NL8000058A

NL8000058A - Proefreagens en werkwijze voor een storingsvrije bepaling van oxyderende stoffen.

Info

Publication number: NL8000058A
Application number: NL8000058A
Authority: NL
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1979-02-23
Filing date: 1980-01-04
Publication date: 1980-08-26
Also published as: DE3000380C2; US4247297A; BE881444A; FR2449889A1; GB2045428A; AT365342B; DK79080A; JPS55121149A; SE8001064L; GB2045428B; CA1114725A; IL59006A0; DE3000380A1; JPH022103B2; NO800498L; LU82180A1; FI800182A7; IL59006A; FR2449889B1; ZA797017B

Description

* ’"'é Ά YO 8875

Titel: Proefreagens en werkwijze voor een storingsvrije bepaling van oxyderende stoffen.

De uitvinding betreft diagnostische proeven en meer in het bijzonder proeven voor het kwalitatief en kwantitatief bepalen van biologische componenten, zoals glucose en urinezuur, waarbij dit soort componenten worden omgezet in een oxyderende stof, zo-5 als een percocyde.

Glucoseoxydase zet glucose enzymatisch cm in gluconzuur en waterstof percocyde. Dit waterstofperoxyde kan tot water worden gereduceerd door een peroxydatief actieve stof bij aanwezigheid van een indicatorsysteem, dat wordt geoxydeerd tot een respons, 10 zoals een kleursverandering. De chramogene indicataro-tolidine is gedurende enige tijd bij glucoseproefsystemen toegepast, maar levert resultaten, waarbij de geoxydeerde indicator kan worden gereduceerd door storende verbindingen, zoals ascorbinezuur,

Yoorts staat de veiligheid van o-tolidine ter discussie.

15 Yoorts zet uricase urinezuur cm in allantoïne en waterstof peroxyde. Ook dit waterstofperoxyde kan door een peroxydatief actieve stof bij aanwezigheid van een indicatorsysteen, meestal o-dianisidine, worden gereduceerd.

Meer recentelijk hebben Gochman en Schmitz een proef be-20 schreven onder toepassing van 3-methyl-2-benzothiazolinon-hydra- zonhydrochloride met If,JT-dimethylaniline, waarbij een azokleurstof-indicator wordt gevormd bij bepalingen van urinezuur, Clin. Chem.

17, 115^ (1971)3en glucose, Clin. Chem. l8, 9^3 (1972). Hoewel erkend wordt, dat het mengsel met Η,Η-dimethylaniline meer resis-25 tent is dan o-tolidine, leverde de gevoeligheid voor een storing door ascorbinezuur duidelijke fouten bij urinezuur en glucose-bepalingen.

Het mechanisme van het axydatief koppelen van heterocyclische hydrazonen met fenolen, aromatische aminen en andere ver-30 bindingen bij de klassieke azokoppelingsreactie is kort weergegeven in ZoHingen, Azo and Diazo Chemistry, Interscience,

Hew York, biz. 215-217 (l96l). Eeh overzicht van bet oorspronke- 80 0 0 0 58 ______' -2- lijke werk , gericht op de vorming van azokleurstoffen door een oxy datieve koppeling^van Hunig en medewerkers in Duitsland (1957-681) is verwerkt in Baer, Cationic Dyes for Synthetic Fibers, Venkataraman (ed.), The Chemistry of Synthetic Dyes, vol. U, 5 Academic Press, N.Y., biz. 188-193 (1971)·

Volgens Amerikaans octrooischrift 3*979.262 wordt een buffer van citroenzuur of maleïnezuur aan het mengsel volgens Gocbman et al., supra, toegevoegd, en daarbij vermeld, dat behalve U,U-dimethylaniline ook andere aromatische aminen kunnen worden ge-10 bruikt, zolang ze. niet zowel op de ortho- als de paraplaatsen zijn gesubstitueerd. De buffer is eveneens critisch en moet een voorbepaald pH-traject tussen 3,2 en U,7 voor een urinezuurbe-paling handhaven en tussen en 5»5 voor een glucose- of choles-terolbepaling.

