DK154859B - Fremgangsmaade til bestemmelse af tumor-associerede glycobindinger og udstyr til brug ved denne fremgangsmaade - Google Patents

Description

DK 154859 B

Opfindelsens baggrund.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af tumor-associeret glycobinding (i det følgende betegnet TAG) i legemsvæske fra et pat-5 tedyr, mere specielt TAG omfattende glycoproteiner, glycopeptider, glycolipider og/eller kulhydrater med en bestemt specifik endegruppe, hvilken TAG stiger ved proliferationen af udifferentierede celler, især tumorceller eller cancerceller.

10 Der kendes fremgangsmåder til diagnose af cancer ved at måle et specifikt glycoprotein, der specielt dannes hos patienter med cancer. De fleste af disse fremgangsmåder udnytter antigeniciteten af glycopro-teinets proteindel; f.eks. kendes en fremgangsmåde til 15 diagnose af primær levercancer ved at måle a^-foeto-protein og en fremgangsmåde til diagnose af cancer i et fordøjelsesorgan, navnlig rektal cancer, ved at måle CEA (Igaku no Åyumi (Progress in Medicine), 106, 5,

Fifth Saturday Special Issue, side 235-250 (1978)).

20 Anvendeligheden af disse diagnosefremgangsmåder er imidlertid forholdsvis begrænset.

Det erved yderligere undersøgelser blevet påvist, at legemsvæsken hos en patient med cancer indeholder TAG dannet af udifferentierede celler (hovedsagelig 25 cancerceller) og afgivet til legemsvæsken, og at sådan TAG er meget forskellig fra de kulhydrater, der er dannet af differentierede celler (hovedsagelig normale celler) og afgivet til legemsvæsken, med hensyn til kulhydratkædestrukturen, kulhydratkædelængden og arten 30 af de indgående kulhydratrester. Man har også fundet frem til at bestemme TAG-niveauet i en prøve af legemsvæske ved at omsætte TAG i prøven med en lectin, der specifikt kan forene sig med galactose-(βΐ-* 3 eller |31-* 4) -N-acetyl-glucosamin- og/eller galactose- (β1->3 35 eller βΐΗΜ)-N-acetyl-galactosaminendegrupper (dansk patentansøgning nr. 369/80).

I betragtning af et stadig stærkere ønske om at 2

DK 154859 B

opnå fremgangsmåder til måling af TAG-niveauet og diagnosemetoder, der er mindre begrænsede, hvad angår deres anvendelighed,og som har forbedret sensitivitet, er der udført omfattende undersøgelser,og som resultat heraf 5 har man fundet, at TAG indeholder glycoproteiner, gly-copeptider, glycolipider og/eller kulhydrater med N-acetyl-D-galactoseamin- (i det følgende betegnet AG) eller L-fucoseendegruppe, at det specifikt forener sig med visse arter lectin (i det følgende vil en lectin, 10 der specifikt kan forene sig med en AG-endegruppe, blive betegnet AG-bindende lectin,og en lectin, der specifikt kan forene sig med en L-fucoseendegruppe, vil blive betegnet L-fucose-bindende lectin), og at man derfor, ved at omsætte TAG i legemsvæske med en 15 AG-bindende lectin eller L-fucose-bindende lectin (begge lectinerne vil i det følgende undertiden blive betegnet som specifikt lectin), kan konstatere cancerceller, kontrollere graden af deres proliferation og få kendskab til deres vækstprofil for cancerdiagnose.

20 Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

Kort beskrivelse af opfindelsen.

Hovedformålet med foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe en ny fremgangsmåde til bestem-25 melse af TAG-niveauet i legemsvæske. Gennem opfindelsen tilvejebringes derfor en fremgangsmåde til bestemmelse af TAG-niveauet i en prøve af legemsvæske bestående i, at man omsætter TAG i prøven med en AG-bindende lectin eller L-fucose-bindende lectin til dannelse af et 30 TAG-lectinkompleks og måler mængden af TAG-lectinkom-plekset eller af ikke omsat lectin.

Kort beskrivelse af tegningerne.

Fig. 1 og 2 er grafer, der viser en standardkurve opnået ved een udførelsesmåde for fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen, ved hvilken der anvendes konkurrerende omsætning (eksempel 1 (viii) og (ix)).

Fig. 3 og 3' er grafer, der viser en kalibreringskurve for een udførelsesmåde for fremgangsmåden

DK 154859 B

3 ifølge opfindelsen, ved hvilken man anvender konkurrenceprocessen ifølge eksempel 2 (ii).

Fig. 4 er en graf, der viser TAG-niveauet hos sunde personer og hos patienter med forskellige cancer-5 sygdomme bestemt ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge foreliggende opfindelse under benyttelse af konkurrenceprocessen ifølge eksempel 2 (iii).

Fig. 5 er en graf, der viser TAG-niveauet hos sunde personer og hos patienter med forskellige cancer-10 sygdomme ifølge eksempel 3 (ii).

Fig. 6 er en graf, der viser en kalibreringskurve for en anden udførelsesmåde for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved hvilken man benytter en sandwichproces ifølge eksempel 3 (iii).

15 Fig. 7 er en graf, der viser en kalibrerings kurve opnået ved fremgangsmåden ifølge eksempel 3 (iv) under anvendelse af PGM som standardstof.

Fig. 8 (si), (b) og (c) er grafer, der viser TAG-niveauet i prøver bestemt under anvendelse af kalibre-20 ringskurven i fig. 7.

Fig. 9 og 9' er grafer, der viser en kalibreringskurve for en yderligere udførelsesmåde for fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af en konkurrencemetode ifølge eksempel 4 (i).

25 Fig. 10 er en graf, der viser en kalibrerings kurve for en yderligere udførelsesmåde for fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af en sandwichproces ifølge eksempel 4 (ii).

Fig. 11 er en graf, der viser TAG-niveauet hos 30 sunde personer og hos patienter med forskellige cancersygdomme bestemt ved anvendelse af konkurrenceprocessen ifølge eksempel 4 (iii).

Fig. 12 er en graf, der viser TAG-niveauet hos sunde personer og hos patienter med forskellige cancer-35 sygdomme bestemt under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempe 4 (iv).

Fig. 13 er en graf, der viser en kalibreringskurve opnået ved fremgangsmåden ifølge eksempel 4 (v).

4

DK 154859 B

Fig. 14 er en graf, der viser TAG-niveauet i prøver bestemt under anvendelse af kalibreringskurven i fig. 13.

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen.

5 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan benyt tes forskellige legemsvæsker, deriblandt blod, vævsvæske, lymfe, thoraxvæske, abdominalvæske, fostervand, mavesaft, urin, bugspyt, cerebrospinalvæske og spyt.

Af disse foretrækkes blod i form af serum eller blod-10 plasma. Den mængde legemsvæske, der skal benyttes til bestemmelsen, andrager fra ca. 0,01 til ca. 10 ml, fortrinsvis fra 0,1 til 0,2 ml.

Ifølge opfindelsen isoleres TAG fra legemsvæsken, omsættes med en specifik lectin ifølge opfindelsen og 15 mængden af den TAG-bundne specifikke lectin eller den resterende specifikke lectin måles, eller alternativt mærkes en specifik lectin og sættes direkte til legemsvæsken og den TAG-bundne mærkede specifikke lectin eller uomsatte mærkede specifikke lectin isoleres, og 20 mængden af nævnte TAG-bundne mærkede specifikke lectin eller uomsatte mærkede specifikke lectin måles. Ved hver af disse metoder kan legemsvæskens TAG-niveau bestemmes.

Det ønskede TAG kan isoleres fra legemsvæsken 25 ved en vilkårlig af de ekstraktions- eller separationsmetoder, der sædvanligvis benyttes til opnåelse af gly-coproteiner, glycopeptider, glycolipider og/eller kulhydrater med AG- eller L-fucoseendegruppe. Blandt disse metoder er udsaltning, udfældning, ekstraktion, centri-30 fugering, dialyse, molekylsigtning og inaktivering af enzymer. Disse metoder kan benyttes i kombination.

Mere specielt kan den ønskede fraktion fremstilles ved at sætte sulfosalicylsyre, trichloreddikesyre eller zinksulfat til serum eller plasma, eller ved at opvarme 35 serumet eller plasmaen, frafiltrere det resulterende bundfald til fjernelse af albumin, immunoglobulin osv. og derpå dialysere remanensen.

I tilfælde, hvor der benyttes en mærket specifik 5

DK 154859 B

lectin,kan udtagne prøver af legemsvæske, bortset fra blod, benyttes direkte som testprøver (i det følgende betegnet "prøver"). For at forhindre denaturering af prøverne og fremskynde omsætningen med den specifikke 5 lectin tilsættes imidlertid fortrinsvis proteiner indeholdende lavere kulhydrater såsom okseserumalbumin (BSA) som beskyttende proteiner . Et bedre resultat opnås ved at sætte en passende mængde beskyttende protein til prøven efter fjernelse af albumin, immunoglo-10 bulin eller lignende derfra. Når legemsvæsken er blod, kan der som prøve benyttes serum opnået ved en kendt serum-indsamlingsmetode eller plasma opnået ved en plasma-indsamlingsmetode under anvendelse af et anti-koaguleringsmiddel såsom heparin, EDTA, citronsyre eller 15 lignende. Den særligt foretrukne prøve er plasma indsamlet og fremstillet under anvendelse af heparin som antikoaguleringsmiddel. Hvis TAG-nlveauet er forholdsvis højt som hos en patient med ascites, kan disse prøver fortyndes med en egnet pufferopløsning i ønsket 20 udstrækning.

