NL8001972A - Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuumperoxidase aktiviteit. - Google Patents
Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuumperoxidase aktiviteit. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8001972A NL8001972A NL8001972A NL8001972A NL8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- hydrogen donor
- peroxidase
- determn
- enzyme reaction
- chromogenic
- Prior art date
Links
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 title claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title abstract 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenyl beta-D-alloside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 peroxide compound Chemical class 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- GVQNHORDCKLWPE-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3-ethyl-5-methylphenyl)-2-ethyl-6-methylaniline Chemical compound CC1=C(N)C(CC)=CC(C=2C=C(CC)C(N)=C(C)C=2)=C1 GVQNHORDCKLWPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
* ΟΑ/8040-072 Douma Akzo N.V. te Arnhem
Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuunperoxidase aktiviteit.
De uitvinding heeft betrekking op een verbeterde methode voor het aantonen en bepalen van "immuunperoxidase" aktiviteit, met name de kleurreaktie zoals die wordt toegepast bij immunochemische 5 bepalingen waarbij een hapteen, antigeen of anti-lichaam is gekoppeld aan het enzym peroxidase.
Om de aktiviteit van dit gekoppelde enzym te bepalen maakt men doorgaans gebruik van waterstofperoxide of een andere peroxide verbinding, waaraan 10 een chromogene waterstofdonor wordt toegevoegd.
Deze laatste component wordt onder invloed van het enzym door het peroxide geoxideerd, waarbij een chromofoor reaktieprodukt ontstaat dat colori-metrisch of spektrofotometrisch kan worden gemeten, 15 en waarvan de concentratie in relatie kan worden gebracht met de hoeveelheid enzym (resp. aktiviteit) van het koppelingsprodukt.
De keuze van een geschikte waterstofdonor voor dergelijke reakties is niet eenvoudig. Deze 20 moet in de eerste plaats voldoende oplosbaar zijn in het waterig milieu waarin de enzymreaktie plaats vindt, en mag de enzymreaktie niet versnellen of remmen. De waterstofdonor mag verder niet al te gevoelig zijn voor luchtoxidatie en niet met de 25 peroxideverbinding of andere komponenten van het reaktiesysteem reageren. Het gevormde oxidatieprodukt moet tenslotte bij voorkeur een enkelvoudige stof zijn en mag geen secundaire reakties met het milieu en het gebruikte reaktievat aangaan.
30 Meestal kiest men de waterstofdonor uit de groep van fenolen, aromatische aminen, leukokleur-stoffen, heterocyclische verbindingen e.d.
800 1 9 72 *' t - 2 -
Een zeer belangrijk bezwaar van stoffen, welke overigens redelijk voldoen aan de hierboven geschetste eigenschappen is, dat ze soms sterk mutageen of zeer carcinogeen zijn en derhalve 5 slechts onder zeer scrupuleuze voorzorgen mogen worden gebruikt.·
Het behoort tot de stand van de techniek dat voor peroxidasereakties 3,3*,5,5* tetra-alkylbenzidine derivaten als waterstofdonor kunnen 10 worden gebruikt, welke niet of nauwelijks mutageen of carcinogeen zijn. Deze waterstofdonoren bleken tot nu toe zeer geschikt voor het aantonen van occult bloed in urine en faeces, en als oxidatie-indicatoren bij andere snel uit te voeren proeven 15 zoals b.v. geschiedt bij het gebruik van diagnostische teststrookjes. Daarentegen was het niet goed mogelijk deze verbindingen toe te passen in het waterig milieu waarin immunochemische reakties ter bepaling van haptenen, antigenen en anti-20 lichamen zich voltrekken, en waarvoor soms relatief lange incubatietijden nodig zijn om gevoelige bepalingsmethoden te verkrijgen.
Verrassenderwijs werd nu gevonden dat men deze "immuunperoxidase" aktiviteit kan aantonen en 25 bepalen met 3,3’,5,5’-tetraalkylbenzidinederivaten als chromogene waterstofdonoren, met het kenmerk dat de waterstofdonor wordt opgelost in een waterige buffer die een met water mengbare aprotische vloeistof bevat, de ênzymreaktie na inkubatie wordt gestopt 30 met een verdund niet-oxiderend zuur met een sterkte-exponent bij 25 °C ^ 2,00 en de extinctie van het gevormde chromofoor wordt gemeten bij de golflengte van het enkele absorptiemaximum tussen 300 en 700 nanometer.
