NL8100210A - Microbiologisch verkregen polypeptide met de aminozuurvolgorde van het proinsuline van primaten, dna en plasmiden, die deze volgorde coderen, microoerganismen die deze genetische informatie bevatten en het maken daarvan. - Google Patents

Description

-i VO 1316

Betr: Microbiologisch. verkregen polypeptide met de aminozuurvolgorde van het. pro insuline van primaten, DBA en plasmiden, die deze volgorde coderen, microorganismen die deze genetische informatie Bevatten en het maken daarvan.

In toenemende mate zijn menselijke hormonen in de therapie nodig. Daartoe behoort o.a. het hormoon insuline. Omdat het onmogelijk is, hormonen in grote hoeveelheden uit menselijke organen te vinnen, moeten geschikte technieken worden ontwikkeld, deze hormonen buiten het menselijk organisme te doen vormen.

De uitvinding geeft een dergelijke weg weer. Deze betreft de isolatie van nucleotidenvolgorden, die de genetische code voor een specifiek eiwit bevatten, de synthese van DMA met deze specifieke nucleo-tidevolgorden en een transfer van dit DMA in een mieroorganisme als gastheer, waarin de replicatie en expressie van dit DNA plaatsvindt.

Het is bekend, polypeptiden en proteïnen door het kweken van bacteriën te bereiden, die plasmiden met genen dragen, die de gewenste polypeptiden of proteïnen coderen. Voorts is het bekend, dat plasmiden kunnen worden geconstrueerd, die de hen bevattende gastheer ertoe aanzetten genprodukten te bereiden, die van nature niet voor deze gastheer karakteristiek zijn. Het is ook bekend, dat door DMA-recambinatietech-niéken de genetische informatie van ratten-preproinsuline in bacteriën gecloneeidis. Er kon worden aangetoond, dat deze bacteriën een eiwit exprimeren, dat antigeen-determinanten van insuline bezit. Bovendien is het bekend, dat de genetische informatie van de A- en B-keten van menselijk insuline gescheiden in bacteriën is gedoneerd. Dit werd aldus bereikt, dat de betreffende DMA's voor A- en B-keten de novo werden gesynthetiseerd. De door de bacteriën geproduceerde A- en B-ketens konden hierna in vitro tot het insulinemolecuul worden verknoopt.

Geen van deze methoden heeft tot een in de menselijke therapie toepasbaar geneesmiddel geleid. Bij het rattenprolnsuline is het eindprodukt, het ratteninsuline, een eiwit, dat tot allergische reacties leidt. Bij de menselijke A- en B-ketens stuitte men op de eigenschappen van de B-keten wegens zijn polymerisatieneiging en de zeer slechte opbrengst bij de combinatie van A- en B-keten tot het einddoel, menselijk insuline.

Met de uitvinding wordt derhalve een andere weg ingeslagen. Het is békend, dat ape- en menselijk insuline een identieke structuur bezitten. Wanneer men erin slaagt ape-prolnsuline te bereiden, kan men daaruit door splitsing menselijk insuline winnen.

8100210 --2-.

De uitvinding "betreft nu in het bijzonder de vorming van genen voor ape-proïnsuline, de transfer van deze genen in een microbe—gastheer, replicatie van gastheer en gen en expressie van dit gen door de gastheer. Daarbij ontstaan proteïnen, die de aminozuurvolgorde van ape-pro-5 insuline bevatten.

Voor het bereiken van dit doel kan men op de volgende wijze te werk gaan, waarbij de aangegeven weg als voorbeeld voor verscheidene andere moet worden opgevat.

Men wint uit apepancreas, liefst van rhesusapen of cynamolgen, 10 door een proteolytische afbraak, die wegens de mogelijke verdergaande _ ontleding zeer zorgvuldig moet worden gecontroleerd, en vervolgens centrifugeren afzonderlijke cellen. Hieruit wordt door een dichtheidscentrifugering over een gradiënt een aan yS-cellen rijke laag gewonnen. Deze cellaag wordt gedenatureerd en het RHA als neerslag volgens een cesium-15 chloridecentrifugering gewonnen. Ha verder hernieuwd neerslaan wordt uit dit RHA de ïriRHA via een oligo-dT-cellulosekolam afgescheiden.

