NL8200334A - Werkwijze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen en werkwijze voor de diagnose van kanker. - Google Patents

Description

* ' ‘ - 1 -

Werkwijze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen en werkwijze voor de diagnose van kanker.

Deze uitvinding betreft een werkwijze voor het in lichaamsvloeistoffen van zoogdieren bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen (hierna afgekort tot TAG), waaronder glucoproteinen, glucopeptiden, glucolipiden 5 en/of suikers met een bepaalde eindgroep, welke glucosidische bindingen sterk in concentratie toenemen met de voortwoekering van ongedifferentieerde cellen, in het bijzonder kankercellen.

Er zijn werkwijzen bekend voor het diag-noseren van kanker door het bepalen van een bepaald gluco-10 proteïne dat specifiek in patiënten met kanker gevormd wordt.

De meeste van deze methoden berusten in hoofdzaak hierop dat het eiwit-deel van de glucoproteinen antigeen werkt, en er is een methode voor de diagnose van primaire leverkanker bekend waarbij men het αΐ-fetoproteïne meet, en ook een methode voor 15 de diagnose van kanker van het maagdarmkanaal, vooral kanker in het rectum, door het GEA te meten (zie blz. 235-250 in "Igaku No Ayumi" ("Progress in Medicine") Vol. 106 (1978)).

Maar deze diagnose-methoden zijn betrekkelijk beperkt in hun toepasbaarheid.

20 Bij verder onderzoek werd gevonden dat de lichaamsvloeistof van een patiënt met kanker stoffen met voor tumoren specifieke glucosidische bindingen bevat die geproduceerd worden door ongedifferentieerde cellen (voornamelijk kankercellen) en aan de lichaamsvloeistof afgegeven, en deze 25 glucosiden onderscheiden zich duidelijk van andere glucosiden door structuur van de suiker-keten, lengte van die keten en aard van de samenstellende zuikers. Ook werd gevonden dat het mogelijk is het gehalte aan TAG in een monster lichaamsvloeistof te bepalen door die TAG in dat monster te laten reageren 8200334 I ί t *« ' - 2 - met een lectine dat specifiek met galactose-(β1->3 of $l-*4)-N-acetyl-glucosmine en/of galactose-(β1·*3 of gl-*4)-N-acetyl-galactosamine kan combineren, zoals beschreven in het Britse octrooischrift 2.043.890.

5 Gezien de toenemende behoefte aan een bepalingsmethode voor TAG en een diagnose-werkwijze waarvan de toepasbaarheid minder beperkt en de gevoeligheid hoger is werd verder onderzoek uitgevoerd, en daarbij werd gevonden dat TAG glycoproteïnen, glycopeptiden, glycolipiden en/of suikers 10 heeft met N-acetyl-D-galactosamine (hierna aangeduid als "AcGal") y&cj.of L-fucose (hierna aangeduid als "Fuc") als eindgroep hebben, en dat deze eindgroepen specifiek met bepaalde soorten lectine combineren, en dat men daardoor de aanwezigheid of afwezigheid van kankercellen, mate van voortwoekering, 15 welzijn of afsterven der cellen en dergelijke nagegaan kan worden door lichaamsvloeistoffen met lectine te laten reageren, waardoor men kanker kan herkennen. Deze uitvinding is op die vondsten gebaseerd.

Deze uitvinding verschaft dus een nieuwe 20 werkwijze voor het bepalen van TAG in lichaamsvloeistoffen, waarbij men de TAG in een monster lichaamsvloeistof met AcGal festfof Fuc bindend lectine laat reageren tot een TAG-lectine-complex en men of de hoeveelheid TAG-lectine-complex of niet verbruikt lectine bepaalt.

25 In de hierbij behorende tekeningen ge ven figuren 1 en 2 standaardkrommen weer, verkregen bij één uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding op basis van een competitieve binding (voorbeeld I(viii) en (ix)). Figuren 3 erv3* geven ijkkrommesvan een uitvoeringsvorm van de 30 werkwijze volgens de uitvinding op basis van de competitieve reactie van voorbeeld II (ii). Figuren 4 en 5 geven de TAG-gehalten van gezonde personen en van kankerpatiënten, bepaald met de methoden van respectievelijk voorbeeld Il(iii) en voorbeeld III(ii). Figuren 6 en 7 zijn grafieken met ijkkrom-35 men voor andere uitvoeringsvormen van de werkwijze volgens de uitvinding, respectie-velijk van voorbeeld Ill(iii) en (iv).

8200334 - 3 -

Figuren 8 ai-C zijn grafiek^met TAG-gehalten in monsters, bepaald met behulp van de ijkkromme van figuur 7. Figuren*? en geven ijkkromme volgens nog een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, zoals beschreven in voorbeeld IV(i).

5 Figuur 10 geeft de ijkkromme van een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding, zoals beschreven in voorbeeld IV(ii). Figuren 11 en 12 geven de TAG-gehalten van een aantal gezonde mensen en patiënten met diverse vormen van kanker, respectievelijk bepaald met de competitieve methode van 10 voorbeeld IV(iii) en de methode van voorbeeld IV(iv). Figuur 13 geeft de ijkkromme bepaald met de werkwijze van voorbeeld IV(v), en figuur 14 geeft weer een aantal TAG-gehalten bepaald met behulp van de ijkkromme van figuur 13.

Deze bepalingsmethode kan toegepast wor-15 den op zeer uiteenlopende lichaamsvloeistoffen, waaronder-bloed, weefselvocht, lymphe, thorax-vocht, buikvocht, amnionvocht, maagsap, urine, pancreassap, cerebrospinale vloeistof en speeksel. De bepaling in bloed zal hieronder van het meeste belang blijken te zijn. De te gebruiken hoeveelheid lichaams-20 vloeistof varieert in het algemeen van öpl'iot 10 ml, en ligt het meest tussen φ. en CpLml.

Volgens de uitvinding worden TAG uit de lichaamsvloeistof geïsoleerd, laat men ze met een bepaald lec-tine reageren en meet men de aan TAG gebonden hoeveelheid van 25 dat lectine of de overgebleven hoeveelheid daarvan, een andere mogelijkheid is dat men een bepaald lectine merkt en direct aan de lichaamsvloeistof toevoegt waarna men het met TAG gebonden lectine of het overgebleven lectine isoleert en bepaalt. Met beide methoden vindt men het gehalte aan TAG in de li-30 chaamsvloeistof.

De TAG kunnen uit de lichaamsvloeistof geïsoleerd worden met de voor het verkrijgen van glycoproteïnen, glycopeptiden, glycolipiden jaiioi suikers gebruikelijke technieken, waaronder uitzouten, neerslaan, extractie, centrifu-35 geren, dialyse, het doorlopen van molecuulzeven, het inactiveren van enzymen, en een combinatie daarvan. Meer in het bij- 8200334 - 4 - • v .

<, ‘k zonder verkrijgt men zo'n fractie door het toevoegen van sulfo-salicylzuur, trichloorazijnzuur of zinksulfaat aan serum of plasma, of door het verhitten van serum of plasma en het affiltreren van het aldus ontstane neerslag (albumine, immuno-5 globuline, enz.)» of door het uitvoeren van dialyse.

Indien een radioactief gemerkt lectine gebruikt wordt kunnen de opgevangen monsters lichaamsvloeistof (behalve bloed) direct gebruikt worden. Maar om denature-ring van die monsters te voorkomen en de reactie met het bepaal-10 de lectine te versnellen worden bij voorkeur lagere suiker-be-vattende eiwitten zoals runderserumalbumine ter bescherming toegevoegd. Een beter resultaat verkrijgt men door een geschikte hoeveelheid beschermend eiwit aan het monster toe te voegen nadat albumine, immunoglobuline e.d. daaruit verwijderd zijn.

15 Indien de lichaamsvloeistof bloed, bloedserum of bloedplasma is heeft men een anti-coagulans zoals heparine, EDTA, citroenzuur of iets dergelijks toegevoegd. Bij voorkeur voert men de bepaling uit in een monster bloedplasma waaraan men als anti-coagulans heparine toegevoegd heeft. Indien het TAG-gehalte be-20 trekkelijk hoog is, zoals in een patiënt met ascites, kan zo'n monster naar behoefte met een geschikte buffer verdund worden.