35 Volgens de werkwijze van de uitvinding past men 3,3',5,5'-tetraalkylbenzidinen toe waarbij de alkyl-groepen maximaal 6 koolstofatomen bevatten en 800 1 9 72 * * -- ' » - 3 - lineaire of vertakte ketens hebben, doch bij voorkeur methyl en/of ethylgroepen bevatten, en in de vorm van vrije basen beschikbaar zijn.
In vergelijking tot andere waterstofdonoren 5 is de oplosbaarheid van deze verbindingen in waterige systemen te gering om in de "immuun-peroxidase" systemen een concentratie van het te meten chromofoor van voldoende hoogte te bereiken. Derhalve werd getracht geschikte organische oplos-10 middelen te vinden die, toegevoegd aan het waterig buffersysteem tegelijkertijd een verhoging van de oplosbaarheid van de waterstofdonor te bewerken, terwijl het verloop van de enzymatische reakties er niet door wordt verstoord. Verrassenderwijze 15 bleken de geschikte oplosmiddelen te kunnen worden geselecteerd uit de groep van de volledig met water mengbare aprotische vloeistoffen, bij voorkeur dimethylsulfoxide, 1,4-dioxaan en dimethylformamide.
In aanwezigheid van deze oplosmiddelen bleken de 20 waterstofdonoren ook weinig of niet gevoelig voor lucht- en fotochemische oxidatie. De wijze waarop de waterstofdonor in het buffersysteem wordt opgelost kan op twee manieren geschieden. Men kan het aprotische oplosmiddel aan de te gebruiken waterige 25 buffer toevoegen, en onder constant roeren de afgewogen hoeveelheid waterstofdonor in oplossing brengen. Beter is het om een afgemeten hoeveelheid van de waterstofdonor, opgëlost in het aprotische oplosmiddel, aan de waterige buffer toe te voegen.
30 De concentratie van het aprotisch oplosmiddel is bij voorkeur 1-2%, hoewel deze nog aanzienlijk groter kan zijn zonder dat de enzymreaktie daar merkbaar door wordt gestoord.
Tijdens de inkubatie, b.v. in een Mcllvaine 35 buffer pH 5,0 of in een acetaatbuffer pH 5,5, ontwikkelt zich een chromofoor die een blauwgroene tot blauwe kleur bezit, afhankelijk van de aktiviteit 800 1 9 72 - 4 - van het immuunperoxidase. Voor kwalitatieve doeleinden is dit een geschikte kleuromslag, doch deze blijkt bij enige uren staan nagenoeg volledig verdwenen te zijn.
5 Voor kwantitatieve bepalingen wordt de reaktie na een vastgestelde tijd gestopt. Dit geschiedt b.v. door het overgebleven peroxide-substraat te verwijderen, b.v. met natriumthiosulfaat of natrium-nitriet. Ook kan men de enzymwerking blokkeren 10 door het toevoegen van natriumazide, zware metalen of vrij hoge concentraties thiomersalaat (NaOOC. C6H4.S.Hg.C2H5>.
De genoemde mogelijkheden blijken bij de waterstofdonoren van deze uitvinding niet te voldoen 15 en gaven geen stabiele kleurontwikkeling te zien. Aanzienlijk betere resultaten werden verkregen met de toevoeging van verdunde, niet-oxiderende, sterke zuren. In aanwezigheid van de aprotische oplosmiddelen als in het bovenstaande aangeduid, ontwikkelden 20 zich hierbij stabiele heldergele oplossingen van het chromofoor, welke bij omstreeks 450 nanometer konden worden gemeten.
Van belang bleek de sterkte van het gebruikte zuur, m.a.w. de dissociatieconstante K hiervan. De 25 negatieve logarithme van deze dissociatieconstante is de pK, de sterkte-exponent. Alle zuren met een sterkte exponent (bij 25 °C) ^ 2,00 geven een absorptie-spectrum tussen 350 en 700 nm met slechts één absorptie-maximum bij omstreeks 450 nm. De incubatievloeistof, 30 gemeten vóór het stoppen van de enzymreaktie, heeft een spectrum dat absorptiemaxima bij ca. 650 nm en - afhankelijk van de enzymconcentratie méér of minder hoog - bij omstreeks 450 nm. Door toevoeging van zuren met een sterkte-exponent >y 2,00 (25 °C) ver-• 35 andert het spectrum gedeeltelijk ten gunste van het 450 nm maximum, doch het maximum bij omstreeks 650 nm blijft aanwezig.
