NL8001972A - Peroxidase determn. in enzyme immunoassay - using tetra:alkyl-benzidine as chromogenic hydrogen donor - Google Patents
Peroxidase determn. in enzyme immunoassay - using tetra:alkyl-benzidine as chromogenic hydrogen donor Download PDFInfo
- Publication number
- NL8001972A NL8001972A NL8001972A NL8001972A NL8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A NL 8001972 A NL8001972 A NL 8001972A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- hydrogen donor
- peroxidase
- determn
- enzyme reaction
- chromogenic
- Prior art date
Links
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 title claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title abstract 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenyl beta-D-alloside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 peroxide compound Chemical class 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- GVQNHORDCKLWPE-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3-ethyl-5-methylphenyl)-2-ethyl-6-methylaniline Chemical compound CC1=C(N)C(CC)=CC(C=2C=C(CC)C(N)=C(C)C=2)=C1 GVQNHORDCKLWPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
* ΟΑ/8040-072 Douma Akzo N.V. te Arnhem* ΟΑ / 8040-072 Douma Akzo N.V. in Arnhem
Verbeterde werkwijze voor het aantonen en bepalen van immuunperoxidase aktiviteit.Improved method for detecting and determining immune peroxidase activity.
De uitvinding heeft betrekking op een verbeterde methode voor het aantonen en bepalen van "immuunperoxidase" aktiviteit, met name de kleurreaktie zoals die wordt toegepast bij immunochemische 5 bepalingen waarbij een hapteen, antigeen of anti-lichaam is gekoppeld aan het enzym peroxidase.The invention relates to an improved method for detecting and determining "immune peroxidase" activity, in particular the color reaction as used in immunochemical assays in which a hapten, antigen or antibody is coupled to the enzyme peroxidase.
Om de aktiviteit van dit gekoppelde enzym te bepalen maakt men doorgaans gebruik van waterstofperoxide of een andere peroxide verbinding, waaraan 10 een chromogene waterstofdonor wordt toegevoegd.In order to determine the activity of this coupled enzyme, hydrogen peroxide or another peroxide compound is usually used, to which a chromogenic hydrogen donor is added.
Deze laatste component wordt onder invloed van het enzym door het peroxide geoxideerd, waarbij een chromofoor reaktieprodukt ontstaat dat colori-metrisch of spektrofotometrisch kan worden gemeten, 15 en waarvan de concentratie in relatie kan worden gebracht met de hoeveelheid enzym (resp. aktiviteit) van het koppelingsprodukt.The latter component is oxidized by the peroxide under the influence of the enzyme, resulting in a chromophore reaction product which can be measured colorimetrically or electrophotometrically, and whose concentration can be related to the amount of enzyme (or activity) of the coupling product.
De keuze van een geschikte waterstofdonor voor dergelijke reakties is niet eenvoudig. Deze 20 moet in de eerste plaats voldoende oplosbaar zijn in het waterig milieu waarin de enzymreaktie plaats vindt, en mag de enzymreaktie niet versnellen of remmen. De waterstofdonor mag verder niet al te gevoelig zijn voor luchtoxidatie en niet met de 25 peroxideverbinding of andere komponenten van het reaktiesysteem reageren. Het gevormde oxidatieprodukt moet tenslotte bij voorkeur een enkelvoudige stof zijn en mag geen secundaire reakties met het milieu en het gebruikte reaktievat aangaan.Choosing a suitable hydrogen donor for such reactions is not easy. First, it must be sufficiently soluble in the aqueous medium in which the enzyme reaction takes place, and must not accelerate or inhibit the enzyme reaction. Furthermore, the hydrogen donor should not be too sensitive to air oxidation and should not react with the peroxide compound or other components of the reaction system. Finally, the oxidation product formed should preferably be a single substance and must not enter secondary reactions with the environment and the reaction vessel used.
30 Meestal kiest men de waterstofdonor uit de groep van fenolen, aromatische aminen, leukokleur-stoffen, heterocyclische verbindingen e.d.Typically, the hydrogen donor is selected from the group of phenols, aromatic amines, leuco dyes, heterocycles, and the like.
