MXPA06013287A - Promocion de la embriogenesis somatica en plantas mediante la expresion del gene de pga37. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con metodos para la promocion de embriogenesis somatica a partir de una celula de una planta, tejido, organo, callo o cultivo celular, mediante la sobre expresion de un gene de PGA37 en el tejido u organo, dicha sobre expresion puede ser utilizada como un marcador silencioso y susceptible de seleccion para plantas transgenicas. En otra modalidad, dicha expresion puede ser utilizada para conferir apomixis a una planta. En otra modalidad, dicha sobre expresion puede ser empleada para crear plantas haploides, las cuales pueden ser utilizadas para producir plantas diploides.

Description

PROMOCIÓN DE LA EMBRIOGENESIS SOMÁTICA EN PLANTAS MEDIANTE LA EXPRESIÓN DEL GENE PGA37 Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para promover la embriogénesis somática a partir de células, tejidos, órganos, callo o cultivos celulares de plantas, mediante la sobre expresión del gene PGA37 en el tejido u órgano.

Antecedentes de la Invención La embriogénesis somática es una única vía para la clonación somática o de propagación asexual en plantas. El proceso de desarrollo de la embriogénesis somática comparte similitud importante con la embriogénesis cigótica (Zimmerman, 1993; Mordhorst et al., 1997) y esto es probable debido a la conservación en los mecanismos molecular y celular de apuntalamiento entre los dos procesos. Por lo tanto, la embriogénesis somática provee un sistema de modelo atractivo para el estudio de la embriogénesis cigótica, particularmente debido a que los embriones cigóticos están encapsulados por tejidos maternales y es difícil tener acceso a ellos mediante herramientas bioquímicas y moleculares. Más aún, en aplicaciones de biotecnología, las plantas de cultivos económicamente más importantes, así como las plantas de no cultivo son regeneradas a través de la embriogénesis somática. En contraste a la organogénesis, la cual requiere de una elevada proporción de citoquinina a auxina (Skoog and Millar, 1957; Sugiyama, 1999; Sugiyama, 2000), la embriogénesis somática no requiere de ningunas citoquininas externas, sino más bien es dependiente de altas concentraciones de 2,4-D (Zimmerman, 1993; Mordhorst et al., 1997; Sugiyama, 2000), un producto químico sintético que se ha utilizado por largo tiempo como un análogo funcional de la auxina. Se cree de manera general que la embriogénesis somática es mediada por una cascada de señalización disparada por auxina externa o 2,4-D (Zimmerman, 1993; Mordhorst et al., 1997; Schmidt et al., 1997). Sin embargo, poco se sabe acerca de la ruta de transducción de la señal, particularmente el mecanismo molecular involucrado en la transición de una célula vegetativa a una célula embriogénica competente.

Durante las dos últimas décadas, se han hecho esfuerzos considerables para identificar genes con patrones de expresión alterados durante la embriogénesis somática (Schmidt et al, 1997; Lin et al., 1996; Thomas, 1993). La mayoría de estos genes, sin embargo, son sobre regulados solo en etapas de desarrollo tardío, sugiriendo que ellos no juegan un papel directo en la transición vegetativa a embriogénica. Hasta ahora, la única excepción es el gene de Kinase Similar a Receptor de Embriogénesis Somática [Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase (SERK)] cuya expresión parece marcar la transición vegetativa a embriogénica; sin embargo, aún es poco clara su función (Schmidt et al., 1997). Se intentó un planteamiento molecular adicional mediante la manipulación de ciertos genes específicos de embrión. El gene Arabidopsis Lea y Cotyledon 1 (LECJ), que codifica para una subunidad del complejo del factor de transcripción heterotrimérico de HAP (HAP3), ha sido propuesto como un regulador clave para identidad embriónica (Lotan et al., 1998). Las mutaciones en el sitio de LEC1 resultan en maduración defectuosa del embrión así como también en la conversión de cotiledones en estructuras similares a hojas verdaderas (Lotan et al., 1998; Meinke, 1992; Meinke et al., 1994). La sobre expresión constitutiva de LEC1 conduce a crecimiento y desarrollo de plantas severamente anormales con formación ocasional de estructuras similares a embriones somáticos (Lotan et al, 1998). El destino del desarrollo de estas estructuras similares a embriones, sin embargo, permanece sin conocerse debido a lo letal de la sobre expresión del LEC1. Otro gene de LEC, LEAFY COTYLEDON2 (LEC2), codifica para un factor de transcripción de dominio de B3 que actúa principalmente en semillas en desarrollo. La expresión post-embriónica ectópica del LEC2 en plantas transgénicas induce la formación de estructuras similares a embriones somáticos y otras estructuras similares a órganos y con frecuencia confiere características embriónicas a las plántulas (Stone et al., 2001). El gene Brassica napus BABY BOOM (BBM) codifica para un miembro de la familia del factor de transcripción AP2/ERF, el cual preferiblemente es expresado durante el desarrollo de embriones y simientes (Boutilier et al., 2002). La expresión ectópica del BBM en Arabidopsis y Brassica conduce a la formación de estructuras similares a cotiledón y estructuras similares a embrión somático en plántulas (Boutiler et al., 2002).

Debe señalarse que en la totalidad de estos casos, no se sabe si las estructuras similares a embrión somático pueden germinar en plantas fértiles. Empleando un novedoso sistema de etiquetado de activación susceptible de ser inducido por productos químicos Zuo et al (2002) identificaron el gene PGA6, el cual puede promover la transición vegetativa a embriónica en raíces de Arabidopsis y otros órganos. El análisis de secuencia de ADN del gene PAG6 lo identificó como correspondiente al gene WUSCHEL (WUS) (Endirzzi et al, 1996; Laux et al, 1996; Mayer et al, 1998). De manera importante embriones somáticos formados mediante la sobre expresión de WUSIPGA6 pueden germinar en plantas fértiles con el retiro del inductor (Zuo et al, 2002). Las publicaciones y otros materiales que aquí se utilizan para ilustrar los antecedentes de la invención y, en particular, los casos para proporcionar detalles adicionales respecto a la práctica, se incorporan a la presente por referencia y, por conveniencia, son referidos por autor y fecha en el texto y se agrupan respectivamente en la bibliografía que se adjunta.

Compendio de la Invención Un aspecto de la presente invención consiste en un método para promover la embriogénesis somática en una célula, tejido, órgano, callo o cultivo celular de una planta, método el cual comprende la sobre expresión de un gene PGA37 en dicho tejido u órgano.

Un segundo aspecto de la invención consiste en un método para generar embriones de plantas somáticos, en done el método comprende la sobre expresión de un gene PGA37 en una célula, tejido, órgano, callo o cultivo celular de una planta. Otro aspecto de la invención consiste en un método para la generación de brotes a partir de una célula, tejido, órgano, callo o cultivo celular de una planta, método el cual comprende la sobre expresión del gene PGA37 en dicho tejido u órgano. Todavía otro aspecto de la invención consiste en un método para la selección de plantas transformadas con un vector que comprende un marcador seleccionable silencioso en donde el marcador es un gene PGA37. Otro objeto de la invención es un método para producir una línea de plantas apomíticas.

