NL8001697A - Werkwijze voor de bereiding van manocolin k. - Google Patents

Description

f 803l04/vd7/cd -1.

Korte Aanduiding :Verkwijze voor de bereiding van Monacolin £*

Be Ïiitvinding heeft betrekking op een webwijze voor de bereiding van een antihyperchole sterolesterend.sch middel Monacolin K, door kweken van bepaalde gespecificeerde micro-organismen van het geslacht Monascus.

^ Monacolin £, met de fomaule 1 van het formuleblad, be schreven in de Hed«octrooiaanvrage 8001041, blijkt een bijzonder waardevolle anti-hyperlipemische, in het bijzonder anti-hypercholes-teremische werking te bezitten·

Het is bekend, dat een hoog cholesterolgehalte in het jq bloed een van de voornaamste oorzaken is van hartaandoeningen, zoals hartinfarct of artereosclerose· Zn verband hiermede heeft men uitgebreide onderzoekingen uitgevoerd met het doel fysiologisch aanvaardbare stoffen te vinden, die in staat zijn de biosynthese van cholesterol te remmen en aldus het cholesterolgehalte in bloed te verlagen*. 15 Een dergelijke verbinding is het in de Ned.octrooiaanvrage 8001041 beschreven Monacolin K, dat verkregen wordt door kweken van micro-organismen van het geslacht Monascus.

Be uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor de bereiding van Monacolin K door kweken van één of meer van de 2o micro-organismen Monascus ank a SAM I0I7I (IFO 6540), Monascus imnmraus SAM 10271 (IFQ 4513), Monascus ruber SAM 10671 (FEHM 4958), Monascus vitreus SAM 10960 (FEBM 4960), Monascus paxii SIM 11172 (ISO 8201), Monascus ruber SAM 13778 (FEHM 4959), Monascus ruber SAM 15^77 (3®ΗΜ 495$) of Monascus ruber SAM 18174 (SEEM 25 4957) in een daarvoor bestemd kweekmedium en extraheren van Monacolin £ uit het gevormde kweekmedium·

Monascus ruber SAM IO67I, Monascus ruber SAM 13778, Monascus ruber SAM 15177 en. Monascus ruber SAM 18174 zijn allen voor het eerst geïsoleerde micro-organismen die nog nader beschre-30 ven zullen worden· Be overige micro-organismen zijn bekend en reeds eerder beschreven· Alle micro-organismen zijn verkrijgbaar bij IFO of SEEM (The Fermentation Eesearch Institute, Agency of Industrial Science and Technology), Ministry of International Trade and 8001697 “ — 2 -

Industry, Japan), onder de tussen haakjes aangegeven depotnummerso Be miero-biologische eigenschappen van de nieuwe micro-organismen zijn als volgt.

Monascus ruber SANK 15177 (FEBM 4956) 5 Bit geslacht is geïsoleerd uit de bodem in Tukimino, Yamaio-

Gity, Kanagawa-prefectuur, Japan en op 27 april 1979 onder No. 4956 hij het eerder genoemde Fermentation Research Institute gedeponeerd.

Het geslacht groeit bij 25°C goed op een aardappel-glucose-agar-medium en levert een oplosbaar gekleurd materiaal met in het me-10 dim een geel-bruine tot rood-bruine kleur en vormt cleistothecen op de basale hyphenlaag. Op havermeel-agar-agar-medium ontstaat een lichtbruin gekleurd materiaal en treedt een goede groei op. Be vorming van sferische cleistothecen met een diameter van 50-60 micron op korte stengels is goed. Be stengels zijn vrijwel kleurloos en vertakt 15 met afmetingen van 25-60 x 3,5-5,0 micron. Be asci verdwijnen en zijn dus moeilijk waar te nemen. Be ascosporen zijn kleurloos en ellipsoid3-vormig en bezitten afmetingen van 4*5-6,5 x 4,0-5,0 micron met een glad oppervlak. Be conidien zijn aan hun basis met elkaar verbonden en bezitten afmetingen van 7*0-10,0 x 6,0-10,0 micron. Hun weefsels 20 zijn gescheurd.

Hoewel de stam bij 37°C groeit wordt de beste groei tussen 23°C en 30°G waargenomen.

Monascus ruber SANK IO67I (EEHM 4956).