Voor deze uitvinding kan elk AcGal föxiof Fuc bindend lectine gebruikt worden als het maar specifiek kan binden met de glycoproteïnen, glycopeptiden, glycolipiden en/of 25 suikers met eindstandig AcGal Söstfof Fuc. Geschikte monsters AcGal bindend lectine kan men isoleren uit de Dolichos-boon (Dolichos biflorus), de limaboon (Phaseolus limensis), de sojaboon (Glycine max), de Bauhinia-boon (Bauhinia purpurea), uit de vlechtsinaasappel ;en uit de wijngaardslak (Helix pomatia).

30 Geschikte bronnen van Fuc bindend lectine zijn de peultjes van de vierrib-rolklaver (Lotus tetragonolobus) zie Brit. J. Exp. Path. _34 (1953) 94 en de gaspeldoorn (Ulex europeus) (zie W.C. Boyd en E. Sharpleigh in Blood 9_ (1954) 1195).

Voor het merken van het lectine kunnen 35 diverse enzymen, fluorescerende stoffen en radioactieve stoffen dienen. Deze enzymen omvatten glucoamylase, glucose-oxydase, s) Maclura pomifera 8200334 v ' - 5 - peroxydase, alkalische fosfatase, β-galactosidase en actieve fragmenten van het hemoctapeptide, enz.; fluorescerende stoffen zijn o.a. fluoresceïne, fluoresceïne-isothiocyanaat, rhodamine, dansylchloride (dat is 5-dimethylamino-1-naftha- 5 leensulfonylchlorile), enz.; radioactieve materialen zijn bij— 125 131 voorbeeld radioactief jodium ( J, J, enz.), radioactief tritium, enz.

Zoals hierna nog beschreven zal worden kan het te gebruiken specifieke lectine met deze stoffen ge-10 merkt worden op een wijze die voor het merken van eiwitten zoals antigenen en antilichamen met enzymen, fluotesce-rende stoffen en radioactieve stoffen bekend is.

De werkwijze van de uitvinding wordt als volgt uitgevoerd: Eerst wordt een bepaalde hoeveelheid 15 lichaamsvloeistof of een TAG bevattende fractie daarvan met een al dan niet radioactief gemerkt lectine gemerkt en het mengsel verwarmd tot een temperatuur beneden 45°C, bij voorkeur tussen 4° en 40°C, het allerbeste tussen 20° en 40°C. Het aan TAG gebonden lectine of het overgebleven lectine kan op ge-20 bruikelijke wijze geïsoleerd worden, bijvoorbeeld met chroma-tografie, elektroforese, uitzouten, fractioneren, dialyse, gelfiltratie, adsorptie of een combinatie daarvan. Of anders kan men voor het scheiden een agar-, agarose- of poly-acryl-amide-gel gebruiken (zie de Japanse octrooipublikatie 151263/80). 25 Meer in het bijzonder kan het al dan niet gemerkte lectine geïsoleerd worden door aan het reactie-mengsel een geschikte hoeveelheid precipitant voor aan glyco-proteïne gebonden lectine zoals polyethyleenglyeol, verzadigd aan ammoniumsulfaat of Rivanol (acrinol), toe te voegen, ge-30 volgd door centrifugeren of aanverwante ingreep. Geschikte omstandigheden bij het centrifugeren zijn afhankelijk van het gebruikte precipitans; indien polyethyleenglyeol gebruikt was gebeurt het centrifugeren bij voorkeur 30 tot 60 minuten op 1000 g.

35 Het aan TAG gebonden, al dan niet ge merkte lectine kan gemakkelijk van het niet verbruikte lectine 8200334 - 6 - » * gescheiden wordeiidoor toepassing van het verschil in diffusie-snelheid in een agar-, agarose- of polyacrylamide-gel. Als een reactiemengsel op zo'n gel geplaatst wordt diffundeert het aan TAG gebonden lectine helemaal niet en blijft het op het 5 oppervlak zitten, terwijl het niet verbruikte lectine door het gel diffundeert, en zo kan dat gemakkelijk afgescheiden worden.

Het bovengenoemde gel kan op gebruikelijke wijze bereid worden. Bijvoorbeeld wordt een geschikte hoeveelheid agar, agarose of polyacrylamide in een verdunnings-10 middel zoals gedestilleerd water, verdund citroenzuur of tris-HCl-buffer (met pH = 7,5) gebracht worden, en het mengsel onder zacht roeren op 60 tot 80°C gebracht worden waarna de oplossing in een geschikt vat zoals een reageerbuis gebracht wordt en men het laat afkoelen zodat er een gel ontstaat. De 15 keuze van de concentratie van dit gel wordt bepaald door de afmetingen (molecuulgewicht, stereochemische structuur) van het niet omgezette lectine en van de TAG-lectine-combinatie. Gewoonlijk heeft het gel een concentratie tussen 0,4 en 2,0 gew.%, bij voorkeur tussen 0,7 en 1,0 gew.%. Indien nodig of 20 gewenst kan het gel een conserveringsmiddel bevatten. Het aldus aangemaakte gel kan een vlak oppervlak hebben, maar een concaaf oppervlak geniet de voorkeur daar het complex dan niet aan de binnenwand van het vat blijft kleven.

Het TAG-gehalte van de lichaamsvloei-25 stof kan uit de gevonden hoeveelheid geïsoleerd lectine of aan TAG gebonden lectine op gebruikelijke wijze berekend worden.

Diverse methoden kunnen gebruikt worden voor het meten van de hoeveelheid niet gemerkt lectine die 30 door de reactie verbruikt wordt. Bij voorkeur wordt een stof toegevoegd die specifiek met dat lectine reageert zodat het neerslaat of agglutineert, en de daarbij optredende verandering wordt met het oog waargenomen of fotometrisch gemeten.

Meer precies: de reactievloeistof wordt in een serie telkens 35 tweevoudig verdund met bijvoorbeeld 0,15 M fosfaat-buffer of 8200334 - 7 -

* * I

fysiologische zout-oplossing, en een bepaalde hoeveelheid verdunning wordt in een V-vormig of U-voraig voorwerpsglaasje of in een kleine reageerbuis of iets dergelijks gebracht, en een stof die dat specifieke lectine doet agglutineren wordt toege-5 voegd; na omroeren laat men het mengsel 30 minuten of langer (bij voorkeur tussen 60 en 90 minuten) bij een temperatuur beneden 45°C (bij voorkeur tussen 4° en 40°C) staan, en men bepaalt de maximale verdunning waarbij nog agglutineren optreedt, Die noemt men dan de agglutinatiewaarde. Alle lectinen 10 die bij deze uitvinding toegepast kunnen worden hebben in wezen dezelfde agglutinatiewaarde.

Een voorbeeld van een stof die specifiek met zulke lectines reageert is een glycoproteïne met eindstandig AcGal KJitfof Fuc. Voor het lectine dat met AcGal 15 combineert kan men Sephadex, latex, glasparels e.d. gebruiken die.bekleed zijn met een glycoproteïne met eindstandig AcGal zoals cytolipine K of R, het membraan van menselijke rode bloedlichaampjes, gesulfateerd glycopeptide type A uit varkensmaagslijm, het asialo-derivaat van de actieve stof A 20 uit menselijk bloed, mucine type A+ uit het membraan onder de varkenskaak, asialo-GMj en de antigene stof van Follisraan.

Voor het lectine dat met L-fucose bindt kan men Sephadex, latex, glasparels e.d. gebruiken die bekleed zijn met een glycoproteïne met eindstandig L-fucose, zoals de actieve stof 25 type Lea of Le^ uit menselijk bloed, gesulfateerd glycoproteïne type A uit varkensmaagslijm of het actieve' gesulfa-teerde glycoproteïne type H(0) en het antigeen tegen menselijke rode bloedlichaampjes H^.

Indien gemerkt lectine gebruikt wordt 30 kan het TAG-gehalte gemeten worden met een geschikte methode die er van afhankelijk is met wat men dat lectine gemerkt heeft. Als bijvoorbeeld het lectine met een enzym gemerkt is kan het TAG-gehalte bepaald worden door de enzymatische werking op een geschikt substraat colorimetrisch of fluorime-35 trisch te bepalen. Als het lectine met een fluorescerende stof 8200334 I 1 - 8 - gemerkt was voert men een bepaling van de fluorescentie uit en als het lectine radioactief gemerkt was meet men de radioactiviteit. Op die wijze vindt men de aan TAG gebonden of juist overgebleven hoeveelheid lectine.

