MXPA06015170A

MXPA06015170A - Procedimiento para aumentar la cantidad de hueso.

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Publication number: MXPA06015170A
Application number: MXPA06015170A
Authority: MX
Inventors: Thomas Aquinas Brown; Leonard Buckbinder; John Charles Kath; Hua Zhu Ke; Michael Joseph Luzzio; Lisa Maria Olson; Angel Guzman Perez
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Co Llc
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2005-06-10
Publication date: 2007-08-21
Also published as: TW200613032A; JP2008503561A; WO2005123191A1; EP1765461A1; US20090118316A1; CA2571482A1; AR049922A1; BRPI0512342A

Abstract

La presente invencion se refiere a procedimientos para estimular la funcion osteoblastica con un inhibidor de PYK2 en sujetos con osteoporosis, fracturas oseas, falta de uniones, seudoartrosis, enfermedad periodontal u otros trastornos del metabolismo de los huesos. Opcionalmente, el procedimiento comprende ademas la administracion de un segundo agente terapeutico oseo. La presente invencion tambien se refiere a procedimientos para identificar un inhibidor de PYK2 eficaz como agente terapeutico oseo, que comprende administrar un agente de prueba a una celula similar a osteoblasto y determinar si se estimula la funcion osteoblastica. Opcionalmente, el procedimiento de identificacion ademas comprende poner en contacto el agente de prueba con PYK2 y determinar si se inhibe la actividad de PYK2.

Description

PROCEDIMIENTOS PARA AUMENTAR LA CANTIDAD DE HUESO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procedimientos de tratamiento para sujetos con osteoporosis, fracturas óseas, falta de uniones, seudoartrosis, enfermedad periodontal y otros trastornos del metabolismo de los huesos. La presente invención también se refiere a ensayos para identificar agentes terapéuticos útiles para estimular la función de los osteoblastos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hueso es un órgano dinámico, que experimenta crecimiento, remodelación y reparación (es decir, ciclos repetitivos de formación y reabsorción). El desarrollo y mantenimiento del esqueleto requiere las actividades coordinadas de formación de hueso por parte de los osteoblastos y de reabsorción de hueso por parte de los osteoclastos. Cuando la reabsorción supera a la formación, habrá una pérdida de masa ósea (osteopenia) y/o de integridad ósea (osteoporosis). Aunque la pérdida ósea es un fenómeno progresivo que comienza en la edad adulta temprana, se acelera rápidamente en mujeres en el momento de la menopausia (natural o quirúrgica) y tal pérdida es mayor a los dos años de la falta de estrógeno. Durante esta fase acelerada, la formación de hueso está muy reducida. Debe observarse también que la reabsorción ósea también disminuye, aunque en menor medida. Los agentes farmacéuticos que disminuyan la reabsorción ósea ("antirreabsortivos") o que incrementen la formación de hueso (anabolizantes óseos) han sido los objetivos de las nuevas terapias. Sin embargo, la eficacia terapéutica de tales agentes está limitada por el hecho de que las funciones osteoblástica y osteoclástica están estrechamente acopladas: los agentes que estimulan a los osteoblastos pueden estimular a los osteoclastos (y viceversa) y la inhibición de una puede, de igual forma, inhibir la otra. La osteoporosis es una enfermedad ósea sistémica, que se caracteriza por una masa ósea baja y el deterioro del tejido óseo, con un consiguiente incremento de la fragilidad ósea y de la susceptibilidad a fracturas. En EE.UU., la afección afecta a más de 25 millones de personas y causa más de 1 ,3 millones de fracturas todos los años, incluidas 500.000 fracturas de columna vertebral, 250.000 de cadera y 240.000 de muñeca anualmente. Las fracturas de cadera son las consecuencias más graves de la osteoporosis, por la que 5-20% de los pacientes mueren en un año y aproximadamentel 50% de los supervivientes están impedidos físicamente. Los ancianos son los que presentan el riesgo más elevado y, por tanto, se pronostica que el problema aumenta de forma significativa con el envejecimiento de la población. Se ha previsto que la incidencia mundial de fracturas se multiplique por tres en los siguientes 60 años y en un estudio se ha estimado que habrá 4,5 millones de fracturas de cadera en todo el mundo en 2050. Las mujeres presentan un mayor riesgo de osteoporosis que los varones. Las mujeres experimentan una aceleración pronunciada de la pérdida ósea durante los cinco años posteriores a la menopausia. Entre otros factores que incrementan el riesgo se incluyen el tabaquismo, el alcoholismo, un estilo de vida sedentario y la baja ingesta de calcio. Además de la osteoporosis, aproximadamente 20-25 millones de mujeres y un número cada vez mayor de varones presentan fracturas vertebrales detectables como consecuencia de la masa ósea reducida, y se han documentado 250.000 fracturas de cadera adicionales anuales sólo en América. El último caso está asociado con una tasa de mortalidad del 12% en los dos primeros años y con una tasa del 30% de pacientes que requieren intemamiento en una residencia tras la fractura. Aunque esto ya es significativo, se espera que las consecuencias económicas y médicas de la convalecencia a causa de una curación lenta o imperfecta de estas fracturas óseas aumenten, a causa del envejecimiento de la población general. Aunque existen varias terapias prometedoras (bisfosfonatos, etc.) en desarrollo para prevenir la pérdida ósea con la edad y, por tanto, reducir la probabilidad de la aparición de fracturas debilitantes, estas terapias no están indicadas para el restablecimiento de la masa ósea una vez que la fractura se ha producido. También se puede producir un desequilibrio entre la formación de hueso y la reabsorción de hueso en regiones localizadas del esqueleto, incluso en sujetos con densidad ósea total normal. Por ejemplo, la erosión ósea local y la pérdida ósea sistémica son características de la artritis reumatoide y causan incapacidad progresiva. Durante la reparación de fracturas óseas, cuando los niveles disminuidos de la formación de hueso se acompañan de una reabsorción ósea más fuerte, el retraso de la curación puede ser clínicamente significativo. Se ha mostrado que los estrógenos (Bolander y col., 38 Annual Meeting Orthopedic Research Society, 1992) mejoran la calidad de la curación de las fracturas de las extremidades. Por tanto, la terapia de reemplazamiento de estrógenos podría ser un procedimiento para la reparación de fracturas. Sin embargo, el cumplimiento por parte del paciente con la terapia de estrógenos es relativamente malo a causa de sus efectos secundarios, incluyendo la reanudación de la menstruación, mastodinia, un aumento del riesgo de cáncer de útero, un aumento del riesgo percibido de cáncer de mama y el uso concomitante de progestinas. Además, es muy probable que los varones pongan objeciones al uso de tratamiento con estrógenos. Claramente, existe la necesidad de un tratamiento del que se beneficiarían los pacientes que han experimentado fracturas óseas debilitantes o que poseen una masa ósea baja, y que aumentaría el cumplimiento del paciente. La tirosina quinasa rica en prolina (PYK2, también conocida como CAKß y RAFTK) es un miembro de la familia FAK (quinasa de adhesión focal).

La PYK2 se expresa en células neuronales y hematopoyéticas, y recientemente se ha mostrado que se expresa de forma considerable en los osteoclastos (Lakkakorpi y col., J Biol Chem. 2003 Mar 28; 278(13): 11502-12.

Además, se ha postulado la hipótesis de que la PYK2 desempeña un papel clave en la regulación dependiente de Src de la adhesión y motilidad de los osteoclastos y, por tanto, se cree que está implicada en la reabsorción ósea. (Zhang y col., 2002, Bone 31(3): 359-365). En el documento WO 98/35056 se menciona un procedimiento para tratar o prevenir la osteoporosis o la inflamación en un mamífero mediante la administración de un compuesto identificado al poner en contacto el compuesto y la PYK2 y determinar si se ha producido la unión. La proteína PYK2 se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.837.524. La proteína PYK2 se describe también en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.837.815. Aunque existe una variedad de terapias para individuos con trastornos del metabolismo óseo, hay una búsqueda continua para llenar una necesidad de terapias óseas alternativas. Más particularmente, existe una necesidad de agentes terapéuticos y procedimientos para estimular la función osteoblástica , aumentar la formación de hueso, por tanto, restablecer la masa ósea y reconstruir las estructuras óseas en una afección con masa ósea baja tal como la osteoporosis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN A continuación, en la presente invención se proporciona un procedimiento para estimular la función osteoblástica, que comprende administrar un inhibidor de la PYK2 a un mamífero que lo necesite en una cantidad eficaz para estimular una función osteoblástica. Deseablemente, un inhibidor de la PYK2 útil en la presente invención inhibe la actividad quinasa dependiente de PYK2. Opcionalmente, un inhibidor de la PYK2 útil en la presente invención es un inhibidor directo de la PYK2. La presente invención es útil para tratar un mamífero que se pueda beneficiar de la estimulación de la función osteoblástica. Un mamífero que se pueda beneficiar de la estimulación de la función osteoblástica es un mamífero que necesita aumentar y mantener la masa ósea, prevenir la pérdida ósea y/o estimular la función osteoblástica en una región local del esqueleto. La función osteoblástica, según la presente invención, incluye sin limitaciones, formación ósea, actividad metabólica que contribuye a la formación de hueso y actividad metabólica que está asociada con el fenotipo osteoblástico. Tal función puede ser como se ha demostrado in vivo, in vitro o ex vivo. Opcionalmente, la presente invención además comprende la administración de un segundo agente terapéutico óseo. Opcionalmente, el segundo agente terapéutico óseo es un agente antirreabsortivo y/o agente anabol izante óseo. Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para identificar un inhibidor de la PYK2 eficaz como agente terapéutico óseo, que comprende administrar un agente de prueba a una célula similar a un osteoblasto y determinar si se estimula la función osteoblástica. Opcionalmente, el procedimiento de identificación además comprende poner en contacto el agente de prueba con la PYK2 y determinar si se inhibe la actividad de la PYK2. La actividad de PYK2 se puede valorar mediante la determinación de la fosforilación dependiente de PYK2 de sustratos endógenos, incluida la PYK2, y mediante la fosforilación de sustratos añadidos de forma exógena, en los que los sustratos pueden ser naturales o artificiales. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA(S) FIGURA(S) La figura 1 es una banda de transferencia en SDS-PAGE que ilustra la expresión de PYK2 en osteoblastos murinos y humanos como se describe en el Ejemplo 1 en la presente memoria descriptiva. La figura 2 es un gráfico que ilustra la mayor actividad de la fosfatasa alcalina que resulta del cultivo de MSC murinas con un inhibidor de la PYK2 como se describe en el Ejemplo 2 en la presente memoria descriptiva. La figura 3 es un gráfico que ilustra el mayor depósito de calcio in vitro en MSC murinas después de su cultivo con un inhibidor de la PYK2 como se describe en el Ejemplo 2 en la presente memoria descriptiva. La figura 4 es un gráfico que ilustra la mayor actividad de la fosfatasa alcalina en MSC humanas después de su cultivo con un inhibidor de la PYK2 como se describe en el Ejemplo 3 en la presente memoria descriptiva. La figura 5 es un gráfico que ilustra el mayor depósito de calcio de MSC humanas tratadas con un inhibidor de la PYK2 en comparación con MSC control como se describe en el Ejemplo 3 en la presente memoria descriptiva. La figura 6 es un gráfico que ilustra el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina en células MC3T3 murinas cultivadas con un inhibidor de la PYK2 como se describe en el Ejemplo 4 en la presente memoria descriptiva.

La figura 7 es una banda de transferencia en SDS-PAGE que ilustra la inhibición de la fosforilación estimulada de la tirosina 402 de la PYK2 en células MC3T3 por el inhibidor de la PYK2, PF-Y como se describe en el Ejemplo 5 en la presente memoria descriptiva. La figura 8 es un gráfico que ilustra la diferenciación más rápida (según la actividad de la fosfatasa alcalina) de células troncales mesenquimáticas defectivas en PYK2 (MSC) en comparación con MSC control como se describe en el Ejemplo 6 en la presente memoria descriptiva. La figura 9 es un gráfico que ilustra el mayor depósito de calcio de osteoblastos PYK2 KO in vitro en comparación con osteoblastos control como se describe en el Ejemplo 6 en la presente memoria descriptiva. La figura 10 es una representación fotográfica que ilustra la mayor mineralización de osteoblastos PYK2 KO diferenciados en comparación con osteoblastos control tras 21 días en cultivo como se describe en el Ejemplo 6 en la presente memoria descriptiva. La figura 11 es una representación fotográfica del análisis con tomografía microcomputarizada de la metáfisis femoral distal, que muestra un incremento significativo en la masa ósea en ratones defectivos en PYK2 en comparación con controles de tipo salvaje a los 6 meses de edad como se describe en el Ejemplo 7 en la presente memoria descriptiva. La figura 12 es una representación fotográfica que ilustra una mayor masa ósea (imágenes de micro-CT, panel derecho) y mayor formación ósea (imágenes histomorfométricas, panel izquierdo) en el cuerpo vertebral lumbar de ratones hembras de 6 meses de edad defectivas en PYK2 en comparación con ratones de la misma camada controles de tipo salvaje (C57BI/6) como se describe en el Ejemplo 7 en la presente memoria descriptiva. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en la presente memoria descriptiva, se aplican las siguientes definiciones: "Inhibición de la PYK2" quiere decir inhibición de la función PYK2. "Fosforilación dependiente de PYK2" quiere decir la actividad de fosforilación de PYK" al margen del sustrato fosforilado. La fosforilación dependiente de PYK2 debe distinguirse del término "fosforilación de PYK2" que indica la fosforilación de PYK2, que incluye autofosforilación (propia, por ejemplo, que se sabe que se produce en Y402) o trans-fosforilación (por, por ejemplo, Src, que se sabe que se produce en Y-579, 580). Un "inhibidor selectivo de la PYK2" quiere decir un inhibidor de la PYK2 que posee una CI50 in vitro mayor hacia la PYK2 que hacia c-erbB-2, c-met, tie-2, PDGFr, FGFr, c-Src o VEGFR. Un "inhibidor directo de la PYK2" quiere decir un inhibidor de la PYK2 en el que la inhibición resulta en parte, de una interacción física directa entre el inhibidor y la PYK2. Un "inhibidor de PYK2" incluye sales farmacéuticamente aceptables. "Farmacéuticamente aceptable" quiere decir que el vehículo, el diluyente, los excipientes, la sal, el solvato y/o el hidrato deben ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no deben ser perjudiciales para el receptor. Un "inhibidor de PYK2" ¡ncluye un profármaco preparado a partir de él.