Enhver AG-bindende lectin eller L-fucose-binden-de lectin kan benyttes ifølge opfindelsen, hvis den er i stand til at binde specifikt til glycoproteiner, gly-copeptider, glycolipider og/eller kulhydrater med AG-25 eller L-fucose-endegruppe. Egnede eksempler på AG-bindende lectin omfatter Dolichos bønne (Dolichos biflorus), Maclura tomifera lectin, Helix pomatia lectin, lima-bønne (Phaseolus limensis) lectin, sojabønne (Glycine max) lectin og Bauhinia bønne (Bauhinia purpurea) lec-30 tin. Egnede eksempler på den L-fucose-bindende lectin omfatter Lotus tetragonolobus lectin [Brt. j. Enp.

Pathi., 34, 94 (1953)] og Ulex europeus lectin [Boyd., W.C. og Sharpleigh. E., Blood, 9^, 1195 (1954)].

Forskellige enzymer, fluorescerende materialer 35 og radioaktive materialer kan benyttes som materiale til mærkning af lectinen ifølge opfindelsen. Illustrerende eksempler på enzymer omfatter glucoamylase, glucoseoxidase, peroxidase, alkaliphosphatase, β-galac- 6

DK 154859 B

tosidase og aktivt fragment af hemoctapeptid osv.j eksempler på de fluorescerende materialer omfatter fluorescein, fluoresceinisothiocyanat, rhodamin, dansylchlorid (dvs. 5-dimethylamino-l-naphthalen-5 sulfonylchlorid), osv., og radioaktive materialer omfatter f.eks. radioaktivt iod (f.eks. ^25I, 131I, osv.), radioaktivt tritium, osv.

Som det vil blive beskrevet i det følgende kan den specifikke lectin, der skal benyttes ifølge opfin-10 delsen, mærkes med disse mærkningsmaterialer ved en fremgangsmåde, der sasdvanligvis benyttes til at mærke kendte proteiner såsom antigener eller antistoffer med enzymer, fluorescerende materialer eller radioaktive materialer.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres på følgende måde: først blandes en forudbestemt mængde af legemsvæsken eller en TAG-fraktion med en mærket eller umærket specifik lectin, og blandingen opvarmes til en temperatur på under 45°C, fortrinsvis mellem 20 4 og 40°C, og mest foretrukket mellem 20 og 40°C. Den resulterende TAG-bundne mærkede eller umærkede specifikke lectin eller den uomsatte mærkede eller umærkede specifikke lectin kan isoleres ved hjælp af konventionel isoleringsteknik, såsom chromatografi, elektro-25 forese, udsaltning, fraktionering, dialyse, gelfiltrering, adsorption eller kombinationer deraf. Alternativt kan agargel, agarosegel eller polyacrylamidgel benyttes som separeringsmidler (se japansk, patentansøgning (OPI) nr. 151263/80 (udtrykket "OPI” som her benyttet betyder 30 en"publiceret ikke nyhedsundersøgt japansk patentansøgning” )) .

Mere specielt kan den uomsatte mærkede eller umærkede specifikke lectin isoleres ved til reaktionsvæsken at sætte en passende mængde af et udfældnings-35 middel for en glycoprotein-bundet specifik lectin såsom polyethylenglycol, mættet ammoniumsulfat eller Rivanol (acrinol); efterfulgt af centrifugering eller andre midler til fjernelse af den TAG-bundne mærkede eller 7

DK 154859 B

umærkede specifikke lectin. Der kan benyttes egnede betingelser for centrifugeringen afhængigt af det anvendte udfældningsmiddelj hvis der som udfældningsmiddel er benyttet polyethylenglycol udføres centrifugeringen 5 fortrinsvis ved ca. 1000 G i 30 til 60 minutter.

Den TAG-bundne mærkede eller umærkede specifikke lectin kan let skilles fra den uomsatte mærkede eller umærkede specifikke lectin ved anvendelse af forskellen i diffusionshastighed på en agargel, agarosegel eller 10 polyacrylamidgel. Især vil den TAG-bundne specifikke lectin, hvis reaktionsblandingen anbringes på en gel, ikke diffundere men forblive på gelens overflade, medens den uomsatte specifikke lectin diffunderer gennem gelen.

Den TAG-bundne specifikke lectin kan følgelig let skil-15 les fra den uomsatte specifikke lectin.

Den ovennævnte gel kan fremstilles ved en konventionel metode. F.eks. sættes en passende mængde agar, agarose eller polyacrylamid til et fortyndingsmiddel såsom destilleret vand eller fortyndet citronsyre eller 20 tris-saltsyre-pufferopløsning (pH = ca. 7,5), og blandingen opvarmes ved 60 til 80°C under forsigtig omrøring til dannelse af en opløsning, der anbringes i en passende beholder, såsom et reagensglas,og henstilles til afkøling, indtil opløsningen koagulerer til en gel.

25 Gelens koncentration vælges i afhængighed af størrelsen (f.eks. molekylvægt, stereospecifik struktur) af den uomsatte lectin ifølge opfindelsen og den TAG-bundne mærkede specifikke lectin. Gelen har sædvanligvis en koncentration fra 0,4 til 2,0 vægt%, fortrinsvis fra 30 0,7 til 1,0 vægt%. Om nødvendigt eller ønsket kan gelen indeholde et konserveringsmiddel. Den således fremstillede gel kan have en flad overflade, men en konkav overflade foretrækkes, da det resulterende kompleks ikke klæber til beholderens indervæg.

35 Legemsvæskens TAG-niveau kan beregnes ud fra mængden af den isolerede TAG-bundne mærkede eller umærkede specifikke lectin eller uomsatte mærkede eller umærkede specifikke lectin som målt ved en konventionel

DK 154859B

8 metode.

Der kan benyttes forskellige metoder til at måle den mængde af den umærkede specifikke lectin, der ikke er blevet forbrugt ved omsætningen. Fortrinsvis sættes et 5 stof, der reagerer specifikt med den specifikke lectin under agglutinering eller udfældning,til reaktionsvæsken, og den resulterende specifikke ændring observeres visuelt eller måles ved fotometrisk analyse. Nærmere forklaret fortyndes reaktio'nsvæsken serievis ved dob-10 beltfortyndingsmetoden med et fortyndingsmiddel såsom 0,15 M phosphatpuffer eller fysiologisk saltopløsning, og en forudbestemt mængde af fortyndingen anbringes på et V-formet eller U-formet objektglas eller i et lille reagensglas eller lignende,og et stof, der bevir-15 ker en specifik agglutineringsreaktion med den specifikke lectin,tilsættes; blandingen omrøres og man lader den henstå ved en temperatur på under 45°C, for trinsvis mellem 4 og 40°C, i en periode på 30 minutter eller længere, fortrinsvis mellem 60 og 90 minutter.

20 Den sluttelige eller maksimale fortyndingsgrad,ved hvilken der finder agglutinering sted,bestemmes. Den maksimale fortyndingsgrad er defineret som agglutineringsværdien. Alle specifikke lectiner, der kan benyttes ifølge foreliggende opfindelse,har i det væsentlige 25 samme agglutineringsværdi.

Et eksempel på et stof, der bevirker en specifik agglutineringsreaktion med den specifikke lectin, er en glycoprotein med AG- eller L-fucose-endegruppe.

Til den AG-bindende lectin kan benyttes Sephadex, 30 kautsjuk, glasperler eller lignende overtrukket med glycoproteiner med AG-endegruppe, såsom cytolipiner K og R fra human erythrocytmembran, sulfateret glycopep-tid type A fra svine-maveslimhinde, asialoderivat af aktivt stof type A fra menneskeblod, mycin type A+ fra 35 den submandibulære membran fra svin, asialo GM^ og

Follisman antigent stof. Til den L-fucose-bindende lectin benyttes Sephadex, kautsjuk, glasperler eller lignende overtrukket med glycoproteiner med L-fucose-ende-

DK 154859 B

9 a gruppe såsom aktivt stof type Le og Le fra menneskeblod, sulfateret glycoprotein type A fra svine-maveslimhinde, sulfateret glycoprotein aktivt stof type H(0) fra svine-maveslimhinde og erythrocyt H^-antigen fra menne-5 ske.

Når den mærkede specifikke lectin benyttes, kan TAG-niveauet måles ved en egnet metode, der udvælges alt efter mærkningsmidlet for den specifikke lectin.

Hvis f.eks. den specifikke lectin er mærket med et 10 enzym, kan TAG-niveauet bestemmes ved at måle den enzymatiske aktivitet under anvendelse af et passende enzymsubstrat for et kolorimetrisk analysesystem eller fluorescensanalysesystem. Hvis mærkningsmidlet er et fluorescerende materiale, kan TAG-niveauet bestemmes 15 ved at måle fluorescensintensiteten, og hvis mærkningsmidlet er et radioaktivt materiale, kan TAG-niveauet bestemmes ved at måle radioaktiviteten. På denne måde kan mængden af den TAG-bundne mærkede specifikke lectin eller den uomsatte mærkede·specifikke lectin måles.

20 En særlig bekvem metode til at udføre den oven for beskrevne bestemmelsesproces ifølge opfindelsen er at anvende et analyseudstyr -til bestemmelse af TAG-niveauet af legemsvæsker, såsom blodplasma eller serum.