15 Voorzover de stand vaade techniek het gebruik van hydrazon- indicatoren bij een analyse van HgOg voorschrijft wordt gesuggereerd, dat de reactie tussen 3-methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (ΜΒΤΞ) en dimethylaniline resistent is tegen de invloeden van reducerende stoffen in het monster. Hoewel dit waar is bij indica-20 toren zoals o-tolidine, levert het gebruik van hydrazonindicatoren bij aanwezigheid van ascorbaat zeer slechte indicaties.

De pogingen van deze voorgangers cm een indicatorsysteem te maken, dat nagenoeg niet wordt gestoord door storende stoffen en dat gebruik maakt van erkend veilige indicatoren, zijn dus niet 25 geslaagd.

Het Amerikaanse octrooischrift U.119.^05 beschrijft tenslotte een toepassing van U,5-dihydroxy-2,7-naftaleendisulfonzuur en 1-hydroxy-2-naftaleensulfonzuur als hydrazonkoppelmiddelen. Anders dan de koppelaars volgens Eunziker zijn deze verbindingen geen 30 aminen. Hoewel beter dan de tot dusver gebruikte koppelmiddelen, laat hun gevoeligheid voor ascorbaat nog veel te wensen over.

De uitvinding betreft nu een verbeterde werkwijze voor het aantonen van oxyderende stoffen in lichaamsvloeistoffen, en wel speciaal oxyderende stoffen die enzymatisch uit andere clinisch 35 significante stoffen zijn gevormd. Tevens betreft de uitvinding 80 0 0 0 58 f 4 -3- een verbeterde proef op het aantonen van oxyderende stoffen in lichaamsvloeistoffen, welke zeer resistent is tegen storende reducerende verbindingen. De onderhavige voordelen worden daarbij bereikt via een nieuw indicatorsysteem, bestaande uit een hydrazon 5 en 8-amino-l-naftol-5,7-disulfonzuur (Chicagozuur).

De uitvinding wordt nu eerst aan de hand van de tekening nader toegelicht.

Fig. 1 is daarbij een grafische weergave van de cijfers weergegeven in voorbeeld III voor MBTH/Chicagozuur overeenkomstig de 10 uitvinding onderzocht bij aanwezigheid van ascorbinezuur bij verschillende pH-waarden, verkregen door een uitzetting van de optische dichtheid (0D), tegen de tijd; en fig. 2 een grafische weergave van de cijfers weergegeven in voorbeeld III voor de diverse MBTH-koppelaars onderzocht bij aan-15 wezigheid van ascorbinezuur in tris-malonaatbuffer met pH 7 onder de voorwaarde dat de dimethylanilinehelling werd waargenomen in een citroenzuurbuffer met pH 5·

De uitvinding betreft tevens proefreagentia, zoals een mengselc of uitrusting, een werkwijze voor het bereiden of vervaardigen 20 van deze uitrusting en een werkwijze voor het bepalen van tenminste een oxyderende stof, zoals een peraxyde. Meer in het bijzonder aavat het onderhavige proefreagens een hydrazon en 8-amino-l-naftol- 5,7-disulfonzuur (Chicagozuur). Voorts betreft de uitvinding een proefsysteem voor het bepalen van een bestanddeel in een monster 25 met reagentia die reageren op de aanwezigheid van dit bestanddeel waarbij tenminste een oxyderende stof ontstaat, alsmede een preparaat voor het bepalen van deze tenminste ene oxyderende stof, waarbij het preparaat een hydrazon en 8-amino-l-naftol-5,7-disulfonzuur anvat. Het proefsysteem is bij voorkeur van het type 30 dat bij enzymatische omzetting van bestanddelen van biologische vloeistoffen gevormde peroxyden bepaalt.. Indien in de vorm van een mengsel kan het reagens bij voorkeur worden verwerkt met een drager, zoals een tablet of een matrix, waardoor een proefuitrusting ontstaat. Het proefreagens is bijzonder gevoelig voor lage concentra-35 ties aan de te bepalen lichaamsvloeistofbestanddelen, terwijl ze 800 00 58 ' ...... ' '-U- voorts zeer resistent zijn tegen storende reducerende stoffen, zoals as cor "bine zuur, die veelal in lichaamsvloeistoffen: aanwezig zijn.