800 1 9 72 - 5 -
Geschikte zuren voor het stoppen van de enzyra-reaktie zijn b.v. zwavelzuur, zoutzuur en trifluor.-azijnzuur. Oxiderende zuren zoals salpeterzuur en perchloorzuur bewerken eveneens een verschuiving 5 van het absorptiespectrum naar omstreeks 450 nm.
Doch zij zijn ongeschikt omdat ze het gevormde chromofoor verder oxideren, zodat de stoechiometrie van de enzymreaktie verloren gaat. Bovendien hebben zij de eigenschap eiwitachtige stoffen uit het enzym- 10 reaktiemengsel te kunnen precipiteren, zodat een kwantitatieve meting zonder verdere voorzorgen onmogelijk wordt.
De voordelen van de werkwijze volgens de uit-• vinding zijn zeer evident. Allereerst is de enzym-• 15 reaktie niet gevoelig voor de invloed van licht zoals b.v. het geval is bij het gebruik van o-phenyleendiamine als waterstofdonor. De uitvoering kan dus gewoon in het laboratorium plaats vinden, zonder dat de reaktievaatjes in het donker moeten 20 worden weggezet.
Verder is het reaktiesysteem volgens de uitvinding zéér gevoelig omdat de moleculaire extinctie bij omstreeks 450 nm veel groter is dan bij omstreeks 650 nm.
25 Tenslotte zijn de nauwkeurigheid en reprodu ceerbaarheid van het onderhavige systeem veel groter dan bij vroegere systemen.
De kern van de uitvinding wordt gedemonstreerd in de navolgende voorbeelden.
30 800 1 9 72 - 6 - V-
Voorbeeld l (p\
Een Cooke Microtiter plaat (8 x 12 cups; polystyreen; fa. C.A. Greiner & SÖhne, NÜrtingen (BRD)) werd gecoat met een passende hoeveelheid 5 en verdunning gezuiverd IgG dat werd geïsoleerd uit het serum van een schaap dat geïmmuniseerd was met hypofysair FSH van menselijke oorsprong.
In de cups werd een reeks oplossingen van hypofysair FSH gebracht, bevattende 100, 80, 60, 40, 10 20, 10 en 0 ml.E. per milliliter in menselijk serum. De oplossingen, elk met een volume van 100 mikroliter, werden in viervoud opgebracht. Bovendien werd, eveneens in 4-voud, 100 mikroliter van een onbekend menselijk serum opgebracht.
15 De plaat werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur weggezet om het te bepalen antigeen met de anti-lichamen op de plaat te laten reageren. Daarna werden de cups viermaal gewassen met een TRIS-Tween buffer, bevattende 0,2 mol/1 Tris(hydroxymethyl) 20 aminomethaan (Sigma, München, BRD) en 0,2 mol/1 natriumchloride (Merck, Darmstadt, BRD); per liter was 0,5 ml polyoxyethyleensorbitan monolaureaat (Sigma, München, BRD) aan deze wasbuffer toegevoegd.
Vervolgens werden de cups gevuld met 100 mikro-25 liter van een verdunde oplossing van een conjugaat, dat verkregen was door anti-FSH IgG te koppelen aan mierikswortelperoxidase (HRP; Boehringer, Mannheim, BRD). Bij kamertemperatuur werd wederom twee uur geïncubeerd, om de gemerkte antistof te laten reageren 30 met het FSH uit standaarden en monster. Vervolgens werden de .cups viermaal gewassen met de hierboven beschreven wasbuffer, en daarna viermaal met gedestilleerd en gedemineraliseerd water.
800 1 9 72 - 7 -
De kleuring werd als volgt uitgevoerd: A. 8,82 g trinatriumcitraat.^O pA (Merck, Darmstadt BRD) werd opgelost in 900 ml gedestilleerd en gedemineraliseerd water. Deze oplossing werd met 5 geconcentreerd fosforzuur pA (Merck) op pH 6,0 gebracht. Het geheel werd daarna met dezelfde kwaliteit water aangevuld tot 1,0 1.
B. Tetramethylbenzidine (Fluka, Buchs, Zwitserland) werd opgelost in dimethylsulfoxide pA (Merck) tot 10 een concentratie van 10 g/1.
C. Per liter buffer A werd 10 ml van oplossing B langzaam en onder roeren toegevoegd. Aan de heldere oplossing werd nog 100 mikroliter 30% waterstofperoxide pA (Merck) toegevoegd.
