MXPA06007144A

MXPA06007144A - Moleculas de acido nucleico recombinante que codifican proteinas de fusion que comprenden polipeptidos de senal secretoria bacterial y de antigenos, casetes de expresion y bacterias, y metodos para usar las mismas.

Info

Publication number: MXPA06007144A
Application number: MXPA06007144A
Authority: MX
Inventors: Thomas W Dubensky Jr; Daniel A Portnoy; William S Luckett; David N Cook
Original assignee: Cerus Corp
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2007-01-31
Also published as: WO2005071088A2; CA2551644A1; AU2004314347B2; CA2551644C; WO2005071088A3; EP1708741A2; EP1708741B1; AU2004314347A1

Abstract

La presente invencion proporciona las moleculas de acido nucleico recombinantes, los casetes de expresion y los vectores utiles para la expresion de polipeptidos, incluyendo polipeptidos heterologos, tales como antigenos, en bacterias. Algunas de las moleculas de acido nucleico recombinantes, casetes de expresion y vectores comprenden secuencias optimizadas en el codon que codifican para los polipeptidos y/o los peptidos de senal. Algunas moleculas de acido nucleico recombinantes, casetes de expresion y vectores de expresion comprenden secuencias que codifican para los peptidos de senal no Listeriales y/o no secA1 para la secrecion de los polipeptidos. La invencion tambien proporciona las bacterias que comprenden las moleculas de acido nucleico recombinantes, los casetes de expresion, y los vectores de expresion, asi como las composiciones tales como vacunas que incluyen las bacterias. Se proporcionan tambien los metodos para elaborar y utilizar las bacterias, las moleculas de acido nucleico recombinantes, y los casetes de expresion.

Description

MOLÉCULAS DE ACIDO NUCLEICO RECOMBINANTE QUE CODIFICAN PROTEÍNAS DE FUSIÓN QUE COMPRENDEN POLIPÉPTIDOS DE SEÑAL SECRETORIA BACTERIAL Y DE ANTIGENOS, CASETES DE EXPRESIÓN Y BACTERIAS, Y MÉTODOS PARA USAR LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de esta invención se refiere en general a los nuevos polinucleótidos y casetes de expresión útiles para la expresión de polipéptidos, incluyendo polipéptidos heterólogos, en bacterias recombinantes. En particular, esta invención se refiere a las bacterias recombinantes que comprenden los nuevos casetes de expresión y/o a las moléculas de ácido nucleico que son útiles en composiciones de vacunas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los microbios han comenzado a ser desarrollados para el uso como vacunas que distribuyen antígenos heterólogos. La distribución del antígeno heterólogo es proporcionada por los microbios que han sido modificados para contener secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína u oxígeno que se origina de una especie diferente. La distribución de antígenos heterólogos es especialmente ventajosa para el tratamiento o prevención de enfermedades o condiciones que resultan de fuentes especialmente virulentas o letales, tales como agentes patógenos y el cáncer (por REF.:173854 ejemplo, VIH o hepatitis B) , en donde la inyección de un agente infeccioso nativo o célula cancerosa es potencialmente dañina para el organismo recipiente, y la administración del agente atenuado o célula ha probado ser no exitoso en la promoción de la respuesta inmune efectiva, en donde no puede ser asegurada suficiente atenuación del agente infeccioso o de la célula cancerosa, con certidumbre aceptable. Recientemente, han sido desarrollados ciertas cepas bacterianas como vacunas recombinantes. Por ejemplo, una vacuna oral de Salmonella atenuada y modificada para expresar el antígeno de circunesporocito del Plasmodium bergheí ha mostrado que protege a los ratones contra la malaria (Aggarwal et al., 1990, J. Exp. Med. 172:1083). Listeria monocytogenes (Listeria) es una bacteria intracelular facultativa Gram-positiva que está siendo desarrollada para el uso en vacunas del antígeno específico debido a su habilidad para aprestar o cebar una respuesta mediada por células CD4+/CD8+T más potente, por medios de las vías de presentación de antígeno MHC de la clase I y de la clase II. Ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6,051,237, 6,565,852 y 5,830,702. La Listeria ha sido estudiada para un número de años como un modelo para estimular la inmunidad antibacteriana dependiente de células T innata y adaptativa. La habilidad de Listeria para estimular efectivamente la inmunidad celular, está basada en su ciclo de vida intracelular. Después de la infección del hospedero, la bacteria ha sido rápidamente recogida por fagotitos, incluyendo macrófagos y células dendríticas (DC) dentro del compartimiento fagolisosómico. La mayor parte de las bacterias son subsecuentemente degradadas. Los péptidos que resultan de la degradación proteolítica de patógenos dentro de los fagosomas de APCs infectadas, son cargados directamente en las moléculas MHC de la clase II y los antígenos procesados son expresados sobre la superficie de la célula progenitora presentida de antígeno por medio de la vía endosomal para la clase II, y estos complejos MHC II-péptido activan las células T "cooperadoras" CD4+ que estimulan la producción de anticuerpos. Dentro del compartimiento ácido, ciertos genes bacterianos son activados, incluyendo la citolisina dependiente del colesterol, LLO, la cual puede degradar el fagolisoso a, liberando la bacteria hacia el compartimiento citosólico de la célula hospedera, donde se propagan las listerias supervivientes. La presentación eficiente de antígenos heterólogos por medio de la vía MHC clase I, requiere la expresión de proteínas endógenas de novo por la Listeria . Dentro del citoplasma de las células presentadas de antígenos (APC) , las proteínas sintetizadas y secretadas por la Listeria son mostradas y degradadas por el proteosoma. Los péptidos resultantes son lanzados hacia el retículo endoplásmico por las proteínas TAP y cargadas sobre las moléculas MHC clase I. El complejo del MHC 1-péptido es distribuido hacia la superficie celular, que en combinación con una co-estimulación suficiente (señal 2) activa y estimula los linfocitos T citotóxicos (CTLs) que tienen el receptor de células T cognado para expandir y subsecuentemente reconocer el complejo MHC I-péptido mostrado sobre, por ejemplo, las células tumorales. En el microambiente apropiado, la célula T se dirige hacia y mata la célula cancerosa. Dado los mecanismos dentro de los cuales la Listeria programa la presentación de los antígenos heterólogos por medio MHC de la clase I, la eficiencia de la expresión de los genes heterólogos y la secreción de la proteína recién sintetizada proveniente de la bacteria hacia el citoplasma de la célula infectada (presentadora de antígeno) está directamente relacionada a la potencia del aprestamiento y/o activación de células T CD8+. Ya que el nivel de aprestamiento de las células T específica Ag del antígeno está directamente relacionado a la eficiencia de la vacuna, la eficiencia de la expresión de la proteína heteróloga y la secreción que está motivada directamente a la potencia de la vacuna. De este modo, son necesarios nuevos métodos en la técnica para optimizar la eficiencia de la expresión de las proteínas heterólogas y la secreción para elevar al máximo la potencia de las vacunas basadas en Listeria y otras vacunas basadas en bacterias. Podría ser benéfico optimizar la eficiencia de la expresión de la proteína heteróloga y la secreción de la misma o un sistema de expresión hospederas bacterianas, donde la expresión y secreción de grandes cantidades de la proteína heteróloga es deseada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona generalmente nuevos polinucleótidos que incluyen las nuevas moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, casetes de expresión, y vectores para el uso en expresión y/o secreción de polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos heterólogos) en bacterias, especialmente Listeria . En algunas modalidades, estos polinucleótidos proporcionan expresión y/o secreción aumentada de los polipéptidos en bacterias. La presente invención también proporciona en general las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, y los casetes de expresión, o los vectores, así como las composiciones farmacéuticas, inmunogénicas y de vacuna que comprenden las bacterias. Estas bacterias y las composiciones son útiles en la inducción de respuestas inmunes en el tratamiento y/o prevención de una amplia gama de enfermedades u otras condiciones, incluyendo cáncer, infecciones y autoinmunidad.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que .comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión de una bacteria, y un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es también optimizado en codón para la expresión en bacterias, tales como Listeria . La invención también proporciona los casetes de expresión que comprenden esta molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado a la molécula de ácido nucleico recombinante. Los vectores y bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión son también proporcionados, como lo son las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas y las vacunas que comprenden bacterias. Son también proporcionados los métodos de uso de las bacterias o de las composiciones que comprenden las bacterias para inducir las respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición tal como una enfermedad o un hospedero.

En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria. La invención también proporciona los casetes de expresión que comprenden esta molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado a la molécula de ácido nucleico recombinante. Los vectores y bacterias que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión, son también proporcionados, como lo son las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y vacunas que comprenden las bacterias . Son proporcionados los métodos para utilizar las bacterias o las composiciones que comprenden las bacterias, para inducir la respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) en un hospedero. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón, para la expresión en Listeria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptído, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional como el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal del polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido es extraño para la bacteria de Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para Listeria . Se proporcionan también las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y vacunas, que comprenden la Listeria . Se proporcionan también los métodos de uso de la Listeria (o las composiciones que comprenden la Listeria ) para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) en un hospedero.

En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano nosecAl, y un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (tal como un antígeno) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional como el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el primero y/o segundo polinucleótido son optimizados en codón para la expresión de bacteria, tales como Listeria . La invención también proporciona los casetes de expresión que comprenden esta molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado a la molécula de ácido nucleico recombinante. Los vectores y bacterias que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión son también proporcionados, como lo son también las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y las bacterias que comprenden las vacunas. Son también proporcionados métodos para utilizar las bacterias o las composiciones que comprenden la bacteria para inducir respuestas inmunes y/o para tratar una condición tal como una enfermedad o un hospedero. En un aspecto más, la invención proporciona una bacteria de Listeria recombinante- que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de señal bacteriano non-secAl y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido ya sea heterólogo para péptido de señal extraño para la bacteria en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional como el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal en el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado para el segundo polinucleótido es heterólogo para el segundo péptido de señal o extraño para la bacteria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria) o ambos. Se proporcionan también las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la Listeria . Se proporcionan también los métodos para utilizar la Listeria (o composiciones que comprenden la Listeria ) para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) en un hospedero. En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para la Listeria (por ejemplo, un antígeno de enfermedad infeccioso del cáncer o no listerial) , en donde el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño es optimizado en codón para la expresión en Listeria . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende además un polinucleótido que codifica para un péptido de señal en la misma estructura de lectura traduccional fue el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño a la Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para la bacteria en Listeria . En otras modalidades, el péptido de señal es expresado para la bacteria Listeria . En algunas modalidades, el polipéptido que codifica para el péptido de señal es también optimizado en codón para la expresión en Listeria . Se proporciona también la Listeria que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante. Son también proporcionadas las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la Listeria. Además, la invención proporciona métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición (tales como, pero no limitada a, una enfermedad) en un hospedero. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria de Listeria recombinante, que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño en Listeria (por ejemplo, un antígeno de enfermedad infecciosa no listerial o del cáncer) en donde el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño es optimizado en codón para la expresión en Listeria , y un promotor operablemente enlazado con el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende además un polinucleótido que codifica para un péptido de señal (un péptido de señal ya sea un nativo o extraño para bacteria Listeria) en la misma estructura de lectura traduccional que el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño a Listeria, y operablemente enlazado al promotor, de modo que el cásete de expresión expresa una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido extraño. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal es también optimizado en codón para la expresión en Listeria . Son también proporcionadas las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la Listeria . Además, la invención proporciona métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición (tales como, pero no limitada a, una enfermedad) en un hospedero.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional del primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no listerial y el polipéptido. La invención también proporciona un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primer y segundo polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante. Los vectores recombinantes comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión son también proporcionados. Además, se proporciona también la bacteria Listeria que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión. Son también proporcionadas las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la Listeria . Además, la invención proporciona métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición (tales como, pero no limitada a, una enfermedad) en un hospedero.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una bacteria de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica un péptido de señal no listerial, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no listerial y el polipéptido. Son también proporcionadas las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la Listeria . Además, la invención proporciona métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición (tales como, pero no limitada a, una enfermedad) en un hospedero. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Listeria (por ejemplo, de la especie Listeria monocytogenes) que comprende un cásete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no listerial, un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno) que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. El cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no listerial y el polipéptido. En algunas modalidades, el primero y/o el segundo polinucleótidos son optimizados 'e codón para la expresión de Listeria . Las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas y las vacunas que comprenden la Listeria , son también proporcionadas. Además, la invención proporciona los métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir las respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) en un hospedero. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o un fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la antolisina, o fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, en donde en la proteína quimera, el polipéptido es fusionado o está colocado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma. Los vectores y bacterias que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión son también proporcionados, como lo son las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y vacunas, que comprenden las bacterias. Se proporcionan también los métodos para utilizar las bacterias de las composiciones que comprenden las bacterias, para inducir respuestas inmunes y/o para tratar una condición tal como una enfermedad en un hospedero. En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico codifica para al menos dos polipéptidos no listeriales discretos. La invención proporciona además un cásete de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico recombinantes y que comprende además un promotor, en donde el promotor está operablemente enlazado a la molécula de ácido nucleico recombinante. Los vectores comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión son también proporcionados. Además, se proporciona también una bacteria Listeria recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante (y/o el cásete de expresión) . Son también proporcionadas las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la Listeria . Además, la invención proporciona métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir respuestas inmunes y/o para prevenir o tratar una condición (tales como, pero no limitada a, una enfermedad) en un hospedero. En un aspecto adicional, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante que comprende un cásete de expresión policistrónico, en donde el cásete de expresión policistróníco codifica para al menos dos polipéptidos no listeriales discretos. Se proporcionan también las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas y las vacunas, que comprenden la Listeria . Se proporcionan también los métodos para utilizar la Listeria (o composiciones que comprenden la Listeria) para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) en un hospedero. En otros aspectos, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo a la proteína secretada, o fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, y el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido y la proteína secretada, o el fragmento de la misma, y en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido está fusionado a la proteína secretada, o fragmento de la misma, o está colocada dentro de la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera. Un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero, segundo y tercero polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante, es también proporcionado. Se proporcionan también los vectores y bacterias que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y /o el cásete de expresión, así como también las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas y bacterias, que comprenden las bacterias. Se proporcionan también los métodos para utilizar las bacterias o composiciones que comprenden las bacterias, para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición no hospedera. En algunas modalidades, los métodos de inducción a la respuesta inmune en un hospedero o un antígeno comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente (por ejemplo, en cualquiera de los aspectos anteriores, o en donde la Descripción Detallada de la Invención en los Ejemplos, más adelante) al hospedero, en donde un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector en la bacteria comprende el antígeno. En algunas modalidades, los métodos de prevenir o tratar una condición, tal como enfermedad, en un hospedero, comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente, al hospedero. La invención proporciona además el uso de una bacteria recombinante descrita en la presente (por ejemplo, en cualquiera de los aspectos anteriores, o en la Descripción Detallada de la Invención en los Ejemplos, más adelante) en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector en la bacteria, comprende el antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es una antígeno heterólogo. La invención también proporciona el uso de una bacteria recombinante descrita en la presente, en la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar una condición en un hospedero (por ejemplo, una enfermedad tal como el cáncer o una enfermedad infecciosa) . La invención proporciona también la bacteria recombinante descrita en la presente para el uso en la inducción de una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector en la bacteria comprende el antígeno. La invención proporciona además la bacteria recombinante descrita en la presente para el uso en la prevención del tratamiento de una condición (tal como una enfermedad) en un hospedero. En aspectos adicionales, la invención proporciona los métodos mejorados para expresar y secretar las proteínas heterólogas en la bacteria hospedera. Se proporcionan también los métodos para fabricar bacterias que comprenden cada una de las moléculas de ácido nucleico recombinantes y los casetes de expresión descritos anteriormente. Se proporcionan también los métodos para utilizar las bacterias, para producir vacunas. La invención proporciona además una variedad de polinucleótidos que codifican para los péptidos de señal y/o los antígenos, incluyendo los polinucleótidos que han sido optimizados en codón para la expresión en Listeria monocytogenes . Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra el alineamiento del promotor hly para Listeria monocytogenes DP-L4056 (SEQ ID No. : 1) (secuencia inferior) y las cepas de EGD (SEQ ID No.: 2) (secuencia superior) . La figura 2 muestra la secuencia (SEQ ID No.: 3) de un polinucleótido que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal LLO, la secuencia LLO PEST, y el antígeno humano EphA2 de longitud completa. La figura 3 muestra la secuencia (SEQ ID No.: 4) de la proteína de fusión codificada por el polinucleótido mostrado en la figura 2. La figura 4 muestra la secuencia nucleotídica nativa (SEQ ID No. : 5) que codifica para el dominio extracelular EphA2 humana (EX2) . La figura 5 muestra una secuencia de nucleótido (SEQ ID No.: 6) que codifica para el dominio extracelular humano EphA2 que ha sido optimizado en codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 7) del dominio extracelular EphA2 (EX2). La figura 7 muestra la secuencia polinucleotídica no optimizada en el codón (SEQ ID No.: 8) que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO, la secuencia de LLO PEST y el dominio extracelular de EphA2 humano . La figura 8 muestra la secuencia de (SEQ ID No.: 9) de la proteína de fusión codificada por la secuencia de codificación mostrada en la figura 7. La figura 9 muestra un cásete de expresión (SEQ ID No.: 10) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO, la secuencia de LLO PEST y el dominio extracelular de EphA2 humano. En esta secuencia, la secuencia que codifica para el dominio extracelular EphA2 humano es optimizado en el codón para la expresión de Listeria monocytogenes . La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 11) codificada por el cásete de expresión de la figura 9. La figura 11 muestra un cásete de expresión (SEQ ID No.: 12) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO, la secuencia LLO PEST y el dominio extracelular EphA2. En esta secuencia, las secuencias que codifican para el péptido de señal LLO, LLO PEST, y el dominio extracelular EphA2 humano han sido todos utilizados en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 13) codificada por el cásete de expresión de la figura 11. La figura 13 muestra un cásete de expresión (SEQ ID No.: 14) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal phoD Tat y el dominio extracelular de EphA2 humano. En esta secuencia, las secuencias que codifican para el péptido de señal phoD Tat y el dominio extracelular humano EphA2 han sido ambas utilizadas en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 15) codificada por el cásete de expresión de la figura 13. La figura 15 muestra la secuencia de nucleótido nativo (SEQ ID No.: 16) que codifica para el dominio intracelular de EphA2 humano (CO) . La figura 16 muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID No.: 17) que codifica para el dominio intracelular humano EphA2 que ha sido optimizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 18) que codifica para el dominio intracelular humano EphA2 (EX2) . La figura 18 muestra la .secuencia polinucleotídica no optimizada en el codón (SEQ ID No.: 19) que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO, la secuencia LLO PEST y el dominio intracelular EphA2 humano. La figura 19 muestra la secuencia (SEQ ID No. : 20) de la proteína de fusión codificada por la secuencia codificada por la secuencia de codificación mostrada en la figura 18. La figura 20 muestra el cásete de expresión (SEQ ID No.: 21) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO, la secuencia LLO PEST y el dominio intracelular de EphA2 humano. En esta secuencia, la secuencia que codifica para el dominio intracelular EphA2 humano es optimizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 21 muestra la secuencia de aminoácido (SEQ ID No.: 22) codificada por el cásete de expresión de la figura 20. La figura 22 muestra un cásete de expresión (SEQ ID No. : 23) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO, la secuencia LLO PEST y el dominio intracelular de EphA2 humano. En esta secuencia, las secuencias que codifican para el péptido de señal LLO, LLO PEST, y el dominio intracelular humano EphA2 han sido todos optimizados en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID No.: 24) por el cásete de expresión de la figura 22. La figura 24 muestra un cásete de expresión (SEQ ID No.: 25) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal phoD Tat y el dominio intracelular de EphA2 humano. En esta secuencia, las secuencias que codifican para el péptido de señal phoD Tat y el domino intracelular EphA2 humano han sido utilizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 25 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 26) codificada por el cásete de expresión de la figura 24. La figura 26 muestra un cásete de expresión optimizado en el codón (SEQ ID No.: 27) que comprende el promotor hly y que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO y un antígeno NY-ESO-1. Ambas secuencias que codifican para el péptido de señal y el antígeno son optimizadas en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 28) codificada por el cásete de expresión de la figura 26. La figura 28 muestra un polinucleótido (SEQ ID No.: 29) que comprende el promotor hly operablemente enlazado a la secuencia optimizada del codón que codifica para un péptido de señal Usp45. La figura 29 muestra un polinucleótido (SEQ ID No. : 30) que comprende el promotor hly operablemente enlazado a una secuencia nativa que codifica para un péptido de señal p60. La figura 30 muestra un polinucleótido (SEQ ID No. : 31) que comprende el promotor hly operablemente enlazado a una secuencia utilizada en el codón que codifica para un péptido de señal p60. La figura 31 muestra la secuencia (SEQ ID No.: 32) de un fragmento del gen hlyP-p60. Las figuras 32A, 32B, y 32C muestran la secuencia (SEQ ID No.: 33) de pAM401-MCS, el plásmido pAM4, que contiene un sitio de clonación múltiple (MCS) proveniente del vector pPL2. La figura 33 muestra la secuencia de codificación (SEQ ID No.: 34) para la mesotelina humana que ha sido utilizada en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos de la mesotelina humana (SEQ ID No.: 35) . La figura 35 muestra la secuencia de codificación (SEQ ID No. : 36) para la mesotelina urina, que ha sido optimizada en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 37) de la mesotelina murina. La figura 37 muestra un análisis de Western Blot de la proteína secretada proveniente de la Listeria recombinante que codifica para una secuencia del dominio EphA2 CO nativo. La figura 38 muestra un análisis de Western Blot de la proteína secretada proveniente de Listeria recombinante que codifica para el péptido de señal LLO secAl optimizado en el codón o nativo fusionado con la secuencia del dominio EphA2 EX2 optimizado en el codón. La figura 39 muestra un análisis de Western Blot de la proteína secretada proveniente de Lísteria recombinante que codifica para el péptido de señal secAl LLO optimizado en el codón o nativo o el péptido de señal, optimizado en el codón fusionado con la secuencia del dominio CO de EphA2 optimizado en el codón. La figura 40 muestra un análisis de Western Blot del lisado de células 293, 48 horas después de la transfección con ADN de plásmido pCDNA4 que codifica para la secuencia EphA2 nativa de longitud completa. La figura 41 es una gráfica que muestra la inmunización de ratones Balb/C que poseen tumores pulmonares CT26.24 (huEphA2+) con la Listeria recombinante que codifica para OVA.AHÍ u 0VA.AH1-A5 que confiere supervivencia a largo plazo. La figura 42 es una gráfica que muestra la supervivencia implementada de ratones Balb/C que poseen tumores pulmonares CT26.24 (huEphA2+) cuando son inmunizados con la Listeria recombinante que codifica para el péptido de señal secAl optimizado en el codón, optimizado con la secuencia del dominio EphA2 EX2, optimizado en el codón. La figura 43 es una gráfica que muestra que la inmunización de ratón Balb/C que poseen los tumores de pulmón CT26.24 (huEphA2+) con Listeria recombinante que codifica para el dominio EphA2 CO, confiere supervivencia a largo plazo. La figura 44 es una gráfica que muestra que la inmunización de ratón Balb/C que poseen los tumores de pulmón CT26.24 (huEphA2+) Listeria recombinante que codifica para el dominio EphA2 CO, pero no con el ADN plásmido que codifica para EphA2 de longitud completa, confiere supervivencia a largo plazo. La figura 45 es una gráfica que muestra que la Listeria que expresa hEphA2 promueve una respuesta de célula T CD8+, específica de EphA2. La figura 46 es una gráfica que muestra que la respuesta de células T CD4+ y CD8+ contribuyan a la eficacia antitumoral dirigida a hEphA2 de la Listeria que expresa hEphA2. La figura 47 muestra la secuencia (SEQ ID No. : 38) del promotor hly de Listeria monocytogenes cepa 10403S operablemente enlazado al péptido de señal del antígeno protector proveniente de B . anthracis, optimizado en el codón para la secreción en Listeria monocytogenes . Seis nucleótidos adicionales (5' -GGATCC-3' ) correspondientes al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Bam Hl fueron incluidos en el extremo carboxilo de la secuencia del péptido de señal, facilitando el enlace infraestructural operable, a cualquier secuencia de codificación seleccionada. El extremo 5' del promotor hly contiene un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Kpn I único. Las figuras 48A-48C muestran la expresión eficiente y la secreción de antígenos tumorales humanos de longitud completa provenientes de Listeria recombinante. La figura 48A muestra la expresión/secreción de mesotelina con construcciones que consisten del péptido de señal LLO fusionado con la mesotelina humana, utilizando codones nativos. La figura 48B muestra la expresión/secreción de mesotelina con construcciones que comprenden diversos péptidos de señal fusionados con la mesotelina humana optimizada en el codón para la expresión en Listeria . La figura 48C muestra la expresión/secreción de NY-ESO-l humana con construcciones que comprenden el péptido de señal LLO optimizado en el codón, fusionado con NY-ESO-l optimizado en el codón, de la mesotelina humana. La figura 49 muestra las secuencias de codificación de phEphA2KD (SEQ ID No.: 39). La figura 50 muestra el subfrag ento Mlul (SEQ ID No. : 40) del EphA2 humano optimizado en el codón, que contiene la región intergénica ActA-plcB. La figura 51 muestra la secuencia (SEQ ID No.: 41) de los aminoácidos N-terminal de p60 del promotor hly. La figura 52 muestra el subfragmento de Kpnl-BamHI (SEQ ID No.: 42) del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp(l-77). La figura 53 muestra el subfragmento de Kpnl-BamHI (SEQ ID No.: 43) del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp(l-77)-mesotelina. La figura 54 muestra el subfragmento de Kpnl-BamHI (SEQ ID No.: 44) del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp(l-77)-mesotelina ?SP/?GPI. La figura 55 muestra el análisis de Western Blot de la expresión y secreción de los antígenos provenientes de Listeria recombinante que comprende las quimeras antígeno-proteína bacteriana. La figura 56 muestra el análisis de Western Blot de la expresión del dominio intracelular (ICD) de EphA2 proveniente de un mensaje bicistrónico . Las figuras 57A - 57C muestran un análisis de Western Blot de la expresión y secreción basada en el plásmido, de la mesotelina murina como una función de la fusión N-terminal con diversos péptidos de señal optimizados en el codón, como se pone en evidencia en diferentes fracciones bacterianos: proteína secretada (figura 57A) ; pared celular (figura 57B) ; y lisado celular (figura 57C) .

La figura -58 muestra un análisis de Western Blot de la expresión basada en el cromosoma de la secreción de la mesotelina humana en Listeria monocytogenes . El análisis de Western Blot de la expresión de mesotelina en diversas fracciones de células bacterianas, con los resultados provenientes de la Listeria (no codifica para la mesotelina) y la Listeria que codifica para la mesotelina expresada a partir de la secuencia de señal indicadas. Las figuras 59A y 59B son gráficas que muestran la distribución de un antígeno heterólogo (AH1-A5) a la vía MHC clase I por una vacuna de Listeria . La vacuna de Listeria comprendía Listeria que expresa una quimera proteica de p60-AH1-A5 (AH1-A5 incrustada en p60) (figura 59A) ó Listeria que expresa una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO y AH1-A5 (figura 59B) . Las figuras 60A y 60B son gráficas que muestran la distribución mediada por la vacuna de Listeria, de los antígenos específicos de la bacteria para la vía MHC de la clase I donde la vacuna comprendía Listeria que expresa una quimera proteica de p60-AHl-A5 (AH1-A5 incrustada en p60) (figura 60A) ó Listeria que expresa una proteína de fusión que comprende un péptido de señal LLO y AH1-A5 (figura 60B) , y donde los péptidos de prueba agregado al ensayo basado en células no fueron el péptido de prueba (no estimulada) (figura 60A) , LLO91-99 (figura 60A) , ningún péptido de prueba (figura 60B) , o p602?7-225 (figura 60B) . La figura 61 es una gráfica que muestra la eficacia terapéutica de la Listeria que expresa la mesotelina humana en animales que poseen tumor vacunados, en donde las células tumorales fueron aisladas por ingeniería genética para expresar la mesotelina humana. La figura 62 es una gráfica que muestra la reducción en el nivel del tumor pulmonar en ratones que poseen tumor, vacunados con Listeria que expresa la mesotelina humana, donde las células tumorales fueron manipuladas por ingeniería genética para expresar la mesotelina humana. La figura 63 es una gráfica que muestra un estudio control utilizando células objetivo progenitoras CT-26, por ejemplo, las células no manipuladas por ingeniería genética para expresar la mesotelina humana, que demuestra que la eficacia antitumoral de la vacunación con Lm-Meso es específica de la mesotelina. La figura 64 es una gráfica que muestra la vacunación con Listeria que expresa la mesotelina humana expresada en el codón, que reduce el volumen tumoral. La figura 65 muestra los resultados de los experimentos ELISPOT que muestran inmunogenicidad de la cepa de Listeria ?actA/?inlB-hMesotelina, donde el ácido nucleico que codifica para la hmesotelina ha sido integrada dentro del genoma de Listeria .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Introducción La presente invención proporciona una variedad de polinucleótidos que incluyen las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión, y loe vectores de expresión útiles para la expresión y/o secreción de los polipéptidos, incluyendo polipéptidos heterólogos (por ejemplo, antígenos y/o proteínas de mamífero) , en bacteria, tales como Listeria . En algunas modalidades, estos polinucleótidos pueden ser utilizados para la expresión y/o secreción aumentada de los polipéptidos en bacterias. Algunos de los casetes de expresión comprenden secuencias de codificación utilizadas en codón para el polipéptido y/o para el péptido de señal. Además, algunos de los casetes de expresión para el uso en bacterias contienen secuencias peptídicas de señal derivadas de otras fuentes bacterianas y/o de una variedad de diferentes vías secretoras. Las bacterias que comprenden los casetes de expresión son también proporcionadas, como lo son las composiciones, tales como vacunas, que contienen la bacteria. Se proporcionan también los métodos para utilizar los polinucleótidos, las bacterias y las composiciones para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición, tal como una enfermedad (por ejemplo, el cáncer) en un hospedero. La invención está basada, en parte, al descubrimiento de que la optimización del codón de la secuencia peptídica de señal en un cásete de expresión aumenta la expresión y/o secreción de polipéptido hospedero (tal como un antígeno) a partir de la bacteria recombinante (particularmente la combinación con la optimización del codón del polipéptido heterólogo) , aún cuando la secuencia del péptido de señal es nativa para la bacteria (ver por ejemplo, Ejemplos 19 y 27, siguientes) . Además, se ha descubierto que las secuencias peptídicas de señal provenientes de las vías secretoras no secAl y/o de las secuencias peptídicas de señal de otras fuentes bacterianas no listeriales, pueden ser también utilizadas para efectuar la expresión y/o secreción eficiente de los polipéptidos heterólogos a partir de Listeria (ver por ejemplo, Ejemplos 19, 27 y 30 siguientes) . La invención está también basada, en parte en el descubrimiento adicional de que la optimización del codón de las secuencias de codificación de los polipéptidos heterólogos aumentan la expresión y/o secreción de los polipéptidos heterólogos en Listeria (ver por ejemplo, Ejemplo 19, más adelante) . La expresión y/o secreción aumentada de la proteína heteróloga obtenida a través de la optimización del cásete de expresión ha mostrado también que conduce a una inmunogenicidad mejorada de las bacterias que comprenden los casetes de expresión optimizados (ver por ejemplo, Ejemplo 20 más adelante). Además, los casetes de expresión que codifican para las quimeras proteicas que comprenden un antígeno heterólogo incrustado dentro de una autolisina, han mostrado que son útiles en efectuar la expresión de secreción eficiente de un antígeno heterólogo en Listeria (ver por ejemplo, Ejemplo 29 más adelante). Las quimeras proteicas de autolisina han mostrado también que son inmunogénicas (ver por ejemplo, Ejemplo 31A, más adelante) . Además, la Listeria que comprende los casetes de expresión optimizados en codón y/o los casetes de expresión que comprenden péptidos de señal no listeriales, han mostrado también que son inmunogénicos, reducen el volumen del tumor e incrementan la supervivencia en un modelo de ratón (ver por ejemplo, Ejemplos 31B-E, más adelante). En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria, y un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno), en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal del polipéptido. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es utilizado en el codón también (típicamente para la expresión en el mismo tipo de bacteria del primer polinucleótido) . En algunas modalidades, el primer polinucleótido y el primero y segundo polinucleótidos son utilizados en el codón para la expresión en Listeria, Bacillus , Yersinia pestis, Salmonella , Shigella , Brucella, micobacteria o E. coli . En algunas modalidades, el o los polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión de Listeria, tales como Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es (o comprende) un antígeno, el cual, en algunos casos, puede ser un antígeno no bacteriano. Por ejemplo, es, en algunas modalidades, un antígeno asociado al tumor o es derivado de tal antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénico de la mesotelina. En algunas modalidades, el antígeno es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica de NY-ESO-l. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el péptido de señal es bacteriano (listerial o no listerial) . En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido optimizado en el codón es nativo para la bacteria. En otras modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido optimizado en el codón, es extraño para la bacteria. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl, tal como un péptido de señal LLO proveniente de Listeria monocytogenes , un péptido de señal Usp45 de lactococcus lactis, o un péptido de señal de antígeno protector de Bacillus anthracis . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2. Por ejemplo, el péptido de señal puede ser el péptido de señal p60 proveniente de Listeria monocytogenes . Además, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende opcionalmente una tercera secuencia del polinucleótido que codifica para p60, o un fragmento del mismo, en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde el segundo polinucleótido está colocado dentro del tercer polinucleótido o entre el primero y tercer polinucleótidos. En algunas modalidades adicionales, el péptido de señal es un péptido de señal Tat, tal como un péptido de señal Tat de B . subtilis (por ejemplo, PhoD) . La invención también proporciona los casetes de expresión que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado a una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, para el primer y segundo polinucleótidos (y el tercer polinucleótido, si está presente) ) . Los vectores de expresión y las bacterias recombinantes (por ejemplo, Listeria) que comprenden el cásete de expresión son también proporcionadas, como lo son las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y las vacunas, que comprenden las bacterias . Son proporcionados también los métodos para utilizar las bacterias de las composiciones que comprenden las bacterias, para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición, tal como una enfermedad. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En un segundo aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria y, (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es heterólogo para el primer polinucleótido. En algunas modalidades, el polipéptido es extraño para la bacteria a la cual es nativo el péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido codificado para el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal, extraño para la bacteria o ambos. En algunas modalidades, la bacteria a partir de la cual es derivado el péptido de señal, es una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Listeria, Bacillus , Yersinia pertis, Salmonella , Shigella , Brucella, micobacteria y E. coli . En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado del codón para la expresión en la bacteria. En algunas modalidades, la optimización del codón del primero y/o segundo polinucleótidos aumenta la expresión en y/o la secreción desde la bacteria, de la proteína de fusión codificada (con relación a la secuencia no optimizada del codón) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. El polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno no bacteriano. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o comprende un antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o un derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigénico, o variante del mismo, o es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante del mismo. En algunas modalidades alternativas, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptidos secAl (por ejemplo, el péptido de señal LLO proveniente de Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2 (por ejemplo, el péptido de señal p60 de Listeria monocytogenes) . Una cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado al primer y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante, es también proporcionado. Se proporciona también un vector de expresión que comprende el cásete de expresión. Se proporciona también una bacteria recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión de la bacteria recombinante. En algunas modalidades, la bacteria recombinante es una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la bacteria recombinante se selecciona del grupo que consiste de Listeria, Bacillus, Yersinia pertis, Salmonella , Shigella , Brucella, micobacteria y E. coli . En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria de Listeria recombinante (por ejemplo, una bacteria Listeria monocytogenes recombinante). Se proporciona además una composición inmunogénica que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es una antígeno. Se proporcionan también los métodos para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es (o comprende) el antígeno. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno . En un tercer aspecto, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante (por ejemplo, Listeria monocytogenes) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria Listeria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica a un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinúcleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es parte de una cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado, al primero y segundo polinucleótidos. En otras palabras, en algunas modalidades la bacteria Listeria recombinante comprende un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, el cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria Listeria . En algunas modalidades, la optimización del codón del primero y/o segundo polinucleótidos aumentan la expresión en y/o la secreción desde la bacteria Listeria de la proteína de fusión codificada (con relación a la secuencia no optimizada en el codón) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria Listeria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria Listeria) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido que comprende un antígeno (por ejemplo, un antígeno no listerial o no bacteriano) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o un derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigéníco o variante antigénica del mismo. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y el dominio ligador GPI . En algunas modalidades alternativas, el antígeno es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. En algunas modalidades alternativas, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es un antígeno derivado de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el péptido de señal es no listerial. En algunas modalidades, el péptido de señal es bacteriano. En algunas modalidades, el péptido de señal es extraño para la bacteria Listeria . En otras modalidades, el péptido de señal es nativo para la bacteria Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl (por ejemplo, el péptido de señal LLO proveniente de Listeria monocytogenes, el péptido de señal Usp45 proveniente de Lactococcus lactis, el péptido de señal del antígeno protector de Bacillus anthracis) . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2 (por ejemplo, el péptido de señal p60 de Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el péptido de señal es el péptido de señal Tat (por ejemplo, el péptido de señal PhoD de B . subtilis) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria está atenuada. Por ejemplo, la Listeria puede ser atenuada para la dispersión de célula a célula, la entrada a las células no fagocíticas, o la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante es deficiente con respecto a ActA, Internalina B, o Act A e Internalina B (por ejemplo, un mutante de doble supresión ?actA?inlB) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante está suprimida en la ActA funcional, Internalina B, o el ActA e Internalina B. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado mediante reacción con un compuesto de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoralen) . La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la bacteria Listeria recombinante y un portador farmacéuticamente aceptable, así como una composición inmunogénica que comprende la bacteria Listeria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. La invención también proporciona una vacuna que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporcionan también los métodos para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende 4 administrar a un hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es (o comprende) un antígeno. Se proporciona también los métodos para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad tal como cáncer o una enfermedad infecciosa) en un hospedero, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno. En un cuarto aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, y un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en un tipo particular de bacteria.

En algunas modalidades, la optimización del codón del primero y/o el segundo polinucleótido aumenta la expresión en y/o la secreción desde la bacteria de la proteína de fusión (con relación a la secuencia no optimizada en el codón) . En algunas modalidades, el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en Listeria, Bacillus , Yersinia pestis , Salmonella , Shigella , Brúcela, micobacteria o E. coli . En algunas modalidades, el o los polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en Listeria , tal como Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido optimizado en el codón es nativo para la bacteria para la cual éste es optimizado en el codón. En algunas modalidades, el primer polinucleótido que codifica para el péptido de señal es heterólogo para el segundo polinucleótido. En algunas modalidades, el polinucleótido codificado para el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno, el cual, en algunos casos, puede ser un antígeno no bacteriano. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de tal antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o SEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o es un fragmento antigénico o variante antigénica de la mesotelina. En algunas otras modalidades, el antígeno es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica de NY-ESO-l. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante es listerial. En otras modalidades, el péptido de señal es no listerial. En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria gram positiva. En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria que pertenece al género Bacillus , Staphylococcus , o Lactococcus . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2. Por ejemplo, el péptido de señal puede ser el péptido de señal p60 de Listeria monocytogenes . Además, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende opcionalmente una tercera secuencia polinucleotídica que codifica para p60, o un fragmento de la misma, en la misma estructura de lectura traduccional como el primero y el segundo polinucleótidos, en donde el segundo polinucleótido está colocado dentro del tercer polinucleótido entre el primero y el tercer polinucleótidos. En modalidades adicionales, el péptido de señal es un péptido de señal Tat, tal como el péptido de señal Tat de B . subtilis (por ejemplo, un péptido de señal PhoD de B. subtillis) . La invención también proporciona los casetes de expresión que comprenden la molécula de ácido nucleico recombinante, y que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y el segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. Los vectores de expresión y las bacterias que comprenden el cásete de expresión y/o la molécula de ácido nucleico recombinante son también proporcionados, como lo son también las composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas, y vacunas, que comprenden las bacterias. En algunas modalidades, la bacteria recombinante que comprende el cásete de expresión o un molécula de ácido nucleico recombinante es una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria seleccionada del grupo que consiste de Listeria, Bacillus , Yersinia pestis, Salmonella , Shigella , Brúcela, micobacteria o E. coli . En algunas modalidades, la bacteria es Listeria (por ejemplo, un miembro de la especie Listeria monocytogenes ) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo 5 polinucleótido es extraño para la bacteria (por ejemplo heteróloga para la bacteria) . Se proporcionan también los métodos para utilizar la bacteria de las composiciones que comprenden la bacteria, para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) en un hospedero. En algunas modalidades, la condición es el cáncer. En otras modalidades, la condición es una enfermedad infecciosa. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado para el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal o es extraño para la bacteria, o ambos. En algunas modalidades, la bacteria Listeria pertenece a la especie Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es parte de un cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En otras palabras, en algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante comprende un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primero o segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. . En algunas modalidades, cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico . En algunas modalidades, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido, o ambos, es decir, el primero y segundo polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en la bacteria en Listeria (por ejemplo Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, la utilización del codón del primero y/o segundo polinucleótidos aumenta la expresión en y/o la secreción desde la bacteria de la proteína de fusión (con relación a la secuencia no optimizada no del codón) . En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos son heterólogos uno hacia el otro. En algunas modalidades, el polipéptido que codifica para el segundo polinucleótido y el péptido de señal son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptido que codifica para el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria Listeria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria Listeria ) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado para el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno (por ejemplo, un antígeno no listerial o no bacteriano) . En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica de la misma. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana. En algunas modalidades, el antígeno es la mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y el dominio ligador GPI . En algunas modalidades alternativas, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el péptido de señal es no listerial. En algunas modalidades, el péptido de señal no secAl es un péptido de señal listerial. En otras modalidades, el péptido de señal no secAl es un péptido de señal no listerial. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2 (por ejemplo, el péptido de señal p60 de Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un péptido de señal secA2, comprende además un tercer polinucleótido que codifica para una autolisina secA2 (por ejemplo, p60 o N-acetilmuramidasa) , o un fragmento de la misma (por ejemplo, un fragmento catalíticamente activo) , en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde el segundo polinucleótido está colocado dentro del tercer polinucleótido o entre el primero y el tercer polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido está colocado dentro del tercer polinucleótido. En algunas- modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal Tat. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal Tat derivado de B. subtilis (por ejemplo, el péptido de señal PhoD de B . subtilis) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria es atenuada. Por ejemplo, la Listeria puede ser atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada dentro de las 5 células no fagocíticas o la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante es deficiente con respecto a ActA, Internalina B, o a Act A e Internalina B (por ejemplo, un mutante de doble supresión ?actA?inlB) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante está suprimida en ActA funcional, Internalina B, o Act A e Internalina B. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante de la bacteria recombinante ha sido modificada por reacción con una composición de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoralen) . La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la bacteria Listeria recombinante y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. La invención también proporciona una vacuna que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporcionan también los métodos para inducción de una respuesta inmune de un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es (o comprende) un antígeno. Se proporcionan también los métodos para la prevención o tratamiento de una condición (por ejemplo, una enfermedad tal como cáncer o una enfermedad infecciosa) en un hospedero, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para una bacteria Listeria (tal como un antígeno similar a un antígeno canceroso o un antígeno bacteriano no listerial) , en donde el polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión de la Listeria . En algunas modalidades, la optimización del codón del polinucleótido aumenta la expresión en y/o la secreción desde la bacteria Listeria del polipéptido (con relación a la secuencia no optimizada en el codón) . En algunas modalidades, el polipéptido extraño comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido extraño es un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno no bacteriano. Por ejemplo, el antígeno es, en algunas modalidades, un antígeno asociado al tumor o es derivado de tal antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido es K-Ras, H- Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o es un fragmento antigénico o variante antigénica de mesotelina. En algunas otras modalidades, el antígeno es NY-ESO-l, o es un fragmento antigénico o variante antigénica de NY-ESO-l. En algunas otras modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es un derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende al menos un polinucleótido que codifica para un péptido de señal en la estructura de lectura traduccional que el polipéptido extraño, de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido extraño. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal (el cual puede o no ser nativo para Listeria ) es optimizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La invención se refiere además un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además promotor operablemente enlazado a la primera y segunda molécula de ácido nucleico recombinante. Un vector (por ejemplo, un vector de expresión) que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión, es también proporcionado. La invención también proporciona un vector de Listeria recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y/o el cásete de expresión. En algunas modalidades, la bacteria Listeria pertenece a la especie Listeria monocytogenes . Se proporcionan también las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la bacteria Listeria recombinante. La invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en el hospedero hacia un antígeno, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante, en donde el polipéptido es (o comprende) el antígeno. Además, la invención proporciona los métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad). Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido extraño comprende el antígeno. En un aspecto más, la invención proporciona una bacteria de Listeria recombinante que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para la • bacteria Listeria (tal como un antígeno un antígeno canceroso o un antígeno bacteriano no listerial) , en donde el polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión de la Listeria, y un promotor, operablemente enlazado que codifica para el polipéptido extraño., En algunas modalidades, la bacteria Listeria pertenece a la especie Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, la optimización del codón del polinucleótido aumenta la expresión en y/o en la secreción de una bacteria Listeria del polipéptido (con relación a la secuencia no optimizada del codón) . En algunas modalidades, el polipéptido extraño comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido extraño es un antígeno, el cual, en algunos casos, puede ser un antígeno no bacteriano. Por ejemplo, el antígeno es, en algunas modalidades, un antígeno asociado al tumor o es derivado de tal antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido es K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o un derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA., En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o es un fragmento antigénico o variante antigénica de mesotelina. En algunas otras modalidades, el antígeno es NY-ESO-l, o un es un fragmento antigénico o variante antigénica de NY-ESO-l. En algunas otras modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende además un polinucleótido que codifica para un péptido de señal que está operablemente enlazado al promotor y en la misma estructura de lectura traduccional que el polipéptido extraño, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido extraño. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal (el cual puede o no ser nativo para Listeria ) es optimizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . Las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la vacuna Listeria recombinante son también proporcionadas. La invención proporciona además un método para inducir una respuesta inmune en el hospedero hacia un antígeno, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante. Además, la invención proporciona métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad) . Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido extraño comprende el antígeno. En un aspecto adicional, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante (por ejemplo Listeria monocytogenes) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no listerial; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no listerial y el polipéptido. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es colocada en un cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. De este modo, en algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante comprende un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, el cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico (por ejemplo, un cásete de expresión bicistrónico) . En algunas modalidades, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, el primero y segundo polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, la optimización del codón del primero y/o segundo polinucleótidos aumentan la expresión de la proteína de fusión y/o la secreción de la proteína de fusión dentro de la bacteria (con relación a la secuencia no optimizada en el codón) . En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y el péptido de señal son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria Listeria recombinante (por ejemplo, heterólogo para la bacteria Listeria) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado para el segundo polinucleótido comprende un antígeno (por ejemplo, un antígeno no listerial). El polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es, en algunas modalidades, un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana suprimido de su péptido de señal y el dominio ligador GPI. En algunas modalidades alternativas, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el péptido de señal es bacteriano. En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria intracelular. En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria gram positiva. En algunas modalidades, el péptido de señal es proveniente de una bacteria que pertenece al género Bacillus , Staphylococcus o Lacotococcus (por ejemplo, Bacillus anthracis , Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, o Lactococcus lactis) . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl (por ejemplo, el péptido de señal Usp45 de lactococcus lactis o el péptido de señal de antígeno protector proveniente de la Bacillus anthracis) . En algunas modalidades, el péptido de - señal es un péptido de señal secA2. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal Tat (por ejemplo, el péptido de señal PhoD de B . subtilis) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria está atenuada. Por ejemplo, en algunas modalidades, la Listeria es atenuada para la dispersión célula a célula, entrada a las células no fagocíticas o en la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante es deficiente con respecto a ActA, Internalina B, o Act A e Internalina B (por ejemplo, el mutante de doble supresión ?ActA?inlB) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante está suprimida en ActA, Internalina B, o Act A e Internalina B. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificada mediante reacción con una composición de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoralen) . La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la bacteria Listeria recombinante y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además una composición inmunogénica que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado para el segundo polinucleótido es un antígeno. La invención también proporciona una vacuna que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporcionan también los métodos para inducir la respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es (o comprende) un antígeno. También se proporcionan los métodos para preparar o tratar una condición (por ejemplo, una enfermedad tal el cáncer o una enfermedad infecciosa) en un hospedero, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante (por ejemplo, de la especie de Listeria monocytogenes) que comprende un cásete de expresión que incluye un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no listerial, un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional del primer polinucleótido, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. El cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no listerial, y el polipéptido. En algunas modalidades, la bacteria Listeria es atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada a las células fagocíticas, o en proliferación. En algunas modalidades, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, o el primero y el segundo polinucleótidos son optimizados en codón para la expresión en Listeria . En algunas modalidades, la optimización del codón del primero y/o segundo polinucleótido aumenta la expresión en y/o la secreción de la bacteria de la proteína de fusión codificada (con relación a la secuencia no optimizada en el codón) . En algunas modalidades, el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno, el cual, en algunos casos, puede ser un antígeno no bacterial. Por ejemplo, el antígeno es, en algunas modalidades, un antígeno asociado al tumor o es derivado de tal antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o derivados de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o es un fragmento antigénico o variante antigénica de mesotelina. En algunas modalidades, el antígeno es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica de NY-ESO-l. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En las modalidades preferidas, el péptido de señal es bacteriano. En algunas modalidades, el péptido de señal es proveniente de una bacteria que pertenece al gen Bacillus, Staphylococcus , o lactococcus . Por ejemplo, en algunas modalidades, el péptido de señal es Bacillus anthractis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, o Lactococcus lactis . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl, tal como un péptido de señal Usp45 de Lactococcus lactis o un péptido de señal de antígeno protector de Bacillus anthracis . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2. En otra modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal Tat, tal como el péptido de señal Tat de B . subtilis (por ejemplo, PhoD). Las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, y las vacunas que comprenden la bacteria Listeria recombinante descrita en la presente, son también proporcionadas. Además, la invención proporciona los métodos para utilizar la bacteria Listeria recombinante para inducir una respuesta inmune y/o para prevenir o tratar una condición tal como una enfermedad.

Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido extraño comprende el antígeno. La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una antolisina bacteriana, o un fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional como el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, en donde, la proteína quimera, el polipéptido es fusionado a la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, en donde, en la proteína quimera, el polipéptido es fusionado a la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma o está posicionado dentro la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma. En algunas modalidades, el primer polinucleótido codifica para una autolisina bacteriana. En algunas modalidades, la proteína quimera es catalíticamente activa con una autolisina. En algunas modalidades, la autolisina bacteriana es de una bacteria intracelular (por ejemplo, Listeria) . En algunas modalidades, la autolisina bacteriana es una autolisina bacteriana. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido que codifica para el polipéptido es colocado dentro del primer polinucleótido que codifica para la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, y la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera, en la cual el polipéptido es colocado dentro de la autolisina, o un fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma (por ejemplo, el polipéptido está incrustado dentro de la lisina o el fragmento catalíticamente activo o variante) . En algunas modalidades alternativas, el segundo polinucleótido es colocado fuera del primer polinucleótido que codifica para la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, y la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera en la cual está fusionado el polipéptido a la autolisina, o fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma. En algunas modalidades, el polipéptido es heterólogo a la autolisina. En algunas modalidades, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende la (c) un tercer polinucleótido que codifica para un péptido de señal en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido, y la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2 (tal como p60) . En algunas modalidades, el péptido de señal es el péptido de señal asociado con la autolisina en la naturaleza (por ejemplo, el péptido de señal es p60 y la autolisina es p60) . En algunas modalidades, la autolisina es una autolisina dependiente de secA2. En algunas modalidades, la autolisina es una peptidoglican-hidrolasa (por ejemplo, N-acetilmuramidasa o p60) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido es un antígeno (por ejemplo, un antígeno asociado al tumor, un antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, o un antígeno derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el antígeno se selecciona del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de una antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica de la misma. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y el ancla GPI . La invención también proporciona un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante, así como un vector de expresión que comprende el cásete de expresión. La invención proporciona además una bacteria recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, la bacteria recubrimiento es una bacteria intracelular, tal como una bacteria Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño a la bacteria recombinante. Se proporciona también una composición farmacéutica que comprende (a) la bacteria recombinante, y (b) un portador 7 farmacéuticamente aceptable. Además, se proporciona también una composición inmunogénica que incluye la bacteria recombinante en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. También se proporciona una vacuna que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. La invención también proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es (o comprende) el antígeno. Se proporciona también un método para prevenir o tratar una condición en un hospedero, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno . En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante que comprende un cásete de expresión policistrónico, en donde el cásete de expresión policistrónico codifica para dos polipéptidos no listeriales.