Otro objeto de la invención consiste en un método para la producción de plantas haploides. Otro objeto de la invención consiste en un método para la producción de frutos sin semilla.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama esquemático del vector pER16 de marcado de activación de XVE. Las Figuras 2A-2F ilustran el fenotipo mutante de ganancia de función de pga37. Explantes de raíz derivados de plántulas depga37 fueron cultivados en SCM (SCM menos 17-ß-estradiol; SCM-) durante 2 semanas (Figura 2 A) o en SCM inductivo (SCM más 17-ß-estradiol; SCM+) durante 2 semanas (Figura 2B). Notar el callo similar a embrión somático en la Figura 2B. La Figura 2C muestra que cultivos de cuatro semanas de edad de explantes de raíz de pga37 en SCM+ regeneraron embriones somáticos. La Figura 2D muestra una vista amplificada de embriones somáticos de la Figura 2C. La Figura 2E muestra que embriones somáticos fueron capaces de germinar en un medio sin el inductor de 17-ß-estradiol. L Figura 2F muestra que plántulas derivadas de embriones somáticos fueron fértiles y capaces de crecer hasta su madurez en suelo y dieron semillas. La Figura 3 muestra un análisis genético del mutante inducible que mostró que el fenotipo de mutante dependiente de 17-ß-estradiol y fenotipo de WT fueron segregados en una proporción de 3: 1, indicando que la mutación inducible fue dominante en un único locus genético. Este resultado sugiere la presencia de una copia del inserto de ADN-T en el mutante depga37. La Figura 4 muestra el sitio de inserción del ADN-T a los 7,785 pares de bases corriente arriba del codón de inicio de traducción putativo del gene MYP118 (At3g27785.1). La Figura 5 A muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de pga37 (SEQ ID NO: 1). La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína del pga37 (SEQ ID NO:2).

La Figura 6 muestra un análisis Northern blot que demuestra que el marco de lectura abierto que codifica para la proteína de unión de ADN similar a MYB fue expresada solo en la presencia de inductor. Las Figuras 7A-7D muestran que la sobre expresión del gene MYB118 es responsable para el fenotipo de pga37. La Figura 7A muestra transformación de raíz en medio SCM-. La Figura 7B muestra transformación de raíz en medio SCM+. La Figura 7C muestra una vista amplificada de transformantes que muestran la estructura de embriones somáticos. La Figura 7D muestra que embriones somáticos fueron transferidos a medio MS sin medio de inductor. Las Figuras 8A-8B muestran que explantes de raíz de pERlO/PGA37 colocados en medio SCM+ fueron capaces de generar embriones somáticos. La Figura 8A muestra el cultivo de raíces de plantas T2 transgénicas de pER10/PG O7 en medio SCM-. La Figura 8B muestra raíces de plantas T2 transgénicas de pER\0/PGA37 cultivadas en medio SCM+. Las Figuras 9A-9B muestran que un mutante knock-out de PGA37 es defectuoso en el desarrollo del embrión. La Figura 9A muestra que un mutante knock-out de PGA37 detuvo el desarrollo del embrión en una etapa muy temprana del desarrollo del embrión. La Figura 9B muestra que líneas transgénicas de ARNi de PGA37 mostraban el mismo fenotipo mortal de embrión que el mutante knock-out de PGA37. La Figura 10 muestra que el ADN-T del mutante SALK_111812 fue insertado a los 819 pares de bases corriente debajo de codón de inicio de traducción putativa del gene MYB 118. Estas cajas abiertas representan exones y las cajas negras representan intrones. La Figura 11 muestra que el PGA37 fue capaz de activar la expresión de LEC2.

Descripción Detallada de la Invención Las siguientes definiciones se utilizan en la presente. "Célula de planta" es la unidad estructural y fisiológica de plantas, que consiste en un protoplasma y la pared celular. "Tejido de planta" es un grupo de células de planta organizadas en una unidad estructural y funcional. "Órgano de planta" es una colección de tejidos que realizan una función particular o conjunto de funciones en el cuerpo de una planta. La hoja, tallo y raíz son tres órganos que se encuentran en muchas plantas. Los órganos están compuestos por tejidos. "Callo de planta" es un agrupamiento de células de planta no diferenciadas que tienen la capacidad de regenerar una planta completa en algunas especies. "Cultivo de suspensión de célula de planta" es un procedimiento artificial de crecimiento de células de plantas. Se aislan células de un callo inducido en explantes de tejido de partes específicas de una planta y son cultivadas en un medio líquido. "Cultivo de células de planta" es una descripción genérica que involucra protoplasma de planta, célula de planta, tejido de planta, órgano de planta y cultivo de planta, en donde estos varios tipos de cultivo involucran, como un factor común, el crecimiento de material de planta libre de microorganismos en un medio ambiente aséptico (estéril), tal como medio nutriente esterilizado. "Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo huésped, incluyendo tanto genomas nuclear como de organelo, resultando en herencia genéticamente estable. En contraste, "transformación transitoria" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u organelo que contiene ADN, de un organismo huésped resultando en expresión genética sin herencia estable o integración. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transferido son referidos como organismos "transgénicos" o "transformados." Un "transgene" es un constructo de ADN recombinante que ha sido introducido en un genoma mediante un procedimiento de transformación. El término "recombinante" significa, por ejemplo, que se hace una secuencia de ácido nucleico mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de alguna otra manera, por ejemplo, mediante síntesis química o por manipulación de los ácidos nucleicos aislados mediante técnicas de ingeniería genética. Un "constructo de ADN recombinante" comprende un polinucleótido aislado ñmcionalmente ligado a cuando menos una secuencia reguladora. El término también abarca un polinucleótido aislado que comprende una región de codificación de todo o una parte de un ARN funcional y cuando menos una de las secuencia reguladoras que ocurren de manera natural que dirigen la expresión en la fuente (por ejemplo, organismo) a partir de la cual el polinucleótido fue aislado. Para diseccionar la vía de señalización durante la embriogénesis somática, nosotros hemos empleado un planteamiento genético para identificar mutaciones de ganancia de función que puedan promover la formación de callo embriogénico a partir de explantes de raíz de Arabidopsis. Se sabe que la Arabidopsis thaliana es una especie difícil para la embriogénesis somática. Hasta ahora, los callos embriogénicos solo son inducidos a partir de embriones inmaduros de plantas de tipo silvestre (WT) o a partir de la planta mutante de primordia timing (pt) (Wu et al, 1992; Mordhorst et al, 1998; y referencia que allí se citan). Por lo tanto, los explantes vegetativos de Arabidopsis parecen ser materiales confiables para el tamizado de mutaciones genéticas involucradas en la transición vegetativa a embriónica. Nosotros hemos descrito aquí la identificación del gene de Plant Growth Activator 37 (PGA37) mediante un novedoso tamizado genético dirigido a dilucidar el mecanismo molecular de la embriogénesis somática. Una mutación de ganancia de función susceptible de ser inducida en este locus causa una transición rápida desde células vegetativas o somáticas a embrionarias, conduciendo al desarrollo de embrión somático a partir de varios tejidos y órganos. En la presencia de inductor, la sobre expresión del PGA37 promueve la formación de embriones somáticos a partir de tejidos vegetativos. Con el retiro del inductor, estos embriones somáticos son capaces de germinar y crecer en plantas saludables y fértiles. Más aún, la pérdida de función del PGA37 es una línea de inserción de ADN-T y la reducción de función del PGA37 en plantas de PGA37RNAÍ transgénicas conducen a un bloqueo en el desarrollo del embrión cigótico. Conjuntamente, estos resultados proveen evidencia de que el PGA37 está involucrado en la conservación de la identidad celular embrionaria y es crítico y necesario para el desarrollo del embrión. Se encontró que el PGA37 es idéntico al gene de MYB118 (At3g27785.1), un factor de transcripción putativo (Stracke et al, 2001). Las secuencias de ácido nucleico y proteína del MYB118 son aquellas que se muestran por los números de acceso de Gen Bank AY550306, AF334817 y NM_113694. Nuestros resultados revelan la función del MYB118/PGA37 durante la embriogénesis, y también abren un nuevo camino en aplicaciones biotecnológicas.