In het proefreagens omvatten de "bestanddelen, die reageren op een "bestanddeel in het monster en daaruit tenminste een oxyderende 5 stof vormen, glucoseoxidase "bij een glucosebepaling of uricase "bij een urine zuur bepaling alsmede een peraxydatief actieve stof. Karakteristiek voor dit soort peraxydatief actieve stoffen zijn peroxidase of hemoglobine, gebruikt wanneer vaterstofperoxyde de oxyderende. stof is.

10 In tegenstelling tot vroegere preparaten is het preparaat volgens de uitvining bijzonder gevoelig voor lage concentraties aan te bepalen lichaamsvloeistofbestanddelen, en bovendien zeer resistent tegen de effecten van concurrerende reducerende stoffen, speciaal ascorbinezuur, in urine. Aangezien een karakteristieke 15 kleursreactie plaatsvindt afhankelijk van de concentratie van de te bepalen oxyderende stof, is ook een kvantüJatieve bepaling voor dit soort lichaamsvloeistofccmponenten als glucose en urinezuur mogelijk.

Hoewel voor de duidelijkheid hieronder specifieke temen 20 warden gebruikt, betreffen deze temen slechts bepaalde uitvoeringsvormen volgens de uitvinding en beperken zij het bestek van de uitvinding niet.

Het proefreagens volgens de uitvinding kan vele fysische vermen bezitten en vele specifieke hydrazonen voor het koppelen 25 met het Chicagozuur cmvatten, onverschillig de toegepaste vorm. Verdere toeslagstoffen, zoals stabilisatiemiddelen kunnen worden gebruikt. Het proefreagens kan zowel in vloeibare als vaste vorm worden gebruikt evenals het proef systeem, waarbij een samenstelling" van het proefreagens als hieronder nader aangegeven wordt ge-30 bruikt.

De toe te passen hydrazonen zijn condensatieprodukten van een hydrazine met een aldehyde of keton en bevatten de'groep C=MH2. Vele hydrazonea kunnen oxydatief koppelen met hydroxy-naftaleensulfonaten en daarbij een gekleurd geheel vomen. Deze 35 omvatten o.m.: 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, l-methyl-2- 80 0 0 0 58 -5- t 4 chinolinonhydrazon, Hnnethyl-pyridon-^-hydrazon, N-methyl-pyridon- 2-hydrazon, 1-methyl-chinolinon-^-hydrazon, H-methyl-thiazolinon- 2-hydrazon, W-methyl-axazolinon-2-hydrazon, W-^iethyl-benzoxazolinon- 2-hydrazon en 1,3-dimethylbenzimidazolinon-2-hydrazorL. Volgens 5 een voorkeur suitvoeringsvorm van het preparaat wordt een alkyl)-2-benzothiazolinonhydrazonchrcmogeen, h.v. 3-methyl-2-henzothiazolinonhydrazon (MBTH) toegepast. Dit soort hydrazonen zijn sterk, reducerende middelen.

De gebruikte uitdrukking "hydrazon” omvat tevens de zuur-10 additiezouten daarvan. Elk gebruikelijk zuuradditiezout kan worden toegepast zoals die, welke worden gevormd met waterstofchloride, waterstofbrcmide, zwavelzuur, salpeterzuur e.d. Deze zuuradditiezout en kunnen op zichzelf of in combinatie met het corresponderende hydrazon worden gebruikt.

15 De molverhoudingen hydrazon/koppelmiddel liggen tussen ca. 17:1 en 1:17, waarbij nagenoeg equimolaire verhoudingen de voorkeur verdienen voor een optimale combinatie wat betreft gevoeligheid en storingsvrijheid.

Het preparaat kan voorts stabilisatiemiddelen omvatten, 20 zoals carboxymethylcellulose en polyoxyethyleenethers van vet-alcoholen (BRIJ van ICI United States).

Proefreagentia volgens de uitvinding en proefsystemen onder toepassing van mengsels van deze reagentia worden bij voorkeur toegepast in een over het algemeen neutraal of zwak basisch 25 pH-traject, hoewel ze ook bruikbaar blijven bij een iets lagere pH. Het handhaven van een nagenoeg neutrale of zwak alkalische pH levert een verbeterde reactiviteit wat betreft snelheid en storingsvrijheid, vergeleken met de stand van de techniek.

