NL8902035A

NL8902035A - Enantioselectieve bereiding van s-2r1,2r2-1,3-dioxolaan-4-methanol en derivaten daarvan.

Info

Publication number: NL8902035A
Application number: NL8902035A
Authority: NL
Original assignee: Stamicarbon
Priority date: 1989-08-09
Filing date: 1989-08-09
Publication date: 1991-03-01
Also published as: EP0412585A1; US5182209A; DD297161A5

Description

ENANTIOSELECTIEVE BEREIDING VAN S-2Ri,2R2-1/3-0I0X0LAAN-4-METHANOL EN DERIVATEN DAARVAN

Deze uitvinding heeft betrekking op de enantioselectieve omzetting van een enantiomerenmengsel van 2R'j/2R2“1/.3-dioxolaan-4-methanol met de formule:

waarin R-| en R2 onafhankelijk van elkaar waterstof of een al dan niet vertakte alkylgroep, een aryl, of R-| en R2 tezamen met het koolstof-atoom waaraan ze zijn gebonden een carbocyclische ring, die eventueel gesubstitueerd kan zijn, voorstellen, tot een aan één van de enan-tiomeren verrijkt produkt door dat enantiomerenmengsel te onderwerpen aan de inwerking van een enantioselectief enzym.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit EP-A-244.912. Volgens die octrooiaanvrage kan een aan R-enantiomeer verrijkt produkt uit een enantiomerenmengsel van een bovengenoemde verbinding worden verkregen door een dergelijk mengsel te onderwerpen aan de inwerking van een enzym, dat van een groot aantal micro-organismen afkomstig kan zijn. Volgens die methode wordt in hoofdzaak het S-enantiomeer van de desbetreffende verbindingen omgezet tot het R-2Ri,2R2-1,3-dioxolaan-4-carbonzuur, waardoor tevens een aan R-enantiomeer verrijkt 2ΡΊ,2Ε2-1,3^ιοχοΐ33η-4-ΓηθΐΗ3ηοΙ overblijft. In de genoemde aanvrage wordt ook vermeld dat het oxydatieprodukt, dat een overmaat aan R-2R-|,2R2"1,3-dioxolaarr-4-carbonzuur bevat, gereduceerd kan worden tot de overeenkomstige alcohol, die dan een overwegende hoeveelheid S-2R1,2R2”1,3-d i oxolaan-4-methanol bevat.

Voor vele toepassingen, in het bijzonder, voor het gebruik als uitgangsverbinding voor de bereiding van daarvan afgeleide farmaceutische verbindingen, is het gewenst om over S-2R«j,2R2-1,3-dioxo-laan-4-methanol te kunnen beschikken. Daartoe is het gewenst om door middel van een enantioselectieve enzymatische werkwijze uit een enan-tiomerenmengsel van 2Ri,2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol rechtstreeks een aan S-enantiomeer verrijkt produkt te kunnen bereiden.

Gevonden werd nu een werkwijze voor de enantioselectieve omzetting van een enantiomerenmengsel van 2R«|,2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol met de formule:

waarin R-j en R2 onafhankelijk van elkaar waterstof of een al dan niet vertakte alkylgroep, een aryl, of R-j en R2 tezamen met het koolstofa-toom waaraan ze zijn gebonden een carbocyclische ring, die eventueel gesubstitueerd kan zijn, voorstellen, tot een aan één van de enan-tiomeren verrijkt produkt door dat enantiomerenmengsel te onderwerpen aan de inwerking van een enantioselectief enzym, door - en dat vormt het kenmerk van de uitvinding - met toepassing van een geschikt PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase als enantioselectief enzym een aan S-enantiomeer verrijkt 2Ri,2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol te bereiden. Als aryl wordt, in de regel fenyl of gesubstitueerde fenyl met C1-C4 alkyl of alkoxy, of halogeen toegepast.