Beze stam is geïsoleerd uit de bodem in Shinagawa-ku, Tokio, 25 Japan en op 27 april 1979 onder noe 4958 bij het eerder genoemde Fermentation Research Institute gedeponeerde

Be groei op aardappel-glucose-agar-agar- en havermeel-agar-agar-medium kont overeen met die van de stam SANK 15177» behalve dat de gevormde kleurstof donkerrood is· Be diameter van de cleistothecen 30 bedraagt 30-80 micron en de afmetingen van de stengels zijn 30-70 x '3*0-5,0 microno Asci werden niet waargenomen· Be ascosporen zijn kleurloos en ellipsvormig met afmetingen van 45-6,5 x 4,0-5,0 micron» Be conidien zijn kleurloos en pyrivormig of eivormig met afmetingen van 6,0-10,0 x 6,0-8,5 microno 35 .Monascus ruber SANK 13778 (FEBM 4959)« » 8001697 _ 3 _

Deze stam is geïsoleerd uit de bodem in Inawashir o-cho,

Nagata, Yama-gun, Fiücushima-prefectuur, Japan en op 27 april 1979 one er Ho* 4959 bij het eerder genoemde Fermentation Research Institute gedeponeerd, 5 De groei op aardappel-glucose-agar-agar- en havermeel- agar-agar-medium komt overeen met die van de stam SANE 15177» behalve dat het gevormde oplosbare gekleurde materiaal licht roodbruin tot roodbruin is. De cleistothecen bezitten een diameter van 55-75 micron en de stengels afmetingen van 30-70 x 3»5~5>0 micron. Asci worden niet 10 waargenomen. De ascosporen zijn kleurloos en ellipsvormig met afmetingen van 4,6-6,0 x 4,0-5,0 micron en een glad oppervlak. De afmetingen van de conidien bedragen 7,0-10,0 x 6,0-10,0 micron.

Monascus ruber SANE 18174 (FERM 4957)·

Deze stam is geïsoleerd uit de bodem in Shakotan-cho, Shakotan-15 gun, Shiribeshi Shicho, Eokkaido-prefeotuur, Japan en op april 197? onder No· 4957 hij het eerder genoemde Fermentation Research Institutï gedeponeerd*

De groei op aardappel-glucose-agar-agar- en havermeel-agar-agarmedium komt overeen met die van de stam SANE 15^77> behalve 20 dat het gevormde gekleurde materiaal liehtrose is· De cleistothecen bezitten een diameter .van 20-70 micron en de afmetingen van de stengei.s bedragen 20-60 x 3,0-5,0 micron· Asci werden niet waargenomen· De ascosporen zijn kleurloos en ellipsvormig en bezitten afmetingen van 5,0-7,0 x 4,0-5,5 micron en een een glad oppervlak· De conidien zijn 25 aan hun basis onderling verbonden en kleurloos en de meeste van hen zijn pyrivormig en bezitten afmetingen van 6,0-9,5 x 6,0-10,0 micron·

Op basis van bovengenoemde eigenschappen werden deze micro-organismen geïdentificeerd als behorende tot de stam Monascus ruber vtn Tieghem, 50 De micro-biologische eigenschappen van Monascus ruber zijn vermeld in de onderstaande literatuur: Takada, Transactions of the iicological Society of Japan, 2» 125-130 (1969) (Materials for the Fungus Flora of Japan (7)) en van Tieghem, Bull, Soc, Botan* France, 21, 227 (1884), De ascosporenvorming van de stam is gerapporteerd dooi 35 3ole et al in de Canadian Journal of Botany, 46, 987 (I968), 8001697 _4 _ "Conidium ontogeny in hymhoraycetes» The imperfect state of Monaaous ruber and its meristem arthrospores",

Monacolin £ kan door kweken van het gekozen micro-orga-nisme in een kweekmedium onder aSrobe omstandigheden en onder toepas-5 sing van de methoden die algemeen voor het kweken van schimmels en andere micro-organismen bekend zijn, worden verkregen» Hen kan bev0 de gekozen Monascua-stam eerst op een geschikt medina kweken, de gevormde micro-organismen verzamelen en op een ander medium enten en kweken onder vorming van het gewenste Monacolin £· Hen kan voor de veΓΙΟ menigvuldiging van het micro-organisme en voor de vorming van Monacolin £ hetzelfde medium of verschillende media gebruiken.

