëxtraheerd en daarna met 2,5 vol.dln ethanol bij -20°C neergeslagen. Het neerslag werd opnieuw in 10 yl van 10 mM tris-hydrochloride, 1 mM EDTA bij pH 8,0 (TE) gesuspendeerd.

Het kernzuur werd toegepast als een matrijs in een cDNA-synthese- kit (Amersham International plc, Amersham, ü.K.) met zowel oligo-dT als statistische hexanucleotide-instructies. De reactieomstandigheden waren als aanbevolen door de leverancier van de kit. In het bijzonder werd 1 ul van het kernzuur toegepast voor een eerste strengsynthesereactie die was gemerkt met Ijk- P JdCTP (Amersham; specifieke activiteit 3000Ci/mmol) in een eindvolume van 20 yl en bij 42°C gedurende 1 uur ge-incubeerd. Het gehele eerste strengreactiemengsel werd daarna toegepast voor het tweede strengsynthesereactiemengsel, dat E.coli RNaseH (0,8 U) en DNA-polymerase I (23 U) in een eindvolume van 100 yl bevatte, bij 12°C gedurende 60 minuten en daarna bij 22°C gedurende 60 minuten geïn-cubeerd. Het gehele reactiemengsel werd daarna bij 70°C gedurende 10 minuten geïncubeerd, op ijs gebracht, waarna 1 U van T4 DNA-polymerase werd toegevoegd en er vervolgens gedurende 10 minuten bij 70°C werd ge-incubeerd. De reactie werd gestopt door toevoeging van 5 yl van 0,2M EDTA pH 8.

Niet-opgenomen nucleotiden werden verwijderd door het reactiemengsel over een NICK-kolom (Pharmacia Ltd., Milton Keynes, Ü.K.) te passeren. Het cDNA werd daarna tweemaal met fenol, driemaal met chloroform, eenmaal met ether geëxtraheerd waarna 20 yg dextran werd toegevoegd vóór neerslag met 2,5 vol.dln 100%'s ethanol.

VOORBEELD II: Vorming van expressiebibliotheken.

Het gedroogde cDNA-pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 5 yl steriel TE en daarna geïncubeerd met 500 ng EcoRI-koppelaars (Pharmacia; GGAATTCC gefosforyleerd) en 0,5 U van T4 DNA-ligase (New England BioLab^ Beverley, MA, USA) in een eindvolume van 10 yl dat 20 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM ATP bevatte gedurende 3 uren bij 15°C. Het ligase werd geïnactiveerd door gedurende 10 minuten te verhitten op 65°C waarna het cDNA werd afgebroken met 180 U van EcoRI (BCL, Lewes, ü.K.) in een eindvolume van 100 yl bij 37°C gedurende 1 uur. Er werd EDTA tot een eindconcentratie van 10 mM toegevoegd en het gehele reactiemengsel werd in een AcA34 (LKB)-kolom geladen. Er werden fracties (50 yl) verzameld en geteld. De piek van cDNA in het uitgesloten volume (980 cpm) werd samengevoegd, tweemaal met fenol, driemaal met chloroform, eenmaal met ether geëxtraheerd en daarna met ethanol neergeslagen.

Het ds cDNA werd opnieuw in 5 yl TE gesuspendeerd en geligateerd aan lambda gtll EcoRl-armen (Gibco, Paisley, Schotland) in een 10 yl re-actiemengsel dat 0,5 U T4 DNA-ligase, 66 mM tris-hydrochloride, 10 mM MgCl^r 15 mM DTT pH 7,6 bevatte gedurende de nacht bij 15°C. Na inacti-vering van de ligase door gedurende 10 minuten tot 65°C te verhitten werd 5 yl van het reactiemengsel aan een Amersham-pakkingsreactiemengsel toegevoegd en gedurende 2 uren bij 22°C geïncubeerd. Het gepakte materiaal werd over E. coli-stam Y1090 (Huynh et al. 1985) getitreerd en bevat- 4 te in totaal 2,6 x 10 recombinanten.

Üitstrijkcellen (Y1090) werden bereid door 10 ml L-beslag te inoculeren met een enkele kolonie van een agarplaat en gedurende de nacht bij 37°C te schudden. De volgende dag werd 0,5 ml van de overnachtse kweek verdund met 10 ml vers L-beslag en er werd 0,1 al 1M MgSO^ en 0,1 ml 20% (w/v) maltose toegevoegd. De kweek werd gedurende 2 uren bij 37°C geschud, de bacteriën werden door centrifugeren a 5000 g gedurende 10 minuten gewonnen en opnieuw in 5 ml 10 mM MgSO^ gesuspendeerd onder vorming van de uitstrijkbare celvoorraad. Een deel (1 yl) van het gepakte materiaal werd met 0,2 ml van de üitstrijkcellen gemengd, gedurende 20 minuten bij 37°C geïncubeerd alvorens 3 ml top-agar werd toegevoegd waarna het gehele mengsel op een 90 mm L-agarplaat werd geschonken. Na incubatie gedurende de nacht bij 37°C werden de plaques geteld en het totale aantal recombinantfaag vastgesteld. Het resterende gepakte materiaal (500 yl) werd bij 4°C opgeslagen.

Èr werden aanvullende bibliotheken op nagenoeg dezelfde wijze gevormd.

VOORBEELD III: Uitsorteren van expressiebibliotheken.

De in voorbeeld II beschreven beginbibliotheek werd uitgestreken 3 op E.coli-stam Y1090 bij een dichtheid van ongeveer 5 x 10 pfu per 140 mm plaat en gedurende 2 uren bij 37°C gekweekt totdat de plaques zichtbaar waren. Men liet steriele nitrocellulosefilters, die met IPTG (iso-propylthiogalactoside) waren geïmpregneerd, gedurende 3 uren in contact met de plaat waarna ze werden verwijderd. De filters werden eerst geblokkeerd door incubatie met een blokkerende oplossing (3% (w/v) BSA/TBS-Tween (10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20) die 0,05% bromidex) bevatte (20 ml/filter) en daarna overgebracht naar een bindende buffer (1% (w/v) BSA/TBS/Tween die 0,05% bromidex bevatte) die gezuiverde (door ionenuitwisselingschromatografie) antilichamen uit samengevoegde A & L plasma bevatte (20 yg/ml). Na gedurende 2 uren incubatie bij kamertemperatuur werden de filters driemaal gewassen met TBS/-Tween en daarna in een bindende buffer die gebiotinyleerde schape-anti-humaan (1 : 250) bevatte, geïncubeerd. Na 1 uur bij kamertemperatuur werden de filters driemaal met TBS/Tween gewassen en daarna geïncubeerd in bindende buffer die streptavidine/peroxydase-complex (1 : 100) bevatte. Het signaal werd ontwikkeld met DAB. Positieve signalen verschenen als (gekleurde) plaques.

4

Uit in totaal 2,6 x 10 uitgesorteerde plaques werden bij het eerste ronde-onderzoek 8 positieven verkregen. Onder toepassing van de filters als matrijs werden de gebieden van de oorspronkelijke platen, die overeenkwamen met deze positieve signalen, weggepikt met een steriele pasteur-pipet. De agarproppen werden in 0,1 ml SM-buffer gesuspendeerd en men liet de faag uitdiffunderen. De titer van de faag van elke prop werd vastgesteld via E. coli stam Y1090. De faagvoorraad uit elke prop werd daarna opnieuw uitgesorteerd als tevoren via individuele 90 mm 3 platen bij een dichtheid van ongeveer 1 x 10 pfu per plaat. Van 8 positieven van de eerste ronde was één duidelijk positief bij de tweede ronde d.w.z. > 1% plaques positief, die werd JG2 genoemd. Dit komt overeen met een positieve intensiteit van 40/10^ in de bibliotheek.

Deze en andere positieve fagen op soortgelijke wijze uit andere cDNA-bibliotheken beschreven in voorbeeld II geïdentificeerd, werden daarna gezuiverd door herhaalde ronden van plaque-uitsortering bij lagere dichtheid (1 - 200 pfu/90 mm plaat) totdat 100% van de plaques met het A & L antilichaam-onderzoek positief waren. Drie dergelijke recombi-nantfagen waren JG1, JG2 en JG3.

VOORBEELD IV: Secundaire uitsortering van JG1, JG2 en JG3 met serum-panels.

Elk van de recombinantfagen JG1, JG2 en JG3 werden plaque-gezui-verd en opgeslagen als getitreerde voorraden in SM-buffer bij 4°C. Deze fagen werden gemengd (1 : 1) met een voorraad fagen, geïdentificeerd als negatief in voorbeeld III en een mengsel toegepast voor het infecteren van E. coli stam Y1090 bij 1000 pfu per plaat. Plaqueverhogingen werden afgenomen en verwerkt als beschreven in voorbeeld III met uitzonde ring dat de filters in kwadranten werden gesneden en elk kwadrant werd geïncubeerd met een ander antilichaam; dit waren A & L-antilichamen (20 yg/ml); A-plasma (1 : 500); L-plasma (1 : 500) en H IgG (20 yg/ml).

H is een persoon waarvan verwacht wordt dat deze positief is op PT-NANBH antilichamen omdat hij een hemofilie-lijder was die niet-warmte-behan-delde factor VIII had ontvangen. Bij het eind van de reactie werd elk filter blind beoordeeld als positief (wanneer er duidelijk twee klassen signalen waren) of negatief (wanneer alle plaques hetzelfde signaal gaven) . Dit zou een subjectieve beoordeling kunnen zijn en aldus werden de beoordelingen vergeleken en alleen die filters waar een meerderheids-overeenstemming was, werden als positief genomen. De resultaten worden in tabel A aangegeven.

TABEL A

A&L A L H

JG1 + + - - JG2 + + + + JG3 + + + + JG1 bleek alleen te reageren met antilichamen uit patiënt A en niet L of H; dit is niet wat men zou verwachten van een ware PT-NANBH verwant recombinant polypeptide en aldus werd JG1 uit de analyse weggelaten.

Zowel JG2 als JG3 gaven echter duidelijke positieve reacties met drie PT-NANBH sera A, L en H; zij werden verder geanalyseerd.

Het bovenbeschreven type analyse werd herhaald voor JG2 en JG3 met uitzondering dat de filters in kleinere porties werden gesneden en dat deze werden geïncubeerd met panels van positieve en negatieve sera.

De panels van positieve sera omvatten een panel van 10 sera van hemofi-lie-zieken en één panel van 9 sera van intraveneus drugverslaafden (IVDA). Deze vertegenwoordigden de beste bron van positieve sera zelfs hoewel de actuele positieve intensiteit onbekend was. Het panel van negatieve sera werd verkregen van algemeen erkende donors die gedurende vele jaren door het Bloedtransfusiecentrum van Noord-Londen, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, U.K. nauwlettend waren bewaakt en nog nooit enig teken van infectie met diverse middelen met inbegrip van PT-NANBH hadden vertoond. De resultaten worden in tabellen B en C opgegeven.