Het proefsysteem omvat behalve het preparaat volgens 30 de uitvinding reagentia die reageren op de aanwezigheid van een in een monster te bepalen bestanddeel, waarbij een cocyderende stof wordt gevormd die door het preparaat wordt bepaald. Dergelijke bestanddelen zijn liefst enzymatisch van aard, Wanneer b.v. glucose moet worden bepaald , zijn dat glucose oxydase en peroxidase, 35 terwijl bij een urinezuurbepaling uricase en peroxidase als 80 0 0 0 58 ' -6- zodanig worden toegepast. De concentraties en typen reagentia, bruikbaar als zodanige bestanddeel-reagentia zijn uit de stand van de techniek bekend.

Het proefreagens kan werden gebruikt als een oplossing voor 5 het bepalen van oxydatieve stoffen in een monster. Voorts kan het proefsysteem voor het bepalen van de in dit soort oxydatieve stoffen omgezette bestanddelen, in een vloeibare vorm worden gebruikt. Het proefsysteem wordt bij voorkeur toegepast voor het aantonen van. bestanddelen in biologische, b.v. lichaamsvloeistoffen, 10 waarbij het reagens wordt toegevoegd aan een monster, zoals urine, serum, cerebrospinaalvocht, weefselcultuurvloeistof of dergelijke. Voor bepalingen onder toepassing van het proefsysteem in een vloeistofvoim worden de peroxidasen. en/of oxidasen bij voorkeur van de andere reagentia gescheiden gehouden tot het 15 gebruik. De bepaling wordt uitgevoerd door toevoeging van het gescheiden reagens, zoals de peroxidase.

Bij toepassing in oplossing hetzij als proefreagens zelf of als een samenstelling daarvan in een proefsysteem, wordt het 8- · amino-l-naftol-5,7-disulfonzuur bij voorkeur in concentraties van -5 . _3 20 10 molair tot ca. 10 molair toegepast'. Ook het hydrazon wordt .. . . -5 bij voorkeur gebruikt m concentraties van ca. 10 molair tot _3 10 molair. Wanneer een of meer stabilisatiemiddelen worden toe-gevoegdjZÏjn deze bij voorkeur aanwezig in totaalconcentraties van ca. 0,5 mg/dl tot ca. 5S0 g/dl. Wanneer peroxidase tenminste 25 een van de reagentia is die moet reageren op het bestanddeel van het monster, worden bij voorkeur concentraties aan peroxidase gebruikt van 10 jig/1 tot ca. 500 ,ug/l. Het oplosmiddel dat wordt · toegepast bij het bereiden van de oplossingen kan water zijn, maar ook een fysiologische oplossing, een organisch oplosmiddel, 30 zoals methanol of mengsels daarvan.

Tevens betreft de uitvinding preefuitrustingen met daarin het proefreagens of het proefsysteem volgens de uitvinding en een werkwijze voor het maken van dit soort uitrustingen, welke methode cmvat het verwerken in een drager, zoals een matrix of 35 een tablet van het proefreagens of proefsysteem. Wanneer dit 80 0 0 0 58

ι I

-7- verwerken plaatsvindt door impregneren met een oplossing van een preparaat volgens de uitvinding, met inbegrip van het proefsysteem, wordt de drager aldus geïmpregneerd en daarna gedroogd. Behalve door impregneren kunnen de uitrustingen volgens de uitvinding ook 5 worden verkregen door andere passende technieken, zoals dooh drukken of sproeien van het preparaat op een substraat of matrix.

De proefuitrusting wordt hij voorkeur verkregen door een multi-daapelprocéd!. De concentraties aan reagentia gebruikt bij -3 de impregneeroplossingen liggen tussen ca. 10 molaar tot die van 10 een. verzadigde oplossing. Meestal wordt voor hydrazon en koppel- middel een concentratie voor elk van 0,02 mol gebruikt. De per- 3 3 oxidaseconcentratie ligt meestal tussen 0,015 mg/cm en 2 mg/cm aan oplossing.

Vaste preparaten worden bij voorkeur toegepast in de vorm van 15 een dragermatrix in strookfornaat. De uitdrukking dragermatrix betreft cpzuigende en niet-opzuigende matrices, die onoplosbaar zijn in en hun structuurintegriteit behouden bij contact met water of fysiologische vloeistoffen. Geschikte opzuigende matrices zijn b.v. papier, cellulose, hout, vliezen van synthetische harsen, 20 glasvezels, geweven en niet geweven textiel e.d. Niet opzuigende matrices omvatten organo-plastische materialen, zoals polypropeen e.d. Wanneer een op zuigende matrix wordt gebruikt wordt deze matrix liefst gehecht op een passend orgaan, b.v. met tape op een onoplosbare drager, zoals een organoplastische strook, b.v. van 25 polystyreen voor een gemakkelijker gebruik.

