CN104039818A - 用于调节植物中rkd多肽的表达或活性的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供方法和组合物以增加RKD多肽或其活性变体或片段在胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的活性/水平。在具体实施例中，对所述RKD多肽的活性/水平的此类调节促进所述胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。此类方法和组合物可采用包含RKD多肽或其活性变体或片段的表达构建体，所述RKD多肽或其活性变体或片段可操作连接至胚珠组织优选启动子，尤其是在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性并且在所述胚囊外的未减数细胞中有活性的胚珠组织优选启动子。

Description

用于调节植物中RKD多肽的表达或活性的方法和组合物

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地讲涉及从在胚珠的未减数的体细胞组织中表达的胚珠组织优选启动子调控植物中的基因表达。

背景技术

单性生殖是指导致在不受精的情况下产生种子，产生与母本植物在遗传上相同的后代的无性生殖(Koltunow，et al.，(1995)Plant Physiol.108：1345-1352(Koltunow等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第1345-1352页)；Ravi，et al.，(2008)Nature451：1121-1124(Ravi等人，2008年，《自然》，第451卷，第1121-1124页))。它是一个绕开雌性减数分裂和有性生殖来产生与母本相同的胚的生殖过程。单性生殖增大了开发优良基因组合的可能性并有利于所需性状的快速掺入。单性生殖不仅提供生殖保证，而且避免了后代的杂合性丢失，因为卵细胞保持了亲代的基因型。因此，单性生殖避免了由于近交造成的活力丧失的效应，并且由于杂种优势效应可另外赋予一些优点。

在物种水平上，单性生殖的发生率小于物种的1％。单性生殖出现在多个野生物种和少量农艺重要性物种例如柑橘和芒果中，但未出现在任何主要谷类作物中(Eckhardt，(2003)The Plant Cell15：1449-1501(Eckhardt，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1449-1501页))。单性生殖的一种形式是不定胚生殖，其中胚由胚囊外部胚珠内的体细胞组织直接形成。不定胚生殖通常与正常有性生殖并行出现。因为其提供对所需基因型的固定和无限增殖保证，所以备受关注的是对该能力进行工程化以使无性系种子形成作物尤其是谷物(Spillane，et al.，(2001)Nat.Biotechnol.22：687-691(Spillane等人，2001年，《自然生物技术》，第22卷，第687-691页))。

在商业化植物株系中工程化单性生殖的分子方法是非常可取的。基因转录的调控在种子特异性发育程序的表达中起到重要作用。因此，早期胚珠发育期间在有性生殖途径和单性生殖过程之间的趋异点处分子开关的调控，是可控制类单性生殖性状的点。

异源卵细胞特异性DNA序列在植物宿主的表达取决于在植物宿主内在恰当的时间和恰当的位置发挥功能的可操作连接的调控元件的存在。启动子序列的选择将决定在生物体中何时和何处表达异源DNA序列。不定胚生殖需要DNA序列在特定生长或发育阶段植物的特定组织或器官中的表达。这种DNA序列可用于促进或抑制植物生长过程，从而影响植物的生长速率或结构(architecture)。通常在胚发生期间将发育特异性基因的表达限定到相关组织对于可存活的后代是必须的。

体细胞胚珠组织优选转录调控因子可作为种子发育早期单性生殖途径中基因表达的调控因子，其分离和表征对于影响植物的各种性状和合成不定胚生殖发育是必需的。

发明内容

本发明提供方法和组合物以提高RKD多肽或其活性变体或片段在胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的活性/水平。在具体实施例中，对所述RKD多肽的活性/水平的此类调节促进位于所述胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。此类方法和组合物可采用包含RKD多肽或其活性变体或片段的表达构建体，所述RKD多肽或其活性变体或片段可操作连接至胚珠组织优选启动子，尤其是在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性并且在胚囊外的未减数细胞中有活性的胚珠组织优选启动子。

附图说明

图1(A-D)示出了可操作连接本发明拟南芥NUC1启动子和本发明经修饰的NUC1(ALT1)启动子的异源基因(GUS)在胚珠中的表达模式。(A)是具有成熟胚囊的拟南芥胚珠的参考示意图，其示出了卵细胞(红色)、2个助细胞(绿色)、中央细胞(蓝色)和3个反足细胞(黄色)。表达处于(B)大配子体期、(C)卵期和(D)球形胚期。表达模式可见于内珠被的珠孔顶端，合点地(chalazally)扩散穿过内珠，从而围绕胚囊的珠孔所在半部。在球形胚期(D)期间，表达从珠孔内珠被过渡到合点珠被，并且在心形胚期，表达仅在与合点端(未示出)相对的珠被中观察到。图1B-D是透明的拟南芥胚珠的微分干涉相衬(DIC)图像，其示出了蓝色的GUS染色。

图2示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(DS-RED)在(A)卵期、(B)鱼雷形胚期和(C)晚期球形胚期胚珠中的表达模式。表达模式可见于内珠被的珠孔顶端(A)，合点地扩散穿过内种皮以围绕胚囊的基部，还扩散到外珠被的珠孔端(B)，然后继续合点地扩散穿过整个内种皮层(C)。图2A-C是与DS-RED荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像(蓝-绿色调)。

图3和4示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(DS-RED)在卵期胚珠中的表达模式。在成熟胚囊期(卵期)，AT-CYP86C1pro：Ds-Red表达局限于围绕胚囊的珠孔端和与其相对的内珠被。图3是使用混合荧光(DS-RED)和明视场光学的拟南芥胚珠立体镜图像。图4是与DS-RED荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像(蓝-绿色调)。

图5示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(DS-RED)在卵/合子期胚珠中的表达模式。在受精时或之后，AT-CYP86C1pro：Ds-Red表达仍局限于围绕胚囊的珠孔端和与其相对的内珠被。表达在内种皮层中合点地延伸，开始于胚珠的远轴侧(左)。图5是与DS-RED荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像(蓝-绿色调)。

图6(A和B)DIC和荧光图像示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(DS-RED)在合子期胚珠中的表达模式。AT-CYP86C1pro：Ds-Red表达仍然强烈地局限于围绕胚囊的珠孔端和与其相对的内珠被(B)。表达在内种皮层中合点地延伸，开始于胚珠的远轴侧。表达还可见于与胚囊的珠孔端相对的外珠被中。图6A是单个拟南芥胚珠的DIC图像。图6B是与DS-RED荧光图像叠加的相同DIC图像(蓝色调)。

图7和8(7A-C和8A-C)示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(RED)在鱼雷形期胚珠中的表达模式。AT-CYP86C1pro：DS-Red表达仍然强烈地局限于围绕胚囊的珠孔端和与其相对的内珠被。表达在与胚囊的珠孔端相对的外珠被中变得更普遍和更强。表达在内种皮层中继续合点地延伸。图7A是与DS-RED荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像；7B是DS-RED荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光；7C是与DS-RED荧光图像叠加的胚珠(蓝色调)的DIC图像。图8A是与DS-RED荧光图像叠加的胚珠的DIC图像；8B是DS-RED荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光；8C是与DS-RED荧光图像叠加的胚珠(蓝色调)的DIC图像。

图9(A和B)示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(DS-RED)在晚期球形胚期的2个不同胚珠中的表达模式。表达在与胚囊的珠孔端相对的珠被中较强。表达现在可在内种皮细胞的更多合点部分观察到。图9A和B是显示出DS-RED荧光表达和来自胚珠的蓝色自发荧光的荧光图像。

图10(A、B和C)示出了可操作连接至启动子AT-CYP86C1(PHP43541)的异源基因(DS-RED)在晚期球形胚期的胚珠中的表达模式。图10A是与DS-RED荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像；10B是DS-RED荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光；10C是与DS-RED荧光图像叠加的胚珠(蓝色调)的DIC图像。

图11(A-D)示出了可操作连接至启动子AT-PPM(推定的果胶甲酯酶，PHP48047)的异源基因(ZS-Green)在合子期胚珠中的表达模式。观察到AT-PPM启动子的两种不同表达模式：在第一模式中(A和B)，仅存在于珠孔内珠被和外珠被，而不存在于表皮外珠被。在第二模式中(C和D)，类似于模式1加上遍及围绕整个胚囊的内珠被的表达，不包括合点珠心。图11A和C是与ZS-GREEN荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像；11B和D是ZS-GREEN荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光。

图12(A-D)示出了可操作连接至启动子AT-SLV3(PHP43852)的异源基因(GUS)在大配子体(A和B)和合子期(C和D)拟南芥胚珠中的表达模式。启动子AT SVL3(AT3G20520)在大配子体发生过程的早期显示出表达(A和B)，在四核大配子体期，表达最初在珠孔内珠被和外珠被中较强，且遍布整个胚珠的珠被。到合子期(C和D)为止，表达强度已在珠被胚组织中增加。另外，胚乳和胚现在显示弱表达。表达在珠柄中不存在。图12A和C为透明的拟南芥胚珠的彩色DIC图像，示出了蓝色的GUS染色。图12B和D是灰度级明视场光学采集的相同胚珠。胚囊＝es。

图13(A-C)示出了可操作连接至启动子AT-EXT(内葡聚木糖转移酶，PHP48049)的异源基因(ZS-Green)在卵/合子期胚珠中的表达模式。表达在围绕胚囊的珠孔端的内珠被和外珠被的最内层中观察到(A和B)，类似于NUC1。偶尔，单个细胞(外珠被的最内层)显示出强表达(C)。图13A是与ZS-GREEN荧光图像叠加的拟南芥胚珠的DIC图像；13B和C是ZS-GREEN荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光。

图14(A和B)示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。正常胚(红色)发育的参考例通过AT-DD45-DsRed卵/早期胚报告基因呈现。图14A是拟南芥胚珠DsRed-阳性球形胚和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。图14B是与图14A的DS-Red荧光图像叠加的相同胚珠的DIC图像。

图15示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。胚囊外部外珠被中的至少一个细胞(红色)显示出表达AT-DD45-DsRed的卵细胞样状态。图15是拟南芥胚珠AT-DD45-DsRed-阳性卵样细胞和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。

图16示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。内珠被的珠孔基部的两个或更多个细胞显示出表达AT-DD45-DsRed的卵细胞样状态。图16A是拟南芥胚珠AT-DD45-DsRed-阳性卵样细胞和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。图16B是与图16A的DS-Red荧光图像叠加的相同胚珠的DIC图像。