TABEL B

I.D. JG2 JG3 IVDA's V19146 4/4 0/5 V27083 2/4 0/5 V29779 0/4 0/5

V12561 0/5 UI

V15444 1/4 1/5 V18342 4/4 0/5 V8403 1/4 0/5 V20001 4/4 °/5 V21213 Uk 0/5

Hemofilie-patiënten M1582 4/4 4/5 M1581 1/5 1/5 M1575 1/1 0/5

M1579 1/1 UI

M1585 1/1 0/5 M1576 1/5 V5 M1580 1/5 °/5 M1578 1/5 0/5 M1587 1/5 2/1 M1577 2/5 1/5

Positieven zijn onderstreept.

TABEL C

IVDA Hemofilie- Erkende patiënt donor JG2 6/9(66%) 5/10(50%) 0/10(0%) JG3 2/9(22%) 4/10(40%) 0/10(0%) JG2+JG3 1/9(11%) 3/10(30%) 0/10(0%) JG2 of JG3 7/9(77%) 6/10(60%) 0/10(0%)

Deze gegevens zijn in overeenstemming met de hypothese dat beide recombinanten polypeptiden tot expressie brengen die verbonden zijn met een middel dat verantwoordelijk is voor PT-NANBH en dat deze polypepti- den niet identiek zijn maar wel bepaalde antigene plaatsen gemeenschappelijk kunnen hebben.

VOORBEELD V: Restrictie-indeling en DNA-volgordebepaling van JG2 en JG3.

Een deel (10 yl) van de faagvoorraden voor zowel JG2 als JG3 werd gekookt om de fagen te denatureren en het DNA vrij te maken. Dit DNA werd daarna toegepast als een matrijs in PCR-versterking met behulp van Taq-polymerase; elk reactiemengsel bevatte de volgende bestanddelen in een eindvolume van 50 yl: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl^, 0,01% gelatine, pH 8,3 bij 25°C plus oligonucleotide-primers dl9 en d20 (SEQ ID No.: 1 resp. 2; elk 200 ng); deze primers zijn gelokaliseerd in de lambda-volgorden die de EcoRI-kloneringsplaats flankeren en zij instrueren derhalve de versterking van elk deel dat in deze plek is gekloneerd.

Een deel van de reactie werd geanalyseerd over een 1,0% agarose-gel en vergeleken met merkstoffen. De versterking van JG2 produceerde een fragment van bij benadering 2Kbj JG3 een van bij benadering 1Kb.

Het resterende reactiemengsel werd met fenol/chloroform in aanwezigheid van 10 mM EDTA en 1% SDS geëxtraheerd en het DNA door ethanolneerslag gewonnen. Het versterkte materiaal werd daarna afgebroken met 20 U EcoRI gedurende 60 minuten bij 37°C en geïsoleerd over 1,0% LGT-agarosegel in TAE. De fragmenten werden verkleind zoals verwacht en werden geëlueerd en gezuiverd onder toepassing van Elutips (S&S). De JG2- en JG3-inser-ties werden met EcoRI afgebroken pUC13 geligateerd en getransformeerd in E. coli stam TG1. Recombinanten werden als witte kolonies op X-gal/L-Amp-platen geïdentificeerd (L-agarplaten gesuppleerd met 1Ö0 yg/ml ampi-cilline, 0,5 mg/ml X-gal) en werden gecontroleerd door kleinschalige plasmidepreparaten en EcoRI-restrictie-enzyraafbraak ter bepaling van de grootte van de insertie-DNA. Het recombinantplasmide dat de JG2-inser-tie bevatte, werd DM415 genoemd en die welke de JG3-insertie bevatte DM416 genoemd.

De volgorde van de JG2-insertie werd vastgesteld door een directe dubbelstrengs-volgordebepaling van het plasmide DNA en door subklonering in M13-volgorde bepaalde vectoren zoals mpl8 en mpl9 gevolgd door enkel-strengs-volgordebepaling. De volgorde van de JG3-insertie werd op soortgelijke wijze bepaald. Het resulterende DNA en de afgeleide aminozuur-volgorden worden aangegeven in SEQ ID No.: 3 en 4.

VOORBEELD VI; Expressie van PT-NANBH polypeptide in E. coli.

Het plasmide pDM416 (5 yg) werd afgebroken met EcoRI (20 U) in een eindvoluxne van 20 yl en de lKb-insertie gewonnen door elutie uit een 1% LGT-agarosegel. Dit materiaal werd daarna "gepolijst" met behulp van een Klenow-fragment en een dNTP-mengsel om de EcoRI-overhangende uiteinden in te vullen. Het DNA werd door ethanolneerslag gevolgd door extractie met fenol/chloroform gewonnen. Het fragment met een kleverig uiteinde werd in Smal gespleten/gefosfataseerd pDEV107 (een vector waarmee klonering bij het 3'-uiteinde van lac Z mogelijk is) geligateerd en daarna in E. coli TGl-cellen getransformeerd. Er was een 30-voudige verhoging in kolonies ten opzichte van een vector-alleen controle. De transformanten die het vereiste recombinantplasmide bevatten, werden geïdentificeerd door hybridisatie met een radioactieve probe geproduceerd door PCR-versterking van de JG3-recombinant. Er werden 12 kolonies geanalyseerd door restrictie-enzymafbraak (Sall) van plasmide mini-preparaten ter bepaling van de oriëntatie van de insertie. Een kwart van deze recombinanten waren in de correctie-oriëntatie om de PT-NANBH-volgorde als een fusie met y3 -galactosidase tot expressie te brengen. Een van deze (pDX113) werd voor verdere analyse toegepast.

Een kolonie van pDX113 werd toegepast voor het inoculeren van 50 ml L-beslag, gekweekt bij 37°C onder schudden tot de midden-logfase en de expressie werd geïnduceerd door toevoeging van 20 mM IPTG. Na 3 uren werden de cellen door centrifugeren bij 5000 g gedurende 20 minuten gewonnen, opnieuw gesuspendeerd in 50 ml PBS en opnieuw gepelletiseerd.

De gepelletiseerde cellen werden opnieuw in 5 ml buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mg/ml lysozym, 0,2% (v/v) Nonidet-P40, pH 8,0) per gram pellet gesuspendeerd en gedurende 2 uren bij 0°C geïncubeerd. Het vrijgekomen bacteriële DNA werd afgebroken door toe/oeging van DNase I en MgSO^ tot eindconcentraties van resp. 40 yg/ml en 2 mM en de viskositeit verlaagd.

Dit ruwe lysaat werd door PAGE geanalyseerd en het patroon van proteïnen gekleurd met Coomassie-blauw. Een proteïne van bij benadering 150kD werd geïnduceerd in bacteriën die pDX113 bevatten en dit proteïne betekende naar schatting 10 - 15% van het totale proteïne. Er werden soortgelijke gels overgebracht op PVDF-membraan (GRI, Dunmow, Essex, U.K.) en de membranen geïncubeerd met PT-NANBH positieve en negatieve sera; het 150kD-proteïne reageerde met A- en L-sera maar niet met normaal humaan serum. Controlesporen die lysaat uit E. coli bevatten en /¾-galactosidase tot expressie brachten, reageerden niet met A-, L- of normale humane sera.

Aan het ruwe lysaat werd tot een eindconcentratie van 6M ureum toegevoegd en onoplosbaar materiaal werd gecentrifugeerd. Het 6M ureum-extract werd toegepast voor het direct bekleden van de microtiterputjes gedurende 1 uur bij 37°C. De putjes wérden driemaal met dubbel-gedestil-leerd water gewassen en daarna geblokkeerd door toevoeging van 0,25 ml van 0,2% BSA per putje dat 0,02% NaN^ bevatte gedurende 20 minuten bij 37°C. De plaat werd daarna belucht. Controleplaten bekleed met een ruw lysaat van /i -galactosidase-producerend E. coli stam (pXY461) werden op dezelfde Wijze geproduceerd. Deze platen werden in ELISA-bepalingen, als beschreven in voorbeeld X, toegepast.

VOORBEELD VII: Expressie van PT-NANBH polypeptide in insectencellen.

De PT-NANBH-insertie uit JG3, geïsoleerd als beschreven in voorbeeld V, werd in-frame gekloneerd met de eerste 34 nucleotiden van poly-hedrine in de vector pAc360 (Luckow en Summers, Biotechnology, 1988, 6, 47 - 55), onder toepassing van de aanwezige kennis van het afleesframe van het lacZ-gen in de gtll-vector. Er werden oligonucleotiden gesynthetiseerd die in Staat waren tot hybridisatie tot gtll-volgorden die de EcoRI-kloneringsplaats flankeren en waarmee de versterking van de insertie door PCR mogelijk zou zijn. Deze oligonucleotiden omvatten BamHI-restrictieplaatsen geschikt geplaatst om directe kloning in de BamHI-plek van pAc360 mogelijk te maken, waarbij het ingebrachte gen in-frame werd gebracht met de eindstandige aminovolgorden van polyhedrine.

Een kleine hoeveelheid van de gtll-recombinant JG3 werd gekookt om het DNA vrij te maken en daarna toe te passen in een PCR-versterking die de oligonucleotide-primers d75 en d76 (SEQ ID No.: 6 en 7; 200 mg) en 0,5 U Taq-polymerase bevatten.

Na versterking werd het reactiemengsel geëxtraheerd met een gelijk volume fenol/chloroform, met ethanol neergeslagen en afgebroken met 10 U BamHI in een eindvolume van 30 yl. Het versterkte fragment werd opgelost op 1% agarosegel, gèëlueerd en geligateerd in BamHl-afgebroken pAc360 onder vorming van de overgangsconstructie pDX119. Het recombi-nantplasmide (2 yg) en wild-type AcNPV DNA (1 yg) werden tezamen getrans-fecteerd in insectencellen door calciumfosfaatprecipitatie. Inclusie negatief recombinantvirus werd door visueel uitsorteren geselecteerd.

Na drie ronden plaque-zuivering werd het recombinantvirus (BHC-5) geëxpandeerd en werd de expressie van recombinantproteïne in insectencellen beoordeeld door SDS-PAGE, Western blot en ELISA. Een overvloedig tot expressie gebracht proteïne van bij benadering 70kD wordt in geïnfecteerde cellen geproduceerd. Dit proteïne is reactief met PT-NANBH-sera volgens Western blot en ELISA.

Een verder baculovirus-recombinant (BHC-7) werd opgebouwd en omvatte JG2-volgorden extra aan de JG3-volgorden aanwezig in BHC-5, als geschetst in fig.l. De PT-NANBH-volgorden die in JG2 aanwezig waren werden versterkte en gekloneerd in de pAc360-vector als boven beschreven en produceerden pDXH8 en de geschikte BamHI/Sal I fragmenten van pDX119 en pDX118 werden in die volgorde in pAc360 aan elkaar gekoppeld en vormden overgangsconstructie pDX122.