For opfindelsens formål benyttes et udstyr indeholden-25 de den specifikke lectin, der kan bindes specifikt til TAG. Der kan til reagenset bestående af den specifikke lectin sættes en stabilisator og/eller et konserveringsmiddel såsom glycerol eller okseserumprotein. Reagenset bestående af specifik lectin kan være et lyophiliseret 30 produkt, eller udstyret kan indeholde et vandopløseligt eller med vand blandbart opløsningsmiddel. Endvidere kan reagenset bestående af specifik lectin indeholde en pufferopløsning til opretholdelse af dets pH-værdi efter rekonstitution og/eller et konserverings-35 middel og/eller et stabiliseringsmiddel til forhindring af for tidlig nedbrydning af prøven. Pufferopløsningen er ikke væsentlig for udstyret, men hvis den benyttes, indstilles denspH-værdi fortrinsvis på fra 6 til 7,8.

DK 154859 B

10

Rekonstitutionsmidlet indeholder fortrinsvis vand, men en del af eller al vandet kan erstattes med et med vand blandbart opløsningsmiddel. Med vand blandbare opløsningsmidler er velkendte for fagmanden? egnede eksempler 5 derpå omfatter glycerol, alkoholer, glycoler og glycol-ethere, men de er ikke på nogen måde begrænset hertil.

Mængden af den specifikke lectin, der er indeholdt i opløsningsmidlet eller fortyndingsmidlet,vælges på passende måde alt efter agglutineringsværdien (der er 10 defineret som den endelige eller maksimale fortynding af serievis dobbeltfortyndede prøver), typen af mærkningsmiddel eller af det stof, der skal bestemmes osv.. Sædvanligvis indeholdes den specifikke lectin i en mængde fra ca. 0,01 til ca. 100 yg/ml, fortrinsvis fra 0,03 15 til 40 yg/ml. Den ovennævnte opløsning af den mærkede eller umærkede specifikke lectin kan fortyndes yderligere.

Formålet med foreliggende opfindelse kan opnås med yderligere fordel ved hjælp af en konkurrence-pro-20 ces eller en sandwich-proces som nedenfor beskrevet.

(1) Legemsvæske-TAG, der skal måles,(i det følgende undertiden betegnet som det materiale, der skal måles) og en given mængde uopløseliggjort TAG eller uopløselig-gjort TAG-lignende materiale omsættes konkurrerende 25 med den specifikke lectin, der er blevet mærket med et mærkningsmiddel (i det følgende betegnet mærket specifik lectin), og det uopløseliggjorte TAG eller uopløselig-gjorte TAG-lignende materiale, der er bundet til den mærkede specifikke lectin, skilles fra den ubundne 30 mærkede specifikke lectin, og aktiviteten af mærkningsmidlet på hvert materiale måles til bestemmelse af TAG-niveauet.

(2) Det materiale, der skal bestemmes,og en given mængde TAG eller TAG-lignende materiale, der er blevet 35 mærket méd et mærkningsmiddel (i det følgende betegnet henholdsvis mærket TAG og mærket TAG-lignende materiale) omsættes konkurrerende med en given mængde af den specifikke lectin eller uopløseliggjorte specifikke lectin,

DK 154859 B

11 og det mærkede TAG eller mærkede TAG-lignende materiale, der er bundet til den specifikke lectin eller uopløse-liggjorte specifikke lectin, skilles fra det ubundne mærkede TAG eller ubundne mærkede TAG-lignende materia-5 le, og aktiviteten af mærkningsmidlet på hvert materiale måles til bestemmelse af TAG-niveauet.

(3) Det materiale, der skal bestemmes, omsættes med den uopløseliggjorte specifikke lectin til dannelse af et kompleks af TAG og den uopløseliggjorte specifik-10 ke lectin, og komplekset omsættes med en given mængde af den mærkede specifikke lectin, og det til den mærkede specifikke lectin bundne kompleks skilles fra den ubundne mærkede specifikke lectin, og aktiviteten af mærkningsmidlet på hvert materiale måles til bestemmelse 15 af TAG-niveauet.

I foreliggende beskrivelse betegner udtrykket "TAG-lignende materiale" et kulhydratderivat med AG-eller L-fucose-endegruppe. Eksempler herpå omfatter kulhydrater ned- AG-endegruppe såsom sulfateret glycopep-20 tid type A fra svine-maveslimhinde, cytolipiner K og R fra human erythrocytmembran, asialoderivat af aktivt stof type A fra menneskeblod, mycin type A+ fra submandi-bulær membran fra svin, asialo GM^ og Follisman antigent stof eller kulhydratderivater med L-fucose-endegruppe cL b 25 såsom aktivt stof type Le og Le fra menneskeblod, sulfateret glycoprotein type A fra svine-maveslimhinde, sulfateret glycoprotein aktivt stof type H(O) fra svine-maveslimhinde og antigen fra human erythrocyt.

Det uopløseliggjorte TAG, uopløseliggjorte TAG-30 lignende materiale og den uopløseliggjorte specifikke lectin kan fremstilles ved kemisk eller fysisk omsætning mellem TAG, TAG-lignende materiale eller den specifikke lectin og en uopløselig bærer. Som eksempler på en sådan uopløselig bærer kan nævnes cellulosepulver, 35 Sephadex, Sepharose, polystyren, filtrerpapir, carboxy-methylcellulose, ionbytterharpiks, dextran, plastfilm, plastrør, nylon, glaskugler, silke, polyamin-methylvi-nylether-maleinsyrecopolymer, aminosyrecopolymer, ethy-

DK 154859 B

12 len-maleinsyrecopolymer osv.. Uopløseliggørelsen kan udføres ved en proces,hvorved der dannes en covalent binding [dvs. en diazoproces, en peptidproces (f.eks. en syreamid-afledt proces, en carboxychloridharpiks-pro-5 ces, en carbodiimidharpiksproces, en maleinsyreanhydridafledt proces, en isocyanat-afledt proces, en cyanbromid-aktiveret polysaccharidproces, en cellulosecarbonat-af-ledt proces, en proces, hvorved der benyttes et kondensationsmiddel, osv.), en alkyleringsproces, en bærer-10 bindingsproces, hvorved der benyttes et tværbindingsmiddel såsom glutaraldehyd, hexamethylenisocyanat osv., en bærer-bindingsproces ifølge Ugi-reaktion og lignende]; en ionbindingsproces, hvorved der benyttes en sådan bærer som ionbytterharpiks; og en fysisk adsorptions-15 proces, hvorved der benyttes porøst glas såsom glaskugler som bærer. Af disse foretrækkes den cyanbromidaktiverede polysaccharidproces og den bærer-bindingsproces, hvorved der benyttes et tværbindingsmiddel,indenfor den proces, hvorved der dannes en covalent binding. Ifølge den cyan-20 bromid-aktiverede polysaccharidproces kan uopløseliggjort TAG, uopløseliggjort TAG-lignende materiale eller uopløseliggjort specifik lectin opnås ved at omsætte TAG osv. med en 10 til 1000 gange så stor mængde af en cyanbromid-aktiveret bærer i et egnet opløsningsmiddel 25 ved 0 til 40°C, fortrinsvis ved 20 til 30°C, i 2 til 4 timer.

Det uopløseliggjorte TAG, uopløseliggjorte TAG-lignende materiale og den uopløseliggjorte specifikke lectin kan også fremstilles ved en strålingsindueeret 30 polymerisationsproces. Det vil sige, der fremstilles en vandig dispersion af en polymeriserbar monomer indeholdende TAG, TAG-lignende materiale eller den specifikke lectin,og dispersionen bestråles med lys eller ioniserende stråling til polymerisation af den monomere 35 og dannelse af en polymer matrix af TAG, TAG-lignende materiale eller den specifikke lectin. En sådan vandig dispersion fremstilles ved at dispergere en hydrofob polymeriserbar monomer (A) i en 0,1 til 5 vægt% van-

DK 154859 B

13 dig opløsning af en vandopløselig polymer (B), disper-gere hydrofil polymeriserbar monomer (C) i en vandig opløsning, eller dispergere en blanding af den hydro-•fobe polymeriserbare monomere (A) med en hydrofil poly-5 meriserbarmonomer (C) i en 3 til 20 vægt% vandig saltopløsning, eller dispergere den hydrofobe polymeriserbare monomere (A) i en vandig opløsning indeholdende 0,01 til 5 vægt% af et overfladeaktivt middel (D). Når den således fremstillede dispersion bestråles med lys 10 eller ioniserende stråling, polymeriseres den polymeriserbare monomere, der er til stede som en dispers fase, til dannelse af en polymer matrix af TAG, TAG-lig-nende materiale eller den specifikke lectin. Om Ønsket kan matrixen formes til et ark eller til partikler på 15 passende måde.

Som specielle eksempler på den hydrofobe polymeriserbare monomere (A) skal nævnes glycidylmethacrylat, ethylenglycoldimethacrylat, diethylenglycoldimethacrylat, triethylenglycoldimethacrylat, trimethylolpropantri-20 methacrylat, polyethylenglycol-200-dimethacrylat, di-propylenglycoldimethacrylat, 1,4-butylenglycoldimethacrylat, 1,6-hexanglycoldimethacrylat, methoxydiethylenglycoldimethacrylat, methylmethacrylat, ethylmethacrylat, butylmethacrylat og de tilsvarende acrylater deraf.