5 Bij een bijzonder geschikte methode voor het uitvoeren van de zo juist beschreven bepaling gebruikt men een kit met daarin het speciale lectine dat specifiek met TAG kan reageren, en dat een conserveringsmiddel zoals glycerol of runderserumalbumine kan bevatten. Dit speciale reagens kan 10 gevriesdroogd zijn, maar het kan ook opgelost zijn in water of in een combinatie van water met ander oplosmiddel. Verder kan dit lectine-reagens een buffer bevatten en/of een stabilisator voor het voorkomen van voortijdig bederf. Die buffer-oplossing is niet van wezenlijk belang, maar als het er is moet zijn pH 15 tussen 6,0 en 7,8 liggen. Voor het aanmaken gebruikt men water, maar dat kan geheel of gedeeltelijk vervangen zijn door met water mengbare oplosmiddelen zoals glycerol, alkoholen, glycolen en glycol-ethers (geen beperkende opsomming). De keuze van de hoeveelheid specifiek lectine wordt bepaald door de aggluti-20 natiewaarde (gedefinieerd als de hoogste verdunning die nog tot agglutinatie leidt), de wijze waarop het lectine gemerkt was, de te bepalen stof enz. Gewoonlijk is het lectine aanwezig in een concentratie tussen 0,01 en 100 yug/ml, bij voorkeur tussen 0,03 en 40 yng/ml. Deze oplossing van al dan niet gemerkt 25 lectine kan zonodig verder verdund worden.

Het oogmerkt van deze uitvinding kan op een van de volgende wijzen bereikt worden: (1) Men laat de te onderzoeken lichaamsvloeistof in competitie met een bekende hoeveelheid onoplosbaar gemaakt TAG of TAG-30 achtig materiaal reageren met een bepaalde hoeveelheid lectine dat op een of andere wijze gemerkt is (hierna "gemerkt lectine" genoemd), waarna men het onoplosbare TAG of TAG-achtige materiaal met daaraan gemerkt lectine scheidt van niet gebonden lectine, en men het merk in een van beide fracties meet, 35 (2) men laat het te onderzoeken materiaal in competitie met een 8200334 « / - 9 - bekende hoeveelheid TAG of TAG-achtig materiaal, dat op een of andere wijze gemerkt is, (hierna ’’gemerkt TAG of TAG-achtig materiaal" genoemd) reageren met een bepaalde hoeveelheid lec-tine of onoplosbaar gemaakt lectine, waarna men het aan lectine 5 gebonden gemerkte TAG of TAG-achtige materiaal scheidt van het niet gebonden TAG of TAG-achtige materiaal, en men het merk in een van beide fraeties meet, en (3) men laat het te onderzoeken materiaal reageren met onoplosbaar gemaakt lectine, en daarna dit onoplosbare TAG-lectine-1Ö complex met een bepaalde hoeveelheid gemerkt lectine, waarna men complex gebonden gemerkt lectine en niet gebonden gemerkt lectine van elkaar scheidt, en men het merk in een van beide fracties meet.

In deze beschrijving geeft "TAG-achtig 15 materiaal" elk suiker-derivaat met eindstandig acetylgalactóse j*j*Kof L-fucose aan; voorbeelden van suikers met eindstandig acetylgalactóse zijn de gesulfateerde glycopeptiden Type A uit varkensmaagslijm, cytolipinen K en R uit het membraan van rode bloedlichaampjes, het asialo-derivaat van de actieve stof 20 A in menselijk bloed, mucine type A+ van het maagslijm onder de varkenskaak, asialo-GMj en de antigene stof van Follisman.

Voorbeelden van suikers met eindstandig L-fucose zijn de ac-a b tieve stoffen Le en Le uit menselijk bloed, gesulfateerd glycoproteïne type A uit varkensmaagslijm, gesulfateerd glyco-25 proteïne type H(0) uit varkensmaagslijm en antigeen tegen menselijke rode bloedlichaampjes H^.

Onoplosbaar gemaakt TAG of TAG-achtig materiaal en onoplosbaar gemaakt lectine worden bereid door respectievelijk TAG, TAG-achtig materiaal of lectine te laten 30 reageren met een onoplosbare drager. Als zo’n onoplosbare drager kunnen bijvoorbeeld genoemd worden cellulosepoeder, Sephadex, Sepharose, polystyreen, filtreerpapier, carboxymethyl-cellulose, ionenwisselaar, dextran, plastic foelie of buis, nylon, glasparels, zijde, amine-methylvinylether-maleïnezuur-35 copolymeer, aminozuur-copolymeren, etheen-maleïnezuur-copoly-meren, enz. Het onoplosbaar maken kan gebeuren door het slaan 8200334 x ι' - JO - van covalente bindingen (bijvoorbeeld met diazo-groepen), door het maken van peptide-bindingen (m.b.v. zuuramide-derivaten, kunsthars-carbonzuurchloriden, kunsthars-diimiden, malexnezuur-anhydride-derivaten, isocyanaat-derivaten, broomcyaan-geacti-5 veerde polysacchariden, cellulosecarbonaat, of een of andere condensatiemiddel, enz.) of door alkylering of door middel van een verknoper zoals glutaaraldehyd, hexamethyleenisocyanaat, enz., of door een binding m.b.v. de Ugi-reactie e.d., of met ionenkrachten aan een ionenwisselaar, en door fysieke absorp-10 tie aan poreus glas in de vorm van glasparels. Hieronder gaat de voorkeur uit naar het gebruik van met broomcyaan geactiveerde polysacchariden of naar de toepassing van verknopings-middelen. In het eerste geval laat men het TAG,, het TAG-achtige materiaal of het lectine 2 tot 4 uur bij 0 tot 40°C (bij voorkeur 15 bij 20 tot 30°C) in een geschikt oplosmiddel reageren met' een 10- tot 1000-voudige hoeveelheid met broomcyaan geactiveerde drager.

Ook kan men onoplosbaar gemaakt TAG, TAG-achtig materiaal of lectine verkrijgen met een door bestra-20 ling geïnduceerde polymerisatie. Men maakt dan een waterige dispersie van een polymeriseerbaar monomeer aan die TAG of TAG-achtig materiaal bevat en bestraalt dit met deze ioniserende straling, waardoor dat monomeer gaat polymeriseren. Voor het aanmaken van de waterige dispersie wordt een hydrofoob 25 polymeriseerbaar monomeer (A) in 0,1-5 gew.% waterige oplossing van een in water oplosbaar polymeer (B) gedispergeerd. Of een mengsel van een hydrofoob polymeriseerbaar monomeer (A) en een hydrofiel polymeriseerbaar monomeer (C) wordt in 3-20 gew.% waterige zoutoplossing gedispergeerd, of een hydrofoob poly-30 meriseerbaar monomeer (A) wordt gedispergeerd in een waterige oplossing van 0,01-5 gew.% oppervlak-actieve stof (D). Als de aldus aangemaakte dispersie met licht of met ioniserende straling bestraald wordt wordt het daarin aanwezige polymeriseer-bare monomeer gepolymeriseerd tot een matrix voor het TAG of 35 aanverwant materiaal. Desgewenst kan dit tot vellen of deeltjes gevormd worden.

8200334 \ i i - 11 -

Als voorbeelden van hydrofobe polyraeriseer-bare monomeren (A) kunnen genoemd worden glycidylmethacrylaat, ethyleendimethacrylaat, diethyleenglycoldimethacrylaat, tri-ethyleenglycoldimethacrylaat, trimethylolpropaantrimethacrylaat, 5 polyethyleenglyco1-200-dimetheorylaat, dipropyleenglycoldimetha- crylaat, butyleen-1,4-dimethacrylaat, hexyleen-1,6-dime thacry-laat, methoxyethoxyethylmethacrylaat, methylmethacrylaat, ethylmethacrylaat, butylmethacrylaat en de overeenkomstige acrylaten. In het algemeen kan hier elk in water onoplosbaar 10 monomeer gébruikt worden dat zich door bestraling met licht of andere straling laat polymeriseren.

Voorbeelden van in water oplosbare polymeren (B) zijn polyvinylpyrrolidon, polymethacrylzuur, poly-acrylzuur, polyvinylalkohol, hydroxypropylcellulose, arabische 15 gom, enz.