Er werden recombinantplasmiden geïdentificeerd door hybridisatie en oriëntatie van ingebracht DNA, bepaald door restrictie-enzymanalyse. Recombinantvirus werd als boven beschreven geproduceerd en het tot expressie gebrachte proteïne geanalyseerd volgens SDS-PAGE, Western blot en ELISA. Een zeer overvloedig (40% totaal celproteïne) 95kDa-polypepti-de dat met PT-NANBH-sera reageerde, werd in geïnfecteerde cellen aangetroffen.

VOORBEELD VIII: Zuivering van DX113-polypeptide.

Er werd een E. coli stam TG1, die het plasmide pDX113 bevatte (aangeduide stam WDL001) gekweekt en geïnduceerd in een 1,5 liter fermen-tator (model SET002, SGI, Newhaven, East Sussex, U.K.) bij 37°C gedurende 5 uren. De cellen werden door centrifugeren a 5000 g gedurende 20 minuten gewonnen en behandeld als volgt: a) Extractie:

De natte cellen worden opnieuw gesuspendeerd (1 : 20, w/v) in buffer A (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% (v/v) glycerol, pH 8,0). Lysozym werd a 5 mg vaste stof per ml suspensie toegevoegd en men liet het mengsel bij 4°C staan. Na 15 minu- ten werd het mengsel aan geluidstrillingen onderworpen (6 ym piek-tot-piek amplitude) op ijs gedurende in totaal 3 minuten (6 X 30 seconden uitbarstingen). DNase I werd a 4 yg per ml suspensie toegevoegd en men liet het mengsel een verdere 30 minuten staan.

De suspensie werd gedurende 20 minuten a 18000 g (max) gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistoflaag afgevoerd.

De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in buffer B (25 mM Hepes, 4 M ureum, 5 mM DTT, pH 8,0) bij een verhouding van 1 : 6 (w/v) waarbij een fijne suspensie werd verkregen. Deze werd bij 18000 g (max) gedurende 20 minuten gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistoflaag afgevoerd. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in buffer C (25 mM Hepes, 8 M ureum, 2 mM DTT, pH 8,0) in een verhouding van 1:6 (w/v); vöór de suspensie werden de volgende ingrediënten toegevoegd: leupeptine (1 yg/ml); pepstatine (1 yg/ml) en E64 (1 yg/ml). De suspensie werd bij 18.000 g (max) gedurende 30 minuten gecentrifugeerd én de bovenstaande vloeistoflaag werd afgeschonken en bewaard. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in 25 mM Hepes, 1% SDS, pH 8,0. b) Chromatografie:

De bovenstaande vloeistoflaag uit de 8 M ureumfractie werd 1 : 5 (v/v) verdund in 25 mM Hepes, 8 M ureum, 2mM DTT, pH 8,0, en ge-fractioneerd over een 7 ml Q-sepharosekolom. De proteïnen werden via een zoutgradiënt van 0-1 M NaCl geëlueerd. De chromatogra-fie en datamanipulatie werden gecontroleerd door een FPLC (Pharmacia). DX113 wordt bij bij benadering 500 mM NaCl geëlueerd en is praktisch homogeen volgens SDS Page en Western blot-analyse.

VOORBEELD IX; Zuivering van BHC-5-polypeptide.

9

Sf9-cellen (2 x 10 ) werden geïnfecteerd met een voorraad van het BHC-5-recombinantvirus (moi 5). Na incubatie bij 28°C gedurende 2 dagen werden de cellen door centrifugeren gewonnen en daarna als volgt behandeld: a) Extractie:

De natte celmassa (1,2 g) werd opnieuw gesuspendeerd in 6 ml buffer A (25 mM Hepes, 5 mM DTT, leupeptine 1 yg/ml, pepstatine 1 ug/ml, E64 1 ug/ml pH 8,0). De opnieuw gesuspendeerde cellen werden op ijs gebracht en gedurende 3 x 15 seconden uitbarstingen (6 yin piek-tot-piek amplitude) met daartussen 30 seconden rustperioden aan geluidsgolven onderworpen- De aan geluidsgolven onderworpen suspensie werd met 18.000 g (max) gedurende 20 minuten gecentrifugeerd en de vloeibare bovenlaag afgevoerd. De pel-let werd opnieuw in buffer A plus 4 M ureum (6 ml) gesuspendeerd en bij 18.000 g (max) gedurende 20 minuten gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistoflaag werd afgevoerd en de pellet werd opnieuw met buffer A plus 8 M ureum (6 ml) geëxtraheerd. Na centrifugeren bij 18.000 g (max) gedurende 30 minuten werd de bovenstaande vloeistoflaag behouden en 1 : 6 in buffer A plus 8 M ureum verdund. Dit extract werd gechromatografeerd over een mono-Q kolom in evenwicht gebracht in dezelfde buffer. De kolom werd via een zoutgradiënt (0 - 1,0 M NaCl) over 12 kolomvolumes geëlu-eerd. BHC-5 werd bij benadering 0,45 - 0,55 m NaCl geëlueerd en was meer dan voor 90% zuiver als beoordeeld door SDS-PAGE. De opbrengst was bij benadering 70%.

VOORBEELD X: Effect van DX113 en BHC-5 en 7 polypeptiden in een ELISA.

Micro-elisa-platen (96 putjes, Nunc) werden direct in 50 mm bi-carbonaatbuffer (50 mM natriumbicarbonaat en 50 mM natriumcarbonaat, getitreerd op pH 9,5) bekleed met hetzij een ruw 6 M ureumlysaat van BHC-5 of met gezuiverd pDX113. De platen werden geblokkeerd met 0,2% BSA en daarna gedurende 30 minuten bij 37°C met sera 1 : 20 verdund (baculo) of 1 : 100 (E. coli), geïncubeerd. Na wassen in Tween-pekel (0,85% pekel, 0,05% Tween 20, 0,01% Bronidox) werden de platen met per-oxydase-geconjugeerde geite-anti-humaan immunoglobuline (1 : 2000) gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. De platen werden dan in Tween-pekel gewassen en kleur ontwikkeld door toevoeging van het chromogene substraat TMB (tetramethylbenzidine-HCl) (100 yl/putje) en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De reactie werd gestopt met 50 yl 2 M zwavelzuur en de OD450 vastgesteld (tabel D):

TABEL D

Indirecte anti-humaan Ig-fornaat ELISA voor de detectie van NANB-antilichaam.

Baculo Ξ. coli BHC-5 (vaste fase) DX113 (vaste fase) >2 1,670 1,855 1,531 1,081 1,015

Sera van hoge-risico 1,842 1,558 patiënten positief 0,526 0,638 in de bepaling >2 1,516 1,823 1,602 1,779 1,318 1,122 0,616 1,686 1,441 0,259 0,205 0,158 0,120 0,298 0,209

Sera van hoge-risico g g patiënten negatief g 232 o 181 in de bepaling 0,263 0,165 0,184 0,163 0,121 0,099 0,243 0,104

Erkende donor g 224 0.119

Sera uit patiënten met hoog risico voor PT-NANB-infectie (IVDA's, hemofilie-patiënten) werden beoordeeld als beschreven; alle gegevens zijn uitgedrukt als OD450-aflezingen, waarbij de erkende donor een negatieve controle voor deze bepaalde groep is. Van deze bepaalde groep van sera zijn 10/19 op beide vaste fasen positief.

Extra gezuiverd DX113 werd geconjugeerd met alkalische fosfatase onder toepassing van SATA/malelmide-reductie en er werd een immunometri- sche bepaling tot stand gebracht. Bekende NANB-positieve en negatieve sera werden verdund als aangegeven in het erkende donorserum en toegevoegd aan een BHC-7 beklede vaste fase. Hetzij gelijktijdig of na incubatie (30 minuten bij 37°C) werd het DXll3-conjugaat toegevoegd (50 yl, 1 : 2000). Na incubatie gedurende 30 minuten bij 37°C werden de platen, gewassen met 50 mM bicarbonaatbuffer en kleur ontwikkeld onder toepassing van het IQ-Bio-versterkingssysteem en de OD492 bepaald (TABEL E).

TABEL E

Immunometrische (gemerkt polypeptide) ELISA voor de detectie van NANB-antilichaam.

Positief in bepaling Negatief in bepaling Erkende donor >2 0,217 0,234 0,821 0,252 >2 0,214 0,542 0,257 0,876 0,308 1,583 0,278 >2 0,296 >2 0,273 1,830 0,262 >2 0,251

Aldus gaven beide bepalingen - antiglobuline of immunometrisch - alle hoge-risicomonsters overeenstemmende resultaten.

VOORBEELD XI: Vaccinsamenstelling.

Er werd een vaccinsamenstelling volgens conventionele technieken bereid onder toepassing van de volgende bestanddelen in de aangegeven hoeveelheden: PT-NANBH viraal polypeptide >0,36 mg

Thiomersal 0,04 - 0,2 mg natriumchloride *£8,5 mg water tot 1 ml.

VOORBEELD XII: Produktie van monoclonale antilichamen voor PT-NANBH-polypeptiden.

De DNA-insertie uit DM415 wrd gesubkloneerd in de baculovirus-overdrachtsvector p36C en recombinantvirus geproduceerd volgens een me- thode die in wezen gelijk was aan die beschreven in voorbeeld VII. Het recombinantvirus werd BHC-1 genoemd en bracht zeer lage niveaus van PT- 7 NANBH-specifiek proteïne tot expressie. Sf-9-cellen (5 x 10 cellen/ml) geïnfecteerd met BHC-1 werden gelyseerd in PBS dat 1% (v/v) NP40 bevatte en gedurende 2 minuten bij 13.000 g gecentrifugeerd. De bovenlaag werd over Extractigel-D (Pierce Chemicals) gepasseerd ter verwijdering van detergens en daarna als een 1 : 1 emulsie gemengd met Freund's complete adjuvans. Muizen werden subcutaan met 0,1 ml emulsie (equivalent aan 5 x 106 cellen) geïnjecteerd. 14 en 28 dagen na de injectie werden de muizen geprovoceerd door intraperitoneale injectie van 0,1 ml (equiva- s lent aan 5 x 10 cellen) van een detergens-vrij extract van BHC-5-geïn-fecteerde Sf-9-cellen; BHC-5 bevat de DNA-insertie van DM416. Er werd voor onderzoek bloed van de staarten, afgetapt en bepaald op anti-PT-NANBH-activiteit in een ELISA (voorbeeld X). Twee muizen met een PT-NANBH-specifieke reactie werden verder geprovoceerd door i.v. injectie met een detergens-vrij extract van BHC-7-geïnfecteerde Sf-9-cellen; BHC-7 bevat een DNA-insertie geproduceerd door het aan elkaar ligateren van de overlappende gebieden van DM415 en DM416 (voorbeeld VII). De milten werden drie dagen later verwijderd.