Por ejemplo, en algunas modalidades, el cásete de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica para el primer polinucleótido no listerial, un segundo polinucleótido que codifica para el segundo polipéptido no listerial, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende además una secuencia intergénica entre el primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, el cásete de expresión policistrónico es un cásete de expresión bicistrónico que codifica para dos polipéptidos no listeriales, discretos. En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante pertenece a la especie Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, al menos uno de los polipéptido no listeriales codificados por el cásete de expresión policistrónico, comprende un antígeno. En algunas modalidades, al menos dos de los polipéptidos no listeriales comprenden cada uno fragmento del mismo antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor, o es derivado de un antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el antígeno mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. En algunas modalidades, el antígeno es la mesotelina humana. En algunas modalidades, el antígeno es la mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y del ancla GPI . En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, al menos uno de los polipéptido no listeriales codificados por el cásete de expresión policistrónico comprende un péptido de señal (ya sea un péptido de señal listerial o péptido de señal no listerial) . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2. En otras modalidades, el péptido de señal es el péptido de señal Tat. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica para el péptido de señal, en donde el polinucleótido que codifica para el péptido de señal es optimizado en el codón para la expresión de Listeria . La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) una bacteria Listeria recombinante, y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. También se proporciona una composición inmunogénica que comprende la bacteria Listeria recombinante.

También se proporciona una vacuna que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporciona también un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante, en donde al menos uno de los polipéptidos no listeriales comprende un antígeno. Se proporciona también un método para prevenir o tratar una condición de un hospedero que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Listeria recombinante. Se proporciona también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde se proporciona al menos uno de los polipéptidos no listeriales codificados por el cásete de expresión policistrónico, que comprende el antígeno. En otros aspectos, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo para la proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado en el primer polinucleótido, y la proteína secretada, o el fragmento de la misma, y en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido está fusionado a la proteína secretada, o el fragmento de la misma, o está colocada dentro de la proteína secretada, o fragmento de la misma, en la proteína quimera. En algunas modalidades, la proteína secretada es una proteína secretada naturalmente (por ejemplo, una proteína que es secretada de su célula nativa) . En algunas modalidades, el tercer polinucleótido es colocado dentro del segundo polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, y el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido es colocado en la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera codificada por la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, el tercer polinucleótido es colocado fuera del segundo polinucleótido en molécula de ácido nucleico recombinante y el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido es fusionado a la proteína secretada al fragmento de la misma, en la proteína quimera. Un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante y que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero, segundo, y tercer polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante es también proporcionado. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de un antígeno asociado al tumor (por ejemplo, un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana o es la mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y el ancla GPI . En modalidades alternativas, el antígeno es un antígeno de enfermedad infecciosa o un derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. Un vector de expresión que comprende el cásete de expresión es también proporcionado. Se proporciona también las bacterias recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes. Es proporcionada también una bacteria Listeria recombinante (por ejemplo, Listeria monocytogenes) y en algunas modalidades, el polipéptido codificado por el tercer nucleótido es extraño para la bacteria Listeria . La invención también proporciona una composición inmunogénica que incluye la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el primer polinucleótido es un antígeno. También se proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante, en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido es (o comprende) un antígeno. Son proporcionadas también las composiciones farmacéuticas y las vacunas, que comprenden las bacterias, así como los métodos del uso de bacterias recombinantes o las composiciones que comprenden las bacterias para prevenir o tratar una condición en un hospedero. Se describe también el uso de la bacteria en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado para el tercer polinucleótido comprende el antígeno. En aspectos adicionales, la invención proporciona los métodos mejorados para expresar y secretar proteínas heterólogas en bacterias hospederas. La invención también proporciona los métodos para mejorar la expresión y la secreción de las proteínas heterólogas en bacterias. La invención proporciona también los métodos para elaborar la molécula de ácido nucleico recombinante, los casetes de expresión, los vectores de expresión y la bacteria recombinante descrita en la presente. La invención también proporciona una variedad de polinucleótidos útiles en la optimización de la expresión de polinucleótidos heterólogos en bacterias tales como Listeria . Se entenderá que las modalidades descritas en un grupo Markush, reivindicación de Markush, o a manera de "o lenguaje" abarca cada modalidad separada, cualquier combinación de cada una de las modalidades separadas, así como una invención que consiste de o que comprende todas y cada una de las modalidades separadas, a no ser que se indique explícitamente de otro modo o por el contexto. Descripciones adicionales de los aspectos y modalidades descritas en la presente, así como modalidades adicionales y aspectos adicionales de la invención, se proporcionan en seguida.

II . Moléculas de ácido nucleico recombinante La invención proporciona una variedad de polinucleótidos útiles para la expresión de polinucleótidos, tales como los polinucleótidos heterólogos en bacterias tales como Listeria . Por ejemplo, son proporcionados las moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden nuevas combinaciones de secuencias que codifican para los péptido de señal (o polipéptidos que comprenden péptido de señal) con las secuencias de codificación de los polipéptidos tales como los antígenos heterólogos. Se proporcionan las moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden secuencias polinucleótidos optimizadas en el codón. En algunas modalidades, estas moléculas de ácido nucleico recombinantes son heterólogas ya que éstas comprenden polinucleótidos (por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos) que no son naturalmente encontradas en combinación una con la otra como parte de la misma moléculas de ácido nucleico. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinantes son aisladas. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinantes son colocadas dentro de las secuencias de casetes de expresión, vectores de expresión, ADN plásmido dentro de la bacteria, y/o incluso el ADN genómico dentro de las bacterias (después de la inserción) . En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinantes proporcionan expresión y/o secreción aumentada del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido heterólogo) dentro de una bacteria. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es ADN. En algunas modalidades, la moléculas de ácido nucleico recombinantes es ARN. En algunas modalidades, el ácido nucleico recombinante es de hebra simple. En otras modalidades, el ácido nucleico recombinante es de doble hebra. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas en la presente codifican para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal y otro polipéptido, tal como un polipéptido heterólogo al péptido de señal. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal bacteriano. Se entiende que los componentes polipeptídicos registrados de una proteína de fusión pueden, pero no necesariamente, estar directamente fusionados uno a otro. Los componentes polipéptidos de una proteína de fusión pueden, en algunas modalidades, estar separados sobre la secuencia polipeptídica en una o más secuencias de aminoácidos de intervención. En algunas modalidades, el otro polipéptido es no bacteriano, por ejemplo, de mamífero o viral. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión de una bacteria; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno), en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En modalidades adicionales, el segundo polinucleótido (el polinucleótido codifica para polipéptido, tal como un antígeno) es también optimizado en el codón para la expresión de una bacteria. La bacteria para la cual el primero y/o el segundo polinucleótidos es optimizado en el codón, debe ser la bacteria de un tipo en el cual se pretenda colocar la molécula de ácido nucleico recombinante. En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo a una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión de la bacteria; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es heterólogo para el primer polinucleótido. En algunas modalidades, el polipéptido es heterólogo para la bacteria a la cual es nativo el péptido de señal (por ejemplo, extraño para la bacteria) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal, extraño para la bacteria, o ambos. En algunas modalidades, la bacteria de la cual es derivada el péptido de señal es una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Listeria, Bacillus , Yersinia pestis, Salmonella , Shigella , Brucella, micobacteria o E. coli . En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para una bacteria Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para una bacteria Listeria que pertenece a la especie Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria. En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria Listeria, y (b) un segundo polinucleótido codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional del primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para la bacteria Listeria . En algunas otras modalidades, el péptido de señal es extraño para la bacteria Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal es heterólogo para el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para la bacteria Listeria . En algunas modalidades, la bacteria Listeria pertenece a la especie Listeria monocytogenes . La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para una bacteria Listeria (por ejemplo, un antígeno del cáncer o de enfermedad infecciosa no listerial) , en donde el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño es optimizado en el codón a la expresión en la bacteria Listeria . En un aspecto más, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polinucleótido, tal como antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano no secAl es un péptido de señal secA2 o un péptido de señal Tat. En algunas modalidades, el primer polinucleótido que codifica para el péptido de señal no secAl es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria en la cual la molécula de ácido nucleico recombinante está destinada a ser colocada (por ejemplo, Listeria) . En algunas modalidades, el segundo polinucleótido codifica para un polipéptido, tal como un antígeno, es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria en la cual la molécula de ácido nucleico recombinante está destinada a ser colocada. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria en la cual la molécula de ácido nucleico recombinante va a ser incorporada o ha sido incorporada. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria en la cual la molécula de ácido nucleico recombinante va a ser incorporada o ha sido incorporada, y el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es también heterólogo para el péptido de señal.

La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, proteína heteróloga y/o antígeno) , y un tercer polinucleótido que codifica para una autolisina SecA2, o fragmento de la misma, en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde el segundo polinucleótido está colocado dentro del tercer polinucleótido o entre el primero y el tercer polinucleótido. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal, el polipéptido, y la autolisina. En algunas modalidades, el fragmento de la autolisina es catalíticamente activo como una autolisina. En algunas modalidades, la autolisina es proveniente de una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la autolisina es una peptidoglicano-hidrolasa. En algunas modalidades, la autolisina bacteriana es una autolisina listerial. En algunas modalidades, la autolisina es p60. En algunas modalidades, la autolisina es N-acetilmuramidasa . La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no listerial; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no listerial y el polipéptido. En algunas modalidades, el péptido de señal no listerial es heterólogo para el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido. En algunas modalidades, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, o ambos, es decir, el primero y segundo polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en una bacteria Listeria . La invención proporciona también una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o un fragmento antigénico o variante antigénica de la misma, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o catalíticamente activo variante de la misma, en donde, en la proteína quimera, el polipéptido está fusionado a la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o catalíticamente activo variante del mismo, o está colocada dentro de la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o catalíticamente activo variante del mismo. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido está colocado dentro del primer polinucleótido, y la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera en la cual el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido está colocado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o catalíticamente activo variante del mismo. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido está colocado fuera del segundo polinucleótido, y la segundo polinucleótido, y la molécula de ácido nucleico codifica para una proteína quimera en la cual el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido está fusionado a la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o catalíticamente activo variante del mismo. En algunas modalidades, el primer polinucleótido codifica para una autolisina. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además (c) un tercer polinucleótido que codifica para un péptido de señal en la misma estructura de lectura traduccional del primero y segundo polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido, y la autolisina, o fragmento catalíticamente activo o catalíticamente activo variante del mismo. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para la autolisina. En algunas modalidades, los fragmentos de la autolisina son al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, la autolisina es proveniente de una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la autolisina bacteriana es una autolisina listerial. Las variantes catalíticamente activas de una autolisina incluyen las variantes que difieren de la autolisina original en una o más sustituciones, supresiones, adiciones, y/o inserciones. En algunas modalidades, la autolisina es una peptidoglicano-hidrolasa . En algunas modalidades, la autolisina es p60. En algunas modalidades, la autolisina es N-acetilmuramidasa. Las autolisinas adicionales pueden ser identificadas y caracterizadas por zimografía, una técnica conocida por aquellos expertos en la materia (por ejemplo, Lenz, et al (2003), Proc. Nati. Acad. Sci EUA 100:12432-12437). La zimografía puede ser también utilizada para determinar si un fragmento y/o variante dada de una autolisina es catalíticamente activo como una autolisina. La técnica puede también ser utilizada para evaluar si una proteína quimera particular es o no catalíticamente activa como una autolisina. En algunas modalidades, los fragmentos y/o variantes catalíticamente activos de la autolisina son al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% tan catalíticamente activos como una autolisina como la autolisina nativa. En algunas modalidades, la proteína quimera es catalíticamente activa como una autolisina. En algunas modalidades, la proteína quimera es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% tan catalíticamente activa como una autolisina como la autolisina nativa. Otra opción más para la expresión de la proteína heteróloga es utilizar una proteína de "andamios" dentro de la cual una proteína heteróloga es funcionalmente insertada Xintra-estructuralmente" . En esta composición, los genes o contenidos completos del gen correspondiente a, por ejemplo, epitopos de la MHC de la clase I o MHC de la clase II son insertados dentro y a través de una proteína de andamio. La proteína de andamio puede ser una proteína bacteriana altamente expresada (tal como una proteína de Listeria, como LLO o p60) , pero en otra modalidades más, puede ser una proteína heteróloga que es seleccionada para su alta expresión, estabilidad, secreción y/o (falta de) inmunogenicidad. Los ejemplos representativos de proteína de andamio son ovalbúmina de pollo, u otras proteínas humanas, tales como ß-globina o albúmina. La invención proporciona también una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo para la proteína secretada, o fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido, y la proteína secretada, o fragmento de la misma, y en donde el polipéptido está fusionado a la proteína secretada, o fragmento de la misma, o está colocada dentro de la proteína secretada, o fragmento de la misma, en la proteína quimera. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido codifica para una proteína secretada. En algunas modalidades, la proteína secretada es una proteína que es secretada desde su célula nativa. En algunas modalidades, el tercer polinucleótido está colocado dentro del segundo polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, y el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido está colocado dentro de la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera codificada por la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, el tercer polinucleótido es colocado fuera del segundo polinucleótido en la molécula de ácido nucleico, y el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido es fusionado a la proteína secretada del fragmento de la misma, en la proteína quimera. En algunas modalidades, la proteína secretada es ovalbúmina. En algunas modalidades, es utilizada la forma truncada de la ovalbúmina. En algunas modalidades, la proteína secretada es p60. En algunas modalidades, la proteína secretada es N-acetilmuramidasa. En algunas modalidades, el péptido de señal es el péptido de señal normalmente asociado con una proteína secretada. En algunas modalidades, el péptido de señal es heterólogo a la proteína secretada. En algunas modalidades, los fragmentos de la proteína secretada son de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.

En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y el vector de expresión comprende una secuencia de codificación para un polipéptido que es extraño para la bacteria, incrustado dentro de parte o una secuencia de codificación entera de una proteína que es altamente expresada dentro de la bacteria. En algunas modalidades, la secuencia altamente expresada es nativa para la bacteria en la cual va a ser expresada la secuencia. En otras modalidades, la secuencia altamente expresada no es nativa para la bacteria en la cual va a ser expresada, pero no obstante proporciona suficiente expresión. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para al menos dos polipéptidos no listeriales discretos. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican para los polipéptidos no listeriales son optimizados en el codón para la expresión de una bacteria Listeria . Los métodos de preparación de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, incluyendo aquellas descritas anteriormente, son bien conocidas para fines de experiencia en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico recombinantes pueden ser preparadas mediante la síntesis de oligonucleótidos largos sobre un sintetizador de ADN, que se traslapan uno con el otro, y luego realizando la reacción de extensión y/o en la PCR para generar la cantidad deseada del ADN de doble hebra. El ADN de doble hebra puede ser cortado con enzimas de restricción e insertado dentro de los vectores de expresión o clonación deseados. El secuenciamiento puede ser inducido para verificar que haya sido obtenida la secuencia correcta. También a manera de ejemplo no limitante, alternativamente, una o más porciones de las moléculas de ácido nucleico recombinantes pueden ser obtenidas a partir de los plásmidos que contienen las porciones. La PCR de las porciones relevantes del plásmido y/o la enzima de restricción escisión de las porciones relevantes del plásmido pueden ser realizadas, seguido por ligadura y/o PCR para combinar los polinucleótidos relevantes, para generar las moléculas de ácido nucleico recombinantes deseadas. Tales técnicas son estándares en la materia. Las técnicas de clonación estándares pueden también ser utilizadas para insertar la secuencia de ácido nucleico recombinante dentro de un plásmido y replicar el ácido nucleico recombinante dentro de una célula hospedera tal como una bacteria. El ácido nucleico recombinante puede ser luego aislado de la célula hospedera. La presente invención también proporciona un método para utilizar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas en la presente, para producir una bacteria recombinante (por ejemplo, una bacteria Listeria recombinante) . En algunas modalidades, el método del uso de una molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente para elaborar una bacteria recombinante, que comprende la introducción de la molécula de ácido nucleico recombinante dentro de una bacteria. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es integrada dentro del genoma de la bacteria. En algunas otras modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante está sobre un plásmido que es incorporado dentro de la bacteria. En algunas modalidades, la incorporación de la molécula de ácido nucleico recombinante dentro de la bacteria ocurre mediante conjugación. La introducción dentro de la bacteria puede ser efectuada mediante cualquiera de las técnicas estándares conocidas en la técnica. Por ejemplo, la incorporación de la molécula de ácido nucleico recombinante en la bacteria puede ocurrir mediante conjugación, traducción (transfección) , o transformación.

III . Péptidos de señal En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de la invención que codifican para las proteínas de fusión o las proteínas quimeras que comprenden péptidos de señal y son adecuados para la expresión en y la secreción desde la células hospederas tales como bacterias. De este modo, en algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de la invención comprenden polinucleótidos que codifican para los péptidos de señal. Los términos "péptido de señal" y "secuencia de señal", son utilizados intercambiablemente en la presente. En algunas modalidades, el péptido de señal ayuda a facilitar la transportación de un polipéptido fusionado al péptido de señal a través de la membrana celular de una célula (por ejemplo, una célula bacteriana) de modo que el polipéptido es secretado desde la célula. En consecuencia, en algunas modalidades, el péptido de señal es un "péptido de señal secretor" o "secuencia secretora". En algunas modalidades, el péptido de señal es colocado en el extremo N-terminal del polipéptido que va a ser secretado. En algunas modalidades, la secuencia que codifica para el péptido de señal en la molécula de ácido nucleico recombinante o cásete de expresión es colocada dentro de la molécula de ácido nucleico recombinante o cásete de expresión, tal que el péptido de señal codificado efectuará la secreción del polipéptido al cual está fusionado desde la célula hospedera deseada (por ejemplo, una bacteria) . En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante o un cásete de expresión, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal es colocado en la estructura (ya sea directamente o separado por polinucleótidos de intervención) por el extremo 5' del polinucleótido que codifica para el polipéptido que va a ser secretado (por ejemplo, un polipéptido que comprende un antígeno) . En algunas modalidades, los péptidos de señal que son una parte de las proteínas de fusión y/o las proteínas quimeras codificadas por las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión, son heterólogas para al menos otra secuencia polipeptídica en la proteína de fusión y/o la proteína quimera. En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, es heterólogo (por ejemplo, extraño) para la bacteria dentro de la cual va a ser incorporada o ha sido incorporada la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión. En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para la bacteria en la cual va a ser incorporada la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal es optimizado en el codón para la expresión de una bacteria (por ejemplo, Listeria tal como ' Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el polinucleótido es optimizado en el codón para una bacteria particular es extraña para la bacteria. En otras modalidades, el polinucleótido que esta optimizado en el codón para una bacteria particular es nativo para esa bacteria. Una gran variedad de péptidos de señal son conocidos en la técnica. Además, son disponibles en la técnica una variedad de algoritmos y programas de software, tales como los algoritmos "SignalP", que pueden ser utilizados para producir las secuencias peptídicas de señal.

Por ejemplo, ver Antelman et al., Genome Res., 11:1484-502 (2001); Menne et al., Bioinformatics, 16:741-2 (2000); Nielsen et al., Protein Eng., 10:1-6 (1997); Zhang et al., Protein Sci., 13:2819-24 (2004); Bendtsen et al., J. Mol. Bio.,' 340:783-95 (2004) (regarding SignalP 3.0); Hiller et al., Nucleic Acids Res, 32: W375-9 (2004); Schneider et al, Proteomics 4:1571-80 (2004); Chou, Curr. Protein Pept . Sci., m3:615-22 (2002); Chah et al., Bionformatics, 19:1985-96 (2003); y Yuan et al., Biochem. Biophys. Res. Común. 312:1278-83 (2003) . En algunas modalidades, el péptido de señal es procariótico. En algunas modalidades alternativas, el péptido de señal es eucariótico. El uso de péptidos de señal procarióticos para la expresión de proteínas en Escherichia coli por ejemplo, se describe en Humphreys et al., Protein Expresión and Purifica tion, 20:252-264 (2000). En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal bacteriano. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal no listerial. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal listerial. En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria gram positiva. En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria intracelular . En algunas modalidades, el péptido de señal (por ejemplo, un péptido de señal bacteriano no secAl) utilizado en una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión, o vector de expresión es derivado de Listeria . En algunas modalidades, un péptido de señal es derivado de Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal de Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el péptido de señal no es derivado de Listeria , sino más bien es derivado de una bacteria diferente de una bacteria que pertenece al género de la Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es derivado de una bacteria Bacillus . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es derivado de Bacillus subtilis . En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria que pertenece al género Staphylococcus . En algunas modalidades, el péptido de señal es derivado de una bacteria Bacillus , Staphylococcus , o Lactococcus . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal proveniente de una bacteria Bacillus, Staphylococcus, o Lactococcus . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal derivado de Bacillus anthracis , Bacillus subtilis , Staphylococcus aureus, o Lactococcus lactis . En algunas modalidades, el péptido de señal bacterial es un péptido de señal proveniente de Bacillus anthracis . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es un péptido de señal proveniente de Bacillus subtilis . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es un péptido de señal proveniente de lactococcus lactis . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es un péptido de señal proveniente de Staphylococcus aureus . En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos en la presente, el péptido de señal que es derivado de un organismo, tal como una bacteria, es idéntico a una secuencia del péptido de señal de origen natural, obtenida a partir a partir del organismo. En otras modalidades, la secuencia del péptido de señal codificada por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión, y/o el vector de expresión es derivada de una secuencia del péptido de señal de origen natural, por ejemplo, un fragmento y/o una variante de una secuencia del péptido de señal de origen 1 natural, en donde el fragmento o la variante todavía funciona como un péptido de señal. Una variante incluye los polipéptidos que difieren de la secuencia original por una o más sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones. 5 Por ejemplo, en algunas modalidades el péptido de señal que es codificado por los polinucleótidos que tienen una o más mutaciones conservadoras. Los posibles cambios de aminoácidos conservadores son bien conocidos por aquellos expertos ordinarios en la técnica. Ver por ejemplo, Sección 10 IV de la Descripción Detallada, más adelante, para información adicional respecto a los cambios de aminoácidos conservadores . Un péptido de señal derivado de otro péptido de señal (por ejemplo, un fragmento y/o una variante del otro 15 péptido de señal) es preferentemente sustancialmente equivalente al péptido de señal original. Por ejemplo, la habilidad de un péptido de señal derivado de otro péptido de señal para funcionar como un péptido de señal, debe ser sustancialmente no afectada por las variaciones (supresiones, 20 mutaciones, etc.) realizadas a la secuencia del péptido de señal original. En algunas modalidades, el péptido de señal derivado es al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% capaz de funcionar como un péptido de 25. señal como la secuencia del péptido de señal nativo. En algunas modalidades, el péptido de señal tiene al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos al péptido de señal original. En algunas modalidades, las únicas alteraciones realizadas en la secuencia del péptido de señal son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los fragmentos de los péptidos de señal son preferentemente al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% de la longitud de los péptidos de señal originales. En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por un polinucleótido en las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión, o los vectores de expresión, es un péptido de señal secAl, un péptido de señal de secA2, o un péptido de señal de la traslocación de arginina gemela (Twin-arg) (Tat) . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2. En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal de traslocación de arginina gemela (Tat) . En algunas modalidades, estos péptidos de señal secAl, secA2, o Tat son derivados de Listeria . En algunas modalidades, estos péptidos de señal secAl, secA2, o Tat son derivados de no listeriales. Por ejemplo, en algunas modalidades, los péptidos de señal secAl, secA2 y Tat son derivados de bacteria que pertenece a uno de los siguientes géneros: Bacillus , Staphylococcus , o Lactococcus . Las bacterias utilizan diversas vías para la secreción de proteínas, incluyendo secAl, secA2, y traslocación de arginina gemela (Tat) . Cuál vía es utilizada, es ampliamente determinado por el tipo de secuencia de señal localizada en el extremo N-terminal de la pre-proteína. La mayor parte de las proteínas secretadas que utilizan la vía Sec, en la cual, la proteína se trasloca a partir del poro Sec proteico incrustado en la membrana bacteriana, en una conformación desplegada. En contraste, las proteínas que utilizan la vía Tat son secretadas en una conformación plegada. La secuencia nucleotídica que codifica para los péptidos de señal correspondientes a cualquiera de estas vías de secreción de proteína, deben ser fusionadas genéticamente, intra-estructuralmente a una secuencia de codificación de proteína heteróloga deseada. Los péptidos de señal contienen óptimamente un sitio de escisión de peptidasa de señal en su extremo carboxilo para la liberación de la proteína deseada auténtica dentro del ambiente extra-celular (Sharkov y Cai . 2002, J. Biol . Chem . 277:5796-5803; Nielsen et al. 1997 Protein Engineering 10:1-6; y, www. cbs . dtu. dk/services/SignalP/) .

Los péptidos de señal utilizados en los polinucleótidos de la invención, pueden ser derivados no únicamente de las vías de secreción diversas, sino también de diversos géneros bacterianos. Los péptidos de señal tienen en general una organización estructural común, que tiene un extremo N cargado (dominio N) , una región de núcleo hidrofóbico (dominio H) , y una región C Terminal más polar (dominio C) , no obstante, éstos no muestran conservación de la secuencia. En algunas modalidades, el dominio C del péptido de señal lleva una sitio de escisión de peptidasa de señal tipo I (SPasa I), que tiene la secuencia de consenso A-X-A, en las posiciones 1 y 3 en relación al sitio de escisión. Las proteínas secretadas por medio de la vía sec tienen péptidos de señal que promedian 28 residuos. La vía de supresión de proteínas secA2 fue primeramente descubierta en Listeria monocytogenes; los mutantes en el parálogo de secA2 son caracterizados por un fenotipo de .colonia rugosa sobre medio de agar, y un fenotipo de virulencia atenuada en ratones (Lenz y Portnoy, 2002 Mol . Microbiol . 45: 1043-1056; y Lenz et al. 2003 PNAS 100:12432-12437). Los péptidos de señal relacionadas a las proteínas secretadas por la vía Tat tienen una optimización tripartita similar a los péptidos de señal Sec, pero son caracterizados por poseer una porción RR (R-R-R-#-#, en donde # es una residuo hidrofóbico) , localizada en el límite del dominio N/dominio H. Los péptidos de señal Tat bacterianos promedian 14 aminoácidos más largos que los péptidos de señal sec. El secretoma de Bacillus subtilis puede contener tantas como 69 proteínas putativas que utilizan la vía de secreción del Tat, 14 de los cuales contienen un sitio de escisión SPasa I (Jungbloed et al. 2002 J. Biol . Chem . 277:44068-44078; Thlasma et al., 2000 Microbiol . Mol . Biol . Rev. 64:515-547). En la Tabla 1 siguiente se muestran los ejemplos no limitantes de los péptidos de señal que pueden ser utilizados en las composiciones de fusión (incluyendo las composiciones de proteína quimera) con un polipéptido seleccionado tal como un polipéptido heterólogo, dando como resultado la secreción desde la bacteria de la proteína codificada.

Tabla 1. Algunos péptidos de señal ejemplares * La autolisis bacteriana secretada por la vía sec (no se determinó secAl ó secA2) En consecuencia, en algunas modalidades, la secuencia que codifica para el péptido de señal codifica para un péptido de señal secAl. Un ejemplo de un péptido de señal secAl es el péptido de señal de Listeriolisina 0 (LLO) proveniente de Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante o el cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para un péptido de señal LLO, comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica para la secuencia LLO PEST. Otros ejemplos de péptidos de señal secAl adecuados para el uso en la presente invención incluyen los péptidos de señal provenientes del gen Usp45 en Lactococcus lactis (ver Tabla 1, anterior, y Ejemplo 12 siguiente) y Pag (Antígeno Protector) de Bacillus anthracis . De este modo, en algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal de antígeno protector proveniente de Bacillus anthracts . En algunas otras modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal diferente del péptido de señal del antígeno protector de Bacillus anthracts . Otro ejemplo más de un péptido de señal de secAl es el péptido de señal SpsB de Staphylococcus aureus (Sharkov et al., J. Biological Chemistry, 277:5796-5803 (2002)). En algunas modalidades alternativas, las secuencias de codificación heterólogas son genéticamente fusionadas con los péptidos de señal que son reconocidos por el complejo de secreción proteico de la vía de secA2. Un parálogo de SecA auxiliar (SecA2) ha sido identificado en nueve bacterias Gram positivas que provocan infecciones severas o letales en humanos. SecA2 es requerida para la secreción de un subgrupo de proteomas exportados (secretomas) de Listeria , Mycobacteria y Microbiol . , 44:1081-94 (2002); Lenz et al., Mol. Microbiol., 45:1043-1056 (2002), y Braunstein et al., J. Bacteriology, 183:6979-6990 (2002))). El SecA2 de Listeria monocytogenes fue identificado a través de su asociación con la variación lisa-rugosa bacteriana, y las mutaciones en la virulencia reducida de secA2 de L. monocytogenes y Mycobacterium tuberculosis . Por ejemplo, la proteína p60 de la Listeria es una autolisina peptidoglucano que es secretada por la vía de secA2. Como un ejemplo, el péptido de señal secA2 y el sitio de escisión de la peptidasa de señal de p60, puede ser vinculada genéticamente con el extremo amino de un gen que codifica para una proteína deseada (por ejemplo, antígeno). En una modalidad, la pre-proteína comprendida del péptido de señal secA2 y la fusión peptidasa de señal-antígeno es traducida desde un cásete de expresión dentro de una bacteria, transportada a través de la pared celular gram positiva, en la cual la proteína heteróloga auténtica es liberada hacia el medio extracelular. Alternativamente, puede ser incorporada una secuencia heteróloga "intra-estructuralmente" dentro de p60, tal que la proteína heteróloga es secretada en la forma de una proteína quimérica p60-heteróloga. La inserción de la secuencia de codificación de la proteína heteróloga intra-estructuralmente dentro de p60 puede ocurrir, por ejemplo, entre el sitio de escisión de la peptidasa de señal y la proteína p60 madura. En esta modalidad, la proteína quimérica conserva las señales de secreción apropiadas secA2 y también su actividad de autolisina, lo que significa que la proteína heteróloga es secretada como un pasajero gratuito de p60. La incorporación intra-estructural del antígeno heterólogo dentro de p60 puede ser - manipulada mediante ingeniería en cualquier punto dentro de p60 que conserve las actividades de secreción y de autolisina de la proteína p60. Un ejemplo de un cásete de expresión parcial, adecuado para la inserción del antígeno deseado u otra secuencia que codifica para el polipéptido heterólogo, se describe en el ejemplo 13, más adelante. En algunas modalidades, la proteína de fusión codificada por la molécula de ácido nucleico recombinante es una quimera que comprende una proteína bacteriana que tiene una propiedad particular deseable (además de la proteína heteróloga deseada tal como un antígeno) . En algunas modalidades, la quimera comprende una hidrolasa. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una quimera p60 que comprende la endopeptidasa p60, una peptidoglicano-hidrolasa que degrada la pared celular bacteriana. En algunas modalidades, la proteína de fusión codificada por la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una hidrolasa de L. monocytogenes, por ejemplo p60 (ver por ejemplo, Genbank acceso no. NP_464110) o una N-acetilmuramidasa (NamA) (Genbank acceso no. NP_466213) , las cuales son proteínas secretadas dependientes de secA2, que degradan la pared celular. Tales composiciones de proteínas quimeras particulares tomaron ventaja no solamente de los chaperones moleculares requeridos para la secreción de las proteínas bacterianas, sino también de la actividad de la proteína bacteriana - que puede facilitar su secreción. Las quimeras proteicas particulares comprendidas de la colocación precisa de una proteína heteróloga que codifica para la secuencia con una hidrolasa de L . monocytogenes dan como resultado la secreción eficiente de la proteína heteróloga. (Ver por ejemplo, el ejemplo específico, Ejemplo 29, más adelante) . En consecuencia, en algunas modalidades, el péptido de señal codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante como parte de una proteína de fusión es el péptido de señal p60. En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante como parte de una proteína de fusión es un péptido de señal NamA. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una tercera secuencia polinucleotídica que codifica para la proteína p60, o un fragmento de la misma, en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido que codifica para el péptido de señal p60 y el segundo polinucleótido que codifica para el otro polipéptido (por ejemplo, el antígeno) . La molécula de ácido nucleico recombinante que codifica entonces para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido (por ejemplo, un antígeno), y la proteína p60, o un fragmento de la misma. En tales modalidades, el segundo polinucleótido es preferentemente colocado ya sea dentro del tercer polinucleótido o entre el primero y tercer polinucleótido. En algunas modalidades, el péptido de señal secA2 es un péptido de señal secA2 derivado de Listeria . Por ejemplo, en algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2, tal como el péptido de señal p60 o el péptido de señal de N-acetilmuramidasa (NamA) proveniente de L . monocytogenes . Además, han sido identificadas otras proteínas de L . monocytogenes por no ser secretadas en ausencia de secA2 (Lenz et al., Mol. Microbiology 45:1043-1056 (2002)) y los polinucleótidos que codifican para los péptidos de señal provenientes de estas proteínas, pueden ser utilizadas en algunas modalidades. Además, los péptidos de señal secA2 provenientes de bacterias diferentes de Listeria, pueden ser utilizados en la expresión y secreción de proteínas heterólogas a partir de Listeria recombinante u otras bacterias. Por ejemplo, como un ejemplo ilustrativo pero no limitante, los péptidos de señal secA2 provenientes de B . anthracis pueden ser utilizados en las moléculas de ácido nucleico recombinantes y/o en los casetes de expresión. En otras modalidades, es utilizado un péptido de señal secA2 proveniente de S . aureus . Ver Tabla 1. Las proteínas secretadas por medio de la vía de SecA2 en otras bacterias han sido identificadas (ver por ejemplo, Braunstein et al., Mol. Microbiol., 48:453-64 (2003) y Bensing et al., Mol. Microbiol. 44:1081-94 (2002)). Proteínas adicionales secretadas por medio de la vía de secA2 pueden ser identificadas. Los heterólogos de SecA2 han sido identificados en un número de especies bacterianas (ver por ejemplo, Lenz et al., Mol. Microbiology 45:1043-1056 (2002) y Braunstein et al., J. Bacteriology, 183:6979-6990 (2001)). Homólogos de secA2 adicionales pueden ser identificados mediante comparación de secuencias adicionales utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia. Una vez que ha sido identificado un homólogo, el homólogo puede ser suprimido del organismo bacteriano para generar un mutante ?secA2. Las proteínas del sobrenadante de los cultivos bacterianos de tipo silvestre y mutante pueden ser precipitados con TCA y analizados mediante cualquiera de las técnicas proteómicas conocidas en la materia, para determinar cómo las proteínas son secretadas por las bacterias de tipo silvestre pero no el mutante ?secA2. Por ejemplo, las proteínas secretadas pueden ser analizadas por medios de SDS-PAGE y con tinción con plata. Las bandas resultantes pueden ser comparadas para identificar aquellas proteínas para las cuales la secreción no ocurrió en ausencia de SecA2 (Ver por ejemplo, Lenz et al., Mol.

Microbilogy 45:1043-1056 (2002)). Las secuencias N-terminales de estas proteínas pueden ser luego analizadas (por ejemplo, con un algoritmo para predecir el sitio de escisión del péptido de señal) para determinar la secuencia del péptido de señal secA2 utilizado por otra proteínas. El secuenciamiento N-terminal por degradación automatizada de Edman, puede ser también realizado para identificar la secuencia del péptido de señal. En modalidades alternativas, los polinucleótidos codifican para los polipéptidos (por ejemplo, secuencias polipeptídicas heterólogas) que están genéticamente fusionados con los péptidos de señal que son reconocidos por el complejo de secreción proteico de la vía Tat. La vía de secreción Tat es utilizada por las bacterias, incluyendo Listeria spp . , para la secreción de las proteínas que son plegadas dentro de la bacteria. Por ejemplo, la proteína YwbN de Listeria innocua tiene una porción Tat putativa en su extremo amino y de este modo utiliza la vía Tat para la secreción (GenBank acceso no. NP_469731 [gi/16799463/ref/NP_469731/ proteína hipotética conservada similar a la proteína YwbN de B . subtilis (Listeria inocua) , incorporada por referencia en la presente) . Otra proteína que contiene un péptido de señal Tat es la proteína YwbN de Listeria monocytogenes cepa EGD(e) (Genbank acceso no. NP 463897 [gi/6802412/ref/NP_463897.1/ la proteína hipotética conservada similar a la proteína YwbN de B . subtilis {Listeria monocytogenes EGD (e) ] ) . Como un ejemplo, el péptido de- señal YwbN y los sitios de escisión de la peptidasa de señal proveniente del YwbN pueden ser genéticamente enlazados con el extremo amino de un gen que codifica para una proteína deseada (por ejemplo, antígeno) . En esta composición, la pre-proteína comprendida del péptido de señal Tat y la fusión peptidasa de señal-antígeno será producida a partir de un cásete de recombinación dentro de la bacteria, transportada a través de la pared celular gram positiva, en la cual la proteína heteróloga auténtica es liberada hacia el medio extracelular. Otra proteína predicha para ser secretada de Listeria inocua por medio de la vía de Tat es la proteína sintasa portadora 3-oxoxacil-acilo (Genbank acceso no. NP_471636 [gi/16801368/ref/NP_471636.1/ similar a 3 (oxoacil (acil (proteína portadora sintasa {Listeria innocua) ] ) . Los polinucleótidos que codifican para las secuencias de señal provenientes de cualquiera de estas proteínas predichas para ser secretadas de Listeria por medio de las vías secretada de Tat, pueden ser utilizadas en los polinucleótidos, en los casetes de expresión, y/o en los vectores de expresión descritos en la presente. Las secuencias de señal Tat provenientes de estas bacterias pueden ser también utilizadas de péptidos de señal, incluyendo, pero no restringidas a, phoD de Bacillus subtilis . Los ejemplos de péptidos de señal Tat provenientes de Bacillus subtilis, tales como phoD, se describen en Jongbloed et al., J. of Biological Chemistry, 277: 44068- 44078 (2002); Jongbloed et al., 275: 41350-41357 (2000), Pop et al., 277: 3268-3273 van Dijl et al., Biotechnology, 98: 243-254 (2002); y Tjalsma et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64: 515-547 (2000), todos los cuales son incorporados por referencia en la presente en su totalidad. Otras proteínas identificadas en B . subtilis que han sido predichas para ser secretadas por la vía Tat incluyen aquellas secuencias que tienen los siguientes números de acceso de Genban/Embl: CAB15017 [gi/2635523/emb/CAB 5017.1/ similar a dos (histidina de cinasa de sensor componente (YtsA) (Bacillus subtilis)]; CAB12056 [gi/2632548/emb/CAB12056.1/ fosfodiesterasa/fosfatasa alcalina D (Bacillus subtilis)]; CAB12081 [gi/262573/emb/CAB1208.1/ similar a las proteínas hipotéticas (Bacillus subtilis); CAB13278 [gi/2633776/emb/CABl3278.1/ similar a proteínas hipotéticas (Bacillus subtilis)]; CAB14172 [gi/2634674/emb/CABl4172.1/ menaquinol : citocroma c oxidorreductasa (hierro (subunidad de azufre) (Bacillus subtilis)]; CAB15089 [gi/2635595/emb/CABl5089.1/yubF (Bacillus subtilis)]; y CAB15852 [gi/263636/emb/CAB15852.1/ nombre de gen alternativo; ipa (29d ~ similar a las proteínas hipotéticas (Bacillus subtilis) ] ; las secuencias de las cuales son todas incorporadas por referencia en la presente.

De este modo, en las mismas modalidades, el péptido de señal codificado por el polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante y/o los casetes de expresión es un péptido de señal Tat derivado de B. subtilis. La información sobre los péptidos de señal Tat provenientes de Pseudomonas aeuruginosa es proporcionada en Ochsner et al., PNAS, 99:8312-8317 (2002). También, los péptidos de señal Tat provenientes de una amplia variedad de otras bacterias son descritas en Dilks et al., J. of Bacteriology, 185: 1478-1483 (2003) y Berks et al., Molecular Microbiology, 35:260-274 (2000) , las cuales son incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. El péptido de señal Tat adicional puede ser identificado y definido de los péptidos de señal tipo sec por su porción de consenso "arginina gemela". Como se anotó anteriormente, los péptidos de señal relacionados a la proteínas secretadas por la vía Tat tienen una organización tripartita similar a los péptidos de señal Sec, pero son caracterizados por que tienen una porción RR (R-R-X-#-#, en donde # es un residuo hidrofóbico) localizado en el límite del dominio N/dominio H. Los péptidos de señal Tat son también en general más largos y menos hidrofóbicos que los péptidos de señal tipo Sec. Ver por ejemplo, Berks et al-, ADv. Microb . Physiol . , 47:187-254 (2003) y Berks et al., Mol .

Microbiol . 35:260-74 (2000). Además, pueden ser también utilizadas técnicas análogas a aquellas descritas anteriormente para la identificación de las proteínas secretadas por la vía de SecA2 y sus péptidos de señal SecA2 correspondientes, para identificar nuevas proteínas secretadas por medio de la vía Tat y sus péptidos de señal. La referencia Jongbloed et al-, J. Biological Chem . , 277:44068-44078 (2002) proporciona las ejemplos de técnicas que puedan ser utilizadas para identificar una proteína expresada por un tipo de bacteria como una proteína secretada por las vías de traslocación de arginina gemela.

IV. Polipéptidos Las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas en la presente, así como los casetes de expresión o los vectores de expresión descritos en la presente, pueden ser utilizados para codificar cualquier polipéptido deseado. En particular, las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y los vectores de expresión son útiles para caracterizar los polipéptidos heterólogos en una bacteria. En algunas modalidades (dependiendo de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, del cásete de expresión o del vector de expresión utilizado) , el polipéptido codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, es codificado como parte de una proteína de fusión con. un péptido de señal. En otras modalidades, el polipéptido codificado es codificado como polipéptido discreto por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión. En otras modalidades adicionales, el polipéptido codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión, es codificado como parte de una proteína de fusión que no incluye un péptido de señal. En otras modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión de la invención es codificado como parte de una proteína de fusión (también denominada en la presente como una proteína quimera) en la cual el polipéptido está incrustado dentro de otra secuencia polipeptídica. De este modo, se entiende que cada uno de los polipéptidos listados en la presente (más adelante y en otros sitios) , que son codificados por los polinucleótidos y las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión o los vectores de expresión de la invención, pueden ser expresados ya sea como proteínas de fusión (fusionados a péptidos de señal y/o a o dentro de otros polipéptidos) o como polipéptidos discretos por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión, o el vector de expresión, dependiendo de la molécula de ácido nucleico recombinante particular, del cásete de expresión o del vector de expresión utilizado. Por ejemplo, en algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un polinucleótido que codifica para el antígeno CEA codificará para CEA como una proteína de fusión con un péptido de señal. En algunas modalidades, el polipéptido es parte de una proteína de fusión codificada por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión, o vector de expresión y es heterólogo al péptido de señal de la proteína de fusión. En algunas modalidades, el polipéptido es colocado dentro de otra secuencia polipeptídica (por ejemplo, una proteína secretada o una autolisina, o fragmentos o variantes de la misma) para la cual es heteróloga. En algunas modalidades, el polipéptido es bacteriano (ya sea listerial o no listerial) . En algunas modalidades, el polipéptido es no bacteriano. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido es un polipéptido de mamífero. Por ejemplo, el polipéptido puede corresponder a una secuencia del polipéptido encontrado en humanos (por ejemplo, un polipéptido humano) . En algunas modalidades, el polipéptido es listerial. En algunas modalidades, el polipéptido es no listerial. En algunas modalidades, el polipéptido es no nativo (por ejemplo, es extraño) a la bacteria en la cual la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, va a ser incorporado o está incorporado. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el polipéptido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el polipéptido es completamente optimizado en el codón para la expresión de una bacteria. En algunas modalidades, el polipéptido que codificado por el polinucleótido optimizado en el codón es extraño para la bacteria (por ejemplo, es heterólogo para la bacteria) . El término "polipéptido" es utilizado intercambiablemente en la presente con "péptido" y "proteína" y no hay limitación con respecto a la longitud o al tamaño de la secuencia de aminoácidos comprendida en éste. Típicamente, no obstante, el polipéptido comprenderá al menos aproximadamente 6 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido comprenderá al menos 9, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, o al menos aproximadamente 50 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido comprende aproximadamente al menos 100 aminoácidos. En algunas modalidades, el polipéptido es un dominio particular de una proteína (por ejemplo, un dominio extracelular, un dominio intracelular, un dominio catalítico, o un dominio de enlace) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende una proteína completa (por ejemplo, de longitud completa) . En algunas modalidades, el polipéptido que es codificado por un polinucleótido de una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión, y/o vector de expresión comprende un antígeno o una proteína que proporciona un tratamiento paliativo para una enfermedad. En algunas modalidades, el polipéptido es codificado por un polinucleótido de una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión y/o el vector de expresión, es un antígeno o una proteína que proporciona un tratamiento paliativo para una enfermedad. En algunas modalidades, el polipéptido es codificado o es una proteína terapéutica (o comprende una proteína terapéutica) . En algunas modalidades, el polipéptido que es codificado por un polinucleótido de una molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o vector de expresión, comprende un antígeno (por ejemplo, cualquiera de los antígenos descritos en la presente) . En algunas modalidades, el polipéptido que es codificado por un polinucleótido de una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión o vector, es un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno bacteriano. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno bacteriano no listerial. En algunas modalidades, no obstante, el antígeno es un antígeno no listerial. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno no bacteriano. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de mamífero. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno humano. En algunas modalidades, el polipéptido es (o comprende) un antígeno que incluye uno o más epitopos inmunogénicos . En algunas modalidades, el antígeno comprende uno o más epitopos MHC de la clase I. En algunas modalidades, el antígeno comprende uno o más epitopos MHC de la clase II. En algunas modalidades, el epitopo es un epitopo de células T CD4+. En otras modalidades, el epitopo es un epitopo de células T CD8+. El polinucleótido que codifica para un antígeno no está limitado a alguna secuencia de ácido nucleico exacta (por ejemplo, aquella que codifica para un antígeno de longitud completa, de origen natural) pero puede ser de cualquier secuencia que codifica para un polipéptido que sea suficiente para promover la respuesta inmune deseada, cuando se administra a un individuo dentro de las bacterias o composiciones de la invención. El término "antígeno" como se utiliza en la presente, es también entendido para incluir los fragmentos de proteínas antigénicas más grandes, siempre y cuando los fragmentos sean antigénicos (por ejemplo inmunogénicos) . Además, en algunas modalidades, el antígeno codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión, puede ser una variante de una secuencia antigénica de origen natural. (Similarmente para los polinucleótidos que codifican para otras proteínas no antigénicas, las secuencias de los polinucleótidos que codifican para una proteína dada pueden variar siempre y cuando la proteína deseada que es expresada, proporcione el efecto deseado (por ejemplo, un efecto paliativo) cuando se administre a un individuo) . Un antígeno que es derivado de otro antígeno incluye otro antígeno que es un fragmento antigénico (por ejemplo, inmunogénico) del otro antígeno, una variante antigénica del otro antígeno, o una variante antigénica de un fragmento del otro antígeno. Una variante de una antígeno incluye los antígenos que difieren del antígeno original en una o más sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones . El fragmento antigénico puede ser de cualquier longitud, pero es más típicamente al menos de aproximadamente 6 aminoácidos, al menos de aproximadamente 9 aminoácidos, al menos de aproximadamente 12 aminoácidos, al menos de aproximadamente 20 aminoácidos, al menos de aproximadamente 30 aminoácidos, al menos de aproximadamente 50 aminoácidos, o al menos de aproximadamente 100 aminoácidos. Un fragmento antigénico de un antígeno comprende al menos un epitopo proveniente del antígeno. En algunas modalidades, el epitopo es un epitopo MHC de la clase I. En algunas modalidades, el epitopo es un epitopo MHC de la clase II . En algunas modalidades, el epitopo es un epitopo de células T CD4+. En otras modalidades, el epitopo es un epitopo de células T CD8+. Una variedad de algoritmos y paquetes de software útiles para predecir las regiones antigénicas (incluyendo epitopos) dentro de las proteínas, están disponibles para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los algoritmos que pueden ser utilizados para seleccionar epitopos que se enlazan a las moléculas MHC de la clase I y de la clase II, son públicamente disponibles. Por ejemplo, el algoritmo "SYFPEITHI" públicamente disponible puede ser utilizado para predecir los péptidos que se enlazan a MHC (Rammemensee et al. (1999) Immunogenetics 50:213-9). Para otros ejemplos de los algoritmos públicamente disponibles, ver las siguientes referencias: Parker et al. (1994) J. Immunol 152:163-75; Singh y Raghava (2001) Bioinformatics 17:1236-1237; Singh y Raghava (2003) Bioinformatics 19:1009-1014; Mallios (2001) Bionformatics 17:942-8; Nielsen et al. (2004) Bioinformatics 20:1388-97; Donnes et al. (2002) BMC Bioinformatics 3:25; Bhasin et al. (2004) Vaccine 22:3195-204; Guan et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:3621-4; Reche et al (2002) Hum. Immunolog. 63:701-9; Schirle et al (2001) J. Immunol Methods 257:1-16; Nussbau et al (2001) Immunogenetics (2001) 53:87- 94; Lu et al (2000) Cáncer Res. 60:5223-7. Ver también, por ejemplo, Vector NTI® Sutie (Informax, Inc., Bethesda, MD) , GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA) ; Willing, et al (1985) FEBS Lett. 188:215-218, Parker, et al. (1986) Biochemistry 25:5425-5432, Van Regenmortel y Pellequer (1994) Pept. Res. 7:224-228, Hopp y Woods (1981) PNAS 78:3823-3828, y Hopp (1993) Pept. Res. 6:183-190. Algunos de los algoritmos o los paquetes de software discutidos en las referencias listadas anteriormente en este párrafo, están dirigidas a la predicción de los péptidos o epitopos que se enlazan a MHC de la clase I y/o la clase II, diferentes de la identificación de sitios de escisión proteosómicos, y otros todavía para la predicción de la antigenicidad con base en la hidrofilicidad. Una vez que un fragmento antigénico candidato que se cree contiene al menos un epitopo de la naturaleza indicada ha sido identificado, la secuencia del polinucleótido que codifica para esta secuencia puede ser incorporado dentro de un cásete de expresión e introducido dentro de vector de vacuna de Listeria, u otro vector de vacuna bacteriana. La inmunogenicidad del fragmento antigénico puede ser luego confirmada mediante la evaluación de la respuesta inmune generada por la Listeria u otras bacterias que expresan los fragmentos. Los ensayos inmunológicos estándares tales como los ensayos ELISPOT, ensayo de tinción de citosina intracelular (ICS) , ensayos de actividad de células T citotóxicas, o similares, pueden ser utilizados para verificar que el fragmento del antígeno elegido mantiene la inmunogenicidad deseada. Los ejemplos de estos tipos de ensayo son proporcionados en los ejemplos más adelante (ver por ejemplo, Ejemplo 21). Además, la eficacia anti-tumoral de las vacunas listeriales y/o bacterianas puede ser también evaluada utilizando los métodos descritos más adelante en los ejemplos (por ejemplo, la implantación de células de colon murino CT26 que expresan el fragmento antigénico en ratones, seguido por la vacunación de los ratones con la vacuna candidata y la observación del efecto sobre el tamaño tumoral, la metástasis, la supervivencia, etc., con relación a los controles y/o al antígeno de longitud completa) . Además, las bases de datos grandes que contienen la información del epitopo y/o el ligando MHC, que se utilizan para la identificación de fragmentos antigénicos, son públicamente disponibles. Ver por ejemplo, Brusic et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:368-371; Schombach et al. (2002) Nucleic Acids Research 30:226-9; y Bhasin et al. (2003) Bioinformatics 19:665-666; y Rammensee et al (1999) Immunogenetics 50:213-9. La secuencia de aminoácidos de una variante antigénica tiene al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98% de identidad al antígeno original. En algunas modalidades, la variante antigénica es una variante conservadora que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad al antígeno original y las sustituciones entre la secuencia de la variante antigénica y el antígeno original, son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las siguientes sustituciones son consideradas como sustituciones conservadoras de aminoácidos: valina, isoleucina, o leucina son sustituidas por alanina; lisina, glutamina, o asparagina son sustituidas por arginina; histidina, lisina, o arginina son sustituidas por asparagina; ácido glutámico es sustituido por ácido aspártico; serina es sustituida por cisteína; asparagina es sustituida por glutamina; ácido aspártico es sustituido por ácido glutámico; prolina o alanina es sustituida por glicina; asparagina, glutamina, lisina o arginina es sustituida por histidina; leucina, valina, metionina, alanina, fenilalanina, o norleucina es sustituida por isoleucina; norleucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, o fenilalanina es sustituida por leucina; arginina, glutamina o asparagina es sustituida por lisina; leucina, fenilalanina, o isoleucina, es sustituida por metionina; leucina, valina, isoleucina, alanina, o tirosina es sustituida por fenilalanina; alanina es sustituida por prolina; treonina es sustituida por serina; serina es sustituida por treonina; tirosina o fenilalanina es sustituida por triptofano; triptofano, fenilalanina, treonina, o serina es sustituida por tirosina; triptofano, fenilalanina, treonina, o serina es sustituida por tirosina; isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, alanina, o norleucina es sustituida por valina. En algunas modalidades, la variante antigénica es una variante conservadora que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad al antígeno original. En algunas modalidades, un antígeno derivado de otro antígeno es sustancialmente equivalente al otro antígeno. Un antígeno derivado de otro antígeno es sustancialmente equivalente al antígeno original del cual se deriva, si el antígeno derivado tiene al menos 70% de identidad en la secuencia de aminoácidos al antígeno original y mantiene aproximadamente 70% de la inmunogenicidad del antígeno original. En algunas modalidades, el antígeno sustancialmente equivalente tiene al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos al antígeno original. En algunas modalidades, el antígeno sustancialmente equivalente comprende únicamente sustituciones conservadoras con relación al antígeno original. En algunas modalidades, el antígeno sustancialmente equivalente mantiene aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% de la inmunogenicidad del antígeno original. Para determinar la inmunogenicidad de un antígeno derivado particular, y compararla a aquella del antígeno original para determinar si el antígeno derivado es o no sustancialmente equivalente al antígeno original, se puede probar que el antígeno derivado y el original en cualquiera de un número de ensayos de inmunogenicidad conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la Listeria que expresa ya sea el antígeno original o el antígeno derivado, puede ser preparada como se describe en la presente. La habilidad de aquellas Listerias que expresan los diferentes antígenos para producir una respuesta inmune, puede ser medida mediante la vacunación de los ratones con Listeria y evaluando luego la respuesta inmunogénica, utilizando las técnicas estándares de ensayo de ELISPOT, ensayo de tinción de citocina intracelular (ICS) , ensayos de actividad de células T citotóxicas, o similares. Los ejemplos de estos ensayos son proporcionados en los ejemplos siguientes (ver por ejemplo, Ejemplo 21). En algunas modalidades, el polipéptido codificado or un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o vector de expresión, comprende un antígeno. En algunas modalidades, el antígeno se selecciona de un grupo que consiste de un antígeno asociado al tumor, un polipéptido derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, y un polipéptido derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, comprende un antígeno asociado al tumor o comprende un antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el polipéptido codificado comprende más de un antígeno que es un antígeno asociado al tumor o un antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido codificado comprende mesotelina (o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo) y K-Ras, 12-K-Ras o PSCA (o un fragmento antigénico o variante antigénica de K-Ras, 12-K-Ras, o PSCA) . En algunas modalidades, el antígeno codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, es un antígeno asociado al tumor o es un antígeno que es derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, un polinucleótido en una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión y/o vector de expresión, codifica para un antígeno (o codifica para un polipéptido que comprende un antígeno) que no es idéntico a un antígeno asociado al tumor, sino más bien es un antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno codificado por un polinucleótido de una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión y/o vector de expresión puede comprender un fragmento de un antígeno asociado al tumor, una variante de un antígeno asociado al tumor o una variante de un fragmento de un antígeno asociado al tumor. En algunos casos, un antígeno, tal como un antígeno tumoral, es capaz de inducir una respuesta inmune más significativa en una vacuna, cuando la secuencia de aminoácidos difiere ligeramente de aquella endógena para un hospedero. En otros casos, el antígeno derivado induce una respuesta inmune menos significativa que el antígeno original, pero por ejemplo, es más conveniente para la expresión heteróloga en un vector de vacuna listerial debido a un tamaño más pequeño. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una variante de un antígeno asociado al tumor o una variante de un fragmento de un antígeno asociado al tumor, difiere de aquella del antígeno asociado al tumor o su fragmento correspondiente por uno o más aminoácidos . El antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor comprenderá al menos una secuencia de epitopo capaz de inducir la respuesta inmune deseada después de la expresión del polinucleótido que codifica para el antígeno dentro de un hospedero. En consecuencia, en algunas modalidades, un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, codifica para un polipéptido que comprende un antígeno derivado de un antígeno asociado al tumor en donde el antígeno comprende al menos un fragmento antigénico de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector, codifica para un antígeno que es derivado de un antígeno asociado al tumor, en donde el antígeno comprende al menos un fragmento antigénico de un antígeno asociado al tumor. El fragmento antigénico comprende al menos un epitopo del antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, el antígeno que es derivado del antígeno asociado al tumor es un fragmento antigénico (por ejemplo, inmunogénico) o una variante antigénica del otro antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un fragmento antigénico del otro antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es una variante antigénica del otro antígeno. 32 Un gran número de antígenos asociados al tumor que son reconocidos por las células T han sido identificados (Renkvist et al., Cáncer Lmmunol Innumother 50:3-15 (2001)). Estos antígenos asociados al tumor pueden ser antígenos de diferenciación (por ejemplo, PSMA, Tyrosinasa, gp 100), antígenos específicos del tejido (por ejemplo, PAP, PSA) , antígenos del desarrollo, antígenos virales asociados al tumor (por ejemplo HPV 16 E7), antígenos de cáncer de testículos (por ejemplo, MAGE, BAGE, NY-ESO-l), antígenos embrionarios (por ejemplo, CA, alfa-fetoproteína) , antígenos de oncoproteína (por ejemplo, Ras, p53) , antígenos de proteínas sobreexpresadas (por ejemplo, ErbB2 (Her2/Neu) , MUCI) , o antígenos de proteína mutada. Los antígenos asociados al tumor que pueden ser codificados por las secuencias de ácido nucleico heteróloga, incluyen pero no están limitados a, 707-AP, Anexina II, AFP, ART-4, BAGE, p-catenina/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl pl90, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA (Huang et al., Exper Rev. Yacanes (2002)1:49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-Bl), EphA2 (Zantek et al., Cell Growth Differ. (1999) 10:629-38; Carles-Kinch et al., Cáncer Res . (2002) 62:2840-7), ELF2M, EphA2 (Zantek et al., Cell Growth Differ. (1999) 10:629-38; Carles-Kinch et al., Cáncer Res . (2002) 62:2840-7), ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT- V, gplOO, HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, H-Ras, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, inhibidores de la apoptosis (por ejemplo, survivina), KIAA0205, K-Ras, 12-K-Ras (K-Ras con la mutación del codón 12), LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D, MART-1, MART-1/Melan-A, MC1R, MDM-2, mesotelina, Miosina/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, neo-poliA polimerasa, NA88-A, N-Ras, NY-ESO-l, NY-ESO-la (CAG-3) , PAGE-4, PAP, Proteinasa 3 (PR3) (Molldrem et al., Blood (} 996) 88:2450-7; Molldrem et al., Blood (1997) 90:2529-34), P15, p!90, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RUI, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/ , Tirosinasa, TARP, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1, y las proteínas NY-ESO-ORF2 y CAMEL alternativamente traducidas, derivadas de los genes NY-ESO-l y LAGE-1. En algunas modalidades, el antígeno codificado por el polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector puede abarcar el antígeno asociado al tumor que pueda promover una respuesta inmune específica del tumor, incluyendo los antígenos todavía por ser identificados. En algunas modalidades, el polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector, codifica para más de un antígeno asociado al tumor.

