NL9001443A - Enzymatische, enantioselektieve bereiding van r-glycidol. - Google Patents

Description

Uitvinders: Arie Geerlof te Alphen aan de Rijn Johannis A. Duine te Schiedam

ENZYMATISCHE, ENANTIOSELEKTIEVE BEREIDING VAN R-GLYCIDOL

-1- (10)

De uitvinding heeft betrekking op een enzymatische, enantioselektieve bereiding van R-glycidol.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit US-A-4732853, waarin de enzymatische hydrolyse van (R,S)-glycidylesters met behulp van een lipase is beschreven.

Bij deze werkwijze wordt echter uitgegaan van de ester van glycidol. Deze ester dient eerst uit glycidol te worden bereid,zodat een extra stap in de bereiding nodig is. Daarnaast geldt dat het lipase R-glycidol levert met een beperkte optische zuiverheid.

De uitvinding beoogt een eenvoudige werkwijze te verschaffen waarbij het gewenste enantiomeer reeds in het mengsel van enantiomeren dat het uitgangsprodukt vormt, aanwezig is.

Dit wordt volgens de uitvinding hierdoor bereikt dat men een mengsel van R en S-glycidol onderwerpt aan de inwerking van een geschikt enantioselektief oxiderend enzym.

Optisch zuiver R-glycidol alsmede derivaten hiervan,zoals bijvoorbeeld het tosylderivaat,zijn geschikt voor diverse toepassingen,in het bijzonder voor het gebruik als uitgangsverbinding voor de bereiding van daarvan afgeleide chirale farmaceutische verbindingen. Een algemene voorwaarde is echter wel dat het produkt voldoende optisch zuiver is ,dat wil zeggen dat meestal een enantiomere overmaat van meer dan 98 % wordt geëist. Er bestaat derhalve een grote belangstelling voor alternatieve bereidingswijzen voor deze universele chirale synthons.

In de publikatie van T.Katsuki en K.B.Sharpless in J. Am. Chem. Soc. 102, 5976-5980 (1980), staat een bereiding van chirale glycidolen langs chemische weg via asymmetrische epoxidate van allylalcohol beschreven. Een dergelijke, chemische, route is in de praktijk veelal minder aantrekkelijk, doordat opschaling lastig is en door de noodzaak extreem droge condities te gebruiken i.v.m. katalysator vergiftiging.

De onderhavige uitvinding berust op een enantioselektieve enzymatische oxidatie van R,S-glycidol waarbij met grote voorkeur het S-enantiomeer wordt geoxideerd en dientengevolge een R-glycidol verrijkt produkt resteert.

Organismen die bijzonder geschikt zijn voor de onderhavige werkwijze zijn bijvoorbeeld Acetobacter pasteurianus,Acetobacter aceti en Gluconobacter oxydans. De produktie van deze organismen vindt plaats in beluchte media die componenten zoals een koolstofbron,een stikstofbron,vitaminen,mineralen e.d. bevatten. De kweek kan zowel batch,fed-batch als continu worden uitgevoerd.

Dergelijke kweekmethoden zijn algemeen bekend en veelvuldig in octrooischriften en wetenschappelijke publicaties beschreven,zoals bijvoorbeeld in EP-A-244912, zodat een beschrijving van die kweekmethoden in dit kader overbodig is. Het enzympreparaat zoals dat bij de onderhavige uitvinding wordt gebruikt,wordt niet beperkt door zuiverheid e.d. en kan zowel een ruwe enzymoplossing als een gezuiverd enzym zijn,maar het kan ook bestaan uit (gepermeabiliseerde en/of geïmmobiliseerde) cellen,die de gewenste aktiviteit bezitten,of uit een homogenaat van cellen met een dergelijke aktiviteit. Het enzym kan ook in geïmmobiliseerde vorm of in chemisch gemodificeerde vorm worden gebruikt. Wanneer in het gebruikte enzympreparaat ook enige ongewenste tegengestelde enzymaktiviteit aanwezig is verdient het aanbeveling deze ongewenste aktiviteit te verwijderen of te onderdrukken teneinde een maximale enantioselektiviteit te verkrijgen. De uitvinding wordt op geen enkele wijze beperkt door de vorm waarin het enzym voor de onderhavige uitvinding wordt gebruikt. Binnen het kader van de uitvinding kan uiteraard ook een

alcoholdehydrogenase,bij voorkeur een PQQ-afhankelijk (PQQ

staat voor pyrrolo-chinoline-chinon, dat is 2,7,9-tricarboxy-lH-pyrrolo[2,3f]chinoline-4,5-dion) alcoholdehydrogenase, worden gebruikt dat afkomstig is van een mutant of van een genetisch gemodificeerd microörganisme.