25 I almindelighed kan en hvilken som helst i vand uopløselig monomer , der kan polymeriseres ved stråling med lys eller anden stråling, benyttes. Som specielle eksempler på den hydrofile polymeriserbare monomere (C) kan nævnes 2-hydroxyethylmethacrylat, methoxytetra-30 ethylenglycolmethacrylat, methoxypolyethylenglycol-400-methacrylat, methoxypolyethylenglyco1-1000-methacrylat, polyethylenglycol-400-dimethacrylat, polyethylenglycol-600-dimethacrylat, methacrylsyre, acrylamid, N-vinyl-2-pyrrolidon osv. og de tilsvarende acrylater deraf. I al-35 mindelighed kan en hvilken som helst vandopløselig monomer, der kan polymeriseres ved stråling med lys eller anden stråling, benyttes.

Som specielle eksempler på den vandopløselige

DK 154859 B

14 polymere (B) kan nævnes polyvinylpyrrolidon, polymeth-acrylsyre, polyacrylsyre, polyvinylalkohol, hydroxypro-pylcellulose, gummi arabicum osv..

Som specielle eksempler på det overfladeaktive 5 middel (D) skal nævnes natriumlaurylsulfat, kaliumoleat, natriumoleat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat, sorbitanmonooleat, propylenglycolmonolaurat, oliesyre og natriumdodecylbenzensulfonat. Imidlertid kan der benyttes et vilkårligt overfladeaktivt middel, som kan 10 tilbageholde den polymeriserbare monomere eller TAG, TAG-lignende materiale eller den specifikke lectin opløst i den polymeriserbare monomere i sin micel-struktur.

TAG mærket med radioaktivt materiale, TAG-lignenr 15 de materiale mærket med radioaktivt materiale og specifik lectin mærket med radioaktivt materiale kan fremstilles ved at indføre et radioaktivt iodatom såsom 125 131 I eller I i TAG, TAG-lignende materiale eller specifik lectin. Indføring af radioaktivt iod udføres 20 ved almindelige ioderingsprocesser, f.eks. en oxidativ ioderingsproces under anvendelse af chloramin, T [Nature, 194, s. 495 (1962); Biochem. J., 89^, s. 114 (1963)].

Herved udføres sådan iodering i et egnet opløsningsmiddel [f.eks. en pufferopløsning med pH 6-8, fortrins-25 vis 0,2 M phosphatpufferopløsning (pH 7)] ved omkring stuetemperatur i 5 til 60 sekunder i nærværelse af chloramin T. Radioaktivt iod og chloramin T benyttes fortrinsvis i mængder på henholdsvis 1 til 5 mCi og 10 til 100 nanomol pr. nanomol tyrosin indeholdt i TAG, 30 TAG-lignende materiale eller specifik lectin. Det således mærkede TAG, TAG-lignende materiale eller specifik lectin isoleres og fraskilles på sædvanlig måde og opbevares om nødvendigt i lyophiliseret form.

Enzym-mærket TAG, enzym-mærket TAG-lignende mate-35 riale og enzym-mærket specifik lectin kan fremstilles ved en kendt koblingsproces [f.eks. B. F Erlanger et al., Acta. Endocrinol. Suppl., 168, 206 (1972) og M.H.

Karol et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 5T_, 713 (1967)].

DK 154859 B

15

Det vil sige TAG, TAG-lignende materiale eller specifik lectin omsættes med et enzym i pufferopløsning med pH

4-6 (f.eks. 1 mM acetatpufferopløsning (pH 4,4)) ved stuetemperatur i 2 til 5 timer i nærværelse af et 5 oxidationsmiddel såsom NalO^ efterfulgt af reduktion med NaBH4 eller lignende. Enzymet benyttes i en mængde på 1 til 3 mol pr. mol TAG eller lignende. Oxidationsmidlet benyttes i en mængde på 100 til 300 mol pr. mol TAG eller lignende, og det reducerende middel benyttes 10 i en mængde på 1 til 2 mol.

Med fluorescerende materiale mærket TAG, med fluorescerende materiale mærket TAG-lignende materiale og med fluorescerende materiale mærket specifik lectin fremstilles ved at omsætte TAG, TAG-lignende materiale 15 eller specifik lectin med et kendt fluorescerende materiale såsom fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller tetra-methylrhodaminisothiocyanat (RITC) i vand eller fysiologisk saltopløsning med pH 6-8 ved 0°C til stuetemperatur, fortrinsvis ved stuetemperatur, i 1/2 til 3 ti-20 mer (fluorescerende-antistof-proces; Ikagaku Jikkenho Koza, No. 4, s. 263-270). Det fluorescerende materiale benyttes fortrinsvis i en mængde på 1/50 af TAG eller lignende.

Bestemmelsesprocessen ifølge opfindelsen i form 25 af konkurrenceprocessen eller sandwichprocessen vil blive beskrevet nedenfor.

Ved de to processer udføres reaktionerne i et egnet opløsningsmiddel ved 45°C eller lavere, fortrinsvis ved 4 til 40°C, og mest foretrukket ved 20 30 til 40°C. Som opløsningsmiddel foretrækkes sådanne, som ikke indvirker ugunstigt på reaktionen mellem TAG eller TAG-lignende materiale med specifik lectin,såsom vand, fysiologisk saltopløsning og pufferopløsninger med pH 6 til 7,8 (f.eks. 0,1 til 0,3 M tris-saltsyre-35 pufferopløsning (pH ca. 7,5), 0,1 M phosphatpufferopløsning (pH ca. 7,4) osv.). Reaktionerne udføres i 5 til 40 timer, fortrinsvis 15 til 25 timer.

Det resulterende TAG (eller TAG-lignende mate-

DK 154859 B

16 riale) bundet til den specifikke lectin kan skilles fra den ubundne specifikke lectin eller ubundet TAG (eller TAG-lignende materiale) på kendt måde. Når der benyttes uopløseliggjort TAG (eller TAG-lignende materiale) eller 5 uopløseliggjort specifik lectin, skilles den faste fase simpelthen fra den flydende fase ved centrifugering, filtrering eller dekantering. I andre tilfælde kan benyttes chromatografi, elektroforese, udsaltning, fraktionering, dialyse, gelfiltrering, adsorption eller 10 kombinationer deraf, eller der kan anvendes en adskillelsesproces, hvorved der benyttes agargel, agarosegel eller polyacrylamidgel,som beskrevet i japansk patentansøgning (OPI) nr. 151263/80.

Aktiviteten af mærkningsmidlet for det således 15 fraskilte produkt kan måles ved en passende metode valgt blandt de allerede beskrevne teknikker alt efter arten af mærkningsmidlet. Den målte aktivitet kan benyttes til bestemmelse af prøvens TAG-niveau.

Som beskrevet ovenfor gør den foreliggende 20 opfindelse det muligt at bestemme TAG-niveauet i legemsvæske på fordelagtig måde. Det bestemte TAG-niveau kan benyttes til at diagnosticere cancer på et vilkårligt trin, og opfindelsen er særlig nyttig til konstatering af cancer på et tidligt trin. Endvidere bestemmes ved 25 foreliggende fremgangsmåde glycobindingen, således at fremgangsmåden i sammenligning med de sædvanlige fremgangsmåder, hvoraf de fleste benytter antistoffer til måling af proteindelen (α^-foetoprotein, CEA osv.), kan benyttes til at diagnosticere et bredere område af 30 cancersygdomme såsom ondartet lymphadenosis, ondartet lymphoma, chorion-epithelioma malignum, levercancer, galdeblærecancer, pancreascancer, lungecancer, galdegangscancer, skjoldbruskkirtelcancer, multipel myeloma, mavecancer, brystcancer, carcinoma i tyktarmen, rectal-35 cancer, ovariecancer, cancer i munden, på tungen, strubecancer, prostatacancer, liposarcoma, ondartet melanoma, uteruscancer og primær sarcoma i maven. Fremgangsmåden er specifik alt efter den benyttede specifikke lec-

DK 154859 B

17 tin. Hvis der benyttes AG-bindende lectin er fremgangsmåden ifølge opfindelsen særlig nyttig ved diagnosticering af cancersygdomme, der stammer fra udifferentiere-de celler,såsom ondartet lymphadenosis, ondartet lympho-5 ma og chorion-epithelioma malignum. Endvidere er fremgangsmåden til diagnosticering af cancersygdomme under anvendelse af AG-bindende lectin eller L-fucose-binden-de lectin ifølge opfindelsen fordelagtig ved, at denne fremgangsmåde viser en betydelig nedsat krydsreaktivitet 10 med andre sygdomme end cancer, f.eks. hepatisk induration, hepatitis, mavesår, diabetes mellitus, colitis osv., i sanmenligning med konventionelle diagnosemetoder for cancersygdomme under anvendelse af bestemmelse af a^-foetoprotein, CEA og lignende. De konventionelle 15 diagnosemetoder giver meget ofte positive resultater for hepatiske sygdomme især hepatisk induration, akut og kronisk hepatitis og lignende og bevirker, at cancerdiagnoser i vid udstrækning bliver forvekslet med andre diagnoser. I modsætning hertil viser diagnosemetoden 20 ifølge foreliggende opfindelse en lav krydsreaktivitet med hepatiske sygdomme og giver således nøjagtige cancerdiagnoser.

Endvidere muliggør den foreliggende fremgangsmåde at bestemme kulhydrater og kulhydratderivater 25 (f.eks. glycopeptider, glycoproteiner, glycolipider, glycoterpener og glycosteroider) med AG- eller L-fucose-endegruppe.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere under henvisning til 30 de nedenstående eksempler.

Eksempel 1 (i) Aktivering af peroxidase.

5 mg peroxidase (fra peberrod) blev opløst i 1 ml af en 0,3 M vandig natriumhydrogencarbonatopløsning.