Het bij de onderhavige werkwijze te gebruiken z.g. PQÖ-afhankelijk alcoholdehydrogenase is op zich zelf bekend uit o.a. de dissertatie "Quinoprotein (PQQ-containing) Alcohol Dehydrogenase" van J.A. Duine (promotie Delft, 19 september 1985) en uit B.W. Groen et al. in Biochem. J. 234 (1986) 611 e.v. PQQ staat voor pyrrolo-chinoline-chinon, dat is 2,7,9-tricarboxy-lH-pyrroloC2,3f;3chinoline-4,5-dion. Het van Pseudomonas testosteroni afkomstig of daaruit verkregen PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase is bijzonder geschikt voor de onderhavige werkwijze. Het micrcrorganisme Pseudomonas testosteroni kan volgens de door B.W. Groen et al, loc. cit. beschreven methode worden gekweekt, maar ook volgens elke andere daartoe geschikte kweekmethode. Dergelijke kweekmethoden zijn zo algemeen bekend en zo veelvuldig in octrooischriften en wetenschappelijke publicaties beschreven dat een beschrijving van die kweekmethoden in dit kader overbodig is. Het enzympreparaat zoals dat bij de onderhavige uitvinding wordt gebruikt, wordt niet beperkt door zuiverheid e.d. en kan zowel een ruwe enzymoplossing als een gezuiverd enzym zijn, maar het kan ook bestaan uit (gepermeabi liseerde en/of gei mobiliseerde) microbiële cellen, die de gewenste aktiviteit bezitte; of uit een homogenaat van cellen met een dergelijke aktiviteit. Hel inzym kan ook in geïmmobiliseerde vorm of in chemisch gemodificeerde vorm worden gebruikt. Wanneer in het gebruikte enzympreparaat ook enige ongewenste tegengestelde enzymaktiviteit aanwezig is verdient het aanbeveling deze ongewenste aktiviteit te verwijderen of te onderdrukken teneinde een maximale enantioselectiviteit te verkrijgen. De uitvinding wordt op geen enkele wijze beperkt door de vorm waarin het enzym voor de onderhavige uivinding wordt gebruikt. Binnen het kader van de uitvinding kan ook een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase worden gebruikt dat afkomstig is van een mutant van Pseudomonas testosteroni of van genetisch gemodificeerde microorganismen. Bij voorkeur wordt een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase gebruikt dat afkomstig is van of verkregen is uit Pseudomonas testosteroni ATCC 15666, ATCC 15667, NCIB 8893, NCIB 8955 of NCIB 10808. Volgens Jin Tamaoko et al. in Int. J. Syst. Bact. 37_ (1987) 52 e.v. dient Pseudomonas testosteroni geclassificeerd te worden als Comamonas testosteroni. De bedoelde organismen worden in deze aanvrage aangeduid als Pseudomonas testosteroni.

Zoals blijkt uit de publicatie van B.W. Groen et al. (loc.

cit.) is het PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase, zoals dat bijvoorbeeld uit Pseudomonas testosteroni kan worden verkregen niet zonder meer aktief met betrekking tot de oxydatie van sommige alcoholen, maar dient voldoende PQQ aanwezig te zijn. Indien bij de kweek van het microorganisme niet voldoende PQQ aanwezig is dan is het voor de oxydatie gewenst dit in voldoende hoeveelheden toe te voegen. In plaats van PQQ kunnen ook PQQ-analoga zoals bijvoorbeeld monoesters van PQQ (op de 2-plaats), 4-hydroxy-PQ (PQ staat voor pyrrolochinoline), 5-hydroxy-PQ, 3-methyl-PQQ, 3-ethyl-PQQ, 3-propyl-PQQ, N-methyl-PQQ, N-ethyl-PQQ, 8-methyl-PQQ of het PQQ-aceton adduct en andere aldehyde en keton adducten, zoals beschreven door J.A. Jongejan, B.W. Groen en J.A. Duine in "PQQ and Qu inoprot eins (J.A. Jongejans and J.A. Duine, eds.) Kluwer Academie Publishers, Dordrecht, 1989, p.p. 205-216) worden toegepast.