"Profármaco" se refiere a compuestos que son precursores del fármaco, que tras la administración liberan el fármaco in vivo a través de algún proceso químico o fisiológico (por ejemplo, un profármaco al llegar al pH fisiológico o a través de la acción de enzimas se convierte en la forma farmacológica deseada). Los profármacos para compuestos de Fórmula I se describen en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 60/435.670, que se incorpora en la presente memoria como referencia. "Agente terapéutico" quiere decir un agente que es útil para tratar un mamífero. "Tratar", "tratando" o "tratamiento" incluye tratamiento preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo, así como un tratamiento corrector. "Células similares a osteoblastos" quiere decir células que expresan, o que pueden manipularse en cultivo de una forma tal que provoque su expresión, una función osteoblástica. "Un seudosustrato de PYK2" es un sustrato que comprende el sitio de fosforilación tirosina 402 de la PYK2 SESCSIESDIYAEIPDETLR, pero que carece de al menos una región de PYK2 tal como el dominio proteico ezrin/radixin/moesin, la región diana de adhesión focal o cualquier otra región de al menos 100 restos de aminoácidos. "Sal(es) farmacéuticamente aceptable(s)" incluyen sales de grupos ácidos o básicos que pueden estar presentes en los compuestos de la presente invención. Los compuestos de la presente invención que son de naturaleza básica son capaces de formar una amplia variedad de sales con diversos ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos que pueden usarse para preparar sales de adición acida farmacéuticamente aceptables de tales compuestos básicos son los que forman sales inocuas de adición de ácido, es decir sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como las sales clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, citrato ácido, tartrato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato [es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)]. Los compuestos de la presente invención que incluyen un resto básico, tal como un grupo amino, pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con diversos aminoácidos, además de con los ácidos mencionados anteriormente. En una forma de realización de la presente invención es un procedimiento para estimular la función osteoblástica, que comprende administrar una cantidad de un inhibidor de PYK2 a un mamífero que lo necesite, donde dicha cantidad es eficaz para estimular una función osteoblástica. Una forma de realización, el inhibidor de PYK2 es un inhibidor selectivo. Opcionalmente, un inhibidor selectivo de la PYK2 abarca un inhibidor de PYK2 que posee actividad inhibidora frente a FAK. En otra forma de realización, el inhibidor de PYK2 es un inhibidor directo. Opcionalmente, el inhibidor directo exhibe una interacción física directa que es no covalente. Opcionalmente, un inhibidor directo posee una constante de unión en equilibrio (es decir, Ka) para PYK2 de al menos aproximadamente 1000 nM. Opcionalmente, la Ka es de al menos aproximadamente 300 nM. Un experto en la técnica es capaz de determinar con facilidad la Ka usando un número cualquiera de procedimientos fisicobioquímicos, por ejemplo, un BioCore 3000 (BioCore Medical Technologies Inc.). Un mamífero que necesite tratamiento según la presente invención incluye un mamífero, en el que es deseable estimular una función osteoblástica. Tal mamífero incluye seres humanos, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, otros mamíferos domesticados, etc.) y mamíferos de importancia para la agricultura (por ejemplo vacas, cerdos, ovejas, caballos, etc.). De acuerdo con la presente invención, las afecciones en las que es deseable estimular una función osteoblástica incluyen, a modo de ejemplo no limitante, una afección seleccionada de osteoporosis, osteopenia, fractura ósea, osteomalacia, raquitismo, fibrogénesis ósea imperfecta, periodontitis, densidad ósea baja y situaciones con riesgo de las mismas. Otras afecciones en las que es deseable estimular una función osteoblástica incluyen afeccion(es) que se presentan con masa ósea baja. La frase "afeccion(es) que se presenta(n) con masa ósea baja" se refiere a una afección en la que el nivel de masa ósea está por debajo de lo normal para una edad específica. Por ejemplo, la Organización Mundial de la Salud define lo normal para una edad específica en "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843" (páginas 1-29). En "afeccion(es) que se presenta(n) con masa ósea baja" se encuentran la osteoporosis primaria y secundaria. La osteoporosis secundaria incluye osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis inducida por heparina y osteoporosis inducida por inmunosupresión. También se incluye la enfermedad periodontal, la pérdida ósea alveolar, la osteotomía y la pérdida ósea idiopática en la infancia. Opcionalmente, las afecciones osteoporóticas pueden ser de un tipo seleccionado de entre osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis inducida por heparina, osteoporosis posmenopáusica y osteoporosis deficiente en vitamina D e inducida por inmunosupresión. La(s) "afeccion(es) que se presenta(n) con masa ósea baja" también incluye(n) complicaciones a largo plazo de la osteoporosis, tales como la curvatura de la columna vertebral, la pérdida de altura y la cirugía protésica. La frase "afección que se presenta con masa ósea baja" también se refiere a una afección de la que se sabe que tiene como resultado un riesgo significativamente mayor que la media de desarrollar tales enfermedades, como se describe en la presente memoria descriptiva, incluyendo osteoporosis (por ejemplo, mujeres posmenopáusicas, varones por encima de 60 años de edad, individuos que fuman, individuos que consumen cantidades superiores a la media de alcohol, que tienen un estilo de vida sedentario, baja ingesta de calcio, tienen un peso corporal bajo, individuos con antecedentes familiares de masa ósea baja o fracturas de cadera, etc.). Otras afecciones en las que es deseable estimular una función osteoblástica incluyen, además, una afección en el que se produce pérdida ósea con el tiempo a una velocidad mayor que la de la población del mismo sexo y la misma edad. Por ejemplo no limitante, tal afección se puede seleccionar de entre afecciones entre las que se incluyen osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, pérdida ósea asociada con periodontitis, pérdida ósea alveolar y pérdida ósea idiopática en la infancia. Otras afecciones en las que es deseable estimular una función osteoblástica incluyen, además, a modo de ejemplo no limitante, un procedimiento quirúrgico. Entre los ejemplos de procedimientos se ¡ncluyen reconstrucción facial, reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, injerto de hueso, implante protésico y sinostosis vertebral. Otras afecciones en las que es deseable estimular una función osteoblástica incluyen una afección en la que sea deseable intensificar la extensión de huesos largos. Entre otras afecciones en las que es deseable estimular una función osteoblástica se encuentran los estados en los que el sujeto está en riesgo de experimentar una de las afecciones mencionadas anteriormente. Una dosis útil es de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg/día de inhibidor de PYK2. Una dosis opcional es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg/día de inhibidor de PYK2. Inhibidores de PYK2 Un inhibidor de PYK2, como se usa en la presente invención, puede ser cualquier agente que inhiba la función de PYK2, por ejemplo una molécula inhibidora de pequeño tamaño. Deseablemente, una molécula inhibidora de pequeño tamaño posee un peso molecular inferior a 2000 daltons. En, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.837.524, incorporada en la presente memoria como referencia, se proporcionan procedimientos para la identificación de un inhibidor de PYK2 de acuerdo con la presente invención.

Otros procedimientos para la identificación de un inhibidor de PYK2 según la presente invención se proporcionan en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.837.815, incorporada en la presente memoria como referencia.

Estos procedimientos pueden incluir, por ejemplo, ensayos para identificar agentes capaces de alterar o inhibir o estimular la interacción entre componentes de los complejos, tales como entre PYK2 y NBP, gelosina, Src quinasa, paxilina, CAS 120 y similares. Otros procedimientos para la identificación de un inhibidor de PYK2 se proporcionan en los ejemplos de la presente memoria descriptiva. Además, un inhibidor de la PYK2 se puede identificar por su capacidad para inhibir la actividad de PYK2, como se establece a continuación ("inhibición de PYK2"). Los inhibidores de la tirosina quinasa de la proteína FAK correspondientes al género de Fórmula I (descritos más adelante) también son inhibidores de PYK2 y son útiles en la presente invención. Los compuestos de Fórmula I se describen en la solicitud de EE.UU. 60/435670 de cesión común con la presente (presentada el 20 de diciembre de 2002), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I también se describen en la solicitud de EE.UU. 60/500742 de cesión común con la presente (presentada el 5 de septiembre de 2003), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I también se describen en la solicitud de EE.UU. 10/734039 de cesión común con la presente (presentada el 11 de diciembre de 2003), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I también se describen en la solicitud de EE.UU. 10/733215 de cesión común con la presente (presentada el 11 de diciembre de 2003), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I también se describen en la solicitud de EE.UU. 60/571312 de cesión común con la presente (presentada el 14 de mayo de 2004), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I también se describen en la solicitud de EE.UU. 60/571210 de cesión común con la presente (presentada el 14 de mayo de 2004), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I también se describen en la solicitud de EE.UU. 60/571209 de cesión común con la presente (presentada el 14 de mayo de 2004), incorporada en la presente memoria como referencia. Los compuestos de Fórmula I comprenden una amplia clase de compuestos de trifluorometilpirimidina representados a continuación, siempre que las sustituciones "A" y "Ar" sean las proporcionadas por la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 60/435.670, incorporada en la presente memoria como referencia.

Fórmula I Opcionalmente, los compuestos de Fórmula I útiles según la presente invención comprenden compuestos de 5-aminooxindol como se describen en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 10/733.215, incorporada en la presente memoria como referencia. Tales compuestos se muestran de forma genérica como la Fórmula II a continuación, con la condición de que las sustituciones "A" sean las proporcionadas por la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 10/733.215 incorporada en la presente memoria como referencia.

Fórmula II Opcionalmente, los compuestos de Fórmula I útiles según la presente invención comprenden compuestos de aminopirimidina terciarios como se describen en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 10/734039, presentada el 12 de diciembre de 2003; incorporada en la presente memoria como referencia. Tales compuestos se muestran de forma genérica en la presente memoria descriptiva como Fórmula lll a continuación, con la condición de que los sustituyentes "Ar, R1, R2, R3, R4 y n" sean los sustituyentes indicados en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 10/734039 incorporada en la presente memoria como referencia.

Fórmula lll A modo de ejemplo, un inhibidor de PYK2 útil según la presente invención es un compuesto PF-X que se ilustra a continuación, una especie de Fórmula I, Fórmula II y Fórmula lll.

PF-X La estructura y síntesis genérica de PF-X se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 60/435.670, presentada el 20 de diciembre de 2002, incorporada en la presente memoria como referencia. La estructura y síntesis genérica de PF-X también se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 10/734039, presentada el 11 de diciembre de 2003; incorporada en la presente memoria como referencia. Opcionalmente, un inhibidor de PYK2 útil según la presente invención se selecciona de compuestos que bloquean la ruta de señalización del receptor Flk-1 , por ejemplo el compuesto PF-Y que se ilustra a continuación.

PF-Y La estructura y síntesis de PF-Y se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n° de serie 09/569.545 (número de publicación US 2003/0191162 A1 ), presentada el 12 de mayo de 2000; incorporada en la presente memoria como referencia. Tratamiento de combinación La presente invención puede además comprender opcionalmente la administración de un segundo agente terapéutico óseo. Tales agentes óseos terapéuticos útiles pueden ser cualquier agente antirreabsortivo o agente óseo anabolizante o un agente que es antirreabsorción y. anabolizante óseo. El uso del término "segundo agente terapéutico óseo" en la presente memoria descriptiva, abarca más de un agente óseo. Como se describe en la presente memoria descriptiva, el término "segundo agente terapéutico óseo" no implica ningún orden de administración (respecto a un inhibidor de PYK2) y puede administrarse antes, después o de forma simultánea con un inhibidor de PYK2. Cualquier agente antirreabsortivo puede usarse opcionalmente como el segundo agente terapéutico óseo en esta invención, incluyendo sin limitaciones, un compuesto estrogénico, un modulador selectivo del receptor de estrógeno o un bisfosfonato. Exclusivamente a modo de ejemplo, se ha reseñado el raloxifeno, 6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-3-[4-(2-piperidinoetoxi)benzoil]benzo[b]tiofeno (Osteoporosis Conference Scrip n° 1812/13 Abr. 16/20, 1993, pág. 29). El raloxifeno imita la acción favorable de los estrógenos sobre el hueso y los lípidos pero, al contrario que los estrógenos, posee un mínimo efecto de estimulación uterina. [Black, L. J. y col., Raloxifene (LY139481 HCl) Prevents Bone Loss and Reduces Serum Cholesterol Without Causing Uterine Hypertrophy in Ovariectomized Rats. Un estudio relacionado en el que se muestran tales efectos selectivos se comunicó en J. Clin. Invest., 1994, 93, 63-69 y Delmas, P. D. y col. En otro estudio más se mostraron efectos selectivos del raloxifeno y se comunicó en el New England Journal of Medicine, 1997, 337, 1641-1647]. Asimismo, el tamoxifen, 1-(4-b-dimetilaminoetoxifenil)-1 ,2-difenil-but-1-eno, es un antiestrógeno que se ha propuesto como agente osteoporótico que posee un efecto paliativo sobre el cáncer de mama, aunque se ha comunicado que posee alguna actividad estrogénica en el útero. En la patente de EE.UU. n° 5.254.595, incorporada en la presente memoria descriptiva como referencia, se describen agentes tales como droloxifen, que previenen la pérdida ósea, reducen el riesgo de fractura y son útiles para el tratamiento de la osteoporosis.