35 Til den resulterende opløsning sattes 0,1 ml af en 0,1 M ethanolisk fluordinitrobenzenopløsning og efter forsigtig omrøring i 1 time ved stuetemperatur tilsattes 0,1

DK 154859 B

18 ml af en 0,06 M NalO^-opløsning efterfulgt af forsigtig omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur. Til reaktionsblandingen sattes yderligere 1 ml 0,16 M ethylen-glycol, og den resulterende opløsning blev omrørt for-5 sigtigt ved stuetemperatur i 1 time. Derpå blev opløsningen dialyseret mod 0,01 M kulsyre-natriumhydrogen-carbonatpufferopløsning (pH 9,5) ved 4°C en hel dag og nat.

(ii) Fremgangsmåde til mærkning af lectin med peroxidase.

10 (Dolichos-bønne lectin-peroxidase): 5 mg Dolichos-bønnelectin blev opløst i 3 ml af den ifølge (i) opnåede aktiverede peroxidase og omrørt forsigtigt ved stuetemperatur i 2 til 3 timer til opnåelse af reaktion. Der blev tilsat 5 ml NaBH^ 15 og omsat ved 4°C i 3 timer. Derefter blev denne opløsning dialyseret mod en 0,1 M tris-saltsyrepufferopløsning (pH 7,4) il dag og 1 nat og underkastet Sephadex G 150 gelsøjlechromatografi (elueringsmiddel: 0,1 M tris-saltsyrepufferopløsning, pH 7,4) for udførelse 20 af gelfiltrering. Hver fraktion blev målt ved OD2gQ og OD403' fiktioner med toppe for 0D2go °9 OD403 ^lev opsamlet.

(iii) Fremgangsmåde til mærkning af lectin med peroxidase .

25 (Lotus tetragonolobus lectin-peroxidase): 5 mg Lotus tetragonolobus lectin blev opløst i 3 ml af den ifølge (i) opnåede aktiverede peroxidase, og opløsningen blev omrørt forsigtigt ved stuetemperatur i 2 til 3 timer. Der blev sat 5 mg NaBH^ til opløs-30 ningen, og man lod denne henstå ved 4°C i 3 timer.

Reaktionsvæsken blev dialyseret mod en 0,1 M tris-saltsyrepuf feropløsning (pH 7,4), en hel dag og en hel nat og underkastet gelfiltrering ved hjælp af Sephadex G 150 gelsøjlechromatografi (elueringsmiddel: 0,1 M 35 tris-saltsyrepufferopløsning, pH 7,4). Hver fraktion blev målt ved 0D2gQ og OD^^, og fraktioner med toppe for 0D2sq °9 odao3 ^ev opsamlet.

DK 154859 B

19 (iv) Fremgangsmåde til fremstilling af uopløseliggjort lectin.

15 g CNBr-aktiveret agarose blev suspenderet i 3 liter 0,001 N saltsyre og, efter henstand i 30 mi-5 nutter, vasket med 1 liter 0,1 M natriumhydrogencar-bonat (pH 8,5) på et glasfilter. Der opnåedes herved en total mængde på ca. 50 ml aktiveret agarose. Denne blev suspenderet i 200 ml 0,1 M natriumhydrogencarbo-nat (pH 8,5),og der blev tilsat 5 ml af en 0,01 M 10 phosphatpufferopløsning (pH 7,7) indeholdende 50 mg

Dolichos-bønnelectin efterfulgt af omsætning ved stuetemperatur i 2 timer med lejlighedsvis omrøring. Efter afslutning af omsætningen blev reaktionsopløsningen vasket på et glasfilter, og reaktionsproduktet blev 15 sat til 200 ml af en 1 M monoethanolaminopløsning (pH 8,5) og omsat i 2 timer ved stuetemperatur. Derpå blev reaktionsproduktet vasket på et glasfilter.Ved ovenstående fremgangsmåder blev vaskningen udført med 1 liter 0,1 M eddikesyrepufferopløsning (indeholdende 20 0,5 M NaCl) og 1 liter 0,1 M borsyrepufferopløsning (indeholdende 0,5 M NaCl) skiftevis tre gange.

(v) Fremgangsmåde til fremstilling af uopløseliggjort lectin.

15 g CNBr-aktiveret agarose blev suspenderet 25 i 3 liter 0,001 N saltsyre og, efter henstand i 30 minutter, vasket med 1 liter 0,1 M natriumhydrogencarbo-nat (pH 8,5) på et glasfilter. Der opnåedes herved en total mængde på ca. 50 ml aktiveret agarose. Denne blev suspenderet i 200 ml 0,1 M natriumhydrogencarbonat 30 (pH 8,5), og der blev tilsat 5 ml 0,01 M phosphatpuffer-opløsning (pH 7,7) indeholdende 50 mg Lotus tetragono-lobus lectin efterfulgt af omsætning ved stuetemperatur i 2 timer under lejlighedsvis omrøring. Efter afslutning af omsætningen blev reaktionsopløsningen vasket 35 på et glasfilter, og reaktionsopløsningen blev sat til 200 ml 1 M monoethanolaminopløsning (pH 8,5) og omsat i 2 timer ved stuetemperatur. Derefter blev reaktionsproduktet vasket på et glasfilter. Ved ovenstående frem-

DK 154859 B

20 gangsmåder blev vaskningen udført med 1 liter 0,1 M eddikesyrepuf feropløsning (indeholdende 0,5 M NaCl) og 1 liter 0,1 M borsyrepufferopløsning (indeholdende 0,5 M NaCl) skiftevis tre gange.

5 (vi) Fremgangsmåde til fremstilling af TAG-lignende materiale.

1 g sulfateret glycoprotein fra svine-mave-slimhinde (i det følgende forkortet til PGM) blev suspenderet i 100 ml af en 0,05 M phosphatpufferopløsning 10 (pH 7,0), og der blev dråbevis tilsat en 1 N vandig NaOH-oplØsning til indstilling af pH-værdien på 11.

Efter omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur blev blandingen centrifugeret i 10 minutter ved 3000 omdr./ min., og supernatanten blev indstillet på pH 7,0 med 15 IN HC1 efterfulgt af fornyet centrifugering i 10 minutter ved 3000 omdr./min.. Supernatanten blev dialyseret mod 10 liter af en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) natten over til opnåelse af renset TAG-lignende materiale (rent PGM).

20 (vii) Fremgangsmåde til fremstilling af mærket TAG-lig-nende materiale.

(a) Mærkning med et enzym (PGM-peroxidase): 4 mg peroxidase fra peberrod (HRPO) (0,1 yM) blev opløst i 1 ml destilleret vand. Hertil sattes 0,2 25 ml 0,1 M NalO^ og, efter omrøring ved stuetemperatur i 20 minutter, blev opløsningen dialyseret mod 1 mM eddikesyr epuf feropløsning (pH 4,4) en hel dag og nat for fjernelse af uomsat NalO^. Til denne dialyserede reaktionsopløsning blev sat ca. 60 yl 0,2 M hydrogencarbo-30 natpufferopløsning (pH 9,5) til indstilling af opløsningens pH-værdi på 9,0. Derpå blev der til denne opløsning straks sat 0,6 ml PGM (10 mg/ml) opløst i en 0,01 M hydrogencarbonatpufferopløsning (pH 9,5), der blev blandet i 2 timer ved stuetemperatur, og der 35 blev tilsat 0,1 ml af en 4 mg/ml NaBH^-opløsning i destilleret vand efterfulgt af henstand ved 4°C i 2 timer. Denne opløsning blev yderligere dialyseret mod en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7,2) en hel dag

DK 154859 B

21 og en hel nat og renset under anvendelse af Sephadex G-200 (1,5 x 150 cm) til opnåelse af ren PGM-peroxidase (PGM-POX). Geleffluenten blev opsamlet i 5 ml portioner, hvis absorption blev målt ved og OD^q^.

5 (b) Mærkning med isotop (-^^I-PGM) .

125 PGM blev mærket med I ifølge en oxidativ ioderingsproces under anvendelse af chloramin T.

10 ug PGM blev opløst i 50 yl af en 0,2 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0), og der blev tilsat 10 10 ylaf lmCi Na^2^I (bærerfri; New England Nuclear Co.) og 50 ug/100 yl chloramin T-opløsning i en 0,2 M phospha tpuf feropløsning, og efter blanding ved stuetemperatur i 30 sekunder blev der tilsat 100 yg/100 yl

Na9S«0r-opløsning i en 0,2 M phosphatpufferopløsning.

j_25 15 Derpå tilsattes 1 mg Na I og der blev blandet. Det 125 således opnåede I-PGM blev renset på Sephadex G-50 125 (1 x 30 cm). Det således fremstillede I-PGM havde en radioaktivitet på ca. 1 til 2 yCi/yg.

(viii) Bestemmelsesfremgangsmådei 125 20 0,1 ml I-PGM (100 ng 0,17 yCi svarende til 5 ca. 2,4 x 10 cpm) opnået ifølge (vii), 0,1 ml af det rene standard PGM (0,1 yg/ml, 0,2 yg/ml, 0,5 yg/ml, 1 yg/ml, 2,5 yg/ml, 5 ym/ml og 10 yg/ml) opnået ifølge (vi), 0,1 ml Dolichos-bønnelectin (10 yg/ml), og 0,2 ml 25 af en 0,05 M phosphorsyrepufferopløsning (0,15 M NaCl, 0,1% BSA : 0,02% NaN^) blev blandet i et 10 x 75 mm glasrør og inkuberet ved 25UC i 1 time. Efter afslutning af reaktionen sattes 0,1 ml anti-DBA-kaninserum (DBA = Dolichos-bønnelectin, fremstillet af E.Y. Labo-30 ratory; 10 gange fortyndet opløsning) til det til DBA bundne 125I-PGM og til DBA ikke bundne 125I-PGM, og efter inkubering ved 25°C i 1 time blev reaktionsopløsningen centrifugeret ved 4°C i 30 minutter ved 125 3000 omdr./min.. Radioaktiviteten af bundfaldet ( I-35 PGM bundet til DBA) blev talt til fremstilling af en standardkurve (fig. 1 ). Som det fremgår af de således opnåede resultater var procenten af bundet materiale (B/T = bundet/totalt) sædvanligvis 20 til 25%, og der

DK 154859 B

22 opnåedes 50% hæmning ved en koncentration på 0,06 yg/ml.