Indien tijdens de kweek van het microörganisme geen of niet voldoende PQQ wordt gevormd ,kan het gewenst zijn voor de oxidatie extra PQQ toe te voegen. In plaats van PQQ kunnen ook PQQ-analoga worden toegepast,zoals bijvoorbeeld monoesters van PQQ (op de 2-plaats), 3-methyl-PQQ, 3-ethyl-PQQ, 3-propyl-PQQ, N-methyl-PQQ, N-ethyl-PQQ, 8-methyl-PQQ, 4-hydroxy-PQ (PQ staat voor pyrrolochinoline) of 5-hydroxy-PQ na oxidatie, of het PQQ/aceton-adduct en andere aldehyde- en keton-adducten, zoals beschreven door J.A. Jongejan, B.w. Groen, en J.A. Duine in "PQQ and Quinoproteïns (J.A. Jongejan and J.A. Duine,eds.) Kluwer Academie Publishers, Dordrecht, 1989, 205-216.

Voor de enantioselektieve oxidatie van R-glycidol wordt bij voorkeur een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase gebruikt dat afkomstig is uit Acetobacter pasteurianus, ATCC 12874,Acetobacter aceti, ATCC 15973, of Gluconobacter oxydans, ATCC 621.

Enantioselektieve enzymatische oxidaties zijn op zichzelf bekend. Enantioselektieve oxidatie van glycidol is daarentegen niet eerder in de literatuur beschreven. De enantioselektiviteit berust op een verschil in omzettingssnelheden van de verschillende enantiomeren. Men verkrijgt reaktieprodukten die aan één van de enantiomeren verrijkt zijn. Voor praktische doeleinden is het in het algemeen gewenst dat één van de enantiomeren met grote overmaat wordt verkregen. Dit wordt bereikt door de omzetting bij een bepaalde conversiegraad te beëindigen.

Voor enantioselektieve, enzymatische hydrolyses is dat beschreven door Qu-Ming Gu et. al. in Tetrahedron Letters 27 (1986) 5203 e.v. en meer algemeen door Ghing-Shih Chen et al. in J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7294 e.v. De in die publikaties beschreven algemene leer van enantioselektieve omzettingen geldt ook voor de onderhavige werkwijze.

Volgens de onderhavige werkwijze wordt door de inwerking van een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase het S-enantiomeer van glycidol met grotere snelheid geoxideerd dan het R-enantiomeer, waardoor een aan R-glycidol verrijkt reaktieprodukt resteert. De reaktiesnelheden van de enantiomeren blijken aanmerkelijk te verschillen waardoor men, uitgaande van een racemisch mengsel, bij een conversie van 55% al een enantiomere overmaat van meer dan 95% van het R-glycidol kan verkrijgen. Een enantiomere overmaat van meer dan 99% kan, eveneens uitgaande van een racemisch mengsel, reeds worden bereikt bij een conversie tussen 55% en 60%. Uitgaande van aan R-enantiomeer verrijkte mengsels worden betere resultaten bereikt, waarbij het enzym zijn selectiviteit behoudt. De percentages R- en S-enantiomeer in het eindprodukt verschuiven volgens algemene leer, afhankelijk van de percentages R- en S-enantiomeer in het uitgangsprodukt.

De bij de reaktie gebruikte cellen kunnen desgewenst worden afgescheiden en in een volgende omzetting opnieuw worden ingezet, zonder dat daardoor de aktiviteit noemenswaard wordt beïnvloed.

De reakties worden meestal uitgevoerd in een waterig milieu. Het is ook goed mogelijk oxidatie-/reductiereakties in organische oplosmiddelen uit te voeren.

De pH van het reaktiemengsel zal veelal liggen tussen 3 en 10, bij voorkeur wordt een pH tussen 4 en 7 aangehouden. De pH kan bijvoorbeeld op een bepaalde waarde worden gehouden door een buffer toe te voegen of door continu loog te doseren.