图17示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。内珠被的三个增大细胞显示出表达AT-DD45-DsRed的胚样状态。图17A是拟南芥胚珠AT-DD45-DsRed-阳性卵样细胞和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。

图18示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。胚囊内的合子胚加上表达来自胚珠的珠孔端的内珠被细胞的卵标记物(AT-DD45-DsRed)的单细胞(箭形)。图18是拟南芥胚珠AT-DD45-DsRed-阳性卵样细胞和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。

图19(A和B)示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在拟南芥胚珠中的表达模式。早期球形胚样结构显示出从表达AT-DD45-DsRed的胚囊外部发育。图19A是AT-DD45-DsRed-阳性胚和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。图19B是与图19A的DS-Red荧光图像叠加的相同胚珠的DIC图像。

图20(A和B)示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在拟南芥胚珠中的表达模式。胚囊内的合子胚加上表达来自胚珠的珠孔端的内珠被细胞的卵标记物(AT-DD45-DsRed)的胚样细胞群(箭形)。图20A是AT-DD45-DsRed-阳性合子胚加上卵样细胞(箭形)和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。图20B是与图20A的DS-Red荧光图像叠加的相同胚珠的DIC图像。

图21示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。来自内珠被并且从胚囊外部发育的球形胚。图21是胚囊外部的AT-DD45-DsRed-阳性胚(箭形)、来自内种皮层(内珠被的最内层)的绿色自发荧光以及来自胚珠的蓝色自发荧光的三色荧光图像。

图22示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在拟南芥胚珠中的表达模式。位于胚囊内非典型位置、中间点、不在胚囊的正常珠孔端的幼胚样体。图22是AT-DD45-DsRed-阳性胚样体和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。

图23示出了AT-NUC1pro：：AT-RKD2-AT-DD45pro：：DsRed(php50089)在胚珠中的表达模式。来自珠被并且从胚囊外部发育的胚样体(红色)。图23是AT-DD45-DsRed-阳性胚样体和来自胚珠的蓝色自发荧光的双色荧光图像。

图24示出了AT-CYP86C1PRO：：AT-RKD2AT-DD45：：Ds-Red(PHP50088)在胚珠的珠被胚细胞中的表达模式。内珠被和外珠被的许多细胞显示出表达AT-DD45-DsRed卵细胞样标识标记物的卵细胞样状态。图24是显示出DS-RED荧光和来自拟南芥胚珠的蓝色自发荧光的图像。

图25示出了AT-CYP86C1PRO：：AT-RKD2AT-DD45：：Ds-Red(PHP50088)的表达模式。单个胚珠内的两个不同焦点平面(左上平面和右下平面)显示出RKD2诱导和AT-DD45-DsRed荧光标记的外珠被细胞和内珠被细胞中的胚发生样表达。图25A和B是显示出DS-RED荧光和来自拟南芥胚珠的蓝色自发荧光的图像。

图26示出了AT-CYP86C1PRO：：AT-RKD2AT-DD45：：Ds-Red(PHP50088)在胚珠中的表达模式。珠孔端的单个内珠被细胞显示出卵/合子样标识AT-DD45-DsRed。插图是所述具有AT-DD45：：DsRed表达的单细胞的高放大率图像。图26A是显示出DS-RED荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光的图像，26B是与DS-RED荧光图像叠加的胚珠的DIC图像。

图27示出了AT-CYP86C1PRO：：AT-RKD2AT-DD45：：Ds-Red(PHP50088)在胚珠中的表达模式，单个内珠被细胞刚好在表达AT-DD45-DsRed标记物的胚囊外部。图27是显示出DS-RED荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光的图像。

图28(A-C)示出了AT-CYP86C1PRO：：AT-RKD2AT-DD45：：Ds-Red(PHP50088)在单个胚珠中的表达模式。三至四个相邻珠被细胞均表达AT-DD45-DsRed标记物。该群的中间细胞(箭形)发育为合子样结构，其看起来从胚珠的珠孔端附近的外珠被的内层形成。该卵/合子样细胞具有浓厚细胞质和单个大液泡，并且在形态上类似于正常卵细胞或合子，但在胚囊外部。图28A是与DS-RED荧光图像叠加的胚珠的DIC图像；28B是DS-RED荧光和来自胚珠的蓝色自发荧光。图28C是表达AT-DD45-DsRed的细胞的高放大率图像，显示出增大且细胞质浓厚的卵/合子样细胞。

图29示出了AT-CYP86C1PRO：：AT-RKD2AT-DD45：：Ds-Red(PHP50088)在拟南芥胚珠中的表达模式。合子胚(箭形)和居中定位于胚囊内的两个小体(箭头)均表达卵/合子细胞样标记物AT-DD45-DsRed。图29是DS-RED荧光和蓝色胚珠自发荧光图像。

发明详述

下文将参照附图更完整地描述本发明，其中示出了本发明的一些但并非全部实施例。事实上，这些公开内容可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

I.概述

本发明提供了促进胚囊外部的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态的方法和组合物。如本文所用，“卵细胞样状态”是指非卵细胞的表型改变，以使其发育为具有可见于卵细胞中的至少一个或多个特性。

卵细胞样状态可通过未减数胚珠植物细胞中“卵细胞样转录状态”的发育来表征。如本文所用，“卵细胞样转录状态”包括未减数胚珠植物细胞的基因表达谱的任何改变，以使得所述未减数胚珠植物细胞的至少一个或多个基因的基因表达水平改变，并且该水平是可见于植物卵细胞内的基因表达状态的反映。多种方法可用于测定此类向卵细胞样状态的转变。例如，卵细胞优选启动子可可操作连接至标记物。此类报告基因构建体在可见于胚囊外部的未减数胚珠植物细胞中将是失活的，但报告基因构建体在形成卵细胞样状态时将变为活性的。可用于检测卵细胞样转录状态的卵细胞优选启动子包括例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)RKD1转录因子启动子(AT-RKD1PRO；SEQ ID NO：21)；拟南芥RKD2转录因子启动子(AT-RKD2PRO；SEQ ID NO：22)；在dif1(决定性不育基因1(determinant infertilel))1中下调的启动子(AT-DD45PRO；SEQ ID NO：10)；和EASE启动子(卵器优选增强子启动子；SEQ ID NO：19)。另参见Yang，et al.，(2005)PlantPhysiology139：1421-1432(Yang等人，2005年，《植物生理学》，第139卷，第1421-1432页)。另参见名称为Ovule Specific Promoters and Methodsof Their Use(胚珠特异性启动子及其使用方法)的美国临时申请序列号_____，该专利申请与本文同时提交且以引用方式整体并入本文。当使用此类可操作连接至适当标记物的卵细胞优选启动子时，可通过测定标记物在胚囊外部未减数细胞中的表达来测定卵样转录状态。以此方式，可测定在包括任何适于不定胚生殖的组织和亚结构的植物胚珠组织中的卵细胞样状态。

可监测另外的雌配子体特异性标记基因，以测定卵细胞样状态，所述基因包括任何雌配子体优选表达基因，例如AT1G18770(MYB98)、AT1G26795(与自交不亲和性蛋白相关)、AT2G20070、at4g25530(同源盒蛋白，fwa)和at5g40260(结瘤素mtN3家族蛋白)。参见例如Koszegi，et al.，(2011)Plant Journal67：280-291(Koszegi等人，2011年，《植物杂志》，第67卷，第280-291页)，该文献以引用方式并入本文。

在另一个实施例中，卵细胞样状态可通过类似于卵的细胞形态的细胞形态的发育指示，明显的是，浓厚细胞质的极性分布占据了大部分细胞体积，细胞核位于细胞的与大液泡相对的浓厚细胞质顶端，大液泡占据细胞内的中部至基部位置。一个实施例将包括类似于大约26μm高×15μm宽的天然卵细胞大小的拟南芥细胞。此类形态学实施例是对分子决定因素的补充，并且不是独立于其他决定因素的卵细胞样状态的诊断因素。

在其他实施例中，可表征卵细胞样状态并且测定胚囊外部的组织和亚结构中胚样结构的发育，包括适于不定胚生殖的任何组织和亚结构中此类结构的形成。胚样状态可通过显示出胚的形态学发育状态的细胞的邻接分群(contiguous grouping)来表征。胚样状态的形态学特征可包括通常空泡细胞变为浓厚细胞质细胞，或等径细胞变为伸长的和卵或合子形。暗示卵样状态的其他细胞学特征可包括细胞极性的变化，“顶点”变宽而“基部”变细并渐缩。其他特征可包括大部分细胞质占据顶部位置，而大液泡占据细胞内的中部至基部位置。该卵样细胞的细胞核将占据细胞内的顶部位置。在拟南芥的例子中，形态学状态将是卵、合子、原胚、球形或心形胚、鱼雷胚、手杖胚和卷曲子叶。胚柄或子叶(一个或多个)的发育将是另一个形态学实施例。此类结构也可表达分子标记物，例如直到球形期早期的AT-DD45表达。在球形期晚期至成熟，胚样结构可表达KTI3报告基因或其他胚特异性标记物表达。

在具体实施例中，“卵细胞样状态”可发展到产生不定胚生殖或不完全胚生殖。此类方法和组合物在本文其他地方进一步详细讨论。在不定胚生殖(孢子体单性生殖)中，胚从胚囊外部胚珠内的体细胞组织直接形成。换句话讲，胚不从配子体，而是例如从珠心和/或珠被组织形成。在不完全胚生殖中，胚发育是不完全的。在一些实施例中，这可指示缺乏胚柄。在其他实施例中，这可指示停留在成熟之前的胚发育阶段。在其他实施例中，这可指示缺乏球形头部、子叶或其他胚器官。

表1

II.编码RKD多肽的序列

本发明提供了促进胚囊外部的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态的方法和组合物。通过增加至少一个RKD多肽在不位于胚囊中的未减数胚珠植物细胞中的表达，在未减数胚珠植物细胞中产生所述卵细胞样状态。