Voorbeelden van hydrofiele polymeriseer-bare monomeren (C) zijn 2-hydroxyethylmethacrylaat, methoxytetra-ethyleenglycolmethacrylaat, methoxypolyethyleenglyco1-400-methacrylaat, methoxypolyethyleenglyco1-1000-methacrylaat, 20 polyethyleengjycol-400-dimethacrylaat, polyethyleenglyco1-600- dimethacrylaat en de overeenkomstige acrylaten, alsmede metha-crylzuur, acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidon, enz. In het algemeen is ieder in water oplosbaar monomeer dat door bestraling tot polymerisatie gebracht kan worden geschikt, ongeacht de 25 soort.

Als voorbeelden van oppervlak-actieve stof (D) kan men noemen natriumlaurylsulfaat, kaliumoleaat, natriumoleaat, sorbitanmonolauraat, sorbitanmonostearaat, sor-bitanmonoöleaat, propyleenglycolmonolauraat, oliezuur, natrium-30 dodecylbenzeensulfonaat, enz. Maar iedere oppervlak-actieve stof die het polymeriseerbare monomeer of de TAG of het TAG-achtige materiaal in de micellen kan houden, ongeacht de soort, kan gebruikt worden.

Radioactief gemerkte TAG, TAG-achtig 35 materiaal en lectine kunnen bereid worden door in TAG, TAG-achtig materiaal of lectine een radioactief jodiumatoom zoals 8200334 X i - 12 - .......... 125 131 ........· ..... -......... ................

J of J in te voeren. Dit laatste gebeurt gewoonlijk door een gewone jodering, bijvoorbeeld een oxydatieve jodering met behulp van chlooramine T (zie Nature 194 (1962) 495 en Biochem. J. 89, (1963) 114). Een dergelijke jodering gebeurt 5 in een geschikt oplosmiddel (bijvoorbeeld een buffer-oplossing met pH 6-8, bij voorkeur 0,2 M fosfaatbuffer met pH = 7, in ongeveer 5 tot 60 seconden bij kamertemperatuur in aanwezigheid van chlooramine T. Per nanomol tyrosine in TAG e.d. gebruikt men bij voorkeur 1 tot 5 mCi radioactief jodium en 10 10 tot 100 nanomol chlooramine T. Het aldus gemerkte TAG e.d.

wordt op gebruikelijke wijze geïsoleerd en bewaard, zonodig in gevriesdroogde vorm.

Met enzym gemerkt TAG, TAG-achtig materiaal of lectine kan bereid worden met bekende koppelings-15 technieken, bijvoorbeeld zoals beschreven door B.F. Erlanger et al; Acta Endocrinol. Suppl. 168 (1972) 206 en M.H. Karol et al; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 57 (1967) 713. Het TAG e.d. laat men 2 tot 5 uur bij kamertemperatuur in een buffer met pH tussen 4 en 6 (bijv. 1 mM acetaat-buffer met pH = 4,4) met 20 een oxydatiemiddel zoals NaJO^ reageren, en daarna met een reductiemiddel zoals NaBH^ e.d. Per mol TAG e.d. gebruikt men 1 tot 3 mol enzym, 100 tot 300 mol oxydatiemiddel en 1 tot 2 mol reductiemiddel.

Met fluorescerend materiaal gemerkte 25 TAG, TAG-achtig materiaal en lectine worden bereid door TAG

e.d. 0,5 tot 3 uur bij een temperatuur tussen 0° en kamertemperatuur (bij voorkeur bij kamertemperatuur) reageren met een bekende fluorescerende stof zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of tetramethylrhodamine-isothiocyanaat (RITC), zoals 30 voor antilichamen beschreven in "Ikagaku Jikkenho Koza, No. 4", blz. 263-270. Van het fluorescerende materiaal gebruikt men bij voorkeur 1 dl per 50 din TAG e.d.

De bepalingsmethode volgens de uitvinding door competitie of met een sandwich-methode zal hierna 35 beschreven worden.

Bij beide methoden gebeuren de reacties 8200334 r - 13 - in een geschikt oplosmiddel bij 45°G of lager, bij voorkeur tussen 4° en 40°C en het beste tussen 20° en 40°G. Als oplosmiddel komen die in aanmerking die de reactie van TAG of TAG-achtig materiaal met lectine niet ongunstig beïnvloeden, 5 zoals water en buffer-oplossingen met pH tussen 6 en 7,8 (bijvoorbeeld 0,1 tot 0,3 M tris-HCl-buffer met pH van ongeveer 7,5 en 0,1 M fosfaat-buffer met pH van ongeveer 7,4). De reactie duurt 5 tot 40 uur, meestal tussen 15 en 25 uur.

Het afscheiden van aan lectine gebonden 10 TAG of TAG-achtig materiaal van het lectine dat niet gebonden is kan op bekende wijze gebeuren. Waar onoplosbaar gemaakte TAG, TAG-achtig materiaal of lectine gebruikt wordt is scheiden van vaste stof van vloeistof (door centrifugeren, filtreren of afschenken) al voldoende, en in andere gevallen kan men 15 chromatografie, elektroforese, uitzouten, fractioneren,-dialyse, gelfiltratie, absorptie en enige combinatie daarvan) toepassen of een scheiding met behulp van agar-gel, agarosegel of poly-acrylamide-gel (zie Japanse octrooiaanvrage 151263/80).

Het merk van het aldus afgescheiden pro-20 dukt wordt dan gemeten met een methode die aangepast is aan de aard van het merk. Als dat een enzym is neemt men een geschikt substraat voor dat enzym, zodat men het na afloop colorimetrisch, door emissie-analyse of door fluorescentie-analyse kan meten, waarbij desgewenst een kleurstof, fluorescerende stof of 25 kleurstof gebruikt is. Als het merk een fluorescerende stof of een radioactief materiaal is meet men natuurlijk de fluorescentie of de radioactiviteit. Aldus vindt men hoeveel gebonden of juist niet gebonden TAG, TAG-achtig materiaal of lectine er was.

30 Zoals hierboven reeds beschreven maakt deze uitvinding het mogelijk met gemak TAG in lichaamsvloeistoffen te bepalen. En hieruit kan men het optreden van kanker vaststellen, in elke fase, vanaf het begin tot aan het eindstadium. Deze werkwijze is vooral nuttig voor het herkennen 35 van kanker in een vroeg stadium. Daar bovendien bij deze werkwijze glucosidische bindingen bepaald worden heeft deze diag- 8200334 r - 14 - nose een veel bredere toepassing dan de gebruikelijke methoden met antilichamen (tegen α-fetoproteïne, CEA, enz.) waarmee men in wezen het eiwitgedeelte bepaalt. Aldus kan men nu ook kanker van maag, borst, dikke darm, rectum, eierstokken, 5 mond, tong, strottehoofd, prostaat, baarmoeder, lever, galblaas en galleider, pancreas, longen en zwezerik diagnoseren, alsmede de kwaadaardige lymphadenose, lymphomen en melanomen en de multipeLe myelomen. Deze werkwijze heeft een specificiteit die bepaald wordt door het ingezette lectine; indien een AcGal 10 bindend lectine gebruikt wordt is de methode van de uitvinding . vooral geschikt voor het herkennen van kanker die ontstaan is in niet gedifferentieerde cellen, zoals kwaadaardige lymphadenose, lymphomen en kanker van het chorion-epitheel. Verder is de diagnose van kanker met AcGal en/of Fuc bindend lectine vol-15 gens deze uitvinding voordelig doordat hij zeer specifiek'voor kanker is en veel minder kruisreacties vertoont met andere kwalen zoals lever-cirrose, hepatitis, maagzweren, diabetes, colitis, enz.; met de gebruikelijke wijzen van diagnose door bepaling van erj-fetoproterne, CEA e.d. heeft men daar veel 20 meer last van. De gebruikelijke diagnosemethoden geven vaak positieve uitslagen bij leverkwalen, vooral lever-cirrose en hepatitis, en dat schept natuurlijk verwarring. Maar de diagnosemethode van deze uitvinding vertoont een zeer lage kruisreactie met leverkwalen en is dus erg betrouwbaar.

25 Bovendien kan men met de werkwijze vol gens de uitvinding suikers en suiker-derivaten met acetylgalactosamine en/of L-fucose als eindstandige groepen (glyco-peptiden, glycoproteïnen, glycolipiden, glycoterpenen en glycosteroxden) bepalen.

