DE102004062386B4

DE102004062386B4 - Monacolin K-Biosynthese-Gene

Info

Publication number: DE102004062386B4
Application number: DE102004062386A
Authority: DE
Inventors: Yi-Pei Chen; Li-Ling Liaw; Chun-Lin Wang; Chung-Tsai Lee; Ing-Er Hwang; Ching-Ping Tseng; Gwo-Fang Yuan
Original assignee: Food Industry Research and Development Institute
Current assignee: Food Industry Research and Development Institute
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2010-06-24
Anticipated expiration: 2024-12-24
Also published as: TW200521230A; FR2864548B1; FR2883297A1; JP2005185283A; DE102004062386A1; TWI297358B; US20050227262A1; FR2883297B1; US7482157B2; KR100662700B1; CN1637143A; KR20050065437A; FR2864548A1

Abstract

Ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aktivität, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase, und dem Acyl-Carrier-Protein, codiert; oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist.

Description

Hintergrund:
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Molekularbiologe und der Mikrobiologe. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf Monacolin K-Biosynthese-Gene.
Monascus wird seit tausenden von Jahren in China in der Nahrungsmittel-Industrie verwendet. Kürzlich wurde entdeckt, dass Monascus verschiedene bioaktive Substanzen produziert. Diese bioaktiven Substanzen sind hauptsächlich sekundäre Metaboliten von Monascus, einschließlich Substanzen für die Senkung von Bluthochdruck, Substanzen gegen Fäulnis-Bakterien wie Monascidin, krebshemmende Substanzen, Substanzen für die Senkung des Blutzuckerspiegels, Ergosteral, Antioxidantien sowie Cholesterin-Synthese-Inhibitoren wie Monacolin. Aus diesem Grunde wird Monascus als funktionelles, gesundheitsförderndes Nahrungsmittel in den letzten Jahren hoch geschätzt. Monacolin K, der von Monascus produzierte Cholesterin-Synthese-Inhibitor, wurde erstmals aus dem Medium von Monascus ruber durch SANKYO CO., LTD, isoliert. Merck & Co., Inc. fanden dann dieselbe Substanz im Medium von Aspergillus terreus, die als Lovastatin bezeichnet wurde und als HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor wirkt. Monacolin K gehört zu den Polyketiden, deren Struktur Ähnlichkeiten mit HMG-CoA aufweist. Aus diesem Grunde hemmt Monacolin K die Cholesterin-Synthese mit HMG-CoA kompetitiv, und die HMG-CoA-Reduktase kann die Reaktion von HMG-CoA nach Mevolonat nicht katalysieren, was zu einer Reduktion der Cholesterin-Synthese führt.
Die durch Pilze produzieren sekundären Polyketid-Metaboliten weisen eine strukturelle Vielfalt und einzigartige Eigenschaften auf, die in anderen Bakterien nicht vorkommen (O'Hagan, 1995). Diese Eigenschaften kommen auch in der Enzym-Vielfalt der Polyketid-Synthese zum Ausdruck. Das durch Monascus produzierte Monacolin K ist ein Mitglied der Polyketid-Gruppe, und es wurde festgestellt, dass die verschiedenen Polyketide durch von der Polyketid-Synthase (PKS) katalysierte Kondensation von Acetyl-CoA produziert werden. (Kennedy et al., 1999; und Abe et al., 2002). Untersuchungen der Polyketid-Synthase in Kombination mit kombinatorischer Biosynthese eröffnen ein großes Potenzial für die Entwicklung neuer Polyketide (Mc Daniel et al., 1999), und die neuen Polyketide werden einen neuen Weg für die Entdeckung effektiver Medikamente eröffnen.
Aus der WO 00/37629 A2 ist bereits ein Lovastatin-Biosynthescluster mit 17 Genen aus Aspergillus terreus bekannt, wobei der Gencluster unter anderem Gene für Polyketidsynthase(nonaketid) (IovB), Polyketidsynthase(diketid) (IovF), P450 Monoxygenase (IovA), Dehydrogenase (IovC), Esterase (IovD) und HMG CoA Reduktase umfasst. Des Weiteren ist aus der WO 00/37629 A2 ein Verfahren zur Erhöhung der Lovastatin-Produktion durch Transformation isolierter und klonierte Gene des beschriebenen Lovastatin-Biosynthesclusters in einem Lovastatin (Monacolin) produzierenden Organismus bekannt.
Aus dem Artikel NICHOLSON T. P., „Design and utility of oligonucleotide gene grobes for fungal polyketide synthases”, erschienen (2001) in Chemistry&Biology Vol. 8, Seite 157–178, sind degenerierte Primer für Gene bekannt, die mit der Monacolin K-Synthase in Zusammenhang stehen. Die bekannten Primer eignen sich zur Herstellung von Sonden für ein DNA-Screening, welche u. a. spezifisch für das Lovastatin-Nonaketid-Synthasegen sind.
Schließlich ist aus der GB 2 049 664 A ein Verfahren zur Herstellung eines antihypercholesterinämischen Mittels der Bezeichnung Monacolin K durch Züchtung von bestimmten spezifischen Mikroorganismen des Genus Monascus bekannt, im Speziellen von Monascus ruber Stämmen.
Zusammenfassung:
Demgemäß stellt eine Ausgestaltung der Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül bereit, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aktivität, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase, und dem Acyl-Carrier-Protein, codiert; oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist.
Eine andere Ausgestaltung der Erfindung stellt ein isoliertes DNA-Molekül bereit, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 aufweist, oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aktivität, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase, und dem Acyl-Carrier-Protein, codiert.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung stellt ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäure-Sequenz aus SEQ ID NO: 11 codiert, wobei das Polypeptid eine Aktivität aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase und Acyl-Carrier-Protein.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung stellt einen Vektor bereit, der das oben beschriebene isolierte DNA-Molekül enthält.
Zusätzlich stellt eine Ausgestaltung der Erfindung eine Zelle bereit, die durch einen Vektor transformiert wurde, der ein Polynukleotid enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 aufweist; b) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkB handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 aufweist; c) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkC handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 4 aufweist; d) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkD handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 5 aufweist; e) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkE handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 6 aufweist; f) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkF handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 7 aufweist; g) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkG handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 8 aufweist; h) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkH handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9 aufweist; i) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkI handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 10 aufweist; und j) einer Kombination daraus.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produkton bereit, aufweisend das Kultivieren einer durch einen Vektor transformierten Zelle und das Aufreinigen von Monacolin K aus der Zelle. Der Vektor weist ein Polynukleotid auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 aufweist; b) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkB handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 aufweist; c) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkC handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 4 aufweist; d) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkD handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 5 aufweist; e) einem Poly nukleotid, bei dem es sich um mkE handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 6 aufweist; f) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkF handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 7 aufweist; g) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkH handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9 aufweist; und h) einer Kombination daraus.