Miltcellen werden met NSo-myelomacellen gefuseerd in aanwezigheid van PEG1500 volgens standaardtechnieken. De resulterende hybridomacellen werden uitgeselecteerd door groei in HAT-(hypoxanthine, aminopfterine, thymidine)-medium. 10 - 14 dagen na de fusie werden de bovenlagen onderzocht op anti-PT-NANBH-activiteit volgens ELISA. Putjes die reactiviteit met zowel DX113 als BHC-7-antigenen (voorbeeld X) vertoonden werden geïdentificeerd en individuele kolonies werden overgebracht naar afzonderlijke putjes, gekweekt en opnieuw onderzocht. Putjes in dit stadium een specifieke reactiviteit vertoonden werden verder gekloneerd bij begrensde verdunningen om monoklonaliteit te verzekeren.

VOORBEELD XIII; Detectie van PT-NANBH viraal kernzuur in seropositieve patiënten.

Sera: Donatiemonsters uit 1400 donors, aangetrokken voor een toekomstig onderzoek van post-transfusie hepatitis, werden bij -20°C bevroren. Pre-transfusie en seriegewijze post-transfusiemonsters uit de rond 260 ont-vancers werden od soortcreliike wiize ODaeslaaen. De oost-transfusiemon- sters werden om de 14 dagen tot 3 maanden, maandelijks tot 6 maanden en 6 maanden daarna tot 8 maanden verzameld. Bevroren donor- en ontvanger-sera uit drie incidenten van PT-NANBH die in 1981 optraden, waren tevens voor onderzoek beschikbaar. De diagnose van PT-NANBH was gebaseerd op een stijging in serumalanineaminotransferase (ALT) van meer dan 2,5-maal de normale bovengrens in tenminste twee afzonderlijke post-transfusie-monsters. Andere hepatotrope virussen werden door serologisch onderzoek uitgesloten en niet-virale oorzaken van hepatocellulair letsel werden door gebruikelijke klinische en laboratoriumstudies uitgesloten.

Immunobepaling: Er werden serummonsters retrospectief onderzocht op de aanwezigheid van antilichamen tegen HCV (ClOO-antigeen) met de Ortho Diagnostics ELISA kit, toegepast in overeenstemming met de instructies van de fabrikant. Er werden herhaalde reactieve sera tot eindpunten getitreerd in een humaan serum negatief voor anti-ClOO.

Detectie van PT-NANBH virale volgorden: Serum of plasma RNA werd geëxtraheerd, complementair overgeschreven en versterkt als hieronder beschreven. De complementaire transcriptie/PCR oligonucleotide-primers waren afgeleid van de nucleotidevolgorde van het JG2 kloon, geïsoleerd volgens voorbeeld III, en gesynthetiseerd met een Applied Biosystems 381A-synthesetoestel. De volgorden van de vier oligonucleotide-primers waren als volgt:

Aanduiding SEQ ID No.: Produkt afmeting d94 sense 8 d95 antisense 9 729bp NI sense 10 402bp N2 antisense 11 (i) RNA-extractie: 5 - 50 yl serum (of plasma) werd tot 200 yl aangevuld door toevoeging van steriel gedestilleerd water. Het 200 yl monster werd aan een gelijk volume van 2 x PK-buffer (2 x PK = 0,2 M TrisCl, pH 7,5, 25 mM EDTA, 0,3 M Nacl, 2% w/v SDS; proteïnase K 200 yg/ml), toegevoegd, gemengd en bij 37°C gedurende 40 minuten geïncubeerd. Proteïnen werden door tweemaal extractie met fenol/chloroform en eenmaal met chloroform alleen verwijderd. Er werd 20 yg glycogeen aan de waterfase toegevoegd en het RNA werd daarna neergeslagen door toevoe- ging van 3 vol.dln ijskoude absolute ethanol. Na opslag bij -70°C gedurende 1 uur werd RNA gepelletiseerd in een Eppendorf-centri-fuge (15 minuten, 14.000 tpm, 4°C). De pellet werd eenmaal in 95%'s ethanol gewassen, onder vacuum gedroogd en opgelost in 10 yl steriel gedestilleerd water. De RNA-oplossingen werden bij -70°C opgeslagen.

(ii) cDNA-synthese:

Een 10 yl mengsel dat 2 yl van de RNA-oplossing, 50 ng van het synthetische oligonucleotide d95, 10 mM Hepes-HCl, pH 6,9 en 0,2 mM EDTA, pH 8,0 bevatte, bereid. Dit 10 yl mengsel werd bedekt met 2 druppels van een minerale olie, gedurende 2 minuten in een waterbad op 90°C verhit en daarna snel op ijs gekoeld. De cDNA-synthese werd uitgevoerd na instelling van het reactiemengsel zodanig dat dit 50 mM Tris-HCL, pH 7,5, 75 mM KC1, 3 mM MgCl^, 10 mM DTT, 0,5 mM van elk dATP, dCTP, dGTP en dTTP, 20 eenheden van RNase-inhibitor (Pharmacia) en 15 eenheden van gekloneerd MLV omgekeerd transcriptase (Pharmacia) in een eindvolume van 20 yl bevat. Het 20 yl mengsel werd bij 37°C gedurende 90 minuten geïn-cubeerd. Na de synthese werd het cDNA bij -20°C opgeslagen.

(iii) "Genesteld" PCR:

Gedurende dit onderzoek werden foute positieve PCR-resultaten vermeden door een strikte toepassing van de maatregelen ter voorkoming van verontreiniging van Kwok en Higuchi (Nature, 1989, 237 - 238) .

(a) Ronde 1:

De polymeraseketenreactie werd uitgevoerd in een 50 yl mengsel dat 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl^, 0,01% w/v gelatine, 1 eenheid recombinant Taq DNA-polymerase (Perkin Elmer Cetus), 200 yM van elk dNTP, 30 ng van elk van "buiten" primer (d94 en d95; SEQ ID No.: 8 resp. 9) en 5 yl van de cDNA-oplossing bevatte. Na een eerste 5 minuten denaturering bij 94°C werden 35 kringlopen van 35°C gedurende 1,2 mjnuten, 56°C gedurende 1 minuut, 72°C gedurende 1 minuut uitgevoerd, gevolgd door een uitein-delijke 7 minuten uitbreiding bij 72°C (Techne PHC-1 Automated Thermal Cycler).

b) Ronde 2:

Het reactiemengsel was als boven beschreven voor ronde 1 maar er werd 125 ng van elke "binnen" primer, Nl en N2 (SEQ ID No.: 10 resp. 11) toegepast in plaats van de "buiten" primer d94 en d95. Er werd een 1 yl aliquot van de ronde 1 PCR-produkten overgebracht naar het ronde 2 50 yl reactiemengsel. Er werden 25 kringlopen van 95°C gedurende 1,2 minuut, 46°C gedurende 1 minuut, 72°C gedurende 1 minuut, gevolgd door een 7 minuten uitbreiding bij 72°C uitgevoerd.

c) Analyse: 20 yl van de ronde 1 en ronde 2 PCR-produkten werden volgens elektroforese over een 2% agarosegel geanalyseerd. De banden werden zichtbaar gemaakt door ethidiumbromidekleuring en gefotografeerd bij 302 nm.

Voorspellende waarde van anti-HCV serologie en PCR in het aanstaande onderzoek: zes van de 1400 donors (0,43%), ingeschreven voor het aanstaande onderzoek, bleken antilichamen tegenover C100 in hun serum te bevatten. Van deze zes antilichaam-positieve donors bleek slechts één (donor D5) infectueus te zijn als beoordeeld door de ontwikkeling van PT-NANBH en C100 seroconversie in een recipiënt (recipiënt R6) - zie tabel F .

Er werden virale volgorden door PCR in het serum van donor D6 gedetecteerd maar niet in elk van de andere vijf seropositieve donor-sera. De recipiënt R6 die PT-NANBH had ontwikkeld had tevens bloed uit zeven andere donors ontvangen (D7 - D13). Sera van deze donors werden onderzocht en bleken zowel antilichaam-negatief als PCR-negatief te zijn.

TABEL F

Donor/recipiënt-gegevens samenvattend: voor onderzoek

DONORS ONTVANGERS

Donor Anti-HCV PCR Ontvanger PT-NANBH Anti-HCV sero conversie

Dl + - R1 niet niet D2 + - R2 niet niet D3 + R3 niet niet D4 + - R4 niet niet D5 + - R5 niet niet TABEL F (vervolg) D6 + + D7 - D8 - - D9 - - R6 wel* wel* D10 -

Dil : - - D12 - - D13 ' ' - * Incubatieperiode 1 maand.

+ Seroconversie vond na 5 maanden post-transfusie plaats.

VOORBEELD XIV: Isolering en expressie van aanvullende PT-NANBH DNA-volgorden.

De lambda gtll-bibliotheken gevormd volgens voorbeeld II, werden tevens uitgesorteerd met sera van patiënten met een hoog risico voor PT-NANBH maar die niet reageerden met de virale antigenen, DX113, BHC-5 en BHG-7, om redenen dat zij waarschijnlijk antilichamen bevatten die verschillende antigenen herkennen. De sera, PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG en Le (üniversity College and Middlesex School of Medicine, Londen) voldeden aan dit kriterium en werden toegepast voor het uitsorteren van de bibliotheken volgens dezelfde procedure als beschreven in voorbeelden III en IV. Er werd aldus een aantal recombinanten geïdentificeerd, waarvan er geen kruis-hybridisatie met probes gemaakt van JG2 en JG3 vertonen. Elk van de recombinanten, BRll, geïdentificeerd door reactie met PJ-5, werd voor verdere analyse uitgekozen.

De kloon, BRll, bevatte een insertie van bij benadering 900bp die werd versterkt door PCR onder toepassing van de d75 en d76 primers (SEQ ID No.: 6 en 7) als beschreven in voorbeeld VII. De versterkervolg-orde werd direct gekloneerd in de baculovirusvector pAc360 onder vorming van pDXl28 dat een open afleeskader in fase met de eerste 11 aminozuren van polyhedrine bevatten. Recombinant baculovirusvoorraden (aangeduid als BHC-9) werden geproduceerd volgens de procedure beschreven in voorbeeld VII. Insectencellen werden geïnfecteerd met gezuiverd recombinant- r-r-i v.iη λπ Λν> Μήλλλ «Λ 1 tmanf λ Aλ wan ·ί 09VTY 4 vi ArramarV— te celextracten verkregen.

De versterkte insertie van BR11 werd tevens gekloneerd in pUC13 en M13 faagvector voor volgordebepaling;DNA en aminozuurvolgordegegevens worden opgegeven in SEQ ID NO.: 5. Insertie bevat 834bp plus de EcoRI-koppelaars, toegevoegd gedurende klonering.

VOORBEELD XV: Effect van BHC-9-polypeptide in een ELISA.