De gewonnen rnRHA wordt met behulp van het enzym reverse transcriptase tot een RHA-DHA-dubbelstrengeomplet verwerkt. Ha afbraak van de RHA-streng wordt de DHA-streng (de complementaire DHA - cDHA) met reverse 20 transcriptase of het enzym polymerase X tot een DHA-DHA-dubbelstreng (dsDHA) gecompletteerd.

Dit dubbelstrengige DHA moet nu in een plasmide worden ingebouwd. Daartoe is een verlenging van het 3’-uiteinde van het DHA b.v. met dCMP-resten nodig. Het plasmide (b.v. pBR 322) wordt met het res-25 trictienuclease PstI opgesneden en b.v. met d(MP-resten verlengd. Bij samenvoegen van het aldus verlengde DHA met een passend verlengd plasmide vindt baseparing tussen DHA en plasmide plaats. Dit circulaire molecuul wordt daarna in microörganismen (liefst bacteriën, met name E. coli, zoals E.coli K 12 of X 1776) getransformeerd; de nog niet gesloten · 30 bindingen worden door,de enzymen van het mieroorganisme covalent \ knaopt. De getransformeerde organismen worden op agarplaten uitgestreken en op antibioticaresistenties, die door het gekozen plasmide en de toegepaste restrietienuclease gegeven zijn, geselecteerd.

Met behulp van immunologische proeven worden de elonen, die in-35 sulinehoudende proteïnen exprimeren, uitgezocht. Deze elonen worden 8100210 -3- * _ η ϊ, * gekweekt, de microörganismemassa afgecentrifugeerd, geëxtraheerd en op insulinegehalte nagegaan. Hierbij konden in een reeks -van clonen insu-linewaardaivan meer dan een insulineëenheid (= 1 IE) per liter cultuuroplossing worden gemeten. Deze cultuur oplossing fungeert als uit-5 gangsmateriaal "voor het winnen van ape-proxnsuline en vervolgens menselijk insuline.

De onderhavige trappen kunnen als volgt worden uitgevoerd: 1. Werkwijze voor het isoleren van MA.

a) De isolatie van insuline producerende pancreas cellen.

10 Van primaten, liefst rhesusapen of cynamolgen werden de pancreas- klieren onder steriele voorwaarden gewonnen en na wegwerpen van de huidjes en grotere bloedvaten eerst mechanisch door snijden verkleind. Daarbij moet er op worden gelet, dat het weefsel tijdens deze behandeling koel wordt gehouden om een zelfontsluiting ten-15 gevolge van de daarin aanwezige pancreatine-enzymmengsels te vermij den. Het verkleinde weefsel wordt enige malen met gekoeld zoog-dierenserum, bij voorkeur kalverserum, gewassen, daarna in kolven gebracht en met een steriele 0,125 %*s verwarmde collagenaseoplos-sing in PBS gemengd. De collagenaseoplossing moet steeds vers voor 20 de ontsluiting worden bereid. Doorslaggevend voor de opbrengst aan cellen uit de pancreas is een gelijktijdige toevoeging van 20 en meer procent serum, liefst kalverserum, aan de collagenase. Dit mengsel wordt 10 minuten geroerd en de gehele bovenstaande vloeistof vervolgens weggeworpen. Daarna wordt opnieuw een collagenase— 25 serummengsel toegevoegd en ca. 6-10 minuten geroerd. Deze behandeling - wordt ca. driemaal herhaald en het telkens gewonnen ontsloten materiaal in een koele houder verzameld. Het verzamelde materiaal met de enzymatisch gewonnen cellen wordt bij ca. 1000 tpm 10 minuten in een gekoelde centrifuge gecentrifugeerd, de bovenstaande vloei-30 stof weggeworpen en het cel-bodemmateriaal in vers Dulbecco-medium met 1 g/l glucose en 20% kalverserum geresuspendeerd. Dit centrifugeren wordt herhaald en het daarbij gewonnen bodemmateriaal in 10 cm Dulbecco-medium met 15% serumtoeslag geresuspendeerd.