Darüber hinaus stellt eine Ausgestaltung der Erfindung die Verwendung einer transformierten Zelle zur Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Bildung bereit, aufweisend das Kultivieren der durch einen Vektor transformierten Zelle und das Aufreinigen von HMG-CoA Reduktase-Inhibitor aus der Zelle. Der Vektor entspricht dem oben beschriebenen.
Weiterhin stellt eine Ausgestaltung der Erfindung die Verwendung einer transformierten Zelle für die Bildung des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Transformation der Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 (mkA genomische DNA), SEQ ID NO: 3 (mkB genomische DNA), SEQ ID NO: 6 (mkE genomische DNA), und SEQ ID NO: 7 (mkF genomische DNA), oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit diesen Sequenzen, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, in eine Wirtszelle, wobei diese Sequenzen für Proteine mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codieren; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenzen geeignet sind; und (c) Aufreinigung des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors.
Darüber hinaus stellt eine Ausgestaltung der Erfindung ein Verfahren für die Produktion von Monacolin K bereit, aufweisend die Kultivierung einer Zelle, die mit einem Vektor transformiert wurde, und das Aufreinigen von Monacolin K aus der Zelle. Der Vektor entspricht dem oben beschriebenen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausgestaltungen der Erfindung können vollständiger verstanden werden, und weitere Vorteile werden offensichtlich, wenn auf die folgende Beschreibung und die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen wird.
1A–1G zeigen Sequenzvergleiche der Polyketid-Synthase aus Monascus oder anderen Pilzen sowie ein Motiv der Fettsäure-Synthase aus der Ratte. 1A zeigt einen Vergleich der Ketoacyl-Synthase, 1B zeigt einen Vergleich der Acyl-Transferase, 1C zeigt einen Vergleich der Dehydratase, 1D zeigt einen Vergleich der Methyl-Transferase, 1E zeigt einen Vergleich der Enoyl-Reduktase, 1F zeigt einen Vergleich der Ketoacyl-Reduktase, und 1G zeigt einen Vergleich des Acyl-Carrier-Proteins.
2 zeigt die Expression des Monascus mk Genclusters nach 3–14 Tagen.
3A und 3B zeigen Karten von pPICZamkA bzw. pPICZamkB.
4 zeigt die MKH Aminosäure-Sequenz und ein mögliches Zn(II)Cys6 Binuclear-Motiv, das mittels Vector NTI analysiert wurde. Die Aminosäure-Sequenz in der Box zeigt das Zn(II)Cys6 Binuclear-Motiv; 6 Cys ist durch graue Unterlegung markiert.
5 zeigt die Konstruktion eines E. coli Expressions-Vektors, der das Polyketid-Synthase mkA-Gen enthält. Ein Satz Oligonukleotid-Primer (p3 und p4) wurde entworfen, um die partielle cDNA des mkA-Gens (6.5 kb) mittels RT-PCR zu amplifizieren. Die Primer p1 und p2 wurden entworfen, um die partielle cDNA des mkA-Gens (3.0 kb) mittels RT-PCR zu amplifizieren.
6 zeigt die Konstruktion eines E. coli Expressions-Vektors, der das 4'-Phosphopantethein-Transferase sfp-Gen aus B. subtilis enthält.
7 zeigt die Expression von mkA und sfp in E. coli. Das Gesamtprotein von E. coli, die die Kontroll-Plasmide pCDF-1b und pET30 (Bahn 1) und die Expressions-Plasmide pCDFsfp (sfp-Gen) und pETmkA (mkA-Gen) (Bahn 2) enthalten, wurde in Loading Buffer gekocht und einer SDS-PAGE unterzogen.
Die Proteine wurden mit kolloidalem Coomassie Blau gefärbt. Die Pfeile zeigen die Positionen von Sfp und mkA an. Die Proteine des Lysats wurden mit dem ProBond<TM> Reinigungssystem (Invitrogen) gereinigt. Bahn 3 zeigt das bei 3000·g und 60 min zentrifugierte Lysat, und Bahn 4 enthält die Proteine, die an einer Ni-Säule gereinigt wurden.
Genauere Beschreibung:
Für Monascus spezifische Sonden wurden anhand der degenerierten Primer für Lovastatin aus Aspergillus terreus, die von Nicholson (2001) veröffentlicht wurden, erstellt. Die Gene, die mit der Monacolin K-Synthese in Zusammenhang stehen, wurden mittels Kolonie-Hybridisierung aus der Monascus BAC-Genbank kloniert, sequenziert und identifiziert. Zwei vollständige PKS-cDNAs wurden mittels RT-PCR amplifiziert bzw. in Expressions-Vektoren kloniert. Dann wurde die Erfindung gemacht.
Seit der Entdeckung von durch Monascus produzierten Cholesterin-Inhibitoren in den achtziger Jahren richtete sich ein gesteigertes Interesse auf die Wirkung von Monascus bezüglich der Senkung des Blutdrucks, des Blutzuckers und des Cholesterins. Neben Monacolin K wurden andere Substanzen für die Senkung des Cholesterins aus Monascus isoliert, z. B. Monacolin J, L, M, und X (Endo et al., 1979, 1985, 1986, und Komagata et al., 1989). Monacolin J und L sind Vorläufer des Monacolin K. Der Mechanismus der Cholesterin-Synthese-Inhibition durch Monacolin K basiert auf den strukturellen Ähnlichkeiten zwischen Monacolin K und HMG-CoA. Monacolin K kann an HMG-CoA-Reduktase binden und deren katalytische Aktivität für die Bildung von Mevolonate aus HMG-CoA blockieren, worauf die Cholesterin-Synthese stark reduziert wird. Neben Monacolin K sind auch andere Verfahren, die sich die Biotransformation oder die chemische Modifikationen für die Inhibition von Cholesterin zu Eigen machen, kommerziell erhältlich, z. B. Pravastatin, Simvastatin, Fluvastatin, oder Atorvastatin, die allesamt strukturelle Ähnlichkeiten mit HMG-CoA aufweisen.
Aus diesem Grunde ist es das primäre Ziel der Erfindung, Gene bereit zustellen, die im Zusammenhang mit der Monacolin K-Produktion bei Monascus stehen. Das in der Erfindung analysierte Objekt ist Monascus sp. BCRC38072, bei dem die folgenden Eigenschaften beobachtet worden:
Makroskopische Eigenschaften:
CYA, 25°C, 7 Tage. Koloniedurchmesser 25–26 mm, Myzel anfangs weiß, wird leicht rötlich-orange, Unterseite tief rötlich-orange. MEA, 25°C, 7 Tage. Koloniedurchmesser 48 mm, hell rötlich-orange, Unterseite lebhaft rötlich-orange. G25N, 25°C, 7 Tage. Koloniedurchmesser 28–29 mm, tief rötlich-orange, tief gelblich-orange in den Koloniezentren.
Mikroskopische Eigenschaften:
Aleurioconidien wachsen einzeln oder gelegentlich in kurzen Ketten, obpyriform bis globulös, 10–13 × 8–10 μm. Cleistothecium globulös, 37–72 μm Durchmesser, Acosporen transparent, ellipsoid, 4.6–6.3 (–6.6) × 3.3–4.2 μm.