30 De uitvinding wordt nu nader toegelicht aan de hand van de volgende, niet beperkende voorbeelden.

8200334 1 4 - 15 -

Voorbeeld I

(i) Activering van peroxydase

Aan 5 mg peroxydase uit rammenas in 1 ml waterige 0,3 M NaHCO^-oplossing werd 0,1 ml 0,1 M fluordinitro-5 benzeen in ethanol toegevoegd, en na 1 uur zachtjes roeren op kamertemperatuur 0,1 ml 0,06 M NaJO^-oplossing. Na nog 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd 1 ml 0,16 M ethaandiol aan dit mengsel toegevoegd, en het geheel werd 1 uur zachtjes op kamertemperatuur geroerd. Daarna werd de oplossing een dag en 10 een nacht bij 4°C gedialyseerd tegen 0,01 M koolzuur-bicarbo-naat-buffer met pH - 9,5.

(ii) Het merken van lectine met peroxydase

In 3 ml van de bij (i) verkregen oplossing werd 5 mg dolichosboon-lectine opgelost, en na 2-3 uur 15 reactie op kamertemperatuur onder zacht roeren werd hieraan 5 mg NaBH^ toegevoegd. Na 3 uur staan op 4°C werd de oplossing een dag en een nacht gedialyseerd tegen 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4, waarna over een kolom Sephadex G 150 gechromatogra-feerd werd (elutie met 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4).

20 Van elke fractie werden de optische dichtheden bij 280 nm en 403 nm gemeten, en fracties die pieken hiervan hadden werden verzameld.

(iii) Het merken van lectine met peroxydase

In 3 ml van de bij (i) verkregen oplos-25 sing werd 5 mg rolklaver-lectine opgelost, en na 2-3 uur reactie op kamertemperatuur onder zacht roeren werd hieraan 5 mg NaBH^ toegevoegd. Na 3 uur staan op 4°C werd de oplossing een dag en een nacht gedialyseerd tegen 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4, waarna over een kolom Sephadex G ‘150 gechromatogra-30 feerd werd (elutie met 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4).

Van elke fractie werden de optische dichtheden bij 280 nm en 403 nm gemeten, en fracties die pieken hiervan hadden werden verzameld.

8200334 - 16 - (iv) Bereiding van onoplosbaar gemaakt lectine

In 3 liter 0,001 N zoutzuur werd 15 g met broomcyaan geactiveerde agarose gesuspendeerd en na 30 minuten staan werd de vaste stof afgefiltreerd en op het glas-5 filter met 1 liter 0,1 M NaHCO^-oplossing uitgewassen (pH = 8,5). Aldus werd in totaal 50 ml geactiveerde agarose verkregen. Deze werd gesuspendeerd in 200 ml 0,1 M NaHCO^-oplossing en 5 ml 0,01 M fosfaat-buffer met pH = 7,7, waarin 50 mg doli-chosboon-lectine werd toegevoegd. Na 2 uur staan op kamer-10 temperatuur onder zo nu en dan roeren werd het reactiemengsel gefiltreerd en de vaste stof op het glasfilter uitgewassen en daarna toegevoegd aan 200 ml 1M monoethanolamine-oplossing met pH = 8,5. Na 2 uur reageren op kamertemperatuur werd weer gefiltreerd en werd de vaste stof op het glasfilter met 1 liter 15 0,1 M azijnzuur-oplossing en met 1 liter 0,1 M boorzuur-oplós- sing (die beiden ook 0,5 M NaCl bevatten) uitgewassen; deze dubbele uitwassing werd nog twee keer herhaald.

(v) Bereiding van onoplosbaar gemaakt lectine

In 3 liter 0,001 N zoutzuur werd 15 g 20 met broomcyaan geactiveerde agarose gesuspendeerd en na 30 minuten staan werd de vaste stof afgefiltreerd en het glasfilter met 1 liter 0,1 M NaHCOg-oplossing uitgewassen (pH = 8,5). Aldus werd in totaal 50 ml geactiveerde agarose verkregen.

Deze werd gesuspendeerd in 200 ml 0,1 M NaHCO^-oplossing en 25 5 ml 0,01 M fosfaat-buffer met pH = 7,7, waarin 50 mg rolklaver- lectine werd toegevoegd. Na 2 uur staan op kamertemperatuur onder zo nu en dan roeren werd het reactiemengsel gefiltreerd en de vaste stof op het glasfilter uitgewassen en daarna toegevoegd aan 200 ml 1M monoethanolamine-oplossing met pH =* 8,5.

30 Na 2 uur reageren op kamertemperatuur werd weer gefiltreerd en werd de vaste stof op het glasfilter met 1 liter 0,1 M azijnzuur-oplossing en met 1 liter 0,3 M boorzuur-oplossing (die beiden ook 0,5 M NaCl bevatten) uitgewassen; deze dubbele uit-wassing werd nog twee keer herhaald.

35 8200334 - 17 - (vi) Bereiding van TAG-achtig materiaal

In 100 ml 0,05 M fosfaat-buffer met pH » 7,0 werd 1 g gesulfateerd glucoproteïne uit het maagslijm van varkens (hierna afgekort tot GP-VMS) opgenomen, en met 5 1 N NaOH werd de pH op 11 bijgesteld. Na 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd het mengsel 10 minuten op 3000 rpm gecentrifugeerd, en in de bovenstaande vloeistof werd de pH met 1 N HC1 weer op 7,0 gebracht, waarna opnieuw 10 minuten op 3000 rpm gecentrifugeerd werd. De bovenstaande vloeistof 10 hiervan werd een nacht tegen 10 liter 0,01 N fosfaat-buffer met pH = 7,0 gedialyseerd, wat zuiver TAG-achtig materiaal gaf.

(vii) Bereiding van gemerkt TAG

(a) Merken met enzym (GP-VMS-peroxydase)

In 1 ml gedestilleerd water werd 4 mg 15 (0,1 yum) peroxydase uit rammenas opgelost, en hieraan werd 0,2 ml 0,1 M NaJO^ toegevoegd. Na 20 minuten roeren op kamertemperatuur werd deze oplossing een dag en een nacht gedialyseerd tegen 1 M acetaatbuffer met pH = 4,4, om niet omgezet NaJO^ te verwijderen. Aan de gedialyseerde vloeistof werd on-20 geveer 60 yul 0,2 M NaHCO^-oplossing met pH = 9,5 toegevoegd, om de pH van het geheel op 9,0 te brengen. Aan deze oplossing werd direct 0,6 ml GP-VMS (10 mg/ml in 0,01 M bicarbonaat-buffer met pH = 9,5) toegevoegd. Na 2 uur roeren op kamertemperatuur werd 0,1 ml NaNH^-oplossing van 4 mg/ml in gedestil-25 leerd water toegevoegd. Na 2 uur staan op 4°C werd deze oplossing een dag en een nacht tegen 0,01 M fosfaat-buffer met pH = 7,5 gedialyseerd, en vervolgens gezuiverd met behulp van een kolom van 150 cm x 1,5 cm Sephadex G-200. De doorkomende vloeistof werd in 5 ml porties opgevangen, waarvan de opti-30 sche dichtheden bij 280 en 403 nm gemeten werden. De fracties die dit vertoonden bevatten gezuiverd GP-VMS-peroxydase.

125 (b) Merken met een isotoop ( J-GP-VMS)

In 50 yul 0,2 M fosfaat-buffer met pH = 7,0 werd 10 jig GP-VMS opgelost en hieraan werd 10 jx 1 35 NaJ-oplossing met 1 mCi aan toegevoegd en vervolgens 100 8200334 - 18 -

* V

/ ; yul fosfaat-buffer die per ml 0,5 mg chlooramine T bevatte. Na

30 seconden mengen op kamertemperatuur werd ook nog 100 yal 0,2 M

fosfaat-buffer met daarin 100 ug Na-S^O- toegevoegd, en vervol-125 Z f 25 gens 1 mg Na J. Het aldus gemaakte J-GP-VMS werd over een 5 kolom Sephadex G-50 van 1 x 30 cm gezuiverd; het had een radioactiviteit van 1-2 yuCi/yüg.