Voor het kweken van schimmels kan elk bekend kweekmedium, dat de nodige bekende voedingsbestanddelen, in het bijzonder een assini-leerbare koolstof-stikstofbron bevat, worden gebruikt, Voorbeelden 13 van geschikte assimileerbare koolstof bronnen zijn, glucose, maltose, dextrine, zetmeel, lactose, sucrose en glycerine, waarbij aan glucose, glycerine en zetmeel voor de bereiding van Monacolin £ in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven, Voorbeelden van geschikte assimileerbare stikstofbronnen zijn pepton* vleesextraotr.»g±st, gistextract, sojav 20 bonenmeel, aardnotenmeel, maisweekvloeistof, rijstzemelen en anorgani- -sche stikstofbronnen, waarbij in het bijzonder aan pepton de voorkeur wordt gegeven» Bij de bereiding van Monacolin £ kan zonodig een anorg1-nisch zout en/of metaalzout aan het kweekmedium worden toegevoegd.

Voorts kan, indien nodig ook een geringe hoeveelheid van een zwaar 25 metaal worden toegevoegd»

Het micro-organisme wordt bij voorkeur gekweekt onder aSrobe omstandigheden onder toepassing van bekende kweekmethoden, bij·· voorbeeld een vaste kweek, een schudkweek of kweken onder beluchting en schudden of roeren» let micro-organisme groeit bij sterk uiteenlopende 30 temperaturen, d«w»z» tussen ^°C en 40°C, waarbij in het bijzonder bij de vorming van Monacolin £ een kweek temperatuur van 20 °C tot 30 °C verdient»

Tijdens het kweken van het micro-organisme kan de voaming van Monacolin £ nagegaan worden door monsters van het kweekmedium te 35 jaemen en de fysiologische werkzaamheid van Monacolin £ in het kweekme- 8001697 -5 - é dim door de hierna beschreven, proeven te bepalen· Het kweken kan dan voortgezet worden tot een aanzienlijke opeenhoping van Monacolin K in het kweekmedium is bereikt, waarna het Monacolin £ geïsoleerd en uit de kweekvloeistof gewonnen kan worden met behulp van elke geschifte 5 kombinatie van isolatiemethoden, rekening houdend met de fysische en chemische eigenschappen· Bijvoorbeeld kunnen een of meer van de volgende isolatiemethoden toegepast worden; extractie van de vloeistof uit de kweek met een hydrofiel oplosmiddel, bijvoorbeeld diethylether, ethylacetaat, chloroform of benzeen, extractie van het organisme met 10 een hydrofiel oplosmiddel zoals aceton of een alkohol, concentratie bijvoorbeeld door verdampen van een deel van het oplosmiddel onder verminderde druk, oplossen in een meer polair oplosmiddel, bijvoorbeeld aceton of een alkohol, verwijdering van verontreinigingen met een minder polair oplosmiddel zoals petroleums the r of hexaan, gel-fiü-15 tratie door een kolom met een materiaal zoals Sephadex (in de handel verkrijgbaar produkt van Pharmacia, Co* Ltd·, U.S.A), absorptiechroms-tograf ie met aktieve kool of silicagel en dergelijke· Door toepassing van een geschikt kombinatie van deze methoden kan het gewenste Monacolin K als een zuivere stof uit de kweek geïsoleerd worden.

20 Het volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding berei de Monacolin K onderscheidt zich door de volgende eigenschappen: 1* Kleur en vorm: kleurloze naalden

2. Smeltpunt: 157~158°C

3« Elementairanalyse: ($) G Ξ 0 25 berekend: *31,25 8,97 19,78 gevonden: 72,67 9,13 18,2 4· Molecuulgewicht: 404 (massaspectrometrisch) 5· Molecuulformule: ^2 4^36° 5 6* ültravioletabsorptiespectrum (methanol): 30 maxima bij 232, 238 en 246 μπι 7· Oplosbaarheid: gemakkelijk oplosbaar/methanol, ethanol, aceten, ethylacetaat, chloroform en tetrachloorkoolstof·

Oplosbaar in benzeen· ~__Onoplosbaar in hexaan en petroleumether.