Gemäß dem Klassifikations-System von Hawksworth & Pitt (1983) wurde BCRC38072 identifiziert als:
Morphologische Eigenschaften:
BCRC38072 liegt zwischen M. pilosus und M. ruber.

1. BCRC38072 ähnelt M. pilosus in seiner Koloniefarbe und seiner Wachstumsrate.
2. BCRC38072 ähnelt M. ruber in der Morphologie der Acospore.

Sequenzanalyse:
BCRC38072, M. ruber und M. pilosus weisen eine 100%ige Sequenzähnlichkeit in ihren rRNA ITS-Fragmenten und dem [beta]-Tubulin-Gen auf.
Artidentifikation:
BCRC 38072 wurde zeitweise als Monascus pilosus K. Sato ex D. Hawksw. & Pitt. bezeichnet.
Anhand der Analyse von Monascus pilosus BCRC38072 wurden Sonden für die Kolonie-Hybridisierung, das Southern Blotting und die PCR erstellt, die spezifisch für die konservierten Regionen der Ketosynthase sind und eine Länge von 226 bp (SEQ ID NO: 1) aufweisen. Ausserdem können diese Sonden für das Screening von Monascus verwendet werden. Die Identifikation und Vorhersage der vollständigen BAC DNA-Sequenz wurde mittels BLAST und Vector NTI durchgeführt. Neun Gene mit hohen Sequenz-Ähnlichkeiten mit dem Lovastatin-Gencluster, das von Aspergillus terreus gebildet wird, von über 54%, wurden in der BAC Genbank gefunden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Monacolin K-Gencluster und Compactin-Gencluster, die aus Penicillin citrinum synthetisiert werden, weisen hohe Ähnlichkeiten von über 49% auf. Die neun Gene beinhalten zwei Polyketid-Synthase-Gene, wovon eins verantwortlich ist für die Nonaketid-Synthese, und das andere für die Diketid-Synthese. Darüber hinaus sind ein Monooxygenase-Gen, ein Oxidoreduktase Gen, ein Dehydrogenase-Gen, ein Transesterase-Gen, ein HMG-CoA Reduktase-Gen, ein Transkriptionsfaktor-Gen, und ein Efflux-Pumpen-Gen enthalten. Es wurde eine Fosmid-Genbank von Monascus erstellt, und zwei Klone, die mittels Vergleich der Fosmid-Endsequenzen gescreent wurden, wurden patentamtlich hinterlegt als pMPF001 mit mkB, mkD, mkE, mkF, mkG, mkH; und als pMPF002 mit mkA, mkC, mkD, mkE, mkF, mkG, mkH, und mkI. pMPF001 wurde in der American Type Culture Collection (ATCC) als PTA-5685 hinterlegt, und pMPF002 als PTA-5686. Die funktionellen Bereiche des Nonaketid-Synthase-Gens und des Diketid-Synthase-Gens wurden weiter analysiert, in dem sie mit bekannten Polyketid-Synthese-Genen aus Aspergillus, Penicillium, Cochliobolus, und Gibberella, und einem Fettsäure-Synthese-Gen (FAS) aus Ratte verglichen wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die funktionellen Bereiche dieser zwei Gene ähnlich denen des von Aspergillus terreus produzierten Lovastatins und des von Penicillium citrinum produzierten Compactins sind, wie in 1 gezeigt. Die Northern Blot-Analyse der aus Monascus extrahierten Gesamt-RNA zeigt die Expression dieser Gene auf der transkriptionalen Ebene, wie in 2 gezeigt.
Die zwei Polyketid-Synthase-Gene der Erfindung sind multifunktionelle Enzyme: Das mkA-Gen hat die Funktionen einer β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase und eines Acyl-Carrier-Proteins. Das mkB-Gen hat die oben erwähnten 6 Funktionen und eine zusätzliche Enoyl-Reduktase-Funktion, wie in 1 gezeigt. Die vollständige cDNA der zwei Gene wurde mittels RT-PCR erhalten, und dann in das Pichia pastoris Expressions-System kloniert, um die Polyketid-Produkte zu exprimieren. Da das Polyketid-Synthase-Gen multifunktionelle Enzyme exprimiert, können verschiedene Polyketid-Produkte mittels DNA- Rekombination, wie z. B. Gen-Shuffling, aus der vollständigen cDNA der Erfindung hergestellt werden. Dieses Verfahren ist ein neuer Weg für das Screening von neuen Arzneimitteln. Verschiedene Patente, wie z. B. die US-Patente No. 6,221,641 und 6,391,594 , offenbaren ähnliche Verfahren für die Expression in Bakterien. Allerdings weisen die sekundären Metaboliten der durch Pilze gebildeten Polyketide eine strukturelle Vielfalt und Komplexität auf. Aus diesem Grunde können die erfindungsgemäß gewonnen pPICZamkA (3A) und pPICZamkB (3B) als Expressions-Plasmide für die Expression verschiedener Polyketid-Produkte durch Gen-Shuffling verwendet werden. Dementsprechend stellt die Erfindung die folgenden DNA-Moleküle, Vektoren und Verfahren zur Verfügung.
(I) Sonden für das Screening von Genen, die mit der Monacolin K-Synthese in Zusammenhang stehen.
Die Erfindung liefert eine Sonde für das Screening von Genen, die mit der Monacolin K-Synthese in Zusammenhang stehen, die eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 1 aufweist. Die Sonde ist spezifisch für Monascus BCRC38072 und wurde anhand der von Nicholson (2001) entwickelten degenerierten Primer für das Lovastatin-Synthese-Gen von Aspergillus terreus entwickelt. Für den Fachmann ist es einfach, mit der erfindungsgemäßen Sonde Gene, die Monacolin K ähneln, mit bekannten Verfahren, wie z. B Hybridisierung, zu isolieren oder zu reinigen.
(II) Nonaketid-Synthase (mkA genomische DNA)
Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 (mkA genomische DNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 2, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und die für ein Protein mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz wurde aus BCRC38072 isoliert. Hinzu kommt, dass der Fachmann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren wie PCR oder Hybridisierung anhand der Offenbarung der Erfindung nacharbeiten kann. Hinweise auf die stringenten Bedingungen finden sich in der EP 1325959 A1 P7. Nonaketid-Synthase katalysiert die Reaktion aus einem Acetat-Rest und acht Malonat-Resten zur Bildung von Nonaketid. Dieses Gen hat multifunktionelle Bereiche, einschliesslich einer [beta]-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase und eines Acyl-Carrier-Proteins.