(viii) Bepalingsmethode 125

Van het in (vii) verkregen J GP-VMS werd 0,1 ml (100 ng met 0,17 yuCi, wat overeenkomt met 240.000 10 tellingen per minuut) in een glazen buis van 10 x 75 mm gemengd met 0,1 ml van het in (vi) verkregen standaard GP-VMS (met respectievelijk 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5 en 10 yug/ml), 0,1 ml oplossing met 10 yug/ml dolichosboon-lectine en 0,2 ml 0,05 M fosfaat-buffer, die bovendien 0,15 M NaCl, 0,1 % runder-serum-15 albumine en 0,02 % NaN^ bevatte. Na 1 uur incubatie op 25°C

werd 0,1 ml 10-voudig verdund konijnenserum tegen dolichosboon-albamine (gemaakt door E.Y. Laboratory) gemaakt. Na nog eens 1 uur incubatie op 25°C werd het mengsel 30 minuten bij 4°C op 3000 rpm gecentrifugeerd. De radioactiviteit van het neer-20 slag werd geteld, waaruit de standaardkromme van figuur 1 getekend kon worden. Zoals uit de verkregen resultaten blijkt werd gewoonlijk 20-25 % gebonden en werd 50 % remming bereikt bij een concentratie van 0,06 yjg/ml.

(ix) Bepalingsmethode 125

25 Van het in (vii) verkregen J GP-VMS

werd 0,1 ml (100 ng met 0,17 yuCi, wat overeenkomt met 240.000 tellingen per minuut) in een glazen buis van 10 x 75 mm gemengd met 0,1 ml van het in (vi) verkregen standaard GP-VMS (met respectievelijk 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5 en 10 yug/ml), 0,1 ml 30 oplossing met 10 yug/ml rolklaver-1eetine en 0,2 ml 0,05 M

fosfaat-buffer, die bovendien 0,15 M NaCl, 0,1 % runderserum-albumine en 0,02 % NaN^ bevatte. Na 1 uur incubatie op 25°C werd 0,1 ml 10-voudig verdund konijnenserum tegen rolklaver-lectine (gemaakt door E.Y. Laboratory) gemaakt. Na nog eens 35 1 uur incubatie op 25°C werd het mengsel 30 minuten bij 4°C

op 3000 rpm gecentrifugeerd. Dejradioactiviteit van het neer- 8200334 - 19 - » ί * slag werd geteld, waaruit de standaardkromme van figuur 2 getekend kon worden. Zoals uit de verkregen resultaten blijkt werd gewoonlijk 20-25 % gebonden en werd 50 % remming bereikt bij een concentratie van 0,6 yug/ml.

5 (x) Bereiding van onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal

In 100 ml 0,01 M fosfaat-buffer met pH « 7,0 werd overmaat GP-VMS gesuspendeerd. Hieraan werd 0,01 N NaOH toegevoegd zodat de pH op 11 kwam, waarna 20 minuten op 3000 rpm gecentrifugeerd werd. Aan de heldere vloeistof werd 10 druppelsgewijs 0,03 N HC1 toegevoegd zodat de pH op 7,0 kwam, en opnieuw werd 20 minuten op 3000 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd tegen 0,01 N fosfaat-buffer met pH » 7,0 gedialyseerd. In deze GP-VMS-ορlossing bleek het hexose-gehalte (bepaald met de fenol-zwavelzuur-methode en met glucose 15 als standaard) 5-7 mg/ml te bedragen en het eiwit-gehalte (met runderserumalbumine als standaard) 1-2 mg/ml.

Deze oplossing werd 2:1 met hydroxyethyl-methacrylaat gemengd, en dit mengsel werd in een reageerbuis van 1 x 15-20 cm geplaatst, snelt tot -70°C afgekoeld en ge- g 20 vriesdroogd. Vervolgens werd het bestraald met 1 x 10 rad aan gamma-straling, waardoor het monomeer polymeriseerde. Het verkregen staafje polymeer werd tot coupes van 10 yum dikte versneden.

(xi) Bereiding van onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal 25 In 3 liter 0,001 N zoutzuur werd 15 g met broomcyaan geactiveerde Sepharose 4B (van de firma Pharmacia AB) gesuspendeerd, en na 30 minuten staan werd dit afgefiltreerd en op het filter uitgewassen met 1 liter 0,1 M NaHCO^-oplossing (pH = 8,5). Daarna werd het neerslag gesuspendeerd in 30 200 ml 0,1 M NaHCO^-oplossing en 5 ml 0,01 M fosfaat-buffer (met pH = 7,7) die 50 mg GP-VMS bevatte. Men liet 2 uur bij kamertemperatuur reageren onder zo nu en dan roeren.

Na afloop van de reactie werd de vaste stof op een glasfilter verzameld en uitgewassen en daarna 35 gesuspendeerd in een 1 M monoethanolamine-oplossing (pH = 8,5), waarmee men het 2 uur liet reageren. Daarna werd de vaste 8200334 * 4 - 20 - stof opnieuw gefiltreerd en op het filter uitgewassen met 1 liter 0,1 M acetaat-buffer en 1 liter 0,1 M boorzuur-oplossing (die beide 0,5 M NaCl bevatten); deze dubbele uitwassing werd nog tweemaal herhaald.

5 (xii) Andere bereiding van onoplosbaar gemaakt TAG-achtig materiaal 10.000 polystyreenparels met een doorsnede van 6,4 mm (gemaakt door de firma Precision Plastic Co., Ltd. in de V.S.) werden uitgewassen met een verdunde oplossing 10 van synthetische zeep (1,5 ml/1 mamalemon gemaakt door de firma Lion Co. Ltd.) en daarna met gedestilleerd water. Vervolgens liet men ze 3 dagen in 0,5 M NaOH staan, waarna ze opnieuw grondig met water uitgewassen werden totdat de pH ongeveer 6 was. Deze uitgewassen 10.000 parels werden gesuspendeerd in 15 2,5 liter 35 % GP-VMS-oplossing in 0,05 M acetaat-buffer met pH = 4,5, en na 24 uur roeren met 10 rpm werden ze afgefiltreerd en met 4x8 liter gedestilleerd water uitgewassen. Daarna werden de parels gesuspendeerd in 2,5 liter 1 % glutaaraldehyd in 0,05 M fosfaat-buffer met pH = 7, en na 2 uur roeren op 10 20 rpm werden ze weer afgefiltreerd en op dezelfde wijze met water uitgewassen. Daarna werden de 10.000 parels gesuspendeerd in

2,5 liter 1 M glycine in 0,05 M acetaat-buffer met pH = 7,0, en na 2 uur roeren op 10 rpm werden ze op dezelfde wijze afgefiltreerd en met gedestilleerd water uitgewassen. Daarna wer-25 den ze overnacht bij 37°C gedroogd. Het eiwit-gehalte van deze parels werd bepaald met de Orcinol-zwavelzuur-methode (beschreven door M. Schonenberger et al in Z. Physiol. Chem. 309 (1957) 145) en bleek 2,7 +_ 0,2 ji% GP-VMS te bedragen Voorbeeld II

30 (i) Bereiding der proefmonsters

Van een aantal patiënten met kanker en met andere ziekten, zwangere vrouwen en geheel gezonde personen werd 5 ml bloed afgetapt met behulp van een met 500 eenheden heparine behandelde injectienaald. Deze monsters werden 10 mi-35 nuten op 2000 rpm gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistoffen werden voor de bepalingen bewaard.

8200334 < é - 21 - (ii) Dé bepaling

Aan 0,1 ml van de in (i) verkregen monsters werden een gelijk volume dolichosboon-lectine-peroxydase-combinatie in 0,2 ml 0,15 M fosfaat-buffer en een 5 coupe onoplosbaar gemaakte PG-VMS (van voorbeel I(x) toegevoegd, en na goed omroeren liet men het mengsel 24 uur op 20-37°C staan. Na grondig uitwassen van de coupe werd de peroxydase-activiteit van die coupe gemeten door inwerking op wet o-fenyleendiamine als rveagens· ; en meten van de extinctie 10 bij 492 nm.

Een ijkkromme werd opgesteld door de proefmonsters te vervangen door porties standaard GP-VMS met bekende concentraties, zoals weergegeven in figuren3.en 3^ waarbij de hoeveelheden GP-VMS opgegeven zijn als de daarmee 15 overeenkomstige hoeveelheden hexose of N-acetylgalactosamine· (iii) Resultaten

Zoals men in figuur 4 ziet hadden alle gezonde mensen een TAG-gehalte van ongeveer 0,1 nanomol/ml. Voorbeeld III

20 (i) Bereiding van een agarose-gel

Een 1 gew.% suspensie van agarose (produkt van de firma Iwai Kagaku Co. Ltd.) in 0,01 M tris-HCl-buffer (pH =* 7,5) werd op 70-80°C verhit, waardoor alles in oplossing ging. Nadat 0,01 % thimerosal toegevoegd was werd 25 de oplossing in porties van 1 ml over reageerbuizen verdeeld en liet men ze bij kamertemperatuur stollen.