Dit celmateriaal, dat uit een mengsel van ^-cellen, fibro-35 blastèn en epitheloxde cellen bestaat , werd vervolgens over een 8100210 -k- di chtheidsgradiënt , biv. uit ficolen of per col, gescheiden. Het besté·' is hiervoor'-een ficol-di chtheids gradiënt gebleken. Daartoe werd ficol UOO/Pharmacia, in Dulbecco-medium zonder serum opgelost en in een refractometer op een viscositeit van 1,38 of met. een as 5 op een dichtheid van 1,16 ingesteld, door een membraanfilter met een poriédiameter van 0,1*5 p. steriel gefiltreerd en bij +i*°C'tot de toepassing bewaard. Van deze ficol-uitgangsuspensie werden dichtheden met een viscositeit.van 1,373, 1,370 en 1,3672 door een toevoeging van Dulbecco-medium ingesteld en in centrifugebuisjes 10 in lagen boven elkander aangebracht. Bovenop werden de geresus pendeerde pancreas cellen aangebracht en 10 minuten werd bij. +U°C en 3200 tpm gecentrifugeerd. Ha dit centrifugeren werden de afzonderlijke banden, voorzichtig gewonnen en van. restantficolen met Dulbecconnedium· vrijgewassen. De hoofdmassa van de insuline 15 producerende ^-cellen werd op de bovenste lagen met de geringste dichtheid en een viscositeit van 1,3672- geconcentreerd,

b) Winnen van MA

De verkregen cellen werden in "denaturerend medium" (b- M gu-anidiniumthiocyanaat, 1 M mercaptoethanol, 0,15 M natri-umacetaat; 20 pïï 5,5) opgencmen en 1 minuut, bij 0°C met een ultra-turrax gehomo geniseerd. De oplossing werd 5 minuten op 80°C verwarmd en on-middellijk in een ijsbad gebracht.

' O

Deze werd vervolgens op een oplossing ("kussen") van 5 cnr 5,7 M CsCl, 10 mM tfis-hydroxyaminamethaan (tris), 10 mM ethyleen-25 diaminetetraazijnzuur (EDÏA) met pH 7,6 als laag aangebracht en in een Beckman-SW 27 rotor 36 uren bij 20°C en 22.000 tpm gecentrifugeerd. Gevonden werd, dat in tegenstelling tot opgaven in de literatuur een toeslag van CsCl aan het lysaat moet worden vermeden cm een zo volledig mogelijke afscheiding van het mBHA 30 bij de volgende reactietrap te bereiken. Ha afloop van het cen trifugeren werden de polyallomeerbuisjes in vloeibare stikstof ingevroren en de bodem van het buisje waarop zich het RHA-neerslag bevond, afgesneden. Dit neerslag werd. in een oplossing, van 10 mM tris, 10 mM EDTA en l! "Sarkosyl" (H-lauryl-sarkosine-natriumzout). 35 met pH 7,6 opgencmen en de suspensie bij 20.000 tpm gedurende 8100210 ^ £ -5- 20 minuten af gecentrifugeerd. Het verkregen neerslag werd nogmaals in dezelfde "buffer opgencmen, 5 minuten op 65°C verwarmd en opnieuw gecentrifugeerd. De verenigde "bovenstaande vloeistoffen werden 0,3 molair aan natriumacetaat gemaakt met het 2,5-voudige volume 5 aan ethanol gemengd en "bij -20°C opgeslagen.

2. Winning van mRNA

Het RNA werd door afcentrifugeren uit de ethanoloplossing (20.000 tpm, 30 minuten, -5°C) afgescheiden en in 0,5 M HaCl, 10 mM tris met pH 7,5 opgelost. Deze oplossing werd op een oligo-dT-cellulosekolom.