15
Per cup werd 200 mikroliter van de gebufferde substraat-waterstofdonor oplossing gepipetteerd, en de plaat gedurende 60 minuten weggezet. Daarna werd de reaktie gestopt door toevoeging van 50 mikroliter 20 2 mol/1 zwavelzuur. Tenslotte werden de extincties (R) gemeten in een Titertek Multiskan apparaat (Organon Teknika Int., Turnhout, België) bij 450 nanometer.
25 De gemeten extincties werden gemiddeld.
Achtereenvolgens werden berekend (gaande van 100 naar 0 ml.E.) de extincties 1,165; 0,984; 0,865; 0,720; 0,496; 0,358; 0,184. De gemiddelde extinctie van het onbekende monster bedroeg 0,783.
30 Hieruit werd berekend dat het onbekende serum 55 ml.E. FSH/ml bevat.
800 1 972 # Vr - 8 -
Voorbeeld 2
Dezelfde bepaling als in voorbeeld 1 tot en met het wassen van de cups met gedestilleerd en gedemineraliseerd water, 5
De kleuring werd als volgt uitgevoerd: A. a) 12,0 g azijnzuur (Merck) werd met gedestil leerd en gedemineraliseerd water verdund tot 1,0 1.
10 b) 27,2 g natriumacetaat,3 1^0 (Merck) werd als boven opgelost in 1,0 1 water, c) 95 ml verdund azijnzuur a) werd gemengd met 905 ml acetaatoplossing b); de pH bedroeg 5,6. Hieraan werd toegevoegd 20 ml 15 Ν,Ν-dimethylformamide (Merck, kwaliteit
Uvasol^).
B. 1 liter van de buffer A.c) werd opgeroerd met 10 g 3,3'-dimethyl-5,5’-diethylbenzidine (smeltpunt 71 °C) gedurende 1 uur, waarna de oplossing 20 helder werd gefiltreerd door een vouwfilter. Tenslotte werd 100 μΐ 30% waterstofperoxide pA (Merck) toegevoegd.
Per cup werd 200 mikroliter van de gebufferde 25 substraat-waterstofdonor oplossing gepipetteerd.
De plaat werd gedurende 75 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. De enzymreaktie werd gestopt door toevoeging van 50 mikroliter 3 mol/1 trifluorazijn-zuur .(Merck, kwaliteit Uvasol' ').
30
De meting was geheel conform voorbeeld 1, gebruikmakend van het 450 nanometer filter. De gemiddelde waarden waren achtereenvolgens voor de standaarden 1,233; 1,130; 0,995; 0,757; 0,485; 0,327; 35 0,146. De gemiddelde waarde gemeten aan het monster bedroeg 0,823. Het te onderzoeken serum bevat dus 53 ml.E. PSH per milliliter.
800 1 9 72
Claims (4)
1. Werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuunperoxidase aktiviteit met 3,3^5,51 -tetra-alkylbenzidine derivaten als chromogene waterstof-donor, met het kenmerk, dat de waterstofdonor wordt opgelost in een waterige buffer die een met water mengbare aprotische vloeistof bevat, de enzymreaktie na incubatie wordt gestopt met een verdund niet-oxiderend zuur met een sterkte-exponent bij 25 °C van ^ 2,00 en de extinctie van het gevormde chromofoor wordt gemeten bij de golflengte van het enkele absorptiemaximum tussen 300 en 700 nanometer.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de aprotische vloeistof dimethylsulfoxide is.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de aprotische vloeistof 1,4-dioxaan is.