(ii) De meting

In elk van twee reageerbuizen werd 200 jïl monster en 50 jil met peroxydase gemerkt dolichosboon-30 lectine gedaan; deze laatste oplossing bevatte 3,5 yug/ml lectine in 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,5. Na even omroeren liet men beide monsters een uur op 20-30°C staan.

Bij een monster (A) werd 250 jil 8 % polyethyleenglycol (MG - 6000) in 0,1 M tris-HCl-buffer ge-35 daan, en bij de ander monster (B) 250 jil 0,1 M tris-HCl-buffer, en na even omroeren liet men beide monsters 30-60 8200334 r / - 22 - minuten op 20-30°C staan. Daarna werden ze in een centrifuge met uitslaande rotor 40-60 minuten op 1000 g gecentrifugeerd. Van de bovenstaande vloeistoffen werd 50 jx 1 in 2 ml fysiologische zout-oplossing overgebracht, en daarna werd aan elk 5 mengsel 500 jil oplossing van een peroxydase-substraat (hierna "substraat-oplossing” genoemd) toegevoegd, waarna men de mengsels 30 minuten in het donker op 20-30°C liet staan. De substraat-oploss ing was aangemaakt door o-fenyleendiamine en waterstofperoxyde aan 0,1 M citraat-iosfaat-oplossing toe te 10 voegen tot eindconcentraties van respectievelijk 6 % en 0,1 %. De substraat-oplossing bewaart men bij voorkeur bij 4°C.

De enzymatische reactie werd afgebroken door 1 ml 2N zoutzuur toe te voegen. De kleurverandering werd vastgelegd door de extinctie in een spectrofotometer bij 15 492 nm te meten. De extinctie van monster A wordt afgetrok ken van die van het monster B, en dit verschil is in figuur 5 opgegeven. De cirkeltjes onderaan geven de uitkomsten bij vijf gezonde mensen weer, de stippen met cijfers 1 en 2 van twee patiënten met leverkanker en de stip met cijfer 3 de uit-20 komst van een patiënt met kwaadaardige lymphadenose. Als men bij deze bepaling een uitkomst krijgt groter dan bij een gezonde dan betekent dat een hoger gehalte aan TAG in het plasma, en dat suggereert dat in die persoon kankercellen aanwezig zijn.

25 (iü) Bepaling met een sandwich-methode

In een 100 yul 0,05 M fosfaat-buffer die per ml 1 tot 10 yig GP-VMS bevatte werd 200 yug DBA-agarose toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij 25°C onder roeren werd de vloeistof verwijderd en de agarose driemaal met 0,05 M fosfaat- 30 buffer (pH = 7,0) uitgewassen en daarna werden er 6 jig met peroxydase gemerkt DBA (verkregen in voorbeeld I(ii)) en 100 ml 0,05 M fosfaat-buffer (pH = 7,0) aan toegevoegd. Na 1 uur incubatie onder roeren bij 25°C werden de reactiemengsels 10 minuten op 3000 rpm gecentrifugeerd en werden de bezinksels 35 elk driemaal met 0,05 M fosfaat-buffer uitgewassen, waarna de .devcerd extinctie bij 100-23^5-23.¾½^ werd. De uitkomsten hiervan^ staan 8200334 ft / - 23 - in figuur 6.

(iv) Bepaling op basis van concurrentie

Van de in voorbeeld II(i) verkregen bloedmonsters werden porties van 100 jxl in reageerbuizen ge-5 mengd met 500 jxl 0,3 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4 die ook 0,22 % gelatine, 0,005 M CaC^ en 0,005 M MgC^ bevatten. Aan elk monster werden een met GP-VMS behandelde polystyreenpare-(van voorbeeld I(xii)) en 100 jil van het volgens voorbeeld I(ii) bereide, met peroxydase gemerkte lectine (met een concentratie 10 van 1 mg/1) toegevoegd. Na omroeren werden de mengsels 48 uur bij 4°C geïncubeerd. Daarna werden de bovenstaande vloeistoffen afgezogen en werden de parels uitgewassen met 2 ml fysiologische zout-oplossing, die opnieuw met een fijn buisje afgezogen werden. Dit uitwassen werd driemaal herhaald.

15 In 20 ml 0,2 M Mcllevein-buffer met pH = 5,8 werd 60 mg o-fenyleendiamine opgelost en hieraan werd EL^ toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,02 vol.%.

In een reageerbuis werden 2 ml fysiologische zout-oplossing, 500 yul van het zojuist beschreven kleur-20 reagens en een uitgewassen polystyreenparel gebracht, en deze combinatie werd 30 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd.

Daarna werd de enzymatische reactie gestopt door 1 ml 3 N HC1 toe te voegen. De optische dichtheid van het reactiemengsel bij 492 nm verd gemeten, en dit gebeurde ook met parels die in 25 contact gestaan hadden met oplossingen van bekende sterkte, wat een ijkkromme gaf die in figuur 7 weergegeven is. Van de echte monsters konden nu de TAG-gehalten gevonden worden, en deze uitkomsten zijn weergegeven in figuren 8(3.), (b) éfi ££).. Voorbeeld IV

30 (i) Bepaling op basis van concurrentie

Een coupe oplosbaar gemaakt TAG bevattend materiaal (het produkt van voorbeeld I(x)) werd gecombineerd met 50 ycl aan rolklaver-lectine gebonden peroxydase (het gemerkte produkt van voorbeeld I(iii)) en 200 ml monster 35 (GP-VMS van diverse concentraties). Na 20 uur incubatie op 25°C werden de coupes met fosfaat-buffer uitgewassen en in 2,0 ml 8200334 -24- s» * fysiologische zout-oplossing gesuspendeerd. Nadat daar ook nog 0,5 ml peroxydase-substraat-oplossing aan toegevoegd was werd 1 uur op 25°C geïncubeerd. Nu werd de reactie gestopt door 1,0 ml 3 N zoutzuur toe te voegen, waarna de extinctie bij 5 492 nm gemeten werd. Tevens werden ook de extincties gemeten van oplossingen die op dezelfde wijze opgewerkt waren behalve dat ze diverse bekende concentraties standaardmateriaal (GP-VMS) bevatte, wat de ijkkromme van figuur 9 gaf.

(ii) Bepaling met een sandwich-methode 10 Aan 100 jil 0,05 M fosfaat-buffer (pH = 7,0) waarin per ml 1 tot 10 yug GP-VMS werd 200 rolklaver-lectine-agarose toegevoegd. Na 1 uur incubatie onder roeren bij 25°C werd de agarose afgescheiden en driemaal met 0,05 M fosfaat-buffer uitgewassen. Van het in voorbeeld I(iii) verkregen met 15 peroxydase gemerkte rolklaverlectine werd 6 g en van een 0,05 M fosfaat-buffer (pH = 7,0) werd 100 jil aan deze coupes toegevoegd, waarna 1 uur onder roeren bij 25°C geïncubeerd werd. Na 10 minuten centrifugeren op 3000 rpm werd de vloeistof afgeschonken en het sediment driemaal uitgewassen met 0,05 M fos-20 faat-buffer, en werd de extinctie bij 492 nm gemeten. Tevens werden de extincties gemeten van op dezelfde wijze opgewerkte oplossingen, behalve dat ze standaardmateriaal in diverse concentraties bevatten, hetgeen de ijkkromme van figuur 10 gaf.

(iii) De eigenlijke bepaling 25 Aan 0,1 ml van elk der in voorbeeld II(i) verkregen monsters werd een gelijk volume van 0,2 ml 0,15 M fosfaat-buffer met daarin per ml 10 yag rolklaverlectine-peroxydase toegevoegd, en ook ëën coupe onoplosbaar gemaakt GP-VMS. Na 24 uur incubatie bij 20-37°C onder goed roeren wer-30 den de coupes afgescheiden en grondig uitgewassen, waarna de activiteit van het aan rolklaverlectine gebonden peroxydase op fyOj». gemeten werd met o-fenyleendiamine als -réagens en door meten van de extinctie bij 492 nm. Een ijkkromme werd verkregen door de proefmonsters te vervangen door bekende concentraties en 35 standaardmateriaal, en die ijkkromme staat in figuur 10 (de 8200334 ψ - 25 - hoeveelheid TAG werd hier weer aangegeven als de overeenkomstige hoeveelheid hexose).