10 (van Collaborative Research, type 3) die met een zelfde buffer was ge-equilibreerd, aangebracht en met 1 mM tris pH 7,6 of gedestilleerd water geëlueerd. De elutie van het poly-A-houdende RNA (mSNA) kan door extinctiemeting bij 260 nm worden gevolgd. Het aldus verkregen mRHA werd met natriumacetaat tot een eindconcentratie vai 0,3 M gemengd, 15 een 2,5-voudig volume aan ethanol toegevoegd en de oplossing bij -20°C cpgeslagen.

3. Winning van cDM

a) Winning van erikelstreng-cDM

De transcriptie van een mRïTA tot het overeenkomstige DNA (cDNA) 20 vindt plaats met behulp van het enzym reverse transcriptase. Het incubatiemengsel bevatte: 50 mM tris, pH 8,3, 10 mMMgClg, 30. inM 2-mercaptëthanol, 0,5 mM aan alle vier gewoonlijk voorkomende des-oxyribonucleosidetrifosfaten (de passende trifosfaten van adenine,

O

guanine, cytosine en thymidine), 100,ng/cmJ oligo-dT 12-18 (pro-

O

25 ducent Boehringer Mannheim) ca. 100 /Ug/cm gepolyadenyleerd EBA

O * ' en 800 eehheden/cm reverse transcriptase (producent:Life Science Inc., St. Petersburg, USA). Om de reactie te kunnen volgen kan een op de ^(-plaats met 32 P-gemerkt desoxyribonycleosidetrifosfaat (specifieke activiteit: 50 Ci/mmol) aan het mengsel worden toege-30 voegd. Het mengsel werd βθ minuten bij k2°C gelncubeerd, waarna door een toevoeging van 20 mM EDTA de reactie werd afgebroken.

De oplossing werd met een gelijk volume met water verzadigde fenol geëxtraheerd, de fenol door uitschudden met ether verwijderd en restanten ether met stikstof af gedestilleerd. Niet ingebouwde des-35 oxyribonucleosidetrifosfaten werden door een kolomchramatografie 8100210

•ύ V

-6- over Sephadex G50 in . 10 mM tris, pH 9j0, 100 mM -NaCl, 1 mM EDTA afgescheiden» Het geëlueerde cDNA werd door een toevoeging van 0,3 M natriumacetaat en het 2,5-voudig volume ethanol neergeslagen.

Ha centrifugeren werd het neerslag in 0,1 M natronloog opge-5 nomen en 20 minuten hij 70°C geïncubeerd of in 0,3 M natronloog een nacht hij kamertemperatuur geïncubeerd. Het mengsel werd met 1 M zoutzuur en 1 M tris op pH 7,6 gebracht, b) Vorming van dubbelstreng-cDNA (ds DNA)

Voor de synthese van de tweede DNA-streng kan wederom het enzym 10 reverse transcriptase of het enzym polymerase I worden gebruikt.

Vorming van dsDHA met reverse transcrintase Dit incubatiemengsel (pH 8,3) bevatte 50 mM tris, 10 mM MgCl^» 30 mM 2-mercaptoëthanol, 0,5 mM van de bovengenoemde vier desoxy- 3 3 ribonucleosidetrifosfaten, 50 jlig/cm cDNA en 800 eenheden/cm 15 reverse transcriptase. De reactie werd 120 minuten.bij h2°C uitge voerd en door een toevoeging van EDTA tot de eindconcentratie van 20 mM beëindigd. Vervolgens vond de fenol-extractie en een gel-permeatiechromatografi e over Sephadex G5Q als tevoren beschreven plaats» 20 Vorming van dsDNA met, polymerase I:

Het incubatiemengsel met pH 6,9 bevatte 200 nM hepes, 0,5 mM van de'bovengenoemde k desoxyribanucleosidetrifosfaten, 10 mM MgCl^, 30 mM 2-mercaptoëthanol en 70 mM EC1. Door een toevoeging van 32 P-gemerkte desoxyribonucleotiden (op ded-plaatsen) aan het incu-25 batiemengsel kan de reactie wordèn gevolgd. De reactie werd met 800 eenheden/cm"^ polymerase X gestart en 2 uren bij 15°C uitge-voerd. Door een toevoeging van 0,1 % natriumdodecylsulfaat en 100 jug/cm RNA werd de reactie af gestopt. De oplossing werd als beschreven geëxtraheerd. De na de extractie verkregen oplossing 30 werd op een Sephadex G50-kolom aangebracht en gechramatografeerd met 10 mM tris pH 9,0, 100 mM NaCl en 1 mM EDTA. Het- geëlueerde DNA kon door zijn radioactiviteit worden bepaald en werd door een toevoeging van 0,3 M natriumacetaat en het 2,5-voudig volume ethanol neergeslagen. Dit ethanol-neerslag werd in een oplossing (pH 35 h-,5) van 300 mM NaCl, 30 mM natriumacetaat en 3 mM ZnClg opgenamen 8100210 3 -τ- en met 1500 eenheden/cm S1 nuclease (Boehringer, Mannheim) gemengd. De reactie werd na 1 uur hij 3T°C door een toevoeging van. EDIA tot een eindcbncentratie van 20 mM beëindigd. Vervolgens werd geëxtraheerd met fenol en met ethanol neergeslagen als eerder 5 beschreven.

c) Winning van cDM volgens een eenvatsprocédé ♦

Haast de beschreven reacties kan het dsDM uit het mRM ook. met een eenvatsproeide worden gewonnen. Daarbij wordt de reactie van de reverse transcriptase als beschreven uitgevoerd, maar aan het 10 incubatiemengsel nog lHO mM KC1 toegevoegd. Ha afloop van de reac

tie wordt het: monster minuten op 100°C verhit en het gevormde neerslag afgecentrifugeerd. Aan de bovenstaande vloeistof wordt een gelijk volume aan 0,1*- M hepesbuffer (pH 6,9) toegevoegd, baarbij de bovengenoemde U desoxyribonucleotiden in de buffer 0,5 mM

3 15 aanwezig zijn. Door een toevoeging van 800 eenheden/cm polymerase I wordt de reactie als beschreven bij 15°C uitgevoerd en door een toevoeging van natriumdodecyIsulfaat en HM afgestqpt. Hieraan aansluitend wordt als onder 3b verder gewerkt .

I*. Verlenging van de 3'-uiteinden van cDFA met dCTP (desoxycitosine- 20 trif osf aat) ______

Voor de inbouw in het plasmide is de verlenging van het 3 '-uiteinde van het DM met een van de bovengenoemde I* desoxynueleotiden nodig. Voorts worden de 3'-uiteinden van het gesneden plasmide met het complementaire desoxynucleotide verlengd. Bij samenvoeging van DM met 25 plasmide vindt dan een baseparing tussen DM en plasmide plaats.

Dit weer circulair gemaakt molecuul kan voor het transformeren van bacteriën worden gebruikt; de nog niet gesloten bindingen worden door een enzymsysteem in de bacterie covalent verknoopt.

B.v. kunnen de 3 '-uiteinden van cDM met dCMP-resten (desoxy-30 cytosinemonofosfaatresten) en het plasmide met dGMP-resten (des- oxyguanidinemonofosfaatresten) worden verlengd. Bij toepassing van deze desoxynueleotiden op de beschreven wijze en bij opening van het plasmide door het restrictie-enzym Pst I wordt na imbouw van het vreemde DM een Pst I-splitsingsplaats op elke insertieplaats nieuw 35 gevormd, zodat na vermeerdering van het plasmide het geinserteerde 8100210 -8- DÏÏA voor verder onderzoek gemakkelijk we.er met een restrictie— enzym Pst I uitgesneden kan worden.

Het neerslag verkregen na de alcoholtoevoeging na afbraak met S1 nuclease werd in een waterige oplossing (pH 6,7) uit 30 mM tris, 5 1 mM CoClg, 1^0 mM kaliumcacodylaat, 150 mM dCTP, 100 ,ug geauto- claveerd gelatinehydrolysaat en 0,1 M dithioërytritol opgelost. Voor het volgen van de reactie kan 32 P-gemerkt dCTP worden gehruikt.