Enantioselectieve enzymatische omzettingen zijn op zich zelf bekend. De enantioselectiviteit berust op een verschil in omzet-tingssnelheid van de betreffende enantiomeren. Hen verkrijgt reak-tieprodukten die aan één van de enantiomeren verrijkt zijn. Voor praktische doeleinden is het in het algemeen gewenst dat één van de enantiomeren met een grote overmaat wordt verkregen. Dit wordt bereikt door de omzetting bij een bepaalde conversiegraad te beëindigen. Voor enantioselectieve enzymatische hydrolyses is dat beschreven door Qu-Ming Gu et al. in Tetrahedron Letters ZJ_ (1986) 5203 e.v. en meer algemeen door Ghing-Shih Chen et al in J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7294 e.v. De in die publicaties beschreven algemene leer van enantioselectieve enzymatische omzettingen geldt ook voor de onderhavige werkwijze.

Volgens de onderhavige werkwijze wordt door de inwerking van een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase het R-enantiomeer van 2R'),2R2-1,3-dioxolaarr4-methanol met de grootste snelheid geoxydeerd tot het S-enantiomeer van het overeenkomstige 2Ri,2R2~1,3-dioxolaan-4-carbonzuur, waardoor tevens een aan S-2R^,2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol verrijkt reaktieprodukt wordt verkregen. De reaktiesnelheden van de enantiomeren blijken aanmerkelijk te verschillen, waardoor men bij een conversie van 50% al een enantiomere overmaat van meer dan 90% van het 2Ri,2R2”1,3-dioxolaan-4-methanol kan verkrijgen en een enan-tiomere overmaat van meer dan 95% al bij een conversie van minder dan 55% kan verkrijgen.

Bij voorkeur wordt volgens de onderhavige werkwijze het S-enantiomeer bereid van 2,2-dimethyl-1,3-dioxolaarr4-methanol. Een enantiomere overmaat aan S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaarr4-methanol van ten minste 95% kan men reeds verkrijgen bij een conversie die tussen 50 en 55% ligt.

Het S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-methanol is een belangrijk uitgangsprodukt voor de bereiding van farmaceutica, gewasbeschermings-en/of landbouwbestrijdingsmiddelen, zoals ook vermeld is in een publicatie van J. Jurczak et al. in Tetrahedron 42_ (1986) 447 e.v. De enan-tiomeren R- en S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-methanol zijn belangrijke chirale C3~synthonen in de organische synthese. Voorbeelden van syntheses van meer complexe structuren uit zulke C3“synthonen zijn ^-receptor blokkeerders en sn-glycerylfosforylcholine (GPC).

Racemisch 2/2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-methanol kan op voor de bereiding van acetalen bekende wijze worden bereid door zuur gekatalyseerde koppeling van glycerol met aceton. Voor verbindingen met de hiervoor weergegeven formule waarin R-| en R2 niet beide een methylgroep voorstellen dient glycerol met het desbetreffende aldehyd of keton te worden gekoppeld.

De uitvinding wordt verder verduidelijkt door de volgende voorbeelden, zonder daardoor te worden beperkt. In deze voorbeelden zijn de analyses van de reaktieprodukten, met name wat betreft de bepaling van de enantiomere overmaat (ee) uitgevoerd met behulp van de hieronder beschreven methode (TAGIT-methode) waarbij, indien gewenst, de selectiviteitswaarde voor de reaktie kan worden berekend met behulp van de formules van Chen et al. (J. Am. Chem. Soc. 104, 7294 e.v. (1982)). Wat betreft de conversiebepaling werd gebruik gemaakt van kolomscheiding over een Aminex HPX-87H HPLC kolom met 0,01 N H2SO4 als loopmiddel en detectie van glycerol aan de hand van de brekingsindex.

Alle analyses werden steeds uitgevoerd aan, op diverse tijdstippen, uit de reaktiemengsels van de experimenten genomen monsters van 10-50 ml wat betreft de conversiebepaling, respectievelijk van 10-50 ml voor de ee-bepaling, afhankelijk van de conversie.