800 1 9 72 *' t - 2 -800 1 9 72 * t - 2 -
Een zeer belangrijk bezwaar van stoffen, welke overigens redelijk voldoen aan de hierboven geschetste eigenschappen is, dat ze soms sterk mutageen of zeer carcinogeen zijn en derhalve 5 slechts onder zeer scrupuleuze voorzorgen mogen worden gebruikt.·A very important drawback of substances which, moreover, reasonably meet the properties outlined above, is that they are sometimes highly mutagenic or very carcinogenic and may therefore only be used under very scrupulous precautions.
Het behoort tot de stand van de techniek dat voor peroxidasereakties 3,3*,5,5* tetra-alkylbenzidine derivaten als waterstofdonor kunnen 10 worden gebruikt, welke niet of nauwelijks mutageen of carcinogeen zijn. Deze waterstofdonoren bleken tot nu toe zeer geschikt voor het aantonen van occult bloed in urine en faeces, en als oxidatie-indicatoren bij andere snel uit te voeren proeven 15 zoals b.v. geschiedt bij het gebruik van diagnostische teststrookjes. Daarentegen was het niet goed mogelijk deze verbindingen toe te passen in het waterig milieu waarin immunochemische reakties ter bepaling van haptenen, antigenen en anti-20 lichamen zich voltrekken, en waarvoor soms relatief lange incubatietijden nodig zijn om gevoelige bepalingsmethoden te verkrijgen.It is known in the art that for peroxidase reactions 3.3 *, 5.5 * tetraalkylbenzidine derivatives can be used as hydrogen donor, which are not or hardly mutagenic or carcinogenic. These hydrogen donors have hitherto proved to be very suitable for detecting occult blood in urine and faeces, and as oxidation indicators in other rapid tests such as e.g. occurs when using diagnostic test strips. On the other hand, it has not been possible to use these compounds in the aqueous medium in which immunochemical reactions to determine hapten, antigens and antibodies take place, and which sometimes require relatively long incubation times to obtain sensitive assay methods.
Verrassenderwijs werd nu gevonden dat men deze "immuunperoxidase" aktiviteit kan aantonen en 25 bepalen met 3,3’,5,5’-tetraalkylbenzidinederivaten als chromogene waterstofdonoren, met het kenmerk dat de waterstofdonor wordt opgelost in een waterige buffer die een met water mengbare aprotische vloeistof bevat, de ênzymreaktie na inkubatie wordt gestopt 30 met een verdund niet-oxiderend zuur met een sterkte-exponent bij 25 °C ^ 2,00 en de extinctie van het gevormde chromofoor wordt gemeten bij de golflengte van het enkele absorptiemaximum tussen 300 en 700 nanometer.Surprisingly, it has now been found that one can detect and determine this "immune peroxidase" activity with 3,3 ', 5,5'-tetraalkylbenzidine derivatives as chromogenic hydrogen donors, characterized in that the hydrogen donor is dissolved in an aqueous buffer containing a water-miscible aprotic liquid, the enzyme reaction after incubation is stopped with a dilute non-oxidizing acid with a strength exponent at 25 ° C. ^ 2.00 and the absorbance of the chromophore formed is measured at the wavelength of the single absorption maximum between 300 and 700 nanometer.
35 Volgens de werkwijze van de uitvinding past men 3,3',5,5'-tetraalkylbenzidinen toe waarbij de alkyl-groepen maximaal 6 koolstofatomen bevatten en 800 1 9 72 * * -- ' » - 3 - lineaire of vertakte ketens hebben, doch bij voorkeur methyl en/of ethylgroepen bevatten, en in de vorm van vrije basen beschikbaar zijn.According to the process of the invention, 3,3 ', 5,5'-tetraalkylbenzidines are used, the alkyl groups containing up to 6 carbon atoms and having 800 linear or branched chains, but preferably contain methyl and / or ethyl groups, and are available in the form of free bases.