En la patente de EE.UU. n° 5.552.412, incorporada en la presente memoria descriptiva como referencia, se describen compuestos moduladores selectivos del receptor de estrógenos (MSRE) de la fórmula en la que las variables se definen como se ha establecido en ella. El cis-6- fenil-5-(4-(2-pirrolidin-1 -il-etoxi)-fenil)-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol, y más particularmente el (-)-cis-6-fenil-5-(4-(2-pirrol¡din-1-il-etoxi)-fenil)-5,6,7,8- tetrahidronaftalen-2-ol, es un MSRE activo por vía oral, altamente potente que , _ previene la pérdida ósea, disminuye el nivel de colesterol total en suero y no 15 posee efectos estimulantes sobre el útero similares a los del estrógeno en ratas OVX. En la patente de EE.UU. n° 5.948.809, también incorporada en la presente memoria descriptiva como referencia, se describe la sal tartrato del (- )-cis-6-fenil-5-(4-{2-pirrolidin-1-il-etoxi)-fenil)-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol. 2Q Cualquier agente anabolizante óseo se puede usar opcionalmente como segundo agente terapéutico óseo de esta invención, incluyendo sin limitaciones IGF-I opcionalmente con la proteína 3 de unión de IGF-I, IGF-II, prostaglandina, agonista/antagonista de prostaglandina, fluoruro sódico, hormona paratiroídea (PTH), fragmentos activos de la hormona paratiroídea, 25 péptidos relacionados con la hormona paratiroidea y fragmentos activos y análogos de péptidos relacionados con la hormona paratiroidea, la hormona de crecimiento o secretagogos de la hormona de crecimiento y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Opcionalmente, un segundo agente terapéutico óseo, útil según la presente invención, es un agonista de prostaglandinas. Opcionalmente, el agonista de prostaglandinas es un agonista selectivo del receptor de PGE2 EP2. Ejemplos no limitantes de los agonistas selectivos del receptor de EP2 son agonistas de Formula AA, como se indica en la patente de EE.UU. número 6.498.172, incorporada en la presente memoria como referencia.

Fórmula AA Otros agonistas selectivos del receptor de EP2 que se pueden usar en la presente invención incluyen los agonistas del receptor de prostaglandinas descritos en la patente de EE.UU. número 6.288.120, incorporada en la presente memoria como referencia. Otros agonistas selectivos del receptor de EP2 que se pueden usar en la presente invención incluyen los agonistas del receptor de prostaglandinas descritos en la patente de EE.UU. número 6.124.314, incorporada en la presente memoria como referencia. Un agonista selectivo del receptor de EP2 opcional es el ácido 7-[(4-butil-bencil)-metanosulfonil-amino]-heptanoico o una sal o profármaco del mismo farmacéuticamente aceptable, o una sal de un profármaco descrita en el documento de EE.UU. 6.288.120, incorporado en la presente memoria como referencia. Una sal opcional del a cido 7-[(4-butilbencil)metanosulfonil-aminojheptanoico es la sal monosódica. Opcionalmente, un agonista del receptor de EP2 es el ácido (3-(((4-trec-butil-bencil)-piridina-3-sulfonil)-amino)-metil)-fenoxi)acético, o una sal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, o una sal de un profármaco. Una sal opcional es la sal de sodio. Los compuestos de ácido (3-(((4-terc-butil-bencil)-piridin-3-sulfonil)-amino)-metil)-fenoxi)-acético se indican en la patente de EE.UU. número 6.498.172, incoporada en la presente memoria descriptiva como referencia. Dosificación La cantidad (y el momento adecuado) de los inhibidores de PYK2 y/o el segundo agente terapéutico óseo administrados dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y del juicio del médico que está tratando al paciente. Por tanto, dada la variabilidad existente de un paciente a otro, las dosis que figuran a continuación son una mera orientación y el médico puede ajustar las dosis del fármaco para alcanzar el tratamiento (por ejemplo aumento de la masa ósea) que el médico considere adecuado para el paciente. Al considerar el grado de tratamiento deseado, el médico debe sopesar una variedad de factores, tales como el nivel de masa ósea de partida, la edad del paciente, la presencia de enfermedad preexistente, así como la presencia de otras enfermedades (por ejemplo, enfermedad cardiovascular). Opcionalmente, se usa una cantidad de inhibidor de PYK2 Y7o del segundo agente terapéutico óseo que sea suficiente para aumentar la masa ósea hasta un nivel que esté por encima del umbral de fractura ósea (como se detalla en el estudio de la Organización Mundial de la Salud mencionado anteriormente en la presente memoria descriptiva). La cantidad de un agente anabolizante óseo que se debe usar se determina mediante, por ejemplo, "ensayo in vivo de formación ósea", como se indica más adelante. En general, una dosis eficaz para un agente anabolizante está en el intervalo de 0,001 a 100 mg/kg/día, preferentemente de 0,01 a 50 mg/kg/día.

La cantidad de agente antirreabsortivo que se debe usar se determina por su actividad como agente inhibidor de la pérdida ósea. Una dosis terapéutica se puede determinar además por medio de la farmacocinética de un agente concreto y su dosis mínima de máxima eficacia en la inhibición de la pérdida ósea usando un protocolo como el que se describe en la presente memoria descriptiva (Ensayo para determinar la actividad para prevenir la pérdida ósea inducida por la deficiencia de estrógenos). En general, una dosis eficaz para un agente antirreabsortivo es de aproximadamente 0,001 mg/kg/día a alrededor 20 mg/kg/día. Régimen de coadministración En una forma de realización de la presente invención, un inhibidor de PYK2 y un segundo agente terapéutico óseo se coadministran de forma simultánea o secuencialmente en cualquier orden, o se pueden administrar una única composición farmacéutica que comprenda un inhibidor de PYK2 como se ha descrito anteriormente y un segundo agente terapéutico como se ha descrito anteriormente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El segundo agente terapéutico óseo puede ser un agente anabolizante óseo, un agente antirreabsortivo y/o un agente que sea antirreabsorción y anabolizante óseo. Por ejemplo, se puede usar un antagonista de PYK2 solo o combinado con un segundo agente terapéutico óseo durante aproximadamente una semana a aproximadamente tres años, seguido por un segundo agente terapéutico óseo solo durante aproximadamente una semana a aproximadamente treinta años, con la repetición opcional del ciclo de tratamiento completo. Como alternativa, se puede usar, por ejemplo, un antagonista de PYK2 solo o combinado con un segundo agente terapéutico óseo durante aproximadamente una semana a aproximadamente treinta años, seguido por un segundo agente terapéutico óseo solo durante el resto de la vida del paciente. Como alternativa se puede administrar, por ejemplo, un inhibidor de PYK2 como se ha descrito anteriormente, una vez al día y un segundo agente terapéutico óseo como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, agonista antagonista de estrógeno) puede administrarse diariamente en una o múltiples dosis. Como alternativa, por ejemplo, el inhibidor de PYK2 y un agente terapéutico óseo se pueden administrar secuencialmente, donde el inhibidor de PYK2 como se ha descrito anteriormente se puede administrar una vez al día durante un periodo de tiempo suficiente para aumentar la masa ósea hasta un nivel que esté por encima del umbral de fractura ósea. Opcionalmente, el umbral de fractura es como ha establecido el estudio de la Organización Mundial de la salud "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843", (páginas 1-29). Tras la administración del inhibidor de PYK2, se puede administrar un segundo agente terapéutico óseo diariamente en una o múltiples dosis. Opcionalmente, el inhibidor de PYK2 como se ha descrito anteriormente se administra una vez al día en una forma de liberación rápida tal como liberación oral (por ejemplo, preferentemente se evita la forma de administración por liberación sostenida). En un aspecto opcional de la presente invención, un inhibidor de PYK2 y un segundo agente terapéutico óseo se administran sustancialmente de forma simultánea. En un aspecto opcional de la presente invención, un inhibidor de PYK2 se administra durante un periodo de aproximadamente una semana a aproximadamente treinta años. Opcionalmente, a la administración de un inhibidor de PYK2 le sigue la administración de un segundo agente terapéutico óseo, en el que el segundo agente terapéutico óseo es un modulador selectivo del receptor de estrógeno administrado durante un periodo de aproximadamente tres meses a aproximadamente treinta años sin la administración del primer agente durante el segundo periodo de aproximadamente tres mesas a aproximadamente treinta años. Como alternativa, a la administración de un inhibidor de PYK2 le sigue la administración de un segundo agente terapéutico óseo, en el que el segundo agente terapéutico óseo es un modulador selectivo del receptor de estrógeno administrado durante un periodo mayor de aproximadamente treinta años sin la administración del primer agente durante el periodo mayor de aproximadamente treinta años. Vía de administración La administración de los agentes de esta invención se puede realizar a través de cualquier procedimiento que libere un agente de esta invención sistémica y/o localmente (por ejemplo, en la zona de la fractura ósea, osteotomía o cirugía ortopédica). Estos procedimientos incluyen las vías oral, parenteral, vías intraduodenales, etc. En general, los agentes de esta ¡nvención se administran por vía oral, aunque se puede utilizar la administración parenteral (por ejemplo intravenosa, intramuscular, subcutánea o intramedular), por ejemplo, cuando la administración oral es inadecuada para el objetivo o cuando el paciente es incapaz de ingerir el fármaco. Los inhibidores de PYK2 y el segundo agente terapéutico óseo opcional se pueden usar para el tratamiento y la estimulación de la curación de fracturas óseas y osteotomías mediante la aplicación local (por ejemplo, a las zonas de fracturas óseas u osteotomías) de los agentes de esta invención o composiciones de los mismos. Los agentes de esta ¡nvención se aplican en las zonas de las fracturas óseas u osteotomías, por ejemplo mediante inyección del agente en un disolvente adecuado (por ejemplo un disolvente oleoso tal como aceite de cacahuete) a la placa de crecimiento del cartílago o, en los casos de cirugía abierta mediante la aplicación local de tales agentes en un vehículo adecuado tal como cera ósea, polvo óseo desmineralizado, cementos óseos poliméricos, agentes de sellado óseo, etc. Como alternativa, la aplicación local se puede conseguir mediante la aplicación de una solución o dispersión del agente en un vehículo adecuado sobre la superficie, o mediante su incorporación en implantes sólidos o semisólidos usados de forma convencional en la cirugía ortopédica, tal como una malla de dacrón, Gore-tex®, gel-espuma y hueso kiel, o prótesis. Un inhibidor de PYK2 y un segundo agente terapéutico óseo opcional de esta invención se pueden administrar sistémicamente y/o aplicarse localmente en la zona de una fractura u osteotomía en un vehículo adecuado en combinación con uno o más agentes óseos terapéuticos descritos anteriormente. En la presente invención, un inhibidor de PYK2 y un segundo agente terapéutico óseo opcional se administran en general, en la forma de una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los agentes de esta invención junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por tanto, los agentes de esta invención se pueden administrar de forma individual o juntos en cualquier forma de dosificación convencional oral, parenteral, rectal o transdérmica. Para la administración oral, una composición farmacéutica puede tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, y similares. Se emplean comprimidos que contienen diversos excipientes tales como citrato sódico, carbonato calcico y fosfato calcico junto con diversos disgregantes tales como almidón y, preferentemente, almidón de patata o de tapioca y ciertos silicatos complejos, junto con agentes aglutinantes tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga. Además, los agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, lauril sulfato sódico y talco a menudo son muy útiles para propósitos de preparación de comprimidos. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se emplean como cargas en cápsulas de gelatina con relleno blando y duro; a este respecto, los materiales preferidos también incluyen lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para la administración oral, los agentes de esta invención se pueden combinar con diversos agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión, así como diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones similares de los mismos. Con el propósito de administración parenteral, se pueden emplear soluciones en aceite de sésamo o de cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles de las correspondientes sales hidrosolubles. Tales soluciones acuosas pueden tamponarse de forma adecuada, si es necesario, y primero convertirse el diluyente líquido en isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para propósitos de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, el medio acuoso estéril empleado se puede obtener con facilidad mediante técnicas estándar bien conocidas para el experto en la técnica.