Er werd een ELISA uitgevoerd onder toepassing van microtiterput-jes, bekleed met BHC-9-infectiecelextract en een anti-humaan Ig-conju-gaatdetectiesysteem volgens de procedure als beschreven in voorbeeld X. Een panel van hoge-risico sera werd paralle tegen BHC-7 en BHC-9 geanalyseerd en ze werden tevens onderzocht door PCR volgens de procedure beschreven in voorbeeld XIII. De resultaten worden in tabel G aangegeven waarin de positieve monsters zijn onderstreept.

TABEL G

Nummer PCR BHC-7 BHC-9 1 + 2.09 2+00 2 + 2.09 2,00

3 + 1.89 UI

4 + Ui °>27 5 + 1-26 2,00 6 + 0,91 2,00 7 - 0.90 P.,51 8 + 0+8^ 4Ü 9 - 0.53 0+43 10 - 0.45 2+00

Π + 0,37 UI

12 - 0»32 13 - °/23 °>30 ÏI - 0,15 15 + 0,16 Q+7£ 16 - °>09 ^ 17 - 0,27 2+00 18 - 0,15 240 19 - 0,12 2+00 20 - 0,08 0,05 afsluiting 0,2 7 0,29

Van deze 20 monsters zijn er 50% duidelijk positief met BHC-7 terwijl daarentegen 85% positief met BHC-9 zijn. Er zijn twee monsters (11 en 12) die net positief met BHC-7 zijn, duidelijk positief met BHC-9 en sommige van de monsters bij of beneden de afsluiting met BHC-7 zijn positief met BHC-9. Daarnaast zijn twee monsters (11 en 15) die grensgevallen of negatief met BHC-7 waren maar positief met BHC-9 PCR-posi-tief.

In totaal zijn er slechts twee monsters (13 en 20) die negatief voor zowel polypeptiden als PCR zijn.

VOORBEELD XVI: Isolering van PT-NANBH-DNA-volgorden die bestaande klonen overlappen.

Door de immunologische uitsortering van cDNA-expressiebibliothe-ken als beschreven in voorbeelden III, IV en XIV kunnen alleen die klonen worden geïdentificeerd, die een immunoreactief gebied van het virus bevatten. Een andere benadering ten opzichte van de produktie van klonen die specifiek voor PT-NANBH zijn, is het gebruik van PCR om cDNA-moleculen te vermeerderen die de bestaande klonen overlappen. Er kunnen stellen primers worden gevormd waarbij één lid van het paar binnen bestaande gekloneerde volgorden ligt en het andere erbuiten; deze benadering kan worden uitgebreid tot eveneens genestelde paren primers.

cDNA, bereid als beschreven voor voorbeeld I, werd vermeerderd door PCR, met hetzij enkele of genestelde paren primers, onder toepassing van de reactieomstandigheden beschreven in voorbeeld XIII. De benadering wordt geïllustreerd door de toepassing van de volgende paren primers: dl64 (SEQ ID No.: 12) en dl37 (SEQ ID No.: 13); dl36 (SEQ ID No.: 14) en dl55 (SEQ ID No.: 15); dl56 (SEQ ID No.: 16) en d92 (SEQ ID No.: 17). Eén lid van elk paar is bestemd om te fungeren als primer binnen de bestaande gekloneerde volgorden (dl37 en dl36 primer binnen de 5'-en 3'-uiteinden van BRll, d92 primer bij het 5'-uiteinde van JG3). De andere primers zijn gebaseerd op volgorden die beschikbaar zijn voor andere PT-NANBH-middelen. Primer dl64 komt overeen met basen 10 - 31 van fig.2 in Okamoto et al., JAPAN. J. Exp, Med., 1990, 60, 167 - 177. Primers dl55 en dl56 komen overeen met resp. plaatsen 462 - 489 en 3315 - 3337 in fig.47 van de Europese octrooiaanvrage 88310922.5. Er werden een of meer nucleotidesubstituties uitgevoerd voor de invoering van een EcoRI-herkenningsplaats nabij het 5'-uiteinde van de primers, met uitzondering van dl64 waar een Bgl2-herkenningsplaats werd ingevoerd; door deze veranderingen wordt de aansluitende klonering van het vermenigvuldigde produkt vergemakkelijkt.

De PCR-produkten werden afgebroken met de geschikte restrictie-enzymen, opgelost door agarosegel-elektroforese en banden van de verwachte afmeting werden uitgesneden en gekloneerd in zowel plasmide als bacteriofaagvectors, als beschreven in voorbeeld V. De volgorden van de vermenigvuldigde DNA's 164/137 (SEQ ID No.: 18), 136/155 (SEQ ID No.: 19) en 156/92 (SEQ ID No.: 20) worden in de volgorderangschikking aangegeven. Deze nieuwe volgorden vermeerderen het uitbreidingsgebied van het PT-NANBH-genoom over dat verkregen door immuno-analyse (SEQ ID No.: 3, 4 en 5). Deze volgorden, tezamen met andere die binnen de reeds beschreven gebieden liggen, kunnen worden gecombineerd in een aaneensluitende volgorde bij het 5'-uiteinde (SEQ ID No.: 21) en het 3'-uiteinde (SEQ ID No.: 22) van het PT-NANBH-genoom.

VOORBEELD XVII: Fusie van verschillende PT-NANBH-antigenen in een enkel recombinant polypeptide.

De in tabel G aangegeven gegevens tonen aan dat hoewel meer se-rummonsters zijn gedetecteerd als antilichaam-positief onder toepassing van een BHC-9 als een doelwit-antigeen (17/20) in plaats van BHC-7 (10/20) er bepaalde monsters zijn (b.v. No.4) die positief met alleen BHC-7 zijn. Dit beeld ontstaat door een breder onderzoek van monsters. Aldus werd een fusieconstructie afgeleid onder toepassing van een volgorde van BHC-7 en BHC-9.

Volgorden uit BHC-7 en BHC-9 kunnen in diverse wijzen worden gecombineerd; elke volgorde kan aan de amino-eindplaats van de resulterende fusie worden aangebracht en de aard van de koppelingsvolgorde kan tevens worden gevarieerd. Fig.2 illustreert twee mogelijke methoden volgens welke de volgorden kunnen worden gecombineerd.

Geschikte restrictiefragmenten, die geschikte restrictie-enzym-plaatsen en koppelaarvolgorden droegen werden hetzijdoor PCR onder toepassing van specifieke primers of door restrictie-enzymafbraak van bestaande plasmiden gevormd. De overdrachtsvector DX143 bestaat uit een BamHl/Pstl-fragment uit DX122 (fig.l; de Pst-plek is op plaats 1504 JG2; SEQ ID NO.:3) gekoppeld aan het 5'-uiteinde van het gehele kode-ringsgebied van BR11 (SEQ ID No.: 7), dat is vermeerderd als een Pstl/BamHl-fragment onder toepassing van primers d24 (SEQ ID No.: 23) en dl26 (SEQ ID No.: 24); het koppelingsgebied bestaat uit zes aminozuren afgeleid van de dl26 primer en rest bacteriofaag lambda volgorden. De overdrachtsvector DX136 verschilt van DX143 doordat het BRll-fragment werd gevormd onder toepassing van d24 (SEQ ID No.: 23) en dl32 (SEQ ID No.: 25) zodat het koppelingsgebied vijf lysinen bevat. Deze overdrachts-vectoren werden toegepast voor de co-transfectie van Sf9-insectencellen in cultuur met AcNPV DNA en plaque-gezuiverde voorraden van recombinant baculovirussen werden geproduceerd als beschreven in voorbeeld VII.

BHC-10 werd geproduceerd als resultaat van transfectie met DX143; BHG-ll als resultaat van transfectie met DX136,

De recombinant polypeptiden die door deze twee virussen tot expressie zijn gebracht, werden geanalyseerd volgens SDS-PAGE en Western blotting. BHC-10 produceerde een polypeptide met een schijnbaar mole-cuulgewicht van 118kDa. BHC-11 produceerde een polypeptide met een schijnbaar molecuulgewicht van 96kDa. Beide polypeptiden reageerden met sera waarvan bekend is dat zij inELISA alleen reageren met BHC-7 (b.v. serum A) of alleen met BHC-9 (serum B64, voorbeeld XIV). De twee polypeptiden verschillen alleen in koppelaarvolgorde en dit kan worden beïnvloed hetzij door hun mobiliteit over SDS-PAGE of hoe ze in de geïnfecteerde cellen worden verwerkt.

VOORBEELD XVIII: EFfect van PT-NANBH-fusie-antigenen in een ELISA.

ER werd een ELISA uitgevoerd onder toepassing van microtiter-putjes, bekleed met BHC-9-geInfecteerde celextracten en een anti-humaan Ig-conjugaat volgens de procedure beschreven in voorbeeld X. Tabel H presenteert de gegevens uit een vergelijking van de twee fusies met de andere PT-NANBH-recombinant-antigenen BHC-7 en BHC-9 alsmede het HCV-recombinant proteïne C-100-3 (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, New-Jersey). De sera zijn gegroepeerd volgens het reactiepatroon met BHC-7, BHC-9 en C-100-3. Groep I-sera reageren sterk met alle drie antigenen; groep II reageert sterk met alleen BHC-7; groep III reageert sterk met alleen BHC-9 en groep IV reageert sterk met alleen twee van de drie antigenen.

TABEL Η SERUM BHC-7 BHC-9 C-100-3 BHC-10 BHC-11

Grofep T

AH >2,0 >2 r0 >2,0 >2,0 >2,0 AC >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 57 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 77 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 84 1,4 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0

Groep TT

805-6 >2,0 0,261 0,1 1,78 +* 805-17 >2,0 0,181 0,12 1,37 +* 805-149 >2,0 0,651 0,084 1,57 ++*

Gro'Op III

JS 0,32 >2,0 0,17 >2,0 >2,0 805-57 0,069 1,403 0,25 1,9 +* 805-82 0.116 1,272 0,4 1,85 ++* 805-94 0,353 1,675 0,2 >2,0 +* PJ1 0.27 >2;0 0,2 >2,0 1,85

Groep IV

A >2,0 0,14 >2,0 >2,0 >2,0 KT 1.57 0,27 >2,0 >2,0 >2,0

Le 0,152 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 PJ5 0,123 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 303-923 >2,0 0,9 0,37 1,9 + 303-939 >2.0 1,55 0,268 2,0 +* * Deze monsters zijn alleen onderzocht volgens Western blotting op BHC-11.

Deze gegevens tonen aan dat zowel BHC-10 als BHC-11 een gelijke reactiviteit met deze sera hebben en wat het meest belangrijk is, dat de beide antigeen-activiteiten door de fusies blijken te zijn behouden. Alle sera in groepen II - III, die reageren met alleen resp. BHC-7 of BHC-9 geven een duidelijke reactie met de fusies. Voorts is er een indicatie dat het bij elkaar hebben van de twee antigenen een meer gevoelige bepaling oplevert. Het monster KT geeft b.v. OD's van 1,57 en 0,27 met resp. BHC-7 en BHC-9 terwijl de OD met de fusies daarentegen >2,0 is.