Der Vergleich dieses Gens mit funktionellen Bereichen anderer Arten zeigt, dass die funktionellen mkA-Bereiche von Monascus BCRC38072 hohe Ähnlichkeiten mit dem lovB-Gen von Aspergillus terreus und dem mlcA-Gen von Penicillium citrinum aufweisen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor mit einem isolierten DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 (mkA genomische DNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 2, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert. Werkzeuge für die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors umfassen molekulare Sequenzen, die selbst-replizierend oder integrierbar in das Chromosom einer Wirtszelle sind, z. B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus; bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Shuttle-Vektor. Der erfindungsgemäße Vektor bildet außerdem durch Gen-Shuffling verschiedene Polyketid-Produkte. Hinweise auf Gen-Shuffling können in den US Patenten No: 6,221,641 und US Patent No: 6,391,594 gefunden werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Transformant, der mit einer isolierten DNA transformiert wurde, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 2, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Bildung des Transformants. Die Wirtszelle schließt Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Die Transformation kann durch Anwendung einer Transformationsmethode für filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, die das bekannte Wirt-Vektor-System verwendet, bewerkstelligt werden. Siehe EP 1325959 A1 P5.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produktion, das folgende Schritte aufweist: (a) Transformation des Polynukleotids, aufweisend die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 2 (mkA genomische DNA), oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 2, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; und (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Produktion. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Transformation des Polynukleotids, wobei es sich um mkA handelt und welches Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 2 oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 2, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind, und (c) Aufreinigen des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
(III) Diketid Synthase (mkB genomische DNA)
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, wobei es sich um mkb handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 (mkB genomische DNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 3, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz, aufweisend das Polynukleotid, wurde aus BCRC38072 isoliert. Hinzu kommt, dass der Fachmann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren wie PCR oder Hybridisierung anhand Offenbarung der Erfindung nacharbeiten kann. Hinweise auf die stringenten Bedingungen finden sich in der EP 1325959 A1 P7.
Diketid-Synthase biosynthetisiert einen Zweig des Monacolin K, nämlich Diketid, auch als 2-Methylbutyrat bezeichnet. Dieses Gen hat multifunktionelle Bereiche, einschliesslich einer β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase, eines Acyl-Carrier-Proteinsund einer Enoyl Reduktase.
Der Vergleich dieses Gens mit funktionellen Bereichen anderer Arten zeigt, dass die funktionellen mkB-Bereiche von Monascus BCRC38072 hohe Ähnlichkeiten mit dem lovF-Gen von Aspergillus terreus und dem mlcB-Gen von Penicillium citrinum aufweisen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor, mit einem isolierten DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkb handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 3, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert. Werkzeuge für die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors umfassen molekulare Sequenzen, die selbst-replizierend oder integrierbar in das Chromosom einer Wirtszelle sind, z. B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus. Der erfindungsgemäße Vektor bildet außerdem durch Gen-Shuffling verschiedene Polyketid-Produkte. Hinweise auf Gen-Shuffling können in den US Patenten No: 6,221,641 und US Patent No: 6,391,594 gefunden werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Transformant, der mit einem Polynukleotid der isolierten DNA transformiert wurde, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkb handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 3, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Bildung des Transformants. Die Wirtszelle schliesst Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Die Transformation kann durch Anwendung einer Transformationsmethode für filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, die das bekannte Wirt-Vektor-System verwendet, bewerkstelligt werden. Siehe EP 1325959 A1 P5.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produktion, das folgende Schritte aufweist: (a) Transformation des Polynukleotids, aufweisend die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 3, oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 3, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; und (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Produktion. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Transformation des Polynukleotids, aufweisend die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 3 oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 3, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und die wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind, und (c) Aufreinigen des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
(IV) Transkriptionsfaktor (mkH genomische DNA)
Die Erfindung bezieht sich auf ein DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt, welches eine Nukleotid- Sequenz aus SEQ ID NO: 9 (mkH genomische DNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 9, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz wurde aus BCRC38072 isoliert. Hinzu kommt, dass der Fachmann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren wie PCR oder Hybridisierung anhand der Offenbarung der Erfindung nacharbeiten kann. Hinweise auf die stringenten Bedingungen finden sich in der EP 1325959 A1 P7.
Das mkH-Gen wurde anhand eines Vergleichs mit Vector NTI als Zn(II)Cys6-Binuklear-Motiv identifiziert. Die konservierte Sequenz dieses Gens lautet Cys-X2-Cys-X6-Cys-X11-Cys-X2-Cys-X6-Cys, wie in 4 gezeigt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor, der mit einem isolierten DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 9, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert. Werkzeuge für die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors umfassen molekulare Sequenzen, die selbst-replizierend oder integrierbar in das Chromosom einer Wirtszelle sind, z. B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus. Bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressions-Vektor.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Transformant, der mit der isolierten DNA transformiert wurde, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkh handelt, aufweisend eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 9, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Bildung des Transformants. Die Wirtszelle schließt Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Die Transformation kann durch Anwendung einer Transformationsmethode für filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, die das bekannte Wirt-Vektor-System verwendet, bewerkstelligt werden. Siehe EP 1325959 A1 P5.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Expressions-System. Das Expressions-System weist ein Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt, mit einer Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9 auf, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 9, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Expression der Nukleotid-Sequenz. Die Sequenz wird mittels Transformation in die Wirtszelle transformiert. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produktion, das folgende Schritte aufweist: (a) Transformation des Polynukleotids, wobei es sich um mkH handelt, aufweisend die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 9, oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 9, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; und (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Produktion. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Transformation des Polynukleotids, wobei es sich um mkH handelt, aufweisend die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 9 oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 9, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und die für ein Protein mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind, und (c) Aufreinigen des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors. Die Wirtszelle schliesst Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072.
(V) HMG-CoA Reduktase-Inhibitor und Monacolin K-Produktion
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Bildung des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors, bevorzugt für die Bildung von Monacolin K. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Transformation eines Polynukleotids, aufweisend die Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 (mkA genomische DNA), SEQ ID NO: 3 (mkB genomische DNA), SEQ ID NO: 6 (mkE genomische DNA), und SEQ ID NO: 7 (mkF genomische DNA), oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit diesen Sequenzen, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, in eine Wirtszelle, wobei die Polynukleotide für Polypeptide mit Nonaketid-Synthase-, Diketid-Synthase-, Dehydrogenase- bzw. Transesterase-Aktivität codieren; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenzen geeignet sind; und (c) Aufreinigung von Monacolin K. Die Wirtszelle schließt Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Hutchinson et al. (2000) schlugen vor, dass bei heterologer Expression vier Gene für die Lovastatin-Synthese erforderlich sind, wobei es sich um Nonaketid-Synthase, Diketid-Synthase, Dehydrogenase, und Transesterase handelt. Dabei tragen Nonaketid-Synthase und Dehydrogenase zur Bildung des Lovastatin-Vorläufers bei, Diketid-Synthase unterstützt die Bildung von 2-Methylbutyrat, und das gebildete 2-Methylbutyrat bindet mit Hilfe der Transesterase an das Nonaketid und bildet so das komplette Lovastatin.