Con el propósito de administración transdérmica (por ejemplo, tópica) se preparan soluciones diluidas estériles, acuosas o parcialmente acuosas (normalmente a una concentración de aproximadamentel 0,1% al 5%), por lo demás similares a las soluciones parenterales anteriores. Los expertos en esta técnica conocen procedimientos para preparar diversas composiciones farmacéuticas con cierta cantidad de ingrediente activo, o estos serán evidentes para ellos a la luz de esta descripción. Para consultar ejemplos de procedimientos para preparar composiciones farmacéuticas, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15 edición (1975). Las composiciones farmacéuticas según la ¡nvención pueden contener un 0.1%-95% del o los agentes de esta ¡nvención, preferentemente un 1%-70%. En cualquier caso, la composición o formulación que se vaya a administrar contendrán una cantidad de un(os) agente(s) según la ¡nvención en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad/afección del sujeto que se esté tratando, por un ejemplo un trastorno óseo. Procedimientos para identificar un agente terapéutico que estimule la función osteoblástica Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para identificar un inhibidor de PYK2 eficaz como agente terapéutico óseo, que comprende administrar a una célula similar a un osteoblasto un agente de prueba y determinar si se estimula la función osteoblástica. Opcionalmente, el procedimiento de identificación además comprende poner en contacto el agente de prueba con PYK2 y determinar si se inhibe la actividad de PYK2. El efecto de un agente de prueba sobre la actividad de PYK2 se puede determinar in vivo o in vitro de acuerdo con cualquier procedimiento conocido para el experto en la técnica, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos indicados en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización, el efecto de un agente de prueba sobre la actividad de PYK2 se determina in vitro en un ensayo con células enteras o sin células. Para el ensayo con células enteras, las células pueden estar intactas o alteradas. Las células pueden ser células similares a osteoblastos o un modelo de células sustitutas de osteoblastos. El efecto del agente de prueba sobre la función osteoblástica se puede determinar ex vivo, in vivo o in vitro de acuerdo con cualquier procedimiento conocido para el experto en la técnica, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos indicados en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización, el efecto de un agente de prueba sobre la actividad de PYK2 y el efecto del agente de prueba sobre la función osteoblástica se determinan in vitro. Opcionalmente, la determinación in vitro de la actividad de PYK2 se lleva a cabo en células similares a osteoblastos cultivadas o en un modelo ¡sustituto de osteoblastos adecuado que exprese PYK2 endógena o recombinante, o en un ensayo sin células in vitro. En otra forma de realización, el efecto de un agente de prueba sobre la actividad de PYK2 se determina in vitro y el efecto del agente de prueba sobre la función osteoblástica se determina in vivo. En otra forma de realización, el efecto de un agente de prueba sobre la actividad de PYK2 se determina in vivo y el efecto del agente de prueba sobre la función osteoblástica se determina in vitro. En otra forma de realización, el efecto de un agente de prueba sobre la actividad de PYK2 y el efecto del agente de prueba sobre la función osteoblástica se determinan in vivo. Opcionalmente, la determinación del efecto del agente de prueba sobre la actividad de PYK2 sigue a la activación de la PYK2 (es decir, determinación del efecto del agente de prueba sobre PYK2 previamente activada). Como ejemplo no limitante, la PYK2 se puede activar previamente a través de fosforilación mediada por Src, como se indica más adelante. Función osteoblástica La función osteoblástica, según la presente invención, incluye, sin limitaciones, una o más de las siguientes: formación de hueso, actividad metabólica que contribuye a la formación de hueso y actividad metabólica que está asociada con el fenotipo de osteoblastos ("función osteoblástica"). Tal función puede ser como se ha demostrado in vivo, in vitro o ex vivo. La función osteoblástica se puede cuantificar por cualquier medio para determinar una o más características que generalmente se atribuyen a los osteoblastos in vivo. Aunque un experto en la técnica entenderá con facilidad el significado de "características que generalmente se atribuyen a los osteoblastos in vivo", en una lista de ejemplos no limitantes se incluyen la producción de fosfatasa alcalina (del tipo no específico de tejido), osteopontina, PYK2, colágeno de tipo I, IGF-1, IGF-II, proteínas de unión a IGF, matriz extracelular, minerales extracelulares insolubles que comprenden calcio y fosfato, y matriz mineralizada. Cuando la función osteoblástica se determina in vivo, además de los ejemplos anteriores se pueden determinar la masa ósea, la potencia ósea, la reparación ósea, las características histomorfométricas y los biomarcadores séricos. Los biomarcadores séricos de la función osteoblástica pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, osteocalcina, fosfatasa alcalina específica de hueso, propéptido amino terminal de procolágeno de tipo I (P 1NP) o péptido de extensión de procolágeno (P1CP). Células similares a osteoblastos Las células reconocidas por el experto como similares a osteoblastos incluyen células MC3T3, SAOS, ROS (por ejemplo ROS 17/2,8), UMR y células troncales mesenquimáticas aisladas de médula ósea (por ejemplo de ser humano, de ratón). Cualquier células similar a osteoblasto que exprese PYK2 (bien de forma natural o bien de forma recombinante) se puede usar de acuerdo con el procedimiento de selección de la presente ¡nvención. En consecuencia, con células similares a osteoblastos también se pretende abarcar células como se han descrito anteriormente y que se transforman con un vector que contiene PYK2 recombinante y que son capaces de transcribir y traducir tales ácidos nucleicos que codifican PYK2. De esta forma, células similares a osteoblastos pueden ser células que expresan PYK2 endógeno, PYK2 recombinante, o ambos. Se conoce la secuencia de PYK2 de varias especies, ¡ncluyendo ratón, rata y ser humano, y un experto en la técnica puede llevar a cabo fácilmente la transformación de células similares a osteoblastos con diversas construcciones de PYK2. Ensayo in vivo de formación de hueso La utilidad y dosificación de un inhibidor de PYK2 o un segundo agente terapéutico óseo de la presente invención en la estimulación de la función osteoblástica se puede valorar, como ejemplo no limitante, mediante su capacidad para aumentar la formación de hueso e incrementar la masa ósea. Tales capacidades se pueden probar en ratas intactas macho o hembra, en ratas con deficiencia de hormonas sexuales macho (orquiectomía) o hembra (ovariectomía). En el estudio se pueden usar ratas macho o hembra de diferentes edades (como de 3 meses de edad). Las ratas están intactas o castradas (ovariectomizadas u orquiectomizadas) y se les inyecta por vía subcutánea o mediante sonda agonistas de prostaglandina a diferentes dosis (tales como 1 , 3 ó 10 mg/kg/día) durante 30 días. En las ratas castradas, el tratamiento comienza al día siguiente de la cirugía (con el propósito de prevenir la pérdida ósea) o en el momento en el que ya se ha producido pérdida ósea (para el propósito de restablecer la masa ósea). Durante el estudio, se permite el acceso libre de todas las ratas a agua y a pienso comercializado (Teklad Rodent Diet n° 8064, Harían Teklad, Madison, Wis) que contiene 1 ,46% de calcio, 0,99% de fósforo y 4,96 Ul/g de vit. D 3. Todas las ratas reciben inyecciones subcutáneas de 10 mg/kg de calceína los días 12 y 2 antes del sacrificio. Se sacrifica a las ratas. Se determinan los siguientes criterios de valoración: Medición del contenido mineral en el fémur En la autopsia se extrae el fémur derecho de cada una de las ratas y se analizó usando absorciometría de rayos X de energía dual (DXA, QDR 1000/W Hologic Inc., Waltham, Mass) equipado con un software "Regional High Resolution Sean" (Hologic Inc., Waltham, Mass). El tamaño de campo de rastreo es de 5,08x1,902 cm, la resolución es de 0,0254 x 0,0127 cm y la velocidad de rastreo es de 7,25 mm/segundo. Se analizan las imágenes de los rastreos femorales y se determinan el área ósea, el contenido mineral óseo (CMO) y la densidad mineral ósea (DMO) del fémur completo (WF), las metáfisis femorales distales (MFD), las diáfisis femorales (DF) y la parte proximal del fémur (PF). Medición del contenido mineral en el hueso vertebral lumbar Se usa absorciometría de rayos X de energía dual (QbR 1001 W Hologic Inc., Waltham, Mass) equipado con un software "Regional High Resolution Sean" (Hologic Inc., Waltham, Mass) para determinar el área ósea, el contenido mineral óseo (CMO) y la densidad mineral ósea (DMO) de toda la columna vertebral lumbar y de cada una de las seis vértebras lumbares (LV1-6) en las ratas anestesiadas. Las ratas se anestesian mediante inyección (ip) de 1 ml/kg de una mezcla de ketamina/rompun (proporción de 4 a 3) y después se colocan en la plataforma para ratas. El tamaño de campo de rastreo es de 6x1,9 cm, la resolución es de 0,0254 x 0,0127 cm y la velocidad de rastreo es de 7,25 mm/segundo. Se obtiene y analiza la imagen de rastreo de la columna vertebral lumbar completa. Se determinan el área ósea 30 (AO) y el contenido mineral óseo (CMO) y se calcula la densidad mineral ósea (CMO dividido entre el AO) para toda la columna vertebral lumbar y cada una de las seis vértebras lumbares (LV1 -6). Análisis histomorfométricos de la tibia En la autopsia se extrae la tibia derecha, se limpia de músculo y se corta en tres partes. La parte proximal de la tibia y la diáfisis tibial se fijan en etanol al 70%, se deshidratan en concentraciones graduales de etanol, se desgrasan en acetona y a continuación se incluyen en metacrilato de metilo (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY). Usando un micrótomo Reichert-Jung Polycut S se cortan secciones frontales de metáfisis de la parte proximal de la tibia con un espesor de 4 y 10 µm. Las secciones de 4 µm se marcan con tinción tricrómica de Masson modificada, mientras que las secciones de 10 µm quedan sin marcar. Una sección de 4 µm y una de 10 µm de cada rata se usan para realizar histomorfometría del hueso esponjoso. Usando un micrótomo Reichert-Jung Polycut S se cortan secciones transversales de diáfisis tibial con un espesor de 10 µm. Estas secciones se usan para los análisis histomorfométricos de hueso cortical. Histomorfometría del hueso esponjoso: se usa un sistema de histomorfometría Bioquant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville, Tenn) para las mediciones histomorfométricas estáticas y dinámicas de la esponjosa secundaria de la metáfisis tibial proximal entre 1 ,2 y 3,6 mm distal a la unión epifisaria-placa de crecimiento-. Es necesario omitir los primeros 1 ,2 mm de la región metafisaria tibial con el fin de restringir las mediciones a la esponjosa secundaria. Las secciones de 4 µm se usan para determinar los índices relacionados con el volumen óseo, la estructura ósea y la reabsorción ósea, mientras que las secciones de 10 µm se usan para determinar los índices relacionados con la formación ósea y el recambio óseo. Medidas y cálculos relacionados con el volumen y estructura del hueso trabecular: (1 ) Área metafisaria total (TV, mm2): área metafisaria entre 1 ,2 y 3,6 mm distal a la unión epifisaria-placa de crecimiento. (2) Área de hueso trabecular (BV, mm2): área total de trabéculas en TV. (3) Perímetro del hueso trabecular (BS, mm): longitud del perímetro total de las trabéculas. (4) Volumen del hueso trabecular (BV/TV, %): BV/TV X 100. (5) Número de hueso trabecular (TBN, n°/mm): 1 ,199/2xBS/TV. (6) Espesor del hueso trabecular (TBT, µm): (2000/1 ,199) x (BV/BS). (7) Separación del hueso trabecular (TBS, µm): (2000 X 1 ,199) X (TV- BV). Medidas y cálculos relacionados con la reabsorción ósea (1) Número de osteoclastos (NOC, n°): número total de osteoclastos en el área metafisaria total. (2) Perímetro osteoclástico (POC, mm): longitud de perímetro trabecular cubierto por osteoclastos. (3) Número de osteoclastos/mm (NOC/mm, n°/mm): NOC/BS. (4) Porcentaje de perímetro osteoclástico (%POC, %): POC/BS X 100. Medidas y cálculos relacionados con la formación y el recambio óseos (1) Perímetro marcado con una calceína (SLS, mm): longitud total de perímetro trabecular marcado con un marcador de calceína. (2) Perímetro marcado con doble calceína (DLS, mm): longitud total de perímetro trabecular marcado con dos marcadores de calceína. (3) Anchura entre mareajes (ILW, µm): distancia media entre dos marcadores de calceína. (4) Porcentaje de perímetro mineralizante (PMS, %): (SLS/2 + DLS)/BS X 100. (5) Tasa de aposición mineral (TAM, µm/día): ILW/intervalo del mareaje (6) Tasa de formación ósea/ref. superficial (BFR/BS, µm2/d/µm): (SLS/2 + DLS) X TAM/BS. (7) Tasa de recambio óseo (TRO, %/y): (SLS/2 + DLS) x TAM/BV x 100.