Wu et al, (1992) previamente reportaron la generación de embriones somáticos a partir de embriones cigóticos de Arabidopsis con una muy baja eficiencia, la cual involucraba múltiples y tediosos tratamientos de hormonas y subcultivos. Nuestro hallazgo de que la simple manipulación de un único gene (MYB 118) era capaz de generar embriones somáticos con una muy alta frecuencia constituye un avance importante en la biotecnología de las plantas. Nuestra observación de que el MYB118 es capaz de promover la transición vegetativa a embriónica y eventualmente la formación de embrión somático descubre una función crítica de este factor de transcripción durante la embriogénesis. Recientemente, se reportó que el Leajy cotyledon 2 (LEC2) codifica para un factor de transcripción que contiene un único dominio de B3 para varios otros factores de transcripción de plantas incluyendo ABI3/VP1 y FUS3. La sobre expresión del LEC2 conduce a la formación de embriones somáticos así como también a la formación d callo, estructuras similares a cotiledón y estructuras similares a hoja. El gene de LEC2 es un regulador embriónico central que juega un papel crítico tanto en la embriogénesis temprana como en la embriogénesis tardía (Stone et al, 2001). Como se muestra en los ejemplos que se presentan más adelante, el PGA37 fue capaz de activar la expresión del LEC2. En otra modalidad de la invención, la embriogénesis es inducida en células haploides, tales como células de polen, para producir plantas haploides. Esto puede ser logrado mediante la transformación estable de una célula de planta o tejido de planta con un gene de MYB 118 bajo el control de un promotor específico de tejido que es activo en una célula o tejido haploide, y expresando el gene de MYB 118 allí, o introduciendo el gene de MYB118 dentro de la célula o tejido de una planta o bajo el control de un promotor susceptible de ser inducido y aplicando el inductor para causar allí la expresión del gene de MYB118. En una modalidad preferida, el gene de MYB118 está bajo el control de un promotor que tanto específico de tejido haploide como susceptible de ser inducido. En una modalidad preferida, se utiliza un promotor que es tanto susceptible de ser inducido como específico de tejido, dando mayor control sobre el proceso. En una modalidad que todavía se prefiere más, se utiliza un gene de MYB118 ligado a un promotor específico de polen y susceptible de ser inducido para inducir la embriogénesis somática en células de polen. La expresión del gene en el tejido o célula haploide (por ejemplo, mediante la aplicación del inductor específico para el promotor susceptible de inducción) resulta en la formación de embriones somáticos haploides que pueden ser hechos crecer en plantas haploides utilizando técnicas estándar. Cuando se utiliza un promotor susceptible de ser inducido (sea que sea o no específico de tejido), un método preferido comprende la exposición de tejido transgénico extirpado que contiene células haploides (por ejemplo, polen u óvulos) al inductor específico para el promotor susceptible de ser inducido durante un tiempo suficiente para inducir la formación de un embrión somático, retirando el inductor, y haciendo crecer el embrión somático en una planta haploide transgénica en la ausencia del inductor. La diploidización de las plantas haploides para formar dihaploides, ya sea de manera espontánea o mediante tratamiento con el producto químico adecuado (por ejemplo, colquicina) hará expedito de manera importante el proceso de obtención de plantas homocigóticas en comparación con un método de segregación genética convencional. Esta tecnología no solo será benéfica para propósitos de reproducción sino también para investigación básica tal como estudios de mutagénesis y otras estudios genéticos, debido a que los dihaploides son homocigóticos verdaderos al nivel del ADN, conteniendo dos copias idénticas de cada gene. Adicionalmente, los genes de MYB118 serán útiles para la inducción de apomixis en plantas. La apomixis y métodos para conferir la apomixis en plantas se describen en varias patentes (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de América Nos. 5,710,367; 5,811,636; 6,028,185; 6,229,064; y 6,239,327, así como también el documento WO 00/24914, las cuales se incorporan a la presente mediante referencias). La reproducción en plantas normalmente se clasifica como sexual y asexual. El término apomixis se acepta de manera general como el reemplazo de la reproducción sexual por varias formas de reproducción asexual (Rieger et al, 1976). En general la iniciación de la proliferación celular en los embriones y endospermo está desacoplada de la fertilización. La apomixis es un método genéticamente controlado de reproducciones en plantas en donde el embrión se forma sin la unión de un óvulo y un esperma. Existen tres tipos básicos de reproducción apomítica: 1) desarrollos de embrión aposporia a partir de óvulo cromosómicamente no reducido en un saco de embrión derivado de una célula somática en el núcleo, 2) desarrollos de embrión diposporia a partir de un óvulo no reducido en un saco de embrión a partir de célula madre de macrospora, y 3) desarrollos embrión-embriónico adventicio directamente a partir de una célula somática. En la mayoría de las formas de la apomixis, es necesaria la seudogamia o fertilización de los núcleos polares para producir endospermo para la viabilidad de la semilla. Estos tipos de apomixis tienen potencial económico debido a que pueden hacer que cualquier genotipo, independientemente de cómo es heterocigoto, verdaderamente se reproduzcan. Es un proceso reproductivo que se desvía de la singamia y meiosis femenina para producir embriones genéticamente idénticos al progenitor maternal. Con la reproducción apomítica, la progenie de genotipos especialmente adaptativos o híbridos mantendría su fidelidad genética a lo largo de ciclos de vida repetidos. Además de fijar vigor híbrido, la apomixis puede hacer posible la producción comercial de híbridos en cultivos en donde no se conocen o se han desarrollado sistemas eficientes de esterilidad masculina o de restablecimiento de la fertilidad para la producción de híbridos. La apomixis puede hacer que sea más eficiente el desarrollo de híbridos. También simplifica la producción de híbridos y aumenta la diversidad genética de especies de plantas con buena esterilidad masculina. Sería ideal encontrar genes que controlen la apomixis obligatoria o un alto nivel de apomixis en las especies cultivadas y que sean capaces de hibridar fácilmente genotipos compatibles de cruce sexual por apomítico para producir híbridos Fl de reproducción verdadera. En la realidad, la mayoría de los genes deseables que controlan la apomixis se encuentran en las especies silvestres que están relacionadas de manera distante con las especies cultivadas. Si bien pueden ser posibles cruces ínter específicos entre las especies cultivadas y las silvestres, el apareamiento de cromosomas entre genomas usualmente es bajo o inexistente. Si bien la apomixis es efectivamente utilizada en Cítricos para producir rizoma uniforme y libre de enfermedad y de virus (Parlevliet et al, 1959) y en buffelgrass (Bashaw, 1990) y Poa (Pepin et al, 1971) para producir cultivos mejorados, no se ha transferido de manera exitosa a una planta de cultivo cultivada. La transferencia de apomixis a cultivos importantes haría posible el desarrollo de híbridos de reproducción verdaderos y la producción comercial de híbridos sin la necesidad de procesos de producción laboriosos, con esterilidad masculina nuclear citoplásmica y altos costos. Un híbrido Fl apomítico obligatorio se reproduciría verdaderamente a través de la semilla de manera indefinida y podría ser considerado un método de reproducción vegetativo o clonal a través de la semilla. El desarrollo de cultivos cultivados que se reproduzcan apomíticamente también proveería una contribución importante a la seguridad alimentaria en naciones en desarrollo (Wilson et al, 1992). Un aspecto adicional de la presente invención consiste en la provisión de frutos sin semilla. Los frutos sin semilla son reproducidos dejando fuera o inhibiendo la función del PGA37. Las plantas transgénicas con la función del PGA37 suprimida no producen semillas, sino que producen frutos que se desarrollarán en frutos sin semilla. Los métodos de interferencia con la función del gene en una planta transgénica incluye la introducción de un gen sintético que causa supresión de sentido o antisentido del gene objetivo (Taylor and Jorgenses, 1992). Los métodos de supresión requieren de similitud substancial entre el gen objetivo y el gen de supresión, de más del 80% de identidad de secuencia de nucleótidos (Mol et al, 1995). Un método adicional de interferencia con la función del gene en una planta transgénica es el uso de ribozimas. La expresión de ribozimas en células de plantas se describió, por ejemplo, por Feyter et al, (1996). Un método adicional para la interferencia con la función del gene en una planta transgénica es el uso de ARN de interferencia (RNAi). Para la descripción de una supresión de gene de RNAi en plantas por transcripción, ver la patente de los Estados Unidos de América no. 6,506,559, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos de América no. 2002/0168707 Al y las publicaciones de solicitudes de patente internacionales nos. WO 98/53083, WO 99/53050 y WO 99/61631. La presente invención se detalla adicionalmente en los siguientes ejemplos, los cuales se ofrecen a manera de ilustración y no se tiene la intención de que limiten la invención de ninguna manera. Se utilizan técnicas estándar que se conocen bien en la materia o las técnicas que se describen de manera específica más adelante.