Das oben genannte Verfahren weist weiterhin Polynukleotide, aufweisend eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 4 (mkC genomische DNA), SEQ ID NO: 5 (mkD genomische DNA), SEQ ID NO: 8 (mkG genomische DNA), SEQ ID NO: 9 (mkH genomische DNA), und SEQ ID NO: 10 (mkI genomische DNA), oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit diesen Sequenzen, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, auf, wobei diese Polynukleotide für Polypeptide mit P450 Monooxygenase-, Oxidoreduktase, HMG-CoA Reduktase, Transkriptionsfaktor-, bzw. Efflux-Pumpen-Aktivität codieren.
(VI) Nonaketid-Synthase (mkA cDNA)
Die Erfindung bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches die Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 (mkA cDNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 19, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz wurde aus BCRC38072 isoliert. Hinzu kommt, dass der Fachmann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren wie PCR oder Hybridisierung anhand der Offenbarung der Erfindung nacharbeiten kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor mit einem isolierten DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 (mkA cDNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 19, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert. Werkzeuge für die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors umfassen molekulare Sequenzen, die selbstreplizierend oder integrierbar in das Chromosom einer Wirtszelle sind, z. B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus. Bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressions-Vektor. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Vektor um pPICZ[alpha]A (Invitrogen). Das erfindungsgemäße Konstrukt ist pPICZamkA, welches die Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 aufweist. Das Konstrukt pPICZamkA wurde durch Klonieren der vollständigen cDNA des mkA-Gens in pPICZ[alpha]A gemäß den Methoden, die in ”Molecular Cloning” beschrieben sind, hergestellt. Verschiedene Polyketide können bei Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors durch Gen-Shuffling hergestellt werden. Hinweise auf Gen-Shuffling können in den US Patenten No: 6,221,641 und US Patent No: 6,391,594 gefunden werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Transformant, der mit der isolierten DNA transformiert wurde, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt, und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 19, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Bildung des Transformants. Die Wirtszelle schliesst Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Die Transformation kann durch Anwendung einer Transformationsmethode für filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, die das bekannte Wirt-Vektor-System verwendet, bewerkstelligt werden. Siehe EP 1325959 A1 P5.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produktion, das folgende Schritte aufweist: (a) Transformation des Polynukleotids mit der Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 19, oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 19, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und die für ein Protein mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; und (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Produktion. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Transformation des Polynukleotids mit der Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 19 oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 19, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und die für ein Protein mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind, und (c) Aufreinigen des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
(VII) Diketid-Synthase (mkB cDNA)
Die Erfindung bezieht sich auf ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkB handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 20 (mkB cDNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 20, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz wurde aus BCRC38072 isoliert. Hinzu kommt, dass der Fachmann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren wie PCR oder Hybridisierung anhand der Offenbarung der Erfindung nacharbeiten kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor mit dem isolierten DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkb handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 20 (mkB cDNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 20, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert. Werkzeuge für die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors umfassen molekulare Sequenzen, die selbstreplizierend oder integrierbar in das Chromosom einer Wirtszelle sind, z. B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus. Bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressions-Vektor. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Vektor um pPICZ[alpha]C (Invitrogen). Das erfindungsgemäße Konstrukt ist pPICZamkB, welches die Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 20 aufweist. Das Konstrukt pPICZamkB wurde durch Klonieren der vollständigen cDNA des mkB-Gens in pPICZ(alpha)C gemäß den Methoden, die in ”Molecular Cloning” beschrieben sind, hergestellt. Verschiedene Polyketide können bei Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors durch Gen-Shuffling hergestellt werden. Hinweise auf Gen-Shuffling können in den US Patenten No: 6,221,641 und US Patent No: 6,391,594 gefunden werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Transformant, der mit der isolierten DNA transformiert wurde, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkB handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 20 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 20, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Bildung des Transformants. Die Wirtszelle schließt Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Die Transformation kann durch Anwendung einer Transformationsmethode für filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, die das bekannte Wirt-Vektor-System verwendet, bewerkstelligt werden. Siehe EP 1325959 A1 P5.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produktion, das folgende Schritte aufweist: (a) Transformation mit der isolierten DNA, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkB handelt, welches eine Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 20, oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 20, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, aufweist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; und (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Produktion. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Transformation mit der isolierten DNA, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkB handelt, welches die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 20 oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 20, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, aufweist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Diketid-Synthase-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind, und (c) Aufreinigen des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
(VIII) Transkriptionsfaktor (mkH cDNA)
Die Erfindung bezieht sich auf ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 25 (mkH cDNA) aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 25, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert. Die DNA-Sequenz wurde aus BCRC38072 isoliert. Hinzu kommt, dass der Fachmann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz mittels bekannter Verfahren wie PCR oder Hybridisierung anhand der Offenbarung der Erfindung nacharbeiten kann. Hinweise auf die stringenten Bedingungen finden sich in der EP 1325959 A1 P7.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor mit dem isolierten DNA-Molekül, aufweisend das Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 25 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 25, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert. Werkzeuge für die Konstruktion des erfindungsgemäßen Vektors umfassen molekulare Sequenzen, die selbstreplizierend oder integrierbar in das Chromosom einer Wirtszelle sind, z. B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Virus. Bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressions-Vektor. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Vektor um pMS. Das erfindungsgemäße Konstrukt ist pMSmkH, welches die Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 25 aufweist. Das Konstrukt pMSmkH wurde durch Klonieren der vollständigen cDNA des mkH-Gens in pMS gemäß den Methoden, die in ”Molecular Cloning” beschrieben sind, hergestellt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Transformant, das das isolierte DNA-Molekül aufweist, aufweisend das Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt, welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 25 aufweist, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 25, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, sowie eine Wirtszelle für die Bildung des Transformants. Die Wirtszelle schließt Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072. Die Transformation kann durch Anwendung einer Transformationsmethode für filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus, die das bekannte Wirt-Vektor-System verwendet, bewerkstelligt werden. Siehe EP 1325959 A1 P5.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Expressions-System. Das Expressions-System weist ein Polynukleotid auf, wobei es sich um mkH handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 25 auf, oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 25, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, sowie eine Wirtszelle, die sich für die Expression der Nukleotid-Sequenz eignet, wobei die Sequenz mittels Transformation in die Wirtszelle transformiert wird. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC38072.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produktion, das folgende Schritte aufweist: (a) Transformation des DNA-Moleküls, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkH handelt, welches die Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 25, oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 25, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, aufweist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; und (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Erhöhung der HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-Produktion. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Transformation des Polynukleotids mit der Nukleotid Sequenz aus SEQ ID NO: 25 oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit SEQ ID NO: 25, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit diesen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Transkriptionsfaktor-Aktivität codiert, in eine Wirtszelle; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenz geeignet sind, und (c) Aufreinigen des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors. Bevorzugt ist die Wirtszelle ursprünglich eine Monacolin K-produzierende Zelle.