如本文所用，“RKD”或“含RWP-RK域”多肽是指充当卵细胞相关基因表达程序的调控子并且包含RWP-RK域的蛋白种类。RKD蛋白在功能上与bZIP转录因子的碱性基序类似。各种RKD多肽的结构是已知的，并且RKD基因已经在包括卷柏属(Selaginella sp.)、葡萄(Vitis vinifera)、杨属(Populus sp.)、水稻(Oryza sativa)、玉蜀黍(Zea mays)和大麦(Hordum vulgare)的多种植物中鉴定。例如，拟南芥的RKD家族包括至少五个成员：AtRKD1(Atg18790)、AtRKD2(At1g74480)、AtRKD3(At5g66990)、AtRKD4(At5g53040)和AtRKD5(At4g35590)。参见图1，其提供了来自拟南芥和小麦的已知RKD多肽的比对。提供了利用具有RKD活性的多核苷酸和多肽的多种方法和组合物。此类RKD多肽包含SEQ ID NO：12、14、16、18和32的任何一者中示出的那些，及其生物活性变体和片段。还提供了编码这些不同多肽及其活性变体和片段的多核苷酸(SEQ ID NO：11、13、15、17和31)。

如本文所用，“RKD活性”包括调控卵细胞基因表达的多肽。如本文所用，具有“RKD活性”的多肽包含RKD多肽或其活性变体或片段，所述RKD多肽或其活性变体或片段保留足够RKD活性，使得(i)所述多肽具有转录调控活性；(ii)当在未减数胚珠植物细胞中以足够水平表达时，所述多肽使转录状态改变为卵细胞样转录状态和/或(iii)当在宿主植物细胞中表达时，所述多肽增加了可操作连接至卵细胞启动子的标记基因的表达，所述卵细胞启动子包括例如卵细胞优选启动子，包括At1g60530、At3g63320、At1g66610或AT1g53930或者本文其他地方公开的其他卵细胞优选启动子。测定此类活性的方法是已知的。参见例如Koszegi，et al.，(2011)PlantJournal Accelerated article，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x(Koszegi等人，2011年，《植物杂志》，加快论文，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x)，该文献以引用方式并入本文。在卵细胞样转录状态中表达的雌配子体特异性标记基因的非限制性例子包括但不限于雌配子体特异性表达基因AT1G18770(MYB98)、AT1G26795(自交不亲和性蛋白相关)、AT2G20070(未知)、at4g25530(同源盒蛋白，fwa)和at5g40260(结瘤素mtN3家族蛋白)。参见Koszegi，et al.，(2011)Plant JournalAccelerated article，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x(Koszegi等人，2011年，《植物杂志》，加快论文，doi：101111/j.1365-313x.2011.04592.x)。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”多核苷酸或多肽或其生物活性部分，实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或蛋白质的天然环境中存在的、与该多核苷酸或多肽相伴随或相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或多肽，当通过重组技术产生时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最优的是，“分离的”多核苷酸不含在得到该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳的是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施例中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。实质上不含细胞物质的多肽包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染性蛋白质的多肽的制备物。当本发明的多肽或其生物活性部分用重组法生产时，最佳的是，培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白的化学品。

如本文所用，当为人工的或工程化的，或来源于人工的或工程化的蛋白质或核酸时，多核苷酸或多肽是“重组的”。例如，插入载体或任何其他异源位置中(如重组生物体的基因组中)使得其不按照天然存在的那样与通常在所述多核苷酸旁侧的核苷酸序列相关联的多核苷酸是重组多核苷酸。由重组多核苷酸体外或体内表达的多肽是重组多肽的例子。同样，天然不存在的多核苷酸序列，例如天然存在的基因的变体是重组的。

“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞表型变化的参照点，并且可以是任何合适的植物或植物细胞。对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型或天然植物或细胞，即具有与用于进行导致受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)遗传上与受试植物或植物细胞相同但未暴露于与受试植物或植物细胞相同的处理(如，除草剂处理)的植物或植物细胞；或者(e)处于其中目的基因不表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。

A.RKD序列的活性片段和变体

如上文所讨论，提供了利用具有RKD活性的多核苷酸和多肽的方法和组合物。还涵盖了RKD多核苷酸和多肽的片段和变体。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列以及因此的蛋白的一部分。多核苷酸的片段可编码保留RKD活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20种核苷酸、约50种核苷酸、约100种核苷酸直至编码RKD多肽的全长多核苷酸的范围内。

编码RKD蛋白质的生物活性部分的RKD多核苷酸片段将编码至少50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、410、415、420、425、430、435或440个连续氨基酸或最多至全长RKD多肽中存在的氨基酸总数。

因此，RKD多核苷酸的片段可编码RKD多肽的生物活性部分。RKD多肽的生物活性部分可通过分离RKD多核苷酸中的一者的一部分，表达RKD多肽的编码部分(如，通过体外重组表达)，以及评估RKD蛋白的RKD部分的活性来制备。为RKD核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续核苷酸或最多至本文所公开的全长RKD多核苷酸中存在的核苷酸数目。

“变体”蛋白旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失(即，在5′和/或3′末端截短)和/或缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从该蛋白质衍生的蛋白质。所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性，即具有RKD活性。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。

“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含具有5′和/或3′末端缺失(即，截短)和/或天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处的一种或多种核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中一个或多个位点处的一种或多种核苷酸的置换的多核苷酸。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码RKD多肽中的一者的氨基酸序列。诸如这些的天然存在的变体可用公知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变或基因合成产生但仍编码RKD多肽的多核苷酸。

通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数测定，RKD多肽(以及编码其的多核苷酸)的生物活性变体将与任何RKD多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，所述RKD多肽包括SEQ ID NO：12、14、16、18和32中的任何一者的多肽。

通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数测定，RKD多核苷酸的生物活性变体将与编码RKD多肽的任何多核苷酸具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，所述RKD多核苷酸包括SEQ ID NO：11、13、15、17或31中的任何一者的多肽。

RKD多肽及其活性变体和片段可以多种方式改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，RKD蛋白的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》，麦克米伦出版公司，纽约)以及其中所引用的参考文献。有关不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可见于Dayhoff，et al.，(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)的模型，将这些专利和文献以引用方式并入本文。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。

显然，将在编码该变体的DNA中所作的突变一定不能将序列设置在阅读框外，并且优选将不会生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见第75,444号欧洲专利申请公开。

变体多核苷酸和蛋白还涵盖由诱变和重组工程方法(如DNA改组)获得的序列和蛋白。用这种程序，可操纵一个或多个不同的RDK编码序列以产生具有所需性质的新的RKD多肽。以此方式，从一组相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列多核苷酸包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区。例如，使用该方法，可将编码目的结构域的序列基序在本文公开的RKD序列和其他已知RKD基因之间进行改组，以获得编码具有改进的目标性质(如在酶的情况中为降低的K_m)的蛋白质的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer，(1994)Nature370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameri，et al.，(1998)Nature391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)和美国专利No.5,605,793和5,837,458。

III.胚珠组织优选启动子

在种子植物中，胚珠是产生并且包含雌性生殖细胞的结构。在发育早期，其由三个部分组成：形成其外层的珠被、珠心(或大孢子囊)和珠柄。珠心产生大孢子母细胞，其在大孢子发生期间经历减数分裂形成大孢子。在蓼(Polygonum)型胚囊发育中，三个大孢子降解，一个变为功能性大孢子。在大配子体发生期间，功能性大孢子(蓼型胚囊)经历三轮合胞有丝分裂变为八核细胞。细胞化在进一步发育期间出现，产生成熟胚囊，所述胚囊包括卵、助细胞、反足细胞和中央细胞，在典型的蓼型胚囊发育中所述中央细胞具有两个极核。在一些物种(玉蜀黍(Zea spp.))中，反足细胞还可分裂而变成多个。因此，如本文所用，胚珠最初由产生雌配子体的单倍体组织的未减数组织构成。雌配子体进一步发育为由如下四种独特细胞类型构成的“成熟卵囊”：一个卵细胞、中央细胞、两个助细胞以及三个或更多个反足细胞。

各种类型的启动子可用于本文提供的方法和组合物。启动子可以细胞类型优选、细胞类型特异性、组织优选或组织特异性的方式驱动表达。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织(如叶、根、种子或胚珠)中起始转录的启动子。这种启动子称为“组织优选的”。仅在某些组织中起始转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”优选启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根、叶或胚珠中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“抑制型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性的、细胞类型优选的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。

如本文所用，“胚珠组织优选启动子”包括当与其未可操作连接至胚珠组织优选启动子时的表达水平比较时，在植物的至少一个或所有未减数胚珠组织(包括例如珠被和珠心)中有优势活性的启动子。因此，虽然在其他植物组织类型中可出现可操作连接的异源核苷酸序列的一定水平的表达，但在胚珠体细胞组织中出现的表达最为丰富。

在具体实施例中，利用胚珠组织优选启动子，该启动子“在植物胚珠中的至少一个非配子体组织中有活性”。此类启动子在胚囊外部的植物胚珠的未减数体细胞中将有活性。此类启动子可以仅在胚珠的非配子体组织中有活性，或者启动子在除至少一个其他胚珠组织/结构之外的配子体组织中也可显示出活性。能够以此方式引导表达的启动子的非限制性例子包括SEQ ID NO：1或2中示出的拟南芥NUC1启动子区；SEQ ID NO：3或4中示出的拟南芥CYP86C1启动子区；SEQ ID NO：5中示出的拟南芥PPM1启动子区；SEQ ID NO：6中示出的拟南芥EXT启动子区；SEQ ID NO：7中示出的拟南芥GILT1启动子区；SEQ ID NO：8中示出的拟南芥TT2启动子区；SEQ ID NO：9中示出的拟南芥SLV3启动子区以及SEQ ID NO：33中示出的拟南芥启动子AT1G24540(AT-CP450-1-PRO)或其活性变体和片段。在具体实施例中，所用的启动子是胚珠特异性启动子。

启动子AT NUC1(AT4G21620；基因库：CP002687.1(bps.11496827-11495501)，GENE ID：828249；也称为F17L22.80；F17L22_80；SEQ IDNO：1和2)启动子显示出于受精前内珠被的珠孔端中的表达模式。表达进一步合点地(chalazally)扩散穿过内珠被，以围绕胚囊的珠孔所在半部。在发育晚期，表达从珠孔内珠被过渡到合点珠被。表达出现于授粉前几天到授粉后几天。在心形胚期，表达仅在相对于合点端的珠被处观察到。图1提供了AT NUC1启动子的表达模式。另参见美国专利申请公布2011/0107458A1，其以引用的方式并入本文。

启动子AT CYP86C1(AT1G24540；基因库：CP002684.1(bps8697732-8699750)；其他名称：F21J9.20；SEQ ID NO：3或4)显示出受精前于内珠被的珠孔端中的表达模式。表达合点地扩散穿过内种皮(内珠被的最内层)，以围绕胚囊的珠孔基部，然后表达合点地扩散穿过整个内种皮层。表达出现于授粉前几天到授粉后几天。图2至10提供了CYP86C1启动子的表达模式。