In vergelijking tot andere waterstofdonoren 5 is de oplosbaarheid van deze verbindingen in waterige systemen te gering om in de "immuun-peroxidase" systemen een concentratie van het te meten chromofoor van voldoende hoogte te bereiken. Derhalve werd getracht geschikte organische oplos-10 middelen te vinden die, toegevoegd aan het waterig buffersysteem tegelijkertijd een verhoging van de oplosbaarheid van de waterstofdonor te bewerken, terwijl het verloop van de enzymatische reakties er niet door wordt verstoord. Verrassenderwijze 15 bleken de geschikte oplosmiddelen te kunnen worden geselecteerd uit de groep van de volledig met water mengbare aprotische vloeistoffen, bij voorkeur dimethylsulfoxide, 1,4-dioxaan en dimethylformamide.Compared to other hydrogen donors, the solubility of these compounds in aqueous systems is too low to achieve a concentration of the chromophore to be measured in the "immune peroxidase" systems of sufficient height. Therefore, an attempt was made to find suitable organic solvents which, when added to the aqueous buffer system, simultaneously effect an increase in the solubility of the hydrogen donor, while not interfering with the course of the enzymatic reactions. Surprisingly, it has been found that the suitable solvents can be selected from the group of fully water-miscible aprotic liquids, preferably dimethyl sulfoxide, 1,4-dioxane and dimethylformamide.
In aanwezigheid van deze oplosmiddelen bleken de 20 waterstofdonoren ook weinig of niet gevoelig voor lucht- en fotochemische oxidatie. De wijze waarop de waterstofdonor in het buffersysteem wordt opgelost kan op twee manieren geschieden. Men kan het aprotische oplosmiddel aan de te gebruiken waterige 25 buffer toevoegen, en onder constant roeren de afgewogen hoeveelheid waterstofdonor in oplossing brengen. Beter is het om een afgemeten hoeveelheid van de waterstofdonor, opgëlost in het aprotische oplosmiddel, aan de waterige buffer toe te voegen.In the presence of these solvents, the hydrogen donors were also found to be little or not sensitive to air and photochemical oxidation. The way in which the hydrogen donor is dissolved in the buffer system can be done in two ways. The aprotic solvent can be added to the aqueous buffer to be used and the weighed amount of hydrogen donor dissolved with constant stirring. It is better to add a measured amount of the hydrogen donor dissolved in the aprotic solvent to the aqueous buffer.
30 De concentratie van het aprotisch oplosmiddel is bij voorkeur 1-2%, hoewel deze nog aanzienlijk groter kan zijn zonder dat de enzymreaktie daar merkbaar door wordt gestoord.The concentration of the aprotic solvent is preferably 1-2%, although it can be considerably larger without noticeably interfering with the enzyme reaction.
Tijdens de inkubatie, b.v. in een Mcllvaine 35 buffer pH 5,0 of in een acetaatbuffer pH 5,5, ontwikkelt zich een chromofoor die een blauwgroene tot blauwe kleur bezit, afhankelijk van de aktiviteit 800 1 9 72 - 4 - van het immuunperoxidase. Voor kwalitatieve doeleinden is dit een geschikte kleuromslag, doch deze blijkt bij enige uren staan nagenoeg volledig verdwenen te zijn.During the incubation, e.g. in a Mcllvaine 35 buffer pH 5.0 or in an acetate buffer pH 5.5, a chromophore having a blue-green to blue color develops, depending on the activity 800 1 9 72-4 of the immune peroxidase. This is a suitable color change for qualitative purposes, but it appears to have disappeared almost completely after a few hours of standing.
5 Voor kwantitatieve bepalingen wordt de reaktie na een vastgestelde tijd gestopt. Dit geschiedt b.v. door het overgebleven peroxide-substraat te verwijderen, b.v. met natriumthiosulfaat of natrium-nitriet. Ook kan men de enzymwerking blokkeren 10 door het toevoegen van natriumazide, zware metalen of vrij hoge concentraties thiomersalaat (NaOOC. C6H4.S.Hg.C2H5>.For quantitative determinations, the reaction is stopped after a set time. This is done e.g. by removing the remaining peroxide substrate, e.g. with sodium thiosulfate or sodium nitrite. The enzyme activity can also be blocked by adding sodium azide, heavy metals or rather high concentrations of thiomersalate (NaOOC. C6H4.S.Hg.C2H5>.