(IX) HMG-CoA Reduktase-Inhibitor und Monacolin K-Produktion
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Bildung des HMG-CoA Reduktase-Inhibitors, bevorzugt für die Bildung von Monacolin K. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Transformation von DNA-Molekülen, aufweisend Polynukleotide, welche eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 (mkA cDNA), SEQ ID NO: 20 (mkB cDNA), SEQ ID NO: 23 (mkE cDNA), und SEQ ID NO: 24 (mkF cDNA), oder einer Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit diesen Sequenzen, oder einer Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, aufweisen, in eine Wirtszelle, wobei die Polynukleotide für Polypeptide mit Nonaketid-Synthase-, Diketid-Synthase-, Dehydrogenase- bzw. Transesterase-Aktivität codieren; (b) Kultivierung der transformierten Zelle bei Bedingungen, die für die Expression der Nukleotid-Sequenzen geeignet sind; und (c) Aufreinigung von Monacolin K. Die Wirtszelle schließt Prokaryonten oder Eukaryonten ein. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefen, tierische Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, oder filamentöse Pilze, sind aber nicht darauf limitiert. Die filamentösen Pilze können Monascus sp. sein, bevorzugt Monascus pilosus, Monascus ruber oder Monascus purpureus, besonders bevorzugt BCRC 38072. Hutchinson et al. (2000) schlugen vor, dass bei heterologer Expression vier Gene für die Lovastatin-Synthese erforderlich sind, wobei es sich um Nonaketid-Synthase, Diketid-Synthase, Dehydrogenase, und Transesterase handelt. Dabei tragen Nonaketid-Synthase und Dehydrogenase zur Bildung des Lovastatin-Vorläufers bei, Diketid-Synthase unterstützt die Bildung von 2-Methylbutyrat, und das gebildete 2-Methylbutyrat bindet mit Hilfe der Transesterase an das Nonaketid und bildet so das komplette Lovastatin.
Das oben genannte Verfahren weist weiterhin Polynukleotide, welche eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 21 (mkC cDNA), SEQ ID NO: 22 (mkD cDNA), SEQ ID NO: 25 (mkH genomische DNA), und SEQ ID NO: 26 (mkI genomische DNA), oder eine Nukleotid-Sequenz mit 95%iger Homologie mit diesen Sequenzen, oder eine Nukleotid-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, auf, wobei diese Polynukleotide für Polypeptide mit P450 Monooxygenase-, Oxidoreduktase, HMG-CoA Reduktase, Transkriptionsfaktor-, bzw Efflux-Pumpen-Aktivität codieren.
Beispiele
Beispiel 1: Kultivierung von Monascus
Monascus wurde auf PDA-Platten (Kartoffel-Dextrose Agar) aufgeimpft und bei 30°C kultiviert. Hyphen und Sporen wurden abgekratzt, 50 ml Medium (7% Glycerin, 3% Glukose, 3% MSG, 1.2% Polypepton, 0.2% NaNO3, 0.1% MgSO4·7H2O) geimpft, und unter Schütteln bei 25°C kultiviert.
Beispiel 2: Erstellung der Monascus BAC Genbank
A. Präparation der Monascus-Zellkerne
Monascus-Zellen wurden gesammelt, mit ddH2O gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das 10-fache Volumen vorgekühlten Waschpuffers (HB-Puffer + 1.5% [beta]-Mercaptoethanol) wurde zu den getrockneten Zellen hinzugefügt, und die Zellen wurden in einem Mixer homogenisiert. Monascus-Zellkerne wurden durch Filtration mit Miracloth aufgefangen.
B. Präparation von Gel-Plugs und chromosomaler DNA
1.8%ige Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt wurde in HB-Puffer angerührt und in einem 50°C-Wasserbad aufbewahrt. Gleiche Volumina an Agarose und Zellkern-Lösung wurden sorgfältig gemischt und in Plug molds (Bio-Rad) gegeben. Unreinheiten wurden mit Proteinase K (1 mg/ml) behandelt. Die flugs wurden in kleine Teile aufgespalten und mit HindIII teilverdaut. Nach der Restriktionsreaktion wurden die flugs in einem 1%igen Agarosegel mit Puls-Elektrophorese analysiert. DNA-Fragmente mit 200 kb wurden mittels Elektroelution aus dem Gel zurückgewonnen.
C. Erstellung der Monascus-Genbank
pIndigoBAC-5 HindIII ready (Epicentre) wurde als Vektor für die Ligation mit der zurückgewonnenen DNA verwendet. Der Ligations-Reaktant wurde dann mittels Elektroporation in kompetente Zellen gebracht. (Epicentre, TransforMax^TM, EC 100^TM elektrokompetente E. coli). Kolonien wurden in 384-Mikrotiterplatten aufbewahrt.
Beispiel 3: Entwicklung der Primer für die Sonden und Präparation der Sonden
Die PCR und die Sequenzierung wurden mit degenerierten Primern durchgeführt, und die zurückgewonnene DNA-Sequenz wurde als Basis für die Entwicklung von Primern für eine 226bp-Sonde, wie in Anhang 1 gezeigt, verwendet. Die Software Vector NTI wurde für die Entwicklung der Primer verwendet, und die entwickelten Primer sind unten aufgelistet.
Eine DNA-Sequenz mit DIG-11-dUTP (Roche, PCR DIG Probe Synthese Kit) wurde mittels PCR amplifiziert und als Sonde verwendet.
Beispiel 4: Analyse der Kolonie-Hybridisierung und Extraktion der BAC DNA
Eine Ecke der Nylonmembran (Roche) wurde abgeschnitten, um die Richtung zu markieren, und die Nylonmembran wurde dann auf eine Platte gelegt, die Kolonien enthielt.
Die Nylonmembran wurde anschliessend mit der Kolonieseite nach oben 5 min mit dem Lysepuffer (2N NaOH, 0.1% SDS), 5 min mit 0.5 mol/l NaOH/1.5 M NaCl-Lösung, 5 min mit 1.5 mol/l NaCl/0.5 M Tris-HCl (pH 7.4), und 5 min mit 2 × SSC kontaktiert. Die DNA wurde dann auf der Nylonmembran mit UV-Licht immobilisiert. Die erhaltene Nylonmembran wurde für die Hybridisierung und Immunodetektion (Roche) verwendet. Anschliessend wurden die in der Reaktion detektierten Kolonien kultiviert, und die BAC DNA wurde mit dem Large-Construct Kit (Qiagen) extrahiert.
Beispiel 5: Analyse der Shotgun-Sequenz
A. Präparation einer Shotgun-Genbank
3–5 mg der BAC DNA wurde so sonifiziert, dass sie unter geeigneten Sonifikationsbedingungen Großen von 1–2 kb annahm, und die Ergebnisse wurden mittels Elektrophorese überprüft. Die DNA wurde dann mit Ba131-Nuklease und T4 DNA-Polymerase repariert, so dass sie stumpfe Enden aufwies, und DNA-Fragmente mit 1–2 kb wurden aus der Elektrophorese zurückgewonnen. Die Ligation wurde mit pUCl8/SmaI/CIAP (50 ng/ml) (Pharmacia) als Vektor durchgeführt, und der Ligations-Reaktant wurde mittels Elektroporation in E. coli DH5α eingebracht.