De reactie werd door een toevoeging van terminaal desoxynueleotidyl-transferase gestart en 10 minuten hij 37°C uitgevoerd. Ha afloop 10 van deze reactietijd werd het monster in ijs gebracht en door een radioactiviteitsmeting in een met tri chloor azijnzuur verkrijgbaar neerslag het aantal van de ingebouwde dCMP-resten bepaald. Bij de reactie moet ca, 10% van het oorspronkelijk aanwezige nucleotide zijn geaddeend; wanneer dit niet het geval is, kan door een toe-15 voeging' van verder enzym de reactie worden voortgezet. Indien een te groot aantal dCMP-resten is geaddeerd, kan de gevormde keten met behulp van het enzym S1-nuclease worden verkort.

5· Werkwijze voor het integreren van DNA in een piasmide.

Een geschikt circulair plasmide, b.v. pBR 322, werd met een res-20 trictieëndonuclease gesneden, dat slechts een sequentie op het plas mide erkent. Gunstig is het, wanneer deze plitsingsplaats achter een sterke of induceerbare premotor is gelegen en/of zo is geloca-liseerd, dat een antibioticaresistentie wordt beïnvloed.

Het aldus gelineariseerde plasmide werd hierna aan de 3 ’-uit-25 einden met een van de vier desoxynucleotiden verlengd.

Dit werd b.v. als volgt uitgevoerd: 30 /ug plasmide werd met 50 eenheden Pst I restrictieendonuclease bi j aanwezigheid van 50 mM

3

NaCl, 6 mM tris, 6 mM MgClg, 6 mM 2rmercaptoëthanol en 0,1 mg/cm , gelatine gedurende Uo minuten bij 37°C en een pH van 7,5· geïncubeerd. 30 Vervolgens werd met fenol en ether als beschreven geëxtraheerd en .

het gesneden plasmide met ethanol bij aanwezigheid van 0,3 M na-triumacetaat neergeslagen. De verlenging van de 3'-uiteinden van het plasmide met dGTP (desoxyguanidinetrifosfaat) vond plaats analoog met de bovenbeschreven verlenging van het cDliA met 35 dGTP.

8100210 -9-

Het verlengde piasmide-DHA werd daarna in. een oplossing met pH

8,0 tiit 0,1 M ïïaCl, 10 mM tris en 1 mM EDÏA. met het verlengde ds cDHA. gemengd, 2 minuten op 56°C verwarmd, 2 uren hij k2°C ge-incubeerd en daarna langzaam op kamertemperatuur af gekoeld. Het 5 ai rins verkregen hybride DBA werd daarna voor een trans formering van E. coli gebruikt.

6. Clonering van het hydrideplasmide in E. coli,

De bacteriën, b.v. JC. coli X 1776,. werden bij 37 °C in 50 cm^ van een gebruikelijke voedingsbodem tot een optische dichtheid van 10 Agoo = 0,5 - 0,6.gekweekt, gesedimenteerd, eenmaal met 10 mM tris met pH 7,5 gewassen en daarna in U0 cm^ van een oplossing, van 75 mM CaClg, 5 mM MgCl^ en 5 mM tris met pH 8,0 geresuspendeerd en 20 minuten in ijs geïncubeerd. Daarna werden de cellen gesedimenteerd en in 2 em^ 75 mM CaCl-,5 mM MgCl^, - 5 mM tris pH 8,0 gere suspen- . 15 deerd.

3 3 0,2 cm van deze bacteriesuspensie werd daarna met 0,1 cm hybride-DM-qplossing gemengd en 115 minuten op ijs geïncubeerd. Daarna werd 90 seconden op k2°C verwarmd en vervolgens met 0,2 cnr voedingsbodem gemengd. 50 tot 75 mm van deze suspensie werden daar-20 na qp tetracycline en ampicilline houdende agarplaten uitgestreken en op antibiotiea-resistentie gesêlecteerd.