De genoemde mogelijkheden blijken bij de waterstofdonoren van deze uitvinding niet te voldoen 15 en gaven geen stabiele kleurontwikkeling te zien. Aanzienlijk betere resultaten werden verkregen met de toevoeging van verdunde, niet-oxiderende, sterke zuren. In aanwezigheid van de aprotische oplosmiddelen als in het bovenstaande aangeduid, ontwikkelden 20 zich hierbij stabiele heldergele oplossingen van het chromofoor, welke bij omstreeks 450 nanometer konden worden gemeten.The abovementioned possibilities are found to be unsatisfactory with the hydrogen donors of this invention and did not show stable color development. Significantly better results were obtained with the addition of dilute, non-oxidizing, strong acids. In the presence of the aprotic solvents as indicated above, stable bright yellow solutions of the chromophore developed, which could be measured at approximately 450 nanometers.
Van belang bleek de sterkte van het gebruikte zuur, m.a.w. de dissociatieconstante K hiervan. De 25 negatieve logarithme van deze dissociatieconstante is de pK, de sterkte-exponent. Alle zuren met een sterkte exponent (bij 25 °C) ^ 2,00 geven een absorptie-spectrum tussen 350 en 700 nm met slechts één absorptie-maximum bij omstreeks 450 nm. De incubatievloeistof, 30 gemeten vóór het stoppen van de enzymreaktie, heeft een spectrum dat absorptiemaxima bij ca. 650 nm en - afhankelijk van de enzymconcentratie méér of minder hoog - bij omstreeks 450 nm. Door toevoeging van zuren met een sterkte-exponent >y 2,00 (25 °C) ver-• 35 andert het spectrum gedeeltelijk ten gunste van het 450 nm maximum, doch het maximum bij omstreeks 650 nm blijft aanwezig.The strength of the acid used was found to be important, in other words the dissociation constant K thereof. The negative logarithm of this dissociation constant is the pK, the strength exponent. All acids with a strength exponent (at 25 ° C) ^ 2.00 give an absorption spectrum between 350 and 700 nm with only one absorption maximum at about 450 nm. The incubation liquid, measured before stopping the enzyme reaction, has a spectrum that absorption maxima at about 650 nm and - depending on the enzyme concentration more or less high - at about 450 nm. By adding acids with a strength exponent> y 2.00 (25 ° C), the spectrum partially changes in favor of the 450 nm maximum, but the maximum at about 650 nm remains.
800 1 9 72 - 5 -800 1 9 72 - 5 -
Geschikte zuren voor het stoppen van de enzyra-reaktie zijn b.v. zwavelzuur, zoutzuur en trifluor.-azijnzuur. Oxiderende zuren zoals salpeterzuur en perchloorzuur bewerken eveneens een verschuiving 5 van het absorptiespectrum naar omstreeks 450 nm.Suitable acids for stopping the enzyme reaction are e.g. sulfuric acid, hydrochloric acid and trifluoro-acetic acid. Oxidizing acids such as nitric acid and perchloric acid also effect a shift of the absorption spectrum to about 450 nm.
Doch zij zijn ongeschikt omdat ze het gevormde chromofoor verder oxideren, zodat de stoechiometrie van de enzymreaktie verloren gaat. Bovendien hebben zij de eigenschap eiwitachtige stoffen uit het enzym- 10 reaktiemengsel te kunnen precipiteren, zodat een kwantitatieve meting zonder verdere voorzorgen onmogelijk wordt.However, they are unsuitable because they further oxidize the chromophore formed, so that the stoichiometry of the enzyme reaction is lost. In addition, they have the property of being able to precipitate proteinaceous substances from the enzyme reaction mixture, so that a quantitative measurement without further precautions becomes impossible.
De voordelen van de werkwijze volgens de uit-• vinding zijn zeer evident. Allereerst is de enzym-• 15 reaktie niet gevoelig voor de invloed van licht zoals b.v. het geval is bij het gebruik van o-phenyleendiamine als waterstofdonor. De uitvoering kan dus gewoon in het laboratorium plaats vinden, zonder dat de reaktievaatjes in het donker moeten 20 worden weggezet.The advantages of the method according to the invention are very obvious. First of all, the enzyme reaction is not sensitive to the influence of light such as e.g. is the case when using o-phenylenediamine as a hydrogen donor. The execution can therefore simply take place in the laboratory, without the reaction vessels having to be put away in the dark.