启动子AT PPM1(AT5G49180；基因库：CP002688.1(bps19943368-19942879)；其他名称：K21P3.5，K21P3_5；SEQ ID NO：5)显示出两种类型的表达模式。第一，AT PPM1启动子显示出在珠孔内珠被和外珠被中，但除外珠被的表皮层的表达模式。第二种类型表达模式是如上所述在珠孔内和外珠被中，但表达合点地延伸穿过内珠被和外珠被(非表皮层)以围绕整个胚囊，但除合点珠心之外。胚囊内未观察到表达。图11提供了ATPPM1启动子的表达模式。另参见美国专利No.7,179,904、美国专利No.7,402,667、WO2006/005023、WO2006/066134、WO2006/076099、WO2007/075172、WO2007/078286和WO2006/08102以及Louvet，et al.，(2006)Planta224：782-791(Louvet等人，2006年，《植物》，第224卷，第782-791页)，这些参考文献中的每个均以引用方式并入本文。

启动子AT SVL3(AT3G20520；基因库登录号NM_112944；也称为K10D20.6、SHV3-LIKE3、SVL3；SEQ ID NO：9)显示出在大配子体发生过程的早期开始的表达模式。在四核大配子体期，表达最初在珠孔内和外珠被中较强，且遍布整个胚珠的珠被。在发育晚期合子期，胚乳和胚也显示出表达。因此，在除珠柄之外的整个胚珠可观察到表达。图12提供了AT-SVL3启动子的表达模式。先前表达数据限于6周龄长角果中的表达。参见Hayashi，et al.，(2008)Plant Cell Physiol.49：1522-1535(Hayashi等人，2008年，《植物细胞生理学》，第49卷，第1522-1535页)，其以引用的方式并入本文。

启动子AT EXT(AT3G48580；基因库CP002686.1，bps18004981-18007235；也称为T8P19.90、XTH11、葡聚木糖内转葡糖基酶/水解酶11；SEQ ID NO：6)显示出围绕胚囊的珠孔端的内珠被和外珠被的最内层中的表达模式。此外，在一个例子中，单个细胞(外珠被的最内层)显示出强表达。AT EXT的表达模式在图13中示出。

在植物胚珠中的至少一个非配子体组织中有活性的另外的胚珠组织优选启动子包括启动子AT GILT1(SEQ ID NO：7；AT4G12890；基因库CP002686.1(bps7545227-7546409)；其他名称：T20K18.240、T20K18-240。另参见美国专利No.7,179,904、美国专利No.7,402,667、美国专利No.7,169,915、WO2006/005023、WO2006/066134、WO2006/076099、WO2007/075172、WO2007/078286、WO2006/081029和WO2002/016655以及Lovet，et al.，(2006)Planta224：782-791(Louvet等人，2006年，《植物》，第224卷，第782-791页)。另外的启动子包括AT TT2(SEQ IDNO：8；AT5G35550；基因库登录号AJ299452；也称为透明种皮2(Transparent Testa2)、ATMYB123、AT TT2、MOK9.18、MOK9_18、MYB域蛋白123(MYB DOMAIN PROTEIN123)、MYB123、TT2)。另参见WO2006/031779；美国专利No.6,972,197；WO2000/055325以及Gonzalez，et al.，(2009)Developmental Bio352(2)：412-421(Gonzalez等人，2009年，《发育生物学》，第352卷，第2期，第412-421页)。另外的启动子包括SEQ ID NO：33中示出的拟南芥启动子AT1G24540或其活性变体和片段。

因此，所述方法和组合物包括分离的多核苷酸，其包含上文公开的胚珠组织优选启动子；以及在植物胚珠中的至少一个非配子体组织中有活性的任何胚珠组织优选启动子。此类序列包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的启动子核苷酸序列。所谓“启动子”是指这样的DNA调控区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点处起始RNA合成的TATA框。启动子可以另外包含通常位于TATA框的上游或5′的其他识别序列，称为上游启动子元件，它们影响转录起始速率。本文所公开的启动子序列调控(即，活化)从启动子区的转录。

已经认识到，另外的域可添加到本文所公开的启动子序列，从而调节表达水平、表达的发育时机、或在其中发生表达的组织类型。参见特别是澳大利亚专利No.AU-A-77751/94和美国专利No.5,466,785和5,635,618。

还提供了胚珠组织优选启动子多核苷酸中的每一者的片段和变体。启动子多核苷酸的片段可保留生物活性，从而保留转录调控活性。因此，启动子核苷酸序列的片段可在至少约20种核苷酸、约50种核苷酸、约100种核苷酸直至本发明的全长多核苷酸的范围内。因此，胚珠组织优选启动子多核苷酸的片段可编码胚珠组织优选启动子的生物活性部分。胚珠组织优选启动子多核苷酸的生物活性部分可通过分离胚珠组织优选启动子多核苷酸的一者的一部分，以及评估胚珠组织优选启动子的所述部分的活性来制备。作为胚珠组织优选多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2000种核苷酸或最多至本文所公开的全长胚珠组织优选启动子多核苷酸中存在的核苷酸数目。

对于启动子多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一种或多种核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一种或多种核苷酸的置换。通常，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数测定，特定胚珠组织优选启动子的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

可以修饰本文利用的任何启动子序列以提供所述异源核苷酸序列的一系列表达水平。因此，可以利用小于完整的启动子区，并且驱动目的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可以按不同方式缺失启动子序列的部分，改变mRNA的表达水平。如果(例如)在截短过程中移除(阻遏蛋白的)负调控元件，则因启动子的缺失，可以降低mRNA表达水平，或者可以增加表达。通常，分离的启动子序列的至少约20种核苷酸将用于驱动核苷酸序列的表达。

变体多核苷酸还涵盖从诱变和诱重组方法(如DNA改组)得到的序列。通过此类步骤，可操作一个或多个不同的启动子序列以形成具有所需性质的新胚珠组织优选启动子。此类DNA改组策略在本文其他地方有所描述。

本领域中可获得用于确定启动子序列是否保留以所需时间和空间模式调控转录的能力的方法。此类活性可通过RNA印迹分析测量。参见例如Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州普莱恩维)，将其以引用方式并入本文。或者，启动子的生物活性可使用特别设计用于测量从启动子表达的多肽的活性和/或水平的测定法来测量。此类测定法是本领域已知的。

IV.表达构建体

本发明提供方法和组合物以增加RKD多肽在胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的活性/水平。在具体实施例中，对所述RKD多肽的活性/水平的此类调节促进所述胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。此类方法和组合物可采用包含RKD多肽或其活性变体或片段的表达构建体，所述RKD多肽或其活性变体或片段可操作连接至胚珠组织优选启动子，尤其是在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性并且在胚囊外的未减数细胞中有活性的胚珠组织优选启动子。

表达盒可包括可操作连接至RKD编码多核苷酸或其活性变体或片段的5′和3′调控序列。“可操作连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，所关注的多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的可操作连接是可使该所关注多核苷酸得以表达的功能连接。可操作连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓可操作连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以额外地含有至少一个待共转化入生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因。这种表达盒提供有多个限制性位点和/或重组位点，以使RKD编码多核苷酸的插入处于胚珠组织偏性启动子的转录调控之下。表达盒可另外含有选择性标记基因。

在5′-3′方向的转录中，表达盒将包括胚珠组织优选启动子或其活性变体或片段、RKD编码多核苷酸或其活性变体或片段，以及在宿主细胞(即，植物)中有功能的转录和翻译终止区(即，终止区)。调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或RKD编码多核苷酸对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是天然的/同功的。或者，调控区和/或RKD编码多核苷酸或其活性片段和变体对于宿主细胞或彼此之间而言可以是异源的。

如本文所用，指涉序列的“异源”，为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作连接至异源多核苷酸的启动子来自与衍生这种多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/相似的物种，则一者或者两者从它们的原始形式和/或基因座经实质修饰而获得，或者该启动子不是用于可操作连接的多核苷酸的天然启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区可操作连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。

终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对可操作连接的RKD编码多核苷酸或对胚珠组织优选启动子序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、RKD编码多核苷酸、植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot，(1991)Cell64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon，et al.，(1991)GenesDev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen，et al.，(1990)Plant Cell2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe，et al.，(1990)Gene91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)以及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。

因此，提供了包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体，其中所述胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性，并且所述胚珠组织优选启动子在植物胚囊外的未减数胚珠细胞中有活性。在又一些实施例中，在表达构建体中编码RKD多肽的多核苷酸编码SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽，或其编码与SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保留RKD活性。

此外，具有RDK编码多核苷酸或其活性变体或片段的构建体可以可操作连接至胚珠组织优选启动子，所述启动子包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸或与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力。

在另一些实施例中，表达构建体包含(i)在SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸，其可操作连接至编码SEQ ID NO：14中示出的多肽的多核苷酸序列或(ii)与SEQ ID NO：1或3中示出的序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力，并且所述多核苷酸可操作连接至与SEQ ID NO：14中示出的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保留RKD活性。

如果适当，可对多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主优选的密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物优选性基因的方法。参见例如美国专利No.5,380,831和5,436,391以及Murray，et al.，(1989)NucleicAcids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)(以引用的方式并入本文)。

已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie，et al.，(1995)Gene165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Johnson，etal.，(1986)Virology154：9-20(Johnson等人，1986年，《病毒学》，第154卷，第9-20页))和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，et al.，(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列(Jobling，et al.，(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，et al.，(1989)in Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑，Liss，纽约，第237-256页))和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，et al.，(1991)Virology81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。另参见Della-Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。也可利用其他已知的增强翻译的方法，例如内含子等等。

在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(例如转换和颠换)。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因被利用于转化细胞或组织的选择。选择性标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su，et al.，(2004)Biotechnol Bioeng85：610-619(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)和Fetter，et al.，(2004)Plant Cell16：215-228)(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science117：943-954(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato，etal.，(2002)Plant Physiol129：913-942(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science117：943-954(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标记，一般参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao，et al.，(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff等人，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley，et al.，1980)The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，《操纵子》，第177-220页)；Hu，et al.，(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown，et al.，(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge，et al.，(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle，et al.，(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，(1993)博士论文，海德堡大学(University of Heidelberg)；Reines，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，(1993)博士论文，海德堡大学)；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill，et al.，(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。可使用任何选择性标记基因。