En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina (Argani et al., Clin Cáncer Res . 7(12): 3862-8 (2001)), Spl7 (Lim et al., Blood 97 (5) : 1508-10 (2001)), gplOO (Kawakami et al., Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 91:6458 (1994)), PAGE-4 (Brink ann et al., Cáncer Res . 59(7): 1445-8 (1999)), TARP (Wolfgang et al., Proc. Nati . Acad Sci . USA 97 (17) : 9437-42 (2000)), EphA2 (Tatsu i et al., Cáncer Res. 63 (15) : 4481-9 (2003)), PR3 (Muller-Berat et al., Clin. Immunol . Immunopath. 70(l):51-9 (1994)), antígeno de células madre de la próstata (PSCA) (Reiter et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 95:1735-40 (1998); Kiessling et al., Int. J. Cáncer, 102:390-7 (2002)), ó SPAS-1 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0150588) . En algunas modalidades, de la invención, el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, o el cásete de expresión es CEA. En algunas modalidades, el antígeno es un fragmento antigénico y/o una variante antigénica de CEA. CEA es una glucoproteína de adhesión intercelular de la membrana, de 180 kDA, que es sobreexpresada en una proporción significativa de tumores humanos, incluyendo 90% de los cánceres colorrectal, gástrico o pancreático, 70% del cáncer de pulmón de células no pequeñas, y 50% del cáncer de mama (Hammarstrom, Semin .

Cáncer Biol . , 9:67-81). Una variedad de agentes inmunoterapéuticos tales como el anticuerpo monoclonal anti- idiotipo imitan a CEA (Foon et al., Clin . Cáncer Res . , 87:982-90 (1995), o la vacunación utilizando un virus de la vaccinia recombinante que expresa CEA (Tsang et al., J. Nati Cáncer Inst . , 87:982-90 (1995)) han sido investigados, desafortunadamente, no obstante, con éxito limitado. No obstante, los investigadores han identificado un epitopo restringido a HLA* 0201, CAP-1 (CEA605-613) , que es reconocido por las líneas de células T humanas que fueron generadas a partir de pacientes vacunados. La vacunación de pacientes con DC pulsadas con ese epitopo, falló en inducir respuestas clínicas (Morse et al., Clin . Cáncer Res . , 5:1331-8 (1999)). Recientemente, fue identificado un agonista del péptido CEA605-613 con una sustitución heteroclítica de aspartato a asparagina en la posición 610 (CAP1-6D) . Aunque esta sustitución de aminoácido no alteró la afinidad del enlace de MHC de este péptido, el uso del ligando peptídico alterado (APL) dio como resultado la generación mejorada de linfocitos T citotóxicos específicos de CEA (CTT) in vitro. Los CTL específicos de CAP1-6D mantuvieron su habilidad para reconocer y lisar las células tumorales que expresan CEA nativa ( (Zaremba et al., Cáncer Res . , 51: 4570-7 (1997); Salazar et al., Int . J. Cáncer, 85:829-38 (2000)). Fong et al. demostraron la inducción de la inmunidad específica de CEA en pacientes con cáncer de colon, vacunados con DC expandidas con el ligando Flt3, incubadas con este APL.

Alentadoramente, 2 de 12 pacientes después de la vacunación experimentaron regresión dramática del tumor, que correlacionó con la inducción de las células T del tetrámero+ péptido-MHC (Fong et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . U. S . A. , 98:8809-14 (2001)). En otra modalidad más, el antígeno es la proteinasa 3 o es derivada de la proteinasa 3. Por ejemplo, en una modalidad, el antígeno comprende el péptido PR1 restringido en HLA-A2.1- (aa 169-177; VLQELNVTV (SEQ ID NO: 63)). La información sobre la proteinasa 3 y/o el epitopo PR1 es disponible en las siguientes referencias: Patente de los Estados Unidos No. 5,180,819, Molldrem, et al., Blood, 90:2529-2534 (1997); Molldrem et al., Cáncer Research , 59:2675-2681 (1999); Molldrem, et al., Nature Medicine, 6:1018-1023 (2000); y Molldrem et al., Oncogene, 21: 8668-8673 (2002). En algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector, comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o comprende un antígeno derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido 'en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector, comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, T-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el polipéptido comprende K-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende H-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende K-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende mesotelina (por ejemplo, mesotelina humana) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende PSCA. En algunas modalidades, el polipéptido comprende NY-ESO-l . En algunas modalidades, el polipéptido comprende T-1. En algunas modalidades, el polipéptido comprende survivina. En algunas modalidades, el polipéptido comprende gplOO. En algunas modalidades, el polipéptido comprende PAP. En algunas modalidades, el polipéptido comprende proteinasa 3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende SPAS-1. En algunas modalidades, el polipéptido comprende SP-17. En algunas modalidades, el polipéptido comprende PAGE-4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende TARP. En algunas modalidades, el polipéptido comprende CEA. En algunas modalidades, el antígeno codificado en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión, y/o el vector, es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, T-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el antígeno es K-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es H-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es N-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es K-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina. En algunas modalidades, el antígeno es PSCA. En algunas modalidades, el antígeno es NY-ESO-l. En algunas modalidades, el antígeno es WT-1. En algunas modalidades, el antígeno es survivina. En algunas modalidades, el antígeno es gplOO. En algunas modalidades, el antígeno es PAP. En algunas modalidades, el antígeno es proteinasa 3. En algunas modalidades, el antígeno es SPAS-1. En algunas modalidades, el antígeno es SP-17. En algunas modalidades, el antígeno es PAGE-4. En algunas modalidades, el antígeno es TARP. En algunas modalidades, el antígeno es CEA. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina humana . En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, SPAS-1, proteinasa-3, EphA2, SP-17, gplOO, PAGE-4, TARP, o CEA, o un antígeno derivado de una de estas proteínas. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina o es derivado de mesotelina. En algunas modalidades, el antígeno es EphA2 o es un antígeno derivado de EphA2. En algunas modalidades, el antígeno codificado por un polinucleótido en una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión o vector de expresión descrito en la presente, no es Epha2 (o un antígeno derivado de Epha2). En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor, diferente de Epha2. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de un antígeno asociado al tumor, diferente de Epha2. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión comprende un antígeno diferente de Epha2. En algunas modalidades, el vector de expresión codificado por un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, comprende un antígeno diferente de Epha2 o un antígeno derivado de Epha2. En algunas modalidades, un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, codifica para un polipéptido que comprende un antígeno derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de K-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de H-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de N-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de 12-K-Ras. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de mesotelina. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de PSCA. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de NY-ESO-l. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de WT-1. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de survivina. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de gplOO. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de PAP. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de proteinasa 3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de SPAS-1. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de SP-17. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de PAGE-4. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de TARP. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de CEA. En algunas modalidades, un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión, y/o vector de expresión, codificada para un antígeno derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de K-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de H-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de N-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de 12-K-Ras. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de mesotelina. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de PSCA. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de NY-ESO-l. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de WT-1. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de survivina. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de gplOO. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de PAP. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de proteinasa 3. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de SPAS-1. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de SP-17. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de PAGE-4. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de TARP. En algunas modalidades, el antígeno es derivado de CEA. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina, o un fragmento antigéníco o variante antigénica de la misma. De este modo, en algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector, comprende mesotelina, o una fragmento antigénico o variante antigénica de la misma. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido es mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica de la misma. En algunas modalidades, el antígeno es mesotelina (por ejemplo, mesotelina humana) en la cual el péptido de señal de mesotelina y/o el ancla de GPI (glucosilfosfatidilinositol) ha sido suprimido. En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido comprende mesotelina en la cual el péptido de señal de mesotelina y/o el ancla de GPI han sido suprimidos. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido es mesotelina en la cual el péptido de señal de mesotelina y/o el ancla de GPI ha sido suprimido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido es mesotelina humana en la cual el péptido de señal de mesotelina y/o el ancla de GPI ha sido suprimido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el polinucleótido es mesotelina humana en la cual el péptido de señal de mesotelina y/o el ancla de GPI ha sido suprimido . En algunas modalidades, el antígeno es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. De este modo, en algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector, comprende un antígeno que es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. En algunas modalidades, el polipéptido es un antígeno que es NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. En algunas modalidades, un polipéptido codificado por el polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector comprende al menos un fragmento antigénico de un antígeno asociado al tumor, por ejemplo, el antígeno de células madre de próstata humana (PSCA; GenBank Acc. No. F043498) , antígeno de testículos humanos (NY-ESO-l; GenBank Acc. No. NM 001327), antígeno carcinoembrionario humano (CEA; GenBank Acc. No. M29540), mesotelina humana (GenBank Acc. No. U40434) , survivina humana (GenBank Acc. No. U75285) , proteinasa 3 humana (GenBank No. X55668), K-Ras humana (GenBank Acc. Nos. M54969 y POI 116), H-Ras humana (GenBank Acc. No. POI 112), N-Ras humana (GenBank Acc. No. POI 111), y 12-K-Ras humana (K-Ras que comprende una mutación Glyl2Asp) (ver por ejemplo, GenBank Acc. No. K00654). En algunas modalidades, un polipéptido codificado por el polinucleótido en una molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión, comprende un fragmento antigénico de un antígeno asociado al tumor, con al menos un aminoácido conservadoramente sustituido. En algunas modalidades, un polipéptido codificado por el polinucleótido en una molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión, comprende un fragmento antigénico con al - menos un residuo de aminoácido suprimido. En algunas modalidades, un polipéptido codificado por el polinucleótido en una molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión, comprende combinaciones de secuencias antigénicas derivadas de más de un tipo de antígeno asociado al tumor, por ejemplo una combinación de fragmentos antigénicos derivados de mesotelina y Ras. Las regiones ejemplares de los antígenos tumorales predichos para ser antigénicos incluyen las siguientes: los aminoácidos 25-35; 70-80; y 90-118 de la secuencia de aminoácidos de PSCA GenBank Acc. No. AF043498; los aminoácidos 40-55, 75-85, 100-115, y 128-146 de NY-ESO-l de GenBank Acc. No. NM_001327; los aminoácidos 70-75, 150-155, 205-225, 330-340, y 510-520 de la secuencia de aminoácidos de CEA de GenBank Acc. No. M29540; los aminoácidos 90-110, 140-150, 205-225, 280-310, 390-410, 420-425, y 550-575; de la secuencia polipeptídica de mesotelina de GenBank Acc. No. U40434; los aminoácidos 12-20, 30-40, 45-55, 65-82, 90-95, 102-115, y 115-130 de la secuencia polipeptídica superviviente de GenBank Acc. No. U75285; los aminoácidos 10-20, 30-35, 65-75, 110-120, y 160-170, de la secuencia de aminoácidos de la proteinasa-3 encontrada en GenBank Acc. No. X55668; los aminoácidos 10-20, 30-50, 55-75, 85-110, 115-135, 145-155, y 160-185 de GenBank Acc. Nos. P01117 o M54968 (K-Ras humano); los aminoácidos 10-20, 25-30, 35-45, 50-70, 90-110, 115-135, y 145-175 de GenBank Acc. No. P01112 (human H-Ras); los aminoácidos 10-20, 25-45, 50-75, 85-110, 115-135, 140-155, y 160-180 de GenBank Acc. No. P01111 (N-Ras humano); y los primeros 25 aminoácidos de 12-K-Ras (secuencia descrita en GenBank Acc. No. K00654). Estas regiones antigénicas fueron predichas por las gráficas de antigenicidad de Hopp-Woods y Welling. En algunas modalidades, los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención ya sea como polipéptidos discretos, como proteínas de fusión con el péptido de señal elegido o como una proteína quimera en la cual ha sido insertado el polipéptido- en otro polipéptido, son polipéptidos que comprenden uno o más de los siguientes péptidos de la mesotelina humana: SLLFLLFSL (aminoácidos 20-28; (SEQ ID NO:64)); VLPLTVAEV (aminoácidos 530-538; (SEQ ID NO: 65)); ELAVALAQK (aminoácidos 83-92; (SEQ ID NO: 66)); ALQGGGPPY (aminoácidos 225-234; (SEQ ID NO:67)); FYPGYLCSL (aminoácidos 435-444; (SEQ ID N0:68)); y LYPKARLAF (aminoácidos 475-484; (SEQ ID N0:69)). Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno codificado por un polinucleótido de la invención es un fragmento (antigénico) de la mesotelina humana que comprende uno o más de estos péptidos. La información adicional concerniente a estas secuencias peptídicas de mesotelina y su correlación con la respuesta inmune médicamente relevante, puede ser encontrada en la publicación del PCT WO 2004/006837. Alternativamente, los polinucleótidos en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión pueden codificar para un antígeno específico de enfermedades autoinmune (o un polipéptido que comprende un antígeno específico de enfermedades autoinmunes) . En una enfermedad autoinmune mediada por células T, una respuesta de células T a los autoantígenos da como resultado la enfermedad autoinmune. El tipo de antígeno para el uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune con las vacunas de la presente invención que puede dirigirse a las células T específicas responsables de la respuesta autoinmune. Por ejemplo, el antígeno puede ser parte de un receptor de células T, el idiotipo, específico para aquellas células T que provocan una respuesta autoinmune, en donde el antígeno incorporado dentro de una vacuna de la invención podría provocar una respuesta inmune específica para aquellas células T que provocan la respuesta autoinmune. Eliminar esas células T podría ser el mecanismo terapéutico para aliviar la enfermedad autoinmune. Otra posibilidad sería incorporar dentro de la molécula de ácido nucleico recombinante un polinucleótido que codifique para un antígeno que dará como resultado una respuesta inmune que dirige anticuerpos que son generados a los autoantígenos, en una enfermedades autoinmune o dirigirse a los clones de células B específicos que secretan los anticuerpos. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un antígeno idiotipo puede ser incorporado dentro de la molécula de ácido nucleico recombinante que da como resultado una respuesta inmune anti-idiotipo para tales células B y/o los anticuerpos que reaccionan con los auto-antígenos en una enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunes tratables con vacunas que comprenden las bacterias que comprenden los casetes de expresión y las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, lupus, miastenia gravis, vitíligo, esclerodermia, psoriasis, pénfigo vulgar, fibromialgia, colitis y diabetes. Un procedimiento celular puede ser emprendido para tratar respuestas alérgicas, donde los antígenos incorporados dentro de la bacteria de la vacuna se dirige ya sea a las células T, a las células B, o a los anticuerpos que son efectivos en modular la reacción alérgica. En algunas enfermedades autoinmunes, tales como la psoriasis, la enfermedad da como resultado crecimiento celular hiperproliferativo con expresión de antígenos a los que se puede dirigir también. Tal antígeno que dará como resultado una respuesta inmune hacia las células hiperprofilerativas, es también considerado. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno que se dirige a estructuras proteicas únicas asociadas a la enfermedad. Un ejemplo de esto es la dirección de los anticuerpos, las células B o las células T, utilizando antígenos idiotipo como se discute anteriormente. Otra posibilidad es dirigirse a las estructuras proteicas únicas que resultan de una enfermedad particular. Un ejemplo de esto podría ser incorporando un antígeno que generará una respuesta inmune hacia las proteínas que provocan las placas amiloides observadas en enfermedades tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) y encefalopatía espongiforme bovina (BSE) . Mientras este procedimiento puede únicamente proporcionar una reducción en la formación de la placa, puede ser posible proporcionar una vacuna curativa en el caso de enfermedades como CJD. Esta enfermedad es provocada por una forma infecciosa de una proteína prión. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la invención codifican para un antígeno para la forma infecciosa de la proteína prión, tal que la respuesta inmune generada por la vacuna puede eliminar, reducir o controlar las proteínas infecciosas que provocan CJD. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, comprende un antígeno de enfermedad infecciosa o un antígeno derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el polipéptido comprende un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas otras modalidades, el polipéptido comprende un antígeno derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por un polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, es un antígeno de enfermedad infecciosa o es un antígeno derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión es un antígeno de enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa . En otras modalidades de la invención, el antígeno es derivado de un patógeno humano o animal. El patógeno es opcionalmente un virus, bacteria, hongo o protozoario. Por ejemplo, el antígeno puede ser un antígeno viral o fúngico o bacteriano. En una modalidad, el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión que es derivado del patógeno, es una proteína producida por el patógeno, o es derivada de una proteína producida por el patógeno. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido codificado por las moléculas de ácido nucleico recombinantes, el cásete de expresión y/o el vector de expresión, es un fragmento y/o variante de una proteína producida por el patógeno. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es derivado del virus de inmunodeficiencia humana (tal como gp 120, gp 160, pg41, antígenos gag tales como p24gag y p55 gag, así como proteínas derivadas de las regiones pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu, y LTR de VIH) , virus de inmunodeficiencia felina, o virus del herpes humano o animal. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno es gp 120. En una modalidad, el antígeno es derivado del virus del herpes simple (HSV) tipos 1 y 2 (tales como gD, gB, gH, la proteína temprana inmediata tal como ICP27), de citomegalovirus (tal como gB y gH) , del metapneumovirus, del virus de Epstein-Barr o el virus de la Varicela Zoster (tal como gpl, II o III). (Ver por ejemplo, Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J.K. McDougall, ed. , Springer Verlag, pp. 125-169; McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69: 1531-1574; Patente de los Estados Unidos No. 5,171,568; Baer et al. (1984) Nature 310:207-211; y Davidson et al. (1986) J. Gen . Virol . 67:1759-1816) . En otra modalidad más, el antígeno es derivado de un virus de la hepatitis tal como el virus de la hepatitis B (por ejemplo, el antígeno superficial de la ^hepatitis B) , virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis delta, virus de la hepatitis E o virus de la hepatitis G. Ver por ejemplo, WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno de superficie, de núcleo u otro antígeno asociado. El genoma del HCV codifica para varias proteínas virales, que incluyen El y E2. Ver por ejemplo Houghton et al., Hepatology 14:381-388 (1991) . Un antígeno que es un antígeno viral es opcionalmente derivado de un virus de cualquiera de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, rinovirus, etc.); Calciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubéola, virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae (por ejemplo, rotavirus, etc.); Birnaviridae; Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc.); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza tipos A, B y C, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (por ejemplo, HTLV; HTLV-11; HIV-1 (también conocidos como HTLV-111, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluyendo pero no limitados a los antígenos de los aislados de HlVIlb, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN) ; HIV-1CM235, HIV-1; HIV-2, entre otros; virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) ; papilomavirus, virus de la encefalitis llevada por garrapatas; y similares. Ver por ejemplo, Virology, 3a. Edición (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 3a. Edición (B.N. Fields, D.M. Gripe, y P.M. Howley, Eds. 1996), para una descripción de estos y otros virus. En una modalidad, el antígeno es Flu-HA (Morgan et al., J. Immunol. 160:643 (1998)). En algunas modalidades alternativas, el antígeno es derivado de los patógenos bacterianos tales como Mycobacterium, Yersinia , Salmonella , Neisseria , Borrelia (por ejemplo, OspA u OspB o derivados de los mismos) , Chlamydia o Bordetella (por ejemplo, P.69, PT y FHA) , o derivados de parásitos tales como Plasmodium o Toxoplasma. En una modalidad, el antígeno es derivado de Mycobacterium tuberculosis (por ejemplo, EAST-6, 85A, 85B, 85C, 72F) , Bacillus anthracis (por ejemplo, PA) , o Yersinia pestis (por ejemplo, Fl, V). Además, los antígenos adecuados para el uso en la presente invención pueden ser obtenidos o derivados de agentes causales conocidos responsables de enfermedades que incluyen, pero no están limitadas a, difteria, pertusis, tétanos, tuberculosis, neumonía bacteriana o micótica, otis media, gonorrea, cólera, tifoidea, meningitis, mononucleosis, peste, shiguelosis o salmonelosis, enfermedad de los legionarios, enfermedad de Lyme, lepra, malaria, cisticercosis u oncocercosis, esquistosomiasis, tripanosomiasis, Leishmaniasis, giardiasis, amibiasis, filariasis, Borelia, y triquinosis. Otros antígenos adicionales pueden ser obtenidos o derivados de patógenos no convencionales tales como los agentes causales de kuru, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , escrapie, encefalopatía transmisible por el visón, y enfermedades de desecho crónicas, o a partir de partículas infecciosas proteicas tales como los priones que están asociados con la enfermedad de las vacas locas . En otras modalidades adicionales, el antígeno es obtenido o derivado de un agente biológico involucrado en el inicio o progresión de enfermedades neurodegenerativas (tales como la enfermedad de Alzheimer) , enfermedad metabólicas (tales como la diabetes tipo I), y adicciones a drogas o fármacos (tales como adición a la nicotina) . Alternativamente, el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante es utilizado para el manejo del dolor, y el antígeno es un receptor del dolor u otro agente involucrado en la transmisión de las señales dolorosas. En algunas modalidades, el antígeno es una proteína humana, o es derivado de una proteína humana. En otras modalidades, el antígeno es una proteína no humana o es derivado de una proteína no humana (o un fragmento o una variante de la misma) . En algunas modalidades, la porción de antígeno de la proteína de fusión codificada por el cásete de expresión, es una proteína proveniente de un animal no humano o es una proteína derivada de un animal humano. Por ejemplo, incluso si el antígeno va a ser expresado en una vacuna basada en Listeria que va a ser usada en humanos, en algunas modalidades, el antígeno puede ser la mesotelina murina o derivada de mesotelina murina.

V. Optimización del codón En algunas modalidades, uno o más de los polinucleótidos (por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos) dentro de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y el vector de expresión, son optimizados en el codón (con relación a la secuencia de codificación nativa) . En algunas modalidades, un polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante (y/o en el cásete de expresión y/o en el vector de expresión) descrito en la presente, que codifica para un péptido de señal, es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria. En algunas modalidades, un polinucleótido que codifica para un polipéptido diferente del péptido de señal, tal como antígeno u otra proteína terapéutica, es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria. En algunas modalidades, un polinucleótido que codifica para un péptido de señal y un polinucleótido que codifica para otro polipéptido fusionado al péptido de señal, son optimizados en el codón para la expresión en una bacteria. En algunas modalidades, un polinucleótido que codifica para una proteína secretada (o fragmento de la misma) utilizada como un andamio o un polinucleótido que codifica para una autolisina (o fragmento o variante de la misma) es optimizado en el codón. Un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación es "optimizado en el codón" si al menos un codón de la secuencia de codificación nativa del polinucleótido ha sido reemplazada con un codón que es más frecuentemente utilizado por el organismo en el cual va a ser expresada la secuencia de codificación (el "organismo objetivo") que el codón original de la secuencia de codificación nativa. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un antígeno no bacteriano que va a ser expresado en un especie particular de bacteria, es optimizado en el codón si al menos uno de los codones provenientes de la secuencia polinucleotídica bacteriana nativa, es reemplazado con un codón que es preferentemente expresado en esa especie particular de bacteria en la cual va a ser expresado el antígeno no bacteriano. Como otro ejemplo más, un polinucleótido que codifica para un antígeno del cáncer humano, que va a ser parte de un cásete de expresión en la Listeria monocytogenes recombinante, es optimizado en el codón si al menos un codón en la secuencia del polinucleótido es reemplazado con un codón que es más frecuentemente utilizado por Listeria monocytogenes para ese aminoácido que el codón en la secuencia humana original. De igual modo, un polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para Listeria monocytogenes (tal como el péptido de señal LLO de L . monocytogenes) que va a ser parte de un cásete de expresión para codificar una proteína de fusión que comprende un antígeno de cáncer humano en Listeria monocytogenes recombinante, es optimizado en el codón si al menos un codón en la secuencia de polinucleótido que codifica para el péptido de señal es reemplazado por un codón que es más frecuentemente utilizado por Listeria monocytogenes para ese aminoácido, que el codón en la secuencia original (nativa) . En algunas modalidades, al menos un codón que es reemplazado en la secuencia optimizada en el codón es reemplazado con el codón más frecuentemente utilizado por el organismo objetivo, para codificar para el mismo aminoácido. En algunas modalidades, al menos dos codones de la secuencia de codificación nativa del polinucleótido han sido reemplazados con un codón que es más frecuentemente utilizado por el organismo en el cual va a ser expresada la secuencia de codificación, que el codón original de la secuencia de codificación nativa. En algunas modalidades, al menos aproximadamente cinco codones, al menos aproximadamente 10 codones, al menos aproximadamente 20 codones de la secuencia de codificación nativa del polinucleótido, han sido reemplazados con un codón que es más frecuentemente utilizado por el organismo en el cual va a ser expresada la secuencia de codificación que el codón original de la secuencia de codificación nativa. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 10% de los codones en el polinucleótido optimizado en el codón, han sido reemplazados con codones más frecuentemente (o lo más frecuentemente) utilizados por el organismo objetivo (que los codones originales de la secuencia nativa) . En algunas modalidades, al menos 25% de los codones en el polinucleótido optimizado en el codón, han sido reemplazados con codones más frecuentemente utilizados (o lo más frecuentemente) utilizados por el organismo objetivo. En algunas modalidades, al menos aproximadamente 50% de los codones en el polinucleótido optimizado en el codón han sido reemplazados con codones más frecuentemente utilizados (o lo más frecuentemente) utilizados por el organismo objetivo. En algunas modalidades adicionales, al menos aproximadamente 75% de los codones en el polinucleótido optimizado en el codón han sido reemplazados con codones más frecuentemente utilizados (o lo más • frecuentemente utilizados) por el organismo objetivo. Las preferencias de codón de los diferentes organismos han sido ampliamente estudiadas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Sharp et al., Nucleic Acids Res . , 15:1281-95 (1987) y Uchiji a et al., The Journal of Immunology, 161:5594-9 (1998). Como resultado, las tablas de uso de codones son públicamente disponibles para una amplia variedad de organismo. Por ejemplo, las tablas de uso de codones pueden ser encontradas en la Internet en www. kazusa. or . p/codon/ para una amplia variedad de organismos, así como en otros sitios públicamente disponibles (Ver por ejemplo, Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292). Una tabla ejemplar de uso de codones de www. kazusa. or. jp/codon/ para Listeria monocytogenes (http : //www. kazusa . or . jp/codon/cgi-bin/showcodon-cgi?species=I?s teria -monocytogenes+ [gbct] ) , es reproducida para conveniencia abajo en la Tabla 2A. Las tablas ejemplares de uso de codones para Bacillus anthracis , Mycobacterium tuberculosis, Salmonella typhimurium, Mycobacterium bovis BCG, y Shigella flexneri son también proporcionadas en las tablas 2B, 2C, 2D, 2E y 2F, respectivamente, en seguida.

Tabla 2A: Tabla de uso de codones para Listeria monocytogenes (de www. kazusa. or. p/codon/) Listeria monocytogenes : 3262 CDSs (1029006 codones) .

Campos: [triplete] [frecuencia: por mil] [(número)] Uüü 29. { 30274 ÜCU 13.2 ( 13586 ÜAU 22 9( 23604) UGU 3 .8 3960) ÜÜC 14.1( 14486 ÜCC 6.5 ( 6714 ÜAC 10 7( 11055) UGC 1 .9 1972) UÜA 36.8 ( 37821 ÜCA 10.4 ( 10751 UAA 2 2( 2307) ÜGA 0 .6 583) UÜG 12.3 ( 12704 ÜCG 6.1 ( 6278 ÜAG 0 • 4( 372) ÜGG 9 .3 ( 9580) CUU 21.0 ( 21567 CCU 8.4 ( 8622 CAÜ 12 .0( 12332) CGU 12 6 12930) CÜC 5.4 ( 5598 CCC 1.7 ( 1780 CAC 5 2( 5336) CGC 7 0 7215) CUA 12.9 ( 13279 CCA 18.5 ( 18996 CAÁ 29 9( 30719) CGA 5 .6 5732) CUG 5.0 ( 5120 CCG 7.0 ( 7219 CAG 5 1( 5234) CGG 2 8 2884) AUU 49.3 < 50692 ACU 17.1 ( 17614 AÜ 33 0( 33908) AGU 14 1 14534) AÜC 18. ( 18894 ACC 6.9( 7089 AAC 15 3( .15790) AGC 8 8 9031) AUA 9.4 ( 9642 ACÁ 26.5 ( 27318 AAA 61 6( 63379) AGA 6 9< 7111) AUG 25.9 ( 26651 ACG 12.9 ( 13285 AAG 10 4( 10734) AGG 1 2( 1254) Güü 26.4 ( 27202 GCU 24.3 ( 24978 GAU 39 8( 40953) GGU 24 2 24871) GÜC 8.7 ( 8990 GCC 8.4 ( 8612 GAC 14 3( 14751) GGC 14 2< 14581) GÜA 21.6 ( 22247 GCA 28.6 ( 29401 GAA 60 4( 62167) GGA 19 K 19612) GUG 13.1 ( 13518 GCG 16.6 ( 17077 GAG 13. K 13507) GGG 8 7( 9003) Tabla 2B: Tabla de uso de codones para Bacillus anthracis (de www. kazusa . or.jp/codon/) Bacillus anthracis [gbbct] : 312 CDSs (90023 codones) Campos: [triplete] [frecuencia: por mil] [(número)] DÜO 32.4( 2916 ) UCÜ 17 •2( 1547 ) ÜAÜ 31.9 ( 2876 ) ÜGÜ S.l( 455) UUC 10.4( 934 ) UCC 5 •0( 453 ÜAC 9.5( 853 ) UGC 1.8( 164) UUA 43.7( 3931 ) OCA 14 -8( 1330 ÜAA 2.2( 199 ÜGA 0.5( 47) ÜUG 11.4 ( 1024 ) UCG 4 2( 375 ÜAG 0.7( 66 ÜGG 9.3( 835) Cüü 14. ( 1300 ) CCÜ 10 -7( 967 CAU 15.5 ( 1392 CGU 9.8( 883) CUC 3.7( 335 ) CCC 2 • 7( 242 CAC 4.2( 379 CGC 2.5( 223) C 12.4 ( 1117 ) CCA 17 • 8( 1599 ) CA 32.3 ( 2912 CGA 6.3( 569) CUUAG 4.4{ 392 CCG 5 9( 534 CAG 9.5( 859 CGG 2.0( 179) AUU 44.5{ 4009 ACÜ 21 0( 1890 AAü 44.0( 3959 AGU 17.4 ( 1565) AÜC 11.9 ( 1072 ACC 5 0( 453 AAC 14.1( 12681 AGC 5.2( 467) AUA 22.7( 2042 ACÁ 26 8( 2414 AAA 64.3 ( 5786 AGA 13.7 ( 1236) AUG 23.3( 2098 ACG 9 4( 844 AAG 22.7 ( 2047] AGG 4.K 368) GUU 20.3( 1824; GCÜ 17 8( 1598 GAü 39.3( 3536] GGÜ 17.9 ( 1611) GUC 4.6( 414] GCC 4 K 372 GAC 9.0( 811] GGC 5.8( 524) GUA 26.4{ 2374) GCA 23. 5( 2117 GAA 53.9 ( 4855] GGA 24.5( 2203) GUG 10.8 ( 973) GCG 7. 9( 709) GAG 17.9( 1614) GGG 12.0( 1083) Codificación de GC 34.55%, primera letra GC 44.99%, segunda letra GC 33.6%, tercera letra GC 22.51% Tabla 2C: Tabla de uso de codones para Mycobacterium tuberculosis (de www. azusa . or. jp/codon/) Mycobacterium tuberculosis [gbbct] : 363 CDSs (131426 códones) Campos: [triplete] [frecuencia: por mil] [(número)] ÜOU 5.4( 709) UCÜ 2 • 0( 265) UAU 6.0( 788) UGU 2.5 ( 326) ÜÜC 25.6 ( 3359) UCC 11 • 4( 1499) ÜAC 17.6( 2307) UGC 5.6 ( 738) UÜA 1.8( 231) UCA 4 • 3{ 571) UAA 0.4( 52) UGA 1.5 ( 201) ÜUG 14.8 ( 1945) UCG 19 • 2( 2522) UAG 0.8( 103) UGG 17.9 ( 2352) Cüü 5.9( 778) CCÜ 3 .9( 511) CAU 5.4{ 711) CGU 8.0 ( 1048) CUC 17.7 ( 2329) CCC 18 • 3( 2411) CAC 14.7( 1928) CGC 26.7 ( 3508) CUA 4.0( 521) CCA 6 • 4( 843) C?? 7.8( 1030) CGA 5.8 ( 764) CUG 45.9( 6032) CCG 33 •2( 4359) CAG 24.2( 3176) CGG 21.1( 2772) AÜU 7.6( 993) ACÜ 4 K 545) AAU 4.8( 637) AGU .0 ( 531) AUC 32.7( 4300) ACC 36 0( 4735) AAC 26.3( 3451) AGC 15.0( 1976) AUA 2.1( 282) AC 4 7( 616) AAA 5.8( 761) AGA 1.5 ( 192) AUG 19.7( 2591) ACG 16 4( 2158) AAG 26.5{ 3485) AGG 3.3 ( 429) GUU 8.3( 1095) GCU 11 2( 1473) GAU 15.6( 2046) GGU 18.7 ( 2455) GUC 32.3 ( 4249) GCC 51 5( 6769) GAC 44.6( 5858) GGC 48.6 ( 6383) GÜA 4.7( 622) GCA 12 4( 1625) GAA 16.8( 2211) GGA 9.0 ( 1183) GUG 35.7 ( 4687) GCG 41 7( 5482) GAG 35.8( 4702) GGG 16.9 ( 2215) Codificación de GC 64.43% primera letra GC 65.27%, segunda letra GC 48.28%, tercera letra GC 79.75% Tabla 2D: Tabla de uso de codones para Salmonella typhymurium (de www. kazusa. or . jp/codon/) Salmonella typhymurium [gbbct] : 1322 CDSs (416065 codones) Campos: [triplete] [frecuencia: por mil] [ (número)] UüU 21.7 { 9041) UCU 8.5 ( 3518) UAU 16.5 ( 6853) UGÜ 4.6{ 1920) UÜC 15.1 ( 6265) UCC 10.6( 4430) UAC 11.6 ( 4826) ÜGC 6.1( 2524) UÜA 13.6 ( 5650) ÜCA 7.9 ( 3286) UAA 1.8 ( 731) UGA 1.1( 465) UUG 12.1 ( 5025) UCG 9.4 ( 3924) UAG 0.3 ( 121) UGG 14.1( 5851) CUU 12.1 ( 5038) CCU 7.9( 3290) CAU 12.1 ( 5047) CGU 18.1( 7542) CUC 10.6 ( 4396) CCC 7.0 ( 2921) CAC 9.2{ 3818) CGC 20.8 ( 8659) CÜA 4.7 ( 1958) CCA 6.5 ( 2712) CA 12.8 ( 5315) CGA 4.1( 1695) CUG 49.3( 20508) CCG 22.7 ( 9463) CAG 30.8 ( 12803) CGG 7.2( 3004) AUU 28.1 ( 11700) ACU 8.2 { 3401) AftU 19.5 ( 8107) AGÜ 8.6( 3569) AUC 23.9 ( 9941) ACC 24.0 ( 9980) AAC 21.4( 8920) AGC 18.0( 7485) AUA 6.7 ( 2771) ACÁ 8.0 ( 3316) AAA 33.0( 13740) AGA 3.2 ( 1348) AUG 26.1 ( 10842) ACG 18.6 ( 7743) AAG 12.4 ( 5151) AGG 2.3( 959) Güü 16.4 ( 6831) GCU 14.4 ( 5985) GAU 32.9 ( 13700) GGÜ 18.1 ( 7541) GÜC 17.7 ( 7367) GCC 27.5 ( 11462) GAC 21.5 ( 8949) GGC 33.0( 13730) GÜA 11.9 ( 4935) GCA 14.8 ( 6156) GAA 36.1( 15021) GGA 9.1( 3788) GUG 24.3 ( 10092) GCG 37.0 ( 15387) GAG 20.9 ( 8715) GGG 11.6( 4834) Codificación de GC 52.45%, primera letra GC 58.32%, segunda letra GC 41.31%, tercera letra GC 57.71% Tabla 2E : Tabla de uso de codones para Mycobacterium bovis ( de www . kazusa . or . jp/codon/ ) Mycobacterium bovis BCG [gbbct] : 51 CDSs ( 16528 codones ) Campos : [triplete] [ frecuencia : por mil] [ (número ) ] UUU 4.7( 77) UCU 1.9( 31) UAÜ 6.6( 109) UGU 2.0{ 33) uuc 27.4( 453) UCC 11. ( 189) ÜAC 17.0( 281) ÜGC 6.7( 110) UUA 1. 6 ( 26) ÜCA 4.5{ 74) UAA 0.9( 15) ÜGA 1.3( 22) UUG 14.7( 243) ÜCG 20.8( 343) UAG 0.8( 14) ÜGG 14.3( 237) Cüü 5.6( 92) CCU 2.9( 48) CAU 4.9( 81) CGU 9.4{ 155) CUC 14.8 ( 244) CCC 16.3( 270) CAC 17.2 ( 285) CGC 33.8( 559) CUA 5.1{ 85) CCA 5.1( 84) CA 7.3( 120) CGA 7.1( 118) CUG 51.5( 852) CCG 31.0( 512) CAG 25.5( 421) CGG 26.7( 441) AUU 6.1( 100) ACU 3.1( 51) AAU 4.8( 80) AGU 2.8( 46) AUC 39.6( 654) ACC 36.8( 609) AAC 22.3 ( 369) AGC 14.5[ 240) AUA 2.2( 37) AC 4.4( 73) AAA 6.2( 102) AGA 1.1( 19) AUG 20.2( 334) ACG 17.4( 288) AAG 24.5( 405) AGG 3.8( 62) GÜU 7.8( 129) GCU 9.6( 158) GAU 13.4 ( 222) GGU 16.9( 280) GUC 30.1( 497) GCC 54.3{ 898) GAC 45.6{ 754) GGC 42.6( 704) GUA 4.1( 67) GCA 12.5( 206) GAA 16.5( 273) GGA 7.3( 120) GUG 37.6 ( 621) GCG 41.7( 689) GAG 32.7( 541) GGG 16.7( 276) Codificación de GC 64.82%, primera letra GC 65.36%, segunda letra GC 48.07%, tercera letra GC 81.04% Tabla 2F: Tabla de uso de codones para Shigella flexneri (de www. kazusa . or. jp/codon/) Shigella flexneri [gbbct] : 706 CDSs (180312 codones) Campos: [tripl ate] [frecuencia : por mil] [ (número) Uüü 25.8( 4658) UCÜ 16.6( 2986) ÜAU 21.9 ( 3945) UGU 6 .9( 1252) ÜUC 15.1 ( 2714) UCC 9.5( 1717) UAC 11.0( 1992) UGC 5 • 6( 1011) UUA 20.8( 3756) UCA 15.6( 2821) UAA 2.0( 362) UGA 1 •4( 254) ÜUG 13.4( 2424) ÜCG 6.9( 1241) DAG 0.5( 91) UGG 13 •K 2357) CÜU 17.6 ( 3169) CCU 9.2( 1656) CAÜ 15.1 ( 2725) CGU 15 .0( 2707) CUC 10. ( 1878) CCC 5.9( 1072) CAC 8.2( 1472) CGC 12 6( 2269) CUA 7.2{ 1295) CCA 9.7( 1744) CAÁ 15.9( 2861) CGA 5 8( 1046) CUG 33.5 ( 6045) CCG 12.2 ( 2199) CAG 23.6( 4255) CGG 9 0( 1627) AÜU 30.0{ 5417) ACU 13.8( 2480) AAU 33.5( 6044) AGÜ 15 3( 2764) AÜC 16.7{ 3018) ACC 13. ( 2413) AAC 18.6 ( 3348) AGC 12 7( 2281) AUA 18.9( 3402) AC 16.2( 2930) AAA 41.6( 7507) AGA 10 3( 1865) AUG 23.3( 4198) ACG 10.0( 1809) AAG 16.4( 2961) AGG 5 7( 1029) GÜU 19.8{ 3576) GCU 19.6 ( 3527) GAÜ 34.0( 6123) GGU 19 2( 3468) GUC 11.8( 2126) GCC 18.5( 3338) GAC 16.3( 2939) GGC 15 3( 2754) GUA 13.1 ( 2370) GCA 22.2 ( 4009) GAft 37.5( 6763) GGA 15. 1( 2727) GUG 16.1( 2910) GCG 15.2 ( 2732) GAG 21.7( 3913) GGG 10. 9( 1970) Codificación de GC 44.63%, primera letra GC 51.72%, segunda letra GC 38.85%, tercera letra GC 43.32% En algunas modalidades de la invención, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 75% de los codones en una secuencia de codificación optimizada en el codón, son el codón más preferido para ese aminoácido utilizado en el organismo objetivo. En otras modalidades, 100% de los codones en la secuencia de codificación optimizada en el codón son el codón más preferido para ese aminoácido en el organismo objetivo (por ejemplo, la secuencia está "completamente optimizada en el codón") . Por ejemplo, en los ejemplos mostrados en seguida, todos los codones de las secuencias caracterizadas como optimizadas en el codón fueron los codones más frecuentemente utilizados para el organismo objetivo; no obstante, cualquier sustitución de codón que dé como resultado un codón más frecuentemente utilizado que la secuencia original (nativa) puede ser considerado "optimizado en el codón". La tabla 3 siguiente muestra el uso de codón óptimo en Listeria monocytogenes para cada aminoácido.

Tabla 3: Tabla de uso óptimo de codones en Listeria monocytogenes En algunas modalidades, los polinucleótidos optimizados en el codón codifican para un péptido de señal. En algunas modalidades, el péptido de señal es extraño para la bacteria para la cual la secuencia es optimizada en el codón. En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para la bacteria para la cual la secuencia es optimizada en el codón. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polinucleótido optimizado en el codón codifica para un péptido de señal seleccionado del grupo que consiste del péptido de señal LLO de Listeria monocytogenes , el péptido de señal Usp45 de Lactococcus lactis, el péptido de señal de Antígeno Protector de Bacillus anthracis, el péptido de señal p60 de Listeria monocytogenes y el péptido de señal PhoD del péptido de señal Tat de B . subtilis . En algunas modalidades, el polinucleótido optimizado en el codón codifica para un péptido de señal diferente del péptido de señal de antígeno protector de Bacillus anthracis . En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para un péptido de señal es optimizado en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el polinucleótido optimizado en el codón codifica para una proteína (no péptido de señal) que es extraño para la bacteria para la cual ha sido optimizada en el codón la secuencia polinucleotídica. En algunas modalidades, el polinucleótido optimizado en el codón codifica para un polinucleótido que comprende un antígeno. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polinucleótido optimizado en el codón codifica para un polipéptido que comprende un antígeno que es un antígeno asociado al tumor o un antígeno que es derivado de un antígeno asociado al tumor. En algunas modalidades, la optimización del codón de un polinucleótido que codifica para un péptido de señal y/u otro polipéptido aumenta la expresión de un polipéptido (tal como una proteína de fusión, proteína quimera y/o un polipéptido extraño codificado por una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión, o vector de expresión) que comprende el péptido de señal y/u otro polipéptido en una bacteria, con relación al polinucleótido correspondiente sin la optimización del codón. En algunas modalidades, la optimización del codón del polinucleótido aumenta la expresión por al menos aproximadamente 2 veces, por al menos aproximadamente 5 veces, por al menos 10 veces, o por al menos aproximadamente 20 veces (con relación al polinucleótido correspondiente sin optimización del codón) . En algunas modalidades, la optimización del codón de un polinucleótido codifica para un péptido de señal y/u otro polipéptido, aumenta la secreción de un polipéptido (tal como una proteína de fusión, proteína quimera y/o polipéptido extraño) que comprende el péptido de señal y/u otro polipéptido proveniente de una bacteria, con relación al polinucleótido correspondiente sin la optimización del codón. En algunas modalidades, la optimización del codón aumenta la secreción por al menos aproximadamente 2 veces, por al menos aproximadamente 5 veces, por al menos aproximadamente 10 veces, o por al menos aproximadamente 20 veces (con relación al polinucleótido correspondiente sin optimización del codón) . En algunas modalidades, el nivel de expresión y secreción es aumentado. Los niveles de expresión y/o secreción pueden ser fácilmente evaluados utilizando técnicas estándares para aquellos expertos en la técnica tales como transferencias de Western de las diversas fracciones de cultivo bacteriano relevantes.

VI . Casetes de expresión Los casetes de expresión son también proporcionados por la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, la invención proporciona un cásete de expresión que comprende cualquier molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente y que comprende además las secuencias promotoras operablemente enlazadas a las secuencias de codificación en las moléculas de ácido nucleico recombinantes (por ejemplo, el primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal y el segundo polinucleótido que codifica para el _ otro polipéptido) . En algunas modalidades, el cásete de expresión es aislado. En algunas otras modalidades, el cásete de expresión está contenido dentro de un vector de expresión, el cual puede ser aislado o puede estar contenido dentro de una bacteria. En modalidades adicionales, el cásete de expresión está colocado en el ADN cromosómico de una bacteria. Por ejemplo, en algunas modalidades, el cásete de expresión ha sido integrado dentro del genoma de una bacteria. En algunas modalidades, un cásete de expresión que está integrado dentro del genoma de una bacteria, comprende uno o más elementos provenientes del ADN genómico. Por ejemplo, en algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante es insertada en un sitio en el ADN genómico de una bacteria (por ejemplo, vía la integración específica del sitio o la recombinación homologa) tal que el ácido nucleico recombinante es operablemente enlazado a un promotor ya presente en el ADN genómico, con el cual se genera un nuevo cásete de expresión integrado dentro del ADN genómico. En algunas otras modalidades, el cásete de expresión es integrado dentro del ADN genómico (por ejemplo, vía la integración específica del sitio o la recombinación homologa) como una unidad intacta que comprende el promotor y la molécula de ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, los casetes de expresión están diseñados para la expresión de los polipéptidos en bacterias. En algunas modalidades, los casetes de expresión están diseñados para la expresión de polipéptidos heterólogos, tales como antígenos heterólogos en bacterias. En algunas modalidades, los casetes de expresión proporcionan la expresión y/o la secreción de los polipéptido. En general, un cásete de expresión comprende los siguientes elementos ordenados: (1) un promotor y (2) un polinucleótido que codifica para un polipéptido. En algunas modalidades, un cásete de expresión comprende los siguientes elementos: (1) un promotor; (2) un polinucleótido que codifica para un péptido de señal; y (3) un polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, una proteína heteróloga) . En modalidades adicionales, un cásete de expresión comprende los siguientes elementos: (1) el promotor procariótico; (2) la secuencia Shine-Dalgarno; (3) un polinucleótido que codifica para un péptido de señal; y (4) un polinucleótido que codifica para un polipéptido (tal como una proteína heteróloga) . En algunas modalidades, un cásete de expresión comprende más de un promotor. En algunas modalidades, el cásete de expresión puede también contener una terminación de la transcripción insertada corriente abajo del extremo C del codón de terminación de la traducción relacionada al polipéptido heterólogo. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencia de terminación de la transcripción puede ser utilizada en construcciones diseñadas para la integración estable dentro del cromosoma bacteriano. Mientras que no se requiere, la inclusión de una secuencia de terminación de la transcripción como el elemento ordenado final en un cásete de expresión de gen heterólogo, puede prevenir los efectos polares sobre la regulación de la expresión de genes adyacentes debido a la transcripción a través de la lectura. En consecuencia, en algunas modalidades, los elementos de secuencia apropiados, conocidos por aquellos quienes tienen experiencia en la técnica, promueven ya sea la terminación de la transcripción dependiente de rho o independiente de rho, pueden ser colocados en el cásete de expresión de la proteína heteróloga. En un aspecto, la invención proporciona un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En otro aspecto, la invención proporciona un cásete de expresión que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria, (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos del cásete de expresión, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es heterólogo para el primer polinucleótido. En algunas modalidades, el polipéptido es heterólogo para la bacteria para la cual el péptido de señal es nativo (por ejemplo, extraño para la bacteria) . En algunas modalidades, la bacteria de la cual se deriva el péptido de señal es una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Listeria , Bacillus, Yersinia pestis, Salmonella , Shigella , Brucella , micobacterias y E. coli . En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria. En otro aspecto, la invención proporciona un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria Listeria , (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos del cásete de expresión, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria Listeria . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria Listeria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria Listeria) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heteróloga para el péptido de señal. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende más de un promotor. En otro aspecto más, la invención proporciona un cásete de expresión que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria, tal como Listeria , Bacillus , Yersinia pestis , Salmonella , Shigella , Brucella , micobacterias y E. coli . En algunas modalidades, el polinucleótido (s) es optimizado en el codón para la expresión en Listeria, tal como Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido optimizado en el codón, es nativo para la bacteria para la cual éste es optimizado en el codón. En algunas modalidades, el primer polinucleótido que codifica para el péptido de señal es heterólogo para el segundo polinucleótido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, el cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico. En algunas modalidades, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, o el primero y el segundo polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y el péptido de señal son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptído codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria Listeria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria Listeria) . En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende más de un promotor.