8001697 - 6 - 8. Kleurreactie: Hose kleur met 50% 7/7 zwavelzuur in een dunne-laag-chromatograaf op silicagel.

9. Dunne-laag-chromatografie: « 0,43 (silicagel *254 Merck & Go»,

Ltd) 0,2? mm dik, 3 x ontwikkeld met een 3 mengsel van methyleenchloride en ethylace taat in de volume verhouding 7*3 en behandeld met jodium of 30% 7/7 zwavelzuur»

De verbinding is neutraal en onoplosbaar in een neutraal of in een zuur waterig medium» De verbinding wordt echter door behande-10 ling met een base in een zure stof omgezet en kan dan in water worder opgeloste De zure stof kan bij zure pH-waarden met ethylacetaat of chloroform geëxtraheerd worden en verandert bij verdampen van het oplosmiddel weer in Monacolin £0

De fysiologische werkzaamheid van Monacolin £ kan onder 15 toepassing van de volgende proeven in vivo en in vitro kwantitatief onderzocht en bepaald worden om de bereiding van Monacolin K volgens de werkwijze „der uitvinding doorlopend te kunnen controleren.

Proef in vivo met konijnen»

Bij deze proef wordt het vermogen van Monacolin £ .om het 20 cholesterolgehalte in het bloed van konijnen te verlagen bepaald. De toegepaste dieren moeten een gewicht van 2,5-3»0 kg bezitten. Onmiddellijk voor de aanvang van de proef wordt bloed uit een ader in het oor van elk konijn verzameld en het cholesterolgehalte in het bloed-iserum volgens een bekende methode bepaald. Een van te voren bepaalde 25 hoeveelheid Monacolin K wordt vervolgens zonder onderbreking gedurende 1-3 dagen oraal toegediend en het cholesterolgehalte in het bloedserui na de toediening bepaald. De werkzaamheid van Monacolin £ of het Monaio-lin K-bevattende kweekmedium kan uit de cholesterolwaarden vóór en na toediening van Monacolin £ kwantitatief worden bepaald.

30 Proef in vitro met rattenlever.

Men laat ruw enzym uit rattenlever 60 min» bij 37°C reageren met radioaktief azijnzuur. Het aldus door biosynthese gevormde ra·» dio-aktieve cholesterol wordt verzeept en vervolgens neergeslagen met digitonine» De radio-aktiviteit wordt ter bepaling van de gevormde 35 hoeveelheid cholesterol gemeten» De werkwijze wordt herhaald, waarbij 8001697 _ 7 - \

Monacolin E of een Monacolin 2-bevattend kweekmedium aan het begin van de reaktie wordt toegevoegd, waarna de door biosynthese gevormde hoeveelheid cholesterol opnieuw wordt bepaald en men aldus een kwantitatieve bepaling van de remmende werking van.Monacolin E verkrijgt» 5 [Bricker en medewerkers. The Journal of Biological Chemistry, 247» 4914 (1972)J* Aan deze proef wordt als snelle en gemakkelijke methode om de vorming van Monacolin K tijdens de kweek volgens de werkwijze der onderhavige uitvinding na te gaan, in het bijzonder de voorkeur gegeven. Het vermogen van Monacolin E om het cholesterolgehalte in 10 bloed en lever te verlagen is bij verschillende proeven in vivo eveneens aangetoond.

Verlaging van het cholesterolgehalte in bloed en lever bi.i ratten.

Be gebruikte dieren waren ratten van de stam Wistar Imamicii t met een lichaamsgewicht van ongeveer 300 g. Be proeven werden uitge-15 voerd op groepen van elk vijf ratten. Elk dier wordt intraveneus met 400 mg/kg Triton WE-1339 (een handelsprodukt, waarvan bekend is dat het het cholesterolgehalte in het bloed verhoogt) ingespoten, terwijl gelijktijdig oraal of intraperitoniaal 10 mg/kg Monacolin E werd toegediend. 20 Uren na orale toediening of 14 uren na intraperitóniale .