Ook kunnen de mengsels volgens de uitvinding werden verwerkt in een drager, die de vorm heeft van een geslagen of gevormd tablet met daarin een gebruikelijk dragermateriaal.

Deze proefuitrusting wordt liefst toegepast door hem 30 een ogenblik te danpelen in een proefmonster of hem anderszins met het proefmonster in contact te brengen, waarna een aantoonbare kleursverandering resulteert indien axydatieve componenten in het monster aanwezig zijn. De proefuitrusting kan worden gebruikt op dezelfde wijze indien monsters van plasma, serum 35 of andere lichaamsvloeistoffen worden onderzocht.

80 0 0 0 58 -8-

De relatie tassen K (de absorptiecoëfficiënt ran het monster), weergegeven in enkele voorbeelden, en de concentratie absorberend species (b.v. urinezuur of glucose) wordt weergegeven door de Kubelka-Monk-verhouding, die wordt weergegeven met een discussie 5 over de reflectantiespectrofotcmetrie in Kortümi, Reflectance Spectroscopy, Springer-Verlag Inc., New York, 1969. K is daarbij tweemaal de absorptie/eenheidsbaanlengte (2A/b) bij transmissie-metingen. Voor het doel van de uitvinding wordt K aangenomen als evenredig met de concentratie aan gekleurde gevormde indicator-10 moleculen. Bij de verhouding weergegeven door de Kubelka-Monk-formule neemt het percentage reflectantie (#R) af naarmate de concentratie aan te onderzoeken oxydatieve stof toeneemt, en omgekeerd. De aflezingen correleren dus volgens deze formule omgekeerd met de concentratie aangetoond absorberend bestanddeel.

15 Bij de onderstaande voorbeelden werden de aflezingen uitgevoerd bij de aangegeven golflengten λ.

Reflectantieaflezingen kunnen worden verkregen met handels-spectrofotcmeters, zoals de Beekman DK-2 spectrofotcmeter van Beekman Instruments, Ine. of de spectrocolorimeter SCF-1 van 20 Israel Electro-Optical Industry Ltd.

Rammenasperoxidase en glucoseoxidase werden verkregen van Miles Reseach Products te Elkhart en een copolymeer van methyl-vinylether en maleïnezuuranhydride (Ganctrez AN-139) en poly-vinylpyrrolidine (PVP) werden verkregen van GAP Corporation, Che-25 mical Products te New York. Het 3-methyl-2-benzothiazolinon-hydrazonhydrochloridemonohydraat, de andere hydrazonen, 1-hy-droxy-3-naftaleensulfonzuur, 1-hydroxy-5-naftaleensulfonzuur, 3-dimethylaminobenzoëzuur, en violetzuur (l-naftol-3,6-disulfonzuur) werden verkregen van Aldrich Chemical Co., te Milwaukee.

30 Het Chicago-zuur werd gekocht van Pfaltz en Bauer, te Stamford,

Conn. Standaardreagenskwaliteitoplosmiddelen en reagentia werden gebruikt. 1

De voorbeelden zijn uitsluitend illustratief en niet bedoeld als een beperking van de uitvinding.

35 Voorbeeld I: 80 0 0 0 58

* I

-9-

Bij de experimenten volgens dit voorbeeld werd de relatieve weerstand tegen ascorbaat van diverse MBTH-koppeIsystemen en van o-tolidine aangetoond.

Een eerste impregneeroplossing werd bereid en bevatte de 5 volgende bestanddelen: 3

Gedestilleerd water Uo cm

O

ethanol UO cm

Gantrez M 139 (5% w/v)in gedestilleerd water 52 cm^ 10 tri smalen aatbuffer (2,8 M tris) hydroxymethyl )aminaaethaan; *3 1,U M malonzuur; Ι,^,Μ natriummalonaat.) 32 cor

Polyvinylpyrrolidon (10 % w/v) in gedestilleerd water 28 cnr

O

15 200 mg peroxidase in U,3 cm glucose-

O O

oxidase (1000 Ε/αα ) + 19>3 cm gedestilleerd water.