Ejemplo 1 Materiales de Plantas. Condiciones de Crecimiento y Transformación de Planta Se utilizaron los ecotipos Wassilewskija, Columbia y landsberg de A. thaliana. Se hicieron crecer plantas bajo luz blanca continua a 22 °C y medio A sólido (I X sales MS (Murashige and Skoog, 1962), 3% de sacarosa, 0.8% de agar) complementado con antibióticos apropiados y/o el inductor 17-ß-estradiol (10 uM). La transformación in planta de plantas de Arabidopsis (el ecotipo Columbia) se llevó a cabo como se describe por Bechtold et al, (1993). La transformación de explantes de raíz se llevó a cabo de acuerdo con Koncz et al, (1989).

Ejemplo 2 Manipulaciones Moleculares Se realizaron manipulaciones moleculares como se manifestó de manera específica o mediante métodos como los mostrados por Sambrook et al, (1989). El vector de expresión pERlO susceptible de inducción de XVE es idéntico al pER8 (Zuo et al, 2000a) excepto en que el marcador seleccionable de higromicina del pER8 fue reemplazado con marcador seleccionable de canamicin. Para construir el vector de mutagénesis pER16, se digirió pERlO con Spely Asp718I seguido por reacción de relleno de enzima de Klenow y religado. El vector de pER16 resultante carecía de la secuencia de adición polyA rbcsS3A del cartucho de expresión oLexA-46:: A (Zuo et al, (2000a)). El pER16 se muestra en la Figura 1. Solo se ve la región entre el Borde Derecho (Right Border [RB]) y el Borde Izquierdo [Left Border[] (pero no a escala). Dos unidades de transcripción y el promotor de 0LexA-46 se ubican entre el RB y el LB. En la primera unidad de transcripción, el promotor de G 10-90 (Ishige et al, 1999) impulsa el gen de fusión de XVE terminado por la secuencia de adición polyA de rbcs E9. La segunda unidad de transcripción consiste en el promotor del gene Nopaline Synthase (NOS), la secuencia de codificación del gene de Neomycin Phosphotransferase II (NPT II) y la secuencia de poliadenilación de NOS. El promotor de 0LexA-46 consiste en 8 copias de la secuencia operadora de LexA fusionada al promotor de -46 CaMV35S. A la integración dentro del genoma de la planta, el promotor de 0LexA-46 puede activar la transcripción de secuencias fusionadas corriente abajo del promotor en una forma que depende del 17-ß-estradiol. Las secuencias genómicas marcadas con pER16 se recuperaron mediante PCR-Tail (Liu et al, 1995), y los fragmentos de PCR purificados se sometieron directamente al análisis de secuenciación de ADN. Se amplificó el ADNc del PGA37 a partir de ARN total extraído de plántulas de pga37 cultivadas en medio MS con 17-ß-estradiol (10 uM) mediante RT-PCR, usando los cebadores MYB118\]p (5'-AATAGGCGCGCCATGGAGTTCGAGTCAGTGTTCA-3'; SEQ ID NO:3) y MYB118Low (5'- AATAACTAGTCTAAAGACGACCATGAGCAATCA-30; SEQ ID NO:4). El fragmento de PCR de 1,336 pares de bases de largo, incluyendo la región completa de codificación de la proteína, se cortó con Ascl (sitio en cebador de MYB118Up) y Spel (sitio en cebador de MYB118Lov/) para clonación en los sitios correspondientes del vector pERlO (Zuo et al, 2000). La secuencia correcta del ADNc de MYB118 fue confirmada mediante análisis de secuenciamiento de ADN. Se llevaron a cabo análisis Northern blot de ARN como se describió previamente (Zuo et al, 2000a; Zuo et al, 2001).

Ejemplo 3 Tamizaje de Mutantes de pga Se sabe que los explantes derivados de tejidos vegetativos de Arabidopsis son incapaces de formar embriones somáticos o callo embriogénico promovido mediante hormonas de planta externas. Nosotros suponemos que las hormonas externas solas eran incapaces de activar reguladores clave de la Arabidopsis necesarios para la transición vegetativa a embriogénesis. Con tratamientos apropiados de hormonas, las mutaciones de ganancia de función en estos genes reguladores pueden activar la transición vegetativa a embriogénica. Dichas mutaciones de ganancia de función, por la otra parte, también pueden causar defectos severos durante el desarrollo y crecimiento subsiguiente de la planta. Por lo tanto, si la expresión del gene mutado y/o la actividad biológica de productos de gene relacionados no es controlada de manera apropiada, será difícil mantener las mutaciones identificadas. Un ejemplo es la sobre expresión constitutiva del gene de LEC1 (Lotan et al, 1998). Como consecuencia, nosotros llevamos a cabo el tamizaje utilizando un sistema de XVE susceptible de ser inducido por productos químicos, que se desarrolló previamente, el cual se ha demostrado que es controlado de manera astringente y que es altamente sensible al inductor 17-ß-estradiol, una hormona mamífera sin efectos fisiológicos aparentes en el crecimiento y desarrollo de la planta (Zuo et al, 2000a). El uso de un promotor susceptible de inducción nos permite de esta manera recuperar plantas mutantes normales mediante el retiro del inductor, aún en el caso en que la mutación de ganancia de función sea letal.

Para identificar mutantes de ganancia de función relacionados con la vía de la embriogénesis, nosotros llevamos a cabo un tamizaje funcional usando un sistema de marcado de activación susceptible de inducción mediante 17-ß-estradiol (Zuo et al, 2000a). En este tamizaje, se utilizaron células AB1 de Agrobacterium tumefactions que portaban el vector pER16 (sensible al inductor de 17-ß-estradiol; Figura 1) para transformar explantes de raíz de Wassilewskija de tipo silvestre de Arabidopsis thaliana de acuerdo con Koncz et al., (1989). Se cultivaron explantes de raíz infectados en un medio de tamizaje con inductor (SCM+), el cual contenía sales de MS 4.3 g/l, 0.15 mg/l de ácido indol-3-acético, 50 mg/l de canamicin, 10 g/l de sacarosa, y 10 µM de 17-ß-estradiol sin ninguna citoquinina. Los explantes de raíz WT no fueron capaces de generar embrión somático ni retoños en el medio SCM+. Sin embargo, una mutación de ganancia de función susceptible de inducción mediante 17-ß-estradiol puede activar la ruta de la embriogénesis para generar embrión somático; alternativamente, una mutación de ganancia de función susceptible de inducción puede activar la señalización de citoquinina para generar retoños. En un tamizaje a gran escala, nosotros hemos recuperado sobre 40 mutantes putativos, los cuales desplegaron fenotipos "embriogénicos" o "retoñantes" en la presencia pero no en la ausencia del inductor de 17-ß-estradiol. Nosotros colectivamente llamamos a estas dos clases de mutantes como pga (plant growth activators [activadores de crecimiento de planta]) (Zuo et al, 2002). Un mutante que muestra típicamente callo embriogénico somático en tamizaje primario se ha denominado pga37.