Verder is het reaktiesysteem volgens de uitvinding zéér gevoelig omdat de moleculaire extinctie bij omstreeks 450 nm veel groter is dan bij omstreeks 650 nm.Furthermore, the reaction system according to the invention is very sensitive because the molecular extinction at about 450 nm is much greater than at about 650 nm.
25 Tenslotte zijn de nauwkeurigheid en reprodu ceerbaarheid van het onderhavige systeem veel groter dan bij vroegere systemen.Finally, the accuracy and reproducibility of the present system are much greater than with previous systems.
De kern van de uitvinding wordt gedemonstreerd in de navolgende voorbeelden.The core of the invention is demonstrated in the following examples.
30 800 1 9 72 - 6 - V-30 800 1 9 72 - 6 - V-
Voorbeeld l (p\Example l (p \
Een Cooke Microtiter plaat (8 x 12 cups; polystyreen; fa. C.A. Greiner & SÖhne, NÜrtingen (BRD)) werd gecoat met een passende hoeveelheid 5 en verdunning gezuiverd IgG dat werd geïsoleerd uit het serum van een schaap dat geïmmuniseerd was met hypofysair FSH van menselijke oorsprong.A Cooke Microtiter plate (8 x 12 cups; polystyrene; fa. CA Greiner & SÖhne, Nürtingen (BRD)) was coated with an appropriate amount of 5 and dilution of purified IgG isolated from the serum of a sheep immunized with pituitary FSH of human origin.
In de cups werd een reeks oplossingen van hypofysair FSH gebracht, bevattende 100, 80, 60, 40, 10 20, 10 en 0 ml.E. per milliliter in menselijk serum. De oplossingen, elk met een volume van 100 mikroliter, werden in viervoud opgebracht. Bovendien werd, eveneens in 4-voud, 100 mikroliter van een onbekend menselijk serum opgebracht.A series of pituitary FSH solutions containing 100, 80, 60, 40, 20, 10 and 0 ml were introduced into the cups. per milliliter in human serum. The solutions, each with a volume of 100 microliters, were applied in quadruplicate. In addition, 100 microliters of an unknown human serum were applied, also in 4-fold.
15 De plaat werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur weggezet om het te bepalen antigeen met de anti-lichamen op de plaat te laten reageren. Daarna werden de cups viermaal gewassen met een TRIS-Tween buffer, bevattende 0,2 mol/1 Tris(hydroxymethyl) 20 aminomethaan (Sigma, München, BRD) en 0,2 mol/1 natriumchloride (Merck, Darmstadt, BRD); per liter was 0,5 ml polyoxyethyleensorbitan monolaureaat (Sigma, München, BRD) aan deze wasbuffer toegevoegd.The plate was left at room temperature for 2 hours to react the antigen to be determined with the antibodies on the plate. The cups were then washed four times with a TRIS-Tween buffer containing 0.2 mol / l Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Sigma, Munich, BRD) and 0.2 mol / 1 sodium chloride (Merck, Darmstadt, BRD); 0.5 ml of polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Sigma, Munich, BRD) was added to this washing buffer per liter.
Vervolgens werden de cups gevuld met 100 mikro-25 liter van een verdunde oplossing van een conjugaat, dat verkregen was door anti-FSH IgG te koppelen aan mierikswortelperoxidase (HRP; Boehringer, Mannheim, BRD). Bij kamertemperatuur werd wederom twee uur geïncubeerd, om de gemerkte antistof te laten reageren 30 met het FSH uit standaarden en monster. Vervolgens werden de .cups viermaal gewassen met de hierboven beschreven wasbuffer, en daarna viermaal met gedestilleerd en gedemineraliseerd water.The cups were then filled with 100 micro-25 liters of a dilute conjugate solution obtained by coupling anti-FSH IgG to horseradish peroxidase (HRP; Boehringer, Mannheim, BRD). Incubation was again for two hours at room temperature to react the labeled antibody with the FSH from standards and sample. The cups were then washed four times with the wash buffer described above, then four times with distilled and demineralized water.