Stroken Eaton-Dikeman 20k filterpapier (E&D) werden tot verzadiging geïmpregneerd met de bovenweergegeven oplossing en 20 bij 80°C gedroogd.

Een eerste portie van deze gedroogde stroken filtreerpapier werd verzadigd met 0,02 M o-tolidine in CHCl^ en bij 50°C gedroogd tot de gebruikte o-tolidinestroken. De overige stroken van de bovengenoemde gedroogde sproken papier werden vervolgens . 3 25 tot verzadiging geïmpregneerd met een oplossing van 50 cm methanol met daarin 250 mg MBTH hydrochloridemonohydraat en gedroogd bij 60°C.

Bij een derde impregnering werden papierstroken van de tweede portie tot verzadiging geïmpregneerd met de oplossingen 30 van een van de volgende potentiële koppelaars:

O

Chicagozuur 200 mg in Uo cm methanol 3 violetzuur 350 mg in ^0 cm methanol + 10 cm^ water o diëthylaniline 186 mg in 50 cm methanol.

35 De aldus geïmpregneerde stroken papier werden vervolgens 80 0 0 0 58 -10-

Taij 6θ°C gedroogd.

Deze stroken -werden respectievelijk onderzocht met ascorbaat-vrije 100 mg/dl waterige glucoseoplossingen en met 100 mg/dl waterige glucoseoplossingen met daarin 50 mg/dl ascorbaat waarna 5 eventuele kleurveranderingen werden af gele zen onder toepassing van een reflectantiespectrofotaneter. De reflect anti ewaarden bij specifieke golflengten werden volgens de bovenbeschreven Kubelka-Monk-formule omgezet in equivalente ahsorptiewaarden (K).

Een verhouding van K-waardem werd gebruikt, waarbij K voor „ 10 cijfers na 1 minuut bij aanwezigheid van 50 mg/dl ascorbaat werd gedeeld door K voor cijfers genomen na 1 minuut bij afwezigheid van ascorbaat. Een waarde van 1 betekent geen ascorbaatstoring; een waarde van 0 betekent een volledige ascorbaatstoring. De resultaten zijn weergegeven in tabel A.

15 Tabel A

Relatieve ascorbaatstoring

Indicator λ K(glucose + 50 mg/dl ascor- '"““eters) K '(ito «eStelt) 20 o-tolidine 620 0,01 ΜΒΤΞ-Chic ago zuur 56o . 0,Uo MBTH-violet zuur 5^0 0,08 MBTH-diethylani line (DEA) 600 0,12 25 Deze cijfers tonen duidelijk aan, dat MBTH/Chicagozuur een aanmerkelijk betere weerstand tegen ascorbaat had dan o-tolidine en dat de weerstand tegen ascorbaat significant gunstiger was dan die van de bekende formules gebaseerd op MBTH/diëthylaniline. Voorbeeld II: 30 Bij de onderstaande experimenten werden MBTH/Chicagozuur proefstroken vervaardigd als volgens voorbeeld I en resp. onderzocht met monsters van ascorbaatvrije urine en/of urine met daarin 50 mg/dl ascorbaat; beide urinemonsters bevatten 100 mg/dl glucose.

De waargenomen reflectantiecijfers werden omgezet in equivalente 35 absorptie (K)cijfers en een verhouding van K-cijfers werd berekend 80 0 0 0 58 -11- als in voorbeeld I. De verhouding van de activiteit bij aanwezigheid van ascorbaat vergeleken met de activiteit in ascorbaatvrije proefoplossingen bedroeg 0,89.

Wanneer men deze resultaten vergelijkt met die volgens tabel A 5 van voorbeeld I blijkt, dat de MBTH/Chicagozuurstraken tweemaal zo resistent waren tegen ascorbaat bij gebruik voor een urine-onderzoek.

Voorbeeld IH:

Oplossingen werden bereid als hieronder weergegeven met pre-10 paraten volgens de uitvinding en vergeleken met die volgens de stand, van de techniek voor het effect van pH en bufferwisseling bij oplossingen met en zonder ascorbaat.

Deze proeven vergelijken evenals de voorgaande de reacties van een hydrazcm met diverse koppelaars als respons op een axidans.