Bij de e.e.-bepaling worden de monsters met twee maal 20 ml dichloormethaan geëxtraheerd, waarna 200 μΐ van het residu dat na indampen van het extract wordt verkregen, wordt opgelost in 5 ml diethylether. Aan de ether oplossing wordt vervolgens 0,35 gram tosylchloride en ca. 0,5 gram kaliumhydroxyde poeder toegevoegd en de verkregen oplossing wordt 15 minuten geroerd bij kamertemperatuur. Het tosyl-additieprodukt van het 2R-|, 2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol wordt vervolgens door extractie met diethylether en water afgescheiden, waarna de etherfractie met water wordt gewassen en ingedampt. Het verkregen tosyl-2R'|, 2R2~1,3-dioxolaan-4-methanol wordt dan opgelost in 2,0 ml rrbutylamine en 1 uur op 100**0 verwarmd. Het reaktieprodukt wordt vervolgens door extractie met diethylether en water afgescheiden, waarna de etherfractie vier maal met water wordt gewassen en ingedampt. Dit residu wordt opgelost in 1,0 ml aceto-nitril, waarna 2,5 yl van de verkregen oplossing wordt vermengd met 50 μΐ acetonitril en 1 mg 2,3,4,6-tetra-0-acetyl- 0-glucopyranosyl-isothiocyanaat (TAGIT). 5 minuten na het mengen wordt vervolgens de e.e. bepaald met behulp van een reversed phase (C^ kolom met 60/40 methanol/water als loopmiddel.

Deze methode voor de bepaling van de enantiomere overmaat is zeer geschikt gebleken. Hierbij wordt een uitstekende scheiding van de R- en S-enantiomeren van 2R^, 2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol (in gederivatiseerde vorm) verkregen, hetgeen in de figuren 1.1, 1.2 en 1.3 welke als een voorbeeldchromatogram van deze scheiding zijn toegevoegd wordt geïllustreerd. 1.1 heeft daarbij betrekking op het race-maat, Voor 1.2 is gebruik gemaakt van het commercieel verkrijgbare S-enantiomeer (Janssen Chemica) en 1.3 betreft het na 56% conversie, volgens de uitvinding verkregen produkt.

Voorbeeld I

Pseudomonas testosteroni, die gedeponeerd is bij de American Type Culture Collection onder nummer ATCC 15667 werd in een fermentor gekweekt, die 20 l van een minerale zouten medium bevatte (samenstelling per liter gedemineraliseerd water: 15,4 g K2HPO4.3H2O, 4,52 g KH2PO4, 0,5 g MgCl2.6H20, 3 g (NH^SO^ 15 mg CaCl2, 15 mg FeS04.7H20 en de sporenelementen Cu, B, Mn, Zn, Mo), waaraan na sterilisatie 100 ml ethanol was toegevoegd. De pH was 7,0. De inhoud van de fermentor werd op 28nc gehouden en geroerd met 350 omwentelingen per minuut. De beluchtingssnelheid was 3,5 l per minuut. Na 80 uur kweken werden de cellen geoogst door centrifugeren. Een deel van deze cellen (nat gewicht 11 g) werd gesuspendeerd in 100 ml tris/HCl-buffer (50 mM, pH 7,5), waaraan 5,3 ymol PQQ was toegevoegd. Nadat de cellen verzadigd waren met PQQ werd 1,8 l van dezelfde buffer en 20 g R,S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaarr4-methanol toegevoegd. Tijdens het incuberen werd de celsuspensie belucht (1,0 l lucht per minuut) en geroerd (400 omwentelingen per minuut), en werd de pH op 7,5 gehouden door titratie met 0,2 N NaOH. De temperatuur werd op 28«C gehouden.

Tijdens deze oxydatie werden regelmatig monsters genomen, die op de boven beschreven wijze werden geanalyseerd.

De resultaten daarvan zijn samengevat in tabel 1.

Tabel 1

Monster Conversie ee (S-enantiomeer) (%) (%) 1 15 17 2 32 45 3 45 75 4 56 99

Voorbeeld II

Volgens de in Biochem. J. (1986) 234, 611 e.v. beschreven zuiveringsmethode werd PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase gewonnen uit Pseudomonas testosteroni ATCC 15667 die gekweekt was volgens voorbeeld I.