800 1 9 72 - 7 -800 1 9 72 - 7 -
De kleuring werd als volgt uitgevoerd: A. 8,82 g trinatriumcitraat.^O pA (Merck, Darmstadt BRD) werd opgelost in 900 ml gedestilleerd en gedemineraliseerd water. Deze oplossing werd met 5 geconcentreerd fosforzuur pA (Merck) op pH 6,0 gebracht. Het geheel werd daarna met dezelfde kwaliteit water aangevuld tot 1,0 1.Staining was carried out as follows: A. 8.82 g trisodium citrate. O pA (Merck, Darmstadt BRD) was dissolved in 900 ml distilled and demineralized water. This solution was adjusted to pH 6.0 with 5 concentrated phosphoric acid pA (Merck). The whole was then made up to 1.0 l with the same quality of water.
B. Tetramethylbenzidine (Fluka, Buchs, Zwitserland) werd opgelost in dimethylsulfoxide pA (Merck) tot 10 een concentratie van 10 g/1.B. Tetramethylbenzidine (Fluka, Buchs, Switzerland) was dissolved in dimethyl sulfoxide pA (Merck) to a concentration of 10 g / l.
C. Per liter buffer A werd 10 ml van oplossing B langzaam en onder roeren toegevoegd. Aan de heldere oplossing werd nog 100 mikroliter 30% waterstofperoxide pA (Merck) toegevoegd.C. Per liter of buffer A, 10 ml of solution B was added slowly and with stirring. An additional 100 microliters of 30% hydrogen peroxide pA (Merck) was added to the clear solution.
1515
Per cup werd 200 mikroliter van de gebufferde substraat-waterstofdonor oplossing gepipetteerd, en de plaat gedurende 60 minuten weggezet. Daarna werd de reaktie gestopt door toevoeging van 50 mikroliter 20 2 mol/1 zwavelzuur. Tenslotte werden de extincties (R) gemeten in een Titertek Multiskan apparaat (Organon Teknika Int., Turnhout, België) bij 450 nanometer.200 microliters of the buffered substrate-hydrogen donor solution were pipetted per cup, and the plate was left for 60 minutes. The reaction was then stopped by addition of 50 microliters of 2 mol / 1 sulfuric acid. Finally, the extinctions (R) were measured in a Titertek Multiskan device (Organon Teknika Int., Turnhout, Belgium) at 450 nanometers.
25 De gemeten extincties werden gemiddeld.The measured extinctions were averaged.
Achtereenvolgens werden berekend (gaande van 100 naar 0 ml.E.) de extincties 1,165; 0,984; 0,865; 0,720; 0,496; 0,358; 0,184. De gemiddelde extinctie van het onbekende monster bedroeg 0,783.The extinctions 1.165 were calculated sequentially (ranging from 100 to 0 ml. E.); 0.984; 0.865; 0.720; 0.496; 0.358; 0.184. The mean absorbance of the unknown sample was 0.783.
30 Hieruit werd berekend dat het onbekende serum 55 ml.E. FSH/ml bevat.From this it was calculated that the unknown serum was 55 ml. FSH / ml.
800 1 972 # Vr - 8 -800 1 972 # Fr - 8 -
Voorbeeld 2Example 2
Dezelfde bepaling als in voorbeeld 1 tot en met het wassen van de cups met gedestilleerd en gedemineraliseerd water, 5The same determination as in example 1 to washing the cups with distilled and demineralized water, 5
De kleuring werd als volgt uitgevoerd: A. a) 12,0 g azijnzuur (Merck) werd met gedestil leerd en gedemineraliseerd water verdund tot 1,0 1.The staining was carried out as follows: A. a) 12.0 g of acetic acid (Merck) was diluted to 1.0 1 with distilled and demineralized water.
10 b) 27,2 g natriumacetaat,3 1^0 (Merck) werd als boven opgelost in 1,0 1 water, c) 95 ml verdund azijnzuur a) werd gemengd met 905 ml acetaatoplossing b); de pH bedroeg 5,6. Hieraan werd toegevoegd 20 ml 15 Ν,Ν-dimethylformamide (Merck, kwaliteitB) 27.2 g of sodium acetate, 3 1 ^ 0 (Merck) was dissolved in 1.0 l of water as above, c) 95 ml of dilute acetic acid a) was mixed with 905 ml of acetate solution b); the pH was 5.6. To this was added 20 ml of 15 Ν, Ν-dimethylformamide (Merck, quality
Uvasol^).Uvasol ^).