Ejemplo 4 La Mutación de Ganancia de Función del pga37 Promueve el Desarrollo de Embrión Somático. En tamizajes primarios, c\pga37 putativo produjo callo similar a embrión somático en medio SCM+. Los callos fueron transferidos a un medio de regeneración de brotes para generar retoños, los cuales fueron posteriormente transferidos a un medio de regeneración de raíz para la regeneración de raíces. Los brotes con raíz fueron transferidos a suelo para su crecimiento hasta la madurez en una cámara de crecimiento. Para confirmar si e\ pga37 putativo puede promover la embriogénesis somática, se recolectaron raíces de plántulas TI de pga37 germinadas en medio de selección y se recolectaron y cultivaron en SCM+ o SCM- sin 17-ß-estradiol (SCM-) como un control negativo. Después de dos semanas en medio SCM+, los explantes de raíz produjeron callo amarillo verdoso (Figura 2B), el cual pareció similar a callo embriogénico somático. Después de unas dos semanas adicionales de crecimiento en medio SCM+, los embriones somáticos regenerados fueron transferidos a medio MS sin 17-ß-estradiol. Estos embriones germinaron en plántulas, las cuales subsecuentemente se desarrollaron en plantas adultas fértiles y dieron semillas (Figura 2C-2F). En contraste, explantes de raíz que fueron cultivados en medio SCM- produjeron raíces y pequeño callo normal debido a la baja concentración de auxina en el medio SCM-(Figura 2 A). No se obtuvo callo embriogénico en estos cultivos.

Ejemplo 5 El PGA37 codifica para Proteína de Unión de ADN Similar a MYB Se cultivaron explantes de raíz recolectados de plántulas de pga37 individuales hechas crecer en medio MS sin selección, tanto en medio SCM+ como en medio SCM-. El análisis genético mostró que el fenotipo mutante dependiente de 17-ß-estradiol y el fenotipo WT fueron segregados en una proporción de 3:1, indicando que la mutación susceptible de ser inducida fue dominante en un único locus genético (Figura 3). La segregación de marcador resistente a antibiótico en una proporción 3:1 sugiere la presencia de una copia de inserto de ADN-T en el mutante depga37. Debido a que el fenotipo de ganancia de función de PGA37 fue estrictamente dependiente del inductor, el gene de PGA37 debe ser marcado mediante el promotor de pER16 susceptible de inducción con 17-ß-estradiol, insertado en el genoma de pga37. Aprovechando esto, nosotros clonamos la secuencia corriente abajo del promotor susceptible de inducción mediante Tail-PCT (Liu et al, 1995). El análisis de secuencia indicó que el ADN-T insertado 7,785 pares de bases corriente arriba de codón de inicio de traducción putativo del gene de MYB118 (At3g27785) codifica para una proteína de unión de ADN similar a MYB (Figura 4). En la Figura 5A (SEQ ID NO: l) se muestra la secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura 5B (SEQ ID NO:2).

Para verificar si el MYB118 era activado por el promotor susceptible de inducción, se analizó nivel transcripcional de este gene mediante Northern blot. La Figura 6 muestra que el marco de lectura abierto que codifica para proteína de unión de ADN similar a MYB fue expresado solo en la presencia del inductor.

Ejemplo 6 Formación de Embrión Somático de Explantes Derivados de Plantas Transgénicas que Portan un Transgene de pER\0-MYB118 El vector pERlO de XVE es idéntico al pER8 excepto en que el marcador de resistencia a la higromicina está reemplazado con un marcador de resistencia a la canamicina (Zuo et al, 2000(a)). Se colocó ADNc de MYB118 de longitud completa bajo el control del sistema XVE en pERlO (Zuo et al, 2001; Zuo et al, 2002). Este constructo fue utilizado para transformar explantes de raíz procedentes de WS de tipo silvestre de Arabidopsis. Explantes de raíz transformados se cultivaron en medio SCM+, o medio SCM- como un control negativo. Los explantes de raíz transformados, que crecieron en medio SCM+ fueron capaces de generar embrión somático después de 3-4 semanas (Figuras 7B y 7C) y estos embriones fueron capaces de germinar cuando se transfirieron a medio MS sin el inductor (Figura 7D). En contraste, explantes de raíz transformados que fueron colocados en medio SCM- no fueron capaces de producir embriones somáticos (Figura 7A). Explantes de raíz derivados de plántulas T2 de plantas transgénicas de pER\0/PGA37 fueron cultivados en medio SCM+ o SCM-. De manera similar a\ pga37, explantes de raíz de pERlO/ GvüZ colocados solo en medio SCM+ fueron capaces de generar embriones somáticos (Figura 8A-8B).

Ejemplo 7 Un Mutante Knock-Out de PGA37 Tiene Desarrollo Defectuoso de Embrión El fenotipo Knock-out es una de las más importantes evidencias de la función del gene. El análisis fenotípico de un mutante de inserción de ADN-T de PGA37 (SALK- 111,812) indicó que la embriogénesis fue ya sea no activada o bloqueada en una etapa muy temprana en este mutante (Figura 9A). Un fragmento específico de PGA37 de ADN con terminación 5'-, de 396 pares de bases (desde el nucleótido 4 hasta el 400), se utilizó para producir un constructo de ARNi impulsado por un promotor de 35s y se empleó para transformar plantas de ecotipo Columbia de tipo silvestre de Arabidopsis. Varias líneas transgénicas independientes mostraron el mismo fenotipo que aquel del mutante de inserción de ADN-T de PGA37 (Figura 9B). La Figura 10 muestra que el ADN-T del mutante de SALK_111812 fue insertado a 819 pares de bases corriente abajo del codón de inicio de traducción putativo del gene de MYB 118. Las cajas abiertas representan exones y las cajas negras representan intrones.

Ejemplo 8 El PGA37 es Capaz de Activar el Gene de LEC2 Durante la Embriogénesis El gene LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2) de Arabidopsis es un regulador embriónico central que juega un papel crítico tanto en la embriogénesis temprana como en la tardía (Stone et al, 2001). Para verificar la relación entre el LEC2 y el PGA37, explantes de raíz de pga37 fueron cultivados en medio SCM+ para inducir embriones somáticos. Se extrajo ARN total en diferentes puntos del tiempo. El análisis de RT-PCR indicó que el PGA37 fue capaz de activar la expresión de LEC2 (Figura 11).