还认识到，除RKD表达构建体之外的各种表达构建体在本文中有所描述。例如，具有编码标记物序列、细胞毒性多肽和胚诱导性多肽的序列的表达构建体在本文中也有所描述。技术人员将会知道如何将上述讨论的语言应用于任何表达构建体。

V.编码胚诱导性多肽的序列

本发明提供方法和组合物以增加RKD多肽在胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的活性/水平。在具体实施例中，对所述RKD多肽的活性/水平的此类调节促进胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。如上文所讨论，此类方法和组合物利用包含可操作连接至胚珠组织优选启动子的RKD编码多核苷酸的表达构建体。此类方法和组合物还可与编码胚诱导性多肽的其他序列组合使用。

如本文所用，“胚诱导性多肽”包含当与可操作连接至胚珠组织优选启动子的RKD编码多肽组合表达时还促进卵细胞样状态的发育(包括还促进卵细胞样转录状态，促进卵细胞样结构的发育，促进不定胚生殖和/或促进不完全不定胚生殖)的任何序列。此类胚诱导性多肽可通过触发发育程序来促进生长。

此类胚诱导序列包括但不限于：体细胞胚发生受体样激酶(SERK)(Schmidt，et al.，(1997)Development124：2049-62(Schmidt等人，1997年，《发育》，第124卷，第2049-2062页))、Wushel(WUS)(Zuo，et al.，(2001)The Plant Journal30：349-359(Zuo等人，2001年，《植物杂志》，第30卷，第349-359页))、LEC多肽家族(包括Leafy Cotyledonl(LEC1)(Lotan，et al.，(1998)Cell93：1195-1205(Lotan等人，1998年，《细胞》，第93卷，第1195-1205页))和Leafy Cotyledon2(LEC2)(Stone，et al.，(2001)PNAS98：11806-11811(Stone等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第11806-11811页)))、Baby Boom(BBM)(Boutilier，et al.，(2002)Plant Cell14：1737-1749(Boutilier等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页))和Agamous样15(Harding，et al.，(2003)Plant Physiol.133：653-663(Harding等人，2003年，《植物生理学》，第133卷，第653-663页))、EMBRYOMAKER(EMK)(Tsuwamoto，et al.，(2010)Plant Molecular Biology73：481-492(Tsuwamoto等人，2010年，《植物分子生物学》，第73卷，第481-492页))。

在特定实施例中，胚诱导性序列参与器官发育、顶端分生组织的起始和/或发育。此类序列包括例如Wuschel(WUS)或其活性变体和片段。参见美国专利No.7,348,468和7,256,322以及美国专利申请公布No.2007/0271628；Laux，et al.，(1996)Development122：87-96(Laux等人，1996年，《发育》，第122卷，第87-96页)和Mayer，et al.，(1998)Cell95：805-815(Mayer等人，1998年，《细胞》，第95卷，第805-815页)，将这些文献中的每个以引用方式并入本文。对WUS的调节预期能调节植物和/或植物组织表型，包括细胞生长刺激、器官发生和体细胞胚发生。WUS还可用来通过体细胞胚发生来改进转化。拟南芥WUS的表达可诱导营养组织中的干细胞，其可分化成体细胞胚(Zuo，et al.，(2002)Plant J30：349-359(Zuo等人，2002年，《植物杂志》，第30卷，第349-359页))。

在又一个实施例中，MYB118基因(参见美国专利No.7,148,402)、MYB115基因(参见Wang，et al.，(2008)Cell Research224-235(Wang等人，2008年，《细胞研究》，第224-235页))、BABYBOOM基因(BBM；参见Boutilier，et al.，(2002)Plant Cell14：1737-1749(Boutilier等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页))、LEC和/或CLAVATA基因(参见例如美国专利No.7,179,963)与包含至少一个RKD家族成员多肽的至少一个表达盒共表达。

在具体实施例中，胚诱导性序列编码Leafy Cotyledon多肽(LEC)或其活性变体或片段。LEC家族转录因子参与发育早期阶段的胚成熟和功能，以维持胚细胞命运，并且显示出促进胚样结构的形成。参见例如Lotan，etal.，(1998)Cell93：1195-1205(Lotan等人，1998年，《细胞》，第93卷，第1195-1205页)；Braybrook，et al.，(2008)Trends in Plant Science13：624-630(Braybrook等人，2008年，《植物科学趋势》，第13卷，第624-630页)；Stone，(2001)PNAS98：11806-11811(Stone，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第11806-11811页)；Gazzarrini，et al.，(2004)DevCell7：373-385(Gazzarrini等人，2004年，《发育细胞》，第7卷，第373-385页)；Gai，et al.，(2005)Planta222：977-988(Gaj等人，2005年，《植物》，第222卷，第977-988页)；Wang，et al.，(2007)Planta226：773-783(Wang等人，2007年，《植物》，第226卷，第773-783页)。

BABY BOOM(BBM或BNM3)或其活性变体和片段显示出与AP2/ERF家族转录因子的类似性，并且在发育中的胚和种子中优先表达。BBM在植物中的异位表达导致幼苗上的体细胞胚和子叶样结构的自发形成。BBM异位表达诱导另外的多效表型，包括赘生性生长、外植体的无激素再生以及叶和花形态的改变。BBM在胚发生期间起到促进细胞增殖和形态发生的作用。参见Boutilier，et al.，(2002)Plant Cell14：1737-1749(Boutilier等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页)和EP1057891(A1)，它们二者均以引用方式并入本文。

其他胚诱导性多肽包括环指蛋白的ARIADNE亚类成员。参见例如Jackson，et al.，(2000)Trends Cell Biol.10：429-439(Jackson等人，2000年，《细胞生物学趋势》，第10卷，第429-439页)和Mladek，et al.，(2003)Plant Physiol.131：27-40(Mladek等人，2003年，《植物生理学》，第131卷，第27-40页)，它们二者均以引用方式并入本文。ARIADNE蛋白属于酵母、植物和动物中存在的E3连接酶家族，并且被认为参与泛素依赖性蛋白降解的控制(在Vierstra，(2003)Trends Plant Sci.8：135-142(Vierstra，2003年，《植物科学趋势》，第8卷，第135-142页)中作了综述)。ARIADNE基因家族的一个成员是ARIADNE7(ARI7)。参见例如Schallan，et al.，(2010)The Plant Journal62：773-784(Schallan等人，2010年，《植物杂志》，第62卷，第773-784页)，该文献以引用方式并入本文。

如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数测定，胚诱导性多肽(以及编码其的多核苷酸)的生物活性变体将与包括但不限于如下的任何胚诱导性多肽具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性：SERK、Wushel(WUS)、LEC多肽家族、Baby Boom(BBM)和agamous样15中任一者的多肽。

因此，可操作连接至胚珠组织优选启动子的RKD编码多核苷酸还可与目的多核苷酸序列(尤其是编码胚诱导性多肽的序列)的任何组合进行堆叠。此类堆叠可发生在同一个的表达盒内或两个不同的序列可单独引入植物。所需的堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或TopCross方法或者遗传转化来对植物进行杂交育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如，WO1999/25821、WO1999/25854、WO1999/25840、WO1999/25855和WO1999/25853，上述专利以引用的方式并入本文。

技术人员将认识到，编码胚诱导性多肽的序列可置于表达盒内。表达盒在本文其他地方讨论。任何目的启动子均可可操作连接至编码胚诱导性多肽的序列，包括例如组成型启动子、组织优选启动子、组织特异性启动子、胚珠组织优选启动子、在植物胚珠中的至少一个非配子体组织有活性的胚珠组织优选启动子、种子优选、胚优选和/或胚乳优选启动子。多个此类启动子已在本文其他地方描述。

组成型启动子的非限制性例子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和WO1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页))和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBOJ.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等等。其他组成型启动子包括(例如)美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。

“种子优选”启动子包括“种子特异性”启动子(那些在种子发育期间活跃的启动子，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些在种子萌发期间活跃的启动子)。参见Thompson，et al.，(1989)BioEssays10：108(Thompson等人，1989年，《生物测定法》，第10卷，第108页)，将该文献以引用的方式并入本文。这类种子优选启动子包括但不限于Ciml(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO2000/11177和美国专利No.6,225,529，这些专利以引用方式并入本文)。HV-NUC1是大麦珠心特异性启动子。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)基因启动子是代表性的胚芽特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米蛋白基因启动子、22kDa玉米蛋白基因启动子、27kDa玉米蛋白基因启动子、γ-玉米蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。另参见WO2000/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子，该专利以引用方式并入本文。可用于表达胚诱导性多肽的其他特异性启动子包括但不限于：AT-SVL3PRO、AT-EXT PRO、AT-GILT1PRO、AT-PPM1PRO、AT-TT2PRO、AT-BAN1PRO、AT-DD1PRO。

VI.编码细胞毒性多肽的序列

如上文所讨论，本发明提供方法和组合物以增加RKD多肽在胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的活性/水平。在具体实施例中，对所述RKD多肽的活性/水平的此类调节促进胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。此类状态的发育(即，转录卵细胞样状态或卵细胞外部的组织和亚结构中胚样结构的发育，包括此类结构在适于不定胚生殖的任何组织和亚结构中的形成)可通过进一步利用以允许靶细胞死亡或胚囊的特定细胞类型消融的方式表达的细胞毒性多肽来改善。在具体实施例中，至少卵细胞被消融。

在具体实施例中，植物胚珠中的卵细胞被特异性消融，从而防止形成合子胚。由于仅消融卵细胞，中央细胞的受精以及一些程度的胚乳发育应是可能的。防止形成合子胚允许使用合成无孢子生殖方法产生自我繁殖杂交植物或克隆繁殖植物。即，不形成合子胚，而是通过如本文所公开的RDK多肽的表达从胚珠中的非减数细胞形成不定胚。

因此，此类消融卵细胞的方法可与表达构建体组合使用，所述表达构建体包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子，其中所述胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性，并且所述胚珠组织优选启动子在植物胚囊外的未减数胚珠细胞中有活性。

多种细胞毒性多肽可用于靶细胞死亡或胚囊特定细胞类型的消融。除如下所述的细胞毒素序列之外，其他可能的细胞毒素包括：α淀粉酶、其他核酸酶；使卵细胞发育和/或任何蛋白质或核酸表达所需的靶基因发生基因沉默的任何方法已知可导致细胞死亡。也可使用消融卵细胞的另外方法和组合物，包括例如杂交到植物中的胚致死突变。