(ix) Bestemmelsesfremgangsmåde: 125 0,1 ml I-PGM (100 ng 0,17 yCi svarende til 5 ca. 2,4 x 10 cpm) opnået ifølge (vii), 0,1 ml af det 5 rene standard PGM (0,1 yg/ml, 0,2 yg/ml, 0,5 yg/ml, 1 yg/ml, 2,5 yg/ml, 5 yg/ml og 10 yg/ml) opnået ifølge (vi), 0,1 ml Lotus tetragonolobuslectin (10 yg/ml) og 0,2 ml af en 0,05 M phosphorsyrepufferopløsning (0,15 M NaCl, 0,1% BSA : 0,02% NaN^) blev blandet i 10 et 10 x 75 mm glasrør og inkuberet ved 25°C i 1 time.

Efter afslutning af reaktionen sattes 0,1 ml anti-Lotus tetragonolobuslectin-kaninserum (fremstillet af E.Y.

Laboratory; 10 gange fortyndet opløsning) til det til 125

Lotus tetragonolobuslectin bundne I-PGM og det 125 15 til Lotus tetragonolobuslectin ikke bundne I-PGM, og efter inkubering ved 25°C i 1 time blev reaktionsopløsningen centrifugeret ved 4°C i 30 minutter ved 125 3000 omdr./min.. Radioaktiviteten af bundfaldet ( I-PGM bundet til Lotus tetragonolobuslectin) blev talt 20 til fremstilling af en standardkurve (fig. 2). Som det fremgår af de således opnåede resultater var procenten af bundet materiale (B/T) sædvanligvis 20 til 25%, og der opnåedes 50% hæmning ved en koncentration på 0,6 yg/ml.

25 (x) Fremstilling af uopløseliggjort TAG-lignende mate riale.

(Fremstilling af PGM-uopløseliggjorte skiver):

Et overskud af PGM blev sat til 100 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) til fremstil-30 ling af en suspension. Hertil blev sat en 0,01 N NaOH-opløsning til indstilling af suspensionens pH-værdi på ca. 11 efterfulgt af centrifugering ved 3000 omdr./ min. i 20 minutter til opnåelse af supernatanten. Til denne supernatant sattes dråbevis 0,03 N HC1 til ind-35 stilling af pH-værdien på 7,0, og der centrifugeredes atter ved 3000 omdr./min. i 20 minutter. Supernatanten blev dialyseret mod en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) til fremstilling af en PGM-opløsning. Hvad

DK 154859 B

23 angår opløsningens kulhydratindhold og proteinindhold blev hexoseindholdet målt til 5 til 7 mg/ml ifølge en phenol-svovlsyre-metode under anvendelse af glucose som standard, og proteinindholdet blev målt til at være 5 1 til 2 mg/ml under anvendelse af BSA som standard« PGM-Opløsningen blev underkastet nedenstående strålingsinducerede polymerisation.

Den stråling-inducerede polymerisation blev udført som følger: Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) (be-10 nyttet som monomer) blev blandet med den ovenfor beskrevne PGM-opløsning i et blandingsforhold på 33:67, og den resulterende blanding blev anbragt i et 1 cm x 15 til 20 cm glasrør og hurtigt lyophiliseret til -70°C

g eller derunder. Derefter blev den bestrålet med 1 x 10 15 rad gammastråler til polymerisation af den monomere.

Polymerstangen blev opskåret til skiver hver med en tykkelse på 10 ym.

(xi) Fremstilling af uopløseliggjort TAG-lignende materiale.

20 15 g (tør vægt) CNBr-aktiveret Sepharose 4B

(fremstillet af Pharmacia AB) blev suspenderet i 3 liter 0,001 N saltsyre og, efter henstand i 30 minutter, vasket med 1 liter 0,1 M natriumhydrogencarbonat (pH 8,5) på et glasfilter til opnåelse af ca. 50 ml aktiveret 25 Sepharose. Denne blev suspenderet i 200 ml 0,1 M natriumhydrogencarbonat (pH 8,5), og der blev tilsat 5 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7,7) indeholdende 50 mg PGM efterfulgt af omsætning ved stuetemperatur i 2 timer med lejlighedsvis omrøring.

30 Efter fuldendelse af reaktionen blev reaktions opløsningen vasket på et glasfilter, og reaktionsproduktet blev sat til 200 ml af en 1 M monoethanolaminopløs-ning (pH 8,5) efterfulgt af omsætning ved stuetemperatur i 2 timer. Derpå blev reaktionsblandingen vasket 35 på et glasfilter med 1 liter af en 0,1 M eddikesyrepuf feropløsning (indeholdende 0,5 M NaCl) og 1 liter af en 0,1 M borsyrepufferopløsning (indeholdende 0,5 M NaCl) skiftevis 3 gange.

DK 154859 B

24 (xii) Fremgangsmåde til fremstilling af uopløselig-gjort TAG-lignende materiale (fremstilling af PGM-kugler): 10.000 Polystyrenkugler med en diameter på 5 6,4 mm fremstillet af Precision Plastic Co., Ltd., U.S.A. blev vasket med en fortyndet opløsning af (b) syntetisk sæbe (Mamalemorr^, fremstillet af Lion Co.,

Ltd.) ved en koncentration på 1,5 ml/liter destilleret vand og derpå med destilleret vand. Kuglerne blev 10 endvidere, efter at have været neddyppet i 0,5 M vandig NaOH-opløsning i 3 dage, vasket omhyggeligt, indtil vaskevæskens pH-værdi var ca. 6. De således vaskede 10.000 kugler blev sat til 2,5 liter af en 35 (vægt/rumfang)% PGM-opløsning i 50 mM eddikesyre-15 puffer indstillet på pH 4,5 med 10 N NaOH, roteret ved ca. 10 omdr./min. i 24 timer, filtreret og vasket med 8 liter destilleret vand 4 gange. Derpå blev kuglerne sat til 2,5 liter glutaraldehydopløsning med en slut-koncentration på 1 (rumfang/rumfang)% i 50 mM natrium-20 phosphatpuffer (pH 7), roteret ved 10 omdr./min. i 2 timer, filtreret og vasket med destilleret vand på samme måde som ovenfor beskrevet. De således behandlede 10.000 kugler blev sat til 2,5 liter 1 M glycinopløs-ning i 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,0), roteret 25 ved 10 omdr./min. i 2 timer, filtreret og vasket med destilleret vand på samme måde som ovenfor angivet, efterfulgt af tørring ved 37°C natten over til opnåelse af PGM-kugler. Kuglernes overfladeareal blev bestemt ifølge Orcinol-^SO^-metoden (M. Schonenberger, et al., 30 Z. Physiol. Chem., 309, 145 (1957)) og det opnåede resultat var 2,7 ± 0,2 yg PGM/kugle.

Eksempel 2 (i) Fremstilling af forsøgsprøver:

Der blev taget 5 ml blodprøver fra patienter 35 med forskellige cancersygdomme, patienter med ikke-ondartede sygdomme og sunde personer under anvendelse af heparin (500 enheder)-behandlede sprøjter, og prø-

DK 154859 B

25 verne blev centrifugeret ved 2000 omdr./min. i 10 minutter. Der blev af supernatanten fremstillet forsøgsprøver.

(ii) Måling: 5 Til 0,1 ml af hver af de ifølge (i) fremstille de forsøgsprøver sattes et ligeså stort rumfang af 10 yg/ml Dolichos-bønnelectinperoxidase i 0,2 ml 0,15 M phosphatpufferopløsning, og der blev tilsat een PGM-uopløseliggjort skive; blandingen blev godt omrørt 10 og henstillet ved 20-37°C i 24 timer. Efter omhyggelig vask af den PGM-uopløseliggjorte skive i reaktionsvæsken blev aktiviteten af den til skiven bundne Dolichos-bønnelectinperoxidase målt fra OD4g2 ved den bestemmelsesmetode for enzymatisk aktivitet, hvorved der benyt-15 tes som sukstrat og orthophfenylendiamin som farve middel. Der blev opnået en kalibreringskurve ved at erstatte forsøgsprøverne med et standardmateriale (PGM) af varierende koncentrationer som vist i fig. 3 og 3", hvori værdierne af TAG-D er angivet henholdsvis som 20 et hexose-reduceret niveau af PGM og N-acetylgalactos-amin-reduceret niveau af PGM.

(iii) Resultater:

Resultaterne blev opnået under anvendelse af en standardkurve vist i fig. 3.

25 Som vist i fig. 4 havde alle sunde personer en TAG-D værdi på ca. 0,1 n mol/ml.

Eksempel 3 (i) Fremstilling af agarosegel:

En agarose (produkt fra Iwai Kagaku Co., Ltd.) 30 blev suspenderet i 0,01 M tris-saltsyre-pufferopløsning (pH 7,5) til opnåelse af en koncentration på 1 (vægt/ væg-6%. Suspensionen blev opvarmet ved 70-80°C til dannelse af en opløsning, hvortil der blev sat 0,01(vægt/ rumfang)! thimerosal. Opløsningen blev fordelt i reagens-35 glas i mængder på 1 ml og henstillet ved stuetemperatur til fremstilling af agarosegeler med en koncentration på 1 (væg t/væg i) %.