La invención también proporciona un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para la Listeria , en donde el polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en Listeria ; y (b) un promotor operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño. En algunas modalidades, el polipéptido que es codificado por el cásete de expresión es un antígeno (por ejemplo, ver la descripción de algunos posibles antígenos anteriores) . En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende además un polinucleótido que codifica para un péptido de señal. El polinucleótido que codifica para el péptido de señal es también operablemente enlazado con el promotor, de modo que el cásete de expresión expresa una proteína de fusión que comprende el polipéptido extraño y el péptido de señal. Los polinucleótidos que codifican para los péptidos de señal, adecuados para el uso en el cásete de expresión incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos anteriormente. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para un péptido de señal que es incluido en el cásete de expresión es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria tal como Listeria (por ejemplo, L . monocytogenes) como se describe anteriormente. La invención también proporciona un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. En algunas modalidades, el cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico. En algunas modalidades, el primer 'polinucleótido, el segundo polinucleótido, o ambos, es decir el primero y segundo polinucleótidos están optimizados en el codón para la expresión en Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y el péptido de señal son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria Listeria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria Listeria) . En algunas modalidades, el c sete de expresión comprende más de un promotor. La invención proporciona además un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina, o un fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la autolisina, o fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, en donde en la proteína quimera el polipéptido está fusionado a la autolisina, o al fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, o está insertado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma. En algunas modalidades, la proteína quimera es catalíticamente activa como una autolisina. En algunas modalidades, el polipéptido es heterólogo para la autolisina. En algunas modalidades, la autolisina bacteriana es de una bacteria intracelular (por ejemplo, Listeria) . En algunas modalidades, el segundo polinucleótido que codifica para el polipéptido es insertado dentro del primer polinucleótido que codifica para la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, y el cásete de expresión que codifica para una proteína quimera en la cual es insertado el polipéptido dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma (por ejemplo, el polipéptido es incrustado dentro de la autolisina o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma) . En modalidades alternativas, el segundo polinucleótido es colocado fuera del primer polinucleótido que codifica para la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma, y el cásete de expresión que codifica para una proteína quimera en la cual está fusionado el polipéptido a la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma. En algunas modalidades, el polipéptido es heterólogo para la autolisina. En algunas modalidades, el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido son heterólogos uno al otro. En algunas modalidades, la autolisina es una autolisina dependiente de SecA2. En algunas modalidades, la autolisina es una peptidoglicano-hidrolasa (por ejemplo, N-acetilmuramidasa o p60) . En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende además un polinucleótido que codifica para un péptido de señal (por ejemplo, un péptido de señal normalmente asociado con la autolisina o un péptido de señal heterólogo para el péptido de señal). Por ejemplo, en algunas modalidades, el cásete de expresión que codifica para una proteína quimera que comprende un péptido de señal p60, la proteína p60 (o el fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa de la misma) , y un polipéptido heterólogo para p60, incrustado dentro de la secuencia de p60. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un polipéptido no Listerial . En otro aspecto más, la invención proporciona un cásete de expresión que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo a la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, y (d) el promotor operablemente enlazado al primero, segundo y tercer polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido, y la proteína secretada, o el fragmento de la misma, y en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido está fusionado a la proteína secretada, o al fragmento de la misma, o está colocado dentro de la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera. En algunas modalidades, los promotores en los casetes de expresión descritos en la presente (o las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas en la presente) son promotores procarióticos . Por ejemplo, los promotores procarióticos pueden ser promotores Listeriales. En algunas modalidades, el promotor Listerial es un promotor hly. En algunas modalidades, los promotores son promotores dependientes de prfA (por ejemplo, un promotor actA) . En algunas modalidades, los promotores son promotores constitutivos (por ejemplo, un promotor p60) . En algunas modalidades, el cásete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante descrita en la presente, comprende un promotor hly, actA, o p60 operablemente enlazado a los polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. Una persona de experiencia en la técnica será capaz fácilmente de identificar los promotores procarióticos y/o Listeriales adicionales, adecuados para el uso en los casetes de expresión en vista del uso pretendido del cásete de expresión y de la bacteria hospedera dentro de la cual será colocado el cásete de expresión. Por ejemplo, son conocidos una variedad de promotores micobacterianos adecuados para el uso en los casetes de expresión recombinantes dentro de micobacterias y otras bacterias. Éstos incluyen los promotores HSP60 y HSP70 de Mycobacterium bovis BCG, también incluyen promotores tales como los promotores de micobactina, un promotor de a-antígeno y el promotor antigénico de 45 kDa de M. Tuberculosis y BCG, el promotor de la superóxido-dismutasa, MBP-70, el promotor micobacteriano asd, los promotores antigénicos micobacterianos de 14 kDa y 12 kda, los promotores icobacteriófagos tales como los promotores Bxbl, Bxb2 y Bxb3, los promotores Ll y L5, el promotor D29 y los promotores TM4 (ver, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 6,566,121). Los promotores adecuados para el uso en Bacillus anthracis incluyen, pero no están limitados a, el promotor pagA, el promotor alfa-amilasa (Pamy) y Pntr (ver, por ejemplo, Gat et al., Infect . Immun . 71; 801-13 (2003)). Los promotores adecuados para el uso en los casetes de expresión de Salmonella recombinantes y las vacunas, son también conocidos e incluyen los promotores nirB, el promotor osmC, P(pagC), y P(tac) (ver, por ejemplo, Bumann, Infect .

Immun . 69: 7493-500 (2001); Wang et al., Vaccine, 17: 1-12 (1999); McSorley et al., Infect. Immun. 65: 171-8 (1997)).

Son también conocidos para aquellos de experiencia en la técnica una variedad de promotores de E. coli . En algunas modalidades, el promotor utilizado en un cásete de expresión descrito en la presente es un promotor constitutivo. En otras modalidades, el promotor utilizado en un cásete de expresión descrito en la presente, es un promotor inducible. El promotor inducible puede ser inducido por una molécula (por ejemplo, una proteína) endógena para la bacteria en la cual va a ser utilizado el cásete de expresión. Alternativamente, el promotor inducible puede ser inducido por una molécula (por ejemplo, una molécula pequeña o proteína) heteróloga para la bacteria en la cual va a ser utilizado el cásete de expresión. Son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica una variedad de promotores inducibles. En algunas modalidades de los casetes de expresión, en el extremo 3' del promotor está una secuencia de poli-purina Shine-Dalgarno, el elemento requerido para el acoplamiento de la subunidad ribosomal 30S (vía el ARNr 16S) al transcrito del ARN del gen heterólogo y el inicio de la traducción. La secuencia Shine-Dalgarno tiene típicamente la siguiente secuencia de consenso: 5' -NAGGAGGU-N5-10-AUG (codón de inicio) -3' (SEQ ID NO: 85). Existen variaciones de la secuencia de poli-purina Shine-Dalgarno. Principalmente, el gen hly de Listeria que codifica para la listerolisina 0 (LLO) tiene la siguiente secuencia Shine-Dalgarno: AAGGAGAGTGAAACCCATG (SEQ ID NO: 70) (secuencia de Shine-Dalgarno está subrayada, y el codón de inicio de la traducción está en negritas). La construcción de los casetes de expresión para el uso en bacterias, e incluso la construcción de casetes de expresión específicamente para el uso en vacunas bacterianas recombinantes, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las descripciones de la producción y el uso de una variedad de casetes de expresión bacterianos y/o vacunas bacterianas recombinantes, pueden ser encontrados en las siguientes referencias, cada una de las cuales es incorporada en la presente en su totalidad: Horwitz et al., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 97: 13853-8 (2000); Garmory et al., J. Drug Target, 11: 471-9 (2003); Kang et al., FEMS Immunol . Med. Microbiol . , 37: 99-104 (2003); Garmory et al., Vaccine, 21: 3051-7 (2003); Kang et al., Infect . Immun . , 1739-49 (2002); Russ an et al., J. Immunol . , 167: 357-65 (2001); Harth et al., Microbiology, 150: 2143-51 (2004); Varaldo et al., Infect . Immun . 72: 3336-43 (2004); Goonetilleke et al., J. Immunol . , 171: 1602-9 (2003); Uno-Furuta et al., Vaccine, 21: 3149-56 (2003); Biet et al., Infect . Immun., 71: 2933-7 (2003); Bao et al., Infect . Immun . , 71: 1656-61 (2003); Kawahara et al., Clin . Immunol . , 105 : 326-31 (2002); Anderson et al., Vaccine, 18: 2193-202 (2000); Bumann, Infect . Immun . , 69: 7493-500 (2001); Wang et al., Vaccine, 17: 1-12 (1999); McSorley et al., Infect . Immun . , 65: 171-8 (1997); Gat et al., Infect . Immun . , 71: 801-13 (2003); Patente de los Estados Unidos No. 5,504,005; Patente de los Estados Unidos No. 5,830,702; Patente de los Estados Unidos No. 6,051,237; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0025323; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0202985; WO 04/062597; Patente de los Estados Unidos No. 6,566,121; y Patente de los Estados Unidos No. 6,270,776. En algunas modalidades, es deseable construir los casetes de expresión que utilizan la expresión bicistrónica, policistrónica (también conocida como multicistrónica) de las secuencias de codificación. Tales casetes de expresión pueden utilizar, por ejemplo, un promotor simple que está operablemente enlazado a dos o más secuencias de codificación independientes. Estas secuencias de codificación pueden, por ejemplo, corresponder a los genes individuales o pueden, alternativamente, corresponder a los subfragmentos deseados y/o seleccionados de un gen designado entero. En este último ejemplo, un gen puede contener una secuencia que codifica para un dominio trans embranal hidrofóbico, el cual puede inhibir potencialmente la secreción eficiente de la Listeria . De este modo, puede ser deseable segregar en dos subfragmentos la secuencia de codificación de este gen a partir del dominio hidrofóbico; en este caso los dos subfragmentos son luego expresados como un mensaje bicistrónico. La utilización de la expresión policistrónica requiere que la subunidad ribosomal 30s permanezca sobre el mensaje del ARN policistrónico después de la terminación de la traducción de la primera secuencia de codificación, y la liberación de la subunidad ribosomal 50s, y subsecuentemente la "lectura" del mensaje de ARN hacia el siguiente codón de inicio, durante el cual la subunidad ribosomal 50s se enlaza a la subunidad ribosomal 30s enlazada al ARN, y se reinicia la traducción. La Listeria monocytogenes, como otras bacterias, utiliza la expresión policistrónica de su repertorio genómico. A manera de ejemplo, la secuencia de una región intergénica de Listeria monocytogenes proveniente de un mensaje policistrónico seleccionado, puede ser utilizada para construir los casetes de expresión policistrónicos para la expresión de una proteína heteróloga seleccionada proveniente de la especie Listeria recombinante. Por ejemplo, varios de los factores de virulencia dependientes de prfA provenientes de Listeria monocytogenes son expresados del mensaje policistrónico. Por ejemplo, las proteínas ActA y PlcB de Listeria monocytogenes son expresadas como un mensaje bicistrónico. La secuencia de ADN correspondiente a la secuencia intergénica actA-plcB de Listeria monocytogenes (5' -3') se muestra enseguida: 5'-TAAAAACACAGAACGAAAGAAAAAGTGAGGTGAATGA-3' (SEQ ID NO: 71) (La secuencia Shine-Dalgarno para el inicio de la traducción de plcB se muestra en negritas. Los primeros 3 nucleótidos de la secuencia corresponden a un codón de inicio Ochre) . Para un ejemplo no limitante de un vector de expresión bicistrónico, un vector de expresión hEphA2 bicistrónico para el uso en Listeria monocytogenes , ver Ejemplo 28, más adelante. Alternativamente, otras secuencias intergénicas o sintéticas conocidas pueden ser utilizadas para construir los casetes de expresión policistrónicos, para el uso en Listeria u otras bacterias. La construcción de las regiones intergénicas que conducen a la estructura de ARN secundaria sustancial, debe ser prevenida, para evitar la terminación no deseada de la transcripción por un mecanismo independiente de rho. De manera importante, si la secreción de cualquiera o todas las proteínas traducidas expresada a partir del mensaje policistrónico es deseada, los péptidos de señal deben ser funcionalmente enlazados a cada región de codificación. En algunas modalidades, estos péptidos de señal difieren uno del otro. De este modo, en algunas modalidades, los casetes de expresión descritos en la presente para el uso en Listeria u otras bacterias son policistrónicos (por ejemplo, bicistrónicos) . Dos o más polipéptidos son codificados por los casetes de expresión bicistrónicos o policistrónicos como polipéptidos discretos. En algunas modalidades, los casetes de expresión bicistrónicos o policistrónicos comprende una secuencia intergénica (por ejemplo, proveniente de un gen bicistrónico o policistrónico) colocada entre las secuencias de codificación de los dos polipéptidos. En algunas modalidades, la secuencia intergénica comprende una secuencia que promueve la entrada ribosomal y el inicio de la traducción. En algunas modalidades, la secuencia intergénica comprende una secuencia Shine-Dalgarno. En algunas modalidades, la secuencia intergénica es la secuencia intergénica actA-plcB de Listeria monocytogenes .

Típicamente, la secuencia intergénica es colocada entre una secuencia polinucleotídica que codifica para un primer polipéptido (o una primera proteína de fusión que comprende un primer polipéptido y una péptido de señal) y una secuencia polinucleotídica que codifica para un segundo polipéptido (o una segunda proteína de fusión que comprende un segundo polipéptido y un péptido de señal) . En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primer polipéptido; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido; (c) una secuencia intergénica colocada entre el primero y segundo polinucleótidos; y (f) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para el primero y segundo polipéptidos como dos polipéptidos discretos. En algunas modalidades, el primero y segundo polipéptidos son polipéptidos seleccionados de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, en la Sección IV, anterior) . En algunas modalidades, al menos uno del primero o segundo polipéptidos comprende un antígeno. En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos cada uno comprende un fragmento (diferente o el mismo) del mismo antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de un antígeno asociado al tumor. La invención proporciona además un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primer péptido de señal; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un primer polipéptido (sin señal) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; (c) un tercer polinucleótido que codifica para un segundo péptido de señal; (d) un cuarto polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido (sin señal) , en donde el cuarto polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el tercer polinucleótido; (e) una secuencia intergénica (típicamente colocada entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido) ; y (f) un promotor operablemente enlazado al primer polinucleótido, al segundo polinucleótido, al tercer polinucleótido y al cuarto polinucleótido, de modo que el cásete de expresión codifica para una primera proteína de fusión que comprende el primer péptido de señal y el primer polipéptido, y una primera proteína de fusión que comprende el segundo péptido de señal y el segundo polipéptido. En algunas modalidades, uno o más polinucleótidos que codifica para un péptido de señal es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria. En algunas modalidades, el tercer y/o cuarto polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en una bacteria (preferentemente además de la optimización del codón de los polinucleótidos que codifican para los péptidos de señal) . En algunas modalidades, el primero y/o el segundo péptido de señal es un péptido de señal bacteriano no -secAl. En algunas modalidades, la secuencia intergénica es la secuencia intergénica actA-plcB de Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, el segundo y tercer polipéptidos son polipéptidos seleccionados de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, en la Sección IV anterior) , tales como los polipéptidos que comprenden antígenos. En algunas modalidades, el primero y segundo polipéptidos son polipéptidos seleccionados de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, en la Sección IV anterior) . En algunas modalidades, al menos uno del tercero o segundo polipéptidos comprende un antígeno. En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos cada uno comprenden un fragmento del mismo antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno asociado al tumor o es derivado de un antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, la invención proporciona un cásete de expresión policistrónico para la expresión de los polipéptidos heterólogos en Listeria, en donde el cásete de expresión codifica para al menos dos polipéptidos no Listeriales discretos. En algunas modalidades, el cásete de expresión policistrónico es un cásete de expresión bicistrónico que codifica para dos polipéptidos no Listeriales discretos. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primer polipéptido no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido no Listerial; (c) una secuencia intergénica colocada entre el primero y segundo polinucleótidos; y (d) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótido, en donde el cásete de expresión codifica para el primero y segundo polipéptidos como dos polipéptidos discretos. Si el cásete de expresión es un cásete de expresión policistrónico que codifica para tres polipéptidos como polipéptidos discretos, el cásete de expresión comprenderá un tercer polinucleótido operablemente enlazado al promotor, y una segunda secuencia intergénica colocada entre el segundo y tercer polinucleótido. En algunas modalidades, al menos uno de los polipéptidos no Listeriales comprende un antígeno. En algunas modalidades, al menos dos de los polipéptidos no Listeriales cada uno comprende un fragmento del mismo antígeno. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primer péptido de señal; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un primer polipéptido no Listerial (sin señal) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; (c) un tercer polinucleótido que codifica para un segundo péptido de señal; (d) un cuarto polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido no Listerial (sin señal) , en donde el cuarto polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el tercer polinucleótido; (e) una secuencia intergénica colocada entre el segundo polinucleótido y el tercer polinucleótido; y (f) un promotor operablemente enlazado al primer polinucleótido, al segundo polinucleótido, al tercer polinucleótido, y al cuarto polinucleótido, de modo que el cásete de expresión codifica para una primera proteína de fusión que comprende el primer péptido de señal y el primer polipéptido, y una segunda proteína de fusión que comprende el segundo péptido de señal y el segundo polipéptido. En algunas modalidades, al menos uno de los polipéptidos no Listeriales es un antígeno. En algunas modalidades, al menos dos de los polipéptidos no Listeriales son cada uno fragmentos del mismo antígeno. La invención también proporciona un método para utilizar cualquiera de los casetes de expresión descritos en la presente para producir una bacteria recombinante (por ejemplo, una bacteria Listeria recombinante) . En algunas modalidades, el método de utilizar un cásete de expresión descrito en la presente, para elaborar una bacteria recombinante, comprende introducir el cásete de expresión dentro de una bacteria. En algunas modalidades, el cásete de expresión es integrado dentro del genoma de la bacteria. En algunas otras modalidades, el cásete de expresión está sobre un plásmido que es incorporado dentro de la bacteria. En algunas modalidades, la incorporación del cásete de expresión dentro de la bacteria ocurre mediante conjugación. La introducción del cásete de expresión dentro de la bacteria puede ser efectuada mediante cualquiera de las técnicas estándares conocidas en la materia. Por ejemplo, la incorporación del cásete de expresión dentro de la bacteria puede ocurrir mediante conjugación, transducción (transfección) o transformación.

VII. Vectores La invención proporciona además los vectores, tales como los vectores de expresión, los cuales comprenden cualquiera de los casetes de expresión y/o las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas en la presente. En algunas modalidades, el vector es un plásmido. En algunas modalidades, el vector es lineal. En algunas modalidades, el vector es circular. En algunas modalidades, el vector es un vector recombinante homólogo o de integración. En algunas modalidades, el vector es pAM401. En algunas modalidades, el vector es pPL2. En algunas modalidades, el vector es aislado. Como se indicó anteriormente, en algunas modalidades, un cásete de expresión descrito en la presente está contenido dentro de un vector de expresión. En algunas modalidades, el vector es un plásmido. En otras modalidades el vector es lineal. En modalidades alternativas, el cásete de expresión es insertado (por ejemplo integrado) dentro del ADN genómico de una bacteria utilizando un vector de expresión. En algunas modalidades, el vector de expresión es lineal. En otras modalidades, el vector de expresión es circular. Los vectores de expresión adecuados para el uso en bacterias tales como Listeria son conocidos para aquellos de experiencia en la técnica. Existe una variedad de vectores adecuados, apropiados para el uso como una cadena principal de construcción de plásmidos, para el ensamble de los casetes de expresión. Una cadena principal de construcción de plásmido, particular se selecciona con base en si la expresión del polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que codifica para un antígeno heterólogo) a partir del cromosoma bacteriano o de un episoma extra-cromosómocio, es deseado . En algunas modalidades, la incorporación del cásete de expresión y/o la molécula de ácido nucleico recombinante) dentro del cromosoma bacteriano de Listeria monocytogenes (Listeria ) es lograda con un vector de integración que contiene un cásete de expresión para una integrasa de listeriofago, que cataliza la integración específica de secuencia del vector dentro del cromosoma de Listeria . Por ejemplo, los vectores de integración conocidos como pPLl y pPL2 programan la integración estable de copia simple de un cásete de expresión de proteína heteróloga, dentro de una región inocua del genoma bacteriano, y han sido descritos en la literatura (Lauer et al. 2002, J. Bacteriol. 184: 4177-4178; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20030203472). Los vectores de integración son estables como plásmidos en E. coli y son introducidos por medio de conjugación dentro del antecedente de Listeria deseado. Cada vector carece de un origen de replicación específico de Listeria, y codifica una integrasa de fago, tal que los vectores son estables únicamente después de la integración en un sitio de acoplamiento al fago cromosómico. Comenzando con una construcción de plásmido deseado, el proceso de generar una cepa de Listeria recombinante que expresa una o varias proteínas deseadas, toma aproximadamente una semana. Los vectores de integración pPLl y pPL 2 están basados, respectivamente, en los listeriofagos U153 y PSA. El vector pPLl se integra dentro de la estructura de lectura abierta del gen comK, mientras que pPL2 se integra dentro del gen tRNAArg, de una manera tal que la secuencia nativa del gen es restaurada después de la integración exitosa, manteniendo de este modo intacta su función expresada, nativa. Los vectores de integración pPLl y pPL2 contienen una secuencia de sitios de clonación múltiples, con el fin de facilitar la construcción de plásmidos que contienen una molécula de ácido nucleico recombinante o un cásete de expresión, tal como el cásete de expresión de la proteína heteróloga. Algunos ejemplos específicos del uso del vector de integración pPL2, se describen en el Ejemplo 2 y en Ejemplo 3 más adelante. Alternativamente, la incorporación del cásete de expresión (y/o la molécula de ácido nucleico recombinante) dentro del cromosoma de Listeria recombinante, puede ser lograda a través de métodos de intercambio alélicos, conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. En particular, las composiciones en las cuales se desea no incorporar un gen que codifique para una proteína de resistencia a antibiótico, como parte de la construcción que contiene el cásete de expresión, son deseables los métodos de intercambio alélicos. Por ejemplo, el vector pKSV7 (Camilli et. Al. Mol . Microbiol . (1993) 8, 143-157), contiene un origen de replicación de Listeria Gram-positiva, sensible a la temperatura, que es explotado para seleccionar los clones recombinantes a la temperatura no permisiva, que representan el plásmido pKSV7 recombinado en el cromosoma de Listeria . El vector plásmido de intercambio alélico pKSV7 contiene una secuencia de sitios de clonación múltiples, con el fin de facilitar la construcción de los plásmidos que contienen el cásete de expresión de la proteína, y también un gen de resistencia al cloranfenicol . Para la inserción dentro del cromosoma de Listeria, la construcción del cásete de expresión puede ser planteada por aproximadamente 1 kb de la secuencia de ADN cromosómico que corresponde a la localización precisa de la integración deseada. El plásmido del cásete de expresión de pKSV7 puede ser introducido dentro de una cepa bacteriana deseada mediante electroporación, de acuerdo a los métodos estándares para la electroporación de bacterias Gram positivas. Un ejemplo no limitante de un método para efectuar el intercambio alélico utilizando el vector pKSV7, es proporcionado en el Ejemplo 16 más adelante.

En otras modalidades, puede ser deseado el expresar el polipéptido (incluyendo una proteína de fusión que comprende un polipéptido) a partir de un episoma de plásmido estable. El mantenimiento del episoma del plásmido a través del pase por múltiples generaciones, requiere la co-expresión de una proteína que confiere una ventaja selectiva para la bacteria que contiene el plásmido. Como ejemplos no limitantes, la proteína co-expresada a partir del plásmido, en combinación con el polipéptido puede ser una proteína de resistencia al antibiótico, por ejemplo cloranfenicol, o puede ser una proteína bacteriana (que es expresada a partir del cromosoma en las bacterias de tipo silvestre) , que puede también conferir una ventaja selectiva. Los ejemplos no limitantes de proteínas bacterianas incluyen la enzima requerida para la biosíntesis de purina o de aminoácidos (seleccionadas utilizando medios definidos que carecen de los aminoácidos relevantes o de otras macromoléculas precursoras necesarias), o un factor de transcripción requerido para la expresión de los genes que confieren una ventaja selectiva in vivo o in vitro (Gunn et . al. 2001 J. Immunol . 167: 6471-6479). Como un ejemplo no limitante, pAM401 es un plásmido adecuado para la expresión episomal de un polipéptido seleccionado en diversos géneros de bacterias Gram positivas (Wirth et al. 1986 J. Bacteriol 165: 831-836). Para la descripción adicional de los usos ejemplares de pAM401, ver Ejemplos 3 y 13 más adelante. La incorporación del cásete de expresión dentro del cromosoma bacteriano de B . anthracis puede, por ejemplo, ser lograda con un vector de integración que contiene un cásete de expresión para una integrasa de fago que cataliza la integración específica de secuencias del vector dentro del cromosoma B . anthracis . La integrasa y el sitio de acoplamiento de un fago de B. anthracis puede ser utilizado para derivar un vector de integración, para incorporar los casetes de expresión del antígeno deseado, dentro de la composición de vacuna. Como un ejemplo no limitante, la integrasa y el sitio de acoplamiento del fago w-alfa templado de B . anthracis es utilizado para derivar un vector de integración específico de (McCloy, E.W. 1951. Studies on a lysogenic Bacillus stain. I. A bacteriophage specific for Bacillus anthracis. J. Hyg. 49: 114-125) . Alternativamente, la incorporación de un cásete de expresión de antígeno dentro del cromosoma de B . anthracis puede ser lograda a través de métodos de intercambio alélico, conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Gat et al., Infect . Immun . , 71: 801-13 (2003). En particular, las composiciones en las cuales se desea no incorporar un gen que codifique para una proteína de resistencia a antibiótico como parte de la construcción que contiene el cásete de expresión, son deseables los métodos de intercambio alélico. Por ejemplo, el vector pKSV7 (Ca illi et al: Mol . Microbiol . 1993 8, 143-157), contiene un origen de replicación Gram positivo derivado de Listeria, sensible a la temperatura, que es explotado para seleccionar los clones recombinantes a las temperaturas no permitidas que representan el plásmido pKSV7 recombinado dentro del cromosoma bacteriano. El vector plásmido de intercambio alélico pKSV7, contiene una secuencia de sitios de clonación múltiples con el fin de facilitar la construcción de los plásmidos que contienen el cásete de expresión, y también un gen de resistencia al cloranfenicol . Para la inserción dentro del cromosoma de Bacillus anthracis, la construcción del cásete de expresión puede ser flanqueada por aproximadamente 1 kb de la secuencia del ADN cromosómico que corresponde a la localización precisa de la integración deseada. El plásmido pKSV7 cásete de expresión puede ser introducido dentro de una cepa bacteriana deseada mediante electroporación, de acuerdo a los métodos estándares para la electroporación de bacterias Gram positivas. Un ejemplo no limitante de un método para efectuar el intercambio alélico en B . anthracis es proporcionado en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/883,599, incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. En particular, el intercambio alélico utilizando el vector pKSV7 puede ser utilizado en cepas de B . anthracis para agregar un cásete de expresión de antígeno deseado en cualquier sitio deseado dentro del cromosoma bacteriano. Los métodos de intercambio alélico descritos anteriormente utilizando pKSV7 son ampliamente aplicables para el uso en bacterias Gram positivas. Además, una variedad de vectores de expresión útiles en la bacteria, incluyendo los vectores bacterianos recombinantes, son conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Los ejemplos incluyen aquellos vectores descritos en las siguientes referencias, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad: Hortwitz et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA, 91 : 13853-8 (2000); Garmory et al., J. Drug Target, 11: 471-9 (2003); Kang et al., FEMS Immunol . Med. Microbiol . 37: 99-104 (2003); Garmory et al., Vacinne, 21: 3051-7 (2003); Kang et al., Infect . Immun . , 1739-49 (2002); Russman et al., J. Immunol . , 167: 357-65 (2001); Harth et al., Microbiology, 150: 2143-51 (2004); Varaldo et al., Infecí . Immun . , 72: 3336-43 (2004); Goonetilleke et al., J. Immunol . , 171: 1602-9 (2003); Uno-Furuta et al., Vaccine, 21: 3149-56 (2003); Biet et al., Infect. Immun., 71: 2933-7 (2003); Bao et al., Infect . Immun . , 71: 1656-61 (2003); Kawahara et al., Clin . Immunol . , 105: 326-31 (2002); Anderson et al., Vaccine, 18: 2193-202 (2000); Bumann, Infect . Immun . , 69: 7493-500 (2001); Wang et al., Vaccine, 17: 1-12 (1999); McSorley et al., Infecí .

Immun . , 65: 171-8 (1997); Gat et al., Infecí . Immun . , 71: 801-13 (2003); Patente de los Estados Unidos No. 5,504,005; Patente de los Estados Unidos No. 5,830,702; Patente de los Estados Unidos No. 6,051,237; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0025323; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0202985; WO 04/062597; Patente de los Estados Unidos No. 6,566,121; y Patente de los Estados Unidos No. 6,270,776. La invención proporciona además los vectores de expresión que comprenden casetes de expresión que comprenden lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primer péptido de señal; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un primer polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; (c) una secuencia intergénica; (d) un tercer polinucleótido que codifica para un segundo péptido de señal; (e) un cuarto polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido, en donde el cuarto polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el tercer polinucleótido; y (f) un promotor operablemente enlazado al primer polinucleótido, al segundo polinucleótido, el tercer polinucleótido, el cuarto polinucleótido, y la secuencia intergénica, tal que el cásete de expresión codifica para la primera proteína de fusión que comprende un péptido de señal, y el primer polipéptido, y una segunda proteína de fusión que comprende el segundo péptido de señal y el segundo polipéptido. La invención proporciona además los métodos para utilizar cualquiera de los vectores de expresión descritos en la presente, para producir una bacteria recombinante (por ejemplo, una bacteria Listeria recombinante). En algunas modalidades, el método para utilizar un vector de expresión descrito en la presente para hacer una bacteria recombinante, comprende la introducción del vector de expresión dentro de una bacteria.

VIII. Bacterias y otras células hospederas La invención proporciona además las células hospederas que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores descritos en la presente (ver, por ejemplo, la Breve Descripción de la Invención, y las Secciones I, II, VI y VII de la Descripción Detalla, anteriormente mencionadas, así como los Ejemplos específicos más adelante) . En algunas modalidades, las células son procarióticas . En algunas modalidades, las células son eucarióticas. En algunas modalidades, las células son de mamífero. En algunas modalidades, las células son célula presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas. En algunas modalidades, las células son células bacterianas. En algunas modalidades, las células hospederas son aisladas. Por ejemplo, la invención proporciona bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores descritos en la presente (ver, por ejemplo, Breve Descripción de la Invención, y las Secciones I, II, VI y VII de la Descripción Detalla, anteriormente mencionadas, así como los Ejemplos específicos más adelante) . Las bacterias que comprenden estos polinucleótidos son alternativamente denominadas en la presente como "bacterias recombinantes", y una bacteria que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión o vector descrito en la presente, es alternativamente denominada en la presente como "una bacteria recombinante". En algunas modalidades, las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión son aisladas. En algunas modalidades, las bacterias recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión expresan los polipéptidos o las proteínas de fusión codificadas por las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión contenidos en ésta. En algunas modalidades, las bacterias recombinantes secretan los polipéptidos o las proteínas de fusión codificadas por las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión contenidos en ésta. En algunas modalidades, la bacteria recombinante expresa y secreta los polipéptidos y/o las proteínas de fusión, en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune en un hospedero después de la administración de la bacteria (o una composición que comprende las bacterias) hacia un hospedero (por ejemplo, un sujeto humano). En algunas modalidades, las bacterias son seleccionadas del grupo que consiste de bacterias gram positivas, bacterias Gram negativas, bacterias intracelulares y micobacterias . En algunas modalidades, las bacterias son bacterias gram positivas. En algunas modalidades de la invención, las bacterias son bacterias intracelulares (por ejemplo, bacterias intracelulares facultativas). En algunas modalidades, las bacterias pertenecen al género Listeria . En otras modalidades, las bacterias son miembros de la especie Listeria monocyíogenes . En algunas otras modalidades, • las bacterias son miembros de las especies Lisíeria ivanovii , Lisíeria seeliger o Listeria innocua . En algunas modalidades, las bacterias son miembros del género Bacillus . En otra modalidad más, las bacterias son Bacillus anthracis . En otra modalidad más, las bacterias son Yersinia pestis . En otras modalidades de la invención, las bacterias son del género Salmonella . En algunas modalidades, las bacterias son Salmonella íyphimurium. En algunas modalidades, las bacterias pertenecen al género Shigella . Por ejemplo, en algunas modalidades, las bacterias son Shigella flexneri . En algunas modalidades, las bacterias son miembros del género Brucella . En una modalidad alternativa, las bacterias son micobacterias. Las micobacterias son opcionalmente un miembro de la especie Mycobacíerium íuberculosis . En algunas modalidades, las bacterias son Bacillus de Calmette-Guerin (BCG) . En algunas modalidades, las bacterias son E. coli, por ejemplo una E. coli que ha sido modificada para expresar la Liesteriolisina 0 (LLO) . En consecuencia, en algunas modalidades, las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores descritos en la presente, se seleccionan del grupo que consiste de Lisíeria , Baccillus aníhracis , Yersinia pesíis, Salmonella y micobacterias. En algunas otras modalidades, las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores descritos en la presente, se seleccionan del grupo que consiste de Lisíeria , Baccillus , Yersinia pesíis, Salmonella , Shigella , Brucella , micobacterias y E. coli . En algunas modalidades, las bacterias de la invención que son modificadas a través de la inserción de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores descritos en la presente (por ejemplo, ver la Breve Descripción de la Invención, y las Secciones I, II, VI y VII de la Descripción Detalla, anteriormente mencionadas, así como los Ejemplos específicos más adelante) para expresar los polipéptidos, y en al menos algunas modalidades, secretar los polipéptidos, son bacterias de tipo silvestre. Por ejemplo, en algunas modalidades, la bacteria recombinante es una bacteria Lisíeria de tipo silvestre, tal como una bacteria Lisíeria monocyíogenes, que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector. No obstante, en algunas modalidades de la invención, las bacterias que comprenden los casetes de expresión y/o los vectores de expresión son una cepa mutante de las bacterias. En algunas modalidades, las bacterias están atenuadas. En algunas modalidades, las bacterias están en una cepa mutante atenuada de las bacterias. Un mutante en el cual ha sido suprimido un gen "xyz" es alternativamente denominado en la presente como Axyz o xyz~ o un mutante de supresión xyz . Por ejemplo, una cepa bacteriana en la cual ha sido suprimido el gen uvrA es alternativamente denominado en la presente como mutante uvrA, AuvrA, o uvrA~ . Además, podrá ser comprendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica que una referencia un mutante o cepa particular como un mutante "xyz" o cepa "xyz" algunas veces se referirá a un mutante o cepa en la cual ha sido suprimido el gen xyz . La mutación en una bacteria mutante que comprende los casetes de expresión y/o los vectores de expresión puede ser una mutación de cualquier tipo. Por ejemplo, la mutación puede constituir una mutación puntual, una mutación de desplazamiento o cambio de estructura, una inserción, una supresión de parte o todo un gen. Además, en algunas modalidades de las cepas modificadas, una porción del genoma bacteriano ha sido reemplazada con un polinucleótido heterólogo. En algunas modalidades, las mutaciones son de origen natural. En otras modalidades, las mutaciones son el resultado de presión de mutación artificial. En otras modalidades adicionales, las mutaciones en el genoma bacteriano son el resultado de ingeniería genética. En algunas modalidades, las bacterias que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o vectores descritos en la presente, son atenuadas para la dispersión célula a célula, la entrada a las células no fagocíticas, o la proliferación (con relación a las bacterias de tipo silvestre) . Las bacterias pueden ser atenuadas mediante mutación o por otras modificaciones. En algunas modalidades, las bacterias que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente, están atenuadas para la dispersión célula a célula (por ejemplo, mutantes AcíA de Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, las bacterias que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente, están atenuadas para la entrada a las células no fagocíticas (por ejemplo, los mutantes de internalina de Listeria monocytogenes , tales como mutantes de supresión inlB) . En algunas modalidades, las bacterias que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente, están atenuadas para la proliferación. En algunas modalidades, las bacterias están atenuadas para la dispersión de célula a célula y para entrada a las células no fagocíticas. En algunas modalidades, las bacterias que comprenden los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente son atenuadas para la dispersión célula a célula. En algunas modalidades, las bacterias (por ejemplo, Listeria ) son defectuosas con respecto a ActA (con relación a las bacterias no mutantes o de tipo silvestre) , o su equivalente (dependiendo del organismo) . En algunas modalidades, las bacterias comprenden una o más mutaciones en acíA. Por ejemplo, la bacteria (por ejemplo, Lisíeria ) puede ser un mutante de supresión de acíA.

ActA es la polimerasa de actina codificada por el gen AcíA (Kocks, et al., Cell , 68: 521-531 (1992); Genbank no. de acceso AL591974, nucleótidos 9456-11389) . La proteína polimerasa de actina está involucrada en el reclutamiento y polimerización de la F-actina del hospedero en un polo de la bacteria Lisíeria . La polimerización y disolución subsecuentes de la actina da como resultado la propulsión de la Listeria a todo lo largo del citosol y hacia las células vecinas. Esta movilidad hace posible que las bacterias se dispersen directamente de célula a célula sin exposición adicional al ambiente extracelular, escapando de este modo de las defensas del hospedero, tales como el desarrollo de anticuerpos. En algunas modalidades, la Listeria atenuada comprende opcionalmente una mutación en un gen de internalina, tal como inlB y en actA. La cepa de Listeria de esta modalidad de la presente invención está atenuada para la entrada a las células no fagocíticas así como atenuada para la dispersión de célula a célula. En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la dispersión de célula a célula es reducida por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%, con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación (por ejemplo, la bacteria de tipo silvestre) . En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la dispersión célula a célula es reducida por al menos aproximadamente 25% con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación. En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la dispersión atenuada de célula a célula, es reducida por al menos 50% con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación. Los ensayos in vitro para determinar si una bacteria tal como una bacteria de Listeria es o no atenuada para la dispersión célula a célula, son conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, el diámetro de las placas formadas en un curso tiempo después de la infección de las monocapas de células cultivadas seleccionadas, puede ser medido. Los ensayos en placa dentro de las monocapas de células L2 pueden ser realizados- como se describe previamente en Sun, A. , A. Camilli, y D.A. Portnoy, 1990, Isolation of Lisíeria monocyíogenes small-plaque mutants detective for intracelular growth and cell-to-cell spread. Infecí . Immun . , 58: 3770-3778, con modificaciones a los métodos de medición, como se describe por Skoble, J. , D.A. Portnoy, y M.D. Welch. 2000, Three regions within Acta promote Arp2/3 complex-mediated actin nucleation and Lisíeria monocyíogenes motility. J. Cell Biol . 150: 527-538. En resumen, las células L2 son desarrolladas hasta la confluencia en cajas de cultivo de tejidos de seis pozos, y luego infectadas con bacterias por 1 hora. Después de la infección, las células son cubiertas con el medio calentado a 40 °C, que está comprendido de DME que contiene 0.8% de agarosa, Suero Fetal Bovino (por ejemplo, 2%), y una concentración deseada de Gentamicina. La concentración de Gentamicina en los medios afecta dramáticamente el tamaño de la placa, y es una medida de la habilidad de una cepa de Lisíeria seleccionada para efectuar célula a célula (Glomski, IJ. , M.M. Gedde, A. W. Tsang, J.A. Swanson, y D.A. Portnoy, 2002. J. Cell Biol . 156: 1029-1038) . Por ejemplo, a los 3 días después de la infección de la monocapa, el tamaño de las placas de las cepas de Lisíeria que tienen un fenotipo de dispersión defectuosa de célula a célula, es reducido por al menos 50%, en comparación a la Lisíeria de tipo silvestre, cuando son cubiertas con el medio que contiene Gentamicina a una concentración de 50 µg/ml. Por otra parte, el tamaño de las placas entre las cepas de Lisíeria que tienen un fenotipo de dispersión defectuosa de célula a célula y las Lisíerias de tipo silvestre, es similar, cuando las monocapas infectadas son recubiertas con el medio + agarosa que contiene únicamente 5 µg/ml de gentamicina. De este modo, la habilidad relativa de una cepa seleccionada para efectuar la dispersión célula a célula en una monocapa de células infectadas con relación a la Lisíeria de tipo silvestre, puede ser determinada al variar la concentración de la gentamicina en los medios que contienen agarosa. Opcionalmente, la visualización y la medición del diámetro de la placa puede ser facilitada por- la adición del medio que contiene Neutral Red (GIBCO BRL; dilución 1:250 en medio de DME + agarosa) a la cobertura a las 48 horas después de la infección. Además, el ensayo en placa puede ser realizado en monocapas derivadas de otras células primarias o células continuas. Por ejemplo las células HepG2, una línea celular derivada de hepatocitos, o los hepatocitos humanos primarios, pueden ser utilizados para evaluar la habilidad de los mutantes de Lisíeria seleccionados para efectuar la dispersión célula a célula, en comparación a la Lisíeria de tipo silvestre. En algunas modalidades, la Lisíeria que comprende mutaciones u otras modificaciones que atenúan la Lisíeria para la dispersión célula a célula, producen placas de "precisión" a altas concentraciones de gentamicina (aproximadamente 50 µg/ml) . En algunas modalidades, las bacterias que comprenden los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente, son bacterias mutantes que están atenuadas para la reparación del ácido nucleico (con relación al tipo silvestre, tales como las bacterias sin la mutación genética de atenuación) . Por ejemplo, en algunas modalidades, las bacterias son defectuosas con respecto a al menos una enzima de reparación del ADN (por ejemplo, los mutantes uvrAB de Lisíeria monocyíogenes) . En algunas modalidades, las bacterias son defectuosas con respecto a PhrB, UvrA, UvrB, UvrC, UvrD y/o RecA, o uno de sus equivalentes (dependiendo del género y la especie de las bacterias) . En algunas modalidades, las bacterias son defectuosas con respecto a UvrA, UvrB y/o UvrC. En algunas modalidades, las bacterias comprenden mutaciones de atenuación en los genes phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD, y/o recA. En algunas modalidades, las bacterias comprenden una o más mutaciones en los genes uvrA, uvrB y/o uvrC. En algunas modalidades, las bacterias están funcionalmente suprimidas en UvrA, UvrB y/o UvrC. En algunas modalidades, las bacterias están suprimidas en UvrA y UvrB funcionales. En algunas modalidades, las bacterias son mutantes de supresión de uvrAB. En algunas modalidades, las bacterias son mutantes ?uvrAB?acíA. En algunas modalidades, el ácido nucleico de las bacterias que están atenuadas para la reparación del ácido nucleico y/o son defectuosas con respecto al menos a una enzima de reparación del ADN, son modificadas por reacción con un compuesto de dirección al ácido nucleico (ver más adelante) . Los mutantes de reparación de ácido nucleico, tales como los mutantes de Lisíeria monocyíogenes ?uvrAB, y los métodos de fabricación de los mutantes, se describen con detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0197343 (ver, por ejemplo, Ejemplo 7 de la Patente de los Estados Unidos No. 2004/0197343) . En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la reparación del ácido nucleico es reducida por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%, con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación (por ejemplo, la bacteria de tipo silvestre) . En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la reparación del ácido nucleico es reducida por al menos aproximadamente 25% con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación. En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la reparación del ácido nucleico es reducida por al menos aproximadamente 50% con relación a la bacteria sin la mutación de atenuación. La confirmación de que una mutación particular está presente en una cepa bacteriana puede ser obtenida a través de una variedad de métodos conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, la porción relevante del genoma de la cepa puede ser clonada y secuenciada. Alternativamente, las mutaciones específicas pueden ser identificadas por medio de PCR utilizando cebadores apareados que codifican para las regiones adyacentes a una supresión u otra mutación. Las Southern Blot pueden ser también utilizadas para detectar cambios en el genoma bacteriano. También, se puede analizar si una proteína particular es expresada por la cepa utilizando técnicas estándares en la materia tales como Western Blot. La confirmación de que la cepa contiene una mutación en el gen deseado puede ser también obtenida a través de la comparación del fenotipo de la cepa con ' un fenotipo previamente reportado. Por ejemplo, la presencia de una mutación de reparación por extirpación de nucleótidos, tal como la supresión de uvrAB, puede ser evaluada utilizando un ensayo que prueba la habilidad de las bacterias para reparar su ácido nucleico utilizando una maquinaria de reparación por extirpación de nucleótidos (NER) y comparando esa habilidad contra las bacterias de tipo silvestre. Tales ensayos funcionales son conocidos en la materia. Por ejemplo, la extirpación del dímero de ciclobutano o la extirpación de los productos inducidos por UV (6-4) puede ser medida para determinar una deficiencia en una enzima NER en el mutante (ver, por ejemplo, Franklin et al., Proc . Na íl . Acad. Sci . EUA, 81: 3821-3824 (1984)). Alternativamente, pueden ser realizadas mediciones de supervivencia para evaluar una deficiencia en la reparación del ácido nucleico. Por ejemplo, las bacterias pueden ser sometidas a tratamiento con psoraleno/UVA y luego evaluadas para su habilidad de proliferar y/o sobrevivir en comparación al tipo silvestre. En algunas modalidades, la bacteria es atenuada para la entrada a las células no fagocíticas (con relación a una bacteria no mutante o de tipo silvestre) . En algunas modalidades, la bacteria (por ejemplo, Lisíeria) es defectuosa con respecto a una o más internalinas (o equivalentes) . En algunas modalidades, la bacteria es defectuosa con respecto a la internalina A. En algunas modalidades, la bacteria es defectuosa con respecto a la internalina B. En algunas modalidades, la bacteria comprende una mutación en inlA. En algunas modalidades, la bacteria comprende una mutación en inlB. En algunas modalidades, la bacteria comprende una mutación en actA y en inlB. En algunas modalidades, la bacteria está suprimida en ActA funcional e internalina B. En algunas modalidades, la bacteria es un mutante de supresión doble ?acíA?inlB . En algunas modalidades, la bacteria es defectuosa con respecto a ActA y a la internalina B. En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la entrada a las células no fagocíticas, es reducida por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%, con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación (por ejemplo, la bacteria de tipo silvestre). En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la entrada a las células no fagocíticas es reducida por al menos aproximadamente 25% con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación. En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la entrada a las células no fagocíticas es reducida por al menos aproximadamente 50% con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación. En algunas modalidades, la capacidad de la bacteria atenuada para la entrada a las células no fagocíticas es reducida por al menos aproximadamente 75% con relación a una bacteria sin la mutación de atenuación. En algunas modalidades, las bacterias atenuadas, tales como una cepa de Lisíeria mutante, están no atenuadas para la entrada a más de un tipo de célula no fagocítica. Por ejemplo, la cepa atenuada puede ser atenuada para la entrada a los hepatocitos, pero no atenuada para la entrada a células epiteliales. Como otro ejemplo más, la cepa atenuada puede ser atenuada para la entrada a células epiteliales, pero no a los hepatocitos. Se entiende también que la atenuación para la entrada a una célula no fagocítica de las bacterias modificadas particulares, es el resultado de la mutación de un gen designado, por ejemplo una mutación por supresión, que codifica para una proteína invasina que interactúa con un receptor celular particular, y como resultado facilita la infección de una célula no fagocítica.

Por ejemplo, las cepas mutantes de Lisíeria ?inlB son atenuadas para la entrada a las células no fagocíticas que expresan el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-met) , incluyendo las líneas celulares de hepatocitos (por ejemplo, HepG2), y los hepatocitos humanos primarios. En algunas modalidades, aún cuando las bacterias (por ejemplo, Lisíerias mutantes) son atenuadas para la entrada a las células no fagocíticas, las Listerias son todavía capaces de realizar la captación por las células fagocíticas, tales como al menos las células dendríticas y/o macrófagos. En una modalidad, la habilidad de las bacterias atenuadas para entrar a las células fagocíticas no es disminuida por la modificación realizada a la cepa, tal como la mutación de una invasina (por ejemplo aproximadamente 95% o más de la habilidad medida de la cepa para ser recogida por las células fagocíticas, es mantenida después de la modificación) . En otras modalidades, la habilidad de las bacterias atenuadas para entrar a las células fagocíticas es disminuida por no más de aproximadamente 10%, no más de aproximadamente 25%, no más de aproximadamente 50%, o no más de aproximadamente 75%. En algunas modalidades de la invención, la cantidad de atenuación en la habilidad de la bacteria (por ejemplo, una bacteria Listeria ) para entrar a las células no fagocíticas, va desde una reducción doble hasta niveles mucho más grandes de atenuación. En algunas modalidades, la atenuación en la habilidad de la bacteria para entrar a las células no fagocíticas es al menos de aproximadamente 0.3 log, aproximadamente 1 log, aproximadamente 2 log, aproximadamente 3 log, aproximadamente 4 log, aproximadamente 5 log, o al menos aproximadamente 6 log. En algunas modalidades, la atenuación está en el intervalo de aproximadamente 0.3 a >8 log, aproximadamente 2 a >8 log, aproximadamente 4 a >8 log, aproximadamente 6 a >8 log, aproximadamente 0.3-8 log, también de aproximadamente 0.3-7 log, también aproximadamente 0.3-6 log, también aproximadamente 0.3-5 log, también aproximadamente 0.3-4 log, también aproximadamente 0.3-3 log, también aproximadamente 0.3-2 log, también aproximadamente 0.3-1 log. En algunas modalidades, la atenuación está en el intervalo de aproximadamente 1 a >8 log, 1-7 log, 1-6 log, también aproximadamente 2-6 log, también aproximadamente 2-5 log, también aproximadamente 3-5 log. Han sido identificadas un número de internalinas en L . monocyíogenes (Boland et a., Clinical Microbiology Revíews, 2001, 14: 584-640). Estas internalinas incluyen, pero no están limitadas a InlA, InlB, InlC, InlC2, InlD, InlE, InlF, InlG e InlH (Dramsi et al., Infecíion and Immuniíy, 65: 1615-1625 (1997); Raffelsbauer et al., Mol . Gen . Geneí . 260: 144-158 (1988)). Las secuencias de genes que codifican para estas proteínas han sido previamente reportadas. Por ejemplo, las secuencias para inlA e inlB han sido reportadas en Gaillard et al., Cell, 65: 1127-1141 (1991) y como GenBank número de acceso M67471. Los genes que codifican para los miembros adicionales de la familia de proteínas relacionadas a la internalina son identificados en Web Tabla 2 del material de Web Suplementario de Glasser et al., Science, 294: 849-852 (2001), (www. sciencemag. org/cgi/content/full/294/5543/849/DCI) , incluyendo lmo0327, lmo0331 , lmo0514 , lmo0610, lml0732, lmoll36, lmol289, lmo2396, ImoOl ll , lmo0333, ImoOßOl , lmol290, lmo2026 y lmo2821 . (Las secuencias de cada miembro de la familia de proteínas relacionadas a la internalina pueden ser encontradas en el genoma de la cepa EGD de L . monocyíogenes, GenBank Acceso no. AL491824 y/o en el genoma de la cepa EGD-e de L . monocyíogenes, GenBank Acceso no.NC_003210. Las localizaciones de los diversos genes relacionados a la internalina son indicadas en Glaser et al.) . InlA (internalina A) (Gaillard et al., Cell , 65: 1127-1141 (1991); GenBank Acceso no. NC_003210) dirige la captación de las Lisíerias por células epiteliales, tales como aquellas de los intestinos. InlB (internalina B) (Gaillard et al., Cell , 65: 1127-1141 (1991); GenBank Acceso no. AL491975 (Lisíeria monocyíogenes cepa EGD, genoma completo, segmento 3/12, región del gen inlB : nucleótidos 97008-98963) ; y GenBank Acceso no. NC_003210 (cepa EGD de Lisíeria monocyíogenes, genoma completo, región del gen inlB: nucleótidos 457008- 458963) , cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad) dirige la captación de la Lisíeria por los hepatocitos o por las células endoteliales, tales como las células endoteliales vacuolares de la microvasculatura cerebral que comprenden la barrera sángrecerebro. (Para descripciones adicionales de la internalina B, ver Ireton, et al., J. of Biological Chemistry, 21 A : 17025-17032 (1999); Dra si et al., Molecular Microbiology 16: 251-261 (1995); Mansell et al., J. of Biological Chemistry, 276: 43597-43603 (2001); y Bierne et al., J. of Cell Science 115: 3357-3367 (2002), todas las cuales se incorporan por referencia en la presente en su totalidad) . En algunas modalidades, la bacteria es deficiente con respecto a ActA, internalina B, o a ActA e internalina B. En algunas modalidades, la bacteria está suprimida en ActA, internalina B, o ActA e internalina B funcionales. En algunas modalidades, la bacteria está suprimida en ActA funcional. En algunas modalidades, la bacteria está suprimida en internalina B funcional. En algunas modalidades, la bacteria está suprimida en ActA e internalina B funcionales.