SEQ ID No.: 1 VOLGORDE-TYPE: nucleotide VOLGORDE-LENGTE: 21 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE; synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: bacteriofaag lambda gtll ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligomicleotide-synthesetoestel; oligo dl9 BIJZONDERHEDEN: 1 - 21 basen homoloog met het begindeel van lacZ-gen dat de EcoRI-plaats in bacteriofaag lambda gtll flankeert.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese uit de faagvector in cDNA ingébracht bij de EcoRI-plaats.

GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C 21

SEQ ID No.: 2 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 21 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: bacteriofaag lambda gtll ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestelf oligo d20 BIJZONDERHEDEN: 1-21 basen homoloog met het benedendeel van lacZ-gen dat de EcoRI- plaats in bacteriofaag lambda gtll flankeert.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese uit de faagvector in cDNA ingébracht bij de EcoRI-plaats.

TTGACACCAG ACCAACTGGT A 21 SEQ ID No.: 3

VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 1770 BASEPAREN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: cDNA tot genomisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: kloon JG2 uit cDNA-bibliotheek in lambda gtll BIJZONDERHEDEN: 1 - 1770bp deel van het PT-NANBH-polyproteïne.

EIGENSCHAPPEN: codeert waarschijnlijk voor virale niet-structurele proteïnen .

CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG 48

Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp 5 10 15 CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG 96

Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys 20 25 30 GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG 144

Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu 35 40 45 CGG GAA GTG TCC GTG CCG GCG GAG ATC-CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC 192

Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe 50 55 60 CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG 240

Pró Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu 65 70 75 80 CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG 288

Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly 85 90 95 TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA 336

Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg 100 105 110 AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG 384

Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala 115 120 125 GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC 432

Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp 130 135 140 AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA 480

Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly 145 150 155 160 GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG 528

Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly 165 170 175 GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT 576

Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser 180 185 190 GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG 624

Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 195 200 205 ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC 672

Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro 210 215 220 ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC 720

Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr 225 230 235 240 GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT 768

Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys Lys Val Thr Phe 245 250 255 GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC GTG CTC AAG GAG 816

Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp Val Leu Lys Glu 260 265 270 ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT CTA TCA GTA GAG 864

Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu 275 280 285 GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA TCT AAA TTT GGC 912

Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly 290 295 300 TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG GCC ATT AAC CAC 960

Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys Ala Ile Asn His 305 310 315 320 ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT GAA ACA CCA ATT 1008

Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Glu Thr Pro Ile 325 330 335 GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC GTC CAA CCA GAG 1056

Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gin Pro Glu 340 345 350 AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC CGA GAC TTG GGG 1104

Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly 355 360 365 GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG GTC TCC ACC CTC 1152

Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr Leu 370 375 380 CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG TAT TCT CCT GGA 1200

Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gin Tyr Ser Pro Gly 385 390 395 400 CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA AAG AAG ACC CCT 1248

Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro 405 410 415 ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACA GTC ACT GAG 1296

Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu 420 425 430 AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT TGT GAC TTG GCC 1344

Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala 435 440 445 CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC 1392

Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile 450 455 460 GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC GGC TAT CGC CGG 1440

Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg 465 470 475 480 TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT AAT ACC CTC ACA 1488

Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr 485 490 495 TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC 1536

Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp 500 505 510 TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT ATC TGT GAG AGC 1584

Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser 515 520 525 GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT 1632

Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala 530 535 540 ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC 1680

Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr 545 550 555 560 GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC 1728

Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His 565 570 575 GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT GAC CCG 1770

Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro 580 585 590 SEQ ID No.: 4 VOLGORDE TYPE: nucleotide met overeenkomend proteïne VOLGORDELENGTE: 1035 BASEPAREN.

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: cDNA tot genomisch RNA.

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: kloon JG3 uit cDNA-bibliotheek in lambda gtll.

BIJZONDERHEDEN: 1 - 1035 bp deel van het PT-NANBH-polyproteïne.

EIGENSCHAPPEN: codeert waarschijnlijk voor virale niet-structurele proteïnen.

ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA 48

Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys 5 10 15 CCT CTG CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC CAA TAC 96

Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val Gly Leu Asn Gin Tyr 20 25 30 CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAT GTA GCA GTG 144

Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val 35 40 45 CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC ACA GCA GAG ACG GCT 192

Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala 50 55 60 AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA 240

Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser 65 70 75 80 GCT AGC CAG TTG TCT GGC CCT TCC TCG AAG GCG ACA TAC ATT ACC CAA 288

Ala Ser Gin Leu Ser Gly Pro Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr Gin 85 90 95 AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG 336

Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg 100 105 110 CAT GAG ATG GGC GGG GAG ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG GTA 384

His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val 115 120 125 GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG CGG 432

Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg 130 135 140 GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC CCA 480

Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro 145 150 155 160 CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG CTG 528

Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu 165 170 175 GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG TGC 576

Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys 180 185 190 CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAG 624

Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys 195 200 205 AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG GAG 672

Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu 210 215 220 CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC AGC 720

Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp Ser 225 230 235 240 GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA GCA 768

Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly Ala ο/.ς o*;n οςς GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG 816

Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu 260 265 270 CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT GAG 864

Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Tbr Val Ser Glu 275 280 285 GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG ACA 912

Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr 290 295 300 GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC ATC 960

Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile 305 310 315 320 AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC GCT 1008

Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr Ala 325 330 335 ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG 1035

Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg 340 345 SEQ ID No.: 5 VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 834 BASEPAREN.

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: cDNA tot genomisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueur voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: kloon BR11 uit cDNA-bibliotheek in lambda gtll.

BIJZONDERHEDEN: 1 - 834 bp deel van het PT-NANBH-polyproteïne.

EIGENSCHAPPEN: codeert waarschijnlijk voor virale structurele proteïnen.

AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC GTC AGG TTC 48

Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gin Asp Val Arg Phe * 5 10 15 CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG 96

Pro Gly Gly Gly Gin Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 20 25 30 GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG 144

Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 35 40 45 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG 192

Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu 50 55 60 GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC 240

Gly Arg Ala Trp Ala Gin Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn 65 70 75 80 GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG 288

Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg 85 90 95 CCT AGT TGG GGC CCC ACT GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT 336

Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 100 105 110 AAA GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC TCT CAT GGG GTA 384

Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Ser His Gly Val 115 120 125 CAT TCC G'CT'CGT CGG CGC TCC CTT AGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG 432

His Ser Ala Arg Arg Arg Ser Leu Arg Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala 130 135 140 GAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT 480

His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 145 150 155 160 TTA CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT 528

Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 165 170 175 TTG ACC ATT CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC 576

Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile 180 185 190 TAC CAT GTC ACG AAC GAT TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA 624

Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr 195 200 205 GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG 672

Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 210 215 220 GGT AAT TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 720

Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 225 230 235 240 AAG GAC GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 768

Lys Asp Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 245 250 255 CTC GTT GGG GCG GCT GCC TTC TCG TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC 816

Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Ser Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 260 265 270 TGC GGA TCT GTT TTC CCG 834

Cys Gly Ser Val Phe Pro 275

SEQ ID No.: 6 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 31 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: bacteriofaag lambda gtll ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel; oligo d75 BIJZONDERHEDEN: 4-9 basen BamHl-plaats 10 - 31 basen homoloog aan bovendeel van lacZ-gen flankeert de EcoRI-plek in bacteriofaag lambda gtll 26 - 31 basen EcoRI-plek EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese van de faagvector in cDNA ingébracht bij de EcoRI-plek en introduceert een BamHl-plek geschikt voor latere klonering in expressievectoren.

TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C 31

SEQ ID No.: 7 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 30 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: bacteriofaag lambda gtll ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel; oligo d76 BIJZONDERHEDEN: van 4-9 basen BamHl-plek van 10 - 30 basen homoloog aan bendendeel van lacZ-gen flankeert de EcoRI-plaats in bacteriofaag lambda gtll EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese uit de faagvector in cDNA ingébracht bij de EcoRI-plek en introduceert een BamHl-plek geschikt voor later kloneren in expressievectoren.

TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG 30

SEQ ID No.: 8 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 19 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusië niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel; oligo d94 BIJZONDERHEDEN: 1 - 19 basen homoloog aan basen 814 - 932 van de sense-streng van JG2 (SEQ ID No.:3) EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de negatieve streng van PT-NANBH genoom RNA/DNA.

ATGGGGCAAA GGACGTCCG 19

SEQ ID No.: 9 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 24 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel; oligo d95 BIJZONDERHEDEN: 1-24 basen homoloog aan basen 1620 - 1643 van de anti-sense streng van JG2 (SEQ ID No.:3) EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de positieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA.

TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG 24

SEQ ID No.: 10 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 17 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel;

oligo NI

BIJZONDERHEDEN: 1-17 basen homoloog aan basen 1033 - 1049 van de sense streng van JG2 (SEQ ID No.:3) EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de negatieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA.

GAGGTTTTCT GCGTCCA 17

SEQ ID No.:11 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 17 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel; oligo N2 BIJZONDERHEDEN: 1-17 basen homoloog aan de basen 1421 - 1437 van de anti-sense streng van JG2 (SEQ ID No.:3) EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de positieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA. : GCGATAGCCG CAGTTCT 17

SEQ ID No.:12 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 22 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide-synthesetoestel; oligo dl64 BIJZONDERHEDEN: 1-22 basen homoloog aan basen 10 - 31 van de volgorde in fig.2 van Okamoto et al., JAPAN. J. Exp. Med., 1990, 60, 167 - 177, base 22 gewijzigd van A in T ter invoering van Bgl2 herkenningsplaats; 8-13 basen Bgl2 herkenningsplaats.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de negatieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA en introduceert een Bgl2-plaats.

CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT 22

SEQ ID No.:13 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 30 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo dl37 BIJZONDERHEDEN: 1-30 basen homoloog aan basen 154 - 183 van de negatieve streng van BR11 (SEQ ID No.:5); basen 174, 177, 178 gemodificeerd door invoering van een EcoRI-herkenningsplek.

5-10 basen EcoRI-herkenningsplek.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de positieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA en introduceert een EcoRI-plek voor klonering.

CGCAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC 30

SEQ ID No.: 14 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGQRDELENGTE: 27 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECüULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis.

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo dl36 BIJZONDERHEDEN: 1-17 basen homoloog aan basen 672 - 698 van de positieve streng van BR11 (SEQ ID No.: 5); base 675 gewijzigd in G ter invoering van een

EcoRI-herkenningsplek; van 4 - 9 basen EcoRI-herkenningsplek.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de negatieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA en introduceert een EcoRI-plek voor klonering.

GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAGC 27

SEQ ID No.: 15 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 28 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECÜULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: chimpansee; serum infectueus voor post-transfusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo dl55 BIJZONDERHEDEN: 1-28 basen homoloog aan basen 462 - 489 van de negatieve streng van fig.47, Europese octrooiaanvrage 88310922.5; basen 483 en 485 gewijzigd ter invoering van een EcoRI-herkenningsplek; 5-10 basen EcoRI-herkenningsplek.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de positieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA en introduceert een EcoRI-plek voor klonering.

ACGGGAATTC GACCAGGCAC CTGGGTGT 28

SEQ ID No.: 16 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 23 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: chimpansee; serum infectueus voor post-transfusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo dl56 BIJZONDERHEDEN: 1-23 basen homoloog aan basen 3315 - 3337 van de positieve streng van fig.47, Europese octrooiaanvrage 88310922.5; base 3323 gewijzigd in C ter invoering van een EcoRI-herkenningsplek; 4-9 basen EcoRI-herkenningsplek.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de negatieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA en introduceert een EcoRI-plek voor klonering.

CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT 23

SEQ ID No.: 17 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 29 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo d92 BIJZONDERHEDEN: 1-29 basen homoloog aan de basen 36 - 64 van de negatieve streng van JG2 (SEQ ÏD No.: 3); basen 57, 58 en 60 gewijzigd ter invoering van een

EcoRl-herkenningsplek; van 5 - 10 basen EcoRl-herkenningsplek.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese op de positieve streng van PT-NANBH genomisch RNA/DNA en introduceert een EcoRI-plek voor klonering.

CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG 29 SEQ ID No.: 18

VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 504 BASENPAREN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: cDNA tot genomisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: kloon 164/137 BIJZONDERHEDEN: 308 - 504 bp start van het PT-NANBH-polyproteïne EIGENSCHAPPEN: codeert waarschijnlijk voor virale structurele proteïnen GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240 AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300 GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397

Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CC 504

Gin Pro Ile Pro 65 SEQ ID No.: 19

VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 1107 BASEPAREN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUÜLTYPE: cDNA tot genomisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-transfusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: kloon 136/155 BIJZONDERHEDEN: 1 - 1107 bp deel van het PT-NANBH-polyproteïne EIGENSCHAPPEN: codeert waarschijnlijk voor virale structurele proteïnen.

TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC 48

Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp 5 10 15 GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT 96

Ala Ser He Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val 20 25 30 GGG GCG GCT GCC TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA 144

Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly 35 40 45 TCT GTT TTC CTC GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG GCT CGC CGA CAT 192

Ser Val Phe Leu Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Hls 50 55 60 CAG ACG GTA CAG GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA 240

Gin Thr Val Gin Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser 65 70 75 80 GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA 288

Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 85 90 95 GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC 336

Ala Leu Val Val Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala Val Val Asp 100 105 110 ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT 384

Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr 115 120 125 TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT 432

Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe 130 135 140 GCC GGC GTT GAC GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC 480

Ala Gly Val Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg 145 150 155 160 GCC GCC CAC GGG CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA 528

Ala Ala His Gly Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys 165 170 175 ATC CAG CTT GTA AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC 576

Ile Gin Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 180 185 190 TTG AAC TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC 624

Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe 195 200 205 TAC ACG CAC AGG TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC 672

Tyr Thr His Arg Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser 210 215 220 TGC CGC CCC ATT GAC CAG TTC GAT GAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT 720

Cys Arg Pro Ile Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr 225 230 235 240 AAT GAG TCC CAC GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA 768

Asn Glu Ser His Gly Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala 245 250 255 CCT CAA CCG TGT GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG 816

Pro Gin Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val 260 265 270 TAC TGT TTC ACT CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC 864

Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe 275 280 285 GGC GCC CCT ACG TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT 912

Gly Ala Pro Thr Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu 290 295 300 CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG 960

Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp 305 310 315 320 ATG AAT AGC ACC GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC 1008

Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn 325 330 335 ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC 1056

Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe 340 345 350 CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG 1104

Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp 355 360 365

TTG

1107

Leu SEQ ID No.: 20

VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 2043 BASEPAREN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: cDNA tot genomisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-transfusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: kloon 156/92 BIJZONDERHEDEN: 1 - 2043 bp deel van het PT-NANBH-polyproteïne EIGENSCHAPPEN: codeert waarschijnlijk voor virale niet-structurele proteïnen.

TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48

Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu 5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96

Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30 CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT 144

Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CGT ACT CTG CGC GGG CCA 192

Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240

Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 65 70 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288

Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu 85 90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336

Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 100 105 110 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384

Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 115 120 125 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432

Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 480

Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528

Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu 165 170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576

Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG 624

Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 195 200 205 TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672

Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 210 215 220 CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC 720

Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 225 230 235 240 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG 768

Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 245 250 255 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816

Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 260 265 270 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 864

Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 275 280 285 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912

Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 290 295 300 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960

Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320 GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008

Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056

Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly 340 345 350 GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG XTC GCC TCG'CGG 1104

Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg 355 360 365 GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152

Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala 370 375 380 GGA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTC 1200

Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu 385 390 395 400 AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248

Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser 405 410 415 GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTG GCT 1296

Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala 420 425 430 GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 1344

Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly 435 440 445 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392

Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly 450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440

Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly 465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488

His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser 485 490 495 AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 1536

Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro 500 505 510 TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584

Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC 1632

Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 530 535 540 GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA 1680

Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro 545 550 555 560 GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC 1728

Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr 565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC 1776

Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 1824

Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC 1872

Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 610 615 620 ACA GCA GAG ACG GCT AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC 1920

Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 625 630 635 640 TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC'TCG AAG GCG 1968

Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala 645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAG GCT GAG CTC ATC GAG GCC 2016

Thr Tyr Ile Thr Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu ïle Glu Ala 660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC 2043

Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly 675 680 SEQ ID No.: 21

VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 2116 BASEPAREN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: cDNA tot genoraisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueusvoorpost-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: aansluitend gevormd door cDNA-klonen van het 5'-uiteinde van het genoom BIJZONDERHEDEN: van 308 - 2116 bp start van het PT-NANBH-polyprotelne EIGENSCHAPPEN: virale structurele en niet-structurele proteïnen..

GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60 TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 120 ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240 AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300 GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn 5 1° ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 397

Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 445

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 541

Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gin 65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC GAG GGC ATG GGG TGG GCA 589

Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala 80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACT 637

Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 100 105 110 115 GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAA GTC ATC GAT ACC CTC 685

Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 120 125 130 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCT 733

Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala 135 140 145 CCC TTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG 781

Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu 150 155 160 GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTA CCC GGT TGC TCT TTC 829

Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe 165 170 175 TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATT CCA GGT TCC 877 Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Iie Pro Ala Ser 180 185 190 195 GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC TAC CAT GTC ACG AAC GAT 925

Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp 200 205 210 TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA GCG GAC ATG ATC ATG CAC 973

Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Met Ile Met His 215 220 225 ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG GGT AAT TCC TCC CGC TGC 1021

Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys 230 235 240 TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC GCC AGC ATC CCC 1069

Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ser Ile Pro 245 250 255 ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCC 1117

Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 260 265 270 275 TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC 1165

Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 280 285 290 GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT CAG ACG GTA CAG 1213

Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Gin Thr Val Gin 295 300 305 GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGT CAC CGC ATG 1261

Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 310 315 320 GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA GCC CTA GTG GTA 1309

Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val 325 330 335 TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG 1357

Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly 340 345 350 355 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1405

Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 360 365 370 AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC 1453

Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 375 380 385 GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC GCC GCC CAC GGG 1501

Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg Ala Ala His Gly 390 395 400 CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA ATC CAG CTT GTA 1549

Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys Ile Gin Leu Val 405 410 415 AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC TTG AAC TGC AAT 1597

Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 420 425 430 435 GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACG CAC AGG 1645

Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Arg 440 445 450 TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT 1693

Phe Asn Ala Ser Gly Cys Sar Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile 455 460 465 GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT AAT GAG TCC CAC 1741

Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asn Glu Ser His 470 475 480 GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT CAA CCG TGT 1789

Gly Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gin Pro Cys 485 490 495 GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG TAC TGT TTC ACT 1837

Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 500 505 510 515 CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACG 1885

Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr 520 525 530 TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT CTC AAC AAC ACG 1933

Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 535 540 545 CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACC 1981

Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr 550 555 560 GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG GTC 2029

Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val 565 570 575 GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC 2077

Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro 580 585 590 595 GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CGT TGG TTG 2116

Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 600 605 SEQ ID No.: 22

VOLGORDETYPE: nucleotide met overeenkomstig proteïne VOLGORDELENGTE: 3750 BASEPAREN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: cDNA tot genomisch RNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: humaan; serum infectueus voor post-trans-fusie niet-A, niet-B hepatitis ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: aansluitend gevormd door cDNA-klonen uit het 3'-uiteinde van het genoom. BIJZONDERHEDEN: 1 - 3750 bp deel van het PT-NANBH-polyproteïne EIGENSCHAPPEN: virale niet-structurele proteïnen.

TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48

Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu 5 10 15 TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC 96

Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30 » CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT. 144

Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45 CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA 192

Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60 ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC 240

Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 65 70 75 80 ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG 288

Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu 85 90 95 GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT 336

Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 100 105 110 CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG 384

Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 115 120 125 ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432

Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 130 135 140 TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC 480

Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160 ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528

Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu 165 170 175 GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG 576

Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 180 185 190 GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG 624

Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 195 200 205 TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG 672

Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 210 215 220' CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC 720

Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 225 230 235 240 ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG 768

Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly 245 250 255 GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC 816

Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 260 265 270 GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG 864

Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 275 280 285 AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912

Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 290 295 300 GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960

Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320 GAG GTG GTT AAG TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008

Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val 325 330 335 GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056

Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly 340 345 350 GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG 1104

Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu 11e Ala Phe Ala Ser Arg 355 360 365 GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152

Gly Asn His Val Ser Pro Thr Hls Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala 370 375 380 GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 1200 Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu 385 390 395 400 AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248 Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser 405 410 415 GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTG GCT 1296 Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala 420 425 430 GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 1344 Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly 435 440 445 GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392 Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly 450 455 460 GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 1440 Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly 465 470 475 480 CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488 His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser 485 490 495 AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 1536

Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro 500 505 510 TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584

Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 520 525 GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC 1632

Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu 'Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 530 535 540 GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA 1680

Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro 545 550 555 560 GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC 1728

Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr 565 570 575 GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC 1776

Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590 GGG CTC AAC CAA TAC CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 1824

Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 600 605 CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC 1872

Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 610 615 620 ACA GCA GAG ACG GCT AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC 1920

Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 625 630 635 640 TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG 1968

Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala 645 650 655 ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAG CTC ATC GAG GCC 2016

Thr Tyr Ile Thr Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala 660 665 670 AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG 2064

Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu 675 680 685 TCA GAG AAC AAG GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG 2112

Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala 690 695 700 GAG GAG GAT GAG CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA 2160

Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys 705 710 715 720 TCC AAG AAA TTC CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC 2208

Ser Lys Lys Phe Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr 725 730 735 AAC CCT CCG CTG CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA 2256

Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro 740 745 750 GTG GTA CAT GGG TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA 2304

Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro 755 760 765 CCT CCA CGG AGG AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT 2352

Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser 770 775 780 TCT GCC CTG GCG GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTC GGT AGC TCC GAA CCG 2400

Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Glu Pro 785 790 795 800 TCG GCC GTC GAC AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA CCC TCC 2448

Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Pro Ser 805 810 815 GAC GAC GGC GGA GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC 2496

Asp Asp Gly Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro 820 825 830 CCC CTT GAG GGG GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG 2544

Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp 835 840 845 TCT ACC GTG AGT GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG 2592

Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met 850 855 860 TCC TAC ACA TGG ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA 2640

Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu 865 870 875 880 AGC AAG CTG CCC ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC 2688

Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His 885 890 895 AAC ATG GTC TAC GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG 2736

Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys 900 905 910 AAG GTC ACC TTT GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC 2784

Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp 915 920 925 GTG CTC AAG GAG ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT 2832

Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu 930 935 940 CTA TCA GTA GAG GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA 2880

Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys 945 950 955 960 TCT AAA TXT GGC TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG 2928 Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys 965 970 975 GCC ATT AAC CAC ATC CGC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT 2976 Ala Ile Asn His He Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr 980 985 990 GAA ACA CCA ATT GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC 3024 Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys 995 1000 1005 GTC CAA CCA GAG AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC 3072 Val Gin Pro Glu Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe 1010 1015 1020 CCA GAC TTG GGG GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG 3120 Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val 1025 1030 1035 1040 GTC TCC ACC CTC CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG 3168 Val Ser Thr Leu Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gin 1045 1050 1055 TAT TCT CCT GGA CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA 3216 Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser 1060 1065 1070 AAG AAG ACC CCT ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TXT GAC TCA 3264

Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser 1075 1080 1085 ACA GTC ACT GAG AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT 3312

Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys 1090 1095 1100 TGT GAC TTG GCC CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG 3360

Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu 1105 1110 1115 1120 CGG CTT TAT ATC GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC 3408

Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys 1125 1130 1135 GGC TAT CGC CGG TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT 3456

Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly 1140 1145 1150 AAT ACC CTC ACA TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA 3504

Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala 1155 1160 1165 AAG CTC CAG GAC TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT 3552

Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val 1170 1175 1180 ATC TGT GAG AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC 3600

Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 TTC ACG GAG GCT ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC 3648

Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro 1205 1210 1215 CAA CCA GM TAC GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG 3696

Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val 1220 1225 1230 TCG GTC GCG CAC GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT 3744

Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg 1235 1240 1245 GAC CCG 3750

Asp Pro 1250

SEQ ID No.: 23 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 23 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: baculovirus Autographa californica Nuclear Pólyhedrose - virus (AcNPV) ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo d24 BIJZONDERHEDEN: 1 - 23 basen homoloog aan deel van AcNPV-polyhedrine-gen beneden de BamHI-kloneringsplaats in pAc360 en soortgelijke vectoren. EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese uit baculovirus-overdrachtsvectorvolgorden die DNA ingebracht bij de BamHI-plek flankeren.

CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC 23

SEQ ID No.: 24 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 31 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrose-virus (AcNPV) ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo dl26 BIJZONDERHEDEN: 1-31 basen homoloog aan de bovenkruispuntvolgorden geproduceerd wanneer cDNA vermenigvuldigd door d75 (SEQ ID 5) wordt gekloneerd in de BamHI-kloneringsplek in pAc360 en soortgelijke vectoren; niet-aanpassingen bij basen 13 en 14 introduceren een Pstl-plek.

1-10 basen homoloog aan gebied van BamHl-plek in pAc360 en soortgelijke vectoren.

4-9 basen BamHI-plek 12 - 17 basen Pstl-plek.

EIGENSCHAPPEN: instrueert DNA-synthese bij het kruispunt van baculovirus-overdrachts-vectorvolgorden en volgorden die eerder zijn vermeerderd door oligo d75; introduceert een Pstl-herkenningsplaats voor later kloneringswerk.

TAAGGATCCC CCT GCA GTA TCG GCG GAA TTC 31

Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe 5

SEQ ID No.: 25 VOLGORDETYPE: nucleotide VOLGORDELENGTE: 45 BASEN

STRENG: enkel TOPOLOGIE: lineair MQLECUULTYPE: synthetisch DNA

OORSPRONKELIJKE BRONORGANISME: N/A

ONMIDDELLIJKE EXPERIMENTELE BRON: oligonucleotide synthesetoestel; oligo dl32 BIJZONDERHEDEN: van 5-10 basen Pstl-herkenningsplaats van 13 - 27 basen koppelaar coderende voor vijf Lys-residuen van 28 - 45 basen homoloog aan de basen 4-21 van BR11 (SEQ ID 7) EIGENSCHAPPEN: , instrueert DNA-synthese bij het 51-uiteinde van BR11 en introduceert een synthetische volgorde die codeert voor vijf lysinen alsmede een PstI herkenningsplek voor later kloneringswerk.

CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA CGT AAC ACC A 45

Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu 5 10

Claims (20)

1. PT-NANBH viraal polypeptide omvattende een antigeen met een ami-nozuurvolgorde die tenminste voor 90% homoloog is met de aminozuurvolgorde, aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, of een antigeen fragment daarvan.

2. PT-NANBH viraal polypeptide volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de aminozuurvolgorde voor tenminste 90% homoloog is met de aminozuur-volgorde aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4 of 5, of een antigeen fragment daarvan is.

3. PT-NANBH viraal polypeptide volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de aminozuurvolgorde voor tenminste 90% homoloog is met de aminozuurvolgorde aangegeven in SEQ ID No.: 3 of 4, of een antigeen fragment daarvan is.

4. PT-NANBH viraal polypeptide volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de aminozuurvolgorde voor tenminste 90% homoloog is met de aminozuurvolgorde aangegeven in SEQ ID No.: 5, of een antigeen fragment daarvan is.

5. PT-NANBH viraal polypeptide volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de aminozuurvolgorde voor tenminste 95% homoloog is met de aminozuurvolgorde aangegeven in SEQ ID No.: 2, of een antigeen fragment daarvan is.

6. PT-NANBH viraal polypeptide volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de aminozuurvolgorde voor tenminste 98% homoloog is met de aminozuurvolgorde, aangegeven in de SEQ ID No.: of een antigeen fragment daar van is.

7. PT-NANBH viraal polypeptide omvattende een antigeen uit het structurele coderingsgebied van het virale genoom en een antigeen uit het niet-structurele coderingsgebied van het virale genoom.

8. PT-NANBH viraal polypeptide volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het antigeen uit het structurele coderingsgebied een aminozuurvolgorde heeft die voor tenminste 90% homoloog is met de aminozuurvolgorde aangegeven in SEQ ID No.: 5, of een antigeen fragment daarvan is, en het antigeen uit het niet-structurele coderingsgebied een aminozuurvolg- orde heeft die voor tenminste 90% homoloog is met de aminozuurvolgorde aangegeven in SEQ ID No.: 3 of 4, of een antigeen fragment daarvan is.

9. DNA-Volgorde die codeert voor PT-NANBH viraal polypeptide volgens een van de conclusies 1-8.

10. DNA-volgorde volgens conclusie 9, als aangegeven in SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22.

11. Expressievector die een DNA-volgorde bevat, volgens een van de conclusies 9 of 10, en die in staat is in een geschikte gastheer de DNA-volgorde tot expressie te brengen ter vorming van een PT-NANBH viraal polypeptide.

12. Gastheercel getransformeerd met een expressievector volgens conclusie 11.

13. Werkwijze voor het bereiden van een PT-NANBH viraal polypeptide welke omvat het kloneren of synthetiseren van een DNA-volgorde die codeert voor een PT-NANBH viraal polypeptide volgens een van de conclusies 1-8, het inbrengen van de DNA-volgorde in een expressievector en wel zodanig, dat deze in staat is in een geschikte gastheer tot expressie te worden gebracht, het transformeren van een gastheercel met de expressievector, het kweken van de getransformeerde gastheercel en het isoleren van het virale polypeptide.

14. Polyklonaal of monoklonaal antilichaam tegen een PT-NANBH viraal polypeptide, volgens een van de conclusies 1-6.

15. Werkwijze voor het detecteren van PT-NANBH viraal kernzuur, welke omvat: i) het hybridiseren van in een proefmonster aanwezig viraal RNA, of cDNA gesynthetiseerd uit dergelijk RNA, met een DNA-volgorde die overeenkomt met SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, en het uitsorteren van de resulterende kernzuurhybriden voor het identificeren van elk PT-NANBH viraal kernzuur; of iij het synthetiseren van cDNA uit viraal RNA aanwezig in een proefmonster, het vermeerderen van een voorgekozen DNA-volgorde die overeenkomt met een deelvolgorde van de SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, en het identificeren van de voorgekozen DNA-volgorde.

16. Testkit voor de detectie van PT-NANBH viraal kernzuur, welke om- vat: i) een paar van oligonucleotide primers waarvan één overeenkomt met een deel van de nucleotide volgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22, en waarvan de andere is gelokaliseerd bij de 31-kant van de eerste en overeenkomt met een deel van de complementaire volgorde, welk paar daartussen een voorgekozen DNA-volgorde vastlegt; ii) een reverse transcriptase-enzym voor de synthese van cDNA uit proefmonster RNA stroomopwaarts van de primer overeenkomend met de complementaire nucleotidevolgorde van SEQ ID No.: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 of 22; iii) een enzym dat in staat is de voorgekozen DNA-volgorde te vermeerderen; en naar keuze iv) het wassen van de oplossingen en de reactiebuffers.

17. Werkwijze voor het detecteren van PT-NANBH viraal antigeen of viraal antilichaam, welke omvat het in reactie brengen van een proefmonster met een PT-NANBH viraal polypeptide volgens een van de conclusies 1-8, of een polyklonaal of monoklonaal antilichaam volgens conclusie 14, en het vaststellen of er al of niet een antigeen-antilichaambinding binnen het proefmonster aanwezig is.

18. Testkit voor de detectie van PT-NANBH viraal antigeen of viraal antilichaam, welke omvat een PT-NANBH viraal polypeptide volgens een van de conclusies 1 - 8, of een polyklonaal of monoklonaal antilichaam volgens conclusie 14, en middelen voor het vaststellen of er al dan niet een antigeen-antilichaambinding binnen het proefmonster aanwezig is.

19. Vaccinpreparaat welke omvat een PT-NANBH viraal polypeptide volgens een van de conclusies 1-8, in samenhang met een farmaceutisch aanvaardbare drager.

20. Werkwijze voor het induceren van immuniteit bij mensen ten opzichte van PT-NANBH, welke omvat het toedienen van een effectieve hoeveelheid van een vaccinpreparaat volgens conclusie 19.