B. DNA-Sequenzierung und Analyse
Plasmid-DNA wurde im Hochdurchsatz mit einer 96-Mikrotiterplatte extrahiert, und die gewonnene Plasmid-DNA wurde mit einem ABI Bigdye v3.0 Kit sequenziert. Die Sequenz-Analyse wurde mit einem ABI3700 Sequenzer mit 10-facher Coverage durchgeführt.
Beispiel 6: DNA Sequenz-Assemblierung und Identifikation
Der DNA-Sequenz-Assemblierung wurde mit Phred-Phrap-Consed, entwickelt durch das Phil Green Lab, durchgeführt. Die vollständige BAC wurde überdies mit Vektor NTI und BLAST identifiziert.
Beispiel 7: Extraktion der Monascus Gesamt-RNA und RT-PCR-Reaktion
0.2 g Monascus-Hyphen wurden in einen Mörser gebracht, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und dann pulverisiert. Die Gesamt-RNA wurde mit Hilfe eines Trizol-Reagenzes (Invitrogen) und Chloroform extrahiert, und in DEPC-H2O aufgelöst. RNA wurde als Matritze für die Reverse Transkription verwendet (Promega, ImProm-IITM Reverse Transcription System), um eine vollständige cDNA zu erhalten. Die vollständige cDNA wurde in einen TA-Vektor (Promega, pGEM-T Vektor system) ligiert.
Beispiel 8: RNA-Elektrophorese und Northern Blot A. RNA-Elektrophorese
Es wurde ein 1.2%iges Agarosegel mit einem Formaldehyd-Gel-Laufpuffer und Formaldehyd hergestellt. Die RNA wurde sorgfältig mit dem Formaldehyd-Gel-Laufpuffer, Formaldehyd (37%) und Formamid vermischt.
Die RNA-Elektrophorese wurde durchgeführt, und das Gel wurde mit EtBr gefärbt.
B. Transfer der RNA
Eine Nylonmembran wurde entsprechend der Größe des Gels ausgeschnitten, und eine Ecke der Nylonmembran wurde abgeschnitten, um die Richtung zu markieren. Der RNA-Transfer vom Gel auf die Nylonmembran wurde durchgeführt, und die RNA wurde auf der Nylonmembran mit UV-Licht immobilisiert. Die erhaltene Nylonmembran wurde für die Hybridisierung und Immunodetektion (Roche) verwendet.
Beispiel 9: Entwicklung von Primern für Sonden und Präparation der Sonden
Für die Präparation der Sonden, die für den Northern Blot verwendet wurden, wurden Primer gemäß der BAC DNA-Sequenz entwickelt. Die entwickelten Primer sind unten aufgelistet.
Beispiel 10: Transformation von Pichia pastoris
Die vollständigen cDNAs aus PKS (mkA und mkB) wurden in pPICZ[alpha]A bzw. C (Invitrogen) ligiert. Die Transformation wurde mit dem Pichia EasyComp. Kit (Invitrogen) durchgeführt.
Beispiel 11: Southern Blot
Eine saure Depurinierung wurde durchgeführt, indem das Gel mit 0.25 mol/l HCl überschichtet und 10 min auf einem Flachbettschüttler geschüttelt wurde, und das Gel wurde mit ddH2O gewaschen. Anschließend wurde die Denaturierung durchgeführt, indem das Gel zweimal für 15 min unter Schütteln mit NaCl/NaOH-Lösung (1.5 mol/l NaCl, 0.5 N NaOH) überschichtet wurde, und das Gel wurde dann mit ddH2O gewaschen. Anschließend wurde eine Neutralisierung durchgeführt, indem das Gel zweimal für 15 min unter Schütteln mit NaCl/Tris-HCl-Lösung (1.5 Mmol/l NaCl, 1 mol/l Tris-HCl, pH 7.4) überschichtet wurde.
Eine Nylonmembran mit derselben Größe wie das Gel wurde vorbereitet, und eine Ecke der Nylonmembran wurde abgeschnitten, um die Richtung zu markieren. DNA wurde vom Gel auf die Nylonmembran transferiert und auf der Nylonmembran mit UV-Licht immobilisiert. Die erhaltene Nylonmembran kann für die Hybridisierung und Immunodetektion (Roche) verwendet werden.
Für die Präparation der Sonden, die für den Northern Blot verwendet wurden, wurden Primer gemäß der BAC DNA-Sequenz entwickelt. Die unten aufgelisteten Primer wurden die Präparation der Sonden, die für den Southern Blot verwendet wur den, entwickelt.
Beispiel 12: Produktion von Polyketid
Die Verwendung von E. coli und Streptomyces als Wirtszellen für die heterologe Polyketid-Synthase-Expression wurde von Redford (1995), Gokhale (1999) und Pfeifer (2001) untersucht. Darüber hinaus wurden bakterielle Polyketid-Synthasen erfolgreich in E. coli und Streptomyces exprimiert, und es wurde eine geringere Ausbeute an Polyketid beobachtet. Allgemein verhindert das Fehlen der posttranslationalen Modifikation in E. coli die heterologe Expression funktioneller Polyketid-Synthasen. Aus diesem Grunde ist es sinnvoll, PKS mit 4'-Phosphopantethein-Transferase (PPTase) zu co-exprimieren, um so holo-ACP (Acyl-Carrier-Protein)-Domänen der PKS für die Polyketid-Produktion zu produzieren (Mootz et al., 2001). Um die Expressionswirkung des erfindungsgemäßen Expressions-Vektor weiter zu untersuchen, wurde das sfp-Gen (PPTase) von Bacillus subtilis durch Klonierung erfolgreich in den Expressions-Vektor pCDF-1b (6) integriert und mit PKS, mkA-Gen (5), in E. coli exprimiert. Das Ergebnis der SDS-PAGE zeigte eine geringere Ausbeute des löslichen Proteins (342 kDa) der PKS (7). Allerdings war der größte Protein-Anteil des Sfp löslich und führte zu der Expression eines 29 kDa-Proteins.
1. Konstruktion von Expressions-Plasmiden
Das partielle cDNA-Fragment (6.5 kb cDNA mit dem forward primer p3: 5'-CCATCAAGGATGCTCTGTCG-3' (SEQ ID NO: 49) und dem reverse primer p4: 5'-TCAAGCCAACTTCAACGCGG-3' (SEQ ID NO: 50)) des mkA-Gens wurde aus dem ersten Strang der cDNA von Monascus mittels RT-PCR amplifiziert. Das 6.5 kb cDNA-Fragment wurde in den pGEM-T-Vektor integriert, um das EcoRI-NotI-Fragment mittels Restriktions-Reaktion zu erhalten. Dann wurde das Fragment mit pET30 ligiert, um so pETmkA1 zu erzeugen. Ein Satz Oligonukleotid-Primer mit dem forward primer p1: 5'-GGAATTCATGTACGTAGGACGCATTGGTGC-3' (SEQ ID NO: 51), der 23 Basen, die komplementär zum 5' mkA-Gen waren, sowie eine EcoRI Restriktionsstelle enthielt, und dem reverse primer p2: 5'-TCGCGAGGACGGACAAAGTT-3' (SEQ ID NO: 52) wurde entwickelt, um die die partielle 3.0 kb cDNA mittels RT-PCR zu amplifizieren. Das 3.0 kb EcoRI-EcoRI cDNA-Fragment wurde mit pETmkA1 ligiert, um so pETmkA (6) zu erzeugen.