Histomorfometría del hueso cortical Se puede usar cualquier análisis histomorfométrico. A modo de ejemplo, se puede usar un sistema de histomorfometría Bioquant OS/2 (R&M biometrics, Inc., Nashville, Tenn) para las mediciones histomorfométricas estáticas y dinámicas del hueso cortical de la diáfisis tibial. Se miden el área tisular total, el área de la cavidad medular, el perímetro perióstico, el perímetro endocortieal, el perímetro de mareaje único, el perímetro de mareaje doble y la anchura entre mareajes sobre la superficie perióstica y endocortieal, y se calculan el área de hueso cortical (área tisular total-área de la cavidad medular), porcentaje de área de hueso cortical (área cortical/área tisular total x 100), porcentaje de área medular (área de cavidad medular/área tisular total x 100), porcentaje del perímetro marcado perióstico y endocortieal (perímetro con un único marcaje/2 + perímetro con mareaje doble)/perímetro total x 100], tasa de aposición mineral (anchura entre mareajes /intervalos) y tasa de formación ósea [tasa de aposición mineral x [(perímetro con un único marcaje/2 + perímetro con mareaje doble)/perímetro total]. La estadística se puede calcular con los paquetes StatView 4.0 (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, California). Para comparar las diferencias entre grupos se usan la prueba del análisis de la varianza (ANOVA), seguida por una PLSD de Fischer. Ensayos de curación de fracturas para determinar los efectos sobre la curación de fracturas tras la administración sistémica La utilidad y dosificación de un inhibidor de PYK2 y/o un segundo agente terapéutico óseo de la presente invención administrados sistémicamente para estimular la función osteoblástica se pueden valorar por su capacidad para ayudar a la curación de las fracturas y se pueden evaluar por cualquier procedimiento conocido para un experto en la técnica. Uno de tales ensayos de curación de fracturas se ilustra a continuación (Ensayos de curación de fracturas para determinar los efectos sobre la curación de fracturas tras la administración local). Otro ensayo opcional para determinar la eficacia del tratamiento con un inhibidor de PYK2 administrado sistémicamente es del siguiente modo: Técnica de fractura: Ratas Sprage-Dawley de 3 meses de edad se anestesian con ketamina. En la cara anteromedial de la parte proximal de la tibia o el fémur derecho se realiza una incisión de 1 cm. A continuación se describe la técnica quirúrgica tibial. La incisión se lleva a cabo a través del hueso y se perfora un orificio de 1 mm, 4 mm proximal a la cara distal de la tuberosidad tibial, 2 mm medial al borde anterior. Con un tubo de acero inoxidable de 0,8 mm (carga máxima 36,3 N, máxima rigidez 61 ,8 N/mm, probado en las mismas condiciones que los huesos) se introduce un clavo intramedular. No se lleva a cabo el escariado del canal medular. Con unas pinzas ajustables diseñadas especialmente con mordazas romas se produce una fractura cerrada convencional 2 mm por encima de la unión tibiofibular mediante flexión de tres puntos. Para minimizar el daño a los tejidos blandos se debe tener cuidado de no desplazar la fractura. La piel se cierra con suturas de nylon de monofilamento. La operación se lleva a cabo en condiciones estériles. Tras la introducción del clavo inmediatamente se toman radiografías de todas las fracturas y se excluyen los animales con fracturas fuera del área diafisaria especificada o con clavos desplazados. Los animales restantes se dividen de forma aleatoria en los siguientes grupos con 10-12 animales por cada subgrupo para comprobar la curación de las fracturas. El primer grupo recibe sondas diarias de vehículo (agua: 100% de etanol= 95:5) a 1 ml/rata, mientras que los otros reciben sondas diarias con de 0,01 a 100 mg/kg/día del agente que se va a probar (1 ml/rata) durante 10, 20, 40 y 80 días. A los 10, 20, 40 y 80 días, 10-12 ratas de cada grupo se anestesian con ketamina y se les realiza la autopsia mediante exanguinación. Ambos huesos tibiofibulares se retiran mediante disección y se quitan todos los tejidos blandos. Los huesos de 5-6 ratas de cada grupo se almacenan en 70% de etanol para su análisis histológico y los huesos de otras 5-6 ratas de cada grupo se almacenan en una solución de Ringer tamponada (+4°C, pH 7,4) para realizar radiografías y las pruebas biomecánicas. Análisis histológico: Mosekilde y Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone 14: 19-27, 1993) han publicado anteriormente los procedimientos para el análisis histológico de huesos fracturados. En pocas palabras, el lado de la fractura se sutura 8 mm a cada lado de la línea de fractura, se incluye sin descalcificar en metilmetacrilato y con un micrótomo Reichert-Jung Polycut se cortan secciones frontales de 8 µm de espesor. Las secciones medio frontales teñidas con la tinción tricrómica de Masson (incluidas la tibia y el peroné) se usan para la visualización de la respuesta celular y tisular a la curación de fracturas con y sin tratamiento. Secciones teñidas con rojo sirio se usan para demostrar las características de la estructura callosa y para diferenciar entre hueso tejido y hueso laminar en la zona de la fractura. Se llevan a cabo las siguientes medidas: (1) hueco de la fractura, medido como la distancia más corta entre los extremos del hueso cortical en la fractura, (2) la longitud del callo y el diámetro del callo, (3) el área de volumen óseo total del callo, (4) tejido óseo por área tisular dentro del área del callo, (5) tejido fibroso en el callo, (6) área de cartílago en el callo. Análisis biomecánico: La utilidad y dosificación de un inhibidor de PYK2 y/o un segundo agente terapéutico óseo de la presente invención administrados localmente para estimular la función osteoblástica se pueden valorar por su capacidad para afectar de forma positiva a la integridad biomecánica del hueso. Bak y Andreassen (The Effects of Aging on Fracture Healing in Rats.

Calcif Tissue Int 45: 292-297, 1989) ya han publicado anteriormente procedimientos para el análisis biomecánico. Peter y col. (Peter, C. P.; Cook, W. O.; Nunamaker, D. M.; Provost, M. T.; Seedor, J. G.; Rodan, G. A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14: 74-70, 1996) han publicado anteriormente otros procedimientos analíticos biomecánicos útiles con la presente invención.