DK 154859 B

26 (ii) Måling:

To forsøgsprøver (hver på 200 yl) blev anbragt i to reagensglas, hvortil der blev sat 50 yl peroxida-se-mærket Dolichos-bønnelectin (3,5 yg/ml lectin i 0,1 5 M tris-saltsyre-pufferopløsning med en pH-værdi på ca.

7,5). Hver blanding blev omrørt let og henstillet ved 20-30°C i en time.

Til den ene prøve (prøve A) blev sat 250 yl 8 (vægt/rumf ang)% opløsning af polyethylenglycol (molvægt= 10 6.000) i 0,1 M tris-saltsyre-pufferopløsning, og til den anden prøve (prøve B) blev sat 250 yl 0,1 M tris-saltsyre-pufferopløsning, og begge blandinger blev omrørt forsigtigt. De to prøver blev henstillet ved 20-30°C i 30-60 minutter og centrifugeret med en sving-15 rotor ved 1000 G i 40 til 60 minutter. Supernatanten (50 yl) blev hældt ud i 2 ml fysiologisk saltopløsning, og. blandingen blev omhyggeligt omrørt. Til hver blanding blev sat 500 yl af en opløsning af peroxidase-substrat (nedenfor betegnet substratvæske), og man lod 20 blandingen henstå i et mørkt rum ved 20-30°C i 30 minutter. Substratvæsken var fremstillet ved at sætte ortho-phenylendiamin og vandig hydrogenperoxid til 0,1 M citrat-phosphat-pufferopløsning til opnåelse af slut-koncentrationer på henholdsvis 6% og 0,1%. Substrat-25 væsken holdes fortrinsvis ved 4°C, indtil den skal benyttes. Enzymreaktionen blev standset ved tilsætning af 1 ml 2 N saltsyre. Farveændringen blev vurderet ved at måle absorbansen ved 492 nm med et spektrofotometer.

Den værdi (c), der blev opnået ved at trække absorban-30 sen (a) af prøve A fra absorbansen (b) af prøve B,blev indtegnet som mængden af TAG-bundet lectin. Resultatet er vist i fig. 5, hvor cirklerne angiver de raske personer, tallene (1),og (2) angiver patienter med levercancer, og (3) angiver patienter med ondartet lymphade-35 nosis. De prøver, der har en højere værdi (c) end prøverne fra de raske personer, betyder et højere TAG-niveau i plasma og antyder, at der var dannet cancerøse celler hos værterne.

DK 154859 B

27 (iii) Sandwich-fremgangsmåde: 200 ug DBA-agarose blev sat til 100 yl af en 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0), hvori der var opløst 1 til 10 yg/ml PGM, og der blev inkuberet ved 5 25°C i 1 time under omrøring. Efter vask af reaktionsopløsningen 3 gange med en 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) blev der tilsat 6 yg DBA mærket med peroxidase opnået ifølge eksempel l-(ii) og 100 yl af en 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) efterfulgt af 10 inkubering ved 25°C i 1 time under omrøring. Efter centrifugering ved 3000 omdr./min. i 10 minutter blev bundfaldet udvundet og vasket tre gange med 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0).

60 mg orthophenylendiamin blev opløst i 20 ml 15 0,2 M Mcllevein-puffer (pH 5,8), og der blev til den resulterende opløsning sat til en slutkoncentration på 0,02 trumfang/rumfang)%, og blandingen blev omrørt til dannelse af et farvningsmiddel.

I et reagensglas blev anbragt 2 ml fysiologisk 20 saltopløsning og 500 yl af farvningsmidlet samt den vaskede kugle efterfulgt af inkubering ved stuetemperatur i 30 minutter. Derpå blev den enzymatiske reaktion standset med 1 ml 3 N HC1. Absorbanåen blev målt ved 492 nm.

De således opnåede resultater er vist i fig. 6.

25 (iv) Konkurrence-fremgangsmåde: .100 yl af en prøve (forsøgsprøve opnået ifølge eksempel 2-(i)) blev anbragt i et reagensglas, hvortil der blev sat 500 yl 0,3 M tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende sluttelig 0,22 (vægt/rumfang)% gelatine, 5 mM 30 CaCl2 og 5 mM MgC^. Een PGM-kugle (uopløseliggjort TAG-lignende materiale fremstillet ifølge eksempel l-(xii)) og 100 yl lectinperoxidase (det lyophiliserede mærkede DBA fremstillet ifølge eksempel l-(ii) ved en koncentration på 1 mg/1 af den ovenfor beskrevne tris-HCl-puffer) 35 blev sat til prøven,og efter omrøring blev blandingen inkuberet i 48 timer ved 4°C. Reaktionsblandingen blev fjernet under anvendelse af en aspirator, og kuglen blev vasket med 2 ml fysiologisk saltopløsning efterfulgt

DK 154859 B

28 af fjernelse af vaskevæsken under anvendelse af en aspirator. Denne vaskeoperation blev gentaget 3 gange.

60 ml orthophenylendiamin blev opløst i 20 ml 0,2 M Mcllevein-puffer (pH 5,8), og der blev tilsat 5 ^en resulteren<^e opløsning til en slutkoncen- tration på 0,02 (rumfang/rumfang)%, og blandingen blev omrørt til dannelse af et farvningsmiddel.

I et reagensglas blev anbragt 2 ml fysiologisk saltopløsning og 500 μΐ af farvningsmidlet samt den va-10 skede kugle efterfulgt af inkubering ved stuetemperatur i 30 minutter. Derpå blev den enzymatiske reaktion standset med 1 ml 3 N HC1. Reaktionsblandingens optiske tæthed blev målt ved 492 nm. På samme tid blev absor-bansen målt på samme måde bortset fra, at prøven blev 15 udskiftet med forskellige koncentrationer af et standardmateriale (PGM) til fremstilling af en kalibreringskurve (fig. 7). Endvidere bestemtes TAG i forsøgsprøverne opnået i eksempel 2-(i) under anvendelse af kalibreringskurven. De opnåede resultater er vist i figurerne 20 8 (a), 8(b) og 8 (c) .

Eksempel 4 (i) Konkurrence-fremgangsmåde:

En rund skive (uopløseliggjort TAG-lignende materiale fremstillet ifølge eksempel 1-(x)) blev an-25 bragt i 50 μΐ Lotus tetragonolobuslectin-bundet peroxidase (mærket lectin fremstillet ifølge eksempel l-(iii)) og 200 yl af prøven (PGM af forskellige koncentrationer), og der blev inkuberet ved 25°C i 20 timer. Derpå blev skiven vasket med PBS og anbragt i 2,0 ml af en vandig 30 saltopløsning, og der blev tilsat 0,5 ml af et peroxida-semateriale dertil efterfulgt af inkubering ved 25°C i 1 time. Derpå blev tilsat 1,0 ml 3 N saltsyre,og absor-bansen blev målt ved 492 nm. Samtidig blev absorbansen målt på samme måde bortset fra, at prøven blev udskiftet 35 med forskellige koncentrationer af et standardmateriale (PGM) til fremstilling af en kalibreringskurve (figurer 9 og 9', hvori TAG-værdierne er angivet henholdsvis som

DK 154859B

29 et hexose-reduceret niveau af PGM og et L-fucose-redu-ceret niveau af PGM).

(ii) Sandwich-fremgangsmåde: 200 yg Lotus tetragonolobuslectin-agarose blev 5 sat til 100 yl af en 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0), hvori var opløst 1 til 10 yg/ml PGM, og der blev inkuberet ved 25°C i 1 time under omrøring. Efter vask af reaktionsopløsningen 3 gange med en 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) blev der tilsat 6 yg 10 peroxidase-mærket Lotus tetragonolobus opnået ifølge eksempel l-(iii) og 100 yl af en 0,05 M phosphatpuf-feropløsning (pH 7,0) efterfulgt af inkubering ved 25°C i 1 time under omrøring. Efter centrifugering ved 3000 omdr./min. i 10 minutter blev bundfaldet udvundet og 15 vasket 3 gange med en 0,05 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0) .

60 mg orthophenylendiamin blev opløst i 20 ml 0,2 M Mcllevein-puffer (pH 5,8), og der blev tilsat H202 til den resulterende opløsning til en slutkoncen-20 tration på 0,02 (rumfang/rumfang)%, og blandingen blev omrørt til dannelse af et farvningsmiddel.

2 ml fysiologisk saltopløsning og 500 ml·af farvningsmidlet samt den vaskede kugle blev anbragt i et reagensglas, og der blev inkuberet ved stuetempe-25 ratur i 30 minutter. Derpå blev den enzymatiske reaktion standset med 1 ml 3 N HC1. Absorbansen blev målt ved 492 nm. Samtidig blev absorbansen målt på samme måde bortset fra, at prøven blev udskiftet med forskellige koncentrationer af et standardmateriale (PGM) 30 til fremstilling af en kalibreringskurve, der er vist i fig. 10.