15 Bij de voorgaande voorbeelden bevatten de preparaten tevens een oxidase, die reageerden met de analyt of de te analyseren stof, waarbij een axidans, HgO^ werd gevormd.

Peroxidase werd in deze preparaten verwerkt tezamen met de andere componenten en de reactie verliep bij contact bij een monster 20 met de betreffende analyt. De onderhavige proefpreparaten werden evenwel bereid onder toevoeging van HgOg, i.p.v. een analyt-res-ponsieve oxidase, en de peroxidase werd niet toegevoegd alvorens de proef uit te voeren.

Proefoplossingen met pH 5,0 werden bereid in 0,311 M citraat-25 buffer. Proefoplossingen met pH 7,0 werden bereid in 0,093 M tris (tris(hydroxymethyl)aminamethaan), gecombineerd met 0,093 M malonaat. Bij elk buffersysteem werden de oplossingen bereid tot concentraties van 100 ;uM MBTH, 100 ;uM koppelaar en 333 /iM HgOg · De proef oplossingen bereid voctr elk van de koppelaars werd verdeeld in twee 30 porties. Aan een portie van elke proefoplossing werd 56,8 ;uM (l mg/dl) ascorbinezuur toegevoegd.

3

De bovenweergegeven oplossingen werden gebracht m 3 cm cuvetten van standaardglas of quartz. In elk van de gevallen liet men de reactie verlopen door een injectie van peroxidase tot een

O

35 concentratie van 125 ng/cm . Als in de voorgaande voorbeelden 80 0 0 0 58 -12- resulteerde de vorming van een chramogeen uit een koppeling van hydrazon met koppelaar in een verandering van de optische dichtheid. Veranderingen in optische dichtheid ( LöD) -werden weergegeven door een standaardabsorptiespectrofotcmeter met de resul-5 taten weergegeven in de tabellen B en C.

Tabel B

Tris-malonaatbuffer (pH 7) MBTH-koppelaar golflengte reactiesnelheid _(Δ OP/min)_ ^0 geen ascorbaat ascorbaat

Chicagozuur 565 nm 0,867 0,360

Chranotroopzuur 572 nm 0,600 0,223 N,N-dimethyl- aniline geen reactie geen reactie 15 l-hydroxy-2-naf- taleenzulfonzuur U.95 nm 0,373 0,159 l-hydraxy-3- naftaleen-sul- Λ

fonzuur 1+90 nm °’5^5 °’°9TT

20 21-hydroxy-5-naf- taleensulfonzuur I+95 nm 0,1+93 0,0815

Tabel C

Citroenzuurbuffer (pH 5) MBTH-koppelaar i golflengte Reactiesnelheid (AOP)_ 25 geen ascorbaat ascorbaat

Chicagozuur 565 nm 0,196 0,0282

Chromotroopzuur 572 nm 0,162 0,0065 H, H-dime t hylani li.> ne ·· 570 nm 0,189 0,0000 30 l-hydroxy-2-naftaleensul- fonzuur 1+95 ^ 0,0891 0,0037 l-hydroxy-3-35 naftaleensul- fonzuur 1+90 nm 0,0992 0,0000 l-hydroxy-5- naftaleen-sul- fonzuur 1+95 nm 0,0822 0,000 800 0 0 58 Λ -13-

De resultaten, waargenomen in het tris-malonaatbuf f er-systeem bij pH 7 voor Chicagozuur waren aanmerkelijk beter dan die voor dimethylaniline en de hydr axyn aft ale ensulf on at en. Chicagozuur is reactiever zowel bij aan- als bij afwezigheid van ascorbaat.

5 De activiteit bij ca. pH 7»0 in termen van de kleursontwikkeling (A^ber minuut was 3 tot U maal die van die in citroenzuur bij pH 5S0 zonder ascorbaat en zelfs nog groter bij aanwezigheid van ascorbaat. De resultaten verkregen bij aanwezigheid van 56,8^nnol/ 1 (1,0 mg/dl) ascorbinezuur op diverse tijdstippen en hun resp.