En pocas palabras, antes de la prueba biomecánica se toman radiografías de todas las fracturas. Las propiedades mecánicas de las fracturas en curación se analizan mediante un procedimiento destructivo de flexión de tres o cuatro puntos. Se determinan la carga máxima, la rigidez, la energía a carga máxima, la deflección a carga máxima y la tensión máxima. Ensayo para determinar los efectos sobre la curación de fracturas tras la administración local La utilidad y dosificación de un inhibidor de PYK2 y/o un segundo agente terapéutico óseo de la presente invención administrados localmente para estimular la función osteoblástica se pueden valorar por su capacidad para ayudar a la curación de la fractura y se pueden evaluar mediante cualquier procedimiento conocido para el experto en la técnica. Uno de tales ensayos de curación de fracturas se ha indicado anteriormente (Ensayos de curación de fracturas para determinar los efectos sobre la curación de fracturas tras la administración sistémica). Otro de tales ensayos opcionales de curación de fracturas útil para valorar el tratamiento con un inhibidor de PYK2 administrado localmente es de la siguiente manera: Técnica de fractura: En el estudio se usan perros sabuesos machos o hembras de aproximadamente 2 años de edad. Se producen fracturas radiales transversas mediante carga lenta continua en flexión de tres puntos como describen Lenehan y col. (Lenehan, T. M.; Balligand, M.; Nunamaker, D. M.; Wood, F. E.: Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs. J Orhop Res 3: 499-507; 1985). El alambre se introduce a través de la zona de fractura para garantizar la alteración anatómica completa del hueso. A continuación, mediante liberación lenta del agente administrado mediante granzas de liberación lenta o minibombas Alzet durante 10, 15 ó 20 semanas se consigue la administración local de agonistas de prostaglandinas en la zona de la fractura. Análisis histológico: Peter y col. (Peter, C. P.; Cook, W. O.; Nunamaker, D. M.; Provost, M. T.; Seedor, J. G.; Rodan, G. A. Effects of Alendronate On Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs. J. Orthop. Res. 14: 74-70, 1996) y Mosekilde y Bak (The Effects of Growth Hormone on Fracture Healing in Rats: A Histological Description. Bone, 14: 19-27, 1993) han publicado anteriormente los procedimientos para el análisis histológico de huesos fracturados. En pocas palabras, la cara de la fractura se sutura 3 cm a cada lado de la línea de fractura, se incluye sin descalcificar en metilmetacrilato y con un micrótomo Reichert-Jung Polycut se cortan secciones frontales de 8 µm de espesor. Las secciones medio frontales teñidas con la tinción tricrómica de Masson (incluidas la tibia y el peroné) se usan para la visualización de la respuesta celular y tisular a la curación de fracturas con y sin tratamiento. Secciones teñidas con rojo sirio se usan para demostrar las características de la estructura callosa y para diferenciar entre hueso tejido y hueso laminar en la zona de la fractura. Se realizan las siguientes medidas: (1) el hueco de la fractura: medido como la distancia más corta entre los extremos de hueso cortical en la fractura, (2) la longitud del callo y el diámetro del callo, (3) Área del volumen óseo total del callo, (4) Tejido óseo por área tisular dentro de la zona del callo, (5) Tejido fibroso en el callo (6) Área de cartílago en el callo. Análisis biomecánico: Aunque el experto en la técnica reconocerá que se dispone de una variedad de procedimientos para el análisis biomecánico, un ejemplo no limitante de ello se indica anteriormente en "Ensayos de curación de fracturas para determinar los efectos sobre la curación de fracturas tras la administración sistémica". Ensayo para determinar la actividad para prevenir la pérdida ósea inducida por la deficiencia de estrógenos La utilidad y dosificación de un inhibidor de PYK2 y/o un segundo agente terapéutico óseo de la presente ¡nvención para estimular la función osteoblástica se pueden valorar por su capacidad para prevenir la osteoporosis y se pueden evaluar mediante cualquier procedimiento conocido para un experto en la técnica. Uno de tales procedimientos es un modelo de pérdida ósea en ratas ovariectomizadas de pérdida ósea posmenopáusica. En estos estudios se usan ratas hembra Sprague-Dawley (Charles River, Wilmington, Mass) de diferentes edades (como por ejemplo de 5 meses de edad). Las ratas se enjaulan de una en una en jaulas de 20 cm x 32 cm x 20 cm durante el periodo experimental. Se permitió a todas las ratas acceso libre a agua y a pienso comercial (Agway ProLab^SOOO, Agway County Food, Inc., Syracuse, NY) que contiene 0,97% de calcio, 0,85% de fósforo y 1 ,05 Ul/g de vit. D 3. Se somete a un grupo de ratas (de 8 a 10) a una operación simulada y se tratan por vía oral con vehículo (10% de etanol y 90% de solución salina, 1 ml/día), mientras que las ratas restantes se someten a una ovariectomía bilateral (OVX) y se tratan con vehículo (v.o.), un inhibidor de PYK2, 17ß-estradiol (Sigma, E-8876, E2, 30 µg/kg, inyección subcutánea diaria) o un modulador selectivo del receptor de estrógeno (tal como droloxifeno a 5, 10 ó 20 mg/kg diarios v.o.) durante un cierto periodo (tal como 4 semanas). Todas las ratas reciben inyecciones subcutáneas de 10 mg/kg de calceína (marcador óseo de fluorocromo) 12 y 2 días antes de su sacrificio con el fin de estudiar los cambios dinámicos en el tejido óseo. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrifica a las ratas y se les realiza la autopsia. Se determinan los siguientes criterios de valoración: Ganancia de peso corporal: peso corporal en la autopsia menos el peso corporal en el momento de la cirugía. Peso del útero e histología: Durante la autopsia se extrae el útero de cada rata y se pesa de inmediato. A continuación él útero se procesa para realizar medidas histológicas tales como ei área tisular transversal del útero, el espesor del estroma y el espesor del epitelio luminal. Colesterol sérico total: Se obtiene sangre mediante punción cardíaca y se deja coagular a 4°C y después se centrifuga a 2.000 g durante 10 minutos. Las muestras de suero se analizan para determinar el colesteroi sérico total usando un ensayo calorimétrico de colesterol de alto rendimiento (Boehringer Mannheim biochemicals, Indianapolis, Ind). Medidas del contenido mineral en el fémur: Aunque el experto reconocerá que se dispone de una variedad de procedimientos para medir el contenido mineral en el fémur, un ejemplo no limitante es el que se ha indicado anteriormente en "Ensayo ¡n vivo de formación ósea". Análisis histomorfométricos de hueso esponjoso en la metáfisis de la parte proximal de la tibia: Aunque el experto reconocerá que se dispone de una variedad de procedimientos para el análisis histomorfométrico del hueso esponjoso en la metáfisis de la parte proximal de la tibia, un ejemplo no limitante es el que se ha indicado anteriormente en "Ensayo in vivo de formación ósea". Protocolo del tratamiento de combinación La utilidad y dosificación de un inhibidor de PYK2 de la presente invención en combinación con un segundo agente terapéutico óseo según la presente invención se pueden evaluar por cualquier procedimiento conocido para un experto en la técnica, incluidos los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva. Aunque debería reconocerse con facilidad, los expertos en la técnica pueden variar el siguiente protocolo, un ejemplo adicional de un procedimiento es el siguiente: Se pueden usar ratas intactas macho o hembras, ratas con deficiencias en hormonas sexuales macho (orquiectomizadas) o hembra (ovariectomizadas). Además, en estos estudios se pueden usar ratas macho o hembra de diferentes edades (como por ejemplo de 12 meses de edad). Las ratas pueden estar intactas o castradas (ovariectomizadas u orquiectomizadas) y se les administra un inhibidor de PYK2 de la presente invención a diferentes dosis durante un cierto periodo (tal como de dos semanas a dos meses), y seguido por la administración de cualquier agente anabolizante y/o cualquier agente antirreabsortivo tal como droloxifeno a diferentes dosis (tal como 1 , 5, 10 mg/kg/día) durante un cierto periodo (tal como de dos semanas a dos meses), o un tratamiento de combinación con un inhibidor de PYK2 y un agente terapéutico óseo (por ejemplo, y un agente antirreabsortivo) a diferentes dosis durante un cierto periodo (tal como de dos semanas a dos meses). En ratas castradas, el tratamiento se puede comenzar el día siguiente a la cirugía (para el propósito de la prevención de la pérdida ósea) o en el momento en el que ya se ha producido pérdida ósea (para el propósito de restablecer la masa ósea). Las ratas se sacrifican mientras están anestesiadas con ketamina. Se determinan los siguientes criterios de valoración: I. Medidas del contenido mineral en el fémur II. Medidas del contenido mineral en el hueso vertebral lumbar: III. Análisis histomorfométricos del hueso esponjoso de la metáfisis de la parte proximal de la tibia: IV. Medidas y cálculos relacionados con la estructura y el volumen de hueso trabecular: V. Medidas y cálculos relacionados con la reabsorción ósea: VI. Medidas y cálculos relacionados con la formación y recambio óseos: VII. Estadística Aunque el experto reconocerá que se dispone de una variedad de procedimientos para determinar los criterios de valoración mencionados anteriormente, un ejemplo no limitante de cada procedimiento de determinación se ha indicado anteriormente en "Ensayo in vivo de la formación ósea" Inhibición de PYK2 La inhibición de la función de PYK2, según ia presente invención, se determina en células similares a osteoblastos (in vivo, in vitro o ex vivo) o un sustituto adecuado de osteoblastos. A modo de ejemplo no limitante, un sustituto adecuado de osteoblastos es una célula de inducción del gen NIH3T3, una célula neuronal PC12 o linfocitos primarios. En una forma de realización, la función PYK2 inhibida es la fosforilación dependiente de PYK2 (es decir, la actividad tirosina quinasa). La actividad tirosina quinasa se puede valorar mediante la determinación de la fosforilación dependiente de PYK2 de un sustrato endógeno tal como PYK2 o mediante fosforilación de un sustrato añadido de forma exógena. Un sustrato añadido de forma exógena puede ser un sustrato natural o un sustrato artificial. Opcionalmente, la fosforilación de un sustrato se mide en un resto de tirosina. Opcionalmente, el resto de tirosina es un residuo de tirosina de PYK2. En una forma de realización de la presente invención, se mide la fosforilación de la tirosina 402 de la PYK2. A modo de ejemplo no limitante, la fosforilación en la tirosina 402 de la PYK2 se determina mediante el uso de un anticuerpo específico para PYK2 que tiene la tirosina 402 fosforilada. Uno de tales anticuerpos primarios adecuados para la presente invención es el pyk2 fosfo-Y402 de Biosource (n° catálogo 44-618G). A modo de ejemplo no limitante, la fosforilación dependiente de PYK2 se puede medir de acuerdo con esta invención mediante un ensayo in vitro con quinasa. En este ensayo, la fosforilación dependiente de PYK2 se determina mediante la medición de la capacidad de la PYK2 para incorporar un fosfato en un sustrato. Opcionalmente, el fosfato está marcado. Opcionalmente, el fosfato está radiomarcado. La fosforilación dependiente de PYK2 también se puede medir usando ATP marcado con gamma-32P, como se establece, a modo de ejemplo, en el Ejemplo 4 del documento WO 98/35016, incorporado en la presente memoria descriptiva como referencia. La fosforilación dependiente de PYK2 también se puede medir de acuerdo con esta ¡nvención midiendo la capacidad de la PYK2 para fosforilar la PYK2 en el resto de tirosina 402. En general, este ensayo se lleva a cabo en condiciones similares a las del ensayo in vitro con quinasa usando poli-(glu.tyr) como se describe más adelante, excepto que no se requiere que esté presente un sustrato exógeno. En una forma de realización opcional, el fosfato está radiomarcado y su incorporación en la PYK2 se controla mediante SDS- PAGE, seguido por radiografía. La cantidad de fosforilación de PYK2 generalmente refleja el estado de activación de PYK2. Por tanto, un compuesto que inhibe la fosforilación dependiente de PYK2 de PYK2 sería un inhibidor de PYK2. En otro ejemplo, la fosforilación dependiente de PYK2 se puede medir mediante el uso de anticuerpos específicos para la PYK2 fosforilada, como se ilustra en el Ejemplo 5. La cantidad de anticuerpo específico para la PYK2 fosforilada (visualizada, por ejemplo, mediante análisis de bandas Western) se puede normalizar a la cantidad de anticuerpo específico de PYK2 (es decir, anticuerpo que inmunoreacciona con PYK2 fosforilada y no fosforilada). La fosforilación dependiente de PYK2 también se puede medir de acuerdo con esta invención mediante la determinación de la incorporación de fosfato marcado en un sustrato añadido de forma exógena. A PYK2 se añaden un inhibidor potencial de PYK2 y un sustrato endógeno de PYK2, y la incorporación se cuantifica en presencia y ausencia del posible inhibidor de PYK2. En esta forma de realización, la PYK2 puede ser recombinante, de una fuente natural (un mamífero como fuente) o se proporciona en una célula similar al osteoblasto intacta o alterada. Seudosustrato de PYK2 En otra forma de realización, la fosforilación dependiente de PYK2 (o inhibición de la misma) se puede cuantificar usando un sustrato exógeno que comprende un seudosustrato de PYK2. Un seudosustrato de PYK2 puede contener cualquier modificación en el extremo N o C tal como, a modo de ejemplo no limitante, biotina. Un resto de cisteína se puede modificar o sustituir con serina para prevenir la formación de disulfuro. Un ensayo según la presente invención se puede realizar mediante la incubación de un posible inhibidor de PYK2 con un seudosustrato de PYK2 y PYK2. La PYK2 puede ser recombinante, de una fuente natural (un mamífero como fuente) o se puede proporcionar en una célula similar al osteoblasto intacta o alterada. Seudoenzima PYK2 En una forma de realización, la PYK2 recombinante es un péptido que comprende un dominio quinasa PYK2 correspondiente a los restos aminoacídicos de PYK2 414-692 ("seudoenzima PYK2"). La seudoenzima PYK2 puede comprender además una marca His en el extremo N. La seudoenzima PYK2 se puede expresar en baculovirus. La seudoenzima PYK2 se puede purificar usando cromatografía de afinidad y/o convencional. Potenciación opcional de la actividad de PYK2 Opcionalmente, la actividad tirosina quinasa de la seudoenzima PYK2 (o, en otras formas de realización, la PYK2 exógena o endógena) se puede potenciar mediante la fosforilación de los sitios de fosforilación Src (Y-579, Y-580) incubando la seudoenzima PYK2 con tirosina quinasa Src recombinante (Upstate Biochemical o una proteína producida de forma similar) y ATP en condiciones recomendadas por el fabricante. La seudoenzima PYK2 fosforilada se purifica después sustancialmente a partir de Src usando cromatografía de afinidad y/o convencional. Sustrato artificial de PYK2 En otra forma de realización, los inhibidores de PYK2 y la actividad inhibidora de PYK2 se identifican usando un sustrato artificial de PYK2 añadido de forma exógena tal como poli(glu, tyr) [proporción molar aproximadamente 4:1; Sigma Chemical Company, San Louis, MO) y se puede cuantificar como se describe en el documento WO 98/35056 del siguiente modo: Después de incubar las células similares a osteoblastos con un inhibidor de PYK2 de prueba, las células se pueden solubilizar en tampón de lisis TNE que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCI mM, 1% de NP-40, EDTA 1 mM, 10% de glicerol, NaF 50 mM, vanadato sódico 1 mM e inhibidores de proteasa. La mitad de la muestra se puede someter a inmunotransferencia con anticuerpos antiPYK2 y la otra mitad se puede lavar dos veces con el mismo tampón de lisis y con tampón de ensayo de quinasa (1 vez) que contienen Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCI 100 mM, MnCI2 10 mM y ditiotreitol 1 mM. Tras la eliminación del tampón de lavado se pueden añadir 50 µl de tampón de ensayo con quinasa que contiene 5 µCi de ATP[?-32P] (3000 Ci/mmol, Amersham), ATP 10 µM, 0,1% de BSA y 100 µg de poli(glu, tyr) y se incuban durante 10 minutos a 30°C (Howell y Cooper, 1995 Mol. Cell. Biol. 14: 5402-5411). Las mezclas de reacción (25 µl) se añaden a 25 µl de 30% de ácido tricloroacético (TCA) y pirofosfato sódico 0,1 M, seguido por incubación a 4°C durante 15 minutos. Las proteínas precipitadas se pueden transferir a una placa de filtros Multiscreen-FC (Millipore, Marlborough, MA), se lavaron con TCA al 15% helado, se dejaron secar y la incorporación de 32P al seudosustrato se puede contar en un contador de centelleo de microplacas de Packard Top Count (Packard, Meriden, CT) II) La actividad específica se puede determinar mediante la comparación de las cuentas radiactivas con señales de ¡nmunotransferencia. La inmunotransferencia se puede llevar a cabo del siguiente modo: la fosfotirosina se detecta mediante ¡nmunotransferencia con anticuerpo monoclonal antifosfotirosina conjugado con HRP 4G10 o con anticuerpos policlonales ant¡PYK2, seguido por IgG anticonejo conjugada con HRP. Se pueden desarrollar bandas de transferencias mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL, Amersham). Las señales ECL se pueden determinar usando un densitómetro láser LKB ultroscan XL (LKB, Bromma, Suecia) y la actividad específica de la PYK2 fosforilada en tirosina se puede calcular mediante la comparación de los contenidos estimados en fosfotirosina con los niveles proteicos de la PYK2. La actividad relativa específica de la PYK2 fosforilada normalmente se determina a partir de experimentos realizados por triplicado. Ensayo de fosforilación dependiente de PYK2 usando polarización de fluorescencia En otra forma de realización, la actividad de fosforilación dependiente de PYK2 se puede detectar usando polarización por fluorescencia. La polarización de fluorescencia usa un fosfopéptido marcado con fluoresceína ("marcador"), un sustrato de PYK2, PYK2, y opcionalmente un posible inhibidor de PYK2. En ausencia de actividad de fosforilación dependiente de PYK2 (por ejemplo, en presencia de un inhibidor de PYK2), una porción significativa del marcador se unirá al anticuerpo antifosfotirosina, lo que dará como resultado un elevado valor de polarización. En presencia de actividad de fosforilación dependiente de PYK2 no inhibida, el sustrato se fosforilará. Tal sustrato fosforilado generado competirá con el marcador por la unión a los anticuerpos antifosfotirosina, por lo que disminuye la cantidad de marcador unido y, por tanto, disminuye el valor de polarización por fluorescencia de la muestra. Si durante la reacción se genera bastante producto quinasa de la reacción, el marcador fluorescente será desplazado completamente de los anticuerpos antifosfotirosina y la luz emitida se despolarizará del todo. Por tanto, el cambio en la polarización de la fluorescencia está relacionado directamente con la actividad de fosforilación dependiente de PYK2. En otra forma de realización, se incuban aproximadamente 150 pM de seudoenzima PYK2 con 15 µM de seudosustrato de PYK2 en tampón de ensayo con quinasa (HEPES 50 mM, pH 7,5, MgCI2 1 mM, 0,1% de BSA, DTT 10 mM y ATP 50M). Cuando el ensayo incluye un posible inhibidor de PYK2, se incluye en la incubación control un vehículo adecuado y el ATP se añade el último. Se deja progresar la reacción durante de 1 a 2 horas a 30°C. La reacción se detiene mediante la adición de una mezcla de detención/detección que contiene EDTA, marcador verde 10X PTK (Invitrogen n° P2843) y 10X de anticuerpo antifosfotirosina (Invitrogen). Tras una hora de equilibrado a temperatura ambiente, las placas se leen en Molecular Devices Analyst GT usando filtros y parámetros compatibles con el marcador verde. Se generan curvas sigmoidales de respuesta a la dosis usando el GraphPad Prism o un software similar que usa regresión lineal con pendiente variable. Cuando tal experimento se lleva a cabo con dosis crecientes de PF-X se determinó que la CI50 era 30,9 nM. Fosforilación in vitro dependiente de PYK2 usando células transformadas con una PYK2 inducible La fosforilación dependiente de PYK2 se puede analizar con células similares a osteoblastos o células sustitutas de osteoblastos transformadas para que sobreexpresen PYK2. La sobreexpresión constitutiva de PYK2 provoca que una serie de tipos celulares se desunan de las placas de cultivo tisular con el tiempo. Opcionalmente, la fosforilación dependiente de PYK2 se puede analizar usando células transformadas con una PYK2 inducible. Un experto en la técnica puede emplear con facilidad varios sistemas de expresión génica inducibles para cultivos de células de mamífero (por ejemplo, tetraciclina, ecdisona, etc.). Opcionalmente, las células se pueden transformar usando el sistema inducible RU486 (Invitrogen). A modo de ejemplo, los detalles se proporcionan en el Ejemplo 9.