Los ensayos in vitro para determinar si una bacteria (por ejemplo, una cepa de Listeria mutante) es o no atenuada para la entrada a las células no fagocíticas, son conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, Dramsi et al., Molecular Microbiology 16: 251-261 (1995) y Gaillard et al., Cell 65: 1127-1141 (1991) describen los ensayos para clasificar la habilidad de las cepas de L . monocytogenes mutante para entrar a ciertas líneas celulares. Por ejemplo, para determinar si una bacteria de Listeria con una modificación particular es atenuada para la entrada a un tipo particular de células no fagocíticas, es determinada la habilidad de la bacteria Listeria atenuada para entrar a un tipo particular de célula no fagocítica, y es comparada con la habilidad de la bacteria de Listeria idéntica, sin la modificación para entrar a células no fagocíticas. De igual modo, para determinar si una cepa de Listeria con una mutación particular es o no atenuada para la entrada a un tipo particular de las células no fagocíticas, se determina la habilidad de la cepa de Lisíeria mutante para entrar a un tipo particular de células no fagocíticas, y se compara la habilidad de la cepa de Lisíeria sin la mutación para entrar a las células no fagocíticas. Además, la confirmación de que la cepa es defectuosa con respecto a la internalina B puede ser también obtenida a través de la comparación del fenotipo de la cepa con los fenotipos previamente reportados para los mutantes de internalina B. En algunas modalidades, la atenuación de las bacterias puede- ser medida en términos de los efectos biológicos de la Lisíeria en un hospedero. La patogenicidad de una cepa de bacteria puede ser evaluada mediante la medición de LD50 en ratones u otros vertebrados. La LD5o es la cantidad, o la dosis, de la Lisíeria inyectada a los vertebrados, necesaria para provocar la muerte del 50% de los vertebrados. Los valores de LD50 pueden ser comparados para las bacterias que tienen una modificación particular (por ejemplo, mutación) versus las bacterias sin la modificación particular como una medida del nivel de atenuación. Por ejemplo, si la cepa bacteriana sin una mutación particular tiene una LD50 de 103 bacterias, y la cepa bacteriana que tiene la mutación particular tiene una LD50 de 105 bacterias, la cepa ha sido atenuada de modo que es la LD50 la que se incrementa 100 veces o por 2 log. Alternativamente, el grado de atenuación de la habilidad de una bacteria (por ejemplo, una bacteria Listeria) para infectar las células no fagocíticas puede ser evaluada mucho más directamente in viíro . Por ejemplo, la habilidad de una bacteria Lisíeria modificada para infectar células no fagocíticas, tales como hepatocitos, puede ser comparada a la habilidad de la Lisíeria no modificada o la Lisíeria de tipo silvestre para infectar células fagocíticas. En tal ensayo, las Lisíerias modificada y no modificada son típicamente agregadas a las células no fagocíticas in viíro por un periodo limitado de tiempo (por ejemplo, una hora), las células son luego lavadas con una solución que contiene gentamicina para matar cualquier bacteria extracelular, las células son Usadas y luego sembradas en placa para evaluar el título. Los ejemplos de tal ensayo son encontrados en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0228877. Como un ejemplo adicional, puede ser también medido el grado de atenuación cualitativamente mediante otros efectos biológicos, tales como el grado de patología tisular o los niveles de enzima hepática en suero. Se determinan también los niveles de alanina-aminotransferasa (ALT) , aspartato-a inotransferasa (AST) , albúmina y bilirrubina en el suero, en un laboratorio clínico para ratones inyectados con Lisíeria (u otra bacteria) . Las comparaciones de estos efectos sobre los ratones u otros vertebrados pueden ser realizadas para la Lisíeria con y sin modificaciones/mutaciones particulares como una manera para evaluar la atenuación de la Lisíeria . La atenuación de la Lisíeria puede también ser medida por patología tisular. La cantidad de Lisíeria puede también ser recuperada de diversos tejidos de un vertebrado infectado, tal como el hígado, el bazo y el sistema nervioso, puede ser- también utilizada como una medida del nivel de atenuación al comparar estos valores en vertebrados inyectados con la Lisíeria mutante versus no mutante. Por ejemplo, la cantidad de Lisíeria que puede ser recuperada de tejidos infectados tales como el hígado o el bazo, como una función del tiempo, puede ser utilizada como una medida de la atenuación al comparar estos valores en ratones inyectados con la Lisíeria mutante versus no mutante. En consecuencia, la atenuación de la Listeria puede ser medida en términos de la carga bacteriana en órganos particulares seleccionados en ratones que se sabe son objetivos para Listeria de tipo silvestre. Por ejemplo, la atenuación de la Lisíeria puede ser medida mediante la enumeración de las colonias (Unidades formadoras de Colonias; CFU) que surgen de las diluciones en placa del homogeneizado de hígado o de bazo (homogeneizado en agua + 0.2% de NP40) sobre medio de agar BHI . Las cfu del hígado o del bazo pueden ser medidas, por ejemplo, en un curso de tiempo después de la administración de la Listeria modificada, vía cualquier número de rutas, incluyendo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y subcutánea. Además, la Listeria puede ser medida y comparada a una Listeria tipo silvestre resistente a fármacos (o cualquier otra cepa de Listeria seleccionada) en el hígado y en el bazo (o cualquier otro órgano seleccionado) , en un curso de tiempo después de la administración mediante el ensayo de índice competitivo, como se describe. El grado de atenuación en la captación de la bacteria atenuada por células no fagocíticas no necesita ser una atenuación absoluta con el fin de proporcionar una vacuna segura y efectiva. En algunas modalidades, el grado de atenuación es uno que proporciona una reducción en la toxicidad, suficiente para prevenir o reducir los síntomas de la toxicidad a niveles que no amenazan la vida. En algunas modalidades de la invención, la bacteria que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, un cásete de expresión y/o un vector de expresión descrito en la presente es una cepa mutante de Lisíeria . En modalidades adicionales, la bacteria es una cepa mutante atenuada de Lisíeria monocyíogenes . Una variedad de cepas mutantes ejemplares de Lisíeria que son atenuadas se describen en las solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Nos. 60/446,051 (presentada el 6 de febrero del 2003), 60/449,153 (presentada el 21 de febrero del 2003), 60/511,719 (presentada el 15 de octubre del 2003), 60/511,919 (presentada el 15 de octubre del 2003), 60/511,869 (presentada el 15 de octubre del 2003), 60/541,515 (presentada el 2 de febrero del 2004), y 10/883,599 (presentada el 30 de junio del 2004), así como en las Publicaciones de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2004/0197343 y Patente de los Estados Unidos No. 2004/0228877, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. las cepas mutantes de Listeria son también descritas en la Solicitud Internacional No. PCT/US2004/23881, presentada el 23 de julio del 2004, que es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Por ejemplo, la bacteria que comprende el cásete de expresión y/o el vector es opcionalmente una cepa mutante de Listeria monocytogenes que es defectuosa con respecto a ActA o a la internalina B, o a ambas, a saber ActA e internalina B. En algunas modalidades, la bacteria es una cepa mutante de Listeria monocytogenes que es acíA" (por ejemplo, DP-L4029 (la cepa DP-L3078 descrita en Skoble et al., J. Of Cell Biology, 150: 527-537 (2000), incorporada por referencia en la presente en su totalidad, que ha sido curada de su profago como se describe en (Lauer et al., J. Bacíeriol . 184: 4177 (2002); Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0203472)), acíK inlEX (por ejemplo, DP-L4029ÍJ-1B, depositada con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd. , Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de América, el 3 de octubre del 2003, bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-5562), acíA'uvrAB' (por ejemplo, DP-L4029uvrAB, depositada con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 2 20110-2209, Estados Unidos de América, el 3 de octubre del 2003, bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-5563) , o acíA" inlB'uvrAB' . En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria atenuada (por ejemplo una bacteria Lisíeria monocyíogenes) es un mutante de supresión doble AacíA?inlB. Las mutaciones bacterianas pueden ser logradas a través de métodos mutagénicos tradicionales, tales como productos químicos mutagénicos o radiación seguida por la selección de mutantes. Las mutaciones bacterianas pueden también ser logradas por una persona de experiencia en la técnica, a través de la tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, el método del intercambio alélico utilizando el vector pKSV7 descrito en Camilli et al., Molecular Micro . 8: 143-157 (1993) y descrito anteriormente con respecto a la introducción de los casetes de expresión heterólgos en genomas bacterianos, es adecuado para el uso en la generación de mutantes que incluyen mutantes de supresión. (Camilli et al. (1993) se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad) . Una modalidad ejemplar de la producción de un mutante de internalina de Lisíeria monocyíogenes utilizando el vector pKSV7, es proporcionado en el Ejemplo 24 más adelante. Alternativamente, el protocolo de reemplazo de genes descrito en Biswas et al., J. Bacíeriol . 175: 3628-3635 (1993), puede ser utilizado. Son conocidos para aquellos expertos en la técnica otros métodos similares. La construcción de una variedad de mutantes bacterianos se describe en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/883,599, Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0197343, y Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0228877, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. En algunas modalidades de la invención, la bacteria que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión es una cepa mutante de Bacillus aníhracis . En algunas modalidades, la bacteria es la cepa Sterne . En algunas modalidades, la bacteria es la cepa de Ames. En algunas modalidades, la bacteria de Bacillus aníhracis es un mutante uvrAB. En algunas modalidades, la cepa de Bacillus aníhracis es un mutante uvrC. En algunas modalidades, el mutante de Bacillus aníhracis es un mutante recA. En algunas modalidades, la bacteria es un mutante zluvrAB del Bacillus aníhracis (por ejemplo, el mutante Bacillus anthracis Sterne uvrAB depositado con la American Type Culture Collection, 10811 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de América, el 20 de febrero del 2004, bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patente, y designada con el número de acceso PTA-5825) . Los métodos para alterar el genoma de Bacillus aníhracis son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un método para generar mutaciones en Bacillus aníhracis es mediante intercambio alélico utilizando un vector de intercambio alélico conocido por aquellos expertos en la técnica. Un plásmido de intercambio alélico ejemplar es pKSV7 descrito en Camilli et al., Molecular Microbiology, 8: 143-147 (1993) . Como un primer paso en la generación de un mutante de Bacillus aníhracis, la región del genoma que va a ser suprimido o de otro modo mutado y aproximadamente 1000 pares de bases corriente arriba (5') y corriente abajo (3') del genoma de B . aníhracis es amplificado por PCR y luego clonado dentro del vector plásmido pKSV7 (o un vector análogo) . (Un replicón (ts) de temperatura específico del género Bacillus o específico de B . aníhracis, puede ser sustituido por el replicón ts de Lisíeria presente en el vector plásmido de intercambio alélico pKSV7) . Los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción en la región que va a ser suprimida o mutada, puede ser utilizado para suprimir la porción deseada del gen objetivo en la región. Alternativamente, una porción del gen objetivo dentro de la región puede ser removido y reemplazada con secuencias que contienen la mutación deseada u otra alteración. La región del genoma de B aníhracis que es amplificada puede ser alterada, por ejemplo, utilizando enzimas de restricción o una combinación de enzimas de restricción y secuencias de genes sintéticos, antes o después de la clonación entro del plásmido de intercambio alélico. En algunas modalidades, la secuencia puede ser alterada como un amplicón de PCR y luego clonada dentro de pKSV7. En modalidades alternativas, el amplicón es primeramente insertado dentro de otro plásmido primeramente y luego alterado, extirpado e insertado dentro de pKSV7. Alternativamente, el amplicón de PCR es insertado directamente dentro del plásmido pKSV7 y luego alterado, por ejemplo, utilizando las enzimas de restricción convenientes. El plásmido pKSV7 que contiene la secuencia alterada es luego introducido dentro de B . aníhracis . Esto puede ser realizado vía la electroporación. Las bacterias son luego seleccionadas sobre medios a una temperatura permisiva en presencia de cloranfenicol . Esto es seguido por la selección para la integración cruzada simple dentro del cromosoma bacteriano, mediante el pase por múltiples generaciones a una temperatura no permisiva en presencia de cloranfenicol . Al final, las colonias son pasadas por generaciones múltiples a la temperatura permisiva en medios que no contienen el antibiótico, para lograr la extirpación y curación del plásmido (cruza doble) . Las Solicitudes Provisionales de los Estados Unidos Nos. de Serie 60/584,886 y 60/599,522, y la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0197343, incorporadas por referencia en la presente en su totalidad, proporcionan descripción adicional respecto a la construcción de diferentes tipos de mutantes de Bacillus aníhracis . En algunas modalidades de la invención, la bacteria que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión es una bacteria que ha sido modificada de modo que la bacteria es atenuada para la proliferación (con relación a la bacteria no modificada) . Preferentemente, la bacteria modificada mantiene un nivel suficiente de expresión del gen, a pesar de la modificación. Por ejemplo, en algunas modalidades el nivel de expresión del gen es sustancialmente no afectado por la modificación, de modo que un antígeno es expresado a un nivel suficiente para estimular una respuesta inmune al antígeno después de la administración de la bacteria que expresa el antígeno a un hospedero. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria ha sido modificado por reacción con un compuesto que se dirige al ácido nucleico. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria modificada ha sido modificado por reacción con un compuesto que se dirige al ácido nucleico, que reacciona directamente 2 con el ácido nucleico, de modo que es atenuada la proliferación de la bacteria. En algunas modalidades, el compuesto que se dirige al ácido nucleico es un alquilante de ácido nucleico, tal como ß-alanina, éster de N- (acridin-9-il) -2- [bis (2-cloroetil) amino] etilo. En algunas modalidades, el compuesto que se dirige al ácido nucleico es activado por irradiación, tal como irradiación de UVA. En algunas modalidades, la bacteria ha sido tratada con un compuesto de psoraleno. Por ejemplo, en algunas modalidades, la bacteria ha sido modificada por tratamiento con un psoraleno, tal como el 4'- (4-amino-2-oxa)butil-4,5' , 8-trimetilpsoraleno ("S-59") , y luz UVA. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria ha sido modificado mediante tratamiento con un compuesto de psoraleno e irradiación con UVA. Las descripciones de los métodos para modificar las bacterias para atenuarlas para la proliferación de los cadenas principales de dirección al ácido nucleico son descritas en cada una de las siguientes solicitudes o publicaciones de Patente de los Estados Unidos, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente en su totalidad: 60/446,051 (presentada el 6 de febrero del 2003), 60/449,153 (presentada el 21 de febrero del 2003), 60/490,089 (presentada el 24 de julio del 2003), 60/511,869 (presentada el 15 de octubre del 2003), 60/541,515 (presentada el 2 de febrero del 2004), 10/883,599 (presentada el 30 de junio del 2004), y US 2004/0197343. Las bacterias modificadas y sus usos son también descritas en la Solicitud Internacional No. PCT/US2004/23881, presentada el 23 de julio del 2004, incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Por ejemplo, para el tratamiento de ?actA?uvrAB L. monocyíogenes , en algunas modalidades, puede ser agregado el psoraleno S-59 a 200 nM en un cultivo de fase logarítmica de (aproximadamente) OD6oo=0.5, seguido por inactivación con 6 J/m2 de luz UVA cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de uno. Las condiciones de inactivación son optimizadas mediante la variación de las concentraciones de S-59, la dosis de UVA, el tiempo de exposición de S-59 antes del tratamiento con UVA así como la variación del tiempo de tratamiento durante el crecimiento bacteriano de la cepa de Lisíeria acíA/uvrAB. La cepa progenitora de Lisíeria es utilizada como un control. La inactivación de Lisíeria (log-muerte) es determinada por la incapacidad de la bacteria para formar colonias sobre BHI (infusión de cerebro y corazón) en placas de agar. Además, se puede confirmar la expresión de una proteína heteróloga y los factores de virulencia, tales como LLO y p60, de la Lisíeria inactivada por S-59/UVA utilizando experimentos con pulsos de 35s, para determinar la síntesis y la secreción de las proteínas recién expresadas después de la inactivación con S-59/UVA. La expresión de LLO y p60 utilizando la marcación metabólica con 35s puede ser rutinariamente determinada. La Lisíeria acíA/uvrAB inactivada por S-59/UVA puede ser incubada por 1 hora en presencia de 35s-metionina. La expresión y secreción del antígeno de la proteína heteróloga, LLO endógeno y p60 puede ser determinada de ambos usados celulares completos, y la precipitación con TCA de los fluidos de cultivo bacteriano. Los anticuerpos monoclonales específicos de LLO-, p60 y de la proteína heteróloga pueden ser utilizados para la inmunoprecipitación, para verificar la expresión continuada y la secreción de la lisíeria recombinante después de la inactivación . En algunas modalidades, las bacterias atenuadas para la proliferación son también atenuadas para la reparación del ácido nucleico y/o son defectuosas con respecto al menos a una enzima de reparación de ADN. Por ejemplo, en algunas modalidades, la bacteria en la cual ha sido modificado el ácido nucleico por un compuesto de dirección al ácido nucleico tal como el psoraleno (combinado con tratamiento con UVA) es un mutante de supresión uvrAB. En algunas modalidades, la proliferación de las bacterias es atenuada por al menos aproximadamente 0.3 log, también al menos 1 log, aproximadamente 2 log, aproximadamente 3 log, aproximadamente 4 log, aproximadamente 6 log, o al menos aproximadamente 8 log. En otra modalidad, la proliferación de las bacterias es atenuada por aproximadamente 0.3 a >10 log, aproximadamente 2 a >10 log, aproximadamente 4 a >10 log, aproximadamente 6 a >10 log, aproximadamente 0.3-8 log, aproximadamente 0.3-6 log, aproximadamente 0.3-5 log, aproximadamente 1-5 log, o aproximadamente 2-5 log. En algunas modalidades, la expresión de un antígeno por las bacterias es al menos de aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 90% de la expresión del antígeno por bacterias en las cuales no es modificado el ácido nucleico bacteriano. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria no ha sido modificado por reacción con un compuesto que se dirige al ácido nucleico. En algunas modalidades, la bacteria recombinante no ha sido atenuada para la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria recombinante no es atenuada en su capacidad para la reparación del ácido nucleico. En algunas modalidades, la bacteria recombinante no es deficiente con respecto al menos a una enzima de reparación del ADN. En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión contenido dentro de la bacteria recombinante, es nativo para la bacteria recombinante. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal que es nativo para la bacteria recombinante, ha sido optimizado en codón para la expresión en la bacteria recombinante. En algunas modalidades, el polinucleótido ha sido completamente optimizado en codón. En algunas modalidades, el péptido de señal codificado por el primer polinucleótido de la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión contenido dentro de la bacteria recombinante, es extraño para la bacteria recombinante hospedera. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal que es extraño para la bacteria recombinante hospedera ha sido optimizado en codón para la expresión en la bacteria recombinante . En algunas modalidades, el segundo polinucleótido en la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión dentro de la bacteria recombinante, ha sido optimizado en codón para la expresión en la bacteria recombinante. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido ha sido completamente optimizado en codón para la expresión en la bacteria recombinante. En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos dentro de la bacteria recombinante han sido optimizados en codón para la expresión en la bacteria recombinante. En algunas modalidades, el primero y segundo polinucleótidos dentro de la bacteria recombinante han sido completamente optimizados en codón para la expresión en la bacteria recombinante. En un aspecto, la invención proporciona una bacteria que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. Como se describe en la presente, por ejemplo, en la Sección III, en algunas modalidades, el péptido de señal que es codificado es un derivado de bacteria. En algunas modalidades, el péptido de señal bacterial codificado por el cásete de expresión es derivado de la bacteria del mismo género y/o especie de la bacteria que comprende el cásete de expresión. En algunas modalidades, el péptido de señal es nativo para la bacteria recombinante hospedera. En otras modalidades, el péptido de señal bacteriana codificado por el cásete de expresión es derivado de bacterias de un género diferente y/o especies diferentes 'que la bacteria que comprende el cásete de expresión. En algunas modalidades, el péptido de señal es extraño para la bacteria recombinante hospedera. En algunas modalidades el péptido de señal es un péptido de señal secAl, secA2 o Tat. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo (por ejemplo, extraño) para la bacteria. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para la bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria intracelular. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es parte de un cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Listeria , Bacillus, Yersinia pesíis, Salmonella , Shigella, Brucella, micobacteria y E. coli . En algunas modalidades, la bacteria es Lisíeria (por ejemplo, Lisíeria monocytogenes) . En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Listeria recombinante (por ejemplo, Listeria monocyíogenes) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria de Lisíeria, y (b)un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es parte de un cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria Lisíeria . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño a la bacteria Lisíeria (por ejemplo, heterólogo a la bacteria Lisíeria ) . En algunas modalidades, la bacteria Listeria está atenuada. Por ejemplo, la Listeria puede ser atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada a células no fagocíticas, o la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante es deficiente con respecto a ActA, Internalina B o a ActA e Internalina B (por ejemplo, un mutante por doble supresión ?acíA?inlB) . En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado por reacción con un compuesto de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoraleno) . En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un primer polinucleótido que codifica para un segundo péptido de señal bacteriano no secAl, y un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es parte de un cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria seleccionada del grupo que consiste de Lisíeria , Bacillus, Yersinia pesíis, Salmonella , Shigella , Brucella , micobacteria o E. coli . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño para la bacteria (por ejemplo, heterólogo para la bacteria) . En otro aspecto, la invención proporciona una bacteria que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido heterólogo a la bacteria) en la misma estructura de lectura traduccional como el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. Como se describe en la presente, por ejemplo, en la Sección II anterior, en algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano no secAl es un péptido de señal secA2. En algunas otras modalidades, el péptido de señal bacteriano no secAl es un péptido de señal Tat. En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano codificado por el cásete de expresión es derivado de la bacteria del mismo género y/o especie que la bacteria que comprende el cásete de expresión. En otras modalidades, el péptido de señal bacteriana codificado por el cásete de expresión es derivado de bacterias de un género y/o especie diferente que la bacteria que comprende el cásete de expresión. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria de Lisíeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante es parte de un cásete de expresión que comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, la bacteria Listeria está atenuada. En algunas modalidades, la bacteria Listeria es una bacteria Listeria monocyíogenes . Por ejemplo, la Lisíeria puede ser atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada a las células no fagocíticas, o la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria recombinante es deficiente con respecto a Acta, la Internalina B, o a ActA e Internalina B (por ejemplo, un mutante de supresión doble ?acíA?inlB) . En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado por reacción con un compuesto de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoraleno). En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Lisíeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño a la bacteria Lisíeria, en donde el polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria . En un aspecto adicional, la invención proporciona una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para la bacteria Lisíeria, en donde el polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria ; y (b) un promotor, operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño. Nuevamente, en algunas modalidades, la Lisíeria es Listeria monocytogenes . En otras modalidades, la bacteria' Listeria pertenece a las especies Lisíeria ivanovii , Lisíeria seeligeri o Lisíeria innocua . En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria es una cepa atenuada de la bacteria Lisíeria como se describió anteriormente. En un aspecto adicional, la invención proporciona -una bacteria Listeria recombinante (por ejemplo, Listeria monocyíogenes) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria está atenuada. Por ejemplo, la Listeria puede ser atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada a las células no fagocíticas o la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Listeria recombinante es deficiente con respecto a Acta, la Internalina B, o a ActA e Internalina B (por ejemplo, un mutante de supresión doble ?acíA?inlB) . En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado por reacción con un compuesto de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoraleno) . En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Lisíeria recombinante (por ejemplo, de la especie Lisíeria monocyíogenes) que comprende un cásete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial, un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido no Listerial) , que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. El cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria es atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada a las células no fagocíticas o la proliferación. En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria es deficiente con respecto a Acta, la Internalina B, o a ActA e Internalina B. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado por reacción con un compuesto de dirección al ácido nucleico (por ejemplo, un compuesto de psoraleno) . En algunas modalidades, el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, o el primero y segundo polinucleótidos son optimizados en codón para la expresión en Lisíeria . En algunas modalidades, el primer polinucleótido y/o el segundo polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es un antígeno, el cual, en algunos casos, puede ser un antígeno no bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido es, en algunas modalidades un antígeno asociado al tumor o es derivado de tal antígeno asociado al tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido es K-ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1 survivina, gplOO, PAP, proteinaza 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA, o es derivado de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido es mesotelina, o es un fragmento o variante de mesotelina. En algunas modalidades, el polipéptido es NY-ESO-l, o un fragmento o variante de mesotelina. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de enfermedad no infecciosa o es derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. En modalidades preferidas, el péptido de señal es bacteriano. En algunas modalidades, el péptido de señal es de una bacteria que pertenece al género Bacillus , Síaphylococcus o Lactococcus . Por ejemplo, en algunas modalidades, el péptido de señal es de Bacillus anthracis , Bacillus subtilis , Síaphylococcus aureus, o Lacíococcus lactis . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secAl, tal como un péptido de señal Usp45 de Lactococcus lactis o un péptido de señal de Antígeno Protector de Bacillus anthracis . En algunas modalidades, el péptido de señal es un péptido de señal secA2. En modalidades adicionales, el péptido de señal es un péptido de señal Tat, tal como un péptido de señal Tat de B . subíilis (por ejemplo, PhoD) . La invención proporciona además una bacteria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o un fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activo del mismo; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa del mismo, en donde, en la proteína quimera, el polipéptido está fusionado a la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa del mismo, o está colocado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa del mismo. En algunas modalidades, la bacteria recombinante es una bacteria intracelular, tal como la bacteria Lisíeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es extraño a la bacteria recombinante. En otro aspecto más, la invención proporciona una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión policistrónico, en donde el cásete de expresión policistrónico codifica para al menos dos polipéptidos no Listeriales discretos. Por ejemplo, en algunas modalidades, el cásete de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica para le primer polipéptido no Listerial, un segundo polinucleótido que codifica para el segundo polipéptido no Listerial, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos. En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria recombinante pertenece a la especie Lisíeria monocyíogenes . En algunas modalidades, el primero y/o el segundo polipéptidos no Listeriales comprenden antígenos (o fragmentos de los mismos) . En algunas modalidades, la invención proporciona una bacteria recombinante (por ejemplo, Listeria ) que comprende un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un primer péptido de señal; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un primer polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; (c) una secuencia intergénica; (d) un tercer polinucleótido que codifica para un segundo péptido de señal; (e) un cuarto polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido, en donde el cuarto polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el tercer polinucleótido; y (f) un promotor operablemente enlazado al primer polinucleótido, al segundo polinucleótido, al tercer polinucleótido, al cuarto polinucleótido y la secuencia intergénica, tal, que el cásete de expresión codifica para una primera proteína de fusión que comprende el primer péptido de señal y el primer polipéptido y una segunda proteína de fusión que comprende el segundo péptido de señal y el segundo polipéptido. En algunas modalidades, uno o más polinucleótidos que codifican para un péptido de señal están optimizados en codón para la expresión en la bacteria. En algunas modalidades, el tercero y/o cuarto polinucleótidos son optimizados en codón para la expresión en la bacteria. En algunas modalidades, el primero y/o el segundo polipéptidos son heterólogos para la bacteria recombinante (por ejemplo, antígenos heterólogos). En algunas modalidades, el primero y/o el segundo péptido de señal es un péptido de señal bacteriano no secAl. El primero y/o segundo péptido de señal puede ser nativo o extraño para la bacteria recombinante. En algunas modalidades, la bacteria recombinante es una bacteria Listeria y el primero y/o segundo péptido de señal es no Listerial. En algunas modalidades, la secuencia intergénica es la secuencia intergénica actA-plcB de Lisíeria monocyíogenes . En algunas modalidades, la bacteria es Lisíeria monocyíogenes . En otros aspectos, la invención proporciona una bacteria que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo para la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido, y la proteína secretada, o el fragmento de la misma, y en donde el polipéptido está fusionado a la proteína secretada, o el fragmento de la misma, o está colocado dentro de la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera. En algunas modalidades, la bacteria es una bacteria Lisíeria . En algunas modalidades, donde la bacteria es una bacteria Lisíeria, el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido es extraño para la Lisíeria . En algunas modalidades, la bacteria es Lisíeria monocyíogenes . En algunas modalidades (por ejemplo, en algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados) , el cásete de expresión contenido dentro de la bacteria está integrado dentro del genoma de la bacteria. En otras modalidades, el cásete de expresión contenido dentro de la bacteria está sobre un plásmido dentro de la bacteria. En general, el promotor que es utilizado en el cásete de expresión será un cásete de expresión que es adecuado para efectuar la expresión heteróloga con el hospedero bacteriano particular elegido. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede discernir fácilmente cuáles promotores son adecuados para el uso en cuáles bacterias. En algunas modalidades, el promotor es un promotor bacteriano. En modalidades adicionales, el promotor sobre el cásete de expresión en la bacteria es un promotor proveniente de las bacterias que pertenecen al mismo género que la bacteria que contiene el cásete de expresión. En otras modalidades, el promotor sobre el cásete de expresión en la bacteria es un promotor proveniente de las bacterias que pertenecen a la misma especie que la bacteria que contiene el cásete de expresión. Por ejemplo, si la bacteria que contiene el cásete de expresión pertenece a la especie Lisíeria monocyíogenes, entonces el promotor que es utilizado sobre el cásete de expresión es opcionalmente derivado de un gen Lisíerial tal como hly. En otras modalidades, el promotor es un promotor constitutivo (por ejemplo, un promotor p60) o es el promotor dependiente de prfA (por ejemplo un promotor actA) . Nuevamente, como se describió anteriormente, el promotor del cásete de expresión es, en algunas modalidades, un promotor constitutivo. En otras modalidades, el promotor del cásete de expresión es un promotor inducible, también como se describió anteriormente. En algunas modalidades (por ejemplo, en algunas modalidades de cada uno de los aspectos anteriormente mencionados) , los polipéptidos o proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos que son codificados por los casetes de expresión en las bacterias, son antígenos u otras proteínas de valor terapéutico, como se describe, por ejemplo, en la Sección IV anterior. En algunas modalidades, el polipéptido o una proteína que comprende el polipéptido es secretado desde la bacteria. En algunas modalidades, el polipéptido que es expresado y/o secretado desde la bacteria es heterólogo para la bacteria. En algunas modalidades, por lo tanto, la invención proporciona la Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano (ya sea Lisíerial o no Lisíerial ) en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria ; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno no Lisíerial, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En modalidades adicionales, la Lisíeria es una cepa de Lisíeria monocyíogenes , tal como una cepa acíA'inlB" . En algunas modalidades, el cásete de expresión ha sido integrado dentro del genoma de la Lisíeria recombinante. En algunas modalidades, el segundo polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria . La invención también proporciona la Lisíeria que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano secA2 o Tat; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es Lisíerial . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es no Lisíerial . En modalidades adicionales, la Lisíeria es una cepa de Lisíeria monocyíogenes, tal como una cepa acíA'inlB". En algunas modalidades, el cásete de expresión ha sido integrado dentro del genoma de la Lisíeria recombinante. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica para el péptido de señal (incluso si el péptido de señal es un péptido de señal Listerial) y/o el polinucleótido que codifica para el antígeno es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria . En modalidades adicionales, la invención proporciona la Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión, donde el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un antígeno no Lisíerial, en donde el polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria; (b) un promotor, operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño. En algunas modalidades, el cásete de expresión comprende además un polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano, el cual es también optimizado en codón para la expresión en Listeria . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es Listerial . En otra modalidad más, el péptido de señal bacteriano es no Listerial . En algunas modalidades, el péptido de señal bacteriano es un péptido de señal secAl, un péptido de señal secA2, o un péptido de señal Tat. En modalidades adicionales, la Lisíeria es una cepa de Lisíeria monocyíogenes, tal como una cepa acíA'inlB' . En algunas modalidades, el cásete de expresión ha sido integrado dentro del genoma de la Lisíeria recombinante. En otra modalidad más, la invención proporciona una bacteria Lisíeria recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano (Lisíerial o no Lisíerial) en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno no Lisíerial, en donde el segundo polinucleótido está también optimizado en codón para la expresión en Lisíeria, y está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y(c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria pertenece a la especie Listeria monocytogenes . En algunas modalidades, la bacteria Lisíeria es una cepa mutante acíA'inlB' de Lisíeria monocyíogenes . La presente invención proporciona además las bacterias tales como Lisíeria que comprende más de un cásete de expresión descrito en la presente. En composiciones particulares, la masa molecular de una proteína dada puede inhibir su expresión a partir de la bacteria recombinante, tal como la Lisíeria recombinante. Un procedimiento para enfrentar este problema es "dividir" molecularmente el gen que codifica para una proteína de interés y fusionar cada división funcionalmente a una secuencia que programará su secreción desde la bacteria (por ejemplo, los elementos SecAl, secA2, o Tat) . Un procedimiento es derivar individualmente la Lisíeria recombinante que expresa cada división del gen heterólogo. Alternativamente, individualmente los componentes del gen molecularmente dividido (que incluye también los elementos apropiados para la secreción) puede ser introducido dentro de las regiones intergénicas a todo lo largo del cromosoma bacteriano, utilizando métodos bien establecidos en la técnica, por ejemplo mediante intercambio alélico. Otro ejemplo más es expresar el gen molecularmente dividido como un mensaje policistrónico simple. De acuerdo a esta composición, intercalado entre la secuencia que codifica para la proteína del gen molecularmente dividido, podría estar la secuencia de enlace al ribosima de Shine-Dalgarno, con el fin de re-iniciar la síntesis de proteína sobre el mensaje policistrónico . En aspectos adicionales, la invención proporciona los métodos para mejorar la expresión y/o secreción de polipéptidos heterólogos en bacterias recombinantes tales como Lisíeria . Cualquiera de los polinucleótidos, casetes de expresión y/o vectores de expresión descritos en la presente pueden ser utilizados en estos métodos. Por ejemplo, la invención proporciona un método para mejorar la expresión y/o secreción del polipéptido heterólogo fusionado a un péptido de señal en Lisíeria, que comprende la optimización del codón ya sea de la secuencia que codifica para el polipéptido sobre el cásete de expresión, la secuencia que codifica para el péptido de señal del cásete de expresión, o ambos. La invención también proporciona un método para mejorar la expresión y/o secreción de un polipéptido heterólogo fusionado a un péptido de señal en Lisíeria, que comprende el uso de un péptido de señal proveniente de una fuente no Listerial y/o de una vía secretora diferente de secAl. La invención también proporciona un método para producir una bacteria recombinante (por ejemplo una bacteria Lisíeria recombinante) que comprende introducir una molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión y/o el vector de expresión descrito en la presente en una bacteria para producir la bacteria recombinante. Por ejemplo, en algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde le primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido, es introducido dentro de una bacteria para producir la bacteria recombinante. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido, es introducido dentro de una bacteria para producir la bacteria recombinante. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante que es introducida dentro de una bacteria para producir la bacteria recombinante es una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para_ una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. La molécula de ácido nucleico recombinante utilizada para producir la bacteria recombinante es, en algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera en la cual el poüpéptido no Listerial está fusionado a la autolisina o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, o es insertado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma. En algunas otras modalidades, es proporcionado un método para proporcionar una bacteria Lisíeria recombinante, que comprende introducir un cásete de expresión policistrónico, en donde el cásete de expresión codifica para al menos dos polipéptidos no Listeriales discretos, dentro de una bacteria Lisíerial para producir la bacteria Listeria recombinante.

IX. Composiciones farmacéuticas, inmunogénicas y/o de vacuna La invención también proporciona una variedad de diferentes composiciones tales como composiciones farmacéuticas, composiciones inmunogénicas y vacunas. Estas composiciones comprenden cualquiera de las bacterias recombinantes descritas en la presente (ver, por ejemplo, la Breve Descripción de la Invención, Secciones I y VIII de la Descripción Detallada, anterior, y en cualquier otro sitio en la especificación, incluyendo los Ejemplos, más adelante) . En algunas modalidades, las composiciones son aisladas. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende lo siguiente: (i) un portador farmacéuticamente aceptable; y (ii) una bacteria recombinante descrita en la presente. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende lo siguiente: (i) un portador farmacéuticamente aceptable; y (ii) una bacteria recombinante que comprende un cásete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en una bacteria, un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende, el péptido de señal y el polipéptido. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende: (i) un portador farmacéuticamente aceptable; y (ii) una bacteria recombinante que comprende un cásete de expresión, donde el cásete de expresión comprende un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl, un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende: (i) un portador farmacéuticamente 'aceptable; y (ii) una bacteria Listeria recombinante que comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para Lisíeria, en donde el polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria; y (b) un promotor, operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño. 2 La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende: (i) un portador farmacéuticamente aceptable; y (ii) una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. Como se utiliza en la presente, "portador" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antimicóticos, agentes retardadores de la absorción e isotónicos, amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve la actividad biológica y sea no reactivo con el sistema inmune del sujeto. Por ejemplo, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua, soluciones salinas amortiguadas (por 2 ejemplo, solución salina al 0.9%), emulsiones tales como emulsiones aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Los posibles portadores incluyen también, pero no están limitados a, aceites (por ejemplo, aceite mineral) , soluciones de dextrosa, soluciones de glicerol, cal o greda, almidón, sales, glicerol y gelatina. Mientras que cualquier portador adecuado conocido por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica puede ser empleado en las composiciones farmacéuticas, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. En algunas modalidades, para la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, el portador comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un amortiguador. En algunas modalidades, cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa y carbonato de magnesio, son empleados para la administración oral. Las composiciones que comprenden tales portadores son formuladas mediante métodos convencionales bien conocidos (ver, por ejemplo, Remingíon r s Pharmaceuíical Sciences, 1 (a edición, A. Gennaro, ed. Mack Publishing Co . , Easton, PA, 1, 990; y Remingíon , The Science and Pracíice of Pharmacy 20a Ed., Mack Publishing, 2000). Además de las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas son proporcionadas. Por ejemplo, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente (ver, por ejemplo, la bacteria recombinante descrita anteriormente en la Breve Descripción de la Invención, Secciones I y VIII de la Descripción Detallada anterior, y en otros sitios en la especificación, incluyendo los Ejemplos, más adelante) . En algunas modalidades, la composición inmunogénica comprende una bacteria recombinante, en donde la secuencia del polipéptido que es parte del polipéptido expresado por la bacteria recombinante como una proteína discreta, como una parte de una proteína de fusión o incrustada en una proteína quimera (dependiendo de la molécula de ácido nucleico recombinante o el cásete de expresión utilizado) es un antígeno o comprende un antígeno. En otras palabras, en algunas modalidades, la composición inmunogénica comprende una bacteria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante o un cásete de expresión que codifica para un polipéptido que comprende un antígeno. Los antígenos adecuados incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de aquellos descritos en la presente (por ejemplo, arriba en la Sección IV) . En algunas modalidades, la bacteria recombinante en la composición inmunogénica expresa el polipéptido que comprende el antígeno a un nivel suficiente para inducir una respuesta inmune al antígeno después de la administración de la composición a un hospedero (por ejemplo un mamífero tal como un humano) . En algunas modalidades, la respuesta inmune estimulada por la composición inmunogénica es una respuesta inmune mediada por células. En algunas modalidades, la respuesta inmune estimulada por la composición inmunogénica es una respuesta inmune humoral. En algunas modalidades, la respuesta inmune estimulada por la composición inmunogénica comprende la respuesta inmune mediada por células y humoral. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una bacteria recombinante, donde la bacteria comprende un cásete de expresión que incluye lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido está optimizado en codón para la expresión en una bacteria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una bacteria recombinante, en donde la bacteria comprende un cásete de expresión que incluye lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polínucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una composición inmunogénica que incluye una bacteria Lisíeria recombinante, en donde la bacteria Lisíeria recombinante comprende un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un antígeno no Listerial y que es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria ; y (b) un promotor operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el antígeno.. La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica un péptido de señal no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el antígeno . En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria recombinante que incluye una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un antígeno, en donde le segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria Lisíeria recombinante, en donde la bacteria recombinante comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria recombinante que incluye una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un primer polinucleótido que codifica para péptido de señal bacteriano no secAl, y un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En otro aspecto más, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria Lisíeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica un péptido de señal bacteriano no secAl, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido ya sea heterólogo para el péptido de señal o extraño para la bacteria, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. En alqunas modalidades, el polipéptido codificado por el primer polinucleótido comprende un antígeno. En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria Lisíeria recombinante, en donde la bacteria Lisíeria recombinante comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño a la Lisíeria, en donde el polinucleótido que codifica para el polipéptido extraño es optimizado en codón para la expresión en Listeria . En algunas modalidades, el polipéptido extraño comprende un antígeno. En otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria Listeria recombinante, en donde la bacteria recombinante comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. La invención también proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria recombinante, en donde la bacteria recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o un fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, en donde en la proteína quimera, el polipéptido está fusionado a o está colocado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma. En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria Lisíeria recombinante, en donde la bacteria Lisíeria recombinante comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para al menos dos polipéptidos no Listeriales discretos, al menos uno de los cuales comprende un antígeno. En otros aspectos, la invención proporciona una composición inmunogénica (o vacuna) que comprende una bacteria recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de la misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo a la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido, y la proteína secretada, o el fragmento de la misma, y en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido es fusionado a la proteína secretada, o el fragmento de la misma, o está colocado dentro de la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo codificado por el tercer polinucleótido comprende un antígeno. Se puede determinar si una forma particular de bacteria recombinante (y/o un cásete de expresión particular) es útil en una composición inmunogénica (o como una vacuna) al probar la habilidad de la bacteria recombinante para estimular una respuesta inmune in viíro o en un sistema modelo . Estas .respuestas de células inmunes pueden ser medidas mediante métodos in viíro e in vivo para determinar si la respuesta inmune de una bacteria recombinante particular (y/o de un cásete de expresión particular) es efectiva. Una posibilidad es medir la presentación de la proteína o del antígeno de interés por una célula 27 presentadora de antígeno que ha sido mezclada con una población de las bacterias reco binantes . Las bacterias recombinantes pueden ser mezcladas con una célula presentadora de antígeno, adecuada, o una línea celular, por ejemplo una célula dendrítica, y la presentación del antígeno por la célula dendrítica a una célula T que reconoce la proteína o el antígeno puede ser medida. Si las bacterias recombinante que están expresando la proteína o el antígeno a un nivel suficiente, éste será procesado en fragmentos peptídicos por las células dendríticas y presentado en el contexto de MHC Clase I o Clase II a las células T. Para fines de detectar la proteína o antígeno presentado, un clon e células T o una línea de células T que responde a la proteína o antígeno particular, puede ser utilizada. Las células T pueden ser también un hibridoma de células T, donde la célula T es inmortalizada por fusión con una línea celular cancerosa. Tales hibridomas de células T, clones de células T o líneas de células T pueden comprender ya sea las células T CD8+ o CD4+. La célula dendrítica puede presentar ya sea células T CD8+ o CD4+, dependiendo de la vía mediante la cual sean procesados los antígenos . Las células CD8+ reconocen los antígenos en el contexto de MHC clase I, mientras que CD4+ reconoce los antígenos en el contexto de MHC clase II. La célula T será estimulada por el antígeno presentado a través del reconocimiento específico por su receptor de 2 células T, dando como resultado la producción de ciertas proteínas, tales como 11-2, factor a de necrosis tumoral (TNF-a), o inferieron ? (IFN-?) , que pueden ser cuantitativamente medidos (por ejemplo, utilizando un ensayo de ELISA, ensayo de ELISPOT, o Tinción de Citocina Intracelular (ICS) ) . Estas son técnicas que son bien conocidas en la materia y que son también ejemplificadas más adelante en los Ejemplos (ver, por ejemplo, Ejemplo 21, más adelante) . Alternativamente, un hibridoma puede ser diseñado para incluir un gen reportero, tal como la ß-galactosidasa, que es activado después de la estimulación del hibridoma de células T por los antígenos presentados. El incremento en la producción de la ß-galactosidasa puede ser fácilmente medido por su actividad sobre un sustrato, tal como el rojo de clorofenol-B-galactosidasa, que da como resultado un .cambio de color. El cambio de color puede ser directamente medido como un indicador de la presentación del antígeno específico. Los métodos in vitro e in vivo adicionales para evaluar la expresión del antígeno de las vacunas de bacterias recombinantes de la presente invención son conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Es también posible medir directamente la expresión de un antígeno heterólogo particular por la bacteria recombinante. Por ejemplo, un aminoácidos radiactivamente marcado puede ser agregado a una población celular, y puede ser determinada la cantidad de radiactividad incorporada dentro de una proteína particular. Las proteínas sintetizadas por la población celular pueden ser aisladas, por ejemplo mediante electroforesis en gel o electroforesis capilar, y la cantidad de la radiactividad puede ser cuantitativamente medida para evaluar el nivel de expresión de la proteína particular. Alternativamente, las proteínas pueden ser expresadas sin radiactividad y visualizadas mediante diversos métodos, tales como un ensayo de ELISA o mediante electroforesis en gel y Western Blot con detección utilizando un anticuerpo ligado a enzima o anticuerpo marcado fluorescentemente. El Ejemplo 21 más adelante, proporciona algunos ejemplos específicos de cómo algunas técnicas conocidas por aquellos expertos en la materia pueden ser utilizados para evaluar la inmunogenicidad. Por ejemplo, el ensayo Elispot, el Ensayo de Tinción de Citocina Intracelular (ICS) , la medición de la expresión de citocina de las células del bazo estimuladas, y la evaluación de la actividad de células T citotóxicas in vitro e in vivo, son todas técnicas para evaluar la inmunogenicidad conocidas por aquellos expertos en la técnica. Las descripciones ejemplares de estas técnicas con los antígenos modelo son proporcionadas en el Ejemplo 21. Los ensayos ejemplares son también descritos en los Ejemplos 31A y 31E, más adelante. Además, la eficacia terapéutica de la composición de vacuna puede ser evaluada más directamente mediante la administración de la composición inmunogénica o vacuna a un modelo animal tal como un modelo de ratón, seguido por una evaluación de la supervivencia o del crecimiento del tumor. Por ejemplo, la supervivencia puede ser medida después de la administración y el reto (por ejemplo, con un tumor o patógeno) . Ver, por ejemplo, los ensayos descritos en los Ejemplos 20 y 31B-D, siguientes) . Los modelos de ratón útil para probar la inmunogenicidad de una composición inmunogénica o vacuna que expresa un antígeno particular, pueden ser producidos primeramente mediante la modificación de una célula tumoral, de modo que ésta expresa el antígeno de interés o un antígeno modelo, y luego implantando las células tumorales que expresan el antígeno de interés dentro de ratones. Los ratones pueden ser vacunados con la composición inmunogénica candidata o la vacuna, que comprende una bacteria recombinante que expresa un polipéptido que comprende el antígeno de interés, o un antígeno modelo antes de la implantación de las células tumorales (para probar la eficacia profiláctica de la composición candidata) o después de la implantación de las células tumorales en los ratones (para probar la eficacia terapéutica de la composición candidata) . Como un ejemplo, células de carcinoma de colon murino de ratón CT26 pueden ser transfectadas con un vector apropiado que comprende un cásete de expresión que codifica para el antígeno deseado o el antígeno modelo utilizando técnicas estándares en la materia. Las técnicas estándares tales como la citometría de flujo y las transferencias de Western, pueden ser luego utilizadas para identificar los clones que expresan el antígeno o el antígeno modelo, a niveles suficientes para el uso en los ensayos de inmunogenicidad y/o eficacia. Alternativamente, las composiciones candidatas pueden ser probadas, las cuales comprenden una bacteria recombinante que expresa un antígeno que corresponde a o es derivado de un antígeno endógeno para una línea de células tumorales (por ejemplo, el antígeno AHÍ del tumor gp70 retroviral, endógeno para las células de carcinoma de colon murino de ratón CT26, o el epitopo heteroclítico AH1-A5) . En tales ensayos, las células tumorales pueden ser implantadas en el modelo animal sin modificación posterior para expresar un antígeno adicional. Las vacunas candidatas que comprende el antígeno pueden ser luego probadas. Como se indica, las composiciones de vacuna que comprenden las bacterias descritas en la presente, son también proporcionadas. Por ejemplo, la invención proporciona una vacuna que incluye una vacuna recombinante descrita en la presente (ver, por ejemplo, la bacteria recombinante descrita anteriormente en la Breve Descripción de la Invención, Secciones I y VIII de la Descripción Detallada anterior y en otros sitios en la especificación, incluyendo los Ejemplos más adelante) donde la secuencia polipeptídica es parte del polipéptido expresado por la bacteria recombinante, como una proteína discreta, como parte de una proteína de fusión, o incrustada en una proteína quimera (dependiendo de la molécula de ácido nucleico recombinante o del cásete de expresión utilizado) es un antígeno. Los antígenos adecuados incluyen cualquiera de aquellos descritos en la presente (por ejemplo, anteriormente en la Sección IV) . En un aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende una bacteria, en donde la bacteria comprende un cásete de expresión, que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en una bacteria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una vacuna que comprende una bacteria, donde la bacteria comprende un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona una vacuna que comprende una bacteria Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un antígeno no Listerial y que es optimizado en codón para la expresión en Lisíeria ; y (b) un promotor, operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el antígeno. En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende una bacteria Listeria recombinante que comprende un cásete de expresión que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el antígeno. En algunas modalidades, las composiciones de vacuna comprenden células presentadoras de antígeno (APC) que han sido infectadas con cualquiera de las bacterias recombinantes descritas en la presente. En algunas modalidades la vacuna (o la composición inmunogénica o farmacéutica) no comprende células presentadoras de antígeno (por ejemplo, la vacuna o composición es una vacuna o composición basada en bacterias, no una vacuna o composición basada en APC) . Los métodos de administración adecuados para la administración de las composiciones de vacuna (y las composiciones farmacéuticas e inmunogénicas) son conocidos en la técnica, e incluyen las rutas de administración oral, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular, intralinfática, intranasal y subcutánea. Las formulaciones de vacuna son conocidas en la técnica y en algunas modalidades pueden incluir numerosos aditivos, tales como conservadores (por ejemplo, timerosal, 2-fenoxi etanol) , estabilizadores, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, citocinas), antibióticos (por ejemplo, neomicina, estreptomicina), y otras sustancias. En algunas modalidades, son agregados estabilizadores tales como lactosa o glutamato monosódico (MSG) , para estabilizar la formulación de vacuna contra una variedad de condiciones tales como variaciones de temperatura o un proceso de liofilización. En algunas modalidades, las formulaciones de vacuna pueden también incluir un fluido o diluyente suspensor tal como agua estéril, solución salina o solución salina amortiguada isotónica (por ejemplo, fosfato amortiguado a pH fisiológico) . La vacuna puede también contener una pequeña cantidad de materiales residuales provenientes del proceso de fabricación. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones de vacuna son liofilizadas (por ejemplo, secadas por congelamiento) . La preparación liofilizada puede ser combinada con una solución estéril (por ejemplo, amortiguador de citrato-bicarbonato, agua amortiguada, solución salina al 0.4% o similar) antes de la administración . En algunas modalidades, las composiciones de vacuna pueden comprender además componentes adicionales conocidos en la técnica para mejorar la respuesta inmune a una vacuna, tales como adyuvantes o moléculas co-estimuladoras . Además de aquellas listadas anteriormente, los posibles adyuvantes incluyen quimiocinas y secuencias de ácido nucleico bacterianas, como CpG. En algunas modalidades, las vacunas comprenden los anticuerpos que mejoran la respuesta inmune a una vacuna, tal como CTLA4. En algunas modalidades, las moléculas co-estimuladoras comprenden uno o más factores seleccionados del grupo que consiste de GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-14, IL-15, IL-18, B7.1,. B7.2, y B7-DC, y son opcionalmente incluidas en las composiciones de vacuna de la presente invención. Otras moléculas co-estimuladoras son conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. En aspectos adicionales, la invención proporciona los métodos para mejorar una vacuna o composición inmunogénica que comprende Listeria que expresa un antígeno. Cualquiera de los polinucleótidos, casetes de expresión y/o vectores de expresión descritos en la presente pueden ser utilizados en estos métodos. Por ejemplo, la invención proporciona un método para mejorar una vacuna o composición inmunogénica que comprende una bacteria Lisíeria, en donde la bacteria Lisíeria expresa un antígeno heterólogo fusionado a un péptido de señal, gue comprende la optimización del codón ya sea de la secuencia que codifica para el polipéptido sobre el cásete de expresión, la secuencia que codifica para el péptido de señal del cásete de expresión, o ambos. La invención proporciona un método para mejorar una vacuna o composición inmunogénica que comprende la bacteria Lisíeria , en donde la bacteria Lisíeria expresa un antígeno heterólogo fusionado a un péptido de señal, que comprende el uso de un péptido de señal proveniente de una fuente no Listerial y/o de una vía secretora diferente de secAl. Se proporcionan también los métodos para producir las vacunas de la presente invención. Por ejemplo, en una modalidad, un método para producir una vacuna que comprende una bacteria recombinante (por ejemplo, una bacteria Lisíeria recombinante) comprende introducir una molécula de ácido nucleico recombinante de ácido nucleico recombinante en la bacteria, el cásete de expresión o el vector de expresión descrito en la presente dentro de una bacteria, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión o el vector de expresión codifica para un antígeno. Por ejemplo, en algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno, es introducido dentro de una bacteria para producir la vacuna. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica . para un péptido de señal bacteriano no secAl, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno, se introduce dentro de la bacteria para producir la vacuna. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico recombinante que es introducida dentro de la bacteria para producir la vacuna, es una molécula de ácido nucleico recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un antígeno que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal bacteriano no Listerial y el antígeno. La molécula de ácido nucleico recombinante utilizada para producir la vacuna es, en algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera en la cual el polipéptido no Listerial está fusionado a la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, o está insertado dentro de la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma. En algunas otras modalidades, se proporciona un método para producir una vacuna que comprende una bacteria Lisíeria recombinante, que comprende introducir un cásete de expresión polícistrónico, en donde el cásete de expresión policistrónico codifica para al menos dos polipéptidos no Listeriales, discretos, en donde al menos uno de los polipéptidos es un antígeno, dentro de una bacteria Listeria para producir la vacuna. Se proporcionan también los equipos que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión, los vectores, las bacterias y/o las composiciones de la invención.