此类细胞毒性多肽包括芽孢杆菌RNA酶(Barnase)(“细菌”“核糖核酸酶”的混成词)，它是细菌蛋白，由110个氨基酸组成，具有核糖核酸酶活性。芽孢杆菌RNA酶多肽的非限制性例子在SEQ ID NO：23中示出。应注意，INT是指ST-LS1INTRON2添加。也可使用其活性片段和变体，其中所述活性片段和变体保留它们在其中表达的细胞中的细胞毒活性。芽孢杆菌RNA酶由细菌解淀粉芽孢杆菌http：//en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_amyloliquefaciens合成和分泌，但表达时若不含其抑制剂芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)，对细胞是致死的。该抑制剂结合并关闭核糖核酸酶活性位点，防止芽孢杆菌RNA酶在合成后但分泌之前破坏细胞的RNA。参见例如Buckle，et al.，(1994)Biochemistry33(30)：8878-8889(Buckle等人，1994年，《生物化学》，第33卷，第30期，第8878-8889页)；Serrano，et al.，(1992)J.Mol.Biol.224(3)：783-804(Serrano等人，1992年，《分子生物学杂志》，第224卷，第3期，第783-804页)；Serrano，et al.，(1992).J.Mol.Biol.224(3)：805-818(Serrano等人，1992年，《分子生物学杂志》，第224卷，第3期，第805-818页)；Matouschek，et al.，(1992)J.Mol.Biol.224(3)：819-835(Matouschek等人，1992年，《分子生物学杂志》，第224卷，第3期，第819-835页)；Mossakowska，et al.，(1989)Biochemistry28(9)：3843-3850(Mossakowska等人，1989年，《生物化学》，第27卷，第9期，第3843-3850页)；Gils，et al.，(2008)Plant Biotechnology Journal6：226-235(Gils等人，2008年，《植物生物技术杂志》，第6卷，第226-235页)和Kempe，et al.，(2009)Plant Biotechnology Journal7：283-297(Kempe等人，2009年，《植物生物技术杂志》，第7卷，第283-297页)。

可用的另外细胞毒素包括但不限于SEQ ID NO：24中示出的Dam甲基化酶或其活性变体或片段、或Dam甲基化酶内含肽断裂：DMETH N端(SEQ ID NO：25)、INTE-N(SEQ ID NO：26)、INTE-C(SEQ ID NO：27)、DMETH C端(SEQ ID NO：28)或其活性变体或片段；或ADP核糖基化酶多肽(SEQ ID NO：29)或其活性变体或片段。

操纵受精和/或种子发育的细胞消融可包括例如本文所公开的一种或多种细胞类型特异性启动子的使用。因此，技术人员将认识到编码细胞毒性多肽的序列可置于表达盒内。表达盒在本文其他地方讨论。任何目的启动子均可可操作连接至编码细胞毒性多肽的序列，只要启动子引导细胞毒性多肽在期望消融的细胞类型中表达。单独的启动子将可特别用于细胞消融以防止花粉管吸引而受精(助细胞消融，DD31或DD2)；防止有性胚形成(卵细胞消融，DD45)和/或防止胚乳形成(中央细胞消融，DD65)。此类启动子包括例如胚囊优选启动子或胚囊特异性启动子，包括卵细胞优选启动子。当卵细胞优选启动子可操作连接至编码细胞毒性多肽的序列时，此类卵优选启动子在中央细胞或胚乳中不具有活性，因此这些组织得以保存。此类卵细胞优选启动子包括拟南芥启动子(AT-DD45PRO；在dif1(决定性不育基因1)下调的拟南芥；SEQ ID NO：10；At2g21740启动子)及其活性变体和片段。分析表明，该启动子对于卵细胞和合子/早期胚是特异性的，并且不在任何其他细胞类型中表达。当采用AT-DD45PRO表达细胞毒性多肽时，植物胚珠中的卵细胞将被特异性消融。参见Steffen，etal.，(2007)Plant J51(2)：281-292(Steffen等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第2期，第281-292页)。使用DD45启动子表达毒素(如，BARNASE)将导致卵细胞消融，并且防止合子胚形成。由于将仅消融卵细胞，中央细胞的受精以及一些程度的胚乳发育应是可能的。因此，此类构建体在与本文所公开的各种方法组合时，可用于合成的无孢子生殖的发育。

可用于表达细胞毒性多肽的另外胚囊优选启动子包括反足细胞优选启动子AT-DD1PRO(SEQ ID NO：41；dif1(决定性不育基因1)1下调；At1g36340)；助细胞优选启动子(AT-DD31PRO；SEQ ID NO：41；dif1(决定性不育基因1)1 31下调；At1g47470)；和/或中央细胞优选启动子(ATDD65PRO；SEQ ID NO：43)；dif1(决定性不育基因1)165下调；At3g10890)；Fem2(SEQ ID NO：30；中央细胞优选/极核优选)及其活性变体和片段。另参见名称为Ovule Specific Promoters and Methods of TheirUse(胚珠特异性启动子及其使用方法)的美国临时申请序列号_______，该专利申请与本文同时提交并且以引用方式整体并入本文，以及Steffen，et al.，(2007)The Plant Journal51：281-292(Steffen等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第281-292页)，该文献以引用方式并入本文。

VII.启动子的变体和片段

如本文所讨论，多种启动子可用于本文提供的方法和组合物，包括：表达编码胚诱导性多肽的序列和编码细胞毒性多肽的序列的启动子。可使用这些启动子多核苷酸的片段和变体。启动子多核苷酸的片段可保留生物活性，因此以未修饰的形式保留所需组织中的转录调控活性。因此，启动子核苷酸序列的片段可在至少约20种核苷酸、约50种核苷酸、约100种核苷酸直至全长启动子序列的范围内。因此，启动子多核苷酸的片段可编码启动子的生物活性部分。启动子多核苷酸的生物活性部分可通过分离启动子多核苷酸中一者的一部分并评估启动子的所述部分的活性来制备。作为多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2000种核苷酸或最多至本文所公开的全长启动子多核苷酸中存在的核苷酸数目。

对于启动子多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一种或多种核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一种或多种核苷酸的置换。通常，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所测定，本发明的特定启动子多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

本文其他地方描述了确定启动子序列是否保留以所需时间和空间模式调控转录的能力的方法。

应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本文所公开的启动子组合使用。增强子是起到增加启动子区的表达的作用的核苷酸序列。增强子是本领域知道的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。一些增强子还已知用来改变正常的启动子表达模式，例如通过造成启动子被组成型表达而改变正常的启动子表达模式，若没有该增强子，则该启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中被表达。

本文所公开的启动子的修饰可提供异源核苷酸序列的一系列的表达。因此，可以将它们修饰成弱启动子或者强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达意在指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反，强启动子以高水平或者说以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。

IIX.植物以及制备方法

本文公开的方法涉及将多肽或多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以多核苷酸或者多肽序列进入植物细胞内部的方式将多核苷酸或者多肽呈送到植物。本文公开的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。

“稳定转化”意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入植物中但它没有整合到植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。

转化规程以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程，可根据转化靶向的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入到植物细胞中的合适方法包括微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))，农杆菌(Agrobacterium)介导的转移(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)，直接基因转化(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速法(参见例如美国专利No.4,945,050；美国专利No.5,879,918；美国专利No.5,886,244和No.5,932,782；Tomes，et al.，(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，(施普林格，柏林))；McCabe，et al.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))以及Lecl转化(WO2000/28058)。另参见Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen，(1991)InVitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh，et al.，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉米)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，(朗文公司，纽约)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals ofBotany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)，全部上述专利文献以引用的方式并入本文。

在具体实施例中，可使用各种瞬时转化方法将本文公开的方法和组合物中采用的各种序列(如，RKD多肽、胚诱导性序列、细胞毒性多肽等)提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于将本文公开的方法和组合物中采用的各种序列(如，RKD多肽、胚诱导性序列、细胞毒性多肽等或其变体和片段)直接引入植物或将转录物引入植物。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway，et al.，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)；Nomura，et al.，(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush，et al.，(1994)The Journalof Cell Science107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有文献均以引用的方式并入本文。

或者，本文公开的方法和组合物中采用的各种序列(如，RKD多肽、胚诱导性序列、细胞毒性多肽等)可使用本领域已知的技术瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用聚乙烯亚胺(PEI；Sigma#P3143)涂覆的粒子。

在其他实施例中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内部。已经认识到，本文公开的方法和组合物中采用的各种序列(如，RKD多肽、胚诱导性序列、细胞毒性多肽等)可最初合成为病毒多聚蛋白的一部分，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。此外，应认识到，本文公开的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931和Porta，et al.，(1996)Molecular Biotechnology5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)，它们以引用方式并入本文。

用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见，例如，WO1999/25821、WO1999/25854、WO1999/25840、WO1999/25855和WO1999/25853，上述专利以引用的方式并入本文。简单而言，可将本发明的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧带有两个非重组产生的(non-recombinogenic)重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点两侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的非重组工程的重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。

用于在体内定向诱变的另外的方法是已知的。例如，具有所需的序列变化的DNA序列可在旁侧带有与基因组靶标同源的序列。然后可选择或筛选成功的同源重组事件。参见美国专利No.5,527,695。通常，此类载体构建体被设计为具有两个在具有所需序列的多核苷酸旁侧的与基因组靶标同源的区域。将载体引入植物细胞中将允许同源重组发生以及在靶位点处的同源区域之间产生序列的交换。

此类同源重组的方法还可与引起植物细胞中位点特异性的基因组双链断裂的试剂组合。此类双链断裂试剂可经基因工程改造在以在靶位点处产生断裂，从而增强同源重组事件。参见例如，Puchta，et al.，(1996)Proc NatlAcad Sci USA93：5055-5060(Puchta等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第5055-5060页)；美国专利申请公布No.2005/0172365A1；美国专利申请公布No.2006/0282914、WO2005/028942；2004年8月12日公布的WO2004/067736；美国专利No.5,792,632；美国专利No.6,610,545；Chevalier，et al.，(2002)Mol Cell10：895-905(Chevalier等人，2002年，《分子细胞》，第10卷，第895-905页)；Chevalier，et al.，(2001)Nucleic Acids Res29：3757-3774(Chevalier等人，2001年，《核酸研究》，第29卷，第3757-3774页)；Seligman，et al.，(2002)Nucleic Acids Res30：3870-3879(Seligman等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第3870-3879页)；美国专利申请公布No.2009/0133152和WO2005/049842，以上每个文献和专利以引用方式整体并入本文。