Men ziet in figuur 11 dat alle gezonde mensen een TAG-gehalte beneden 3 riM/ml hadden.

5 (iv) De eigenlijke bepaling

Van de in voorbeeld II(i) verkregen bloedmonsters werden porties van 100 yul in reageerbuizen gemengd met 50 ji 1 met peroxydase gemerkte rolklaverlectine (3,5 ^ïg/ml lectine in 0,1 M tris-HCl-buffer met pH = 7,5, bereid 10 zoals beschreven in voorbeeld I(iii)). Na even omroeren liet men elk mengsel I uur op 20-30°C staan. Aan ëén ervan (A) werd 250 jxl 8 % polyethyleenglycol (MG = 6000) in 0,1 M tris-HCl-oplossing toegevoegd en aan het andere (monster B) 250 yul 0,3 M tris-HCl-oplossing. Na even omroeren liet men beide 15 monsters 30-60 minuten op 20-30°C staan en werden $ 40"tót 60 minuten gecentrifugeerd in een uitslaande rotor op 1000 g.

Van de bovenstaande vloeistof werd 50 jsl in 2 ml fysiologische zoutoplossing gebracht en na goed omroeren ook nog 500 jil peroxydase-substraat-oplossing (voor de bereiding hiervan zie 20 voorbeeld III(ii)). Na 30 minuten staan in het donker op 20-30°C werd de enzymatische reactie onderbroken door 1 ml 2 N zoutzuur toe te voegen. De kleurverandering werd in een spectrofoto-meter bij 492 nm gemeten. De extinctie van monster A werd afgetrokken van die van monster B, en de uitkomst daarvan werd 25 in figuur 10 afgezet tegen de hoeveelheid aan TAG gebonden lectine. In figuur 12 ziet men de uitkomsten, waarbij de ongenummerde cirkeltjes die van gezonde personen voorstellen, de stippen met cijfers 1 en 2 die van patiënten met maagkanker en die met cijfer 3 van een patiënt met borstkanker. Monsters met 30 een hogere uitkomst dan bij gezonde personen hebben een verhoogd gehalte aan TAG, en dat suggereert dat er in die mensen kankercellen zijn.

(v) Bepaling op basis van concurrentie

Van de in voorbeeld II(i) verkregen 35 bloedmonsters werden porties van 100 jxl in reageerbuizen gemengd met 500 ƒ11 0,3 M tris-HCl-buffer met pH = 7,4 die ook 8200334 t - 26 - 0,22 % gelatine, 0,005 M CaC^ en 0,005 M MgC^ bevatten. Aan elk monster werden een met GP-VMS behandelde polystyreen-parel (produkt van voorbeeld I(xii)) en 100 jil van het volgens voorbeeld I(iii) bereide, met peroxydase gemerkte lectine 5 (met een concentratie van 1 mg/1) toegevoegd. Na omroeren werden de mengsels 48 uur bij 4°C geïncubeerd. Daarna werden de bovenstaande vloeistoffen afgezogen en werden de parels uitgewassen met 2 ml fysiologische zout-oplossing, die opnieuw met een fijn buisje afgezogen werden. Dit uitwassen werd driemaal 10 herhaald.

In 20 ml 0,2 M Mcllevein-buffer met pH = 5,8 werd 60 mg o-fenyleendiamine opgelost en hieraan werd H2O2 toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,02 vol.%.

In een reageerbuis werden 2 ml fysio-15 logische zout-oplossing, 500 yul van het zojuist beschreven kleur-reagens en een uitgewassen polystyreenparel gebracht, en deze combinatie werd 30 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna werd de enzymatische reactie gestopt door 1 ml 3 N HCl toe te voegen. De optische dichtheid van het reactie-20 mengsel bij 492 nm werd gemeten, en dit gebeurde ook met parels die in contact gestaan hadden met oplossingen van bekende sterkte, wat een ijkkromme gaf die in figuur 13 weergegeven is. Van de echte monsters konden nu de TAG-gehalten gevonden worden, en deze uitkomsten zijn weergegeven in figuur 14.

25 8200334

Claims (16)

1. Werkwij ze voor het bepalen van met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen (TAG), met het 5 kenmerk, dat men de te onderzoeken lichaamsvloeistof laat reageren met een lectine dat N-acetyl-D-galactosamine fcjaftof L-fucose bindt, waardoor een TAG-lectine-complex ontstaat, en men of de hoeveelheid TAG-lectine-complex of de overgebleven hoeveelheid lectine meet.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, 'mét hét kenmerk, dat de reactie van de TAG met het lectine gebeurt door de TAG in de lichaamsvloeistof in concurrentie met een bekende hoeveelheid onoplosbaar gemaakt TAG of TAG-achtig materiaal laat reageren met een bekende hoeveelheid ge-15 merkt lectine, waarna men het lectine dat gebonden zit aan de onoplosbaar gemaakte TAG of het onoplosbaar gemaakte TAG-ach-tige materiaal scheidt van het niet gebonden lectine en men in een van beide fracties de hoeveelheid merk bepaalt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, 20 met hét kenmerk, dat de reactie van de TAG met het lectine in concurrentie gebeurt door de TAG in de te bepalen lichaamsvloeistof in concurrentie met een bekende hoeveelheid gemerkte TAG of gemerkt TAG-achtig materiaal te laten reageren met een bekende hoeveelheid lectine of onoplosbaar gemaakt lectine, 25 waarna men de gemerkte TAG of het gemerkte TAG-achtige materiaal dat aan lectine of onoplosbaar gemaakt lectine gebonden zit scheidt van de niet gebonden TAG of het niet gebonden TAG-achtige materiaal en men in éën van beide fracties de hoeveelheid merk bepaalt. 30

* 4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie van TAG met lectine gebeurt door de TAG in de te bepalen lichaamsvloeistof laat reageren met een onoplosbaar gemaakt lectine zodat een TAG-lectine-complex ontstaat, en men dit complex met een bekende hoeveelheid 35 gemerkt lectine laat reageren, waarna men het TAG-lectine- 8200334 * - 28 - complex scheidt van het gemerkte, niet gebonden lectine en men * in een van beide fracties de hoeveelheid merk bepaalt.

5. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, 'mét hét kenmerk, dat de TAG uit het te onderzoe- 5 ken monster lichaamsvloeistof afgescheiden worden en men ze dan met het lectine laat reageren.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, 4 of 5, met hét'kenmerk, dat het gemerkte lectine met een enzym, een fluorescerende stof of een radioactieve stof gemerkt is.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat aan de te onderzoeken lichaamsvloeistof een beschermend eiwit toegevoegd wordt.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 4,'met het kenmerk, dat de lichaamsvloeistof bloed, weef-15 selvloeistof, lymphe, ascites-vloeistof, amnion-vloeistöf, maagsap, urine, pancreassap, cerebrospinaal vloeistof of speeksel is.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, mét hét kenmerk, dat de lichaamsvloeistof bloedserum of bloed-20 plasma is.

10. Werkwijze volgens conclusie 6, met het'kenmerk, dat het enzym glucoamylase, glucoseoxydase, peroxydase, alkalische fosfatase of hemoctapeptide of een actief fragment daarvan is.

11. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de fluorescerende stof fluoresceïne, fluoresceïiïi%hiocyanaat of dansylchloride is.

12, Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de radioactieve stof radioactief jodium 30 of tritium is.

13. Werkwijze voor de diagnose van kanker, waarbij men in een monster lichaamsvloeistof het gehalte aan met tumoren geassocieerde glucosidische bindingen bepaalt op een wijze volgens een der voorafgaande conclusies en men het 35 aldus gevonden gehalte vergelijkt met dat van een gezonde persoon. 8200334 -> W - 29 -

14. Kit voor het bepalen van het gehalte aan TAGin lichaamsvloeistoffen die lectine bevat dat acetyl-galactose ïi)0(of fucose bindt en ook een specifiek TAG agglutinerend agens bevat.

15. Kit volgens conclusie 14, waarin het lectine gevriesdroogd is en die bovendien een reagens op basis van water of op basis van een met water mengbaar oplosmiddel voor het weer aanmaken van dat lectine bevat.

16. Werkwijze in hoofdzaak volgens be-10 schrijving en/of voorbeelden. 8200334