III) Aunque los solicitantes han incluido encabezamientos en la presente solicitud, tales encabezamientos son para la conveniencia del lector y no deben leerse como limitaciones. Deberá ser obvio que muchos términos (A modo de ejemplo no limitante, inhibidor de PYK2, función osteoblástica, célula similar al osteoblasto, etc.) son aplicables a múltiples formas de realización de la presente invención. EJEMPLOS DE FUNCIONAMIENTO Habiendo ya descrito la invención en general, la misma se entenderá con más facilidad haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y con los que no se pretende limitar la presente invención, a menos que se especifique. EJEMPLO 1 Banda de transferencia de PYK2 en SDS-PAGE. Los lisados de células osteoblastos murinas (MC3T3 y C3H10T1/2) y humanas (células troncales mesenquimáticas de 2 donantes y MG63) se inmunoprecipitaron con un anticuerpo policlonal antiPYK2 (3Pn° 5 o antiPYK2 Santa Cruz). La PYK2 ¡nmunoprecipitada se resolvió por SDS-PAGE, se transfirió a membranas de PVDF y después se introdujo una sonda con el anticuerpo policlonal ant¡PYK2, seguido por la proteína A unida a HRP. Como control positivo se usó un lisado de células 293 T sometidas a transfección con un vector de expresión de PYK2. En la figura 1 se muestran dos exposiciones diferentes de la transferencia. Estos resultados demuestran que la PYK2 se expresa en células similares a osteoblastos murinas y humanas. Procedimientos usados en los Ejemplos 2, 3, 4 y 6 Medida cuantitativa de la fosfatasa alcalina. Para las medidas cuantitativas de la fosfatasa alcalina, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), seguido por la incubación con tampón sustrato (glicina 50 mM, cloruro de magnesio 1 mM, pH 10,5) que contiene 1 ,3 mg/ml de p-nitrofenol fosfato. Los niveles de actividad fosfatasa alcalina se determinaron mediante la medición de la absorbancia a 405 nm y se compararon con los valores convencionales de p-nitrofenol. El nivel de actividad de fosfatasa alcalina se corrigió para la cantidad de ADN en cada muestra. Tinción de la fosfatasa alcalina (cualitativa). La determinación cualitativa de la fosfatasa alcalina se llevó a cabo usando un kit de fosfatasa alcalina de leucocitos (Sigma, n° 85L-3R). Las células se enjuagaron dos veces con DPBS y se fijaron durante 1 minuto con citrato:acetona (2:3-vol/vol). El fijador se lavó con DPBS y las células se tiñeron con una solución de Fast Violet B que contiene solución de fosfatasa alcalina Naftol AS-MX según las instrucciones dei fabricante. Las células se incubaron en oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Las células se enjuagaron tres veces con agua. Ensayo de calcio. El calcio depositado por las células se midió usando un kit diagnóstico (Sigma n° 587A). En pocas palabras, las células se enjuagaron dos veces con DPBS y se hidrolizaron en HCl 0,5N en rotación durante la noche a 4°C. A continuación se rascaron las células y se precipitaron los restos celulares. Los sobrenadantes se usaron para medir los niveles de calcio según el protocolo del fabricante. Se determinó la absorbancia a 570 nm y se comparó con los valores convencionales de calcio. Los niveles de calcio se corrigieron para el contenido de ADN en cada pocilio. Ensayo de ADN. El contenido en ADN se mide usando pigmento bisbencimida fluorescente de Hoechst 33258. Las células se lavan dos veces con DPBS y se tripsinizan. Los sedimentos celulares se digieren durante la noche a 60°C con tampón de digestión con papaína (acetato sódico 0,1 M, pH 5,6, EDTA 0.05M, cisteína 0,001 M, 150 µg/ml de papaína). Tras la digestión se añaden 100 µl de muestra a 100 µl de pigmento de Hoescht 1 µg/ml en tampón TNE (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, NaCI 2M, pH 7,4). Las lecturas de la absorbancia se miden a 356 nm/458 nm y se comparan con los valores convencionales para ADN de timo de ternero. Tinción de Von Kossa. Se llevó a cabo una tinción de Von Kossa tras la tinción de muestras para fosfatasa alcalina. Se aspiró el agua y las células se incubaron con 2% de nitrato de plata durante 10 minutos en oscuridad. A continuación las células se lavaron tres veces con agua, dejando el aclarado final en las células. Las placas se colocaron bajo luz UV o se expusieron a luz del sol brillante durante 15 minutos. A continuación se enjuagaron las células tres veces con agua y se fotografiaron los nodulos negros de Von Kossa. EJEMPLO 2 El papel de la PYK2 en la diferenciación y función de los osteoblastos se estudió mediante el análisis del efecto de los inhibidores de PYK2 sobre la fosfatasa alcalina y el depósito de calcio por parte de los osteoblastos in vitro.

Células troncales mesenquimáticas murinas se aislaron de fémures y tibias de ratones C57BI/6 se cultivaron en MEM-alfa que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y se sembraron en placas de seis pocilios a una densidad de 3 x 106 células/pocilio. El día después de la siembra se retiraron los medios y se sustituyeron con medios solos, en medios con OS o en medios OS que contienen 1 µM de dexametasona o dosis crecientes de PF-Y durante 21 días. El "medio "OS"" contiene ácido ascórbico 50 µM y ß-glicerofosfato 10 mM. Los medios se refrescaron cada 3 días. La cantidad de fosfatasa alcalina se midió el día 7 y el día 21. Las cantidades de calcio secretado se determinaron sólo el día 21. La tinción de Von Kossa se realizó tras la tinción de las muestras del día 21 para la fosfatasa alcalina.

Como se muestra en la Figura 2, la incubación de células MSC murinas con dexametasona, un agonista conocido de la función osteoblástica, tuvo como resultado una estimulación de la actividad de fosfatasa alcalina (un marcador de la función osteoblástica). La PF-Y también tuvo como resultado una actividad elevada de la fosfatasa alcalina. El antagonismo de PYK2 estimuló la actividad de fosfatasa alcalina, ya sea expresada en unidades por cultivo (panel izquierdo) o en unidades por µg de ADN (panel derecho). Como se muestra en la Figura 3, la incubación de células MSC murinas con dexametasona, un agonista conocido de la función osteoblástica, tuvo como resultado un aumento de los niveles de depósito de calcio (un marcador de la función osteoblástica). La PF-Y también tuvo como resultado un aumento de los niveles de depósito de calcio. El antagonismo de PYK2 estimuló el depósito de calcio, ya sea expresado en µg por cultivo (panel izquierdo) o en g por µg de ADN (panel derecho). EJEMPLO 3 Se cultivaron células troncales mesenquimáticas humanas en DMEM rico en glucosa con 10% de FBS y l-glutamina 10 mM y se sembraron en placas de seis pocilios a una densidad de 3 x 104 células/pocilio. El día después de la siembra, estos cultivos se trataron y analizaron como en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 4, la incubación de células MSC humanas con PF-Y tuvo como resultado un aumento de la actividad de fosfatasa alcalina expresada en unidades por µg de ADN (panel derecho). Como se muestra en la Figura 5, la incubación de células MSC humanas con dexametasona, un agonista conocido de la función osteoblástica, tuvo como resultado un aumento de los niveles de depósito de calcio (un marcador de la función osteoblástica). Cuando se compara con el medio OS solo, la incubación con PF-Y (especialmente las dos dosis menores) también tuvo como resultado un incremento de los niveles de depósito de calcio, ya sea expresado en µg por cultivo (panel izquierdo) o en g por µg de ADN (panel derecho). EJEMPLO 4 Se cultivaron células MC3T3 en medio MEM alfa que contenía 10% de FBS y se sembraron en placas de seis pocilios a una densidad de 5 x 104 células/pocilio. El día después de la siembra, se eliminaron los medios y se añadieron medios OS con dosis crecientes de PF-Y. Los medios se refrescaron cada 3 días. La cantidad de fosfatasa alcalina se midió como en los Ejemplos 2 y 3. Como se muestra en la figura 6, la incubación de células MC3T3 murinas con PF-Y tuvo como resultado un aumento de la actividad de fosfatasa alcalina expresada en unidades por placa (panel izquierdo) o en unidades por µg de ADN (panel derecho). EJEMPLO 5 Células MC3T3 murinas se trataron con fluorato de aluminio (AIF) solo o en presencia de PF-Y 3 mM. Se usaron las células y la cantidad de PYK2 total y de PYK2 fosforilada (P-Y402) se determinó mediante inmunoprecipitación con anticuerpos que reconocen la PYK2 total o la PYK2 fosforilada en la Tyr 402, seguido por SDS-PAGE. Como se muestra en la figura 7, el AIF estimulaba la fosforilación de la tirosina 402 y el PF-Y inhibía la fosforilación inducida por el AIF. EJEMPLO 6 Ensayos con osteoblastos de PYK2KO. Células de médula ósea aisladas de fémures y tibias de ratones hembra C57BI/6 o PYK2 KO se cultivaron con medios solos o con medios complementados con ácido ascórbico 50 µM y ß-glicerofosfato 10 mM (OS) durante 21 días. Los medios se cambiaron cada 3-4 días. La actividad de fosfatasa alcalina se midió el día 7 y el 21. La cantidad de calcio secretado a la matriz extracelular se midió el día 21 y la matriz extracelular se visualizó mediante el procedimiento de von Kossa. Como se muestra en la figura 8 (panel izquierdo), tras 7 días de cultivo en medio sin suplementar ("basal") o en medios OS, se demostró que los osteoblastos deficientes en PYK2 poseían una mayor actividad de fosfatasa alcalina. Como se muestra en la figura 9, el depósito de calcio extracelular se vio considerablemente aumentado en osteoblastos deficientes en PYK2 cultivados en medio OS en comparación con los osteoblastos de tipo salvaje.