转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如，McCormick，etal.，(1986)Plant Cell Reports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。这些使这些植株生长，并用同一转化株或不同的株进行授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得子代。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。

本文所公开的方法和组合物可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物种类的例子包括(但不限于)：玉米(Zea mays)、芸苔(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树，如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)，和雪松，如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属物种、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。

其他目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属物种、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括荚果类(beans)和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。

IX.各种应用方法

提供用于促进胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态的方法。此类方法包括表达包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体，其中所述胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性，并且所述胚珠组织优选启动子在植物胚囊外的未减数胚珠细胞中有活性。此类方法促进胚囊外的至少一个未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态。在具体实施例中，本文公开的方法提供“卵细胞样状态”以进展到产生不定胚生殖或不完全胚生殖。

刺激器官发生和/或体细胞胚发生的能力可用来产生单性生殖的植物。单性生殖具有经济潜力，因为它能造成任何基因型(无论有多杂合)纯育。它是一个绕开雌性减数分裂和有性生殖来产生遗传上与母本相同的胚的繁殖过程。在单性生殖情况下，特别适应的或杂种的基因型的后代将在反复的生命周期中保持它们的遗传保真度。除了固定杂种活力之外，单性生殖还可使得有可能在没有有效的雄性不育或能育性恢复系统以供产生杂种的作物中进行商业性杂种生产。单性生殖可使杂种发育更有效。它还能在具有良好雄性不育的植物物种中简化杂种生产和提高遗传多样性。此外，在可能会危及授粉的胁迫(干旱、寒冷、高盐等)条件下，单性生殖可以是有利的。

在具体实施例中，在本文公开的方法中采用的编码的RKD多肽包含如在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽或其活性变体或片段。此外，胚珠组织优选启动子可包含在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸或其活性变体或片段。在另一些实施例中，表达构建体包含在SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸或其活性变体，所述多核苷酸或其活性变体可操作连接至编码在SEQ ID NO：14中示出的多肽或其活性变体或片段的多核苷酸序列。

另外的序列可用于方法中以促进卵样状态的形成。例如，来自胚珠组织优选启动子的RDK多肽的表达可与胚诱导性多肽的表达组合。此类胚诱导性多肽在本文其他地方进行了讨论并且包含BBM、WUS、LEC、MYB115、MYB118和/或RI7多肽或其活性变体。编码此类胚诱导性多肽的序列可可操作连接至任何启动子，包括例如胚珠组织优选启动子。

在另一些实施例中，RKD多肽与在表达时将消融胚囊内的至少一个细胞的第二多核苷酸组合表达。在非限制性例子中，第二表达构建体包含可操作连接至在表达时将消融胚囊内的至少一个细胞的多核苷酸的胚囊特异性启动子。胚囊优选启动子可为反足细胞优选启动子、助细胞优选启动子、卵细胞优选启动子或中央细胞优选启动子。而在其他实施例中，胚囊优选启动子为卵细胞优选启动子并且包含在SEQ ID NO：10中示出的多核苷酸或其活性变体或片段。

在本文其他地方讨论了可用于检测卵细胞样状态、卵细胞样转录状态、卵细胞样结构的发育、不定胚生殖和不完全不定胚生殖的各种方法和组合物。以此方式，可测定在植物胚珠组织(包括任何适于不定胚生殖的组织和亚结构)中的卵细胞样状态。

还提供了用于调节在植物胚珠的至少一个非配子体组织中的RKD多肽或其活性变体的浓度和/或活性的方法。在其他实施例中，RKD多肽的浓度和/或活性的调节发生在植物胚囊外的未减数胚珠细胞中。通常，相对于天然对照植物、植物部分或细胞，浓度和/或活性增加至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。本发明的调节可在植物生长至所需的发育阶段过程中和/或在其后发生。

在具体实施例中，调节(即，增加)RKD多肽或其活性变体或片段的浓度和/或活性的方法包括将编码所利用的RKD多肽的多核苷酸引入植物或植物细胞，所利用的RKD多肽包含如在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽或其活性变体或片段。在其他实施例中，将编码RKD多肽的序列可操作连接至胚珠组织优选启动子，其可包含在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸或其活性变体或片段。在又一些实施例中，用于调节RKD多肽水平的表达构建体包含在SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸或其活性变体，所述多核苷酸或其活性变体可操作连接至编码在SEQ ID NO：14中示出的多肽或其活性变体或片段的多核苷酸序列。

IX.胚珠组织优选启动子序列的另外的使用方法

当与DNA构建体装配使得启动子序列可操作连接至编码目的异源蛋白或RNA的异源多核苷酸时，本文公开的各种胚珠组织优选启动子序列以及其变体和片段可用于任何植物的基因操作。以此方式，胚珠组织优选启动子序列的核苷酸序列在表达盒中与用于在目的植物中表达的异源多核苷酸一起提供。

合成的杂合启动子区是本领域已知的。此类区包含一种核苷酸序列的上游启动子元件，所述核苷酸序列可操作连接至另一种核苷酸序列的启动子元件。在本发明的一个实施例中，通过合成的杂合启动子控制异源基因表达，该合成的杂合启动子包含可操作连接至来自异源启动子的上游启动子元件的本文公开的胚珠组织优选启动子序列或其变体或片段。

本文所公开的胚珠组织优选启动子序列和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。

目的基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，并且随着发展中国家面向世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些。

X.序列同一性

如下术语用来描述两条或更多条核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较序列”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质上相同”。

本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。

本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的片段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定，。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller，(1988)CABIOS4：11-17(Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith，et al.，(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的算法；Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法；Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的算法；Karlin and Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872：264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872卷，第264页)的算法，其在Karlin and Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了改进，将这些文献以引用方式整体并入本文。

这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类执行包括、但不限于：PC/Gene程序(可获自加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，Calif.))中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software版本10(可获自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys公司(Accelrys Inc.，9685ScrantonRoad，San Diego，Calif.，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins，et al.，(1988)Gene73：237-244(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；Higgins，et al.，(1989)CABIOS5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，etal.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-10890(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，et al.，(1992)CABIOS8：155-165(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)和Pearson，et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)，将这些文献以引用方式整体并入本文。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)(以引用方式整体并入本文)的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可利用Altschul，et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所述的Gapped BLAST(在BLAST2.0中)，将该文献以引用方式整体并入本文。或者，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人，1997年(出处同上)。当采用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。

除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。本文所用的“等同程序”是任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

GAP程序利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两条完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0至200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短片段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)，以引用方式整体并入本文)。

在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时该两条序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是(例如)如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，美国加州)中所执行那样进行计算。

本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。所述百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

术语多核苷酸序列的“实质同一性”是指多核苷酸与参考序列相比包含具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％序列同一性的序列，所述百分比是用比对程序采用标准参数得到。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常是指至少60％、70％、80％、90％和至少95％的序列同一性。

以下实例以说明性方式而不是以限制性方式提供。

实例

以下实施例进一步说明各实例，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。应理解，这些实例虽然说明本发明的各实施例，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实例，本领域技术人员可确定各实施例的必要特征，且在不背离各实施方案的精神和范围的情况下，对各实施方案作出各种变化和修改以适应各种用法和条件。因此，除了本文显示和描述的那些实施例之外，本领域技术人员由前文的描述将显而易见地知道各实施例的各种修改。这类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。

本文给出的每个参考文献的公开内容以引用方式整体并入本文。

实例1：AT NUC1修饰的启动子(ALT1)的活性

产生出PHP42329，以用GUS报告基因测试AT-NUC1PRO(ALT1)的表达模式。发现表达专门出现在胚珠中，且主要在珠孔端。表达也似乎出现在内珠被中。结果还表明，表达在种子发育的极早期局限于胚珠，且可见于雌蕊内。参见图1。

进一步更详细的工作证实，早在胚囊发育的4-8核成核期的受精之前，表达在珠孔端的内珠被中为特异性的。结果还表明，大多数胚珠在发育晚期在其合点端显示GUS表达。虽然到晚期球形胚期为止，表达在胚珠的珠孔端仍然显著，但表达也已移至合点端。在心形胚期，可在胚珠合点端的外珠被和内珠被中观察到显著的表达部分。在心形胚期，在珠孔珠被中还可观察到弱表达。

对于不定胚生殖和无孢子生殖而言珠孔表达是有利的，因为天然胚在胚囊的珠孔端形成。AT NUC1(ALT1)表达模式遍布助细胞和卵细胞且非常接近胚囊，尽管不在胚囊内。为证明作为AT NUC1启动子分离的DNA序列起到启动子的作用，进行了转基因拟南芥测定。这些测定提供了该所述DNA序列是否能够指导基因表达的快速评估。

实例2：包含连接至DS-Red报告基因(PHP43541)的AT-CYP86C1启 动子的表达盒的活性

产生出PHP43541，以用红色荧光蛋白报告基因测试AT-CYP86C1启动子的表达模式。启动子AT CYP86C1(AT1G24540)呈现出在卵期围绕胚囊的珠孔所在半部的内珠被的珠孔顶端中的表达模式。外珠被在外珠被的珠孔最末端处也显示出表达。表达出现于授粉前几天到授粉后几天。在从合子期到晚期球形胚期的发育期间，表达通过内种皮层(内珠被的最内层)朝着胚珠的合点端逐渐延展。到心形胚期为止，整个内种皮层显示表达(图2至10)。

实例3：包含连接至ZS-GREEN(PHP48047)的AT-PPM1启动子的表 达盒的活性

启动子AT PPM1(AT5G49180)呈现出两种不同类型的表达模式。第一，AT-PPM1启动子呈现出在内珠被和外珠被的珠孔最末端中(但不在外珠被的表皮层中)的表达模式。第二种类型的表达模式是第一种的延伸。不仅远珠孔内珠被和外珠被(表皮层除外)显示表达，而且表达合点地延伸以完全围绕整个胚囊。合点珠心不显示表达(图11)。

实例4：包含连接至GUS(PHP43542)的AT-SLVL3启动子的表达盒的 活性

启动子AT SVL3(AT3G20520)呈现出在大配子体发生过程的早期开始的表达模式。在四核大配子体期，表达最初在珠孔内珠被和外珠被中较强，且遍布整个胚珠的珠被。到合子期为止，表达的强度已在珠被组织中增加。另外，胚乳和胚现在显示弱表达。表达在珠柄中不存在(图12)。