(iii) Bestemmelse:

Til 0,1 ml af hver af de forsøgsprøver, der blev fremstillét ifølge eksempel 2-(i),sattes et ligeså 35 stort rumfang af 10 yg/ml Lotus tetragonolobuslectin-peroxidase i 0,2 ml 0,15 M phosphatpufferopløsning og een PGM-uopløseliggjort skive, og blandingen blev omrørt godt og henstillet ved 20 til 37°C i 24 timerc

DK 154859 B

30

Efter omhyggelig vask af skiven med uopløseliggjort PGM i reaktionsvæsken måltes aktiviteten af den til skiven bundne Lotus tetragonolobuslectin-peroxidase fra OD4g2 ve^ den Proces til bestemmelse af enzymatisk 5 aktivitet, hvorved der benyttes som substrat og orthophenylendiamin som farvningsmiddel. Der opnåedes en kalibreringskurve ved at erstatte forsøgsprøverne med et standardmateriale (PGM) af forskellige koncentrationer. Kurven er vist i fig. 11, hvori værdierne af 10 TAG-D er angivet som et hexose-reduceret PGM-niveau. Resultater:

Som vist i fig. 11 havde alle raske personer en TAG-D værdi på under 3 nM/ml.

(iv) Bestemmelse: 15 . To af de forsøgsprøver (hver på 200 μΐ), der blev fremstillet ifølge eksempel 2-(i)fblev anbragt 1 to reagensglas, og der blev tilsat 50 μΐ af den per-oxidase-mærkede Lotus tetragonolobuslectin (3,5 μg/ml lectin i 0,1 M tris-saltsyre-pufferopløsning med en 20 pH-værdi på ca. 7,5) fremstillet ifølge eksempel l-(iii).

Hver af blandingerne blev omrørt forsigtigt og henstillet ved 20 til 30°C i een time. Til den ene prøve (prøve A) blev sat 250 μΐ af en 8 (vægt/rumfahg)% opløsning af polyethylenglycol (molvægt = 6000) i 0,1 M tris-25 saltsyre-pufferopløsning, og til den anden prøve (prøve B) blev sat 250 μΐ 0,1 M tris-saltsyre-pufferopløsning, og begge blandinger blev omrørt forsigtigt. Begge prøver blev henstillet ved 20-30°C i 30 til 60 minutter og centrifugeret med en svingrotor ved 1000 G i 40 til 30 60 minutter. Supernatanten (50 μΐ) blev dekanteret i 2 ml fysiologisk saltopløsning, og blandingen blev omhyggeligt omrørt. Til hver af blandingerne blev sat 500 μΐ af en opløsning af peroxidasesubstrat (i det følgende betegnet substratvæske), og blandingen blev 35 henstillet i et mørkt rum ved 20-30°C i 30 minutter. Substratvæsken blev fremstillet ved at sætte orthophenylendiamin og vandig hydrogenperoxid til 0,1 M citrat-pufferopløsning til en slutkoncentration på henholds-

DK 154859 B

31 vis 6% og 0,1%. Substratvæsken holdes fortrinsvis ved 4°C, indtil den skal benyttes. Den enzymatiske reaktion blev standset ved at tilsætte 1 ml 2 N saltsyre. Farveændringen blev vurderet ved at måle absorbansen ved 5 492 nm med et spektrofotometer. Den værdi (c), der blev opnået ved at trække absorbansen (a) af prøve A fra absorbansen (b) af prøve B blev indtegnet som mængden af TAG-bundet lectin. Resultatet er vist i fig. 12, hvor cirklerne angiver de raske personer, tallene (1) 10 og (2) angiver patienter med mavecancer, og (3) angiver patienter med brystcancer. De prøver, der har en højere værdi (c) end prøverne fra de raske personer, betyder et højere TAG-niveau i plasma og antyder, at der er dannet cancerøse celler hos værterne.

15 (v) Konkurrence-fremgangsmåde: 100 μΐ af en prøve (forsøgsprøve opnået ifølge eksempel 2-(i)) blev anbragt i et reagensglas, hvortil der blev sat 500 μΐ 0,3 M tris-HCl-puffer (pH 7,4) med en s lutkoncentration på 0,22 (vægt/rumfang)% gelatine, 20 5 mM CaCl2 og 5 mM MgC^. Een PGM-kugle (uopløselig- gjort TAG-lignende materiale fremstillet ifølge eksempel l-(xii)) og 100 yl lectin-peroxidase (det lyophilisere-de mærkede DBA fremstillet ifølge eksempel l-(iii) med en koncentration på 1 mg/1 i den ovenfor beskrevne tris-25 HCl-puffer) blev sat til prøven,og efter omrøring blev blandingen inkuberet i 48 timer ved 4°C. Reaktionsblandingen blev fjernet under anvendelse af en aspirator, og kuglen blev vasket med 2 ml fysiologisk saltopløs-, ning efterfulgt af fjernelse af vaskevæskerne under 30 anvendelse af en aspirator. Vaskningsoperationen blev gentaget 3 gange.

60 mg orthophenylendiamin blev opløst i 20 ml 0,2 M Mcllevein-puffer (pH 5,8), og der blev tilsat H2O2 til den resulterende opløsning til en slutkoncen-35 tration på 0,02 (rumfang/rumfang)%, og blandingen blev omrørt til dannelse af et farvningsmiddel.

I et reagensglas blev anbragt 2 ml fysiologisk saltopløsning og 500 μΐ af farvningsmidlet samt den

DK 154859B

32 vaskede kugle, hvorpå der inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Derpå blev den enzymatiske reaktion standset med 1 ml 3 N HC1. Reaktionsblandingens optiske tæthed blev bestemt ved 492 nm. Samtidig blev absorban-5 sen målt på samme måde bortset fra, at prøven blev udskiftet med forskellige koncentrationer af et standardmateriale (PGM) til fremstilling af en kalibreringskurve (fig. 13). Endvidere blev TAG i forsøgsprøverne opnået ifølge eksempel 2-(i) bestemt under anvendelse af kali-10 breringskurven. De opnåede resultater er vist i fig. 14.

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af niveauet af tumor-associeret glycobinding (TAG) i en prøve af legemsvæske, kendetegnet ved, at man omsætter TAG i en prøve af legemsvæske med en N-acetyl-D- 5 galactosamin (AG)-bindende lectin eller L-fucose-bin-dende lectin til dannelse af et TAG-lectinkompleks og måler mængden af TAG-lectinkomplekset eller af uomsat lectin.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-10 net ved, at omsætningen mellem TAG og lectinen udføres ved, at man konkurrerende omsætter det legemsvæske TAG, der skal måles, og en bestemt mængde uop-løseliggjort TAG eller uopløseliggjort TAG-lignende materiale med en bestemt mængde mærket lectin, skiller 15 det uopløseliggjorte TAG eller uopløseliggjorte TAG-lignende materiale bundet til mærket lectin og ubundet lectin fra hinanden og måler begges mærkningsmiddelaktivitet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-20 net ved, at omsætningen mellem TAG og lectinen udføres ved, at man konkurrerende omsætter det legemsvæske TAG, der skal måles, og en bestemt mængde mærket TAG eller mærket TAG-lignende materiale med en bestemt mængde lectin eller uopløseliggjort lectin, skiller 25 det mærkede TAG eller mærkede TAG-lignende materiale bundet til lectin eller til uopløseliggjort lectin og ubundet mærket TAG eller mærket TAG-lignende materiale fra hinanden og måler begges mærkningsmiddelaktivitet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende- 30 tegnet ved, at omsætningen mellem TAG og lectinen udføres ved, at man omsætter det legemsvæske TAG, der skal måles,med en uopløseliggjort lectin til dannelse af et TAG-uopløseliggjort lectin kompleks, omsætter dette kompleks med en bestemt mængde mærket lectin, 35 skiller det til den mærkede lectin bundne kompleks og ubundet mærket lectin fra hinanden og måler begges mærkningsmiddelaktivitet. DK 154859 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter fraskillelse af TAG fra den nævnte legemsvæskeprøve og omsætning af det fraskilte TAG med den nævnte lectin.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 4, ken detegnet ved, at den nævnte mærkede lectin er en lectin, der er mærket med et enzym, et fluorescerende stof eller et radioaktivt stof.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kende-10 t e g n e t ved, at der til nævnte legemsvæske sættes et beskyttende protein.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, kendetegnet ved, at legemsvæsken er blod, vævsvæske, lymfe, thoraxvæske, ascites, fostervæske, 15 mavesaft, urin, bugspyt, cerebrospinalvæske eller spyt.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at nævnte legemsvæske er blodserum eller blodplasma.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kende-20tegnet ved, at enzymet er glucoamylase, glucose- oxidase, peroxidase, alkaliphosphatase eller hemeoctapep-tid eller aktivt fragment deraf.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det fluorescerende stof er fluores- 25 cein, fluoresceinisothiocyanat, rhodamin eller dansyl-chlorid.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det radioaktive stof er radioaktivt iod eller tritium.

13. Fremgangsmåde til diagnosticering af cancer, kendetegnet ved, at man måler niveauet af tumor-associeret glycobinding i legemsvæske fra en patient ved fremgangsmåden ifølge et vilkårligt af kravene 1, 2, 3 og 4 og sammenligner det således målte 35 niveau med niveauet hos en person med normalt helbred.

14. Udstyr til bestemmelse af TAG-niveauet i en legemsvæske, kendetegnet ved, at det omfatter AG-bindende lectin eller L-fucose-bindende DK 154859B lectin som specifikt agglutineringsmiddel for TAG.

15. Udstyr ifølge krav 14, kendetegnet ved, at lectinen er blevet lyophiliseret, og at udstyret yderligere indeholder et rekonstitueringsreagens, der 5 indeholder et vandbaseret eller med vand blandbart opløsningsmiddel .