B. 1 liter van de buffer A.c) werd opgeroerd met 10 g 3,3'-dimethyl-5,5’-diethylbenzidine (smeltpunt 71 °C) gedurende 1 uur, waarna de oplossing 20 helder werd gefiltreerd door een vouwfilter. Tenslotte werd 100 μΐ 30% waterstofperoxide pA (Merck) toegevoegd.B. 1 liter of buffer A.c) was stirred with 10 g of 3,3'-dimethyl-5,5'-diethylbenzidine (melting point 71 ° C) for 1 hour, after which the solution was filtered clear through a pleated filter. Finally, 100 μΐ 30% hydrogen peroxide pA (Merck) was added.
Per cup werd 200 mikroliter van de gebufferde 25 substraat-waterstofdonor oplossing gepipetteerd.200 microliters of the buffered substrate hydrogen donor solution were pipetted per cup.
De plaat werd gedurende 75 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. De enzymreaktie werd gestopt door toevoeging van 50 mikroliter 3 mol/1 trifluorazijn-zuur .(Merck, kwaliteit Uvasol' ').The plate was incubated at room temperature for 75 minutes. The enzyme reaction was stopped by addition of 50 microliters of 3 mol / l trifluoroacetic acid (Merck, quality Uvasol '').
3030
De meting was geheel conform voorbeeld 1, gebruikmakend van het 450 nanometer filter. De gemiddelde waarden waren achtereenvolgens voor de standaarden 1,233; 1,130; 0,995; 0,757; 0,485; 0,327; 35 0,146. De gemiddelde waarde gemeten aan het monster bedroeg 0,823. Het te onderzoeken serum bevat dus 53 ml.E. PSH per milliliter.The measurement was entirely in accordance with Example 1, using the 450 nanometer filter. The mean values were successively for the standards 1,233; 1,130; 0.995; 0.757; 0.485; 0.327; 35 0.146. The mean value measured on the sample was 0.823. The serum to be examined therefore contains 53 ml. E. PSH per milliliter.
800 1 9 72800 1 9 72
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8001972A NL8001972A (en) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Peroxidase determn. in enzyme immunoassay - using tetra:alkyl-benzidine as chromogenic hydrogen donor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8001972 | 1980-04-03 | ||
| NL8001972A NL8001972A (en) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Peroxidase determn. in enzyme immunoassay - using tetra:alkyl-benzidine as chromogenic hydrogen donor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8001972A true NL8001972A (en) | 1981-11-02 |
Family
ID=19835107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8001972A NL8001972A (en) | 1980-04-03 | 1980-04-03 | Peroxidase determn. in enzyme immunoassay - using tetra:alkyl-benzidine as chromogenic hydrogen donor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NL (1) | NL8001972A (en) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0103915A1 (en) * | 1982-08-17 | 1984-03-28 | Akzo N.V. | Improved visual reading of colour tests |
| US4503143A (en) * | 1982-08-20 | 1985-03-05 | Btc Diagnostics Limited Partnership | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen |
| WO1985005688A1 (en) * | 1984-06-01 | 1985-12-19 | Travenol-Genetech Diagnostics | Assay of peroxidase enzyme activity |
| WO1988003649A1 (en) * | 1986-11-12 | 1988-05-19 | Rijksuniversiteit Utrecht | Process for detecting, identifying and/or quantifying of circulating immune complexes in blood serum |
| US4824784A (en) * | 1985-04-08 | 1989-04-25 | Hygeia Sciences, Incorporated | Chromogenic solution for immunoassay |
| EP0307975A3 (en) * | 1985-03-07 | 1989-06-28 | Celltech Diagnostics Limited | Improvements relating to assay reagents |
| US4868108A (en) * | 1985-12-12 | 1989-09-19 | Hygeia Sciences, Incorporated | Multiple-antibody detection of antigen |
| US4886760A (en) * | 1985-01-31 | 1989-12-12 | Savyon Diagnostics Limited | Stable chemical compositions containing chromogenic materials, peroxides, and stabilizing chemicals |
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