实例5：包含连接至ZS-Green(PHP48049)的AT-EXT启动子的表达盒 的活性

启动子AT EXT(AT3G48580)呈现出在围绕胚囊的珠孔端的内珠被和外珠被的最内层中的表达模式。此外，在一个例子中，单个细胞(在珠孔端处的外珠被的最内层)显示出强表达。在胚囊内未观察到表达(图13)。

实例6：包含AT-RKD2多核苷酸的AT-NUC1启动子在拟南芥中表达 时的活性及其表征

RKD表达盒与AT-DD45-DSRED报告基因构建体(PHP50089AT-NUC1PRO(ALT1)：AT-RKD2-AT-DD45PRO：DsRed)在分子水平堆叠。RKD2的异位表达在胚囊外的胚珠的未减数细胞中表现出卵细胞样状态。

来自约50％细胞系的许多胚珠表明，在胚珠的体细胞中一至六个细胞表达AT-DD45PRO：DS-RED EXPRESS报告基因。报告基因构建体与RKD2多肽以胚珠优选方式共表达表现出在适于不定胚生殖的组织和亚结构中诱导的卵细胞样转录状态。已在胚珠的珠被空间中观察到胚样结构，表明处于不定胚生殖的早期阶段。参见图14至23。

实例8：包含AT-RKD2多核苷酸的AT-CYP86C1启动子在拟南芥中 表达时的活性及其表征

RKD表达盒与AT-DD45-DSRED报告基因构建体(PHP50089PHP50088AT-CYP86C1PRO：AT-RKD2-AT-DD45PRO：DsRed)在分子水平堆叠。参见图24至29。

胚珠示出了在胚珠的体细胞中表达AT-DD45Pro-Red Express报告基因的多个细胞。报告基因构建体与RKD2多肽以胚珠优选方式共表达表现出在适于不定胚生殖的组织和亚结构中诱导的卵细胞样转录状态。

说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。

虽然为清楚理解起见而已经通过举例说明和实例较详细地描述了前述公开内容，但显然可以在所附权利要求书范围内实施一些改变和修改。

Claims (51)

1.一种包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体，其中所述胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性，并且所述胚珠组织优选启动子在所述植物的胚囊外的未减数胚珠细胞中有活性。

2.根据权利要求1所述的表达构建体，其中所述编码的RKD多肽包含：

i)如在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽，或

ii)与在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的所述多肽具有至少80％序列同一性的多肽，其中所述多肽保留RKD活性。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的表达构建体，其中所述胚珠组织优选启动子包含

i)在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的所述多核苷酸，或

ii)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33具有至少80％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力。

4.根据权利要求1所述的表达构建体，包含：

i)在SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸，其可操作连接至编码在SEQ ID NO：14中示出的多肽的多核苷酸序列，或

ii)与在SEQ ID NO：1或3中示出的序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力，并且所述多核苷酸可操作连接至与在SEQ ID NO：14中示出的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保留RKD活性。

5.一种植物细胞，所述植物细胞在其基因组中已稳定整合了根据权利要求1-4中任一项所述的表达构建体。

6.一种植物或种子，所述植物或种子在其基因组中已稳定整合了根据权利要求1-4中任一项所述的表达构建体。

7.根据权利要求6所述的植物或种子，还包含编码胚诱导性多肽的异源多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的植物或种子，其中所述胚诱导性多肽包含与所述多肽具有至少80％序列同一性并且保留胚诱导活性的BabyBoom(BBM)、Wushel(WUS)、Leafy Cotyledon(LEC)、EMBRYOMAKER、MYB115、MYB118、Ariadne7(ARI7)或其活性变体。

9.根据权利要求7或8所述的植物或种子，其中编码所述胚诱导性多肽的所述多核苷酸可操作连接至胚珠组织优选启动子。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的植物或种子，还包含第二表达构建体，所述第二表达构建体包含可操作连接至在表达时将消融所述胚囊内的至少一个细胞的多核苷酸的胚囊优选启动子。

11.根据权利要求10所述的植物或种子，其中所述胚囊优选启动子为：卵、合子或幼合子胚细胞优选启动子。

12.根据权利要求11所述的植物或种子，其中所述卵细胞优选启动子包含在SEQ ID NO：10中示出的多核苷酸或与SEQ ID NO：10的多核苷酸具有至少95％序列同一性的序列，其中所述序列保留卵细胞优选启动子活性。

13.根据权利要求6-12中任一项所述的植物或种子，其中所述植物或种子为单子叶植物。

14.根据权利要求13所述的植物或种子，其中所述单子叶植物选自包含下列的组：玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和裸麦。

15.根据权利要求6-12中任一项所述的植物或种子，其中所述植物为双子叶植物。

16.根据权利要求15所述的植物或种子，其中所述双子叶植物选自包含下列的组：大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

17.一种用于促进所述胚囊外的未减数胚珠植物细胞中的卵细胞样状态的方法，所述方法包括在植物或种子中表达包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体，其中所述胚珠组织优选启动子在植物胚珠的至少一个非配子体组织中有活性，并且所述胚珠组织优选启动子在所述植物的所述胚囊外的未减数胚珠细胞中有活性；使得在所述胚囊外的所述植物的至少一个未减数胚珠细胞中产生卵细胞样状态。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述编码的RKD多肽包含：

i)如在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽，或

ii)与在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的所述多肽具有至少80％序列同一性的多肽，其中所述多肽保留RKD活性。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述胚珠组织优选启动子包含

i)在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸，或

ii)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33具有至少80％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述表达构建体包含：

i)在SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸，其可操作连接至编码在SEQ ID NO：14中示出的多肽的多核苷酸序列，或

ii)与在SEQ ID NO：1或3中示出的序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力，并且所述多核苷酸可操作连接至与在SEQ ID NO：14中示出的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保留RKD活性。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述植物或种子中表达编码胚诱导性多肽的异源多核苷酸。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述胚诱导性多肽包含与所述多肽具有至少80％序列同一性并且保留胚诱导活性的BabyBoom(BBM)、Wushel(WUS)、Leafy Cotyledon(LEC)、EMBRYOMAKER、MYB115、MYB118、Ariadne7(ARI7)多肽或其活性变体。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中编码所述胚诱导性多肽的所述多核苷酸可操作连接至胚珠组织优选启动子。

24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，还包括表达第二表达构建体，所述第二表达构建体包含可操作连接至在表达时将消融所述胚囊内的至少一个细胞的多核苷酸的胚囊优选启动子。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述胚囊优选启动子为卵细胞优选启动子。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述卵细胞优选启动子包含在SEQ ID NO：10中示出的多核苷酸或与SEQ ID NO：10的多核苷酸具有至少95％序列同一性的序列，其中所述序列保留卵细胞优选启动子活性。

27.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述植物或种子为单子叶植物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述单子叶植物选自包含下列的组：玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和裸麦。

29.根据权利要求17-26中任一项所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述双子叶植物选自包含下列的组：大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

31.根据权利要求17-30中任一项所述的方法，其中所述未减数细胞中的所述卵细胞样状态产生不定胚生殖。

32.根据权利要求17-30中任一项所述的方法，其中所述未减数细胞中的所述卵细胞样状态产生不完全不定胚生殖。

33.一种用于在植物细胞中表达RKD多肽的方法，包括将包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体引入植物细胞中，其中所述胚珠组织优选启动子在至少一个体细胞中有活性。

34.根据权利要求33所述的方法，还包括从所述植物细胞中再生出植物。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述编码的RKD多肽包含：

i)如在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽，或

ii)与在SEQ ID NO：12、14、16、18或32中示出的多肽具有至少80％序列同一性的多肽，其中所述活性多肽保留RKD活性。

36.根据权利要求33或34或35所述的方法，其中所述胚珠组织优选启动子包含

i)在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33中示出的多核苷酸，或

ii)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9或33具有至少80％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个非配子体组织中表达的能力。

37.根据权利要求33所述的方法，其中所述表达构建体包含：

i)在SEQ ID NO：1或3中示出的多核苷酸，其可操作连接至编码在SEQ ID NO：14中示出的多肽的多核苷酸序列，或

ii)与在SEQ ID NO：1或3中示出的序列具有至少95％序列同一性的多核苷酸，其中所述多核苷酸保留引导可操作连接的多核苷酸以胚珠组织优选方式在植物胚珠的至少一个体细胞组织中表达的能力，并且所述多核苷酸可操作连接至与在SEQ ID NO：14中示出的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，其中所述活性变体保留RKD活性。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将编码胚诱导性多肽的异源多核苷酸引入所述植物细胞。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述胚诱导性多肽包含与所述多肽具有至少80％序列同一性并且保留胚诱导活性的BBM、WUS、LEC、MYB115、MYB118、Ariadne7(ARI7)多肽或其活性变体。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中编码所述胚诱导性多肽的所述多核苷酸可操作连接至胚珠组织优选启动子。

41.根据权利要求33-40中任一项所述的方法，还包括将第二表达构建体引入所述植物细胞，所述第二表达构建体包含可操作连接至在表达时将消融所述胚囊内的至少一个细胞的多核苷酸的胚囊优选启动子。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述胚囊优选启动子为卵细胞优选启动子。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述卵细胞优选启动子包含在SEQ ID NO：10中示出的多核苷酸或与SEQ ID NO：10的多核苷酸具有至少95％序列同一性的序列，其中所述序列保留卵细胞优选启动子活性。

44.根据权利要求33-43中任一项所述的方法，其中引入包括育种或转化。

45.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其中所述植物或种子为单子叶植物。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述单子叶植物选自包含下列的组：玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、粟、甘蔗和裸麦。

47.根据权利要求33-44中任一项所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述双子叶植物选自包含下列的组：大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

49.一种用于在植物细胞中提高RKD多肽水平的方法，包括将包含可操作连接至编码RKD多肽的异源多核苷酸的胚珠组织优选启动子的表达构建体引入植物细胞中，其中所述胚珠组织优选启动子在至少一个体细胞中有活性。

50.一种包含可操作连接至目的异源多核苷酸的启动子的表达构建体，其中所述启动子选自：

(a)包含在SEQ ID NO：33中示出的序列的核苷酸序列，以及

(b)与SEQ ID NO：33具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列保留启动子活性。

51.一种植物或植物细胞，所述植物或植物细胞在其基因组中稳定整合了至少一种DNA构建体，所述至少一种DNA构建体包含可操作连接至启动子的目的异源多核苷酸，其中所述启动子选自：

(a)包含在SEQ ID NO：33中示出的序列的核苷酸序列，以及

(b)与SEQ ID NO：33具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列保留启动子活性。