Het geïsoleerde enzym werd opgelost in 20 ml kaliumfosfaatbuffer (pH 8,0; 50 mM) en verzadigd met 100 nmol PQQ. Vervolgens werd 1,01 mmol kaliumferricyanide en 0,5 mmol R,S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaarr4-methanol toegevoegd. De oplossing werd op pH 8,0 gehouden door titratie met 0,1 N NaOH. Na reductie van ferricyanide werd het reaktie-mengsel geanalyseerd. De conversie bedroeg 51% en de ee-waarde van S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaarr4-methanol was 99%.

Voorbeeld III

Het uit Pseudomonas testosteroni ATCC 15667 (zie voorbeeld II) gewonnen alcoholdehydrogenase werd opgelost in 20 ml kalium-fosfaatbuffer (pH 8,0; 50 mM) en verzadigd met 100 nmol PQQ, vervolgens werd overmaat kaliumferricyanide en 0,5 mmol 2,2-pentyleerr1,3-dioxolaan-4-methanol toegevoegd. Na oxydatie van ongeveer 50% van het substraat werd de reaktie gestopt en het reaktie-mengsel geanalyseerd. De conversie bedroeg 54% en de enantiomere overmaat van het S-enantiomeer was 99%.

Voorbeeld IV

Een 2,0 l erlenmeijerkolf gevuld met 500 ml minerale zouten medium (zie voorbeeld I), 2,5 ml ethanol en 2 ymol PQQ werd geënt met Pseudomonas testosteroni ATCC 15667. Zowel PQQ (filter gesteriliseerd) als ethanol waren toegevoegd na sterilisatie door verhitting van het medium. De kweektemperatuur was 28«C, de schudsnelheid 200 omw./min.

Na 36 uur werden de cellen door centrifugeren geoogst waarna ze gesuspendeerd werden in 100 ml kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0; 50 mM). Na toevoeging van 1,0 g R,S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaarr4-methanol werd het reaktiemedium onder schudden (200 omw./min.) bij 28ac geincubeerd. Na 24 uur werd het reaktiemedium geanalyseerd. De conversie bedroeg 54%. De ee-waarde voor het S-enantiomeer bedroeg 96%.

Voorbeeld V

Volgens de werkwijze van voorbeeld IV werd respectievelijk Pseudomonas testosteroni ATCC 15666, NCIB 8893 en NCIB 10808 gekweekt en werd telkens met het daarmee verkregen PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase op de wijze van voorbeeld IV R,S-2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-methanol enantiospecifiek geoxydeerd, met overeenkomstige resultaten wat betreft de enantioselectiviteit.

Claims

1. Werkwijze voor de enantioselectieve omzetting van een enantio-merenmengsel van 2R-|/2R2_1/3-dioxolaan"4-methanol met de formule:

waarin r-j en R2 onafhankelijk van elkaar waterstof of een al dan niet vertakte alkylgroep, een aryl, of R·] en R2 tezamen met het koolstofatoom waaraan ze zijn gebonden een carbocyclische ring, die eventueel gesubstitueerd kan zijn, voorstellen, tot een aan één van de enantiomeren verrijkt produkt door dat enantiomererr mengsel te onderwerpen aan de inwerking van een enantioselectief enzym, met het kenmerk, dat men door toepassing van een geschikt PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase als enantioselectief enzym een aan S-enantiomeer verrijkt 2R-j,2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol bereidt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men S“2R-|,2R2-1,3-dioxolaan-4-methanol met een enantiomere overmaat van ten minste 95% bereidt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men aan S-enantiomeer verrijkt 2,2-dimethyl-1,3-dioxolaan-4-methanol bereidt.

4. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men als enzym een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase afkomstig van of verkregen uit Pseudomonas testosteroni toepast.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men als enzym een PQQ-afhankelijk alcoholdehydrogenase afkomstig van of verkregen uit Pseudomonas testosteroni ATCC 15666, 15667, NCIB 8893, NCIB 8955 en/of NCIB 10808 toepast.