Ejemplo 9 Colocación de MYB118 Bajo el Control de un Promotor Específico de Tejido Puede reemplazarse el promotor de G 10-90 en el vector XVE con un promotor específico de tejido (por ejemplo, promotor específico de polen, raíz, tallo u hoja). Se conoce bien por aquellos capacitados en la técnica una variedad de promotores específicos de tejido. Debido a que la expresión de un transgene es activada por el gene de XVE quimérico que es controlado por un promotor específico de tejido en este ejemplo, el promotor de 0Lex?-46 que controla el transgene de MYB 118 es por lo tanto específico de tejido en una forma que depende del inductor. Esto significa que el MYB118 será inducido solo en la presencia de un inductor y solo en el tejido específico que corresponde al promotor específico de tejido. Por lo tanto, pueden recolectarse tejidos o tipos de células apropiadas procedentes de las plantas transgénicas y utilizarse para la inducción de embriones somáticos como se describe en los ejemplos anteriores.

De manera particular, cuando se utilizó polen derivado de plantas transgénicas portando un vector de XVE de promotor específico de polen/MYB118 de 0LexA-4, plantas de progenie generadas a partir de embriones somáticos derivados de polen deberían ser haploides en lugar de diploides (Ver, por ejemplo, Twell et al, 1989 y Twell et al, 1990 para promotores específicos de polen). En esta modalidad de la invención, un planta transgénica que tiene en su genoma un gene de MYB118 bajo el control de un promotor específico de polen, susceptible de inducción, normalmente no expresaría el gene. Polen procedente de tal planta puede ser cultivado en la presencia del inductor hasta que ocurra la embriogénesis somática, después de lo cual el inductor es retirado y se deja que los embriones haploides se desarrollen en clonas haploides de acuerdo con técnicas estándar.

Ejemplo 10 Uso del pER\0-MYB118 como Marcador Silencioso para Transformación Se puede utilizar el vector de pER\0-MYB118 directamente para la transformación de explantes sin el uso de un marcador resistente a antibiótico. Embriones somáticos que se formaron en la presencia de un inductor pero en la ausencia de citoquinina deben ser transformantes, debido a que bajo tales condiciones los no-transformantes serían incapaces de formar embriones somáticos ni brotes debido a la falta de expresión de gene de MYB118 inducida. A la remoción del inductor, los embriones y brotes se desarrollarán en plantas normales y fértiles. El vector puede incluir cualquier gene o genes que se desee que estén presentes en las plantas transformadas y estos pueden estar bajo el control de un promotor deseado. Las plantas seleccionadas como resultado de la selección para embriones o brotes somáticos dependientes de la expresión del MYB 118, susceptible de inducción, contendrán el gene o genes deseados. Si se desea, el transgene de MYB118 puede ser colocado en un vector que comprende un medio de remoción del transgene de MYB118 así como también otras porciones del vector que ya no se desean más, por ejemplo, usando el sistema XVE-Cre/lox (Zuo et al, 2001). Dichos métodos también son descritos en la patente de los Estados Unidos de América No. 6,723,896, la cual se incorpora a la presente mediante referencia.

Ejemplo 11 Generación de una Planta Apomítica La apomixis puede ser inducida mediante la introducción del MYB118 en una célula de planta en una forma tal que el gene de MYB118 sea expresado en los tejidos apropiados (por ejemplo, tejido del núcleo). Esto puede ser por medio de, pero no está limitado a, la colocación del gene de MYB118 bajo el control de un promotor específico de tejido (por ejemplo, promotor específico de núcleo), un promotor susceptible de inducción, o un promotor que sea tanto susceptible de inducción como específico de tejido. La expresión de inducción del gene de MYB 118, por ejemplo, en el núcleo, produce apomixis que conduce a una planta apomítica. Esta planta puede entonces ser utilizada para establecer una línea de planta genéticamente pura. Adicionalmente, el vector utilizado para transferir MYB118 en la célula de planta puede incluir cualquier otro gene heterólogo deseado además del MYB 118, incluyendo pero no limitándose a, un gene marcador o un gene para conferir una característica deseable a la planta, por ejemplo, un gene que resulte en plantas más grandes, de crecimiento más rápido, con resistencia al estrés, etc. Esto conduciría al desarrollo de una línea apomítica con la característica deseada. En una variación del esquema, pueden fácilmente construirse cartuchos de expresión de planta, incluyendo pero no limitándose a cartuchos de expresión monocote o dicote, que dirijan la expresión de MYB118 al núcleo o integumento interno. Un cartucho de expresión que dirige la expresión de las secuencias de ADN del MYB118 hacia el núcleo se prepara utilizando el promotor Nucí de cebada (Doan et al, 1996). La expresión se utiliza para la transformación de planta. Otros genes que confieren rasgos deseados también pueden estar incluidos en el cartucho. Se anticipa que plantas transgénicas que portan el cartucho de expresión serán entonces capaces de producir embriones nuevos a partir de células nucleares que expresan el MYB118 En el caso de maíz, esto se complementa mediante la polinización de las espigas para promover la fertilización normal de célula central y el desarrollo del endospermo. En otra variación de este esquema, transformantes con un cartucho de expresión de Nucl: FZ?7/# son preparados haciendo un fondo genético nulo en fie (endospermo independiente de la fertilidad [fertility-independient endosperm]) el cual promovería tanto el desarrollo de nuevos embriones como el desarrollo de endospermo sin fertilización (Ohad et al, 1999). Durante el examen microscópico de los embriones en desarrollo será claro que la apomixis ha ocurrido por la presencia de embriones surgiendo del núcleo. En todavía otra variación de este esquema las secuencias de ADN de MYB 118 podrían ser entregadas como se describe anteriormente en un genotipo homocigoto letal de embrión cigótico. Solo los embriones adventicios producidos a partir de tejido de núcleo somático se desarrollarían en la semilla. Si bien la invención ha sido descrita con referencia a los detalles de modalidades preferidas de la invención, deberá comprenderse que la descripción tiene la intención de ser en un sentido ilustrativo más que limitativo, ya que se contempla que fácilmente se le ocurrirán modificaciones a aquellos capacitados en la técnica, dentro del espíritu de la invención y del alcance de las reivindicaciones anexas.

Bibliografía Bashaw (1980). Crop Science 20: 112. Bechtold, N., Ellis, J., and Pelletier, G. (1993). "In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration ofadult Arabidopsis thaliana plants." CR Acad Sci Ser III Sci Vie 316:1194-1199. Boutiller, K., Offringa, R., Sharma, V. K., Kieñ, H., Ouellet, T., Zhang, L., Hattori, J., Liu, C-M., Lammeren, A.A.M., Miki, B.L.A., Custers, J.B.M., and Campagne, M.M.L.,(2002). "Ectopic espression of BABY BOOM triggers a conversión from vegetative to embryonic growth." The Plant Cell 14: 1737- 1749. Doan, D.N., Linnestad, C. and Olsen, O.A. (1996). "Isolation of molecular markers from the barley endosperm coenocyte and the surrounding nucellus cell layers." Plant Mol. Endrizzi et al. (1996). Plant Journal 10:967-979. Feyter et al. (1996). Mol Gen Genet 250:329-338. Ishige, F., Takaichi, M., Foster, R., Chua, N.-H., and Oeda, K. (1999). "A G-box motif (GCCACGTGCC) tetramer confers high-level constitutive expression in dicot and monocot plants." Plant J 18:443-448. Koncz, C, Martini, N., Mayerhofer, R., Koncz-Kalman, Z., Korber, H., Redei, G.P., and Schell, J. (1989). "High-frequency T-DNA-mediated gene tagging in plants." Proc Nati Acad Sci USA 86(21): 8467-8471.