X. Métodos de uso Se proporciona una variedad de métodos de uso de las bacterias recombinantes o de las composiciones farmacéuticas, inmunogénicas o de vacuna descritas en la 2 presente, para inducir respuestas inmunes, y/o para prevenir o tratar condiciones en un hospedero. En algunas modalidades, la condición que es tratada o prevenida es una enfermedad. En algunas modalidades, la enfermedad es el cáncer. En algunas modalidades, la enfermedad es una enfermedad infecciosa. Además, las bacterias recombinantes son también útiles en la producción y aislamiento de proteínas heterólogas, tales como proteínas de mamífero. Como se utiliza en la presente, "tratamiento" o "tratar" (con respecto a una condición o una enfermedad) es un procedimiento para obtener resultados benéficos o deseados, que incluyen y preferentemente son resultados clínicos. Para fines de esta invención, los resultados benéficos o deseados con respecto a la enfermedad incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguiente: el mejoramiento de una condición asociada con una enfermedad, la curación de una enfermedad, la disminución de la severidad de una enfermedad, el retraso de la progresión de una enfermedad, el alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, el incremento de la calidad de vida de alguien que sufre de una enfermedad, y/o la prolongación de la supervivencia. De igual modo, para los propósitos de esta invención, los resultados benéficos o deseados con respecto a una condición incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: mejoramiento de una condición, curación de una condición, disminución de la severidad de una condición, retardado de la progresión de una condición, alivio de uno o más síntomas asociados con una condición, el incremento de la calidad de vida de alguien que sufre de una condición y/o la prolongación de la subsistencia. Por ejemplo, en aquellas modalidades donde las composiciones descritas en la presente son utilizadas para el tratamiento del cáncer, los resultados benéficos o deseados incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: reducción de la proliferación de (o destrucción de) células neoplásicas o cancerosas, reducción de la metástasis de células neoplásicas encontradas en cánceres, el encogimiento del tamaño de un tumor, la disminución de los síntomas resultantes del cáncer, el incremento de la calidad de vida de aquellos que sufren del cáncer, la disminución de la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, el retraso de la progresión del cáncer, y/o la prolongación de la subsistencia de los pacientes que tienen cáncer. Como se utiliza en la presente, los términos "prevención" de la enfermedad o "protección de un hospedero" de la enfermedad (utilizados aquí intercambiablemente) abarcan, pero no están limitados a uno o más de los siguientes: detención, postergación, impedimento, alentamiento, retardo y/o posposición del inicio o progresión de una enfermedad, la estabilización de la progresión de una enfermedad, y/o el retraso del desarrollo de una enfermedad. Los términos "prevención" de una condición "protección de un huésped" contra una condición (utilizados aquí intercambiablemente) abarcan, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: detención, postergación, impedimento, alentamiento, retardo y/o posposición del inicio o progresión de una condición, estación en la progresión de una condición y/o retraso en el desarrollo de una condición. El periodo de esta prevención puede ser de longitudes variantes de tiempo, dependiendo de la historia de la enfermedad o la condición y/o del individuo que se trate. A manera ejemplo, donde la vacuna está diseñada para prevenir o proteger contra una enfermedad infecciosa provocada por un patógeno, los términos "prevención" de una enfermedad o "protección de un huésped" contra una enfermedad abarcan, pero no están limitados a uno más de los siguientes: detención, postergación, impedimento, alentamiento, retardo y/o posposición de la infección por un patógeno de un hospedero, la progresión de una infección por un patógeno de un hospedero, o el inicio o la progresión de una enfermedad asociada con la infección de un hospedero por un patógeno, y/o la estabilización de la progresión de una enfermedad asociada con la infección de un hospedero por un patógeno. También, a manera de ejemplo, donde la vacuna es una vacuna anti-cáncer, los términos "prevención" de la enfermedad o "protección del hospedero" contra la enfermedad, abarcan, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: detención, postergación, impedimento, alentamiento, retardo y/o posposición del desarrollo del cáncer o la metástasis, la progresión de un cáncer, o una recurrencia de un cáncer. En un aspecto, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una bacteria reco binante descrita en la presente o una cantidad efectiva de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica, composición inmunogénica o vacuna) que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente (ver, por ejemplo, la Breve Descripción de la Invención, Secciones I y VIII de la Descripción Detallada, anterior, o los Ejemplos, más adelante) . En algunas modalidades, el polipéptido codificado por el ácido nucleico recombinante, el cásete de expresión, y/o el vector de expresión en la bacteria recombinante, comprende el antígeno o es una proteína de fusión o proteína quimera que comprende el antígeno . Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende el administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria recombinante, en donde la bacteria recombinante comprende un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la expresión en la bacteria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para el antígeno, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende el administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria recombinante que incluye un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; (b) un segundo polinucleótido que codifica para el antígeno en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno no Listerial, que comprende el administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para el antígeno no Listerial y que está optimizado en codón para la expresión en Lisíeria; y (b) un promotor operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión, que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para el antígeno que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. En algunas modalidades de los métodos de inducir respuestas inmunes descritos'' aquí, la bacteria es administrada en la forma de una composición farmacéutica, una composición inmunogénica y/o una composición de vacuna. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta inmune MHC de la Clase I. En otras modalidades, la respuesta inmune es una respuesta inmune MHC de la Clase II. En otras modalidades adicionales, la respuesta inmune que es inducida por la administración de la bacteria o las composiciones es una respuesta MHC de la Clase I y una MHC de la Clase II. En consecuencia, en algunas modalidades, la respuesta inmune comprende una respuesta de células T CD4+. En algunas modalidades, la respuesta inmune comprende una respuesta de células T CD8+. En algunas modalidades, la respuesta inmune comprende la respuesta de células T CD4+ y la respuesta de células T CD8+. En algunas modalidades, la respuesta inmune comprende una respuesta de células B y/o una respuesta de células T. Las respuestas de células B pueden ser medidas mediante la determinación del título de un anticuerpo dirigido contra el antígeno, utilizando métodos conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. En algunas modalidades, la respuesta inmune que es inducida por las composiciones descritas en la presente es una respuesta humoral. En otras modalidades, la respuesta inmune que es inducida es una respuesta inmune celular. En algunas modalidades, la respuesta inmune comprende las respuestas inmunes celular y humoral. En algunas modalidades, la respuesta inmune es específica del antígeno. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta de células T específicas del antígeno. Además de proporcionar los métodos para inducir las respuestas inmunes, la presente invención también proporciona los métodos para prevenir o tratar una condición en un hospedero (por ejemplo, un sujeto tal como un paciente humano) . En algunas modalidades, la condición es una enfermedad. Los métodos comprenden la administración al hospedero de una cantidad efectiva de una bacteria recombinante descrita en la presente, o una composición que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente (ver, por ejemplo, la Breve Descripción de la Invención, Secciones I, VIII y IX de la Descripción Detallada, anterior, y los Ejemplos, más adelante) . En algunas modalidades, la enfermedad es el cáncer. En algunas modalidades, la enfermedad es una enfermedad infecciosa. Por ejemplo, en un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad (o condición) en un hospedero, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria, en donde la bacteria comprende un cásete de expresión que comprende lo siguiente: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en codón para la 29 expresión en una bacteria; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno y/o una proteína terapéutica de mamífero) , en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para prevenir o tratar la enfermedad (o condición) en un hospedero, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria recombinante, donde la bacteria comprende un cásete de expresión, y donde el cásete de expresión comprende lo siguiente: (a) un primer "polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; (b) un segundo polipéptido que codifica para un polipéptido (por ejemplo un antígeno y/o proteína de mamífero) en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, de modo que el cásete de expresión codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el antígeno. En otro aspecto más, la invención proporciona un método para prevenir o tratar la enfermedad (o una condición) en un hospedero que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria Lisíeria recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende lo siguiente: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido no Listerial (por ejemplo, un antígeno y/o una proteína de mamífero terapéutica) y que está optimizado en codón para la expresión en Lisíeria ; y (b) un promotor operablemente enlazado al polinucleótido que codifica para el antígeno. En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar la enfermedad (o condición) en un hospedero, que comprende el administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido (por ejemplo, un antígeno y/o una proteína terapéutica de mamífero) que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; (c) un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos, en donde el cásete ' de expresión codifica para una .proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido.

En algunas modalidades, la enfermedad es el cáncer. En algunas modalidades, donde la condición que se trata o se previene es el cáncer, la enfermedad es melanoma, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer testicular, cáncer de ovario, cáncer de células escamosas, cáncer gastrointestinal, cáncer cervical, cáncer de riñon, cáncer de tiroides o cáncer de próstata. En algunas modalidades, el cáncer es melanoma. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer pancreático. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de colon. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de próstata. En algunas modalidades, el cáncer es metastático. En otras modalidades, la enfermedad es una enfermedad autoinmune. En otras modalidades, la enfermedad es una enfermedad infecciosa u otra enfermedad provocada por un patógeno tal como virus, bacteria, hongo o protozoario. En algunas modalidades, la enfermedad es una enfermedad infecciosa. En algunas modalidades, el uso de la bacteria recombinante en la profilaxis o tratamiento de un cáncer, comprende la distribución de las bacterias recombinantes a las células del sistema inmune de un individuo, para prevenir o tratar un cáncer presente o para el cual el individuo tiene factores de riesgo incrementados, tales como la exposición ambiental y/o al disposición familiar. En otras modalidades, el uso de las bacterias recombinantes en la profilaxis o tratamiento de un cáncer, comprende la distribución de la bacteria recombinante a un individuo a quien se le ha eliminado un tumor, o ha tenido cáncer en el pasado, pero está actualmente en remisión. En algunas modalidades, la administración de la composición que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente a un hospedero, promueve una respuesta de células T CD4+ en el hospedero. En algunas otras modalidades, la administración de una composición que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente, a un hospedero, promueve una respuesta de células T CD4+ en el hospedero. En algunas modalidades, la administración de una composición que comprende una bacteria recombinante descrita en la presente, promueve una respuesta de células T CD4+ y una respuesta de células T CD8+ en el hospedero. La eficacia de las vacunas u otras composiciones para el tratamiento de una condición pueden ser evaluadas en un individuo, por ejemplo en ratones. Un modelo de ratón es reconocido como un modelo para la eficacia en humanos, y es útil en la medición y definición de las vacunas de la presente invención. El modelo de ratón es utilizado para demostrar el potencial para la efectividad de las vacunas en cualquier individuo. Las vacunas pueden ser evaluadas por su habilidad para proporcionar efecto profiláctico o terapéutico contra una enfermedad particular. Por ejemplo, en el caso de enfermedades infecciosas, una población de ratones puede ser vacunada con una cantidad deseada de la vacuna apropiada de la invención, donde la bacteria recombinante expresa un antígeno asociado a la enfermedad infecciosa. Los ratones pueden ser subsecuentemente infectados con el agente infeccioso relacionado al antígeno de vacuna, y evaluado para la protección contra la infección. La progresión de la enfermedad infecciosa puede ser observada con relación a una población control (ya sea no vacunada o vacunada con vehículo únicamente o una bacteria que no contiene el antígeno apropiado) . En el caso de vacunas para el cáncer, los modelos de células tumorales son disponibles, donde una línea de células tumorales que expresa un antígeno tumoral deseado, puede ser inyectada dentro de una población de ratones ya sea antes (modelo terapéutico) o después (modelo profiláctico) de la vacunación con una composición que comprende una bacteria de la invención, que contiene el antígeno tumoral deseado. La vacunación con una bacteria recombinante que contiene un antígeno tumoral, puede ser comparada a las poblaciones control que están ya sea no vacunadas, vacunadas con vehículo, o con una bacteria recombinante que expresa un antígeno irrelevante. La efectividad de la vacuna en tales modelos puede ser evaluada en términos del volumen tumoral como una función del tiempo después de la inyección del tumor, o en términos de las poblaciones de supervivencia como una función del tiempo después de la inyección del tumor (por ejemplo, Ejemplo 31D) . En una modalidad, el volumen tumoral en ratones vacunados con una composición que comprende la bacteria recombinante es aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, aproximadamente 90% o aproximadamente 100% menor que el volumen tumoral en ratones que están ya sea no vacunados o están vacunados con vehículo o una bacteria que expresa un antígeno irrelevante. En otra modalidad, esta diferencial en el volumen de tumor es observada al menos aproximadamente 10, aproximadamente 17, o aproximadamente 24 días después del implante de los tumores en los ratones. En una modalidad, el tiempo de supervivencia media en los ratones vacunados con la composición que comprende una bacteria recombinante, es al menos de aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 7 o al menos aproximadamente 10 días más prolongado que en ratones que están ya sea no vacunados o están vacunados con el vehículo con bacterias que expresan un antígeno irrelevante. El hospedero (por ejemplo, el sujeto) en los métodos descritos en la presente, es cualquier vertebrado, preferentemente un mamífero, incluyendo animales domésticos, animales deportivos, y primates, incluyendo humanos. En algunas modalidades, el hospedero es un mamífero. En algunas modalidades, el hospedero es un humano. La distribución de las bacterias recombinantes, o una composición que comprende la cepa, puede ser mediante cualquier método adecuado, tal como la administración intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intralinfática, oral o intranasal, así como mediante cualquier ruta que sea relevante para cualquier enfermedad maligna o infecciosa dada u otra condición. Las composiciones que comprenden la bacteria recombinante y un agente inmunoestimulador, pueden ser administradas a un hospedero simultáneo, secuencia o separadamente. Los ejemplos de agentes inmunoestimuladores incluyen, pero no están limitados a IL-2, IL-12, GMCSF, IL-15, B7.1, B7.2 y B7-DC e IL-1 . Los ejemplos adicionales de agentes estimuladores son proporcionados en la Sección IV, anterior. Como se utiliza en la presente, una "cantidad efectiva" de una bacteria o composición (tal como una composición farmacéutica o una composición inmunogénica) es una cantidad suficiente para efectuar los resultados benéficos o deseados. Para el uso profiláctico, los resultados benéficos o deseados incluyen los resultados tales como la eliminación o reducción del riesgo, aminoramiento de la severidad, o retraso del inicio de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de una enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermediarios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados benéficos o deseados incluyen los resultados clínicos tales como la inhibición o supresión de una enfermedad, la disminución de uno o más de los síntomas que resultan de una enfermedad (bioquímica, histológica y/o conductual) , incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermediarios que se presentan durante el desarrollo de una enfermedad, incrementando la calidad de vida de aquellos que sufren de una enfermedad, disminuyendo la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, aumentando el efecto de otra medicación, retrasando la progresión de la enfermedad, y/o prolongando la supervivencia de los pacientes. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para fines de esta invención, una cantidad efectiva del fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr el tratamiento profiláctico o terapéutico ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una cantidad efectiva de un fármaco, compuesto, o composición farmacéutica puede o no ser lograda en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. De este modo, una cantidad efectiva puede ser considerada en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y un agente simple puede ser considerado como el que se da en una cantidad efectiva si, en conjunto con uno o más de otros agentes, puede ser o es logrado un resultado deseable. En algunas modalidades, para un tratamiento terapéutico de un cáncer, una cantidad efectiva incluye una cantidad que dará como resultado la respuesta inmune deseada, en donde la respuesta inmune retarda el crecimiento de los tumores objetivo, reduce el tamaño de los tumores, o preferentemente elimina los tumores completamente. La administración de la vacuna puede ser repetida a intervalos apropiados, y puede ser administrada simultáneamente en distintos sitios múltiples en el individuo vacunado. En algunas modalidades, para un tratamiento profiláctico de un cáncer, una cantidad efectiva incluye una dosis que dará como resultado una respuesta inmune protectora tal que la probabilidad de que un individuo desarrolle el cáncer, es significativamente reducida. El régimen de vacunación puede estar comprendido de una dosis simple, o puede ser repetido a intervalos adecuados hasta que es establecida una respuesta inmune protectora. En algunas modalidades, el tratamiento terapéutico de un individuo para el cáncer puede ser iniciado en un individuo quien ha sido diagnosticado con un cáncer como un tratamiento inicial, o puede ser utilizado en combinación con otros tratamientos. Por ejemplo, los individuos quienes han tenido tumores quirúrgicamente removidos, o quienes han sido tratados con radioterapia o con quimioterapia, pueden ser tratados con la vacuna, con el fin de reducir o eliminar cualesquiera tumores residuales en el individuo, o para reducirle riesgo de una recurrencia del cáncer. En algunas modalidades, el tratamiento profiláctico de un individuo para el cáncer, podría ser comenzado en un individuo quien tiene un riesgo incrementado de contraer ciertos cánceres, ya sea debido a condiciones ambientales o a predisposición genética. La dosis de las composiciones farmacéuticas o las vacunas que son dadas al hospedero, variarán dependiendo de la especie del hospedero, el tamaño del hospedero, y la condición o enfermedad del hospedero. La dosis de las composiciones dependerá también de la frecuencia de administración de las composiciones y de la ruta de administración. La dosis exacta es elegida por el médico individual en vista del paciente que va a ser tratado. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas, las composiciones inmunogénicas, o las vacunas utilizadas en los métodos comprenden bacterias recombinantes gue comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinante, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente. En algunas modalidades, la bacteria recombinante es modificada y/o son bacterias mutantes tales como aquella descritas en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/883,599, titulada "Microbios de Vida Libre Modificada, Composiciones de Vacuna y Métodos de Uso de los Mismos", por Thomas W. Dubensky, Jr . et al., presentada el 30 de junio del 2004, a Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0228877 y la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2044/197343, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente, en su totalidad. En algunas modalidades, una dosis simple de una composición farmacéutica o de vacuna que comprende tal bacteria modificada y/o mutante o cualquiera de las otras bacterias recombinantes descritas en la presente, comprende de aproximadamente 102 a aproximadamente 1012 de los organismos bacterianos. En otra modalidad más, una dosis simple comprende de aproximadamente 105 a aproximadamente 1011 de los organismos bacterianos. En otra modalidad más, una dosis simple comprende de aproximadamente 106 a aproximadamente 1011 de los organismos bacterianos. En otra modalidad más, una dosis simple de la composición farmacéutica o vacuna comprende de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 de los organismos bacterianos. En otra modalidad más, una dosis simple de la composición farmacéutica o vacuna comprende de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 de los organismos bacterianos . En algunas modalidades, una dosis simple comprende al menos aproximadamente 1 x 102 organismos bacterianos. En algunas modalidades, una dosis simple de la composición farmacéutica comprende al menos aproximadamente 1 x 105 organismos. En otra modalidad, una dosis simple de la composición o vacuna comprende al menos aproximadamente 1 x 106 organismos bacterianos. En otra modalidad más, una dosis simple de la composición o vacuna comprende al menos aproximadamente 1 x 107 de los organismos bacterianos. En algunas modalidades, una dosis simple de la composición farmacéutica, la composición inmunogénica, o la vacuna que comprende las bacterias recombinantes, modificadas y/o mutantes descritas en la presente, comprende de aproximadamente 1 UFC/kg hasta aproximadamente 1 x 1010 UFC/kg (UFC = unidades formadoras de colonias) . En algunas modalidades, una dosis simple de la composición comprende de aproximadamente 10 UFC/kg hasta aproximadamente 1 x 109 UFC/kg. En otra modalidad, una dosis simple de la composición o la vacuna comprende de aproximadamente 1 x 102 UFC/kg hasta aproximadamente 1 x 108 UFC/kg. En otra modalidad más, una dosis simple de la composición o la vacuna comprende de aproximadamente 1 x 103 UFC/kg hasta aproximadamente 1 x 108 UFC/kg. En otra modalidad más, una dosis simple de la composición o la vacuna comprende de aproximadamente 1 x 104 UFC/kg hasta aproximadamente 1 x 107 UFC/kg. En algunas modalidades, una dosis simple de la composición comprende al menos aproximadamente 1 UFC/kg. En algunas modalidades, una dosis simple de la composición comprende al menos aproximadamente 10 UFC/kg. En algunas modalidades, una dosis simple de la composición o de la vacuna comprende al menos aproximadamente 1 x 102 UFC/kg. En otra modalidad más, una dosis simple de la composición o de la vacuna comprende al menos aproximadamente 1 x 103 UFC/kg. En otra modalidad, una dosis simple de la composición o de la vacuna comprende al menos aproximadamente 1 x 104 UFC/kg. En algunas modalidades, la cantidad de dosis apropiada (por ejemplo, efectiva) para un hospedero, tal como un humano, puede ser extrapolada de los datos de LD50 para otro hospedero, tal como un ratón, utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. En algunas modalidades, la composición farmacéutica, la composición inmunogénica o la vacuna comprenden células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas, las cuales han sido infectadas con bacterias recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, casetes de expresión y/o vectores de expresión descritos en la presente. En algunas modalidades, las bacterias han sido modificadas y/o son mutantes tales como aquellas descritas en la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/883,599, presentada el 30 de junio del 2004, y las Publicaciones de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2004/0228877 y 2004/0197343, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. Tales vacunas basadas en células presentadoras de antígeno son descritas, por ejemplo, en la siguiente referencia: Solicitud Internacional No. PCT/US2004/23881, titulada "Vacunas de Células Presentadoras de Antígeno y Métodos de Uso de las Mismas", por Thomas W. Dubensky, Jr. et al, presentada el 23 de julio del 2004; la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/883,599, presentada el 30 de junio del 2004; Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0228877; y la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0197343, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. En algunas modalidades, una dosis individual de una vacuna basada en células presentadoras de antígeno, que comprende bacterias tales como aquellas descritas en la presente, comprende entre aproximadamente 1 x 103 hasta aproximadamente 1 x 1010 células presentadoras de antígeno. En algunas modalidades, una dosis individual de la vacuna comprende entre aproximadamente 1 x 105 hasta aproximadamente 1 x 109 células presentadoras de antígeno. En algunas modalidades, una dosis individual de la vacuna comprende entre aproximadamente 1 x 107 hasta aproximadamente 1 x 109 células presentadoras.de antígeno. En algunas modalidades, son preferidas administraciones múltiples de la dosis unitaria, ya sea en un solo día o en el curso de una semana o mes o año o años. En algunas modalidades, la dosis unitaria es administrada cada día por múltiples días, o una vez a la semana por múltiples semanas . La invención proporciona además el uso de cualquier bacteria recombinante descrita en la presente (por ejemplo, cualquier bacteria que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión, o vector descrito en la presente) en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, cásete de expresión /o vector en la bacteria, comprende el antígeno. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno heterólogo. La invención también proporciona el uso de una bacteria recombinante descrita en la presente en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una condición en un hospedero (por ejemplo, una enfermedad tal como cáncer o una enfermedad infecciosa) . La invención proporciona además las bacteria recombinante descrita en la presente para el uso en la inducción de una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico recombinante, es cásete de expresión y/o el vector en la bacteria comprende el antígeno. La invención proporciona además la bacteria recombinante descrita en la presente para el uso en la prevención o tratamiento de una condición (tal como una enfermedad) en un hospedero. La invención también proporciona un método para inducir la presentación de antígeno MHC de la clase I o la presentación de antígeno MHC de la clase II, sobre una célula presentadora de antígeno, que comprende poner en contacto una bacteria descrita en la presente con una célula presentadora de antígeno. La invención proporciona además un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende los siguientes pasos: (a) poner en contacto una bacteria recombinante descrita en la presente con una célula presentadora de antígeno proveniente del hospedero, bajo condiciones adecuadas y por un tiempo suficiente para cargar las células presentadoras de antígeno; y (b) administrar la célula presentadora de antígeno al hospedero. Otros posibles usos de las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y las bacterias, serán reconocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico recombinantes, casetes de expresión, los vectores y las bacterias recombinantes (y otras células hospederas) descritas en la presente son útiles para la producción y aislamiento de polipéptidos heterólogos. En consecuencia, en un aspecto alternativo, la invención proporciona un método de expresar un polipéptido en una bacteria, que comprende (a) introducir un cásete de expresión o vector descrito en la presente, dentro de bacterias (por ejemplo, vía transfección, transformación o conjugación) ; y (b) desarrollar las bacterias en cultivo bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína. En otro aspecto alternativo, la invención proporciona un método para producir un polipéptido aislado que comprende lo siguiente: (a) introducir un cásete de expresión o vector descrito en la presente dentro de las células (por ejemplo, vía la transfección, transformación o conjugación) ; (b) desarrollar las bacterias en cultivo celular bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína; y (c) aislar la proteína del cultivo celular bacteriano. Los métodos adecuados de transformación, transfección y conjugación son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, como lo son los métodos de cultivo y desarrollo de bacterias y aislamiento de la proteína secretada o no secretada a partir del cultivo celular.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son proporcionados para ilustrar, pero no para limitar, la invención.

Ejemplo 1. Preparación de cepas mutantes ejemplares de Lisíeria Las cepas de Lisíeria fueron derivadas de 10403S (Bishop et al., J. Immunol . 139: 2005 (1987)). Las cepas de Lisíeria con supresiones intraestructurales de los genes indicados, fueron generadas mediante SOE-PCR e intercambio alélico con métodos establecidos (Camilli, et al., Mol . Microbiol . 8: 143 (1993)). La cepa mutante LLO L461T (DP-L4017) fue descrita en Glo ski, et al., J. Cell . Biol . 156: 1029 (2002), incorporada por referencia en la presente. El mutante ActA' (DP-L4029) es la cepa DP-L3078 descrita en Skoble et al., J. Of Cell Biology, 150: 527-537 (2000), incorporada por referencia en la presente en' su totalidad, la cual ha sido curada de su profago. (La curación de profago es descrita en (Lauer et al., J. Bacíeriol . 184: 4177 (2002); la Publicación de Patente No. 2003/0203472) . La construcción de una cepa acíA'uvrAB' es descrita en la solicitud provisional de los Estados Unidos 60/446,051, presentada el 6 de febrero del 2003, como L4029/uvrAB (ver, por ejemplo, Ejemplo 7 de esa solicitud) , así como la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0197343. DL- L4029uvrAB (un mutante de doble supresión AcíA /uvrAB de Lisíeria monocyíogenes) fue depositada con la American Type Culture Collection (ATCC), en 10801 University Blvd. Manassas, Virginia, 20110-2209, Estados Unidos de América, el 3 de octubre del 2003, bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimientos de Patente, y designada PTA-5563. Descripciones adicionales respecto a la Lisíeria mutante son proporcionadas en las siguientes solicitudes o publicaciones, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad: la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0228877; la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2004/019733; la Solicitud Internacional del PCT No. PCT/US2004/23881, presentada el 23 de julio del 2004; y la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/883,599, presentada el 30 de junio del 2004. Además, un mutante de doble supresión ?acíA?inlB de Lisíeria monocyíogenes, ejemplar ha sido depositada con la American Type Culture Collection (ATCC), en 10801 University Blvd. Manassas, Virginia, 20110-2209, Estados Unidos de América, el 3 de octubre del 2003, bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimientos de Patente, y designada PTA-5562.

Un ejemplo no limitante de un método para suprimir un gen en Lísíeria monocyíogenes para generar un mutante atenuado, se proporciona más adelante en el Ejemplo 24.

Ejemplo 2. Construcción de cepas de Lisíeria que expresan AHÍ/OVA o AH1-A5/0VA Cepas mutantes de Lisíeria que expresan una forma truncada de una ovoalbúmina de antígeno (OVA) , el epitopo inmunodominante proveniente del cáncer colorrectal de ratón (CT26) conocido como AHÍ (SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 72)), y el epipoto alterado AH1-A5 (SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 73); Slansky et al., Immuniíy, 13: 529-538 (2000)) fueron preparados. El vector integracional pPL2 (Lauer et al., J. Bacíeriol . 184: 4177 (2002); Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0203472) fue utilizado para derivar las cepas de Lisíeria recombinante OVA y AH1-A5/OVA que contienen una copia simple integrada dentro de un sitio inocuo del genoma de Lisíeria .

A. Consírucción de Lisíeria que expresa OVA (DP-L4056) Un cásete de expresión del antígeno que consiste de LLO suprimido en hemolisina fusionado con OVA truncada, y contenido en el vector de integración pPL2 (pPL2/LL0-0VA) es primeramente preparado. La cepa de vacuna de Lisíeria-OVA es derivada por la introducción de pPL2/LLO-OV dentro de la cepa de L . monocyíogenes DP-L4056 curada con el fago, en el sitio de enlace a PSA (Fago de ScottA) tRNAarg-a ííBB . Se utiliza PCR para amplificar LLO suprimido con hemolisina, utilizando la siguiente plantilla y cebadores: Fuente: ADN genómico DP-L4056 Cebadores : Delantero ( KpnJ-LLO nts. 1257-1276): 5'CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC (SEQ ID NO: 74) (Tm: LLO-spec: 52°C. General: 80°C) Inverso (BamHI-XhoJ-LLO nts. 2811-2792): 5 ' CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC (SEQ ID NO: 75) (Tm: LLO-spec: 52°C. General: 102°C) Se utiliza también PCR para amplificar el OVA truncado utilizando la siguiente plantilla y cebadores: Fuente: ADN del plásmido pDP3616 proveniente de E. coli DP-E3616 (Higgins et al., Mol . Molbiol . 31: 1631-1641 (1999)). Cebadores : Delantero (Xhol-Ncol OVA cDNA nts. 174-186): 5 ' -ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC (SEQ ID NO: 76) (Tm: OVA-spec: 60°C. General: 88°C) Inverso (Xhol-Noíl-HindIII) : 5' -GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT (SEQ ID NO: 77) (Tm: General: 82°C) Un protocolo para completar el proceso de construcción involucra cortar primeramente el amplicón LLO con Kpnl y BamHI e insertar el vector Kpnl/BamHI dentro del vector de pPL2 (pPL2-LL0) . El amplicón de OVA es luego cortado con Xhol y Noíl e insertado dentro de pPL2-LL0 el cual ha sido cortado con Xhol/Noíl. (Nota: El vector pP12 no contiene sitios Xhol; pDP-3616 contiene un sitio Xhol, que es explotado en el diseño de cebador inverso de OVA) . La construcción pPL2/LL0-0VA es verificada mediante análisis de restricción (Kpnl-LLO-XhoI-OVA-Noíl ) y secuenciamiento. El plásmido pPL2/OVA es introducido dentro de E. coli mediante transformación, seguido por introducción e integración dentro de Listeria (DP-L4056) mediante conjugación, exactamente como se describe por Lauer et al. (o dentro de otra cepa deseada de Listeria, tal como un mutante inlB' o un doble mutante inlB'acíA') .

B . Consírucción de cepas de Lisíeria que expresan AHÍ/OVA o AH1-A5/OVA. Para preparar Lisíeria que expresa cualquiera de las secuencias de antígeno AHÍ/OVA o AH1-A5/OVA, son primeramente preparados insertos que poseen el antígeno, a partir de los oligonucleótidos y luego ligados dentro del vector pPL2/LL0-0VA (preparado como se describe anteriormente) . Los siguientes oligonucleótidos son utilizados en la preparación del inserto AHÍ o AH1-A5: Inserío de epitopo AHÍ (extremos compaíibles con Clal-psíl) : Oligo de hebra superior (AHÍ Superior) : 5'-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA (SEQ ID NO: 78) Oligo de hebra inferior (AHÍ Inferior) : 5'-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT (SEQ ID NO: 79) Inserío de epitopo AH1-A5 (extremos compaíibles con Clal-Avall) : La secuencia del epitopo AH1-A5 es SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 73) (5-AGT CCA AGT TAT GCA TAT CAT CAÁ TTT-3' (SEQ ID NO : 80 ) ) Superior: 5 ' -CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC (SEQ ID NO: 81) Inferior : 5' -GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT (SEQ ID NO: 82) El par de oligonucleótidos para un epitopo dado son mezclados entre sí a una proporción equimolar, calentados a 95°C por 5 minutos. La mezcla de oligonucleótidos se deja luego enfriar lentamente. Los pares de oligonucleótidos recocidos son luego ligados a una proporción molar de 200 a 1 con el plásmido pPL2-LL0/0V preparado mediante digestión con las enzimas de restricción relevantes. La identidad de la nueva construcción puede ser verificada mediante análisis de restricción y/o secuenciamiento. El plásmido puede estar luego introducido dentro de E. coli mediante transformación, seguido por introducción e integración dentro de Lisíeria (DP-L4056) mediante conjugación, exactamente como se describe por Lauer et al . , o dentro de otra cepa deseada de Lisíeria, tal como una cepa mutante actA" (DP-L0429) , la cepa LLO L461T (DP-L4017), o la cepa acíA~ /uvrAB' (DP-L4029uvrAB) .

Ejemplo 3. Construcción de polinucleótidos de Listeria y elementos del cásete de expresión A. Vectores de clonación Las construcciones moleculares del cásete de expresión del antígeno heterólogo, seleccionadas fueron insertadas dentro de pPL2 (Lauer et al. J. Bacíeriol . 2002), o pAM401 (Wirth et al., J. Bacíeriol . 165: 831-836), modificadas para contener la secuencia de clonación múltiple de pPL2 (fragmento pequeño Aaí II, 171 pares de bases) , insertado entre los sitios de reconocimiento romo Xba I y Nru I, dentro del gen de resistencia a la tetraciclina (pAM401-MCS, Figura 32) . En general, el promotor hly y la secuencia del péptido de señal (seleccionada) se insertó entre los sitios únicos Kpn I y Bam Hl en los vectores plásmido pPL2 o pAM401-MCS. Los genes EphA2 seleccionados (algunas veces modificados para contener los marcadores de epitopo N- terminales y C-terminales; ver descripción más adelante) fueron clonados subsecuentemente dentro de estas construcciones entre los sitios únicos Bam Hl y Sac I. Las construcciones moleculares basadas en el vector plásmido pAM401-MCS fueron introducidas mediante electroporación dentro de las cepas seleccionadas de Lisíeria monocyíogenes también tratadas con lisozi a, utilizando métodos comunes para aquellos expertos en la técnica. La estructura plasmídica esperada en los transíectantes de Lisíeria fue purificada mediante el aislamiento del ADN a partir de las colonias que se formaron sobre las placas BHI que contenían cloranfenicol (10 µg/ml) mediante análisis de enzima de restricción. La Lisíeria recombinante transformada con las diversas construcciones del cásete de expresión de proteína heteróloga basadas en pAM401-MCS, fueron utilizadas para medir la expresión y secreción de la proteína heteróloga, como se describe más adelante. Las construcciones del cásete de expresión de la proteína heteróloga, basadas en pPL2, fueron incorporadas dentro del gen tRNA?rg en el genoma de las cepas seleccionadas de Lisíeria, de acuerdo a los métodos como se describe previamente [Lauer et al., J. Bacteriol. 184, 4177-4186 (2002)]. En resumen, el plásmido de las construcciones del cásete de expresión de la proteína heteróloga pPL2, fue primeramente introducido dentro de la cepa hospedera E. coli SM10 (Simón et al., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)] mediante electroporación o por medios químicos. Subsecuentemente, el plásmido basado en pPL2 fue transferido del SM10 transformado hacia las cepas de Lisíeria seleccionada, mediante conjugación. Después de la incubación sobre placas de agar BHI selectivas del fármaco, que contenían 7.5 µg de cloranfenicol por ml y 200 µg de estreptomicina por ml como se describe, las colonias seleccionadas son purificadas mediante el pase 3 veces sobre placas con la misma composición. Para verificar la integración del vector de pPL2 en el sitio de acoplamiento del fago, colonias individuales son recogidas y seleccionadas mediante PCR utilizando el par de cebadores del cebador delantero NC16 (5 ' -gtcaaaacatacgctcttatc-3' (SEQ ID NO: 94)) y el cebador inverso PL95 (5' -acataatcagtccaaagtagatgc-3' (SEQ ID NO: 95) ) . Las colonias seleccionadas que tienen el plásmido basado en pPL2 incorporado dentro del gen tRNAñrg en el genoma de las cepas de Lisíeria seleccionadas, produjeron un amplicón de ADN de diagnóstico de 499 pares de bases.

B . Promoíor Los casetes de expresión de proteína heteróloga contenían el promotor hly dependiente de prfA, el cual impulsa la transcripción del gen que codifica para la Listeriolisina O (LLO) , y es activado dentro del microambiente de la célula infectada. Los nucleótidos 205586-206000 (414 pares de bases) fueron amplificados mediante PCR a partir de . Lisíeria monocyíogenes , cepa DP-L4056, utilizando el par de cebadores mostrado más adelante. La región amplificada incluye el promotor hly y también los primeros 28 aminoácidos de LLO, que comprende el péptido de señal secAl (ver arriba) y el dominio PEST. La secuencia esperada de esta región para Lisíeria monocyíogenes , cepa EGD puede ser encontrada en GenBank (número de acceso: gi|16802048 | ref | NC_003210.1| [16802048] ) . Los cebadores utilizados en la región de PCR son como sigue: Par de cebador: Delantero (KpnJ-LLO nts. 1257-1276): 5' -CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC (SEQ ID NO: 74) inverso (Bam JíJ-LLO nts) : 5' -CTCTGGATCCATCCGCGTGTTTCTTTTCG (SEQ ID NO: 84) (Los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción están subrayados) . El amplicón de PCR de 422 pares de bases fue clonado dentro del vector plásmido pCR-XL-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, California) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias de nucleótidos de las bases específicas de Lisíeria en el clon del plásmido promotor pCR-XL-TOPO- y fueron determinadas. Lisíeria monocytogenes cepa DP-L4056 contenía ocho cambios de bases nucleotídicas que flanquean la casilla prfA en el promotor hly, en comparación a la cepa EGD. El alineamiento del promotor hly para histeria monocytogenes cepas DP-L4056 y EGD se muestra en la Figura 1 más adelante. El ADN de 422 pares de bases correspondiente al promotor hly y el péptido de señal LLO de secAl fueron liberados del clon del plásmido promotor pCR-XL-TOPO- y mediante digestión con Kpn I y Bam Hl, y clonado dentro del vector plásmido pPL2 (Lauer et al. 2002, J. Bact . ) , de acuerdo a los métodos convencionales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Este plásmido es conocido como pPL2-hlyP (nativo) .

C. Secuencia Shine-Dalgarno En el extremo 3' del promotor está contenida una secuencia de poli-purina de Shine-Dalgarno, el elemento requerido para el acoplamiento de la subunidad ribosomal 30S (vía el ARNr de 16S) para el transcrito de ARN del gen heterólogo, y el inicio de la traducción. La secuencia Shine-Dalgarno tiene típicamente la siguiente secuencia de consenso: 5' -NAGGAGGU-N5-10-AUG (codón de inicio) -3 ' (SEQ ID NO: 84). Existen variaciones de la secuencia Shine-Dalgarno de poli-purina. Principalmente, el gen hly de Listeria que codifica para la listerolisina O (LLO) tiene la siguiente secuencia Shine-Dalgarno: AAGGAGAGTGAAACCCATG (SEQ ID NO: 70) (la secuencia Shine-Dalgarno está subrayada, y el codón de inicio de la traducción está con negritas) .

Ejemplo 4. Polinucleótidos que codifican para una proteina de fusión que comprende un péptido de señal secAl (LLO) y EphA2 humano La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el antígeno EphA2 humano de longitud completa fusionado al péptido de señal secAl (péptido de señal LLO) , más la secuencia LLO PEST, se muestra en la Figura 2. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión, se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 5. Optimización del codón del dominio extracelular de EphA2 humano (EX2) La secuencia que codifica para el dominio extracelular de EphA2 humano (aminoácidos 25-526) ha sido optimizada en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La secuencia nucleotídica nativa que codifica para el dominio extracelular de EphA2 humano se muestra en la Figura 4. La secuencia nucleotídica para el uso de codón óptimo en Listeria se muestra en la Figura 5. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de EphA2 humano se muestra en la Figura 6.

Ejemplo 6. Polinucleótidos que codifican para las proteínas de fusión que comprenden un péptido de señal secAl (LLO) y el dominio extracelular de huEphA2 (EX2) A. Polinucleóíido sin la opíimización del codón La secuencia de un polinucleótido que codifica para el dominio extracelular del antígeno EphA2 humano fusionado al péptido de señal secAl (péptido de señal LLO) , más la secuencia LLO PEST, se muestra en la Figura 7. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión, se muestra en la Figura 8.

B . Caseíe de expresión con el dominio exíracelular opíimizado en el codón, de EphA2 humano La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el dominio extracelular del antígeno EphA2 humano fusionado a un péptido de señal secAl (péptido de señal LLO) , más la secuencia LLO PEST, en la cual la secuencia que codifica para el dominio extracelular de EphA2 es optimizada en el codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes , se muestra en la Figura 9. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 10.

C. Caseíe de expresión con el pépíido de señal secAl opíimizado en el codón , y el dominio exíracelular optimizado en el codón, de EphA2 humano La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el dominio extracelular del antígeno EphA2 humano fusionado a un péptido de señal secAl (péptido de señal LLO) , • más la secuencia LLO PEST, donde las secuencias que codifican para el dominio extracelular de EphA2, el péptido de señal y la secuencia PEST" son todos optimizados en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes , como se muestra en la Figura 11. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión, se muestra en la Figura 12.

Ejemplo 7. Cásete de expresión optimizado en el codón que codifica para una proteína de fusión que comprende un péptido de señal Tat (phoD de B . subtilis) y el dominio extracelular de huEphA2 (EX2) La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el dominio extracelular del antígeno EphA2 fusionado a un péptido de señal Tat (phoD de B. subtilis) donde las secuencias que codifican para el dominio extracelular de EphA2 y el péptido de señal, están todas optimizadas en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes , se muestra en la Figura 13. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 14.

Ejemplo 8. Optimización del codón del dominio intracelular de EphA2 humano (CO) La secuencia que codifica para el dominio intracelular de EphA2 humano (aminoácidos 558-975) ha sido optimizado en el codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes . La secuencia de nucleótidos nativa que codifica para el dominio extracelular de EphA2 humano, se muestra en la Figura 15. La secuencia nucleotídica para el uso óptimo del codón en Lisíeria , se muestra en la Figura 16. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de EphA2 humano, se muestra en la Figura 17.

Ejemplo 9. Polinucleótidos que codifican para las proteínas de fusión que comprenden un péptido de señal secAl (LLO) y el dominio intracelular de huEphA2 (CO) A. Polinucleóíido sin la opíimización del codón La secuencia de un polinucleótido que codifica para el dominio intracelular del antígeno EphA2 humano fusionado al péptido de señal secAl (LLO) , más la secuencia LLO PEST, se muestra en la Figura 18. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 19.

B. Cásete de expresión con el dominio intracelular optimizado del codón de EphA2 humano La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el dominio intracelular del antígeno huEphA2 fusionado al péptido de señal secAl (péptido de señal LLO) , más la secuencia LLO PEST, en la cual la secuencia que codifica para el dominio intracelular de EphA2 es optimizada en el codón para la expresión en Listeria monocyíogenes, se muestra en la Figura 20. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 21.

C. Caseíe de expresión con el pépíido de señal secAl opíimizado en el codón y el dominio intracelular optimizado en el codón de EphA2 humano La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el dominio intracelular del antígeno EphA2 fusionado a un péptido de señal secAl (péptido de señal LLO) , más la secuencia LLO PEST, donde las secuencias que codifican para el dominio intracelular de EphA2, el péptido de señal y la secuencia PEST son todas optimizadas en el codón para la expresión en Listeria monocyíogenes , se muestra en la Figura 22. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 23.

Ejemplo 10. Cásete de expresión optimizado en el codón que codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal phoD de B . subíilis y el dominio intracelular de huEphA2 (CO) La secuencia de un cásete de expresión que codifica para el dominio intracelular del antígeno EphA2 fusionado a un péptido de señal Tat (phoD de B . subíilis) donde las secuencias que codifican para el dominio intracelular de EphA2 y el péptido de señal son todas optimizadas en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes , se muestra en la Figura 24. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 25.

Ejemplo 11. Cásete de expresión optimizado en codón que codifica para una proteína de fusión que comprende péptido de señal LLO y NY-ESO-l Un cásete de expresión fue diseñado para la expresión del antígeno NY-ESO-l de cáncer de testículo humano (Genbank Acceso No. NM_001327) en Listeria monocytogenes . La secuencia del cásete de expresión que codifica para NY-ESO-l fusionada al péptido de señal secAl (LLO) , más la secuencia LLO PEST, se muestra en la Figura 26. Las secuencias que codifican para el antígeno, así como el péptido de señal en el cásete de expresión, fueron optimizadas en el codón para la expresión en Lisíeria monocytogenes . La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión codificada por este cásete de expresión se muestra en la Figura 27.

Ejemplo 12. Cásete de expresión optimizado en codón para codificar los antígenos fusionados a un péptido de señal secAl no Listerial (L . lactis usp45) Un cásete de expresión fue diseñado para la expresión de antígenos heterólogos en Lisíeria monocyíogenes, utilizando un péptido de señal secAl no Listerial. La secuencia de aminoácidos del péptido de señal usp45 proveniente de Lacíococcus lactis (Steidler et al., Nature Biotechnology, 21: 785-9 (2003)), su secuencia de codificación nativa, y la secuencia de codificación optimizada para la expresión en Lisíeria monocyíogenes , se muestran enseguida.

Secuencia de aminoácidos: MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA'DT (SEQ ID NO: 46) Sitio de reconocimiento de la peptidasa de señal: VYA-DT (SEQ ID NO: 55) Secuencia nucleotídica nativa: 5' ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCT GCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGACACA3' (SEQ ID NO: 86) Codones optimizados para la expresión en Lisíeria monocyíogenes : 5' TGAAAAAAAAAATTATTAGTGCAATTTTAATGAGTACAGTTATTTTAAGTGCA GCAGCACCATTAAGTGGTGTTTATGCAGATACA3' (SEQ ID NO: 87) La secuencia de un cásete de expresión parcial que comprende el promotor hly de Lisíeria monocyíogenes operablemente enlazado a la secuencia optimizada en el codón que codifica para el péptido de señal Usp45 se muestra en la Figura 28. Esta secuencia puede ser combinada ya sea con una secuencia del antígeno optimizado en el codón o no optimizado en el codón para la expresión de una proteína de fusión que comprende el péptido de señal Usp45 y el antígeno deseado.

Ejemplo 13. cásete de expresión optimizado en el codón y vector para codificar los antígenos fusionados a un péptido de señal secA2 (p60) A. Diseño del caseíe de expresión opíimizado en el codón Un cásete de expresión fue diseñado para la expresión de los antígenos heterólogos en Lisíeria monocytogenes, utilizando la vía de secreción de secA2. La secuencia del péptido de señal p60 proveniente de Listeria monocytogenes , su secuencia de - codificación nativa, y la secuencia de codificación optimizada para la expresión en Listeria monocytogenes, se muestra enseguida.

Secuencia de aminoácidos: MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPTIASA' ST (SEQ ID NO: 48) Sitio de reconocimiento de la peptidasa de señal: ASA-ST (SEQ ID NO: 57) Secuencia nucleotídica nativa: 5' -ATGAATATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCTACAGCTGGGATTGCGGTAACAGC ATTTGCTGCGCCAACAATCGCATCCGCAAGCACT3' (SEQ ID NO: 90) Codones optimizados para la expresión de Listeria monocytogenes : 5 ' -?TGAATATGAAAA??GCAACA?TTGCAGCA?C?GCAGGTATTGCAGTTACAGC ATTTGCAGCACCAACAATTGCAAGTGCAAGTACA3' (SEQ ID NO: 91) La secuencia de un cásete de expresión parcial que comprende el promotor hly de Lisíeria monocyíogenes operablemente enlazado a la secuencia nativa que codifica para el péptido de señal p60 se muestra en la Figura 29. La secuencia de un cásete de expresión parcial que comprende el 3 promotor hly de Lisíeria monocyíogenes operablemente enlazado a la secuencia optimizada en el codón que codifica para el péptido de señal p60, se muestra en la Figura 30.

B. Consírucción de pPL~2~hlypro_p60 Puede ser también construido un cásete de expresión en el cual la secuencia de codificación del antígeno sea insertada intraestructuralmente en uno o más sitios dentro de la secuencia de codificación del gen p60. Una descripción de la construcción de un cásete de expresión parcial, útil para insertar la secuencia del antígeno intraestructuralmente dentro de la secuencia p60, se describe más adelante. Este cásete de expresión parcial contiene un promotor hly. Las reacciones de PCR primarias individuales utilizando Pfx o Vent polimerasa se realizan utilizando los siguientes cebadores y pPL2-hlyP-OVA (idéntico a pPL2/LLO-OVA descrito anteriormente en el Ejemplo 2A) como una primera plantilla: pP12-5F: 5' -GACGTCAATACGACTCACTATAG (SEQ ID NO: 92) p60-hlyP-237R: 5' -CTTTTTTCATATTCATGGGTTTCACTCTCCTTCTAC (SEQ ID NO: 93) el tamaño del amplicón resultante es de 285 pares de bases. Las reacciones de PCR primarias individuales utilizando la polimerasa Pfx o Vent son también realizadas utilizando los siguientes cebadores y pCR-TOPO-p60 como una 33 segunda plantilla. (El vector pCR-TOPO-p60 es elaborado a partir de un vector pCR-TOPO obtenido de Invitrogen, Carlsbad, California en cual la secuencia p60 genó ica proveniente de Lisíeria monocyíogenes ha sido insertada. Cualquier otra de las muchas fuentes alternativas de la secuencia que codifica para p60, que estén disponibles, podrían ser utilizadas como una plantilla) . Los cebadores utilizados en esta reacción de PCR son como sigue: hlyP-p60-lF: 5'-AAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCAAC (SEQ ID NO: 88) pCR-TOPO-2283R: 5' -GTGTGATGGATATCTGCAGAATTC (SEQ ID NO: 89) El tamaño del amplicón resultante es de 1510 pares de bases. Las reacciones de PCR son luego limpiadas con las columnas S6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) . Se realiza luego una reacción de PCR secundaria, utilizando aproximadamente 5 µl de cada reacción de PCR primaria como plantilla. La reacción de PCR secundaria utiliza los siguientes cebadores: pnJ-LLO 1257F (cebador utilizado previamente) : 5'CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC (SEQ ID NO: 74) y pCR-TOPO-2258R: 5' CCCTTGGGGATYCCTTAATTATACG (SEQ ID NO: 83). El tamaño del amplicón resultante es de 1715 pares de bases. Los tamaños del amplicón esperados en todas las reacciones de PCR son verificados mediante análisis en gel de agarosa. La reacción de PCR secundaria es limpiada, digerida con BamHI, limpiada nuevamente, y digerida con Kpnl. El fragmento del gen hlyP-p60 (Kpnl-BamHI) (Figura 30) es luego ligado entre los sitios BamHI y Kpnl de los plásmidos pPL2 y pAM401 modificado (pAM401-MCS; Figura 32) . La construcción del plásmido pPL2-p60 es luego confirmada con digestiones con BamHI/Kpnl (1697, 6024 pares de bases) y HindIII (210, 424, 3460, 3634 pares de bases) . El sitio PstJ en el plásmido pPL2-p60 es también confirmado como único. (También, la digestión con Kpnl/Psíl producirá fragmentos de 736 y 6985 pares de bases) . La construcción del plásmido pAM401-p60 (fragmentos Kpnl/Pstl y Kpnl/BamHI provenientes de la región p60, es el mismo que aquel para la construcción pPL2. Aislamientos preparativos grandes de cada plásmido son luego preparados utilizando métodos conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Las secuencias que codifican para el antígeno deseado pueden ser luego insertadas dentro de la secuencia de p60 y en la misma estructura traduccional que la secuencia p60 utilizando técnicas bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Típicamente, la inserción o inserciones deben dejar la secuencia de péptido de señal N-terminal de p60, intacta. La secuencia autolisina C-terminal de p60 debe también ser dejada intacta. 33 Ejemplo 14. Optimización en el codón de las secuencias que codifican para la mesotelina humana para la expresión en Lisíeria monocyíogenes Una secuencia polinucleotídica optimizada en el codón que codifica para la mesotelina humana, un antígeno canceroso, se muestra en la Figura 33. La secuencia mostrada en la Figura 32 ha sido optimizada en el codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes . La secuencia polipeptídica codificada por la secuencia en la Figura 33, se muestra en la Figura 34.