10 absorptie (optische dichtheids)waarden zijn grafisch weergegeven in fig. 1 voor MBTH/Chicagozuur in tris-malanaat (pH 7) en citroenzuur (pH 5) systemen. Een vergelijking van de resultaten verkregen met de diverse koppelaars bij aanwezigheid van 56,8 pmol/1 ascorbinezuur is grafisch, weergegeven in fig. 2 voor het tris-15 malonaatsysteem met pH 7, met een duidelijke uitzondering. Aangezien de bekende koppelaar, dimethylaniline, onder deze parameters zelfs niet eens zou reageren, is de kromme hiervan bij de citroen-zuurcijfers (pH 5) niet cpgenanen.

Chicagozuur is dus optimaal, vooral bij een voorkeurs-20 fysiologische pH, dus speciaal van belang bij enzymproeven.

De uitvinding wordt amlijnd door de volgende conclusies.

800 0 0 58

Claims

1. Proefreagens voor het bepalen van een oxyderende stof, met het kenmerk, dat het een hydrazon en 8-amino-l-naftol-5,7-disulf on-zuur bevat.

2. Proefreagens volgens conclusie 1,-met het kenmerk, dat als 5 hydrazon 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazon wordt gebruikt.

3. Proefreagens voor het bepalen van een oxyderende stof, be-r staande uit een dragermatrix met daarin een reagens volgens conclusie 1. k. Proefreagensuitrusting voor het bepalen van een oxyderende 10 stof, met het kenmerk, dat deze een dragermatrix cravat met daarin een proefreagens volgens conclusie 2.

5. Reagensuitrusting volgens conclusie 3> met het kenmerk, dat de drageimatrix opzuigend is.

6. Proefuitrusting voor hetbepalen van een oxyderende stof, 15 met het kenmerk, dat deze een tablet cravat met daarin een proefreagens volgens, conclusie 1.

7. Werkwijze voor het vervaardigen van een uitrusting voor'-het bepalen van oxyderende stoffen, met het kenmerk, dat men in een dragermatrix een proefreagens volgens conclusie 1 verwerkt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7> met het kenmerk, dat men een oplossing van de reagentia in de matrix impregneert gevolgd door drogen.

9. Werkwijze voor het bepalen van een oxyderende stof in een vloeistoflmonster, met het kenmerk, dat men dit-monster in contact 25 brengt met een proefreagens volgens conclusie 1 en de resulterende respons afleest.

10. Werkwijze voor het bepalen van een oxyderende stof in een vloeistofmonster, met het kenmerk, dat men dit monster in contact brengt met een uitrusting volgens conclusie 3 en een eventuele 30 kleursverandering waarneemt.

11. Proef systeem voor het bepalen van een bestanddeel in een monster met in dit systeem reagentia die reageren bij aanwezigheid van het genoemde bestanddeel in het monster door tenminste 80 0 0 0 58 Λ '' -15- een nxyderende stof te vormen en met in dit systeem verder een mengsel voor het "bepalen van deze axyderende stof, met het kenmerk, dat dit mengsel een hydrazon en 8-amino-l-naftol-5,7-disulfonzuur anvat.

12. Proefsysteem volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat als hydrazon 3-methyl-2-henzothiazolinonhydrazon wordt gebruikt.

13. Proefuitrusting bestaande uit een drageimatrix met daarin een reagens systeem volgens conclusie 11. Ik. Proefuitrusting, met het kenmerk, dat hij bestaat uit 10 een dragermatrix met daarin een proef systeem volgens conclusie 12.

15. Proefuitrusting volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de dragermatrix opzuigend is.

16. Proefuitrusting, bestaande uit een tablet met daarin een proefreagenssysteem volgens conclusie 11.

17. Werkwijze voor het vervaardigen van een proefuitrusting, met het kenmerk, dat men een dragermatrix een proefsysteem volgens, conclusie 11 doet bevatten.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat men de matrix impregneert met een oplossing van het proefsysteem 20 gevolgd door drogen.

19. Werkwijze voor het bepalen van een bestanddeel in een vloeistofkonster, met het kenmerk, dat men dit monster in contact brengt met een proefsysteem volgens conclusie 11 en een eventuele kleursverandering waarneemt.

20. Werkwijze voor het bepalen van een bestanddeel van een vloeistofkonster,met het kenmerk, dat men dit monster met een proefuitrusting volgens conclusie 13 in contact brengt en een eventuele kleursverandering waarneemt. 800 0 0 58