-
1980
- 1980-04-03 NL NL8001972A patent/NL8001972A/en not_active Application Discontinuation
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0103915A1 (en) * | 1982-08-17 | 1984-03-28 | Akzo N.V. | Improved visual reading of colour tests |
| US4503143A (en) * | 1982-08-20 | 1985-03-05 | Btc Diagnostics Limited Partnership | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen |
| WO1985005688A1 (en) * | 1984-06-01 | 1985-12-19 | Travenol-Genetech Diagnostics | Assay of peroxidase enzyme activity |
| US4596770A (en) * | 1984-06-01 | 1986-06-24 | Travenol-Genetech Diagnostics | Assay of peroxidase enzyme activity |
| US4886760A (en) * | 1985-01-31 | 1989-12-12 | Savyon Diagnostics Limited | Stable chemical compositions containing chromogenic materials, peroxides, and stabilizing chemicals |
| EP0307975A3 (en) * | 1985-03-07 | 1989-06-28 | Celltech Diagnostics Limited | Improvements relating to assay reagents |
| US4824784A (en) * | 1985-04-08 | 1989-04-25 | Hygeia Sciences, Incorporated | Chromogenic solution for immunoassay |
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
| US4868108A (en) * | 1985-12-12 | 1989-09-19 | Hygeia Sciences, Incorporated | Multiple-antibody detection of antigen |
| WO1988003649A1 (en) * | 1986-11-12 | 1988-05-19 | Rijksuniversiteit Utrecht | Process for detecting, identifying and/or quantifying of circulating immune complexes in blood serum |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3653841A (en) | Methods and compositions for determining glucose in blood | |
| SU680635A3 (en) | Method of determining hydrogen peroxide | |
| US4503143A (en) | Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen | |
| US7381797B2 (en) | Stabilization of H2O2 under alkaline conditions for use in luminescence, fluorescence and colorimetric assays for enhanced detection of peroxidase type assays | |
| US20020146754A1 (en) | Immunochromato device and method for measuring samples using the same | |
| NL7905350A (en) | RESEARCH INSTRUMENT FOR THE DETECTION OF BILIRUBIN; METHOD FOR MANUFACTURING THE RESEARCH INSTRUMENT; METHOD FOR DETECTING BILIRUBINE. | |
| US3668076A (en) | Diagnostic agent | |
| DE10111392A1 (en) | Bioanalytical measurement method using oxidases | |
| JPS5813398A (en) | Agent and method for detecting hydrogen peroxide, substrate containing same, peroxidase and substance having peroxidase like action | |
| NL8001972A (en) | Peroxidase determn. in enzyme immunoassay - using tetra:alkyl-benzidine as chromogenic hydrogen donor | |
| WO1999001768A1 (en) | Peroxidase-catalysed fluorescence | |
| EP1618377B1 (en) | Chromogenic substrate with a ph indicator dye | |
| WO1981001883A1 (en) | Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry | |
| JPS61138163A (en) | Color developing coupler and use to measurement of hydrogen peroxide or other substance to be analyzed | |
| JPS63179251A (en) | Measuring method of alkali metal ion concentration | |
| EP0075982B1 (en) | Immunofluorescence reagents, and the method for their preparation | |
| Templeton et al. | Time-resolved fluorescence detection of enzyme-amplified lanthanide luminescence for nucleic acid hybridization assays | |
| US3853476A (en) | Diagnostic agent for the detection of bilirubin | |
| DK167159B1 (en) | REAGENT AND PROCEDURE FOR DETERMINING GAMMA-GLUTAMYL TRANSFERASE | |
| US5215890A (en) | Chromogenic substrate to peroxidase enzymes | |
| US5043269A (en) | Chromogenic substrate to peroxidase enzymes | |
| US3667915A (en) | Colorimetric methods and compositions for determining iron in blood | |
| US4290771A (en) | Diagnostic agent for the detection of urobilinogen | |
| US5597702A (en) | Automated lead assay | |
| SU416969A3 (en) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BI | The patent application has been withdrawn |