Ejemplo 15. Optimización de codón de las secuencias que codifican para la mesotelina murina para la expresión en Lisíeria monocyíogenes Una secuencia polinucleotídica optimizada en el codón que codifica para la mesotelina humana, un antígeno canceroso, se muestra en la Figura 35. La secuencia mostrada en la Figura 35 ha sido optimizada en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . La secuencia polipeptídíca codificada por la secuencia en la Figura 35, se muestra en la Figura 36. Ejemplo 16. Integración de un cásete de expresión dentro del cromosoma de Lisíeria vía el intercambio alélico Como una posible alternativa para utilizar un vector de integración tal como pPL2 para insertar el cásete de expresión del gen heterólogo dentro del cromosoma de Lisíeria , puede ser utilizado un intercambio alélico. En resumen, las bacterias sometidas a electroporesis con el plásmido del cásete de expresión de la proteína heteróloga de pKSV7 , son seleccionadas mediante siembra en placas sobre agar BHI que contiene cloranfenicol (10 µg/ml), y se incuban a temperatura permisiva de 30°C. La integración de cruce simple dentro del cromosoma bacteriano se selecciona mediante el pase de varias colonias individuales por múltiples generaciones a la temperatura no permisiva de 41 °C en el medio que contiene cloranfenicol. Finalmente, la extirpación y curación del plásmido (cruce doble) es lograda mediante el pase de varias colonias individuales por múltiples generaciones a la temperatura permisiva de 30 °C en el medio BHI que no contiene cloranfenicol. La verificación de la integración del cásete de expresión de la proteína heteróloga dentro del cromosoma de la bacteria, es realizada mediante PCR, utilizando un par de cebadores que amplifica una región definida desde dentro del cásete de expresión de la proteína heteróloga hacia el cromosoma bacteriano que se dirige a la secuencia no contenida en la construcción del vector plásmido pKSV7. 33 Ejemplo 17. Clonación e inserción de EphA2 dentro de los vectores pPL2 para la expresión en cepas recombinante seleccionadas de Listeria monocytogenes Los dominios externos (EX2) y citoplásmicos (CO) de EphA2 que flanquean la hélice transmembranal EphA2, fueron clonados separadamente para la inserción dentro de diversas construcciones de expresión del péptido de señal pPL2. Los genes que corresponden a la secuencia de mamífero nativa u optimizados en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes de los dominios EX2 y CO de EphA2, fueron utilizados. Los codones óptimos en Lisíeria (ver Tabla 3 anterior) para cada uno de los 20 aminoácidos, fueron utilizados para EX2 de EphA2 y CO de EphA2 optimizados en el codón. Los dominios EX2 y CO de EphA2 optimizados en el codón fueron utilizados mediante extensión de los oligonucleótidos traslapados, utilizando técnicas comunes para aquellos expertos en la materia. La secuencia esperada de todas las construcciones de EphA2 sintetizadas fueron verificadas mediante secuenciamiento de nucleótido. Las secuencias de aminoácidos primarias, junto con las secuencias de nucleótidos nativas y optimizadas en el codón para los dominios EX2 y CO de EphA2 se muestran en las Figuras 4-6 (secuencias EX2) y las Figuras 15-17 (secuencias de dominio CO) . Adicionalmente, fueron insertados marcadores de epitopo FLAG (Stratagene, La Jolla, California) y myc, respectivamente, intraestructuralmente en el extremo amino y el extremo carboxilo de los genes de EX2 y CO de EphA2, sintetizados, para la detección del EphA2 expresado y secretado, mediante análisis de Western Blot utilizando anticuerpos específicos para el FLAG o las proteínas. De este modo, la proteína esperada tuvo los siguientes elementos ordenados: NH2-péptido de señal-FLAG-EphA2-myc-C02. Enseguida se muestran las secuencias de aminoácidos del marcador de epitopo FLAG y myc y las secuencias de nucleótidos optimizadas en el codón: FLAG: 5'-GATTATAAAGATGATGATGATAAA (SEQ ID NO: 96) NH2-DYKDDDDK-C02 ( SEQ ID NO : 97 ) Myc : 5'-GAACAAAAATTAATTAGTGAAGAAGATTTA (SEQ ID NO: 98) NH2EQKLISEEDL-C02 (SEQ ID NO: 99) Ejemplo 18. Detección de las proteínas heterólogas sintetizadas y secretadas mediante análisis de Western Blot La síntesis de la proteína EphA2 y la secreción a partir de diversas cepas recombinantes seleccionadas de Jístería-EphA2 fue determinada mediante análisis de Western Blot de fluidos de cultivo bacteriano precipitados con ácido tricloroacético (TCA) . En resumen, cultivos de fase semi-logarítmica de Lisíeria desarrollados en el medio BHI fueron recolectados en un tubo para centrífuga cónico de 50 ml, las bacterias fueron concentradas, y el TCA enfriado con hielo fue agregado a una concentración final de [6%] al sobrenadante de cultivo bacteriano, y se incubó sobre hielo minimamente por 90 minutos o toda la noche. Las proteínas precipitadas con TCA fueron recolectadas • mediante centrifugación a 2400 x g por 20 minutos a 4°C. El botón se suspendió luego en un volumen de 300 a 600 µl de TE, pH 8.0 que contenía 15 µg/ml de rojo de fenol. La disolución de la muestra fue facilitada mediante agitación en torbellino. El pH de la muestra fue ajustado mediante la adición de NHOH si fuera necesario, hasta que el color estuviera rosa. Todas las muestras fueron preparadas 'para la electroforesis mediante la adición de 100 µl de amortiguador de carga SDS 4X, e incubando por 10 minutos a 90 °C. Las muestras fueron luego centrifugadas de 5 minutos a 14,000 rpm en una micro-centrifuga, y los sobrenadantes fueron recolectados y almacenados a -20 °C. Para el análisis de Western Blot, 20 µl de las fracciones preparadas (el equivalente de fluidos de cultivo a partir de 1-4 x 109 bacterias) , fueron cargados sobre el gel de SDS-PAGE al 4-12%, sometidos a electroforesis, y las proteínas fueron transferidas a la membrana de PDDF, de acuerdo a los métodos comunes utilizados por aquellos expertos en la materia. Las membranas transferidas fueron preparadas para la incubación con el anticuerpo, mediante la incubación en 5% de leche deshidratada en PBS por 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Fueron utilizados los anticuerpos bajo las siguientes diluciones en el amortiguador PBST (0.1% de Tween 20 en PBS) : (1) anticuerpo policlonal de conejo anti-Myc (ICL Laboratories, Newberg, Oregon) a 1:10,000; (2) anticuerpo monoclonal murino anti-FLAG (Stratagene, La Jolla, California) a 1:2,000; y (3) anticuerpo policlonal de conejo anti-EphA2 (específico del extremo carboxilo) (sc-924, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California). En enlace específico del anticuerpo a los objetivos proteicos fue evaluado mediante incubación secundaria con el anticuerpo de cabra anti-conejo o anti-ratón, conjugado con peroxidasa de rábano y detección con el equipo de ensayo de quimioluminiscencia ECL (Amersham), y exposición a película.

Ejemplo 19. Secreción de la proteina EphA2 por Listeria recombinante que codifica para varias formas de EphA2 A. Listeria : [cepas DP-L4029 (actA) o DP-L401 7 (LLO L461T) ] Construcción del caseíe de expresión : LLOss-PEST-CO-EphA2 La secuencia nativa del dominio CO de EphA2 fue genéticamente fusionada a la secuencia LLO de secAl nativa, y el cásete de expresión de antígeno heterólogo bajo el control del promotor hly de la Lisíeria insertado dentro del plásmido pPL2 entre los sitios Kpn I y Sac I como se describió anteriormente. Las construcciones plasmídicas pPL2-EphA2 fueron introducidas mediante conjugación en Lisíeria cepas DP-L4029 (actA-) y DP-L4017 (L461T LLO) como se describió anteriormente. La Figura 37 muestra los resultados de un análisis de Western Blot de los fluidos de cultivo bacterianos precipitados con TCA de 4029-EphA2 CO y 4017-EphA2 CO. Este análisis demostró que la Lisíeria recombinante manipulada por ingeniería genética para contener un cásete de expresión de proteína heteróloga comprendido de las secuencias nativas correspondientes a la proteína de fusión CO de EphA2 y secAl, secretó múltiples fragmentos específicos de EphA2 que fueron menores que el peso molecular esperado de 52 kDa, demostrando la necesidad para la modificación del cásete de expresión.

B. Lisíeria : [DP-L4029 (acíA') J Construcciones del cásete de expresión : 1 . LLOss naíivo-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-Codón0p 2. (CodónOp) LLOs s- PEST- (CodónOp) FLAG-EX2_EphA2 -myc La secuencia del péptido de señal LLO de secAl nativo o la secuencia del péptido de señal LLO de SecAl optimizado en el codón para la expresión en Listeria fue fusionada genéticamente con la secuencia del dominio EX2 de EphA2 optimizada en el codón para la expresión en Listeria, y el cásete de expresión del antígeno heterólogo bajo el control del promotor de hly de Lisíeria, fue insertado dentro del plásmido pPL2 entre los sitios Kpn I y Sac I como se describe anteriormente. Las construcciones plasmídicas pPL2-EphA2 fueron introducidas mediante conjugación dentro de la cepa de DP-L4029 (actA) de Listeria como se describe anteriormente. La Figura 38 muestra los resultados de un análisis de Western Blot de los fluidos de cultivo bacterianos precipitados con TCA, de actA de Listeria que codifica ya sea para el péptido de señal LLO de secAl nativo u optimizado en codón fusionado con el dominio EX2 de EphA2 optimizado en codón. Este análisis demostró que la combinación de utilizar la secuencia para el péptido de señal y la proteína heteróloga optimizada para el uso de codón preferido en Listeria monocytogenes, dio como resultado la expresión de la proteína del dominio EX2 de EphA2 de longitud completa, esperada. La expresión de la proteína del domino EX2 de EphA2 de longitud completa fue pobre con optimizado en codón de la secuencia de codificación de EphA2 sola. El nivel de expresión de la proteína heteróloga (fragmentada o de longitud completa) fue más alto cuando se utilizó el péptido de señal secAl de LLO de Lisíeria monocyíogenes, optimizado en codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes .

C. Lisíeria : [DP-L4029 (actA) ] Construcciones del cásete de expresión : 3. LLOss nativo-PEST- (CodónOp) FLAG~EphA2_C0-myc 4. CodónOp LLOss-PEST- (CodónOp) FLAG-EphA2_C0-myc 5. CodónOp PhoD- (CodónOp) FLAG-EphA2_C0-myc La secuencia del péptido de señal LLO de secAl nativo o la secuencia del péptido de señal LLO de secAl optimizada en el codón para la expresión en Listeria, o alternativamente, el péptido de señal Tat del gen phoD Bacillus subtilis optimizado en codón para la expresión de Listeria, fue fusionado genéticamente con la secuencia del dominio CO de EphA2 optimizada en el codón para la expresión en Lisíeria, y el cásete de expresión del antígeno heterólogo bajo el control del promotor hly de Lisíeria fue insertado dentro del plásmido pAM401-MCS entre los sitios Kpn I y Sac I como se describe anteriormente. Las construcciones plasmídicas pAM401-EphA2 fueron introducidas mediante electroporación dentro de Lisíeria cepa DP-L4029 (actA) como se describe anteriormente. La Figura 39 muestra los resultados de un análisis de Western Blot de los fluidos de cultivo bacterianos precipitados con TCA de actA de Lisíeria, 3 que codifica ya sea para el péptido de señal LLO de secAl nativo u optimizado en codón, o el péptido de señal Tat de Bacillus subíilis phoD optimizado en codón, fusionado con el dominio CO de EphA2 optimizado en codón. Este análisis demostró una vez más que la combinación de utilizar la secuencia para el péptido de señal y la proteína heteróloga optimizada para el uso de codón preferido en Lisíeria monocytogenes , dio como resultado la expresión de la proteína del dominio CO de EphA2 de longitud completa, esperada. Además, la expresión y secreción de la proteína del domino CO de EphA2 de longitud completa, esperada resultó de la Listeria recombinante que codifica para el péptído de señal Tat de Bacillus subtilis phoD optimizado en codón, fusionado con el dominio CO de EphA2 optimizado en el codón. Estos resultados demuestran el novedoso e inesperado hallazgo de que los péptidos de señal provenientes de especies bacterianas distintas pueden ser utilizados para programar la secreción de las proteínas heterólogas de la Listeria recombinante. La expresión de la proteína del dominio CO de EphA2 de longitud completa, fue pobre con optimizado del codón solo de la secuencia de EphA2. El nivel de expresión de la proteína heteróloga fue más alto cuando se utilizaron los péptidos de señal optimizados en el codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes .

D. Transfección de células 293 con los plásmidos de pCDNA4 que codifican para EphA2 de longiíud compleía Consírucciones del caseíe de expresión : 6. pCDNA4-EphA2 El gen de EphA2 de longitud completa, nativo fue clonado dentro del plásmido de expresión pCDNA4 basado en el promotor CMV eucariótico (Invitrogen, Carlsbad, California) . La Figura 40 muestra los resultados de un análisis de Western Blot de los Usados preparados a partir de células 293 transfectadas con el plásmido pCDNA4-EphA2, y demuestra la expresión abundante en células de mamífero de la proteína EphA2 de longitud completa.

Ejemplo 20. Eficacia terapéutica en ratones Balb/C que poseen tumores CT26 que codifican para EphA2 humano inmunizado con Lisíeria recombinante que codifica para EphA2 optimizado en el codón Los siguientes datos presentados en las Figuras 41- 44 demostraron lo siguiente: inmunización de los ratones Balb/C que poseen tumores pulmonares CT26.24 (huEphA2+) con la Lisíeria recombinante que codifica para OVA.AHÍ (epitopo inmunodominante gp70 de MMTV) u OVA.AH1-A5 (epitopo inmunodominante gp70 de MMTV, con cambio heteroclítico para el enlace mejorado al receptor de células T) confiere supervivencia a largo plazo (Figura 41) .

El dominio CO de EphA2 es fuertemente inmunogénico, y fue observado un incremento significativo a largo plazo en la supervivencia de los ratones Balb/C que poseen los tumores pulmonares CT26.24 (huEphA2+) cuando se inmunizaron con la Lisíeria recombinante que codifica para la secuencia del dominio CO de EphA2 optimizado en el codón o nativo (Figura 43) . El dominio EX2 de EphA2 es pobremente inmunogénico, y la supervivencia incrementada de los ratones Balb/C que poseen tumores pulmonares CT26.24 (huEphA2+) fue observado únicamente cuando se inmunizaron con la Lisíeria recombinante que codifica para el péptido de señal secAl optimizado en el codón, fusionado con la secuencia del dominio EX2 de EphA2 optimizado en el codón. La eficacia terapéutica no fue observada en ratones cuando fueron inmunizados con la Listeria recombinante que codifica para el péptido de señal secAl nativo fusionado con la secuencia del dominio EX2 de EphA2 optimizado en el codón (Figura 42) . El deseo de utilizar el péptido de señal secAl optimizado en el codón y la secuencia del dominio EX2 de EphA2, fue apoyado por la eficacia anti-tumoral terapéutica, estadísticamente significativa como se muestra en la Tabla 4 siguiente. Tabla 4. Comparación por prueba de rango logarítmico de las curvas de supervivencia mostradas en la Figura 42 Significativamente, aún cuando las células 293 transfectadas con el plásmido pCDNA4-EphA2 produjeron niveles muy altos de expresión de la proteína, la inmunización de ratones Balb/C que poseen tumores pulmonares CT26.24 (huEphA2+) con el plásmido pCDNA4-EphA2, no dio como 3 resultado ninguna observación de la eficacia anti-tumoral terapéutica (Figura 44). Para estudios de tumores in vivo,- terapéuticos, ratones Balb/C hembra fueron implantados IV con 5 x 105 células CT26 que expresan establemente EphA2. Tres días más tarde, los ratones fueron repartidos aleatoriamente y vacunados intravenosamente con diversas cepas de Lisíeria recombinante que codifican para EphA2. En algunos casos (anotados en las figuras) los ratones fueron vacunados con 100 µg del plásmído pCDNA4 o el plásmido pCDNA4-EphA2 en el músculo íibialis anterior. Como un control positivo, los ratones fueron vacunados intravenosamente con cepas de Lisíeria recombinante que codifican para las proteínas quimeras OVA.AHÍ u OVA.AH1-A5. Los ratones fueron vacunados en los días 3 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Los ratones inyectados con Solución Salina Balanceada de Hanks (HBSS) como amortiguador o la Lisíeria no modificada, sirvieron como controles negativos. Todos los grupos experimentales contenían 5 ratones. Para los estudios de supervivencia, los ratones fueron sacrificados cuando éstos comenzaron a mostrar signos de estrés o de respiración difícil .

Ejemplo 21. Evaluación de las respuestas inmunes específicas del antígeno después de la vacunación Las vacunas de la presente invención pueden ser evaluadas utilizando una variedad de métodos in viíro e in vivo . Algunos ensayos involucran los análisis de células T específicas del antígeno a partir de bazos de ratones que han sido vacunados. En este ejemplo se proporcionan los ejemplos no limitantes de los métodos de evaluación de las respuestas inmunes in viíro e in vivo . Los antígenos indicados en estas descripciones ejemplares de los ensayos son antígenos modelo, no necesariamente antígenos producidos utilizando las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconocerá fácilmente que los ensayos descritos en este ejemplo pueden ser aplicados fácilmente para el uso en la evaluación de las respuestas inmunes in vitro o in vivo de las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes, los casetes de expresión y/o los vectores de expresión descritos en la presente. Por ejemplo, los ratones C57B1/6 o Balb/c son vacunados mediante inyección intravenosa de 0.1 LD50 de una cepa de Listeria que expresa OVA (u otro antígeno apropiado) . Siete días después de la vacunación, las células del bazo de los ratones son cosechadas (típicamente 3 ratones por grupo) mediante la colocación de los bazos dentro del medio RPMI 1640 enfriado con hielo, y preparando una suspensión celular simple a partir de éste. Como una alternativa, los nodulos linfáticos de los ratones pudieron ser similarmente cosechados, preparados como una suspensión de células simples y sustituidos por las células del bazo en los ensayos descritos más adelante. Típicamente, las células del bazo son evaluadas para la administración intravenosa o intraperitoneal de la vacuna, mientras que las células del bazo y las células provenientes de los nodulos linfáticos son evaluadas para la administración intramuscular, subcutánea o intradérmica de la vacuna. A no ser que se indique de otro modo, todos los anticuerpos utilizados en estos ejemplos pueden ser obtenidos de Pharmingen, San Diego, California. Ensayo ELISPOT: Utilizando una cepa de Lisíeria que tiene un antígeno OVA como un ejemplo, la frecuencia cuantitativa de las células T específicas del antígeno, generadas después de la inmunización en un modelo de ratón, es evaluada utilizando un ensayo ELISPOT. Las células T específicas del antígeno evaluadas son las células T CD8+ específica de OVA o CD8+ específica de LLO o CD4+. Este modelo de antígeno OVA evalúa la respuesta inmune a un antígeno tumoral heterólogo insertado dentro de la vacuna, y podría ser sustituido con un antígeno de interés. El antígeno LLO es específico de Lisíeria . Las células T específicas son evaluadas mediante la detección de la liberación de citocina (por ejemplo IFN-?) después del reconocimiento del antígeno específico. Placas de 96 pozos basadas en PVDF (BD Biosciences, San José, California) son recubiertas toda la noche a 4°C con un anticuerpo monoclonal IFN-? anti-murino (mAb R4 ; 5 µg/ml). Las placas son lavadas e inyectadas por 2 horas a temperatura ambiente con 200 µl de RPMI completo. Las células del bazo provenientes de ratones vacunados (o ratones control no vacunados) son agregadas a 2 x 105 células por pozo, e incubadas por 20 a 22 horas a 37 °C en presencia de diversas concentraciones de los péptidos que van de 0.01 a 10 µM. Los péptidos utilizados para OVA y LLo son ya sea SL8, un epitopo MHC de la clase I para OVA, LLO?90 (NEKYAQAYPNVS (SEQ ID NO: 100) Invitrogen) un epitopo MHC clase II para la listeriolisina O (antígeno de Lisíeria) , LL0296 (VAYGRQVYL (SEQ ID NO: 101) un epitopo MHC de la clase I para listeriolisina O, o LLO?90 (GYKDGNEYI (SEQ ID NO: 102)), un epitopo MHC de la clase I para listeriolisina O. LLO190 y LL0296 son utilizados en un modelo de C57B1/6, mientras que LL09? es utilizado en el modelo de ratón Balb/c. Después del lavado, las placas son incubadas con anticuerpos secundarios biotinilados específicos para IFN-? (XMG1.2) diluido en PBS a 0.5 µg/ml. Después de la incubación a 3 3 temperatura ambiente por 2 horas, las placas son lavadas e incubadas por 1 hora a 37 °C con un conjugado de oro 1 nm y anti-biotina de cabra (GAB-1; 1:200 dilución; Ted Pella, Redding, CA) diluido en PBS que contiene 1% de BSA. Después de un lavado completo, las placas son incubadas a temperatura ambiente por 2 a 10 minutos con el sustrato (Equipo de Mejoramiento Silver; 30 ml/pozo; Ted Pella) para el revelado de los puntos. Las placas son luego enjuagadas con agua destilada para detener la reacción del sustrato. Después de que las placas han sido secadas al aire, los puntos en cada pozo son contados utilizando un lector de placas automatizado ELISPOT (CTL, Cleveland, Ohio) . La respuesta de la citocina es expresada como el número de células formadoras de puntos de IFN-? (SFCs) por 2 x 105 células del bazo para las células T específicas de OVA o bien para las células T específicas de Lisíeria . Ensayo de Tinción de Ciíocina Iníracelular (ICS) : Con el fin de evaluar adicionalmente el número de células T CD8+ o CD4+ específicas del antígeno y correlacionar los resultados con aquellos obtenidos de los ensayos ELISPOT, se realiza ICS y las células son evaluadas mediante análisis de citometría de flujo. Las células del bazo provenientes de los grupos vacunados y control de ratones, son incubadas con SL8 (estimula las células CD8+ específicas de OVA) o LLO190 (estimula las células CD4+ específicas de LLO) por 5 horas en presencia de Brefeldina A (Pharmingen) . La Brefeldina A inhibe la secreción de las citocinas producidas después de la estimulación de las células T. Las células del bazo incubadas en un péptido MHC de la clase I irrelevante, son utilizadas como controles. Las células del bazo estimuladas con PMA (forbol-12-miristato-13-acetato, Sigma) a 20 ng/ml e ionomicina (Sigma) 2 µg/ml, son utilizadas como un control positivo para la tinción de citocina intracelular de IFN-? y TNF-a. Para la detección de la expresión de la citocina citoplásmica, las células son teñidas con el Ab FITC-anti- CD4 (RM 4-5) y el mAb PerCP-anti-CD8 (53-6.7), fijado y permeabilizado con la solución Cytofix/CytoPerm (Pharmingen) , y teñido con el anticuerpo mAb anti-TNF-a conjugado a PE (MP6-XT22) y el mAb anti-IFN-? conjugado a APC (el XMG1.2) por 30 minutos sobre hielo. El porcentaje de células que expresan IFN-? intracelular y/o TNF-a fue determinado por citometría de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) y los datos analizados utilizando el software CELLQuest (Becton Dickinson Immunocytometry System) . Ya que los marcadores fluorescentes sobre los diversos anticuerpos pueden ser todos distinguidos mediante el método FACScalibur, las células apropiadas son identificadas mediante entrada para aquellas CD8+ y CD4+ que son teñidas con uno o ambos de anti-IFN-? o anti-TNF-a.

Expresión de Ciíocina de Células del Bazo Esíimuladas : El nivel de secreción de citocina por las células del bazo de ratones puede ser también evaluado para los ratones control y vacunados C57B1/6. Las células del bazo son estimuladas por 24 horas con SL8 o LLO190- La estimulación con el péptido irrelevante HSV-gB2 (Invitrogen, SSIEFARL, SEQ ID NO: 4) es utilizada como un control. Los sobrenadantes de las células estimuladas son recolectados, y son determinados los niveles de citocinas de células T cooperadoras 1 y células T cooperadoras 2, utilizando un ensayo de ELISA (eBiosciences, CO) o un Equipo de Arreglo de Esferas Citométricas (Pharmingen) . Evaluación de la Acíividad de Células T Ciíoíóxicas : Las células T CD8+ específicas de OVA pueden ser además evaluadas mediante la evaluación de su actividad citotóxica, ya sea in viíro o directamente en ratones C57B1/6 in vivo . Las células T CD8+ reconocen y lisan sus respectivas células objetivo de una manera específica del antígeno. La citotoxicidad in viíro es determinada utilizando un ensayo de liberación de cromo. Las células del bazo de ratones intactos y vacunados con Lisíeria-OVA (interna) son estimuladas a una proporción de 10:1 ya sea con las células EG7. OVA y irradiadas (línea de células tumorales EL-4 transfectadas para expresar OVA, ATCC, Manassas, VA) o con SL8 100 nM, con el fin de expandir las células T específicas de OVA en la población de células del bazo. Después de 7 días de cultivo, se determina la actividad citotóxica de las células efectoras en un ensayo de liberación de 51Cr por 4 horas, estándar, utilizando las células EL-4 pulsadas con EG7. OVA o SL8 (ATCC, Manassas, VA) como células objetivo, y células EL-4 solas como control negativo. La línea celular YAC-1 (ATCC, Manassas, VA) es utilizada como objetivo para determinar la actividad de las células NK, con el fin de distinguir la actividad debida a las células T de aquella debida a las células NK. El porcentaje de citotoxicidad específica es calculado como 100 x (liberación experimental-liberación espontánea) / (liberación máxima-liberación espontánea) . La liberación espontánea es determinada mediante la incubación de las células objetivo sin células efectoras. La liberación máxima es determinada mediante la lisis de las células con 0.1% de Tritón X-100. Los experimentos son considerados válidos para el análisis si la liberación espontánea es <20% de la liberación máxima. Para la evaluación de la actividad citotóxica de células T CD8+ específicas de OVA in vivo, las células del bazo provenientes de ratones C57B1/6 nativas, son divididas en dos alícuotas equivalentes. Cada grupo es pulsado con un péptido específico, ya sea el objetivo (SL8) o el control (HSV-gB2) , a 0.5 µg/ml por 90 minutos a 37°C. Las células son luego lavadas 3 veces en el medio, y dos veces en PBS + 0.1% de BSA. Las células son resuspendidas a 1 x 107 por ml en PBS caliente + 0.1% de BSA (10 ml o menos) para la marcación con el éster de succinimidilo del diacetato de carboxifluoresceína (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR) . Para la suspensión de células objetivo, se agrega 1.25 µl de una reserva de 5 mM de CFSE y la mezcla se mezcla mediante agitación en torbellino. A la suspensión de células control, una dilución a un décimo de la reserva de CFSE se agrega, y la muestra se mezcla mediante agitación en torbellino. Las células son incubadas a 37 °C por 10 minutos. La tinción es detenida por la adición de un volumen grande (>40 ml) de PBS enfriado con hielo. Las células son lavadas dos veces a temperatura ambiente con PBS, luego resuspendidas y contadas. Cada suspensión celular es diluida a 50 x 106 por ml, y 100 µl de cada población se mezclan y se inyectan por la vena de la cola ya sea a ratones intactos o vacunados. Después de 12 a 24 horas, los bazos son cosechados y se analizan un total de 5 x 106 células mediante citometría de flujo. Los picos fluorescentes altos (objetivo) y bajos (control) son enumerados, y la proporción de los dos se utiliza para establecer el porcentaje de lisis de células objetivo. El ensayo de citotoxicidad in vivo permite la evaluación de la actividad lítica de las células T específicas del antígeno, sin la necesidad de reestimulación in viíro . Además, este 35 ensayo evalúa la función de las células T en su ambiente nativo.

Ejemplo 22. Inmunidad de EphA2 humano mediante vacunación de ratones Balb/C con cepas de Lisíeria que expresan EphA2 Ratones Balb/c (n=3) fueron inmunizados con la Lisíeria L461T que expresa el dominio intracelular de hEphA2 (Lisíeria hEphA2-ICD en la Figura 45) o una cepa ?acíA (acíA') de Lisíeria que expresa el dominio extracelular de hEphA2 a partir de una secuencia optimizada en el codón para la expresión en L . monocyíogenes (Lisíeria hEphA2-ECD en la Figura 45) con dos semanas de separación. (El dominio intracelular de hEphA2 es alternativamente referido en la presente como hEphA2-ICD, hEphA2 ICD, EphA2 CO o CO. El dominio extracelular de hEphA2 es alternativamente denominado en la presente como hEphA2-ECD, hEphA2 ECD, EphA2 EX2, o EX2). Los ratones fueron sacrificados, y los bazos son cosechados y combinados 6 días después de la última inmunización. Para el ensayo ELISPOT las células fueron re-estimuladas in viíro con células P815 que expresan hEphA2 de longitud completa o los usados celulares preparados a partir de estas células. Las células P815 progenitoras o los usados celulares sirvieron como un control negativo. Las células fueron también estimuladas con la proteína de fusión hEphA2-Fc recombinante. Las colonias formadoras de puntos positivos a IFN-gamma (SFCs) fueron medidas utilizando un lector de puntos de 96 pozos. Como se muestra en la Figura 45, se observaron SFCs de IFN-gamma incrementadas, con las células del bazo derivadas de ratones vacunados con Listeria-hEphA2. Las células que expresan hEphA2 o la estimulación de los Usados celulares dio como resultado un incremento en las SFC de IFN-gamma, lo cual sugiere una respuesta de células T CD8+ específicas de EphA2 así como células T CD4+. Las células del bazo provenientes de ratones vacunados con la Listeria progenitura control, no demostraron un incremento en SFC de IFN-gamma.

Ejemplo 23. Son requeridas respuestas de células T CD4+ Y CD8+ para la eficacia anti-tumoral específica de EphA2 Ratones Balb/c (n=10) fueron inoculados i.v. con 2 x 105 CT26-hEphA2 en el día 0. Las células T CD4+ y las células T CD8+ fueron agotadas mediante inyección de 200 µg de anti-CD4 (ATCC hibridoma GK1.5) o anti-CD8 (ATCC hibridoma 2.4-3) en los días 1 y 3, lo cual fue confirmado por análisis de FACS (datos no mostrados) . Los ratones fueron luego inmunizados i.v. con 0.1 LD50 de Listeria L461T que expresa ICD de hEphA2 en el día 4, y se monitorizó para la supervivencia . Como se muestra en la Figura 46, los grupos agotados en CD4+ y CD8+ fallaron en demostrar la respuesta anti-tumoral observada en animales no agotados en células T. Los datos son resumidos en la Tabla 5 siguiente: Tabla 5 Los datos anteriores indican un recubrimiento para las células T CD4+ y CD8+ en la supresión óptima del crecimiento tumoral.

Ejemplo 24. Agotamiento de inlB de Lisíeria por intercambio alélico Las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes y los casetes de expresión descritos en la presente son, en algunas modalidades, Lisíeria mutante.

Por ejemplo, en algunas modalidades, las bacterias que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes y los casetes de expresión son las cepas de Lisíeria monocyíogenes en las cuales han sido suprimidos el gen actA, el gen inlB, o ambos. Un método ejemplar para generar un mutante de supresión en Listeria es descrito más adelante. La supresión del gen de la internalina B (inlB) de Listeria DP-L4029 (o de otras cepas mutantes seleccionadas o de Listeria de tipo silvestre) puede ser efectuado mediante intercambio alélico, como se describe por Camilli et al., Mol , Microbiol . 8: 143-147 (1993). Pueden ser utilizadas las PCR de Extensión de Traslape de Empalme (SOE por sus siglas en ingles) para preparar la construcción utilizada en el procedimiento de intercambio alélico. La fuente del gen de la internalina B es la secuencia listada en Genbank número de acceso AL591975 (Lisíeria monocyíogenes cepa EGD, genoma completo, segmento 3/12; región del gen inlB: nucleótidos 97008-98963) , incorporada por referencia en la presente en su totalidad, y/o la secuencia listada como Genbank número de acceso NC_003210 [Lisíeria monocyíogenes cepa EGD, genoma completo, región del gen inlB: nucleótidos 457008-458963) , incorporada por referencia en la presente en su totalidad. En las reacciones de PCR primarias, aproximadamente 1000 pares de bases de la secuencia corriente arriba (5') y corriente abajo (3' ) de los extremos 5' y 3' del gen inlB de Listeria, respectivamente, son amplificados utilizando la siguiente plantilla y los cebadores: Plantilla : ADN genómico DP-L4056 o DP-L4029 Par de cebadores 1 (Para la amplificación de la región corriente arriba desde el extremo 5' de inlB) : Lm-96031F: 5' -GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG (SEQ ID NO: 103) (Tm: 72°C) Lm-(3' inlB-R+ ) 97020R: 5'- AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT (SEQ ID NO: 104) (Tm: 114°C) (La secuencia subrayada complementaria a la región corriente abajo (3') del extremo carboxilo de inlB) Tamaño del amplicón (pares de bases (pbs) ) : 1007 Par de cebador 2 (Para la amplificación de la región corriente abajo (3') desde el extremo 3' de inlB) : Lm-(5' inlB-F+) 98911F: 5'- CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGAAGGC (SEQ ID NO: 105) (Tm: 118°C) (La secuencia subrayada complementaria a la región corriente arriba (5' ) del extremo amino de inlB) Lm-99970R: 5' -TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC (SEQ ID NO: 106) (Tm: 74°C) Tamaño del amplicón (pbs) : 1074 En la reacción de PCR secundaria, los amplicones de PCR primarios son fusionados a través de SOE PCR, tomando ventaja de la complementariedad entre el cebador inverso del par 1 y el cebador delantero del par 2. Éste da como resultado la supresión precisa de la secuencia de codificación de inlB: nucleótidos 97021-98910=1889 pbs. La siguiente plantilla y cebadores fueron utilizados en la reacción de PCR secundaria: Plantilla : Reacciones de PCR primarias limpias Par cebador: Lm-96043F: 5' -GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG (SEQ ID NO: 107) (Tm: 74°C) Lm-99964R: 5' -GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC (SEQ ID NO: 108) (Tm: 74°C) (Tamaño del amplicón (pbs) : 2033) Un protocolo para completar el proceso de construcción es como sigue: Las reacciones de PCR primarias (ciclo de 3 temperaturas) son realizadas utilizando la ADN-polimerasa Vent (NEB) y 10 µl de un cultivo de toda la noche de Listeria DP-L4056 o DP-L4029 a 30°C, lavado. El tamaño esperado de los amplicones de Listeria por 1% de gel de agarosa (1007 pares de bases y 1074 pares de bases) . Las reacciones de PCR primarias son purificadas en gel y el ADN eluido con GeneClean (BIO 101) . Una reacción de PCR secundaria es realizada, utilizando cantidades aproximadamente iguales de cada reacción primaria como plantilla (aproximadamente 5 µl) . El tamaño esperado del amplicón de Lisíeria proveniente de la reacción de PCR secundaria es verificado por gel de agarosa al 1% (2033 pbs) . Son agregados residuos de adenosina en los extremos 3' del amplicón di ínlB de Lisíeria con la polimerasa Taq. El amplicón di inlB de Lisíeria es luego insertado dentro de un vector pCR2.1-TOPO. El ADN plásmido pCR2.1-TOPO-dl inlB es digerido con Xhol y Kpnl y el fragmento de 2123 pb es purificado en gel. El fragmento de Kpnl/Xhol de 2123 pb es insertado dentro de un vector pKSV7 que ha sido preparado mediante digestión con Kpnl y Xhol, y tratamiento con CIAP (pKSV7-dl nlB) . La fidelidad de la secuencia de di inlB en pKSV7-dl inlB es luego verificada. El gen inlB es suprimido de las cepas de Lisíeria deseadas mediante intercambio alélico con el plásmido pKSV7-dl inlB.

Ejemplo 25. Péptidos de señal optimizados en el codón para la construcción de Lisíeria recombinante Algunos péptidos de señal optimizados en el codón, ejemplares, que pueden ser utilizados en los casetes de expresión en la Lisíeria recombinante se proporcionan en la Tabla 6 siguiente.

Tabla 6. Péptidos de señal ejemplares para la construcción de Lisíeria recombinante """La secuencia mostrada incluye la secuencia PEST proveniente de LLO.

Ejemplo 26. Cásete de expresión optimizado en el codón que comprende el péptido de señal del Antígeno Protector (PA) de Bacillus anthracis Fue diseñado un cásete de expresión para la expresión de antígenos heterólogos en Listeria monocytogenes utilizando un. péptido de señal secAl no Listerial. La secuencia de aminoácidos del péptido de señal del Antígeno Protector (PA) proveniente de Bacillus anthracis (Ba) (GenBank número de acceso NC_007322), su secuencia de codificación nativa, y la secuencia de codificación optimizada para la expresión en Lisíeria monocytogenes, se muestran enseguida.

Secuencia de aminoácidos: MKKRKVLIPLMALSTILVSSTGNLEVIQAEV (SEQ ID NO: 47) Sitio de reconocimiento de la peptidasa de señal: IQA'EV (SEQ ID NO: 56) Secuencia nucleotídica nativa: ATGAAAAAACGAAAAGTGTTAATACCATTAATGGCATTGTCTACGATATTAGTTT CAAGCACAGGTAATTTAGAGGTGATTCAGGCAGAAGTT (SEQ ID NO: 111) Codones optimizados para la expresión en Listeria monocytogenes : ATGAA?AAACGTAA?GTTTTAATTCCATTAATGGC?TTAAGTAC??TTTTAGTTA GTAGTACAGGTAATTTAGAAGTTATTCA?GCAGAAGTT (SEQ ID NO: 114) La secuencia de un cásete de expresión parcial que comprende el promotor hly de Listeria monocyíogenes, operablemente enlazado a la secuencia optimizada en el codón que codifica para el péptido de señal Ba PA, se muestra en la Figura 47. Esta secuencia puede ser combinada ya sea con un antígeno optimizado en el codón o no optimizado en el codón, para la expresión de una proteína de fusión que comprende el péptido de señal PA de Bacillus aníhracis y el antígeno deseado.

Ejemplo 27. Expresión y secreción de antígenos provenientes de Lisíeria recombinante que comprenden los casetes de expresión optimizados en el codón La opíimización del codón del pépíido de señal y del aníígeno íumoral , proporciona expresión eficieníe y secreción desde la Lisíeria recombinaníe: La optimización del codón de los elementos genéticos que codifican para el péptido de señal y para la proteína heteróloga, proporciona secreción óptima a partir de las vacunas basadas en Lisíeria recombinante de los antígenos tumorales humanos que contienen dominios hidrofóbicos . La secreción eficiente del antígeno a partir de bacterias citosólicas es requerida para la presentación eficiente por medio de la vía MHC de la clase I y aprestamiento de células T CD8+, y es de este modo vinculada directamente a la potencia de las vacunas basadas en Lisíeria . La secreción a partir de Lisíeria recombinante de dos antígenos tumorales humanos malignos, enlazados a la membrana celular, la mesotelina y NY-ESO-l, que son objetivos inmunes relacionados al cáncer pancreático y de ovario (mesotelina) , y melanoma (NY-ESO-l) , entre otros tumores sólidos, ha sido optimizada a través de la optimización del codón de la combinación de las secuencias que codifican para el antígeno en eL péptido de señal. Fueron construidas una variedad de casetes de expresión que comprenden el promotor hly enlazado ya sea a las secuencias nativas u optimizadas en el codón, que codifican para los péptidos de señal relacionados a las vías de secreción secAl o alternativa incluyendo secA2 y la Traslocación Twin-Arg (Tat) , fusionada intraestructuralmente con un antígeno tumoral humano seleccionado - NY-ESO-l humano o mesotelina humana. (ver Ejemplos 11-14 y 25 anteriores, para las secuencias antigénicas y/o las secuencias de señal) . El análisis de Western Blot de los fluidos de cultivos precipitados con TCA de Listeria desarrollado en caldo BHI, se utilizó para evaluar la síntesis y la secreción de las proteínas heterólogas a partir de la Listeria recombinante.

(Métodos análogos para aquellos descritos en el Ejemplo 18 anterior, fueron utilizados para los análisis de Western Blot) . Los resultados de estos experimentos son mostrados en la Figura 48A-C. La expresión y secreción eficientes de los antígenos tumorales de longitud completa provenientes de la Lisíeria recombinante, fueron observados cuando las secuencias que codifican para el péptido de señal, incluyendo cuando son derivadas de Lisíeria monocyíogenes , y las secuencias que codifican para el antígeno extraño, operablemente enlazadas, fueron optimizadas para el uso del codón en Listeria monocytogenes . La Figura 48A muestra la expresión/secreción de la mesotelina humana por Listeria monocytogenes ?acíA con una construcción que comprende un péptido de señal LLo fusionado con la mesotelina humana, utilizando codones nativos para LLO y mesotelina. Mediante análisis de Western de los fluidos de cultivo bacterianos precipitados con TCA, no fue observada la secreción de la mesotelina esperada de longitud completa (62 kDa) con estas construcciones, y únicamente se observó la secreción de varios fragmentos pequeños (Figura 48A) . La Figura 48B muestra un análisis de Western Blot de la expresión/secreción de la mesotelina humana por Lisíeria monocytogenes ?actA que comprende los plásmidos (pAM401) que contienen construcciones que codifican para los péptidos de señal diversos fusionados con la mesotelina humana. En cada construcción, la secuencia de codificación de la mesotelina fue optimizada en el codón para la expresión en Listeria monocytogenes . Donde se ilustra, las secuencias de codificación del péptido de señal utilizadas, contenían ya sea la secuencia nativa ("nativa") o fueron optimizadas en el codón ("CodOp") para la expresión en Listeria monocyíogenes . La mesotelina secretada fue detectada utilizando un anticuerpo policlonal anti-humano/ratón, purificado por afinidad, preparado mediante inyección con los conejos con los péptidos seleccionados, junto con IFA. Significativamente, como se muestra en las bandas 3-5 y 8-9 de la Figura 48B, la secreción de la mesotelina de longitud completa (62 kDa) fue observada únicamente cuando el péptido de señal y las secuencias que codifican para la mesotelina, fueron optimizadas en el codón para la expresión en Lisíeria . Esta observación también incluyó significativamente los péptidos de señal derivados de Lisíeria a partir de las proteínas bacterianas LLO y p60, relacionadas a las vías de secreción de secAl y secA2, respectivamente, las cuales contienen codones infrecuentemente utilizados. (La secuencia LLO PEST es también incluida con el péptido de señal LLO y su secuencia de codificación está también optimizada en el codón) . La secreción eficiente de la mesotelina de longitud completa (62 kDa) fue observada cuando el péptido de señal LLO de Lisíeria optimizado en el codón fue ligado con la mesotelina optimizada en el codón (Banda 8, Figura 48B) , pero NO cuando la secuencia de codificación nativa del péptido de señal LLO de Lisíeria fue utilizado (Banda 7, Figura 48B) . Además, la secreción de la mesotelina de longitud completa (62 kDa) fue observada cuando el péptido de señal p60 de Lisíeria optimizado en el codón fue ligado con la mesotelina optimizada en el codón (Banda 3, Figura 48B) , pero no cuando la secuencia de codificación nativa del péptido de señal p60 de Listeria fue utilizado (Banda 6, Figura 48B) . Finalmente, se observó la secreción de la mesotelina de longitud completa (62 kDa) cuando los péptidos de señal optimizados en el codón provenientes de especies bacterianas diferentes de Listeria monocyíogenes , fueron operablemente enlazados a la mesotelina optimizada en el codón (Figura 48B) . El péptido de señal proveniente del antígeno protector de Bacillus aníhracis (Ba PA) , o el péptido de señal proveniente de la proteína Usp45 de Lacíococcus lactis (Ll Usp45) programó la secreción eficiente de la mesotelina de longitud completa (62 kDa) a partir de las cepas de Listeria recombinante (Figura 48B, bandas 4 y 5) . El péptido de señal phoD de Bacillus subtilis (Bs phoD) también programó la secreción eficiente de la mesotelina de longitud completa de Listeria (Figura 48B, banda 9) . Las bandas con un peso molecular de aproximadamente 62,000 corresponden a la mesotelina, y los 7 pares de bandas dobles corresponden probablemente a los polipéptidos de mesotelina no escindidos más escindidos (por ejemplo, para la escisión parcial) . La Figura 48C muestra la expresión/secreción de NY-ESO-1 de ?acíA?inlB de Lisíeria , con construcciones que comprenden una secuencia que codifica para el péptido de señal LLO que fue fusionado con una secuencia que codifica para NY-ESO-l humano, las cuales fueron optimizadas en el codón para la expresión en Lisíeria . NY-ESO-l secretada fue detectada utilizando un anticuerpo monoclonal NY-ESO-l. En este ejemplo, el péptido de señal y los dominios del antígeno tumoral fueron sintetizados para utilizar el codón más preferido para cada aminoácido, como es definido por la presencia de aparición por 1000 codones en las secuencias de codificación provenientes del genoma de Lisíeria (http: //www. kazusa. or . jp/codón/cgi-bin/showcodón. cgi?species=Listeria+monocytogenes+ [gbbct] ) . Los péptidos de señal relacionados a las vías de secreción secAl, secA2 o traslocación twin-Arg (Tat) de Lisíeria y otros géneros de bacterias Gram-positivas programaron la secreción eficiente de los antígenos tumorales humanos a partir de Lisíeria recombinante. Sorprendentemente, los péptidos de señal provenientes de las proteínas LLO y p60 de Lisíeria , cada uno contienen codones raros (frecuencia <10 por 1000 codones) , y la optimización de estas secuencias fue 37 requerida para la secreción eficiente de la mesotelina y NY-ESO-l a partir de la Lisíeria recombinante (Figura 48B) . La secreción de mesotelina fue también observada cuando se vinculó a los péptidos de señal secAl del antígeno protector de B . aníhracis (pagA) y Usp45 de Lacíococcus lacíis, y el péptido de señal Tat proveniente del gen de la fosfodiesterasa/fosfatasa alcalina D (PhoD) de B . subtilis . Los péptidos de señal provenientes de las distintas vías de secreción, fueron utilizados para determinar si una vía particular podría ser favorecida para la secreción óptima de las proteínas heterólogas. Por ejemplo, la vía Tat es utilizada para la secreción de proteínas plegadas dentro de la bacteria, y la proteína phoD de B . subtilis es secretada vía este mecanismo. Se ha lanzado originalmente la hipótesis de que la secreción de antígenos tumorales que contienen dominios hidrofóbicos significativos, tales como NY-ESO-l, puede ser facilitada mediante el plegamiento antes del transporte. No obstante, estos resultados indicaron que la optimización del péptido de señal y la secuencia de codificación del antígeno tumoral, y no la vía de secreción, es el requerimiento principal para la secreción eficiente de las proteínas de mamífero. De manera importante, el fenotipo de vacunas recombinantes que utilizan cualquier vía para la secreción de antígeno tumoral no fue significativamente afectado, en comparación a la cepa progenitoria de Lisíeria ?acíA/?nlB. La letalidad media (LD50) de Lisíeria ?acíA/?nlB es de 1 x 108 ufe en ratones C57BL/6. La incorporación específica del sitio, de copia simple, estable de los casetes de expresión del antígeno tumoral en un sitio inocuo sobre el cromosoma de Lisíeria ?acíA/?nlB, fue logrado utilizando el vector de integración pPL2. La LD50 del antígeno tumoral que codifica para Listeria ?acíA/?nlB estuvo dentro de 5 veces de aquella de Lisíeria ?acíA/?nlB .