20 toediening werden de ratten gedood door aderlating, het bloed en de levers verzameld en de cholesterolgehalten met behulp van de gebruikelijke middelen bepaald. Hierbij werd gevonden dat het cholesterolgehalte in het bloed bij orale toediening met 22,4$ en bij intraperi-toniale toediening met 23,9$ gedaald was in vergelijking met een groe;> 25 dieren, die alleen Triton WS-1339 hadden ontvangen. Het cholesterolgehalte in de lever was bij de dieren waaraan Monacolin E oraal was toe-gediend verlaagd met 16,7$.

Verlaging van het cholesterolgehalte in het bloed van konijnen.

Be gebruikte proefdieren waren konijnen met een lichaamsge·· 30 wicht van 2,7 kg tot 2,9 kg. Aan elk konijn werd 5 dagen achter elkaar twee maal per dag (¾ morgens en *s avonds) oraal 1 mg/kg Monacolin E toegediend· Y66x de toediening, en op de 3e en 3e dag na de toediening werd bloed verzameld uit een ader in het oor en het cholesterolgehalte in het bloedserum bepaald. Hierbij werd gevonden, dat het cholesterol-' 35 gphalte op de 3e en 5® dag na de toediening van Monacolin E resp. 15$ 8001697 , _ 8 _ en 29$ lager was dan het cholesterolgehalte vdór de toediening van Monacolin £·

Gevonden werd dat Monacolin E bij een concentratie van 0,002 μg/ml bij de proef waarbij men azijnzuur met het enzym uit rat-5 tenlever laat reageren de biosynthese van cholesterol 50$ verlaagte Tender heeft men vastgesteld dat Monacolin E de HMG-CoA reductase, het snelheidsbepalende enzym bij de biosynthese van cholesterol, en «10 bovendien het HMG-CoA-substraat remt en een Ki-waarde van 5»3 * '0 M bezit» De Ki-waarde is de remmingskonstante en in het bijzonder de dis-10 sociatiekonstante van het enzymenremmende complex0 Deze waarde berekent men door vermenigvuldigen van de concentraties van enzym en remmer en delen door de concentratie van het enzymremmercomplex„

Behalve de waardevolle remmende werking bij de biosynthese van cholesterol is de giftigheid van Monacolin £ zeer gering, waar-15 door de toepassing bij de behandeling van hypercholesteraemie zeer aantrekkelijk is» In het bijzonder bedraagt de acute orale giftigheid (lDj-0) van Monacolin £ bij muizen 1 g/kg lichaamsgewicht of meer»

Monacolin £ kan oraal of parenteraal worden toegediend in de vorm van capsules, tabletten, injektiepreparaten of elk andere 20 bekende vorm, hoewel gewoonlijk de voorkeur wordt gegeven aan orale toediening, De dosis varieert afhankelijk van de leeftijd, het li» chaamsgewicht van de patient en de ernst van de toestand» De dagelijkse hoeveelheid bedraagt echter in het algemeen voor volwassenen 0,5 tot 50 mg, in de vorm van een enkele dosis of verdeeld over 2 of 25 3 doses» In verband met de geringe giftigheid van de verbinding-kunnen desgewenst grotere hoeveelheden worden toegepast·

De uitvinding zal nader toegelicht worden door de hierna volgende niet beperkende voorbeelden·

Toorbeeld I· 30 Men brengt 300 liter van een kweekmedium met een pH vö6r de sterilisatie van 7» 4> dat 1,5 gew/volume oplosbaar zetmeel, 1,5$ gew/vol® glycerine, 2% gew/vol· vismeel en 0,2% gew/vol* calciumcar-bonaat bevat, in een fermentatie tank van 600 liter en ent met het organisme Monascus ruber SANK B174 (ϊΈΒΜ 4957)» Men kweekt het organisme 35 -420 uren bij 27°G met een beluchtingssnelheid van 300 liter/min· en 8001697 -9 - een roersnelheid van 190 omw/min. Hierna filtreert men de kweekvloei-stof in een filterpers, waarbij men 2£0 liter filtraat en 60 kg (nat gewicht) van het organisme verkrijgt·