7. Isolatie van stammen, die insulinehoudende proteïnen produceren.

Met behulp van een door Broome en Gilbert (E. PITAS 75., 27½, (1978)) ontwikkeld proef systeem werden de clonen op de expressie 25 van insulinehoudende proteïnen onderzocht. Clonen, die insuline houdende proteïnen exprimeren werden door de binding van radioactieve antilichamen aan de proteïnen met hieropvolgende autoradio-grafie aldus onderkend, dat de röntgenfilm cp deze plaatsen werd gezwart. Daartoe werd tot 50 clonen per nitrocellulosefilter ge-30 durende 2 dagen bij 37°C gekweekt. Daarna werden de filters cp een agarblok gelegd, dat 1 mg/cm lysozyme bevatte; cp de bacterie-kolonie werd een met insulineantilichamen beklede PVC-folie aangebracht, en daarna werd 2-3 uren bij k°C geïncubeerd. De PVC-folie werd vervolgens 15 uren bij if°C in een oplossing van mét 132 35 jodium-gemerkte insulineantilichamen geïncubeerd. De specifieke 8100210 g o activiteit van de oplossing "bedroeg ca, 1 x lO .cpm/cnr . Ifa wassen en drogen van de folies werden deze geautoradigrafeerd.

De op de plaat immunologisch op insuline reagerende cloneneerden v- in een gebruikelijke voedingsbodem gekweekt, de bacteriën afgece'n- 5 trifugeerd, geëxtraheerd en nu met een radioimmunoproef op -aanwezigheid van insulinegehalte uitgetest. Een aantal van'deze clonen vertoonden daarbij insulinewaarden van meer .dan 1 IE per liter cultuur oplossing. 1 8100210 · '%

Claims (8)

1. Microbiologisch verkregen polypeptide, dat de aminozuurvolgorde van proinsuline van primaten geheel of gedeeltelijk gevat.

2. Microbiologisch verkregen polypeptide volgens conclusie 1, dat de aminozuurvolgorde van het C-peptide van proinsuline van primaten ge- 5 heel of gedeeltelijk bevat. 3. cDNA, dat voor aminozuurvolgorden van proinsuline volgens con- . clusies 1 of 2 codeert, verkregen met behulp van mRNA van primaten. U. Flasmide, dat voor aminozuurvolgorden volgens conclusies 1 of 2 codeert, verkregen uit het cDNA- volgens conclusie 3 en een plasmide, 10 liefst plasmide pER 322.

5. Microörganisme, speciaal E. coli. met de genetische informatie voor de biosynthese van het polypeptide volgens conclusies 1 of 2.

6. Werkwijze voor het bereiden van een polypeptide volgens de conclusies 1-2, met het kenmerk, dat men de genetische informatie voor 15 de biosynthese van het polypeptidè met mRNA van primaten wint, het verkregen gen op een op zichzelf bekende wijze in microörganismen aanbrengt en die microörganismen op een op zichzelf bekende wijze uitselecteert en cultiveert, die dit polypeptide produceren.

7. Werkwijze voor het bereiden van cDNA. volgens conclusie 3, met 20 het kenmerk, dat men uit de pancreas van primaten RNA wint, daaruit het mRNA isoleert en hiermede op een op zichzelf bekende wijze cDNA bereidt.

8. Werkwijze volgens conclusie J, met het kenmerk, dat men bij het winnen van eilandcelletjes uit de pancreas van primaten een zoogdier-serum, liefst kalverserum, in een hoeveelheid vaibij voorkeur 20 of 25 meer procent van het totale volume toepast en uit de aldus gewonnen ei-landcellen RNA wint.

9. Werkwijze voor het maken van een microörganisme volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een microörganisme, bij voorkeur JI. coli, met een plasmide volgens conclusie 4 transformeert.

10. Werkwijze voor het winnen van RNA, met het kenmerk, dat men een cesiumchloride-vrij lysaat op een waterige geconcentreerde cesium-chloride pp los sing als laag aanbrengt, centrifugeert en het RNA wint. 8100210