Ejemplo 28. Construcción de los vectores de expresión de hEphA2 bicistrónicos Como un agente no limitante, la construcción de un cásete de expresión del antígeno, en el cual los dominios externo (EX2) e interno (CO; cinasa muerta) de hEphA2 a parece a partir de un mensaje bicistrónico. La secreción de los dominios EX2 y CO es lograda mediante enlace funcional de los péptidos de señal Ba PA y Bs PhoD con los dominios EX2 y CO, respectivamente. Un plásmido muerto en cinasa EphA2 humano optimizado en el codón, conocido como phEphA2KD, es utilizado en la construcción de un vector de expresión hEphA2 bicistrónico. (EphA2 es una tirosina-cinasa receptora, pero la actividad de la cinasa es abolida por una mutación de K a M en el sitio activo de la enzima) . Las secuencias de codificación de phEphA2KD son mostradas en la Figura 49. La secuencia phEphA2KD en la Figura 49 comprende la secuencia de codificación optimizada en el codón para hEphA2 suprimido del dominio transmembranal, y contiene los sitios de restricción únicos Ba Hl y Sac 1 5' y 3' , para facilitar la construcción de los casetes de expresión de antígeno funcional. Las secuencias de reconocimiento Mlu I son mostradas en negritas en la secuencia mostrada en la Figura 49. Un sub-frag ento del EphA2 humano (dominio transmembranal suprimido, muerte en cinasa) entre las dos secuencias de reconocimiento de enzima de restricción Mlu I es sintetizada (por un método de síntesis de genes conocido en la técnica, por ejemplo mediante síntesis de oligonucleótido, PCR, y/o relleno de Klenow, o similares) . La región intergénica actA-plcB es insertada durante la síntesis precisamente en la unión entre los dominios extracelular e intracelular de EphA2, los cuales están separados por el dominio transmembranal hidrofóbico en la proteína nativa. La secuencia del sub-fragmento Mlu I de EphA2 humano optimizado en el codón que contiene la región intergénica actA-plcB se muestra en la Figura 50 (la región intergénica es mostrada en negritas) . Además, el péptido de señal phoD de Bs optimizado en el codón es colocado en el extremo 3' de la secuencia intergénica actA-plcB y está fusionado intraestructuralmente con la región de codificación del dominio CO de EphA2, corriente abajo (3'). El cásete bicistrónico EphA2 humano funcional es ensamblado por sustitución del fragmento Mlu I que contiene la región intergénica actA-plcB y el péptido de señal phoD de Bs para la región correspondiente de la secuencia de EphA2 humana, muerta en cinasa, suprimida, transmembranal, mostrada en la Figura 49. Esta secuencia resultante contiene los sitios de reconocimiento de enzima de restricción únicos Bam Hl y Sac I en sus extremos 5' y 3' , respectivamente, para facilitar la inserción y el enlace funcional al promotor hly y al péptido de señal inicial, por ejemplo Ba PA. De este modo, los siete elementos funcionales ordenados del cásete de expresión del antígeno EphA2 humano bicistrónico, son los siguientes: promotor de hly-péptido de señal Ba PA-dominio EX EphA2-codón de termínación-actA-región intergénica plcB (con la secuencia Shine-Dalgarno) -péptido de señal PhoD de Bs-dominio CO de EphA2-codón de terminación. Todas las secuencias que codifican para EphA2 y el péptido de señal son preferentemente optimizadas en el codón. Las cepas de Lisíeria recombinante que expresan y secretan los dominios EX y CO de EphA2 pueden ser derivados por métodos ilustrados en esta solicitud, utilizando los vectores de integración pAM401, pKSV7, o pPL2 y pPL2. La expresión y secreción de las proteínas EphA2 es detectada mediante análisis de Western de las fracciones bacterianas deseadas, utilizando los métodos descritos en la presente y/o conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Ejemplo 29. Expresión y secreción de antígenos a partir de Lisíeria recombinante que comprende quimeras antígeno- proteína bacteriana En algunas modalidades de la invención, las secuencias que codifican para el péptido de señal y su socio proteína de fusión heteróloga son optimizadas en el codón. En algunas modalidades, es necesario colocar la secuencia de la proteína heteróloga optimizada en el codón dentro de una región definida de una proteína, cuya forma nativa es secretada de Lisíeria . La secuencia de proteína heteróloga es funcionalmente colocada dentro de una secuencia definida de la secuencia de proteína de Listeria secretada, seleccionada, tal que una proteína quimera es sintetizada y secretada, la cual corresponde a los pesos moleculares combinados de las proteínas secretadas. La secreción de la proteína heteróloga puede ser facilitada por la explotación de la maquinaria de la bacteria Listeria hospedera, que es requerida para la secreción óptima de las proteínas bacterianas autólogas . Los chaperones moleculares facilitan la secreción de las proteínas bacterianas seleccionadas. Como un ejemplo no limitante, las quimeras 37 proteicas entre la proteína p60 de L . monocytogenes y el antígeno tumoral humano, mesotelina, fueron generadas. Las quimeras proteicas fueron generadas mediante colocación precisa del antígeno tumoral humano, mesotelina, dentro de la proteína p60 de L . monocyíogenes en la posición del aminoácido 70 (aunque se entiende que cualquier proteína heteróloga deseada que codifica para la secuencia, puede ser seleccionada para generar una proteína quimera) . La proteína quimera contenía codones óptimos para la expresión en Listeria en los aminoácidos 1-70 de p60 y la secuencia de codificación de la mesotelina completa. Además, la proteína quimera p60-mesotelina humana fue funcionalmente ligada al promotor hly de L . monocytogenes, incorporada dentro del vector pPL2, que fue utilizado subsecuentemente como se describe en la presente para generar las cepas recombinantes de i. monocytogenes que expresan y secretan la mesotelina humana. Los métodos experimentales utilizados para construir una cepa de Lisíeria recombinante que óptimamente expresa y secreta una proteína quimera p60-mesotelina humana, se describen más adelante. En algunas modalidades, una característica importante de las quimeras proteicas entre un gen de L . monocyíogenes seleccionado y una secuencia de proteína heteróloga seleccionada, es la colocación funcional apropiada de la secuencia de proteína heteróloga seleccionada, dentro del gen de L . monocyíogenes seleccionado, para retener la secreción óptima de la proteína quimera a través de la interacción de la proteína expresada por L . monocyíogenes con los chaperones bacterianos y el aparato de secreción, así para retener actividad funcional de la proteína de L . monocytogenes en el contexto de la proteína quimera. En algunas modalidades, la colocación funcional de una secuencia heteróloga dentro de las proteínas NamA y p60 dependientes de secA2 de L. monocytogenes, es deseada para conservar las actividades de hidrolasa de la pared celular de peptidoglucano de estas proteínas. (Ver Lenz et al. (2003 PNAS, 100: 12432-12437), por ejemplo, para las descripciones de las proteínas NamA y p60 dependientes de secA2) . En algunas modalidades, la colocación funcional de la secuencia que codifica para la proteína heteróloga es deseada entre la secuencia de señal (SS) y los dominios de enlace a la pared celular (LySM) y los dominios catalíticos Lyz-2 (NamA) y p60-dom (p60) (Lenz et al. (2003)). En algunas modalidades, la expresión de los antígenos o las proteínas heterólogas está funcionalmente ligada a un promotor dependiente de prfA. Como tal, la expresión de la proteína heteróloga es inducida dentro del microambiente de la célula infectada por Listeria recombinante . El primer paso en la construcción de la proteína quimera p60-mesotelina involucró la síntesis de ADN del promotor hly dependiente de prfA y ligado funcionalmente a una secuencia de ADN que codifica para los primeros 70 aminoácidos de p60, con codones para la secreción óptima en Listeria. (En algunas modalidades, el uso del codón puede ser modificado adicionalmente para evitar las regiones de la estructura secundaria de excesiva de ARN, que puede inhibir la eficiencia de traducción de la proteína) . El subfragmento de ADN correspondiente a los aminoácidos de p60 N- terminales del promotor 70 de hly, fue sintetizado. (Esto puede ser en general realizado por un método de síntesis de genes conocido en la técnica, por ejemplo, mediante síntesis de oligonucleótido, PCR, y/o relleno con Klenow, o similares) . , La secuencia de los primeros 70 aminoácidos de p60 de L. monocytogenes, cepa 10403S, se muestra enseguida: MNMKKAT I AATAG I AVTAFAA P T I A SA S TVVVE AG DTLW GI AQ S KG T TVDAI KKANNL T T DK I V P G Q K L Q (SEQ ID NO: 116) Puede ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que existen múltiples aislados de laboratorio y de campo de L. monocytogenes que codifica para los genes, incluyendo p60, que pueden contener variabilidad en la 3 1 secuencia nucleotídica y al nivel de aminoácidos, pero que no obstante son esencialmente el mismo gen y proteína. Además, podrá ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que las quimeras proteicas pueden ser construidas utilizando genes provenientes de cualquier aislado de laboratorio o de campo (incluyendo la cepa clínica o llevada por los alimentos) de L . monocytogenes . La secuencia de ADN sintetizada correspondiente a los aminoácidos de p60 N-terminales del promotor 70 de hly se muestra en la Figura 51. Además, los codones que codifican para los residuos de aminoácidos 69 (L) y 70 (Q) de p60, fueron modificados para contener una secuencia de reconocimiento de enzima Pst I, única, para facilitar la inserción funcional de una secuencia heteróloga. Además, el extremo 5' del subfragmento sintetizado contiene una secuencia de reconocimiento de la enzima Kpnl. El fragmento de sub-fragmento digerido con Kpnl y Psíl de 447 pares de bases fue ligado dentro de los sitios Kpnl y Psíl correspondientes del vector pP12, y tratados por digestión con las enzimas Kpnl y Psíl, y digestión con la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP) . Este plásmido es conocido como pPL2-hlyP-Np60 CodOp. Subsecuentemente, el resto del gen nativo de p60 fue clonado dentro del plásmido hlyP-Np60 CodOp, entre los sitios únicos Psí I y BamHI . El resto del gen de p60 fue clonado por PCR, utilizando una lectura de prueba que contenía polimerasa termoestable, y el siguiente par de cebadores: Cebador delantero: 5' -CGC CTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTG (SEQ ID NO: 117) cebador inverso: 5'-CGCGGATCCTTAATTATACGCGACCGAAG (SEQ ID NO: 118) El amplicón de 1241 pares de bases fue digerido con PstI y BamHI, y el fragmento purificado de 1235 pb fue ligado dentro del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp, digerido con PstJ y BamHI, y tratado con CIAP. Este plásmido contiene el gen de p60 de Lisíeria monocyíogenes completo con los codones óptimos correspondientes a los aminoácidos 1-11 , y los codones nativos correspondientes a los aminoácidos 78-478, y es ligado funcionalmente al promotor hly de Lisíeria monocyíogenes . Este plásmido es conocido como pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77), y la secuencia del sub-fragmento Kpnl-BamHI que contiene el hlyP ligado funcionalmente a la secuencia de codificación de p60, se muestra en la Figura 52. La secuencia esperada del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) fue confirmada mediante secuenciamiento. El siguiente paso en la construcción fue la inserción funcional de una proteína heteróloga que codifica para la secuencia en el sitio Psíl único del plásmido como pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77), el cual está entre la secuencia de señal N-terminal y el primer dominio de p60 que se enlaza a la pared celular LysM, conservando de este modo la función biológica normal de la proteína de L . monocyíogenes . Como un ejemplo no limitante, la mesotelina humana que fue optimizada en el codón para la expresión óptima en la proteína de L . monocyíogenes, fue insertada dentro del sitio Psíl único del plásmido como pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77). Específicamente, la mesotelina de longitud completa, o la mesotelina que fue suprimida del péptido de señal y los dominios ligadores GPI (Mesotelina ?SP/?GPI) fue clonado a partir del plásmido descrito en el Ejemplo 27, que contiene la mesotelina humana de longitud completa, conteniendo los codones óptimos para la expresión en L . monocyíogenes, utilizando una polimerasa termoestable con actividad de lectura de prueba, y el siguiente par de cebadores: 1. Longitud Completa cebador Delantero (huMeso 3F) : 5'-AAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCC (SEQ ID NO: 119) cebador Inverso (hMeso 1935R) : 5'-AAACTGCAGAGCTAATGTACTGGCTAATAATAATGCTAAC (SEQ ID NO: 120) 2. Péptido de Señal ?, Ancla ? GPI Cebador Delantero (huMeso 133F) : 5'-CGCCTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGG (SEQ ID NO: 121) Cebador Inverso (huMeso 1770R) : 5 ' -CGCCTGCAGGCCTTGTAAACCTAAACCTAATGTATC (SEQ ID NO: 122) Los amplicones de PCR de 1932 pares de bases (mesotelina de longitud completa) y de 1637 pares de bases (Mesotelina ?SP/?GPI) fueron purificados, digeridos con Psíl, purificados y ligados dentro del sitio único Psíl del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) tratado por digestión con Psíl, y tratamiento con CIAP. La orientación N-CO consistente- de p60 y los dominios de mesotelina, fue confirmada mediante mapeo de endonucleasa de restricción. Estos plásmidos son conocidos como pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) -Mesotelina y pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77) -Mesotelina ?SP/?GPI, y fueron introducidos dentro de las cepas seleccionadas de L . monocytogenes (tales como los mutantes de supresión doble ?acíA?inlB) , como se describe a todo lo largo de los ejemplos contenidos en la presente. La secuencia del sub-fragmento Kpnl-BamHI del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77 ) -Mesotelina que contiene el promotor hly ligado funcionalmente al gen que codifica para la proteína quimera p60-Mesotelina humana, se muestra en la Figura 53. La secuencia del sub-fragmento Kpnl-BamHI del plásmido pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1.77) -Mesotelina ?SP/?GPI que contiene el promotor hly ligado funcionalmente a la proteína quimera p60-mesotelina humana ?SP/?GPI, que codifica para el gen, se muestra en la Figura 54.

Análisis de Wesíern de la expresión y secreción de las quimeras proíeicas de pßO-mesoíelina : Como se discute a todo lo largo de los ejemplos, la expresión y la secreción de un antígeno heterólogo seleccionado da como resultado potente cebadura de las respuestas de células T CD8+ restringidas en MHC de la clase I . La expresión y secreción de las quimeras proteicas dentro de los medios por los mutantes de doble supresión de L . monocyíogenes recombinante ?acíA?inlB que contiene las inserciones cromosómicas tRNA-Arg de los plásmidos pPL-hlyP-Np60 CodOP (1-77) -Mesotelina o pPL-hlyP-Np60 CodOP(l-77)-Mesotelina ?SP/?GPI, generados mediante los métodos descritos en la presente, fueron probados mediante análisis de Western por los métodos descritos en los Ejemplos contenidos en la presente, utilizando un anticuerpo policlonal específico de mesotelina. 38 Las supresiones manipuladas por ingeniería genética indicadas en la hMesotelina (?SP?GPI, también denominadas en la presente como ?SS?GPI, ?SP/?GPI, ?SS/?GPI, etc.) para las proteínas mostradas en algunas de las bandas fueron como sigue: La secuencia de señal suprimida (?SP) corresponde a los 34 aminoácidos N-terminales de la hMesotelina (para las secuencias de la mesotelina humana, ver, por ejemplo, Figura 34 o GenBank Acceso No. BC009272) . El dominio de GPI suprimido (?GPI) corresponde a los 42 aminoácidos C-terminales, comenzando con los residuos de aminoácidos Gly-Ile-Pro y terminando con los residuos de aminoácidos Thr-Leu-Ala (ver, por ejemplo, Figura 34). Los resultados de este análisis demostraron que las quimeras proteicas comprendidas de p60 con la inserción precisa de la mesotelina humana o la mesotelina humana ?SP/?GPI (insertada intraestructuralmente en el aminoácido70 de p60 entre la secuencia de señal N-terminal y el primero de dos dominios de enlace a la pared celular de LysM) fueron eficientemente expresados y secretados a partir de Lisíeria monocyíogenes recombinante. Ver Figura 55. (El eje Y de la Figura 55 muestra el peso molecular (en kDa) de las proteínas en la escalera corrida en la banda izquierda extrema) . Específicamente, las bandas 1-4 en la Figura 55 demuestran la expresión y la secreción de las quimeras proteicas esperadas que contienen la mesotelina humana o la mesotelina humana ?SP/?GPI. La eficiencia incrementada de expresión y de secreción de la mesotelina human ?SP/?GPI con relación a la mesotelina de longitud completa, es evidente en las bandas 2 y 4. En las quimeras proteicas mostradas en las bandas 3 y 4, fueron utilizados los aminoácidos auténticos de p60 N-terminales. En las primeras corridas en las bandas 1 y 2 en la Figura 55, los nucleótidos que codifican para los aminoácidos T y V en las posiciones 29 y 64, respectivamente, fueron suprimidos. La banda 5 muestra la expresión y la secreción del péptido de señal PA de Bacillus aníhracis fusionado a la ?SP?GPI humana-mesotelina (donde el péptido de señal y las secuencias que codifican para la mesotelina fueron optimizadas en el codón para la expresión en L . monocyíogenes) , y la banda 6 muestra la expresión y secreción de LLO fusionado a la mesotelina humana de longitud completa (donde el péptido de señal y las secuencias que codifican para la mesotelina, fueron optimizadas en el codón para la expresión en Lisíeria monocyíogenes) . La banda 8 muestra la expresión de proteína por J293, una línea celular humana, mientras que la banda 7 muestra la proteína expresada y secretada por J293 que contiene un plásmido que codifica para la mesotelina humana de longitud completa ("J293/Longitud Completa") . La banda 10 muestra la expresión y secreción de la proteína a partir de Lisíeria , la cual ha sido suprimida de p60 endógeno. El panel inferior en la Figura 55 muestra el análisis de Western de la secreción de p60 de L . monocytogenes utilizando un anticuerpo policlonal a-p60. Los resultados demuestran que las cantidades equivalentes de proteína secretada por Lm, fueron cargadas sobre el gel. Los resultados demuestran que p60 puede ser utilizado como un chaperón molecular para secretar proteínas heterólogas y facilitar la presentación de la vía MHC de la clase I.

Ejemplo 30 Ejemplos adicionales de expresión y secreción del antígeno por Listeria monocyíogenes recombinante A. Expresión del dominio intracelular (ICD) de EphA2 de la construcción bicistrónica utilizando un péptido de señal no Listerial La Figura 56 muestra el análisis de Western Blot de la expresión y secreción del dominio intracelular (ICD) de EphA2 a partir de los mensajes bicistrónicos utilizando una secuencia de señal no Listerial, no secAl. EphA2 es una proteína comprendida de un dominio extracelular (ECD) y un dominio intracelular (ICD) . Las Lisíerias ?acíA?nlB fueron manipuladas por ingeniería 3 genética para expresar un ARNms bicistrónico, donde los ARNms bicistrónicos codificaron el dominio extracelular y el dominio intracelular de EphA2 como polipéptidos discretos. Todas las secuencias que codifican para las secuencias de señal utilizadas en las construcciones (el péptido de señal phoD de B . subíilis, el péptido de señal de Antígeno Protector de B . aníhracis, y el péptido de señal Usp45 de L . lacíis) fueron optimizados en el codón para la expresión en L . monocyíogenes . Las secuencias que codifican para los dominios ECD e ICD fueron también optimizados en el codón para la expresión en L . monocyíogenes . El promotor hly Listerial proveniente del gen LLO fue utilizado como el promotor en estas construcciones. Los casetes de expresión que codifican para el ARNm bicistrónico fueron integrados dentro del genoma de Lisíeria utilizando el vector de integración pPL2. El análisis de Western Blot de diversas fracciones bacterianas utilizando técnicas estándares, fue utilizado para detectar y para medir el dominio EphA2 intracelular acumulado. Los resultados demostraron que el dominio intracelular de EphA2 fue expresado y secretado a partir de las construcciones bicistrónicas utilizando los péptidos de señal no Listeriales codificados por las secuencias optimizadas en el codón. Las construcciones de expresión comprendieron: (1) una secuencia optimizada en el codón que codifica para la secuencia secretora Usp45 de L . lacíis operablemente (funcionalmente) ligada con la secuencia de codificación para el dominio extracelular de EphA2 (primer polipéptido) y una secuencia optimizada en el codón que codifica para la señal secretora phoD de B. subíilis operablemente enlazada con un dominio intracelular de EphA2 (segundo polipéptido) (banda 1) ; y (2) una secuencia optimizada en el codón que codifica para la secuencia secretora del Antígeno Protector de B. aníhracis operablemente enlazada con la secuencia de codificación para el dominio extracelular de EphA2 (primer polipéptido) y una secuencia optimizada en el codón que codifica para la secuencia secretora phoD de B . subíilis operablemente enlazada con la secuencia de codificación para el dominio intracelular de EphA2 (segundo polipéptido) (bandas 2-3 (dos diferentes clones) ; ver descripción de la construcción de este cásete de expresión en el Ejemplo 28 anterior). Los estudios control (banda 4) con la cepa de Lisíeria ?acíA?inlB progenitora, atenuada demostraron una cantidad variable de reactividad cruzada detectable, en algunas transferencias control. Las bandas 1-3 muestran una banda de migración lenta y una banda de movimiento rápido, donde la banda de movimiento rápido corresponde al dominio intracelular (ICD) . El dominio intracelular expresado de EphA2 proveniente de todas las construcciones (bandas 1-3) fue observado en las tres fracciones bacterianas. La banda 4 (control) muestra únicamente la banda de migración lenta. Debido a que no estuvo disponible ningún anticuerpo para el dominio extracelular la expresión/secreción del dominio extracelular no fue evaluada.

B . Expresión y secreción basada en plásmido de la mesoíelina murina como una función de la fusión N-íerminal en diversos pépíidos de señal opíimizados en el codón La Figura 57 muestra la expresión y secreción basada en plásmido de la mesotelina murina expresada a partir de una secuencia que codifica para la mesotelina, optimizada en el codón utilizando diversos péptidos de señal, incluyendo las secuencias de señal no Listerial y las secuencias de señal no secAl. La expresión y secreción basada en plásmido de mesotelina murina es mostrada como una función de la fusión N-terminal con diversos péptidos de señal codificados por las secuencias optimizadas en el codón. En todos los casos, las secuencias codifican para los péptidos de señal de las proteínas de fusión de mesotelina fueron optimizadas en el codón, así como la secuencia que codifica para la mesotelina murina, fue optimizada en el codón para la expresión en L . monocyíogenes . La expresión y secreción de la mesotelina murina proveniente de L . monocyíogenes fue medida, donde la Lisíeria albergó un plásmido pAM401, y donde el plásmido codificó para la mesotelina. Diversas construcciones basadas en plásmido fueron probadas, donde la secuencia de señal fue variada. Las transferencias de Western fueron realizadas con las proteínas recuperadas de las diversas fracciones de las proteínas secretadas (A) , la pared celular (B) , y el lisado celular (C) . Para cada fracción, las bandas 1-2 muestran la mesotelina murina expresada como una fusión con la secuencia de señal del Antígeno Protector de B. anthracis, las bandas 3-4 muestran la mesotelina murina expresada como una fusión con la secuencia de señal Usp45 de Lactococcus lactis, las bandas 5-6 muestran la mesotelina murina expresada como una fusión con la secuencia de señal phoD de B . subíilis, las bandas 7-8 muestran la mesotelina murina expresada como una fusión con la secuencia de señal p60, las bandas 9-10 muestran la mesotelina murina expresada como una fusión con la secuencia de señal LLO, y la banda 11 muestra la proteína expresada por la Lisíeria hospedera control ?acíA?inlB. Los resultados demuestran que la más alta expresión y secreción fue encontrada donde la secuencia de señal comprendió la secuencia de señal del Antígeno Protector de B . aníhracis (bandas 1-2) y una secuencia de señal phoD de B . subíilis (bandas 5-6) .

C. Expresión y secreción basada en cromosomas de Lisíeria monocyíogenes , de mesoíelina humana La Figura 58 muestra el análisis de Western Blot de la expresión y secreción basada en cromosomas de Lisíeria monocyíogenes , y la mesotelina humana en diversas fracciones de células bacterianas (por ejemplo, proteína secretada, pared celular, y lisado) . La expresión y secreción de la mesotelina humana fue probada cuando fue fusionada a uno de los péptidos de señal secAl no Listerial y no secAl. Las bacterias Lisíeria probadas fueron todas las Lisíeria ?acíA?inlB y fueron como sigue: Listeria ?actA/?inlB (Listeria control que no fue manipulada por ingeniería para expresar la mesotelina) (Banda 1) ; Lisíeria que codifica para la secuencia de señal del Antígeno Protector de B . aníhracis, fusionada a ?SS/?GPI hMesotelina (Bandas 2-3) ; la Lisíeria que codifica para la secuencia de señal phoD de B . subíilis fusionada a ?SS/?GPI hMesotelina (Bandas 4-5) ; la Lisíeria que codifica para la secuencia de señal del Antígeno Protector de B. anthracis, fusionada con la hMesotelina de longitud completa (Bandas 6-7); Listeria que codifica para la secuencia de señal phoD de B. subtilis fusionada a la hMesotelina de longitud completa (Bandas 8-9) . Las secuencias que codifican para las secuencias fusionadas a la mesotelina en todas las Listerias anteriores, fueron optimizadas en el codón para la expresión en L . monocyíogenes . Además, las secuencias que codifican para la mesotelina (?SS/?GPI y de longitud completa) fueron optimizadas en el codón para la expresión en L . monocyíogenes en cada una de las construcciones. En cada una de las Lisíerias anteriores que expresan la mesotelina, los casetes de expresión de mesotelina fueron insertados dentro del cromosoma de la Lisíeria vía la integración con pPL2. La más alta expresión ocurrió con la secuencia secretora phoD de B. subtilis donde la mesotelina humana fue manipulada por ingeniería genética para suprimir su secuencia de señal y para suprimir una región hidrofóbica (región gpi) (Bandas 4-5) .

Ejemplo 31: Ejemplos adicionales de inmunogenicidad y eficacia anti-tumoral de vacunas de Listeria monocyíogenes ' recombinante Los siguientes ejemplos describen los resultados de la vacunación con Lisíeria de la presente invención, por ejemplo, la estimulación dependiente de la vacuna de la expresión de citocina, la supervivencia dependiente de la vacuna de un animal con tumores, la reducción dependiente de la vacuna en metástasis tumoral, y la reducción dependiente de la vacuna en el volumen tumoral .

A. Inmunogenicidad de la vacuna de Lisíeria que comprende la quimera p60-aníígeno modelo Las Figuras 59A y B muestran la distribución de un antígeno heterólogo hacia la vía MHC de la Clase I por Lisíeria que expresa ya sea la quimera p60-antígeno o una proteína de fusión péptido de señal LLO-antígeno . El antígeno heterólogo utilizado en este experimento fue AH1-A5. La vacunación fue con Listeria manipulada por ingeniería genética para comprender un cásete de expresión de la proteína quimera p60 que codifica para AH1-A5 (fusionado al péptido OVA SL8) insertado dentro de la secuencia del polipéptido de p60 que incluye la secuencia del péptido de señal p60 N-terminal ("construcción basada en p60") , o Listeria manipulada por ingeniería para codificar un péptido de señal LLO ligado a un ácido nucleico que codifica para el mismo antígeno, AH1.A5 incrustado dentro de OVA ("construcción basada en LLO") . Estas dos construcciones utilizaron el promotor Listerial hly. p60 es una autolisina peptidoglicano Listerial que es secretada por una vía secA2, mientras que LLO es listeriolisina. Para generar la construcción basada en p60, el ácido nucleico que codifica para p60 fue manipulado por ingeniería para contener un sitio de clonación PstI, donde el sitio de clonación PstI representó una mutación silenciosa, por ejemplo dando como resultado ausencia de cambio en la secuencia de aminoácidos codificada. El sitio PstI fue localizado entre la secuencia de señal N-terminal y el 3 primero de dos dominios de enlace a la pared celular de LysM en la secuencia de p60. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo que comprende el epitopo AH1-A5 (SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 73)) y el epitopo SL8 (SIINFEKL (SEQ ID NO: 123) ) fue insertado intraestructuralmente dentro del sitio de clonación de PstI. Las secuencias de codificación para estos epitopos fueron separadas mediante un sitio Xhol único y optimizadas en el codón para la expresión en L . monocytogenes . La inserción dentro del sitio PstI ocurrió al equivalente del número de base nucleotídica del número de base 199 de p60. Los primeros 1-70 aminoácidos de la secuencia de codificación de p60 fueron optimizados en el codón para la expresión en L . monocytogenes . En consecuencia, los primeros 27 aminoácidos correspondientes al péptido de señal fueron expresados a partir de los codones óptimos para la expresión en L . monocyíogenes . El cásete de expresión del antígeno contenía además los sitios Kpnl y Sacl 5' y 3 ' únicos, respectivamente para la inserción dentro de MCS del plásmido pPL2, para la integración específica del sitio adyacente al gen de tRNAArg del genoma de L . monocyíogenes . La construcción basada en LLO comprendió una secuencia que codifica para una secuencia de señal LLO operablemente enlazada a un ácido nucleico que codifica para AH1-A5 dentro de OVA (sin el uso de ninguna optimización de codón) . De este modo, en el presente estudio, el péptido de señal fue ya sea LLO de Listeria o p60 de Lisíeria . Las construcciones fueron colocadas dentro de pPL2, un vector que es mediador de la recombinación específica del sitio con el genoma de Lisíeria, e insertado dentro del genoma de Lisíeria . Las Figuras 59A y 59B muestran la respuesta inmune a una vacunación (vena de la cola) de la Lisíeria que expresa el antígeno AH1-A5 con la secuencia de señal de p60/autolisina como una quimera de p60, y la respuesta inmune a la vacunación de Listeria que expresa el antígeno AH1-A5 ligado con la secuencia de señal LLO. En el eje X de la figura, "Unstim" significa que ningún péptido fue agregado a los pozos (por ejemplo, las células fueron no estimuladas) , mientras que "AHÍ" significa el nonapéptido AHÍ fue agregado a los pozos, y "AH1-A5" significa que el nonapéptido AH1-A5 fue agregado a los pozos. Todas las vacunas bacterianas fueron manipuladas por ingeniería para contener un ácido nucleico integrado que codifica para AH1-A5 (las vacunas bacterianas no codificaron para AHÍ) (ver, por ejemplo, Slansky, et al. (2000) Immunity 13: 529-538). Donde la vacunación fue realizada con la Listeria que comprende las construcciones basadas en p60, la cepa es indicada sobre el eje X de la figura como "p60". Donde la vacunación fue realizada con Listeria que comprende las construcciones basadas en LLO, la cepa es indicada sobre el eje X de la 3 Figura como "LLO" . El protocolo completo para la vacunación con Lisíeria que expresa la construcción basada en p60 fue como sigue: (1) fueron vacunados ratones con Lisíeria (vena de la cola (i.v)) que contenía un ácido nucleico integrado, donde el ácido nucleico integrado codificó para p60 que contenía un ácido nucleico que codifica para AH1-A5 insertado en el nucleótido 199 de p60. En otras palabras, el ácido nucleico que codifica para el antígeno AH1-A5 estuvo en estructura con y operablemente enlazado con la secuencia de señal de p60 y con autolisina de p60. El ácido nucleico que codifica para AH1-A5 fue optimizado en el codón para la expresión en L . monocyíogenes; (2) siete días después de la infección, los bazos fueron retirados; (3) las células del bazo fueron disociadas, colocadas en pozos, y fueron incubadas ya sea sin péptido agregado (Figuras 59A y 59B) , con AHÍ agregado (Figura 59A) , o con AH1-A5 (Figura 59B) , como se indica sobre el eje X; (4) después de la adición del péptido, las células fueron incubadas por cinco horas, seguido por la evaluación del porcentaje de células T CD8+ que expresan IFNgamma, mediante análisis de FACS. Se utilizó un protocolo análogo para la vacunación con Lisíeria que expresa la construcción basada en LLO. Los resultados demuestran que las vacunas de Lisíeria estimularon la expresión de células T CD8+ de IFNgamma, donde el péptido agregado fue AHÍ (Figura 59A) o donde el péptido agregado fue AH1-A5 (Figura 59B) . La estimulación fue algo mayor donde el AH1-A5 integrado fue operablemente ligado con la secuencia de señal LLO, y la estimulación fue algo menor cuando AH1-A5 integrado fue operablemente enlazado con la secuencia de señal p60 (Figuras 59A y B) . Las Figuras 60A y 60B muestran experimentos conducidos con las mismas dos vacunas de Lisíeria que se describieron anteriormente, por ejemplo, como se muestra en las Figuras 59A y B. La Figura 60A muestra los resultados donde los ratones fueron vacunados con la Lisíeria manipulada por ingeniería para contener la construcción basada en p60 ("p60") o con la Lisíeria manipulada por ingeniería para contener la construcción basada en LLO ("LLO") . Como se indica sobre el eje X de la Figura 60A, los ensayos basados en células fueron suplementados en el péptido (no estimulado; "unstim") o con el péptido LLO91-99 ("LL091"; Badovinac y Harty (2000) J. Immunol. 164: 6444-6452 ) . Los resultados demostraron una respuesta inmune similar (expresión de IFNgamma) donde la vacuna 'de Lisíeria contenía la construcción basada en p60 o la construcción basada en LLO. La respuesta inmune estimulada en la Figura 60A, como es reflejada en los resultados provenientes del ensayo basado en células, es debido a la expresión endógena en Lisíeria de LLO nativo. La Figura 60B muestra los resultados donde los ratones fueron vacunados con la Lisíeria manipulada por ingeniería para contener la construcción basada en p60, donde el promotor hly y las secuencias peptídicas de señal fueron operablemente enlazadas con un ácido nucleico que codifica para AH1-A5, o con la Lisíeria manipulada por ingeniería para contener la construcción basada en LLO, donde el promotor hly y el péptido de señal fueron operablemente enlazados con un ácido nucleico que codifica para AH1-A5. Los péptidos agregados fueron ya sea sin péptido (no estimulado; "unstim") o p602?7-225 ("p60-217", Sijts, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 19261-19268), como se indicó en el eje X. La respuesta inmune estimulada en la Figura 60B, como es reflejado en los resultados del ensayo basado en células, es debida a la expresión de Lisíeria de p60 endógeno para la construcción basada en LLO, y la combinación de p60 endógeno y la secuencia de la proteína quimera p60 expresada, para la construcción basada en p60.

B. Eficacia íerapéuíica de la • Lisíeria que expresa mesoíelina humana Los resultados descritos en la Figura 61 revelan que la vacunación con Lisíeria que expresa la mesotelina humana (huMesotelina) prolonga la supervivencia en ratones que poseen tumores, donde las células tumorales en los ratones habían sido manipuladas por ingeniería para expresar la mesotelina humana. Las células tumorales fueron células CT26 que expresan la mesotelina humana y los ratones fueron ratones Balb/c. (Todos los estudios de tumores CT26 descritos en la presente involucran ratones Balb/c) . En uno de los casetes de expresión, una secuencia que codifica para una secuencia de señal no Listerial fue operablemente enlazada en la estructura con una secuencia optimizada en el codón que codifica para la mesotelina humana (suprimida de su secuencia de señal y del ancla GPI) . El cásete de expresión que codifica para un péptido de señal fusionado con la mesotelina humana (?GPI?SS) fue administrado a los ratones que poseen tumores en una vacuna de Lisíeria , en estudios sobre el efecto de la proteína de fusión sobre la respuesta inmune hacia los tumores. El cásete de expresión que codifica para la proteína de fusión de mesotelina había sido integrado dentro del cromosoma de Lisíeria . En el día 0, 2 x 105 células CT26 que expresan la mesotelina humana (CT.26 huMesot) fueron inyectadas intravenosamente dentro de ratones Balb/c. La vacunación de los ratones fue en la vena de la cola (i.v.) . La inoculación con 1 x 107 unidades formadoras de colonia (UFC) de Lisíeria (i.v.) ocurrió en el día 3. La Figura 61 muestra la supervivencia porcentual (mostrada sobre el eje y) de los ratones hacia el tumor CT26 que expresa la mesotelina humana donde la vacuna comprende Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) (una pseudo-vacuna; "HBSS") ; Lisíeria ?acíA?inlB que expresa SF-ÁH1A5 a partir de un cásete de expresión integrado (vacuna control positivo; "SF-AH1A5") ; o la Lisíeria ?acíA?inlB que comprende un cásete de expresión que codifica para la secuencia de señal del Antígeno Protector de B . aníhracis (codificado por una secuencia no optimizada en el codón) , fusionada con la huMesotelina (codificada por una secuencia optimizada en el codón) , donde la huMesotelina tenía una secuencia de señal suprimida y una región suprimida que codifica para el péptido de anclaje a gpi, hidrofóbico ("BaPA-huMeso ?gpi?ss") . Las Lisíerias que poseen la construcción de SF-AH1A5 y la construcción BaPA-huMeso ?gpi?ss contenían estas construcciones como construcciones cromosómicamente integradas. La molécula de ácido nucleico que codifica para SF-AH1A5 y la molécula de ácido nucleico que codifica para la construcción BaPA-huMeso ?gpi?ss habían sido integradas dentro del genoma de Lisíeria utilizando pPL2. SF es la abreviatura para un péptido de ocho aminoácidos derivados de la ovoalbúmina, también conocido como SL8 (ver, por ejemplo, Shastri y Ganzalez (1993) J. I munol . 150:' 2724-2736). Las abreviaturas "SF-AH1A5", "SF-AH1-A5" y "OVA/AH1-A5" se refieren a AH1-A5 conectado a un andamiaje de ovoalbúmina.

"SF AH1-A5" se refiere a AH1-A5 (SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 73)) y el péptido SF fusionado al extremo N de los aminoácidos 138 a 386 de GenBank Acceso No. P01012 (ovoalbúmina) . Los polinucleótidos que 'codifican para "SF-AH1A5", en este ejemplo, comprendieron un ácido nucleico optimizado en el codón que codifica para AH1-A5 y un ácido nucleico no optimizado en el codón que codifica para la secuencia derivada de la ovoalbúmina. Los resultados demuestran que una inmunización simple con la Listeria que expresa huMesotelina prolonga la supervivencia de los ratones que contiene los tumores que expresan huMesotelina. El porcentaje de supervivencia fue más alto con la secuencia de señal del Antígeno Protector de B . anthracis, cromosómicamente integrada, fusionada con. la ? secuencia de señal/?gpi huMestoelina (BaPA-huMeso ?gpi?ss; cuadros cerrados). La supervivencia fue la más baja donde la "vacunación" fue con la solución salina control.

C. Reducción en el nivel del nodulo de tumor pulmonar en raíones que poseen íumores , vacunados con la Lisíeria que expresa la mesoíelina humana , debido a la eficacia aníi-íumoral específica de la mesoíelina Los datos en la Figura 62 demuestran que el nivel de los nodulos del tumor pulmonar es reducido por la vacunación con Lisíeria ?acíA?inlB que expresa la mesotelina humana, donde las células tumorales fueron manipuladas por ingeniería para expresar la mesotelina humana. La cepa de ratón fue Balb/c y las células de tumor pulmonar fueron células CT26 que albergan un vector que expresa la mesotelina humana. En el día 0, fueron administradas intravenosamente los ratones Balb/c, 2 x 105 células CT26 que expresan la mesotelina humana. Las secuencias que codifican para las diversas secuencias de señal fueron operablemente enlazadas intraestructuralmente con las secuencias de codón optimizado que codifican para la mesotelina humana en los casetes de expresión. Los casetes de expresión que codifican para los diversos péptidos de señal fusionados con la mesotelina humana fueron administrados a ratones que poseían tumores, vía las vacunas con Lisíeria que comprenden los casetes de expresión. En el día 3, 1 x 107 UFC/100 µl de las vacunas de Listeria fueron administrados a los ratones que poseen tumores, intravenosamente. Las vacunaciones de control negativo fueron con HBSS o Listeria ?actA?inlB. Las vacunaciones de control positivo fueron con Listeria que expresa una proteína de fusión de OVA que comprende AH1A5 (intraestructuralmente con la secuencia de OVA) . (La proteína de fusión OVA que comprende AH1A5 fue codificada por un cásete de expresión no optimizado en el codón) . En el día 19, los ratones fueron sacrificados, sus pulmones cosechados, y los nodulos tumorales pulmonares fueron contados. Las vacunas de Lisíeria redujeron el número de metástasis en los pulmones. Las vacunas control que involucran únicamente HBBS o Lisíeria ?acíA?inlB dieron como resultado 250 metástasis por pulmón, consistentes, detectadas, y un promedio de 135 metástasis por pulmón, respectivamente. La Lisíeria que posee el plásmido (pAM401) que codifica para el péptido de señal LLO fusionado a la mesotelina humana ("pAM-LLO-HuMeso") mostró aproximadamente 25 metástasis por pulmón. Las secuencias de polinucleótidos del plásmido pAM-LLO-HuMeso que codificó para el péptido de señal LLO y la secuencia de la mesotelina humana, fueron optimizados en el codón para la expresión en L . monocyíogenes . La Lisíeria que posee las secuencias integradas que codifican para la secuencia de señal del Antígeno Protector de B . aníhracis (BaPA) fusionada con la huMesotelina (?gpi/?secuencia de señal) ("BaPA-HuMeso ?gpi?ss") también mostró en promedio aproximadamente 25 metástasis por pulmón. El polinucleótido en BaPA-HuMeso ?gpi?ss que codificó para la secuencia de señal de Antígeno Protector de B . aníhracis, no fue optimizada en el codón, mientras que el polinucleótido que codificó para la secuencia de mesotelina humana suprimida del péptido de señal de 40 mesotelina y del ancla GPI, fue optimizada en el codón para la expresión en L . monocyíogenes . La Figura 63 muestra los resultados de un estudio control utilizando ratones que comprenden nodulos de tumor pulmonar generados utilizando las células objetivo progenitoras CT.26. Fueron utilizados ratones Balb/c, pero se inyectó CT26 de tipo silvestre (2 x 105 células (i.v.) en el día 0) . El estudio demuestra que la eficacia anti-tumoral de la vacunación con la vacuna de Lisíeria que expresa las proteínas de fusión de mesotelina es específica de mesotelina. Las secuencias que codifican para las diversas secuencias de señal fueron operablemente enlazadas intraestructuralmente con las secuencias optimizadas en el codón que codifican para la mesotelina humana en los casetes de expresión. (Las construcciones utilizadas en este experimento fueron idénticas a aquellas utilizadas en los experimentos anteriores, para generar los datos mostrados en la Figura 62) . Los casetes de expresión que codifican para los diversos péptidos de señal fusionados con la mesotelina humana, fueron administrados a los ratones que poseen tumores vía las vacunas de Lisíeria que comprenden los casetes de expresión. La vacunación fue en la vena de la cola (1 x 107 UFC/100 µl i.v. en el día 3) . En este estudio particular, las células tumorales no expresaron la mesotelina humana. La supervivencia fue determinada. Donde los datos fueron disponibles, fue también medido el número de metástasis pulmonares. Existió un total de cinco ratones en cada grupo de vacunación. La inoculación control negativo involucró HBSS o Lisíeria ?actA?inlB. La inoculación control positivo involucró Listeria que expresa una fusión de OVA que comprende AH1A5 (no optimizada en el codón) . Los resultados son mostrados en la Figura 63. Las cruces indican falla para sobrevivir y cada grupo de vacunación contenía 5 ratones. Con la inoculación control positivo, los ratones sobrevivieron, y el número de metástasis detectadas en el pulmón fue en promedio de aproximadamente 25 por pulmón. Ya que las células tumorales no fueron manipuladas por ingeniería para expresar la mesotelina humana, los ratones inoculados con Listeria que alberga un plásmido que expresa el péptido de señal LLO fusionado con la mesotelina humana ("pAM-LLO-HuMeso") no sobrevivieron. Donde los ratones fueron inoculados con Listeria que posee la secuencia secretora del Antígeno Protector de B. aníhracis, cromosómicamente integrado (BaPA; codificada por una secuencia nucleotídica no optimizada en el codón) fusionada con la mesotelina humana (?gpi/?secuencia de señal) ("BaPA-HuMeso ?gpi?ss") , algunos sobrevivieron pero otros fallaron en sobrevivir. B. Vacunación con Lisíeria que expresa la mesoíelina humana opíimizada en el codón, reduce el volumen íumoral La Figura 64 muestra la vacunación con Listeria (?actA?inlB) que expresa la mesotelina humana a partir de casetes de expresión que comprenden las secuencias del codón de la mesotelina optimizadas en el codón, reduce el volumen tumoral . Las secuencias que codifican para las diversas secuencias de señal fueron operablemente enlazadas intraestructuralmente con las secuencias optimizadas en el codón, que codifican para la mesotelina humana en los casetes de expresión. Los casetes de expresión que codifican para los diversos péptidos de señal fusionados con la mesotelina humana, fueron administrados a ratones que poseen tumores vía las vacunas de Listeria que comprenden casetes de expresión. Las vacunas de Lisíeria que expresan la mesotelina humana que fueron utilizadas para la vacunación de los ratones que poseen tumores en este estudio, incluyen lo siguiente: Lisíeria (?actA?inlB L . monocytogenes) que posee un plásmido pAM401 que expresa y que secreta el péptido de señal LLO (codificado por una secuencia optimizada en el codón para la expresión en L . monocyíogenes) fusionada con la mesotelina humana ("pAM opt .LLO-opt .huMeso") ; Lisíeria que posee un plásmido pAM401 que expresa la secuencia del Antígeno Protector de B . aníhracis (codificada por un cásete de expresión no optimizado en el codón) fusionado con huMesotelina ("pAM no-opt .BaPA-opt . huMeso") ; y Lisíeria que comprende un cásete de expresión integrado que codifica para el péptido de señal de Antígeno Protector de B. aníhracis (codificado por una secuencia no optimizada en el codón) fusionado con huMesotelina, donde la huMesotelina tuvo una secuencia de señal suprimida y una región suprimida que codifica para el péptido hidrofóbico de anclaje a gpi ("No-opt . BaPA-opt .huMesodelgpi-ss") . En el estudio, ratones Balb/c fueron implantados subsecuentemente con 2 x 105 células de tumor de colon murino CT26 manipuladas por ingeniería genética para la expresión de mesotelina humana (día 0) . Cinco ratones fueron incluidos en cada grupo de vacunación. En el día 3 después de la inyección con las células CT26, los ratones fueron vacunados con el control no Listerial o 1 x 107 unidades formadoras de colonias (UFC) de la vacuna de Listeria intravenosamente. La inoculación control negativo involucró HBSS. La inoculación control positivo involucró Lisíeria que expresa SF-AH1A5 (optimizado en el codón) . (SF es un péptido de ocho aminoácidos derivados de ovoalbúmina, también conocido como SL8 (ver, por ejemplo, Shastri y González (1993) J. Immunol . 150: 2724-2736). A diversos puntos de tiempo, se determinó el volumen tumoral medio. Los resultados de este estudio son mostrados en la Figura 64. Los resultados demostraron que la vacunación con Listeria que expresa la mesotelina humana fusionada a diversos péptidos de señal traduce el volumen tumoral. La vacunación con Listeria que expresa un péptido se señal del Antígeno Protector de B . anthracis fusionado con la mesotelina humana, fue protectora (círculos abiertos con línea discontinua) . La vacunación con Listeria que expresa mesotelina humana codificada por el plásmido, fusionada al péptido de señal LLO, fue protector (triángulos abiertos) . La vacunación con Lisíeria que comprende un cásete de expresión cromosómicamente integrado que codifica para el péptido de señal bacteriano de Antígeno Protector de B . aníhracis (ácido nucleico optimizado en el codón) fusionado con mesotelina humana (?gpi/?secuencia de señal) (óvalos abiertos con línea continua) fue también protectora. Respecto a los controles positivos, la Lisíeria que expresa SF-AH1A5 cromosómicamente integrado (cuadros abiertos) fue también protectora. El volumen tumoral más alto, y el tiempo más temprano del inicio del crecimiento tumoral, ocurrieron en ratones que reciben la pseudo vacuna (HBSS) .

E. Inmunogenicidad de una vacuna de Lisíeria que expresa la mesoíelina humana fusionada a una secuencia de señal no Lisíerial La Figura 65 describe la inmunogenicidad de una cepa de Listeria /lactA/zinlß-hMesotelina, donde la Listeria contenía un ácido nucleico cromosómicamente integrado que codifica para la hMesotelina fusionada a un péptido de señal de Bacillus anthracis (BaPA hMeso ?GPl?SS optimizado) . Se utilizaron ensayos de ELISPOT para evaluar la respuesta inmune, donde los ensayos fueron sensibles a la expresión de inferieron gamma. El estudio comprendió los siguientes pasos: (1) Ratones (ratones Balb/c o ratones C57BL/6) fueron vacunados (i.v.) con la Listeria que comprende un cásete de expresión inteqrado, que codifica para el péptido de señal de Antígeno Protector de B . anthracis (codificado por una secuencia no optimizada en el codón) fusionado con la huMesotelina (codificada por una secuencia optimizada en el codón en la cual la secuencia de señal de mesotelina y las secuencias hidrofóbicas de anclaje a gpi, habían sido suprimidas); (2) después de 7 días, los bazos fueron retirados; (3) las células removidas de los baños fueron insertadas en los pozos. Cada pozo recibió aproximadamente 200,000 células esplénicas; (4) uno de tres tipos de medios fueron agregados a los pozos, como se indica. Las células esplénicas de los estudios con ratones Balb/c recibieron medio únicamente ("No estimulado") , el combinado de péptido de mesotelina ("combinado Meso") , o p602?7-225 ("p602?7") . Las células esplénicas provenientes de los estudios con C57BL/6 recibieron únicamente el medio ("No estimulado") , el combinado de péptido de mesotelina ("combinado Meso") , o LL0296-3o ("LL0296-3o ) (5) se realizaron ensayos ELISPOT para determinar el número de células inmunes que responden al o a los péptidos agregados. El combinado del péptido de mesotelina comprendió 153 diferentes péptidos, donde estos péptidos abarcaron la secuencia completa de la hMesotelina, donde cada péptido fue de 15 aminoácidos de longitud, traslapando los péptidos adyacentes por 11 aminoácidos. Los resultados de los ensayos de ELISPOT se muestran en la Figura 65. Los resultados indicaron que la vacuna de Listeria que expresa mesotelina humana fusionada al péptido de señal de B. anthracis, fue capaz de inducir una respuesta inmune hacia la mesotelina en ratones Balb/c. Una respuesta de IFN-gamma más alta hacia la hMesotelina expresada por Listeria, fue observada con el sistema inmune de ratones Balb/c que con el sistema inmune de ratones C57BL/6. La señal de ELISPOT hacia p60 o LLO fue en respuesta a las proteínas p60 y LLO de origen natural, de Listeria . Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, sitios de internet, y números de acceso/secuencias de bases de datos (incluyendo las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos) citadas en la presente, son incorporadas aquí por referencia en su totalidad, para todos los fines, al mismo grado como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente, sitio de internet, o número de acceso/secuencia de base de datos fueron específica e individualmente indicadas para ser así incorporadas por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal nativo para una bacteria, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. 2. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la bacteria es una bacteria Listeria . 3. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno asociado al tumor, un polipéptido derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, y un polipéptido derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. 4. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal, extraño para la bacteria, o ambos. 5. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal LLO proveniente de Lisíeria monocyíogenes o es un péptido de señal p60 proveniente de Lisíeria monocyíogenes . 6. Un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. 7. Una bacteria recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en la bacteria recombinante. 8. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado porque comprende el administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante de 5 conformidad con la reivindicación 7, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno . 9. Una bacteria Lisíeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, 10 caracterizada porque la molécula de ácido nucleico recombinante comprende : (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal, en donde el primer polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en una bacteria 15 Lisíeria; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccionalque el primer polinucleótido, 20 en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. 10. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque £5 comprende un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. 11. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la bacteria Lisíeria pertenece a la especie Lisíeria monocyíogenes . 12. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno asociado al tumor, un polipéptido derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, y un polipéptido derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. 13. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP y CEA o comprende un polipéptido derivado de un antigeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-i, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP y CEA. 14. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo, o comprende NY-ESO-l, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. 15. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende la mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y el dominio ligado de GPI . 16. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido es heterólogo para el péptido de señal. 17. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el péptido de señal es extraño para la bacteria Lisíeria . 18. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el péptido de señal es nativo para la bacteria Lisíeria . 19. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal seleccionado del grupo que consiste de un péptido de señal LLO proveniente de Listeria monocyíogenes, un péptido de señal Usp45 de Lactococcus lacíis, un péptido de señal de Antígeno Protector de Bacillus aníhracis, un péptido de señal, p60 de Lisíeria monocyíogenes , y un péptido de señal phoD de B . subíillis . 20. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque está atenuada para la dispersión de célula a célula, la entrada hacia las célula no fagocíticas o la proliferación. 21. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es deficiente con respecto a ActA, Internalina B o tanto para ActA e Internalina B. 22. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado por reacción con un compuesto que se dirige al ácido nucleico. 23. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9. 24. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado porque comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria 42 recombinante de conformidad con la reivindicación 9, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno . 25. Un método para prevenir o tratar una condición en un hospedero, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 9. 26. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo para el péptido de señal, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, y en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. 27. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido, o el primero y segundo polínucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en una bacteria. 28. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal Listerial. 29. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal secA2 o un péptido de señal Tat. 30. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal p60 proveniente de Listeria monocytogenes o es un péptido de señal phoD de B . subtílis. 31. La molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno asociado al tumor, un polipéptido derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, y un polipéptido derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. 32. Un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. 33. Una bacteria recombinante caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 26. 34. La bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque es una bacteria Listeria . 35. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 33, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno. 36. Una bacteria Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico recombinante comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal bacteriano no secAl; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que es heterólogo para el péptido de señal o es extraño para la bacteria o ambos, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; • en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal y el polipéptido. 37. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque comprende un cásete de expresión que incluye la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. 38. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido o ambos, es decir el primero y segundo polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en la bacteria Lisíeria . 39. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque pertenece a la especie Listeria monocyíogenes . 40. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el péptido de señal no secAl es un péptido de señal no Listerial . 41. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el péptido de señal no secAl es un péptido de señal Listerial. 42. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal secA2. 43. La Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además: (c) un tercer polinucleótido que codifica para una autolisina secA2, o un fragmento de la misma, en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde el segundo polinucleótido está colocado dentro del tercer polinucleótido o entre el primero y tercer polinucleótidos. 44. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el péptido de señal bacteriano es un péptido de señal Tat. 45. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal PhoD de B. subtilis o es un péptido de señal ?60 de Listeria monocytogenes . 46. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el -polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno asociado al tumor, un polipéptido derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, y un polipéptido derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. 47. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP y CEA o comprende un polipéptido derivado de un antigeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP y. 48. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. 49. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y anclaje GPI . 50. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque está atenuada para la dispersión de célula a célula, la entrada hacia las célula no fagocíticas o la proliferación. 51. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es deficiente con respecto a ActA, Internalina B o tanto para ActA e Internalina B. 52. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificado por reacción con un compuesto que se dirige al ácido nucleico . 53. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36. 54. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado porque comprende administrar al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno. 55. Un método para prevenir o tratar una condición en un hospedero, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 36. 56. Una bacteria Lisíeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico recombinante comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal no Listerial; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido que está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína de fusión que comprende el péptido de señal no Listerial y el polipéptido. 57. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque comprende un cásete de expresión que incluye la molécula de ácido nucleico recombinante, en donde el cásete de expresión comprende además un promotor operablemente enlazado al primero y segundo polinucleótidos de la molécula de ácido nucleico recombinante. 58. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque el primer polinucleótido, el segundo polinucleótido o ambos, es decir el primero y segundo polinucleótidos son optimizados en el codón para la expresión en la bacteria Lisíeria . 59. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la bacteria es Lisíeria monocyíogenes . 60. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque el péptido de señal es bacteriano. 61. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el péptido de señal es derivado de una bacteria gram positiva. 62. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque el péptido de señal es derivado de una bacteria que pertenece al género Bacillus, Síaphylococcus o Lacíococcus . 63. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque el péptido de señal es un péptido de señal seleccionado del grupo que consiste un péptido de señal Usp45 de Lacíococcus lacíis, un péptido de señal de Antígeno Protector de B . aníhracis y un péptido de señal phoD de Bacillus subíílis . 64. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de un antígeno asociado al tumor, un polipéptido derivado de un antígeno asociado al tumor, un antígeno de enfermedad infecciosa, y un polipéptido derivado de un antígeno de enfermedad infecciosa. 65. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 64, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA o comprende un polipéptido derivado de un antígeno seleccionado del grupo que consiste de K-Ras, H-Ras, N-Ras, 12-K-Ras, mesotelina, PSCA, NY-ESO-l, WT-1, survivina, gplOO, PAP, proteinasa 3, SPAS-1, SP-17, PAGE-4, TARP o CEA. 66. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende mesotelina, o un fragmento antigénico o variante antigénica del mismo. 67. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende mesotelina humana suprimida de su péptido de señal y anclaje GPI . 68. La bacteria Listeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque está atenuada para la dispersión célula a célula, la entrada a células no fagocíticas o la proliferación. 69. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque es deficiente con respecto a ActA, Internalina B o ActA e Internalina B. 70. La bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque el ácido nucleico de la bacteria recombinante ha sido modificada por reacción con un compuesto que se dirige al ácido nucleico . 71. Una composición inmunogénica o vacuna, caracterizada porque comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56. 72. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacía un antígeno, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lísteria recombinante de conformidad con la reivindicación 56, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno. 73. Un método para prevenir o tratar una condición en un hospedero, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 56. 74. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para una autolisina bacteriana, o un fragmento catalíticamente activo o variante catalíticamente activa del mismo; y (b) un segundo polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo para la autolisina bacteriana, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido y la autolisina, o el fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, en donde en la proteína quimera el polipéptido está fusionado a la autolisan, o fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma, o está colocado dentro de la autolisina, o fragmento catalíticamente activo o la variante catalíticamente activa de la misma. 75. Una bacteria reco binante, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 74. 76. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, que comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno . 77. Una bacteria Lisíeria recombinante que comprende un cásete de expresión policistrónico, caracterizada porque el cásete de expresión policistrónico codifica para al menos dos polipéptidos no Listeriales discretos . 78. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 77, en donde al menos uno de los polipéptidos no Listeriales codificados por el cásete de expresión policistrónico, comprende el antígeno. 79. Una bacteria de Listeria recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico recombinante comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido extraño para la bacteria Listeria, en donde el polinucleótido es optimizado en el codón para la expresión en Listeria . 80. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 79, en donde el polipéptido extraño comprende el antígeno. 81. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica para un péptido de señal; (b) un segundo polinucleótido que codifica para una proteína secretada, o un fragmento de las misma, en donde el segundo polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primer polinucleótido; y (c) un tercer polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo para la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en donde el tercer polinucleótido está en la misma estructura de lectura traduccional que el primero y segundo polinucleótidos, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante codifica para una proteína quimera que comprende el péptido de señal, el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido, y la proteína secretada, o el fragmento de la misma, y en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido está fusionado a la proteína secretada, o el fragmento de la misma, o está colocado dentro de la proteína secretada, o el fragmento de la misma, en la proteína quimera . 82. Una bacteria recombinante, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 81. 83. Un método para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, caracterizado porque comprende administrarle al hospedero una cantidad efectiva de una composición que comprende la bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 82, en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido comprende el antígeno. 84. El uso de la bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 7, 9, 33, 36, 56 o 75 en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el segundo polinucleótido comprende el antígeno. 85. El uso de la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 77, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde al menos uno de los polipéptidos no Listeriales codificados por el cásete de expresión policistróncio, comprende el antígeno. 86. El uso de la bacteria Lisíeria recombinante de conformidad con la reivindicación 79, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido extraño comprende el antígeno. 87. El uso de la bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 82, en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un hospedero hacia un antígeno, en donde el polipéptido codificado por el tercer polinucleótido comprende el antígeno. 88. El uso de la bacteria recombinante de conformidad con la reivindicación 7, 9, 33, 36, 56, 75, 77, 79 u 82, en la fabricación e un medicamento para prevenir o tratar una condición en un hospedero.