Hen brengt de pH van dit filtraat op 4>0 door toevoeging van 5 6f zoutzuur en extraheert het filtraat met 400 liter ethylacetaato Hen concentreert het extract, droogt boven watervrij natriumsulfaat en dampt in tot droog waarbij men 95 g van een olieachtig produkt verkrijgt. Het organisme (dat 2,5 maal zo werkzaam is als het filtrai t) extraheert men tweemaal, telkens met 100 liter 80$ ’ s (volume/volume) 10 waterige methanol. Men verdampt de methanol uit het extract en extraheert het residu tweemaal met telkens 100 liter ethylacetaato De samengevoegde extracten worden geconcentreerd, boven watervrije natriumsulfaat gedroogd en vervolgens ingedampt tot droog, waarbij men 120 g van een olieachtig produkt verkrijgt, dat men samenvoegt 15 met het residu van het filtraat van de kweekvloeistof0

Men adsorbeert de verkregen 223 g samengevoegde olieproducten in een kolom die 3 hg silieagel (Wakogel C-200) bevat die men var-tevoren met benzeen behandeld heeft» Men elueert de kolom achtereenvolgens met 10 liter benzeen en daarna met 180 liter van een mengsel 20 van methyleenchloride en ethylacetaat in de volumeverhouding 4*1«

De werkzame fraktie wordt tot droog ingedampt, waarbij men 30 g olieachtig produkt verkrijgt die men vervolgens in een kolom die 450 g van tevoren met hexaan behandelde silieagel (Wakogel C-200) bevat, adsorbeert.

25 Men elueert de kolom achtereenvolgens met 2 liter hexaan, 30 liter van een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhouding 9s 1 en 30 liter van een mengsel met hexaan en aceton in de volumeverhouding 4*1· he werkzame fraktie wordt geconcentreerd en het neerslag gefiltreerd. Men dampt het filtraat in tot droog, waarbij men 4 g var 50 een olie achtig produkt verkrijgt dat men in een kolom die $6 g van tevoren met hexaan behandelde silieagel (Wakogel C-200) bevat, adsorbeert. Men elueert de kolom achtereenvolgens met 500 ml hexaan en 6 liter van een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhouding 9*1· he werkzame fraktie wordt tot droog ingedampt waarbij men 521 mg van een 55 -olieachtig produkt verkrijgt, dat men in een kolom adsorbeert, die 8001697 _ 1CL_ 50 g van tevoren met "benzeen "behandelde silicagel (Wakogel C-200) hevato Hen elueert achtereenvolgens met 10 ml henzeen, 100 ml van eer mengsel van henzeen en ethylacetaat in de volumeverhouding 95*5 en 900 ml van een mengsel van henzeen en ethylacetaat in de volumever-5 houding 4*1o Ha concentreren van de werkzame frak tie verkrijgt men 92 mg kleurloze kristallen die hij herkristalliseren uit water en ace ton 54 mg Monacolin E in de vorm van kleurloze naalden levert*, Voorbeelden II-7III.

Men brengt 500 liter van een kweekmedium met een pH v66r 10 sterilisatie van 6,0, dat 2$ gew/volo glucose, 2$ gew/vol pepton (merk Kyokuto, een produkt van Kyokuto Seiyaku EK, Japan) en 0,5$ gew/volo maiskweekvloelstof bevat in een fermentatie tank van 600 liter eh ent met één van de in de volgende tabel genoemde micro-organismen«

Men kweekt de micro-organismen 96 uren hij 27°C met een heluchtingsi 15 snelheid van 500 liter/mine en een roersnelheid van 190 omWj/min«

Hierna wordt 1 ml van het kweekmengsel verwijderd en met ethylacetaat met een pH van 5-4 geëxtraheerd» Het extract wordt opgenomen in 0,2 ml van een reaktiemengsel beschreven door MoKuroda, I^Hazama-Shimada en AoEndo in Biochenu and Biophys* Acta», 436 (1977)· r 20 biz» 254-259 hij 255 ("Inhibition of Sterol Synthesis by Citrinin in a Cell-free System from Hat Liver and Yeast'·) en AeEndo* MoKuroda en YoTsujita in the Journal of Aatibiotics,. gepubliceerd door de Japanese ^ intibiotics Research Association, 29 Ho<» 12 (December 1976) biz* 1546” I548, waarbij het percentage van de remming van de cholesterol-bio-25 synthese bepaald wordt», De resultaten zijn in tabel A als werkzaam-heidseenheden van de remming per ml kweekvloeistof aangegeven, waarbij 50$ remming van de cholesterol-biosynthese gelijk staat met 1 eenheid/ml» » ί i 8001697 _ 11_ gabel A.