De temperatuur waarbij de reaktie wordt uitgevoerd kan binnen wijde grenzen variëren en ligt meestal tussen -20° en 100 °C, bij voorkeur tussen 20 en 35°C.

Om een goede toevoer van de voor de oxidatie benodigde zuurstof, desgewenst in de vorm van lucht, veilig te stellen wordt de reaktie meestal onder geforceerde beluchting uitgevoerd. De reaktie kan ook worden uitgevoerd onder elektrochemische omstandigheden.

De uitvinding wordt verduidelijkt door de volgende voorbeelden, zonder daardoor te worden beperkt.

In deze voorbeelden zijn de analyses van de reaktieprodukten, met name wat betreft de bepaling van de enantioroere overmaat (ee) uitgevoerd met behulp van de hieronder beschreven methode (TAGIT-methode) waarbij, indien gewenst, de selectiviteitswaarde voor de reaktie kan worden berekend met behulp van de formules van Chen et al. (J. Am. Chem. Soc. 104, 7294 e.v. (1982)). Wat betreft de conversiebepaling werd gebruik gemaakt van kolomscheiding over een Aminex HPX-87H HPLC kolom met 0,01 N H2SC>4 als loopmiddel en detectie van glycidol aan de hand van de brekingsindex.

Alle analyses werden steeds uitgevoerd aan, op diverse tijdstippen, uit het reaktiemengsel van de experimenten genomen monsters van 1-2 ml wat betreft de conversiebepaling, respectievelijk van 10-50 ml voor de ee-bepaling, afhankelijk van de conversie.

Bij de e.e.-bepaling worden de monsters, na met natriumchloride te zijn verzadigd, met twee maal 20-100 ml dichloormethaan geëxtraheerd. 50 μΐ van het residu dat na indampen van het extract wordt verkregen wordt opgelost in 1.0 ml n-butylamine. Deze oplossing wordt in een afgesloten reactievaatje gedurende 1 uur bij 100°C verwarmd. De overmaat n-butylamine wordt vervolgens afgedampt en het residu overnacht in een vacuümexsiccator boven P2Og gedroogd. Dit residu wordt opgelost in 0,5 ml acetonitril, waarna 2,5 μΐ van de verkregen oplossing wordt vermengd met 50 μΐ acetonitril en 1 mg 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-0-gluco-pyranosyl-isothiocyanaat (TAGIT). Vijf minuten na het mengen wordt vervolgens de e.e. bepaling met behulp van een reversed phase (C^g) kolom met 48/52 methanol/water als loopmiddel.

Deze methode voor de bepaling van de enantiomere overmaat is zeer geschikt gebleken. Hierbij wordt een uitstekende scheiding van de R- en S-enantiomeren van glycidol (in gederivatiseerde vorm) verkregen.

Voorbeeld 1

Acetobacter pasteurianus ATCC 12874 werd in een 2.0 1 Erlemeyer gekweekt (28°C, 250 rpm) die 300 ml kweekmedium bevatte. De samenstelling van dit kweekmedium was als volgt: 1,55 gl"1 K2HP04, 0,85 gl"1 NaH2P04.H20; 2,0 gl"1 NH4C1? 0,1 gl-1 (NH4)2 S04; 0,1 gl"1 MgCl2.6H20. 0,1 gl"1 gist-extract, 0,2 ml sporeelementen oplossing (W. Vishniac & M. Santer Bact. Rev. (1957) 21, 195-213) en 10 gl ethanol, de pH bedroeg 7,0. Op het einde van de exponentiële groeifase werden de cellen afgescheiden m.b.v. centrifugatie.

De aldus verkregen cellen werden toegevoegd aan 100 ml 50 mM kaliumfosfaatbuffer pH 6,0 (30°C) die 100 mM R,S-glycidol bevatte. Om voor voldoende zuurstof zorg te dragen werd het incubatiemengsel geroerd en belucht, de pH werd op 6,0 gehouden door titratie met 2N NaOH. Nadat 59% van het R,S-glycidol geoxideerd was, werd de incubatie gestopt, de cellen afgescheiden door centrifugatie en het resterend alcohol in de waterfase geanalyseerd op optische zuiverheid. De enantiomere overmaat bedroeg 99%.