Como se muestra en la figura 10, el depósito de calcio extracelular se vio considerablemente aumentado en osteoblastos deficientes en PYK2 cultivados en medio OS en comparación con los osteoblastos de tipo salvaje tal como se visualizó mediante tinción de Von Kossa. EJEMPLO 7 Ratones defectivos en Pvk2: los ratones defectivos en Pyk2 se desarrollaron como se describe en Okigaki y col., PNAS, 100(19): 10740-10745,2003. En ratones hembra defectivos en Pyk2 (n= 7) y compañeras de camada de tipo salvaje (C57BI/6) como controles (n= 5) de 6 meses de edad se inyectó por vía subcutánea tetraciclina (20 mg/kg) en 10 días y calceína (20 mg/kg) en 4 días antes del sacrificio como marcadores óseos fluorescentes para la determinación de la formación ósea. Se llevó a cabo el análisis mediante tomografía micro-computarizada (Scanco micro-CT 40, Scanco Medical AG, Bassersdorf, Suiza) de la metáfisis femoral distal y de la 4a vértebra lumbar, para evaluar el cambio en la masa ósea y las estructuras óseas. Las medidas histomorfométricas estáticas y dinámicas se llevaron a cabo en secciones longitudinales sin descalcificar del 4o cuerpo vertebral lumbar. Además, se evaluó la resistencia ósea usando una prueba de flexión en cuatro puntos en la diáfisis femoral. El análisis mediante tomografía micro-computarizada de la metáfisis femoral distal mostró un incremento significativo en ratones hembra defectivos en Pyk2 en comparación con los controles hembra de la misma camada de tipo salvaje (C57BI/6) a los 6 meses de edad (Figura 11). De igual forma, el análisis mediante tomografía micro-computerizada del 4o cuerpo vertebral lumbar mostró un incremento significativo en ratones hembra defectivos en Pyk2 en comparación con los controles hembra de la misma camada de tipo salvaje (C57BI/6) a los 6 meses de edad, como se observa en la Figura 12, panel derecho. En comparación con los controles hembra de la misma camada de tipo salvaje (C57BI/6), los ratones hembra defectivos en Pyk2 mostraron incrementos estadísticamente significativos en el volumen óseo trabecular, el espesor trabecular y el número de trabéculas (varía de +48% a +206%) y la disminución de la separación trabecular (-67%). Los análisis histomorfométricos dinámicos mostraron que ratones defectivos en Pyk2 poseían una formación ósea significativamente elevada , que incluye incrementos estadísticamente significativos (varía desde +22% a +323%) en el porcentaje de superficie mineralizante (MS/BS), la tasa de aposición mineral (TAM), la tasa de formación ósea-referente superficial (TFO/BS) y la formación ósea-referente de volumen tisular (TFO/TV) en comparación con controles hembra de la misma camada de tipo salvaje (C57BI/6). El panel izquierdo de la Figura 12 ilustra que los ratones defectivos en Pyk2 (inferior) poseían marcadores significativamente más fluorescentes sobre la superficie del hueso, lo que indica un incremento de la mineralización ósea y la formación ósea, en comparación con los controles de la misma camada de tipo salvaje (C57BI/6) (parte superior). Los fémures de ratones defectivos en Pyk2 fueron significativamente más rígidos y requirieron una carga significativamente mayor para romperse en comparación con los controles de la misma camada de tipo salvaje (C57BI/6). En conclusión, estos datos demuestran que una deficiencia en Pyk2 conduce a un incremento en la formación ósea, la masa ósea y la resistencia del hueso. EJEMPLO 8 Se analizó el efecto del tratamiento de un mamífero con un antagonista de PYK2 de Formula I, en concreto la sal diclorhidrato de PF-X. PF-X es un inhibidor de PYK2 con una CI50 de 30,9 nM. Se usó el modelo de ratas ovariectomizadas (OVX). Animales v diseño del estudio: En este estudio se usaron cincuenta ratas hembra Sprague Dawley de 5 meses de edad (Taconic Farms Inc., Germán Town, NY), de un peso aproximado de 330 gramos y a 4,5-5 meses de edad. Los animales se enjaularon a 24°C con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad y se les permitió acceso libre a agua y a una dieta comercializada (Purina laboratory Rodent Chow 5001 , Purina-Mills, San Louis, MO) que contiene 0,95% de calcio, 0,67% de fósforo y 4,5 Ul/g de vitamina D3. Los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados de cuidado y uso de animales por Pfizer y se mantuvo a los animales de acuerdo con la Guía ILAR (Institute of Laboratory Animal Research) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Diez ratas se sometieron a operaciones simuladas y se trataron con sondas orales diarias con vehículo (20% de beta- ciclodextrina, 1 ml/rata), mientras que las ratas restantes (n= 10/grupo) se sometieron a ovariectomía bilateral (OVX) y se trataron mediante sonda oral con vehículo, PF-X a dosis de 10 ó 30 mg/kg/día o 17-ß-etinilestradiol (EE) a 30 µg/kg/d durante 28 días, comenzando 1 día después de la cirugía. Todas las ratas recibieron inyecciones subcutáneas de 10 mg/kg de calceína (Sigma Chemical Co. San Louis, MO), un marcador óseo de fluorocromo, 12 y 2 días antes del sacrificio, con el fin de determinar los cambios dinámicos en los tejidos óseos (Frost HM 1969 Tetracycline-based histologic analysis of bone remodeling. Calcif Tissue Int 3: 211-237). Después de 4 semanas de tratamiento, se pesó a las ratas y se obtuvo la ganancia de peso corporal. A continuación, se procedió a la eutanasia de las ratas mediante punción cardíaca bajo anestesia con ketamina/xilazina. Osteocalcina sérica: El suero se obtuvo mediante extracción de sangre de la cola tras 2 semanas de tratamiento. Los niveles de osteocalcina en suero se determinaron mediante RÍA (Price PA, Nishimoto SK 1980 Radioimmunoassay for the vitamina K-dependent protein of bone and its discovery in plasma. Proc Nati Acad Sci USA 77: 2234-2238). Análisis mediante tomografía computarizada cuantitativa periférica (pQCT): Los fémures escindidos se analizaron con una máquina de rayos X pQCT (Stratec XCT Research M, Norland Medical Systems, Fort Atkinson, Wl) con software versión 5.40. Se tomó una sección transversal de 1 mm de espesor de la metáfisis del fémur 5,00 mm proximal al extremo distal con un tamaño vóxel de 0,10 mm. El hueso cortical se definió y analizó usando el modo de contorno 2 y el modo cortical 4. Se usó un parámetro del umbral externo de 340 mg/cm3 para distinguir la vaina cortical del tejido blando y un umbral interno de 529 mg/cm3 para distinguir el hueso cortical a lo largo de la superficie endocortieal . El hueso trabecular se determinó usando el modo de peladura 4 con un parámetro umbral de 655 mg/cm3 para distinguir el hueso (sub)cortical del esponjoso. Se usó una peladura concéntrica adicional del 1 % del hueso esponjoso definido para garantizar que se ha eliminado el hueso (sub)cortical del análisis. Se determinaron el contenido volumétrico, la densidad y el área tanto para el hueso trabecular como para el cortical. Usando los parámetros anteriores los inventores han determinado que la precisión ex vivo del contenido volumétrico, la densidad y el área de hueso total, trabecular y las regiones corticales variaba desde 0,99% a 3,49% con recolocación (Ke HZ y col., Lasofoxifene, a selective estrogen receptor modulator, prevents bone loss induced by aging and orchidectomy ¡n the adult rat. Endocrinology, 141: 1338-1344, 2000). Histomorfometría del hueso trabecular de la metáfisis de la parte proximal de la tibia (MTP): En la necropsia, se retiró el tercio proximal de la tibia derecha de cada rata, se limpió de tejido blando, se fijó en 70% de etanol, se marcó con tinción ósea de Villanueva, se deshidrató en concentraciones graduales de etanol, se desgrasó en acetona, y se incluyó en metilmetacrilato. Se prepararon secciones longitudinales de la metáfisis tibial proximal con espesores de 4 y 10 µm para histomorfometría como se ha descrito previamente (Barón R, Vignery A, Neff L, Silvergate A, Maria AS 1983 Processing of undecalcified bone specimens for bone histomorphometry. En: Recker RR. Ed. Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Ratón, FL: CRC Press, 13-36. Metodología adicional se comunicó en Jee WSS, Li XJ, Inoue J, Jee KW, Haba T, Ke Hz, Setterberg RB, Ma YF 1997 Histomorphometric assay of the growing long bone. En: Takahashi H., ed. Handbook of Bone Morphology. Nishimusa, Niigata City, Japón, 87-112.). El análisis histomorfométrico del hueso trabecular se llevó a cabo usando un Sistema de Análisis de Imágenes (Osteomeasure, Inc., Atlanta, GA). Se llevaron a cabo medidas histomorfométricas del tejido óseo trabecular de la metáfisis de la parte proximal de la tibia entre 0,5 mm y 3,5 mm distal a la unión epifisaria-placa de crecimiento, y se extendieron a la superficie endocortieal en la dimensión lateral. Las medidas y cálculos relacionados con el volumen y la estructura del hueso trabecular incluyeron el volumen de hueso trabecular (VHT), espesor (Esp. Tb), número (N. Tb.) y separación (Sep. Tb.), mientras que las medidas y cálculos relacionados con la reabsorción ósea incluían la superficie de osteoclastos y el número de osteoclastos. Los parámetros relacionados con la formación ósea incluyeron el porcentaje de superficie mineralizante [(superficie con mareaje doble + 1 superficie con mareaje único )/superficie trabecular total x 100], tasa de aposición mineral, tasa de formación ósea/TV, tasa de formación ósea/BV, tasa de formación ósea/BS. Las definiciones y fórmulas para los cálculos de estos parámetros las han descrito previamente Parfitt y col. (Parfitt AM, Drezner MK, Glorieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR 1987 Bone histomorphometry: Standardization of nomenclature, symbols and units. J Bone Miner Res 2: 595-610). En Jee y col.(Jee WSS, Li XJ, Inoue J, Jee KW, Haba T, Ke Hz, Setterberg RB, Ma YF 1997 Histomorphometric assay of the growing long bone. En: Takahashi H., ed. Handbook of Bone Morphology. Nishimusa, Niigata City, Japón, 87-112.) se describe metodología adicional. Resultados del estudio y análisis: Las ratas OVX tratadas con vehículo aumentaron de forma significativa su peso corporal en comparación con controles simulados. En ratas OVX tratadas con EE se impidió la ganancia de peso inducida por la OVX. No se observaron diferencias significativas en el peso corporal entre ratas OVX tratadas con vehículo o con PF-X a ambas dosis. La osteocalcina sérica, un marcador de formación ósea, aumentó de forma significativa en ratas OVX tratadas con PF-X, mientras que disminuyó significativamente en ratas OVX tratadas con EE en comparación con las ratas OVX tratadas con vehículo a las 2 semanas después del tratamiento. Estos datos indican que el EE disminuyó la formación ósea, mientras que el inhibidor de PYK2 la incrementó, en un modelo con ratas OVX de osteoporosis humana. El análisis PQCT de metáfisis femoral distal mostró que habían incrementos significativos en el contenido mineral óseo total, la densidad mineral ósea total, el área ósea total, la densidad ósea trabecular y el contenido de hueso cortical en ratas OVX tratadas con 10 ó 30 mg/kg/día de PF-X en comparación con ratas OVX tratadas con vehículo, lo que indica que un inhibidor de PYK2 aumenta el hueso trabecular y cortical en un modelo de ratas OVX. Las ratas OVX tratadas con EE poseían mayor contenido mineral óseo total, mayor densidad mineral ósea total y mayor contenido óseo cortical en comparación con las ratas OVX tratadas con vehículo. Los análisis histomorfométricos del hueso trabecular de la metáfisis de la parte proximal de la tibia mostraron que había un incremento significativo del volumen de hueso trabecular, el espesor trabecular, la tasa de aposición mineral, el porcentaje de superficie mineralizante, la tasa de formación ósea BV y la tasa de formación ósea TV, y una disminución significativa de la superficie osteoclástica y del número de osteoclastos en ratas OVX tratadas con 30 mg/kg/día de PF-X en comparación con las ratas OVX tratadas con vehículo. Estos datos indican que un inhibidor de PYK2 incrementa la masa ósea mediante una combinación de un aumento del número de osteoblastos y de la actividad osteoblástica. Por el contrario, el tratamiento con EE en ratas OVX disminuye la tasa de aposición mineral, el porcentaje de superficie mineralizante, la tasa de formación ósea/BV y la tasa de formación ósea/TV, la superficie osteoclástica y el número de osteoclastos. Estos datos demuestran que el PF-X, un inhibidor de PYK2, estimula la función y el número de los osteoblastos, EJEMPLO 9 El ADNc de longitud completa de la PYK2 humana se clonó en el pGENE que contiene una marca del epítope V5-His (Invitrogen). Este plásmido se transfectó en la línea de células inductoras NIH 3T3 (Invitrogen) y se seleccionaron las líneas clónales en el medio de selección adecuado y se aislaron usando cilindros de clonación. Los clones se analizaron para detectar la expresión inducible del gen de PYK2 usando lisados celulares y la técnica de bandas de transferencia Western y la detección con anticuerpos marcados antiPYK2 o anti epítope V5. Se analizó el PF-X para determinar la inhibición de PYK2 del siguiente modo: la línea clonal PYK GeneSwitch seleccionada se cultivó en placas con medio de crecimiento (DMEM rico en glucosa suplementado con 10% de suero de ternero, 1 x glutamina, 50 µg/ml de higromicina, 150 µg/ml de zeocina (todos los productos del cultivo celular se obtienen de Invitrogen) en placas Biocoat® recubiertas con colágeno (Becton-Dickinson, n° catálogo 359132). Al día siguiente se cambió el medio a uno sin suero. Al día siguiente, se indujo la expresión de pyk2 con una concentración final de mifepristona 10 nM (RU486). Después de un periodo de inducción de 4 horas, se añadió el compuesto de prueba o el vehículo a los pocilios adecuados. Después de un periodo de tratamiento de una hora, las células se fijaron mediante el reemplazo del medio con formaldehído recientemente diluido en PBS (1:10 de solución al 37%) durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación se procedió a la permeabilización de las células con 4 lavados de 100 µl (5 minutos cada uno, en agitación rotatoria) de Tritón X-100 al 0,1% en PBS a temperatura ambiente. La unión inespecífica se impidió mediante el bloqueo durante la noche a 4°C con 100 µl de tampón de bloqueo Odyssey (licor.com, n° catálogo 927-40000). Al día siguiente se añadió anticuerpo primario (pyk2 fosfo-Y402, Biosource, n° catálogo 44-618G) a 1 :200 en tampón de bloqueo Odyssey durante 2 horas con agitación rotatoria a temperatura ambiente. Como alternativa, en función del tipo celular, se pueden sustituir los anticuerpos por otros fosfosustratos de PYK2 (por ejemplo, cortactin fosfo-Y421, Sigma C0739; paxilin fosfo-Y31 Sigma P6368). Después de 4 lavados de 5 minutos con Tween 20 PBS, 0,1%, se añadió el anticuerpo secundario anticonejo conjugado con Pigmento IR 800 (Rockiand, n° catálogo 611-132-122) durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación rotatoria. Después del mismo régimen de lavado las placas se transfirieron en seco y se exploraron en el instrumento LICOR. Para determinar la CI50, la señal relativa del grupo tratado con PF-X se comparó con la del vehículo usando software de ajuste de curvas (por ejemplo, GraphPad Prism, regresión lineal con pendiente variable). Con este procedimiento se descubrió que el PF-X poseía una CI50 de aproximadamente 136 nM.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para estimular la función osteoblástica en un mamífero, que comprende administrar un inhibidor de PYK2 a un mamífero que lo necesita en una cantidad eficaz para estimular una función osteoblástica.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que el inhibidor de PYK2 es un compuesto trífluorometilpirimidina.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que el inhibidor de PYK2 es un compuesto 5-aminooxindol.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que el inhibidor de PYK2 es un compuesto terciario de aminopirimidina.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que el inhibidor de PYK2 es el compuesto de fórmula PF-X.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que el inhibidor de PYK2 es el compuesto de fórmula PF-Y.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el inhibidor de PYK2 es un inhibidor selectivo de PYK2. 0
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el inhibidor de PYK2 es un inhibidor de FAK.
9. El procedimiento de la reivindicación 1 , en el que el inhibidor de PYK2 5 es un inhibidor de Flk.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el inhibidor de PYK2 es un inhibidor directo de PYK2. 0
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el mamífero presenta osteoporosis, osteopenia, fractura ósea, osteomalacia, raquitismo, fibrogénesis ósea imperfecta o una densidad ósea baja, o presenta riesgo de los mismos. e
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el mamífero tiene pérdida ósea idiopática de la infancia o pérdida ósea por periodontitis.
13. El procedimiento de la reivindicación 11 , en el que la osteoporosis es osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis inducida por heparina, osteoporosis posmenopáusica, osteoporosis por deficiencia de vitamina D u osteoporosis inducida por inmunosupresión.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el mamífero es un ser humano.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la función osteoblástica es producción de osteoides, mineralización, producción de osteopontina, producción de osteonectina, acumulación de calcio extracelular o curación del hueso.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el mamífero necesita curación ósea.
17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el mamífero necesita curación ósea tras una reconstrucción facial, una reconstrucción maxilar, una reconstrucción mandibular, sinostosis vertebral, un injerto óseo, osteotomía o un implante de prótesis.
18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende la administración de una cantidad de un segundo agente terapéutico óseo.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el segundo agente terapéutico óseo es un agente anabolizante óseo, un agente anti reabsorción o un agente antirreabsortivo anabolizante.
20. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el segundo agente terapéutico óseo es (-)-cis-6-fenil-5-(4-(2-pirrolidin-1-il-etoxi)-fenil)-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-2-ol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
21. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el segundo agente terapéutico óseo es un agonista selectivo del receptor de PGE2 EP2.