Voorbeeld Organisme Remwerking in ______________ eenheden per ml,.

II Monascus purpurous SANE 10271 120 III Monascus ruber SANE 10671 120 5 I? Monascus vitreus SANE 10$60 150 V Monascus paxii SANE IH72 120 71 Monascus ruber SANK 13778 440 VII Monascus ruber SANE 15177 2*400 VIII Monascus ruber SANE 18174 20*000 10 De resultaten tonen de bereiding van aanzienlijke hoeveel heden Monacolin E door de micro-organismen der onderhavige uitvinding, Voorbeeld IX*

Men herhaalt de werkwijze beschreven in de voorbeelden II-VIII, waarbij echter het gebruikte micro-organisme Monascus ank a SANE 15 10171 is en de monsters van het kweekmedium resp. na een 96 uren, 168 uren, 216 uren en 288 uren durende kweek wordt verwijderd* De remwer-king bedraagt volgens dezelfde prcef als beschreven in de voorbeelden II-VIII resp. 110^100,30 en 80 eenheden/ml*

Voorbeelden X-XVII.

20 Men brengt 300 liter van een vloeibaar kweekmedium met een pH vóör de sterilisatie van 5»5, dat 5$ gew/vol. glucose, 0,5$ gew/vol* maiskweekvloeistof, 2$ gew/vol, pepton (Eyokuto) en 0,5$ gew/vol. ammoniumchloride bevat in een kwek tank van 600 liter. Eëh van de in - tabel B genoemde stammen wordt in het medium geënt en gedurende 120 ur< n 29 gekweekt. Men herhaalt deze behandeling voor elk van de andere stammen afzonderlijk.

Ea het kweken wordt elk medium door een filterpers gefiltreerd onder vorming van een voohtige myceliumkoek met de in tabel B aangegeven hoeveelheid, en een filtraat. De pH-waarde van het filtraa·; 30 wordt op 4 gebracht doer toevoeging van 6E zoutzuur, waarna men met 400 liter ethylacetaat extraheert. Vervolgens wordt het 400 liter.: metende extract door indampen onder verminderde druk geconcentreerd 8001697 ' _ 12_ en boven watervrij natriumsulfaat gedroogde Het geconcentreerde extract wordt verder geconcentreerd en daarna ingedampt tot droog, waarbij een olie ontstaat met de in tabel B onder "hoeveelheid extract uit vloeistof" aangegeven hoeveelheid» 5 Intussen wordt de myceüumkoek die ongeveer twee tot driemaal werkzamer is dan het overeenkomstige filtraat, tweemaal geëxtraheerd, telkens met 100 liter 80$*s (volume/volume) water-metha-nol. Men concentreert het extract en droogt boven watervrije natrium· sulfaate Het geconcentreerde extract wordt verder geconcentreerd en 10 vervolgens tot droog ingedampt, waarbij men een olie verkrijgt met d<i in tabel B onder "hoeveelheid extract uit myceliumkoek" aangegeven hoeveelheid.

Men voegt de uit de verschillende filtraten en mycelium-koeken verkregen oliën samen en adsorbeert in een silicagelkolom 15 (3 kg Wakogel G-200* bereid met benzeen), die men achtereenvolgens elueert met 10 liter benzeen en 130 liter van een mengsel van methy-leenchloride en ethylacetaat in de volumeverhouding 4:1» Se werkzame fraktie uit de elutie wordt geconcentreerd en ingedampt tot droog, waarbij men een olie verkrijgt met de in tabel B onder "fraktie 1" 20 aangegeven hoeveelheide Deze olie adsorbeert men in een kolom die 340 tot 450 g siücagel bevat (Wakogel 0-200* van tevoren bereid met hexaan), waarbij de hoeveelheid siücagel 1 g per 65 mg oüe bedraagt,, Men elueert de kolom achtereenvolgens met 1,5-2 Üter hexaan, 23-30 üter van een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhou-23 ding 9:1 en 23-30 liter van een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhouding 4:1»

Men concentreert de werkzame Bak tie van deze elutie en filtreert de neergeslagen kristallen af» Het verkregen residu wordt verder geconcentreerd en vervolgens tot droog ingedampt, waardoor mei.