Voorbeeld 2

Acetobacter pasteurianus ATCC 12874 werd batchgewijs gekweekt zoals beschreven in voorbeeld 1. De verkregen cellen werden toegevoegd aan een 1,5 1 fermentor bevattende 1,0 1 50 mM kaliumfosfaatbuffer pH 6,0, en 100 mM R,S-glycidol. Gedurende de incubatie werd de pH op 6,0 gehouden door toediening van 3,0 N NaOH, bedroeg de temperatuur 30°C, en werd de opgeloste zuurstofconcentratie op ca. 100 //M gehouden door het regelen van zowel de roersnelheid als de luchttoevoer. Nadat 56% van het glycidol geoxideerd was werd de incubatie gestopt. De enantiomere overmaat aan R-glycidol bedroeg 98%.

Voorbeeld 3

Gelijk voorbeeld 1 is ook een R,S-glycidol oxidatie experiment uitgevoerd met A. pasteurianus ATCC 12874 bij 20°C en pH 6,0. Na oxidatie van 64% van het alcohol werd de reactie gestopt. Het resterende glycidol bevatte R-glycidol met een enantiomere overmaat van 97,5%.

Voorbeeld 4

Gelijk voorbeeld 1 is eveneens een R,S-glycidol oxidatie experiment uitgevoerd met A. pasteurianus ATCC 12874 bij 20°C en pH 5,0. Na oxidatie van 63% van het alcohol werd de reactie gestopt. Het resterend glycidol bevatte R-glycidol met een enantiomere overmaat van 98,5%.

Voorbeeld 5

Acetobacter aceti ATCC 15973 werd batchgewijs gekweekt zoals voorheen beschreven voor Acetobacter pasteurianus ATCC 12874. De verkregen cellen werden toegevoegd aan 100 ml 50 mM kaliumfosfaatbuffer pH 6,0 (20°C) bevattende 100 mM R,S-glycidol. Om voor voldoende zuurstof te zorgen werd het incubatiemengsel geroerd en belucht, de pH werd op 6,0 gehouden door titratie met 2N NaOH. Nadat 64% van het aangeboden glycidol geoxideerd was werd de incubatie beëindigd en de cellen m.b.v.

centrifugatie afgescheiden. Het aldus verkregen supernatant bevatte R-glycidol met een enantiomere overmaat van 96%.

Voorbeeld 6

Membraan-gebonden, PQQ-afhankelijk alcohol dehydrogenase van Gluconobacter oxydans ATCC 621 (verkregen zoals beschreven in Agric. Biol. Chem. 42, 2045-2056 (1978) werd toegevoegd aan 20 ml kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0; 50 mM, 20°C) en verzadigd met 100 nmol PQQ. Vervolgens werd overmaat kaliumferricyanide en 0.1 mmol R,S-glycidol toegevoegd. Nadat ongeveer 55% van het substraat geoxideerd was werd de incubatiereaktie gestopt.

De exacte conversie bedroeg 56% en de enantiomere overmaat van R-glycidol was 97%.

Claims (9)

1. Enzymatische, enantioselektieve bereiding van R-glycidol, met het kenmerk, dat men een mengsel van R en S-glycidol onderwerpt aan de inwerking van een geschikt enantioselektief oxiderend enzym.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men R-glycidol bereidt met een e.e. groter dan 95%.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat als enzym een alcoholdehydrogenase wordt toegepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase wordt toegepast.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat een alcoholdehydrogenase uit de klasse van azijnzuurbacteriën wordt toegepast.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat als enzym een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase afkomstig van of verkregen uit het genus Acetobacter of het genus Gluconobacter wordt toegepast.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat als enzym een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase afkomstig van of verkregen uit Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti of Gluconobacter oxydans wordt toegepast.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat als enzym een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase afkomstig van of verkregen uit Acetobacter pasteurianus ATCC 12874, Acetobacter aceti ATCC 15973 of Gluconobacter oxydans ATCC 621 wordt toegepast.

9. Enzymatische, enantioselektieve bereiding van R-glycidol zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de voorbeelden. UITTREKSEL Enzymatische, enantioselektieve bereiding van R glycidol door een mengsel van R,S-glycidol te onderwerpen aan de inwerking van een geschikt enantioselektief oxiderend enzym. Geschikte enzymen zijn alcoholdehydrogenasen in het bijzonder PQQ-afhankelijke alcoholdehydrogenasen. Op deze wijze kan bij relatief lage conversie R-glycidol met een hoge e.e. worden bereid.