4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het verdunde niet-oxiderende zuur zwavelzuur is. 800 1 9 72
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8001972A NL8001972A (nl) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuumperoxidase aktiviteit. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8001972 | 1980-04-03 | ||
| NL8001972A NL8001972A (nl) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuumperoxidase aktiviteit. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8001972A true NL8001972A (nl) | 1981-11-02 |
Family
ID=19835107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8001972A NL8001972A (nl) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuumperoxidase aktiviteit. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NL (1) | NL8001972A (nl) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0103915A1 (en) * | 1982-08-17 | 1984-03-28 | Akzo N.V. | Improved visual reading of colour tests |
| US4503143A (en) * | 1982-08-20 | 1985-03-05 | Btc Diagnostics Limited Partnership | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen |
| WO1985005688A1 (en) * | 1984-06-01 | 1985-12-19 | Travenol-Genetech Diagnostics | Assay of peroxidase enzyme activity |
| WO1988003649A1 (en) * | 1986-11-12 | 1988-05-19 | Rijksuniversiteit Utrecht | Process for detecting, identifying and/or quantifying of circulating immune complexes in blood serum |
| US4824784A (en) * | 1985-04-08 | 1989-04-25 | Hygeia Sciences, Incorporated | Chromogenic solution for immunoassay |
| EP0307975A3 (en) * | 1985-03-07 | 1989-06-28 | Celltech Diagnostics Limited | Improvements relating to assay reagents |
| US4868108A (en) * | 1985-12-12 | 1989-09-19 | Hygeia Sciences, Incorporated | Multiple-antibody detection of antigen |
| US4886760A (en) * | 1985-01-31 | 1989-12-12 | Savyon Diagnostics Limited | Stable chemical compositions containing chromogenic materials, peroxides, and stabilizing chemicals |
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
-
1980
- 1980-04-03 NL NL8001972A patent/NL8001972A/nl not_active Application Discontinuation
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0103915A1 (en) * | 1982-08-17 | 1984-03-28 | Akzo N.V. | Improved visual reading of colour tests |
| US4503143A (en) * | 1982-08-20 | 1985-03-05 | Btc Diagnostics Limited Partnership | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen |
| WO1985005688A1 (en) * | 1984-06-01 | 1985-12-19 | Travenol-Genetech Diagnostics | Assay of peroxidase enzyme activity |
| US4596770A (en) * | 1984-06-01 | 1986-06-24 | Travenol-Genetech Diagnostics | Assay of peroxidase enzyme activity |
| US4886760A (en) * | 1985-01-31 | 1989-12-12 | Savyon Diagnostics Limited | Stable chemical compositions containing chromogenic materials, peroxides, and stabilizing chemicals |
| EP0307975A3 (en) * | 1985-03-07 | 1989-06-28 | Celltech Diagnostics Limited | Improvements relating to assay reagents |
| US4824784A (en) * | 1985-04-08 | 1989-04-25 | Hygeia Sciences, Incorporated | Chromogenic solution for immunoassay |
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
| US4868108A (en) * | 1985-12-12 | 1989-09-19 | Hygeia Sciences, Incorporated | Multiple-antibody detection of antigen |
| WO1988003649A1 (en) * | 1986-11-12 | 1988-05-19 | Rijksuniversiteit Utrecht | Process for detecting, identifying and/or quantifying of circulating immune complexes in blood serum |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3653841A (en) | Methods and compositions for determining glucose in blood | |
| SU680635A3 (ru) | Способ определени перекиси водорода | |
| US4503143A (en) | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen | |
| US7381797B2 (en) | Stabilization of H2O2 under alkaline conditions for use in luminescence, fluorescence and colorimetric assays for enhanced detection of peroxidase type assays | |
| US20020146754A1 (en) | Immunochromato device and method for measuring samples using the same | |
| NL7905350A (nl) | Onderzoekinstrument voor de detectie van bilirubine; werkwijze voor de vervaardiging van het onderzoekin- strument; werkwijze voor het detecteren van bilirubine. | |
| US3668076A (en) | Diagnostic agent | |
| DE10111392A1 (de) | Bioanalytisches Messverfahren unter Verwendung von Oxidasen | |
| JPS5813398A (ja) | 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペルオキシダ−ゼもしくはペルオキシダ−ゼのように作用する物質を検出するための剤および方法 | |
| NL8001972A (nl) | Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuumperoxidase aktiviteit. | |
| WO1999001768A1 (en) | Peroxidase-catalysed fluorescence | |
| EP1618377B1 (en) | Chromogenic substrate with a ph indicator dye | |
| WO1981001883A1 (en) | Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry | |
| JPS61138163A (ja) | 発色性カップラー及び過酸化水素又は他の被分析物の測定へのその使用 | |
| JPS63179251A (ja) | アルカリ金属イオン濃度の測定法 | |
| EP0075982B1 (en) | Immunofluorescence reagents, and the method for their preparation | |
| Templeton et al. | Time-resolved fluorescence detection of enzyme-amplified lanthanide luminescence for nucleic acid hybridization assays | |
| US3853476A (en) | Diagnostic agent for the detection of bilirubin | |
| DK167159B1 (da) | Reagens og fremgangsmaade til bestemmelse af gamma-glutamyltransferase | |
| US5215890A (en) | Chromogenic substrate to peroxidase enzymes | |
| US5043269A (en) | Chromogenic substrate to peroxidase enzymes | |
| US3667915A (en) | Colorimetric methods and compositions for determining iron in blood | |
| US4290771A (en) | Diagnostic agent for the detection of urobilinogen | |
| US5597702A (en) | Automated lead assay | |
| SU416969A3 (nl) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BI | The patent application has been withdrawn |