Laux et al. (1996). Development 122:87-96. Lin, X., Hwang, GJ, and Zimmerman, J.L. (1996). "Isolation and characterization of a diverse set of genes from carrot somatic embryos." Plant Physiol 112:1365-1374. Liu, Y.G., Mitsukawa, N., Oosumi, T., and Whittier, R.F. (1995). "Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR." Plant J 8:457-463. Lotan, T., Ohto, M., Yee, K.M., West, M.A., Lo, R., Kwong, R.W., Yamagishi, K., Fischer, R.L., Goldberg, R.B., and Harada, JJ. (1998). "Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells." Cell 93: 1195-1205. Mayer et al. (1998). Cell 95:805-815. Meinke, D.W., (1992). "A homoeotic mutant of Arabidopsis thaliana with leafy cotyledons." Science 258: 1647-1650. Meinke, D.W., Franzmann, L.H., Nickle, T.C., and Yeung, E.C. (1994). "Leafy cotyledon mutants oí Arabidopsis " Plant Cell 6:1049-1064. Mol, J.M.N, et al. (1994). "Post-transcriptional inhibition of gene expression: sense and antisense genes." In: J. Paszkowski (Ed.). Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Netherlands, pp. 309-334. Mordhorst, A.P., Toonen, M.A.J., and de Vries, S.C. (1997). "Plant embryogenesis." Crit Rev Plant Sci 16:535-576. Mordhorst, A.P., Voerman, K.J., Hartog, M.V., Meijer, E.A., van Went, J., Koornneef, M., and de Vries, S.C. (1998). "Somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana is facilitated by mutations in genes repressing meristematic cell divisions." Genetics 149:549-563. Murashige, T., and Skoog, F. (1962). "A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue culture." Physiol Plant 15:473-497. Ohad, N., Yadegari, R., Margossian, L., Hannon, M., Michaeli, D., Harada, JJ., Goldberg, R.B., and Fischer, R.L. (1999). "Mutations in FJJE, a WD polycomb group gene, allow endosperm development without fertilization." The Plant Cell 11:407-416. Parlevliet, J.E. et al. (1959). "Citrus." Proc Am Soc Hort Sci 74: 252-260. Pepin et al. (1971). Crop Science 11:445-448.

Rieger et a\. (1976). In Glossary of Genetics and Cytogenetics, Springer- Verlag, New York, N.Y. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A Labor atoty Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schmidt, E.D., Guzzo, F., Toonen, M.A., and de Vries, S.C. (1997). "A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos." Development 124:2049-2062. Skoog, F., and Miller, C.O. (1957). "Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro." Symp Soc Exp Biol 11:118-131. Stone, S.L., Kwong, L.W. Yee, K.M., Pelletier, J., Lepiniec, L., Fisher, R.L., Goldberg, R.B., and Harada, JJ. (2001). "LEAFY COTYLEDON 2 encodes a B3 domain transcription factor that induces embryo development." Proc Nati Acad Sci USA 98:11806-11811. Stracke, R., Weber, M., and Weisshaar, B. (2001). The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana. Curr Opin Plant Biol 4(5):447-456. Sugiyama, M. (1999). "Organogénesis in vitro." Curr Opin Plant Biol 2:61-64. Sugiyama, M. (2000). "Genetic analysis of plant morphogenesis in vitro." Int Rev Cytol 196:67-84. Taylor, L. P. and Jorgensen, R. A. (1992). JHered 83: 11-17. Thomas, T.L. (1993). "Gene expression during plant embryogenesis and germination: an overview." Plant Cell 5:1401-1410. Twell, D., Wing, R. Yamaguchi, J. and McCormick S. (1989). "Isolation and expression of an anther-specifíc gene from tomato." Mol Gen Genet 217:240-245. Twell, D. Yamaguchi, J. and McCormick, S. (1990). "Pollen-specifíc gene expression in transgenic plants: coordínate regulation of two different tomato gene promoters during microsporogenesis." Development 109:705-713. Wilson et al. (1992). Proceedings of the International Workshop on Apomixis in Rice, Changsha, People's Republic of China, Jan. 13- Jan. 15, 1992. Hunan Hybrid Rice Research Center, Changsha, People's Republic of China.

Wu, Y., Haberland, G., Zhou, C, and Koop, H.-U. (1992). "Somatic embryogenesis, formation of morphogenetic callus and normal development in zygotic embryos of Arabidopsis thaliana in vitro." Protoplasma 169:89-96. Zimmerman, J.L. (1993). "Somatic embryogenesis: A model for early development in higher plants." Plant Cell 5: 1411-1423. Zuo, J., Niu, Q.-W., and Chua, N.-H. (2000a). "An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants," Plant J 24:265-273. Zuo, J., Niu, Q.-W., Nishizawa, N., Wu, Y., Kost, B., and Chua, N.-H. (2000b). "KORRIGAN, an Arabidopsis endo-l,4-b-glucanase, localizes to the cell píate by polarized targeting and is essential for cytokinesis." Plant Cell 12(7): 1137-1152. Zuo, J., Niu, Q.-W, Moller, S.G., and Chua, N.-H. (2001). "Chemical-regulated, site- specifíc DNA excisión in transgenic plants." Nat Biotechnol 19.157-161. Zuo, J., Niu, Q.W., Frugis, G., . and Chua, N.H. (2002). "The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis." Plant J 30(3):349-59. Solicitud de Patente PCT Publicada WO 98/53083. Solicitud de Patente PCT Publicada WO 99/53050 Solicitud de Patente PCT Publicada WO 99/61631 Solicitud de Patente PCT Publicada WO 00/24914 Solicitud de Patente PCT Publicada WO 01/23575 Publicación de Solicitud de Patente E.U.A. No. 2002/0168707 Al Patente de los E.U.A. No. 5,710,367 Patente de los E.U.A. No. 5,811,636 Patente de los E.U.A. No. 6,028,185 Patente de los E.U.A. No. 6,229,064 Patente de los E.U.A. No. 6,239,327 Patente de los E.U.A. No. 6,506,559 Patente de los E.U.A. No. 6,723,896

Claims (65)