30 een oüe verkrijgt met de im tabel 3 onder "Fraktie 2" aangegeven hoeveelheid· Deze fraktie adsorbeert men in een kolom die 18—155 g siücagel bevat (Vakogel C-200, van tevoren bereid met hexaan), waar·' bij de hoeveelheid siücagel 1 g per 42 mg oüe bedraagt. De kolom wordt vervolgens geëlueerd met achtereenvolgens 100-730 ml hexaan en 33 Jl»2-9 üter van een mengsel van hexaan en aceton in de volumeverhou- 8001697 -13- ding 9:1* Be werkzame frak tie van deze elutie wordt geconcentreerd en tot droog ingedampt, waardoor men een olie verkrijgt met de in tafce1 B onder "fraktie 3M aangegeven hoeveelheid, Beze olie adsorbeert men in een kolom die 6-45 g silicagel bevat (Wakogel G-200, van te-5 voren bereid met benzeen), waarbij de hoeveelheid silicagel 1 g per >7 mg olie bedraagt, Vervolgens wordt de kolom gedineerd met achtereenvolgens 15-100 ml benzeen, 15-100 ml van een mengsel van benzeen en ethylacetaat in de volumeverhouding 95:5 en 120-1200 ml van een mengsel van benzeen en ethylacetaat in de volumeverhouding 4:1, Be werk-10 zame fraktie wordt geconcentreerd waarbij ruwe Monacolin E kristalie: 1 met de in tabel B aangegeven hoeveelheden ontstaan, Hen herkristalli -seert de ruwe kristallen uit waterig ace ton waarbij kristallen in de vorm van kleurloze 'naalden in de in tabel 3 aangegeven hoeveelheid ontstaan, 8001697 - 14-Tabel 3«

Yb. Stam Hoeveel- Hoeveel-Hoeveel- Hoeveel.- heid my- heid heid ex- heid viin celium- extrakt trakt samengo- c koek uit uit my- voegde (kg) vlOei- celium- extrak;en __stof(g) koek (g) (g) X MQnaseus ank a SANE 10171 56 86 116 202 XI Monacus -purpurous SANE 10271 55 87 114 201 10 XII Monascus ruber SANE IO67I 55 88 115 203 3III Monascus vitreus SANE 10960 61 89 123 212 XIV Monascus paxii SANE 11172 58 91 120 211 XV Monascus ruber SANE 13778 63 95 127 222 XVI Monascus ruber SANE 15177 58 91 119 210 152VII Monascus ruber SANE I8I74 62 93 125 218

η· Frsktie Monacolin E

No. ----.-- .A A 3 Euwe kristallen Herkristalli- (g) (mg) seerde krisial- __ lea (mg) X 22 0,9 102 ' 9,3 0,8 20 115 10,4 1t1 XII 22 0,75 98 8,9 0,8 xiii 25 1,1 110 10,7 1,2 XIV 24 2,2 121 12,0 1>6 W 28 1»65 216 14,2 6,3 25 XVI “26 1,8 255 24,4 9>8 ^711 29 5,7 765 135,0 81,0 -Conclusies- 8001697

Claims (3)

1, Werkwijze voor de bereiding van Monacolin Z door kweken van een stam van het geslacht Monascus, met het kenmerk, dat de gekweekte stam één of meer van de volgende 5 is: Monascua an>A 1017"1 (l£Q 6540)» Monascus Ournurous SIM 102" 1 (IJPO 4515}, Monascus ruber SAM IO67I (ΕΕΕΙί 4958)» Monascus vitreus SAM I096O (FERM 4960), Monascus paxii SAM HI72 (ISO 8201), Monascus ruber SAM 15778 (FERM 4959)» Monascus ruber SANK 15177 (£EBM 495^) of Monascus ruber SAM 18174 (ï®HM 4957)·

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het ken merk, dat de kweek uitgevoerd wordt bij een temperatuur van 7-40°<!.

5. Werkwijze volgens conclusie 1,methetken-m e r k, dat de kweek uitgevoerd wordt bij een temperatuur van 20-30°G. 15 · 4· Werkwijze volgens- conclusie 1,met het ken merk, dat de stam Monascus ruber SAM 15177 is en de kweek uitgev<“erd wordt bij een temperatuur van 23-30°C. aiasssBaasfc 8001697 > ( Η°γ-γΟ ω 800 t 6 97