Ein Satz Oligonukleotid-Primer mit dem forward primer 5'-CGGGATCCCATGAAGATTTACGGAATTTA-3' (SEQ ID NO: 53), der 20 Basen, die komplementär zum 5' sfp-Gen waren, sowie eine BamHI Restriktionsstelle enthielt, und dem reverse primer 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTTATAAAAGCTCTTCGTACG-3' (SEQ ID NO: 54), der 20 Basen, die komplementär zum 5' sfp-Gen waren, sowie eine NotI Restriktionsstelle enthielt, wurde entwickelt, um das sfp-Gen aus der genomischen DNA von Bacillus subtilis 168 zu amplifizieren. Das BamHI-NotI-sfp-Gen wurde mit pCDF-1b ligiert, um pCDFsfp (7) zu erzeugen.
2. Co-Expression von mkA und sfp in E. coli
Sowohl pETmkA als auch pCDFsfp wurden in E. coli BL21 (DE3) co-transformiert, und LB-Medium wurde mit einer einzelnen Kolonie geimpft, und über Nacht kultiviert. Dann wurde das LB-Medium in ATCC-Medium 765 überführt, das mit 10% Glycerin angereichert war, und die Kultur wuchs, bis eine OD600 von 0.6–0.8 er reicht war. Die Genexpression wurde induziert, in dem 1.0 mM (finale Konzentration) Isopropyl β-D-Thiogalactosid (IPTG) hinzugefügt wurde, und die Kultur 48 h bei 20°C inkubiert wurde. Das Zell-Pellet wurde geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren, und bei 42°C aufgetaut, um die Zellen zu lysieren. Um die Lyse zu erleichtern, wurde dem Zell-Pellet Lysozym hinzugefügt. Die Protein-Expression wurde mittels SDS-PAGE (7.5%ige Gele) des gesamten Zell-Proteins und des löslichen Proteins, und anschließender kolloidaler Coomassie-Blau-Färbung beobachtet.
Literatur:

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Sequenzprotokoll:

Claims

Ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aktivität, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase, und dem Acyl-Carrier-Protein, codiert; oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit Nonaketid-Synthase-Aktivität codiert.
Ein Shuttle-Vektor, aufweisend das isolierte DNA-Molekül gemäß Anspruch 1.
Ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, wobei es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 19 aufweist, oder ein Polynukleotid, das zu diesem komplementär ist, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aktivität, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase, und dem Acyl-Carrier-Protein, codiert.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 4, wobei das Polypeptid Nonaketid-Synthase-Aktivität aufweist.
Ein Expressions-Vektor, aufweisend das isolierte DNA-Molekül gemäß Anspruch 4.
Eine Zelle, die mit einem Polynukleotid der isolierten DNA gemäß Anspruch 1 oder 4 transformiert wurde, wobei die Zelle keine menschliche embryonale Stammzelle ist.
Zelle gemäß Anspruch 7, wobei die Zelle ein Bakterium, eine Hefezelle, eine tierische Zelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzellen oder ein filamentöser Pilz ist.
Zelle gemäß Anspruch 7, wobei die Zelle Monascus sp. ist.
Zelle gemäß Anspruch 7, wobei die Zelle ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Monascus pilosus, Monascus ruber, und Monascus purpureus.
Ein Verfahren für die Erhöhung der Monacolin K-Produkton, aufweisend: I) das Kultivieren einer Monacolin K-produzierenden Zelle, die mit einem Polynukleotid der isolierten DNA gemäß Anspruch 1 oder 4 transformiert wurde; und II) das Aufreinigen von Monacolin K aus der Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Kultivierungsschritt I) mit einer Zelle durchgeführt wird, die außerdem mit einem Polynukleotid transformiert wurde, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkB handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 oder 20 aufweist; b) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkC handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 4 oder 21 aufweist; c) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkD handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 5 oder 22 aufweist; d) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkE handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 6 oder 23 aufweist; e) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkF handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 7 oder 24 aufweist; f) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkH handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9 oder 25 aufweist; und g) einer Kombination daraus.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle ein Pilz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle Monascus sp. ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle ausgewählt ist aus einem Gruppe bestehend aus Monascus pilosus, Monascus ruber, und Monascus purpureus.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle Monascus BCRC38072 ist.
Verwendung einer transformierten Zelle für die Herstellung von HMG-CoA Reduktase-Inhibitor, wobei: die HMG-CoA Reduktase-Inhibitor-produzierenden Zelle mit einer Gruppe von Polynukleotiden transformiert wurde, umfassend: a) ein Polynukleotid, bei dem es sich um mkA handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 2 oder 19 aufweist, wobei das Polynukleotid für eine Polyketid-Synthaseaktivität codiert; b) ein Polynukleotid, bei dem es sich um mkB handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 3 oder 20 aufweist, wobei das Polynukleotid für eine Polyketid-Synthaseaktivität codiert; c) ein Polynukleotid, bei dem es sich um mkE handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 6 oder 23 aufweist, wobei das Polynukleotid für eine Dehydrogenaseaktivität codiert; und d) ein Polynukleotid, bei dem es sich um mkF handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 7 oder 24 aufweist, wobei das Polynukleotid für eine Transesteraseaktivität codiert.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der HMG CoA-Reduktase-Inhibitor Monacolin K ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Zelle ein Pilz ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Zelle Monascus sp. ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Zelle ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Monascus pilosus, Monascus ruber, und Monascus purpureus.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Zelle Monascus BCRC38072 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Zelle darüber hinaus mit einem Polynukleotid transformiert wurde, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkC handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 4 oder 21 aufweist; ii) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkD handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 5 oder 22 aufweist; iii) einem Polynukleotid, bei dem es sich um mkH handelt und welches eine Nukleotid-Sequenz aus SEQ ID NO: 9 oder 25 aufweist; und iv) einer Kombination daraus.
Ein isoliertes DNA-Molekül, aufweisend ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, aufweisend eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID NO: 11, wobei das Polypeptid eine Aktivität aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Ketoacyl-Synthase, Acetyl-Transferase, Dehydratase, Methyltransferase, Ketoreduktase und Acyl-Carrier-Protein.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 24, wobei das Polypeptid eine Nonaketid-Synthase-Aktivität aufweist.
Ein Expressions-Vektor, aufweisend das isolierte DNA-Molekül gemäß Anspruch 24.