1. Reivindicaciones I. Un método para promover la embriogénesis somática a partir de una célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular, el cual consiste en la sobre expresión de un gene de PGA37 en la célula de una planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular comprende un promotor que controla la expresión del gene dc PGA37.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular es transgénico para el promotor.
4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde el promotor es susceptible de inducción.
5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde el gene de PGA37 que es sobre expresado está en un vector.
6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el vector comprende un promotor susceptible de inducción que controla la expresión del gene de PGA37.
7. 7. El método de la reivindicación 6, en donde el promotor susceptible de inducción es inducido por un estrógeno.
8. 8. El método de la reivindicación 7, en donde el estrógeno es 17-ß-estradiol.
9. 9. El método de la reivindicación 5, en donde el vector comprende un promotor específico de tejido.
10. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la planta se selecciona del grupo formado por árboles y cultivos.
11. II. Un método para generar embriones somáticos de plantas, en donde el método comprende la sobre expresión de un gene de PGA37 en la célula de una planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular.
12. 12. El método de la reivindicación 11, en donde la célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular comprende un promotor que controla la expresión del gene de PGA37.
13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde la célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular es transgénico para el promotor.
14. 14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde el promotor es susceptible de inducción.
15. 15. El método de la reivindicación 11, en donde el gene de PGA37 que es sobre expresado está en un vector.
16. 16. El método de la reivindicación 15, en donde el vector comprende un promotor susceptible de inducción que controla la expresión del gene de PGA37.
17. 17. El método de la reivindicación 16, en donde el promotor susceptible de inducción es inducido por un estrógeno.
18. 18. El método de la reivindicación 17, en donde el estrógeno es 17-ß-estradiol.
19. 19. El método de la reivindicación 5, en donde el vector comprende un promotor específico de tejido.
20. 20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en donde la planta se selecciona del grupo formado por árboles y cultivos.
21. 21. Un método para la generación de brotes a partir de una célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular, el cual consiste en la sobre expresión de un gene de PGA37 en la célula de una planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular.
22. 22. El método de la reivindicación 21, en donde la célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular comprende un promotor que controla la expresión del gene de PGA37.
23. 23. El método de la reivindicación 22, en donde la célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular es transgénico para el promotor.
24. 24. El método de la reivindicación 22 o 23, en donde el promotor es susceptible de inducción.
25. 25. El método de la reivindicación 21, en donde el gene de PGA37 que es sobre expresado está en un vector.
26. 26. El método de la reivindicación 25, en donde el vector comprende un promotor susceptible de inducción que controla la expresión del gene de PGA37.
27. 27. El método de la reivindicación 26, en donde el promotor susceptible de inducción es inducido por un estrógeno.
28. 28. El método de la reivindicación 27, en donde el estrógeno es 17-ß-estradiol.
29. 29. El método de la reivindicación 5, en donde el vector comprende un promotor específico de tejido.
30. 30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, en donde la planta se selecciona del grupo formado por árboles y cultivos.
31. 31. Un método para la selección de plantas transformadas con un vector que comprende un marcador silencioso seleccionable, el marcador silencioso seleccionable siendo un gene de PGA37, en donde el método comprende los pasos de a) transformar una planta, célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular con una vector que comprende el gene de PGA37 bajo el control de un promotor susceptible de inducción; b) cultivar la planta, célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular en la presencia de un inductor del promotor susceptible de inducción; c) seleccionar embriones somáticos que se forman; y d) hacer crecer los embriones somáticos en la ausencia del inductor para desarrollar la planta; en donde las plantas que se desarrollan son transformadas con el vector.
32. 32. El método de la reivindicación 31, en donde el promotor susceptible de inducción es inducible por un estrógeno.
33. 33. El método de la reivindicación 32, en donde el estrógeno es 17-ß-estradiol.
34. 34. El método de la reivindicación 31, en donde el vector comprende un promotor específico de tejido.
35. 35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en donde el vector comprende un gene de interés.
36. 36. El método de la reivindicación 35, en donde el gene de interés está bajo el control de un promotor.
37. 37. El método de la reivindicación 36, en donde el promotor que controla el gene de interés es un promotor constitutivo o un promotor susceptible de inducción.
38. 38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 37, en donde la planta, célula de planta, tejido, órgano, callo o cultivo celular se selecciona del grupo formado por árboles y cultivos.
39. 39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 38, en donde el vector comprende medios para eliminar el gene de PGA37.
40. 40. Un método para inducir la apomixis en una célula de planta, el cual comprende la sobre expresión del gene PGA37 en la célula de planta.
41. 41. El método de la reivindicación 40, en donde la célula de planta es transformada con un vector que comprende PGA37.
42. 42. El método de la reivindicación 41, en donde el PGA37 está bajo el control de un promotor susceptible de inducción.
43. 43. El método de la reivindicación 41 o 42, en donde el vector comprende un segundo gene además del PGA37.
44. 44. El método de la reivindicación 43, en donde el segundo gene codifica para un marcador.
45. 45. El método de la reivindicación 43, en donde el segundo gene confiere una característica deseada a la planta.
46. 46. Una planta apomítica que comprende PGA37 bajo el control de un promotor susceptible de inducción.
47. 47. Un método para conferir apomoxis a una planta, el cual comprende los pasos de: a) transformar de manera estable una célula de planta susceptible de responder, con una secuencia de ADN que comprende cuando menos una secuencia de codificación de PGA37 bajo el control de un promotor para producir una célula de planta transgénica, el promotor siendo del grupo que consiste en un promotor específico de tejido, un promotor susceptible de inducción y un promotor que es tanto específico de tejido como susceptible de inducción, y b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula de planta transgénica, por medio de lo cual la sobre expresión de un polipéptido de PGA37 procedente de la secuencia de codificación de PGA37 en la planta transgénica resulta en la formación de un embrión apomítico.
48. 48. El método de la reivindicación 47, en donde el promotor es un promotor específico de tejido.
49. 49. El método de la reivindicación 47, en donde el promotor es un promotor susceptible de inducción.
50. 50. El método de la reivindicación 47, en donde el promotor es tanto un promotor específico de tejido como un promotor susceptible de inducción.
51. 51. El método de la reivindicación 48, en donde el promotor es un promotor específico de núcleo.
52. 52. El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51, en donde la célula de planta transgénica comprende cuando menos una secuencia de ADN heteróloga adicional en su genoma.
53. 53. Una planta producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a 52.
54. 54. El método para producir una planta haploide, el cual comprende los pasos de: a) transformar de manera estable una célula de planta con una secuencia de ADN que comprende cuando menos una secuencia de codificación de PGA37 bajo el control de un promotor para producir una célula de planta transgénica, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor específico de tejido haploide, un promotor susceptible de inducción y un promotor que es tanto específico de tejido haploide como susceptible de inducción, b) generar una planta transgénica a partir de la célula de planta transgénica, c) sobre expresar la secuencia de codificación de PGA37 en un tejido haploide de la planta transgénica para producir un embrión somático haploide, y d) hacer crecer el embrión en una planta haploide.
55. 55. El método de la reivindicación 54, en donde el promotor es un promotor específico de tejido haploide.
56. 56. El método de la reivindicación 55, en donde el promotor es un promotor específico de polen, y el tejido haploide de la planta transgénica es polen.
57. 57. El método de la reivindicación 55, en donde el promotor es un promotor específico de óvulo, y el tejido haploide de la planta transgénica es tejido de óvulo.
58. 58. El método de la reivindicación 54, en donde el promotor es un promotor susceptible de inducción.
59. 59. El método de la reivindicación 54, en donde el promotor es tanto un promotor específico de tejido haploide como un promotor susceptible de inducción.
60. 60. El método de la reivindicación 58, en donde el promotor es un promotor específico de polen, y la célula de planta haploide es una célula de polen.
61. 61. El método de cualquiera de las reivindicaciones 58 a 60, en donde la etapa (c) de sobreexpresión se logra en tejido haploide cortado y cultivado en la presencia del inductor específico para el promotor susceptible de inducción, durante un tiempo suficiente para inducir la formación del embrión somático haploide, seguido de la remoción del inductor, y además en donde la etapa (d) de crecimiento se lleva a cabo en la ausencia del inductor.
62. 62. Un método para la producción de frutos sin semilla, el cual comprende los pasos de: a) transformar de manera estable una célula de planta susceptible de responder, con un ácido nucleico que comprende cuando menos una secuencia de ADN bajo el control de un promotor para producir una célula de planta transgénica, en donde la secuencia de ADN es capaz de interferir con la expresión de un gene de PGA37 y el promotor siendo seleccionado del grupo que consiste en un promotor específico de tejido, un promotor susceptible de inducción y un promotor que es tanto específico de tejido como susceptible de inducción; b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula de planta transgénica; y c) hacer crecer la planta transgénica bajo condiciones que sean adecuadas para la sobre expresión de la secuencia de ADN. Por medio de lo cual la expresión de la secuencia de ADN interfiere con la expresión de un gene de PGA37 en la planta transgénica en la formación de un fruto sin semillas.
63. 63. El método de la reivindicación 62, en donde el promotor es un promotor susceptible de inducción.
64. 64. El método de la reivindicación 63, en donde el promotor es un promotor susceptible de inducción por un estrógeno.
65. 65. El método de la reivindicación 64, en donde el estrógeno es 17-ß-estradiol.